BR112017012875B1

BR112017012875B1 - Sensores de nanoporo integrantes dentro de matrizes de canal microfluídico como uso de ruptura controlada

Info

Publication number: BR112017012875B1
Application number: BR112017012875-6A
Authority: BR
Inventors: Vincent Tabard-Cossa; Michel Godin; Radin TAHVILDARI; Eric Beamish
Original assignee: The University Of Ottawa
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-03-23
Also published as: AU2015365374A1; EP3828540A1; EP3234571B1; US20170363609A1; EP3234571A1; BR112017012875A2; AU2020267274A1; CA2970627C; JP7124136B2; JP2018508745A; SG10201906952QA; MX2017007833A; EP3234571A4; SG11201704688WA; JP2021089286A; CN107250782A; JP6822960B2; US20200325593A1; EP3828540B1; AU2015365374B2

Abstract

as matrizes de nanoporo são fabricadas por meio de ruptura controlada em membranas de estado sólido integradas nos dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (pdms). essa técnica possibilita a produção escalável de nanoporos independentemente direcionáveis. confinando-se o campo elétrico na arquitetura microfluídica, a fabricação de nanoporo é precisamente localizada e o ruído elétrico é significativamente reduzido durante a captação.

Description

SENSORES DE NANOPORO INTEGRANTES DENTRO DE MATRIZES DE CANAL MICROFLUÍDICO COMO USO DE RUPTURA CONTROLADA

[001] REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório no US 62/094.669, depositado em 19 de dezembro de 2014. A revelação, na íntegra, do pedido acima está incorporada no presente documento a título de referência.

[003] CAMPO

[004] A presente revelação refere-se à fabricação de sensores de nanoporo dentro de canais microfluídicos por meio de ruptura controlada (CBD) em membranas em estado sólido.

[005] ANTECEDENTES

[006] Os nanoporos são, agora, uma classe bem estabelecida de sensores sem rótulos com capacidade de detectar únicas moléculas eletricamente. A técnica conta com a aplicação de uma tensão través de uma abertura em nanoescala em uma membrana isolante e fina imersa em uma solução iônica. A modulação da corrente iônica resultante pode ser associada à translocação das biomoléculas carregadas individuais como DNA e proteínas que são acionadas eletroforeticamente através do nanoporo. Essas alterações na condutância fornecem informações sobre o comprimento, tamanho, carga e formato de moléculas de translocação. Uma variedade de estudos de única molécula, incluindo sequenciamento de DNA, a detecção e o desdobramento de proteína, a espectrometria de massa de única molécula e espectroscopia de força tornam essa tecnologia particularmente atraente.

[007] Os nanoporos podem ser formados incorporando-se poros proteináceos em membranas de bicamada de lipídeo ou fabricados em membranas em estado sólido e finas. Os poros biológicos oferecem propriedades de ruído muito baixo, mas a alta fragilidade da membrana de bicamada de lipídeo convencionalmente usada conforme uma estrutura de suporte limita seu tempo de vida e as tensões que podem ser aplicadas restringindo, desse modo, algumas aplicações. Por outro lado, os nanoporos em estado sólido presentes aumentaram a durabilidade em uma gama mais ampla de condições experimentais, como tensões aplicadas, temperatura e pH, e seu tamanho é ajustável in situ. A princípio, os nanoporos em estado sólido oferecem uma propensão maior a ser integrada nos dispositivos do tipo laboratório em um chip robustos como matrizes. De fato, estudos recentes revelaram várias estratégias de integração, que embutem tais nanoporos nas redes microfluídicas. Os nanoporos usados nessas investigações são tipicamente construídos em uma membrana dielétrica ultrafina (de 10 nm a 50 nm) (por exemplo, SiN) com o uso de feixes de íon ou elétron de alta energia. No entanto, o uso de FIB ou TEM para fabricar nanoporos introduz desafios de integração. A necessidade de acesso por linha de visão direta quando se perfura com feixes de partículas energéticas demanda que os nanoporos sejam fabricados antes de sua integração nos dispositivos microfluídicos. Isso impõe requisitos de alinhamento estrito durante tanto a fabricação de nanoporo quanto a montagem do dispositivo, resultando em desafios que limitam o rendimento dos dispositivos funcionais, particularmente para a formação de matriz em uma única membrana ou quando as dimensões dos canais microfluídicos forem reduzidas a fim de minimizar o ruído elétrico. De modo mais geral, essas técnicas de nanofabricação convencional contam com a produção de nanoporos em um ambiente a vácuo, o que introduz inevitavelmente riscos de manuseio e questões de umedecimento quando em transição para soluções aquosas para experimentos de biocaptação.

[008] Um método alternativo de fabricar nanoporos em estado sólido que conta com o uso de altos campos elétricos foi proposto recentemente e é denominado no presente documento como fabricação de nanoporo por meio de ruptura controlada (CBD). In situ e sob típicas condições de captação biológicas experimentais (por exemplo, em KCl a 1M), um evento de ruptura dielétrica é induzido na membrana isolante intacta de suporte resultante na formação de um único nanoporo com um diâmetro tão pequeno quanto 1 nm de tamanho, mas ajustável à tamanhos grandes com precisão sub nm. A simplicidade do método de CBD está na integração de sensores de nanoporo nas arquiteturas microfluídicas complexas e nos potenciais dispositivos do tipo laboratório em um chip. Combinando-se as capacidades de manuseio e processamento de amostra avançadas inerentes em dispositivos microfluídicos com fabricação de nanoporo in situ espera-se mitigar várias questões de integração e expandir a faixa de aplicações da plataforma de captação. Mais detalhes relacionados a essa técnica de fabricação podem ser encontrados na Publicação de Patente n° US 2015/0108808 que é intitulada “Fabrication of Nanopores using High Electric Fields” e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[009] Essa seção fornece informações antecedentes relacionadas à presente revelação que não são, necessariamente, a técnica anterior.

[010] SUMÁRIO

[011] Essa seção fornece um sumário geral da revelação e não é uma revelação abrangente de todo seu escopo ou todos seus recursos.

[012] Um aparelho é apresentado para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana. O aparelho inclui: um primeiro substrato que tem um microcanal comum formado em uma superfície exposta do primeiro substrato; uma estrutura de suporte disposta sobre a superfície exposta do primeiro substrato e configurada para hospedar uma membrana; um segundo substrato que tem um ou mais canais microfluídicos formados em uma superfície interna do segundo substrato, sendo que o segundo substrato é disposto sobre a estrutura de suporte com a superfície interna voltada para a estrutura de suporte de modo que o um ou mais canais microfluídicos sejam fluidamente separados pela membrana do microcanal comum; e um conjunto de eletrodos que gera um potencial elétrico através da membrana. O conjunto de eletrodos pode incluir um eletrodo de referência posicionado em um lado da membrana e dois ou mais eletrodos adicionais posicionados em um lado oposto da membrana, em que os dois ou mais eletrodos adicionais são dispostos em relação à membrana de modo que o campo elétrico através da membrana seja uniforme. Em algumas modalidades, a grandeza do potencial elétrico através da membrana resulta no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro.

[013] O aparelho inclui adicionalmente: um sensor de corrente eletricamente acoplado a um dos eletrodos e operável para medir a corrente que flui entre um dentre o um ou mais canais microfluídicos e o microcanal comum; e um controlador interfaceado com o sensor de corrente, em que o controlador detecta um aumento abrupto na corrente medida o que indica a formação de um poro e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana.

[014] Em uma modalidade, os dois ou mais eletrodos adicionais incluem um primeiro eletrodo disposto no um ou mais canais microfluídicos a montante da membrana e um segundo eletrodo disposto no um ou mais canais microfluídicos a jusante da membrana.

[015] Em algumas modalidades, uma pluralidade de canais microfluídicos é formada na superfície interna do segundo substrato. Cada microcanal tem um conjunto de eletrodos associado. Desse modo, uma matriz de nanoporos (que corresponde ao número de canais microfluídicos) pode ser fabricada na membrana.

[016] Em outras modalidades, a membrana pode ser disposta diretamente no primeiro substrato sem o uso de uma estrutura de suporte. Em tais modalidades, o conjunto de eletrodos pode incluir dois eletrodos de referência dispostos no microcanal comum, de modo que um dos eletrodos de referência esteja a montante da membrana e o outro eletrodo de referência esteja a jusante da membrana.

[017] Em um outro aspecto desta revelação, uma camada intermediária é disposta diretamente sobre a estrutura de suporte e, então, entre a estrutura de suporte e o segundo substrato. Nesse caso, o aparelho para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana inclui: um primeiro substrato que tem um microcanal comum formado em uma superfície exposta do primeiro substrato; uma estrutura de suporte disposta sobre a superfície exposta do primeiro substrato e configurada para hospedar uma membrana; uma camada intermediária disposta sobre a estrutura de suporte e que tem pelo menos uma via formada na mesma; um segundo substrato que tem um ou mais canais microfluídicos formados em uma superfície interna do segundo substrato, sendo que o segundo substrato é disposto na camada intermediária com a superfície interna voltada para a estrutura de suporte de modo que o um ou mais canais microfluídicos sejam fluidamente separados pela membrana do microcanal comum; e um par de eletrodos disposto nos lados opostos da membrana. O par de eletrodos gera um potencial elétrico através da membrana. A uma ou mais vias na camada intermediária acopla fluidamente o um ou mais canais microfluídicos com uma superfície exposta da membrana e é configurada para criar um campo elétrico que é uniforme na via e ao redor da mesma. Em algumas modalidades, a grandeza do potencial elétrico através da membrana resulta no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro.

[018] O aparelho inclui adicionalmente: um sensor de corrente eletricamente acoplado a um dos eletrodos e operável para medir a corrente que flui entre um dentre o um ou mais canais microfluídicos e o microcanal comum; e um controlador interfaceado com o sensor de corrente, em que o controlador detecta um aumento abrupto na corrente medida o que indica a formação de um poro e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana.

[019] Em algumas modalidades, uma pluralidade de canais microfluídicos é formada na superfície interna do segundo substrato. Cada microcanal tem um conjunto de eletrodos associado. Desse modo, uma matriz de nanoporos (que corresponde ao número de canais microfluídicos) pode ser fabricada na membrana.

[020] Em outras modalidades, a membrana pode ser disposta diretamente no primeiro substrato sem o uso de uma estrutura de suporte. Em tais modalidades, o conjunto de eletrodos pode incluir dois eletrodos de referência dispostos no microcanal comum, de modo que um dos eletrodos de referência esteja a montante da membrana e o outro eletrodo de referência esteja a jusante da membrana.

[021] Em ainda outro aspecto desta revelação, o um ou mais canais microfluídicos são roteados adjacentes à membrana de uma maneira que cria um campo elétrico que é uniforme através da área da membrana e reduz, desse modo, o número de eletrodos necessários. Em uma modalidade, o canal microfluídico forma um laço a jusante do eletrodo disposto no canal, em que uma seção do laço é roteada sobre a membrana.

[022] Em algumas modalidades, uma ou mais válvulas de controle são dispostas no canal microfluídico e opera para controlar a quantidade de fluxo através do canal microfluídico. A válvula de controle pode ser implantada por um polímero elastomérico fluidamente acoplado a uma fonte pneumática e atuado pela mesma.

[023] Em algumas modalidades, uma pluralidade de canais microfluídicos é formada na superfície interna do segundo substrato. Cada microcanal tem um conjunto de eletrodos associado. Desse modo, uma matriz de nanoporos (que corresponde ao número de canais microfluídicos) pode ser fabricada na membrana. Além disso, cada canal microfluídico na matriz de canais microfluídicos passa sobre uma porção da membrana e tem pelo menos duas válvulas de controle dispostas na mesma, uma válvula é disposta a montante da membrana e a outra válvula é disposta a jusante da membrana. Desse modo, o valor do potencial elétrico através da membrana é controlado ajustando-se o fluxo através das válvulas de controle dispostas na matriz de canais microfluídicos.

[024] As áreas de aplicabilidade adicionais se tornarão evidentes a partir da descrição fornecida no presente documento. A descrição e exemplos específicos nesse sumário estão destinados apenas para propósitos de ilustração e não estão destinados a limitar o escopo da presente revelação.

[025] DESENHOS

[026] Os desenhos descritos no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos de modalidades selecionadas e não para todas as implantações possíveis, e não estão destinados a limitar o escopo da presente revelação.

[027] A Figura 1 é um esquemático de um aparelho para fabricar nanoporos com um único eletrodo inserido em qualquer lado da membrana.

[028] As Figuras 2A e 2B são uma vista em corte transversal de uma modalidade exemplificativa do aparelho que tem cinco canais microfluídicos independentes; e imagens ópticas refletidas tiradas de cima do aparelho com os cinco canais microfluídicos situados diretamente na membrana, respectivamente.

[029] As Figuras 3A-3C são esquemáticos que retratam um método de montagem exemplificativo para o aparelho mostrado na Figura 2A;

[030] As Figuras 4A-4C são esquemáticos que retratam diferentes disposições de eletrodo, que podem ser usadas para criar um campo elétrico uniforme através da área superficial da membrana.

[031] A Figura 5A e 5B são uma vista em corte transversal de uma segunda modalidade exemplificativa do aparelho com uma camada de microvia; e imagens ópticas refletidas tiradas de cima do aparelho com cinco canais microfluídicos situados diretamente na membrana, mas isolados da membrana por uma camada de microvia.

[032] As Figuras 6A e 6B são imagens que mostram a modelagem de elemento finito do campo elétrico no aparelho com e sem uma via microfluídica, respectivamente.

[033] As Figuras 6C e 6D são ampliadas em imagens do campo elétrico que circunda o nanoporo mostrado nas Figuras 6A e 6B, respectivamente.

[034] A Figura 6E é um gráfico que retrata a grandeza do campo elétrico medida ao longo do meio caminho plano através da membrana de SiN espessa de 20 nm quando uma diferença de potencial de 10 V for aplicada (como na fabricação de nanoporo).

[035] A Figura 6F é um gráfico que retrata a grandeza do campo elétrico para um aparelho sem uma microvia.

[036] As Figuras 7A e 7B são gráficos que mostram (a) corrente de vazamento através da membrana de SiN alguns segundos antes da fabricação de nanoporo por meio de CBD em 10 V; e (b) Curvas de corrente-tensão (I-V) usadas para inferir o diâmetro do nanoporo com o uso de um modelo baseado em condutância por cinco nanoporos fabricados independentemente em um único dispositivo com cinco canais.

[037] As Figuras 8A e 8B são gráficos que mostram (a) comparação de ruído de densidade espectral de potência (PSD); e (b) traços de corrente, respectivamente, em uma célula macroscópica (preto), dispositivo com cinco canais (azul) e dispositivo com cinco canais com microvias (vermelho). Todas as medições foram realizadas na ausência de qualquer nanoporo fabricado sem tensão aplicada, amostrado em 250 kHz e com filtro passa-baixa a 100 kHz por um filtro de Bessel de 4 polos em KCl a 1 M, pH 7,5.

[038] As Figuras 9A e 9B são plotagens de dispersão do bloqueio de corrente médio normalizado (0% que representa um poro totalmente aberto, e 100% de um poro totalmente bloqueado) em função da duração de evento total de (a) detecção de α-trombina humana com o uso de um poro de 10, 5 nm para tensão aplicada de -200 mV, e (b) translocação de 10-kb dsDNA através de um poro de 11,5 nm a -200 mV (quadrados pretos), -250 mV (triângulos vermelhos) e -300 mV (círculos azuis), respectivamente. Cada ponto de dados representa um único evento. As inserções mostram bloqueios de corrente transiente à medida que as biomoléculas interagem com o nanoporo. Por questão de clareza os dados foram multiplicados por -1 nas inserções.

[039] As Figuras 10A e 10B são vistas em corte transversal de uma válvula pneumática micromecânica exemplificativa sem e com pressão aplicada ao canal de controle, respectivamente.

[040] A Figura 11 é uma vista superior esquemática de um dispositivo de matriz 5x1 com cinco pares de válvulas pneumáticas e que emprega um único par de eletrodos.

[041] A Figura 12 é uma vista superior esquemática de um dispositivo de matriz 5x1 que emprega dois eletrodos superiores.

[042] A Figura 13 é uma vista superior esquemática de um dispositivo de matriz 2x1 com dois pares de válvulas pneumáticas e dois eletrodos superiores.

[043] As referências numéricas correspondentes indicam partes correspondentes ao longo de diversas vistas dos desenhos.

[044] DESCRIÇÃO DETALHADA

[045] As modalidades exemplificativas serão descritas, agora, mais completamente com referência aos desenhos anexos.

[046] A Figura 1 retrata um aparelho 10 para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana 12. O aparelho é compreendido, em geral, por um (primeiro) substrato superior 14, um (segundo) substrato inferior 15, e uma estrutura de suporte 16 disposta entre os substratos superior e inferior 14,15. A estrutura de suporte 16 é configurada para hospedar uma membrana dielétrica fina 12 que define superfícies planas opostas 13. Para fins de ilustração, um único canal microfluídico 4 é formado no substrato superior 14 e um canal microfluídico comum maior 5 é formado substrato inferior 15. Um par de eletrodos 17 eletricamente acoplado a uma fonte de tensão 18 é usado para gerar um potencial elétrico através da membrana; com um único eletrodo colocado em casa canal microfluídico 4, 5. Conforme será descrito abaixo, o aparelho pode ter mais canais microfluídicos com disposições de eletrodo divergentes.

[047] O aparelho 10 inclui adicionalmente um sensor de corrente (não mostrado) eletricamente acoplado a um dos eletrodos e um controlador 19 interfaceado com o sensor de corrente e a fonte de tensão 18. Durante a operação, o sensor de corrente mede correntes que flui através da membrana. O controlador 19, por sua vez, detecta um aumento abrupto na corrente medida e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana conforme será descrito adicionalmente abaixo.

[048] As Figuras 2A e 2B retratam adicionalmente uma modalidade exemplificativa do aparelho 10’. Nessa modalidade exemplificativa, os chips de silício comercialmente disponíveis (por exemplo, tamanho da armação de 3 mm) que possuem uma membrana de SiN espessa de 500×500 µm2 , 20 nm exposta (SiMPore Inc. SN100-A20Q05) serve como a estrutura de suporte 16 e foram montados entre as matrizes de canal microfluídico de arquiteturas diferentes. Com referência à Figura 2A, o aparelho 10’ apresentado no presente documento utilizou geometrias que contêm cinco canais microfluídicos independentemente direcionáveis 21 em um lado da membrana 12, enquanto o outro lado da membrana 12 foi acessado por um único microcanal comum 22. Mais especificamente, o aparelho 10’ incluiu uma matriz de cinco canais microfluídicos independentes 21 que consistem em canais amplos com 200 µm de largura (50 µm de altura) que se afunila através da membrana 12 para uma largura de 15 µm conforme melhor visto na Figura 2B. Cada um dos cinco canais independentes 21 é separado dos outros por 25 µm. Embora cinco canais microfluídicos independentes sejam mostrados nessa modalidade, é prontamente compreendido que mais ou menos canais microfluídicos podem ser formados em outras modalidades.

[049] Na modalidade exemplificativa, cada camada foi fabricada por meio de litografia macia com o uso de polidimetilsiloxano PDMS (Sylgard 184 da Dow Corning em uma razão de 7:1 (p/p)), padronizada a partir de um molde mestre preparado por meio de fotolitografia macia. Em todas as configurações, a camada inferior consistiu em uma camada de ~3 mm de espessura de PDMS que contém um único canal fluídico 22 de 250 µm de largura por 100 µm de altura ligado a uma lâmina de vidro (ligação de plasma de oxigênio, AutoGlow Research). A fim de permitir o acesso fluídico aos nanoporos, um furo de 2 mm foi furado a mão através desse microcanal inferior comum 22 através do qual o lado cauterizado do chip de silício foi assentado. Uma camada fina (100 ±10 µm) de PDMS foi, então, revestida por centrifugação ao redor do chip 16 para compensar a espessura do chip de silício e para deixar uma superfície vedada e macia na qual os múltiplos canais microfluídicos poderiam estar ligados. Após o revestimento por centrifugação, essa camada de PDMS fina foi curada em uma chapa quente a 80 °C por 20 minutos.

[050] As Figuras 3A-3C ilustram adicionalmente esse processo de fabricação. Os dispositivos apresentados integram as membranas de nitreto de silício (SiN) comercialmente disponíveis (SN100-A20Q05, SiMPore Inc.) nos dispositivos microfluídicos produzidos a partir de polidimetilsiloxano (PDMS). As camadas de PDMS foram replicadas a partir de um molde mestre fabricado por meio de litografia macia e produzidas a partir de SU8-2050 fotorresistente (Microchem Inc.) em uma pastilha de silício. Cada camada microfluídica (via microfluídica, camadas de canal independentes e comuns) foi fabricada com o uso de diferentes velocidades de centrifugação, tempo e temperatura de cozimento, exposição à UV e tempos de desenvolvimento que que dependem da espessura final desejada (altura) dos recursos resultantes.

[051] Seguindo a fabricação de cada molde mestre, as pastilhas foram, primeiro, tratadas com aminossilano para facilitar a remoção de PDMS. PDMS (7:1 (p/p) base:agente de cura para todas as camadas) foi, então, despejado sobre o molde mestre para cada camada de canal, seguido pela desgaseificação em uma câmara a vácuo por 30 minutos e cozimento a 80 °C por 2 horas. O PDMS curado foi, então, retirado do molde para criar a estrutura de microcanal. Os componentes de dispositivo individuais foram, então, recortados e os furos de acesso para a introdução de fluido e eletrodo foram perfurados através dos canais independentes (0,75 mm de OD para tubulação fluídica e 1,25 mm de OD para eletrodos). Um furo de 2,0 mm também foi perfurado a mão no meio do microcanal comum para permitir o acesso fluídico ao fundo do chip. Com referência à Figura 3A, o chip de silício (lado cauterizado) foi, então, ligado à camada de canal comum sobre o furo perfurado com o uso de plasma de oxigênio (Glow Research AutoGlow). Todas as etapas de ligação de plasma foram realizadas em 30 W por 30 segundos.

[052] A fim de compensar a espessura do chip de silício e deixar uma superfície nivelada, macia para a ligação dos canais independentes (superiores) em ambas as configurações (com e sem camadas de via microfluídica), uma camada fina (~100 ± 10 µm) de PDMS foi girada ao redor do chip (5 s a 500 rpm seguido por 10 s a 1.000 rpm). Essa camada fina foi curada diretamente em uma chapa quente a 80 °C por 20 minutos.

[053] A fim de permitir o acesso fluídico e elétrico aos canais microfluídicos, os furos foram perfurados através de cada um dos canais comuns superiores e inferiores separados fluidicamente antes da ligação para acomodar o encaixe justo de eletrodos de Ag/AgCl e tubulação de PEEK com fluxo de solução de eletrólito (ou iônica). Colocando-se os eletrodos ~5 mm do centro da membrana, a resistência do microcanal que leva até o nanoporo é limitada a ~100 kΩ em solução de eletrólito de KCl a 1 M, menos de ~1% da resistência elétrica total de um dispositivo que contém um nanoporo com um diâmetro de 10 nm. Por fim, o canal comum foi ligado a uma lâmina de vidro limpa. Enquanto se faz referência a uma técnica de fabricação específica, compreende-se que outras técnicas de litografia também estão dentro do escopo desta revelação.

[054] Imediatamente antes de introduzir a solução de eletrólito nos canais microfluídicos, o dispositivo montado foi tratado com plasma de oxigênio por 5 minutos a 70 W para aumentar a hidrofilicidade de microcanal. Os canais microfluídicos foram, então, conectados aos frascos de amostra com tubulação de polietileno e o fluxo foi iniciado pressurizando-se os frascos com o uso de reguladores de pressão de alta precisão. A vedação eficaz (˃10 GΩ) entre canais microfluídicos foi testada antes da fabricação de nanoporo fluindo-se a solução de KCl a 1 M (pH 7,5) e tentando-se medir a corrente iônica entre canais microfluídicos sob uma tensão moderada aplicada (por exemplo, 0,2 V a 1 V).

[055] A fim de aprimorar a funcionalidade do aparelho, os contaminantes e monômeros devem ser removidos do material microfluídico usado para produzir o aparelho. Em particular, pedaços de polidimetilsiloxano (PDMS) devem ser quimicamente tratados com solventes antes da montagem do dispositivo e tratamentos de plasma podem ser usados para remover contaminantes na superfície da membrana como resultado da integração de microfluídica.

[056] De acordo com um aspecto desta revelação, o posicionamento de eletrodo nos canais microfluídicos deve resultar em um campo elétrico uniforme sobre a área da membrana isolante. Vários posicionamentos de eletrodo podem ser usados dependendo da arquitetura microfluídica conforme visto nas Figuras 4A a 4D. No caso de um único microcanal estendido sobre a fina membrana isolante, um único par de eletrodos posicionado em qualquer lado da membrana, em algum lugar abaixo do comprimento de canais microfluídicos, irá produzir um campo elétrico não uniforme através da superfície da membrana. No entanto, a colocação de dois eletrodos polarizados no mesmo potencial elétrico, no mesmo canal microfluídico, mas em ambos os lados da membrana (isto é, um eletrodo a montante da membrana enquanto o outro eletrodo está a jusante da membrana), pode aumentar a uniformidade de campo elétrico conforme melhor visto na Figura 4A. Nesse exemplo, um conjunto de eletrodos 30 é usado para gerar um potencial elétrico através da membrana 12. O conjunto de eletrodos 30 inclui um eletrodo de referência 33 posicionado abaixo da membrana e dois ou mais eletrodos adicionais 32 posicionados acima da membrana. Mais especificamente, os dois eletrodos 32 são posicionados no canal microfluídico do substrato superior; enquanto, o eletrodo de referência 33 é posicionado no canal microfluídico comum do substrato inferior. Os dois eletrodos adicionais 32 são dispostos em relação à membrana de modo que o campo elétrico através da membrana seja uniforme. Por exemplo, um dos eletrodos adicionais 32 pode ser disposto a montante da membrana enquanto o outro dos eletrodos adicionais 32 pode estar disposto a jusante da membrana. Outros posicionamentos para os dois eletrodos adicionais também são contemplados por essa revelação.

[057] Com referência à Figura 2A, o lado inferior da estrutura de suporte 16 inclui uma reentrância afunilada 13 que ajuda a moldar o campo elétrico de uma maneira uniforme, semelhantemente ao papel desempenhado pela via e, desse modo, possibilita o uso de um único eletrodo de referência 33.

[058] Em algumas modalidades, a membrana 12 pode ser colocada diretamente sobre e sustentada pelo substrato inferior 15 sem o uso de uma estrutura de suporte 16. Nessas modalidades, um segundo eletrodo de referência 33 pode ser colocado no lado de baixo da membrana conforme visto na Figura 4C. Em particular, um dos eletrodos de referência 33 é disposto a montante da membrana enquanto o outro dos dois eletrodos de referência 33 pode ser disposto a jusante da membrana. Desse modo, os dois eletrodos de referência 33 funcionam para moldar o campo de eletrodo próximo da membrana de uma maneira uniforme.

[059] A Figura 4B retrata uma disposição de eletrodo alternativa. Nessa disposição, um único eletrodo 35 está posicionado dentro de um canal microfluídico em laço 36 que contém solução iônica para obter um campo elétrico semelhantemente uniforme através da superfície da membrana. O canal microfluídico 36 forma um laço a jusante do eletrodo 35 e uma seção do laço é roteada sobre a membrana. A válvula em tal aparelho é pressurizada, fechando o canal de fluxo inferior. Durante o processo de fabricação de nanoporo, a pressão da válvula será liberada (o canal microfluídico é aberto). Desse modo, a presença da solução de eletrólito através do canal com laço moldará o campo elétrico de uma maneira uniforme. Essa configuração é escalonável para diversos canais microfluídicos com o uso de tecnologia de microválvula (por exemplo, conforme visto na Figura 11). Nessa disposição alternativa, compreende-se que o único eletrodo de referência 33 pode ser posicionado sob a membrana conforme descrito em relação à Figura 4A ou dois eletrodos de referência podem ser usados conforme descrito em relação à Figura 4B.

[060] Os microeletrodos também podem ser padronizados nos canais microfluídicos para obter campos elétricos semelhantemente uniformes. Esses eletrodos padronizados em relação à superfície, mantidos no mesmo potencial, podem ser posicionados conforme descrito acima para resultar em um campo elétrico uniforme. Os eletrodos circulares centralizados ao redor da membrana isolante podem garantir também a uniformidade de campo. Um único microeletrodo padronizado pode ser padronizado diretamente acima da membrana isolante ou dentro de cada canal microfluídico individual. Tais eletrodos padronizados em relação à superfície seriam especificamente benéficos em chips personalizados em que as matrizes de grande escala de nanoporo podem se formar. Outras variantes para disposições de eletrodo que resultam em um campo elétrico uniforme também são contempladas por esta revelação.

[061] Em um outro aspecto desta revelação, as microvias podem ser adicionadas ao sistema microfluídico para ajudar a moldar o campo elétrico na via e ao redor da mesma. As Figuras 5A e 5B retratam uma segunda modalidade exemplificativa do aparelho 10’’. Nessa modalidade, o aparelho é novamente compreendido de um substrato superior 14, um substrato inferior 15 e uma estrutura de suporte 16 disposta entre os substratos superior e inferior. A estrutura de suporte 16 é igualmente configurada para hospedar uma membrana dielétrica fina 12 que define superfícies planas opostas 13. Nessa modalidade, uma camada intermediária 19 é formada sobre a estrutura de suporte 16 e disposta entre o substrato superior 14 e a estrutura de suporte 16. Uma ou mais vias 51 podem ser formadas na camada intermediária 19 e configuradas para criar um campo elétrico que é uniforme na via e ao redor da mesma.

[062] Essa segunda configuração microfluídica foi projetada para localizar a formação de nanoporo por meio de CBD em cada microcanal no centro da membrana, e reduzir adicionalmente o ruído elétrico de alta frequência minimizando-se a área da membrana exposta à solução iônica. Nessa segunda configuração, uma camada espessa de 200 µm de PDMS com uma matriz de aberturas retangulares, que variam em comprimento de 40 µm a 120 µm com uma largura constante de 15 µm, foi usada para formar vias microfluídicas que ligam os canais microfluídicos a uma área bem definida sobre o centro da membrana. Para fabricar camadas de via microfluídica finas (200 µm) nas quais os canais independentes poderiam estar ligados, o PDMS desgaseificado foi centrifugado em seu molde mestre (5 s a 500 rpm seguido por 10 s a 800 rpm) e curado diretamente em uma chapa quente a 80 °C por 30 minutos. A fim de situar precisamente as vias microfluídicas e camadas de canal independentes sobre a membrana de SiN, toda as etapas de alinhamento foram realizadas com o uso de um alinhador de máscara OAI DUV/NUV (Modelo 206). Essa camada foi então ligada à matriz de cinco canais microfluídicos de PDMS independentes como no projeto inicial. Exceto conforme notado acima, a segunda modalidade do aparelho 10’’ foi fabricada da mesma maneira que aquela descrita em relação às Figuras 3A a 3C.

[063] A fim de compreender os efeitos de adicionar uma camada de microvia à configuração microfluídica, a modelagem de elemento finito do campo elétrico em ambas as geometrias do dispositivo (com e sem uma via microfluídica) foi explorada. As configurações do dispositivo foram geradas em 2D e os campos elétricos foram moldados com o uso de um estudo estacionário no módulo de Correntes Elétricas de COMSOL Multiphysics Modeling Software. Ambas as geometrias foram examinadas primeiro com uma membrana intacta (nenhuma conexão aquosa através da membrana) e, então, com um nanoporo (conduto fluídico de 20 nm através da membrana).

[064] As Figuras 6A e 6B mostram a geometria de um dispositivo com um microcanal independente colocado diretamente na membrana; e um dispositivo que contém uma via microfluídica, respectivamente. Ambos os dispositivos contêm um poro de 20 nm no centro da membrana. Uma ampliação da área que circunda o nanoporo na Figura 6D mostra que o campo elétrico nas redondezas imediatas do nanoporo na configuração da via microfluídica é relativamente uniforme através da membrana e do poro. Isso é realçado pelo fato de que a intensidade do campo elétrico decai uniformemente em direção oposta ao nanoporo em qualquer lado da membrana. Ademais, as linhas de campo elétrico são simétricas da esquerda para a direita apesar do fato de que ambos os eletrodos são colocados 3 mm para a esquerda do nanoporo. Inversamente, a Figura 6C mostra que as linhas de campo elétrico são um tanto não uniformes sob as mesmas condições em um dispositivo sem uma via microfluídica. Tanto as linhas de campo elétrico quanto uma intensidade de campo diferem tanto através da membrana quanto da esquerda para a direita no microcanal (superior) independente.

[065] A investigação adicional do formato do campo elétrico nessas configurações mostra que a fabricação de nanoporo com o uso de CBD também pode ser afetada pela colocação assimétrica de eletrodos. A Figura 6E mostra a grandeza do campo elétrico através de um corte transversal horizontal de uma membrana intacta em dispositivos com e sem vias microfluídicas. Nesse exemplo, uma diferença de potencial de 10 V foi aplicada através da membrana a fim de simular as condições de fabricação de nanoporo usadas na prática. Embora o dispositivo que contém uma via microfluídica exiba um campo elétrico uniforme através do comprimento da membrana exposta, o dispositivo em que o microcanal (superior) independente é colocado diretamente na membrana exibe um campo elétrico mais forte mais próximo do lado em que os eletrodos são colocados.

[066] Para ambas as modalidades exemplificativas, os nanoporos individuais foram fabricados induzindo-se um evento de ruptura dielétrica distinto em cada um dos canais microfluídicos independentes integrados sobre a membrana. Brevemente, isso foi feito aplicando-se campos elétricos altos com o uso de conjunto de circuitos eletrônicos personalizados. Uma diferença de potencial que varia de 10 V a 14 V foi aplicada a um dos canais microfluídicos independentes em relação ao microcanal comum aterrado para fabricar um nanoporo em minutos ou segundos. A grandeza do potencial elétrico através da membrana resulta no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro. Essa diferença de potencial também induziu uma corrente de vazamento através da membrana de SiN, que é monitorada em tempo real (consulte a Figura 7A). A formação de um único nanoporo é detectada pelo aumento repentino e abrupto da corrente de vazamento passado um limite predefinido, por meio da qual a tensão aplicada foi recortada com um tempo de resposta de 0,1 s. Embora a corrente-limite e o tempo de resposta possam ser variados para obter um tamanho de nanoporo resultante desejado que segue o evento de ruptura, aqueles discutidos no presente documento tinham, tipicamente, sub-2 nm de diâmetro (condições de corte justas). Esse processo é, então, repetido em cada microcanal superior fluidicamente separado resultando em nanoporos independentemente direcionáveis em uma única membrana, mas localizados em diferentes canais microfluídicos. Seguindo-se a fabricação de nanoporo, as medições sensíveis para caracterização elétrica e captação de única molécula foram realizadas com o uso de um amplificador de corrente de baixo ruído Axopatch 200B (Molecular Devices).

[067] A fim de obter nanoporos do tamanho desejado para a detecção de biomoléculas específicas, cada nanoporo foi fabricado conforme descrito acima e, então, condicionados com o uso de campos elétricos altos moldados pela aplicação de pulsos alternantes de -5 V e +5 V através da membrana. Esse tratamento foi usado para otimizar as propriedades de ruído elétrico e rejuvenescer os nanoporos entupidos para experimentos adicionais com resultados comparáveis àqueles relatados em estudos anteriores que usaram reservatórios fluídicos macroscópicos. Mais detalhes em relação a essa técnica de condicionamento podem ser encontrados na Publicação de Patente n° US 2015/0109008 que é intitulada “Method for Controlling the Size of Solid-State Nanopores” e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[068] Para inferir o diâmetro de cada nanoporo fabricado por CBD, sua condutância G foi medida diretamente na solução monitorando-se a corrente iônica que passa através de cada nanoporo conforme uma diferença de potencial aplicada foi varrida de -200 mV para +200 mV. Supondo-se uma geometria cilíndrica e justificando-se a resistência ao acesso,30 o diâmetro eficaz, d, do nanoporo pode ser calculado a partir de sua condutância pela relação a seguir:

[069] Na Eq. 1, σ é a condutividade total do eletrólito e L é o comprimento eficaz do nanoporo, suposto como igual à espessura nominal da membrana de SiN. As curvas de corrente e tensão (I-V) na Figura 2(c) exibem uma resposta ôhmica em KCl a 1 M pH 7,5 (σ = 10,1 ± 0,1 Sm-1) para cinco nanoporos independentemente formados que variam em tamanho de 3 nm a 10 nm em um único dispositivo com cinco canais. O erro incorrido ao ignorar a contribuição da carga da superfície na equação 1 afeta a precisão do diâmetro do nanoporo calculado eficaz por ˂0,5 nm para as altas concentrações de sal usadas aqui, enquanto o erro atribuído aos valores da condutividade de eletrólito e da espessura da membrana afeta a incerteza do diâmetro de nanoporo por ~0,3 nm.

[070] Para caracterizar ainda mais o desempenho, as plotagens de densidade espectral de potência (PSDs) da corrente iônica foram adquiridas para nanoporos fabricados em cada uma das duas arquiteturas microfluídicas (consulte a Figura 8A). Embora o ruído de baixa frequência (abaixo de 1 kHz) seja tipicamente do tipo 1/f, o ruído de frequência maior é regulado pelas propriedades dielétricas e a capacitância do dispositivo que surge da área superficial exposta à solução de eletrólito. Desse modo, minimizando-se a superfície exposta à solução leva a uma redução nesse ruído de alta frequência, que aprimora significativamente a razão de sinal para ruído durante a captação de biomolécula em largura de banda alta. Isso é ilustrado na Figura 8A, em que ambos os dispositivos de 5 canais (com e sem microvias) são comparados a um chip de nanoporo montado entre reservatórios fluídicos em uma célula macrofluídica padrão. Nessa faixa de alta frequência, o dispositivo microfluídico de 5 canais (sem a microvia) exibe características de ruído comparáveis àquelas adquiridas na célula macroscópica. Esse resultado é consistente com o argumento de que o ruído nesse regime surge da quantidade da área de membrana exposta calculada para ser ~3×105 µm2 para o reservatório macroscópico e ~2×105 µm2 para um microcanal no dispositivo de 5 canais padrão. No entanto, quando a área da membrana exposta for reduzida 350 vezes para ~6×102 µm2 com o uso da menor microvia (40×15 µm2 ) do dispositivo de 5 canais, o ruído de alta frequência é significativamente reduzido. Essa redução de ruído é adicionalmente realçada pelos traços de corrente iônica de linha de base de cada dispositivo enquanto nenhuma tensão aplicada é mostrada na Figura 8B, em que o ruído de pico a pico na largura de banda de 100 kHz é reduzido por um fator de 2 (5 em largura de banda de 10 kHz) na configuração com microvias, enquanto o ruído de RMS é reduzido por um fator de 7 em largura de banda de 10 kHz e 2 em largura de banda de 100 kHz.

[071] Com referência à Figuras 9A e 9B, a funcionalidade desses dispositivos foi avaliada observando-se a translocação de biomoléculas. Em cada caso, os nanoporos foram, primeiro, fabricados e ampliados até um diâmetro desejado conforme descrito acima. Seguindo-se a introdução de amostra, o fluxo foi minimizado nos canais microfluídicos desligando-se os reguladores de pressão. A Figura 9A mostra uma plotagem de dispersão dos bloqueios de condutância e durações à medida que as moléculas de α-trombina humana individuais (Haematological Technologies, Inc.) em concentração a 250 µM são detectadas com o uso de um nanoporo de 10,5 nm em um canal microfluídico (sem vias) em KCl a 1 M pH 8,0. No presente documento, as moléculas de proteína foram carregadas em um dos cinco canais microfluídicos superiores independentes, que foi polarizado a -200 mV em relação ao canal inferior comum aterrado. Em geral, mais de 5.000 eventos individuais foram observados. A Figura 9B mostra uma plotagem de dispersão semelhante de eventos de translocação de DNA através de um nanoporo de 11,5 nm diferente, que estava localizado dentro de um microcanal que incluía uma microvia. No presente documento, uma solução a 3 pM de 10 kbp de dsDNA em KCl a 2 M pH 10 foi adicionada ao microcanal superior enquanto polarizações de -200 mV, -250 mV e -300 mV foram aplicadas em relação ao canal comum, resultando em mais de 1.500 eventos de translocação. Vale notar que as grandezas dos bloqueios de condutância obtidos para ambos os eventos de proteína e de dsDNA de único nível, estão de acordo com os modelos relatados e os experimentos que utilizam as células macrofluídicas padrão.

[072] O projeto microfluídico deve ser considerado cuidadosamente quando se integram nanoporos com o uso dessa abordagem. Embora os nanoporos integrados nos canais microfluídicos colocados diretamente na membrana (sem uma microvia) tiveram capacidade de capturar e detectar amostras proteináceas em 30% dos dispositivos testados (9 de 30), a eficácia de captura e o rendimento experimental de dispositivos com capacidade de demonstrar translocação de ácido nucleico foram notavelmente reduzidos. No presente documento, os critérios usados para definir o rendimento experimental é um dispositivo com capacidade de detectar mais de 1.000 eventos de translocação biomolecular. É importante notar que a colocação dos eletrodos dentro de canais microfluídicos leva ao fato de a membrana introduzir não uniformidade no campo elétrico na membrana e perto do nanoporo quando o microcanal superior contiver apenas um único eletrodo. É possível que essa assimetria resulte na fabricação de um nanoporo perto da borda da membrana (perto da borda do chip de suporte de silício), uma região que pode ser mais tensionada mediante ligação com a camada de microcanal de PDMS. Nessa região, as características de carga da superfície da membrana nas redondezas do nanoporo podem impedir, eletrostaticamente, a translocação de polímeros de ácido nucleico altamente carregados enquanto permite a passagem de polipeptídeos menos carregados. A introdução de uma microvia, no entanto, localiza a fabricação de nanoporo até uma região pretendida no centro da membrana ou em direção oposta às bordas e garante um campo elétrico mais simétrico, rendimento para 3 de 4 dispositivos testados em pH 10. Também é possível reduzir essa assimetria no campo elétrico incorporando-se os pares de eletrodos polarizados no mesmo potencial, nos canais superiores independentes em qualquer lado da membrana conforme descrito acima. Nessa configuração, 5 de 6 dispositivos testados em pH 8 foram bem-sucedidos na detecção de pelo menos 1.000 eventos de translocação biomolecular.

[073] Em ainda um outro aspecto desta revelação, a tecnologia de microválvulas pode desempenhar um papel na obtenção de integração microfluídica em grande escala. O desenvolvimento de microválvulas funcionalmente confiáveis também é uma etapa importante no sentido de miniaturização e comercialização bem-sucedidas de sistemas microfluídicos totalmente automatizados. As microválvulas são usadas para controlar o fluxo de fluido e a rota da corrente elétrica/iônica por toda a rede microfluídica. Várias abordagens como parafuso, válvulas pneumáticas e solenoides podem ser usadas para integrar válvulas nos dispositivos microfluídicos.

[074] A Figura 11 retrata uma modalidade exemplificativa do aparelho 110 que emprega a tecnologia de microválvula pneumática. O aparelho é compreendido, em geral, de um substrato superior, um substrato inferior, uma estrutura de suporte disposta entre os substratos superior e inferior, e também pode incluir uma camada de via intermediária, conforme descrito nas modalidades estabelecidas acima. Nessa modalidade exemplificativa, cinco canais microfluídicos 112 se formam no substrato superior. Novamente, mais ou menos canais microfluídicos podem ser formados em outras modalidades.

[075] Os canais microfluídicos 112 são roteados adjacentes à membrana de uma maneira que crie um campo elétrico que é uniforme através da área da membrana. Por exemplo, cada canal microfluídico 112 forma um laço a jusante de um eletrodo 116 em que uma seção do laço é roteada sobre a membrana. Diferentes disposições de laço fechado que fazem com que as linhas de campo elétrico de dois lados opostos da membrana estejam dentro do escopo desta revelação.

[076] As válvulas de controle 114 também são dispostas nos canais microfluídicos 112 e operam para controlar a trajetória eletricamente condutiva definida pelas válvulas abertas e fechadas dentro dos canais. Em uma modalidade exemplificativa, os canais microfluídicos 112 são embutidos em um polímero elastomérico para obter microválvulas pneumáticas. Essas válvulas são tipicamente fabricadas em duas camadas com o uso de técnicas de litografia macia. Com referência à Figuras 10A e 10B, a válvula é composta de duas camadas, que são separadas com uma camada muito fina de membrana conforme indicado em 108 na Figura 10A. Uma camada (camada de fluxo) 106 tem canais para escoar fluidos. A membrana fina de separação deflete no canal microfluídico quando os canais de controle (válvulas) na outra camada (camada de controle) 107 são pressurizados pelo ar ou água conforme visto na Figura 10B. Isso irá parar o fluxo de fluido (eletrólito líquido) e, consequentemente, uma vedação pode ser obtida. A quantidade pela qual um canal de fluxo é fechado está relacionada à impedância elétrica que a válvula irá impor na rede elétrica. Por exemplo, um canal de fluxo completamente fechado pode ter ˃10 GΩ de impedância (o valor preciso dependerá da condutividade de eletrólito e da geometria de válvula), isolando efetivamente essa região da rede microfluídica.

[077] Retornando para a Figura 11, cada um dos cinco canais microfluídicos 112 tem pelo menos duas válvulas 114 dispostas nos mesmos, em que uma válvula está disposta em cada lado da membrana. Adicionalmente, cada válvula 114 é fluidamente acoplada e acionada por uma fonte pneumática (não mostrada). Controlando-se o grau que cada grupo de válvulas fecha um canal microfluídico 112, as válvulas 114 podem agir como resistores variáveis em um divisor de tensão. Desse modo, as válvulas podem ser usadas para rotear o potencial elétrico através de canais microfluídicos selecionados para produzir um campo elétrico que é uniforme ao longo da área da membrana.

[078] A inclusão de microválvulas pneumáticas é um modo prático de obter a integração microfluídica em grande escala. É um método robusto para controle independente em chip, o valor do potencial elétrico através da membrana em cada um dos microcanais com alguns eletrodos. As microválvulas atuam como divisores de tensão (fornecendo ˃10 GΩ de vedações de resistência em um microcanal) que permitem o controle preciso do campo elétrico através de várias regiões da membrana. Esse controle é essencial para a escalabilidade e a funcionalidade de dispositivos em que: se concede a habilidade de direcionar qualquer quantidade de nanoporos para fabricação, controlar o tamanho e captação com um único par de eletrodos posicionado em algum lugar nos canais fluídicos em cada lado da membrana; pode ser usado para redirecionar o potencial elétrico para produzir um campo elétrico uniforme ao longo do comprimento da membrana em um microcanal específico (um recurso importante para a captação biomolecular) com o uso de um único par de eletrodos; é necessário para a fabricação de matriz e captação nos dispositivos que contêm um microcanal comum (um recurso necessário para a sondagem serial e paralela de uma única amostra com o uso de múltiplos nanoporos); permite a rápida troca de soluções que contêm vários solventes, intensidades iônicas, pHs ou analitos, facilitando a fabricação e captação; e resistores fluídicos e elétricos variáveis para a fabricação em chip e captação biomolecular. Notase, também, que a retenção da hidrofobicidade do corte transversal das válvulas e dos canais é crítica para obter a vedação com alta resistência usada no controle da grandeza e uniformidade de campo elétrico através da membrana durante a fabricação e a captação. Isso é obtido tratando-se quimicamente cada camada do dispositivo antes da montagem, eliminando-se o requisito de tratamento com plasma da membrana para remover contaminantes que deixariam o corte transversal da válvula hidrofílico.

[079] O controle dessas válvulas resistivas pode ser usado para impor as condições específicas de potencial elétrico em locais diferentes dentro da rede microfluídica com o uso de um número reduzido de eletrodos. Nessa modalidade, um único par de eletrodos pode ser usado. Os eletrodos 116 são posicionados nos canais microfluídicos em qualquer lado da membrana (apenas o eletrodo superior é mostrado na Figura 11, mas um eletrodo inferior é semelhantemente posicionado abaixo da membrana). Exceto pela diferença descrita acima, o aparelho 110 é semelhante ao aparelho descrito em relação às Figuras 2A.

[080] As Figuras 12 e 13 retratam outras modalidades exemplificativas do aparelho que emprega a tecnologia de microválvula pneumática. Na Figura 12, o aparelho 120 é semelhante ao aparelho 110, mas inclui adicionalmente uma válvula de roteamento 121 e um segundo eletrodo superior 116. Durante a operação, a válvula de roteamento 121 permanece fechada, para que a solução iônica flua através dos canais para a membrana 12 tanto do lado direito quanto do lado esquerdo da membrana conforme visto na Figura. A válvula de roteamento 121 em efeito cria dois subsistemas microfluídicos. Um eletrodo é colocado a montante de onde o canal se divide em cinco canais microfluídicos separados em cada um dos dois subsistemas microfluídicos.

[081] A Figura 13 retrata um aparelho semelhante 130, mas que tem apenas dois canais microfluídicos 112. Igualmente, os dois eletrodos superiores são posicionados em cada lado da membrana e os dois canais microfluídicos passam sobre uma porção da membrana. Duas válvulas de controle 114 são dispostas em cada canal microfluídico 112, um a montante da membrana e um a jusante da membrana. Exceto para a diferença descrita acima, esses dois aparelhos 120, 130 são semelhantes ao aparelho descrito em relação às Figuras 11.

[082] A descrição supracitada das modalidades foi fornecida para propósitos de ilustração e descrição. A mesma não é destinada a ser excludente ou limitar a revelação. Os elementos ou características individuais de uma modalidade em particular são, geralmente, não limitados para aquela modalidade em particular, mas, quando aplicável, são intercambiáveis e podem ser usados em uma modalidade selecionada, mesmo se não mostrado ou descrito especificamente. O mesmo também pode ser variado de muitas maneiras. Tais variações não devem ser consideradas como um desvio da revelação e todas as tais modificações são destinadas a serem incluídas dentro do escopo da revelação.

[083] A terminologia usada no presente documento tem como propósito descrever modalidades específicas apenas e não se destina a ser limitante. Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma" e "o" e "a" podem se destinar a incluir as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Os termos "compreende", "que compreende", “que inclui” e “que tem” são inclusivos e, portanto, especificam a presença de recursos estabelecidos, números inteiros, etapas, operações, elementos e/ou componentes, mas não excluem a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, operações, elementos, componentes e/ou grupos dos mesmos. As etapas, processos e operações de método descritos no presente documento não devem ser interpretados como necessariamente exigindo seu desempenho na ordem específica discutida ou ilustrada, a menos que especificamente identificados como uma ordem de desempenho. Deve-se compreender também que as etapas adicionais ou alternativas podem ser empregadas.

[084] Quando se faz referência a um elemento ou uma camada como estando "sobre", “engatado a”, "conectado a" ou "acoplado a" outro elemento ou camada, o mesmo pode estar diretamente sobre, engatado, conectado ou acoplado ao outro elemento ou camada ou elementos ou camadas intervenientes podem estar presentes. Em contrapartida, quando se faz referência a um elemento como estando "diretamente sobre", “diretamente engatado a”, "diretamente conectado a" ou "diretamente acoplado a" outro elemento ou camada, pode não haver elementos ou camadas intervenientes presentes. Outros termos usados para descrever a relação entre elementos devem ser interpretados em uma maneira semelhante (por exemplo, “entre” em função de “diretamente entre”, “adjacente” em função de “diretamente adjacente” etc.). Conforme usado no presente documento, o termo “e/ou” inclui qualquer uma e todas as combinações de um ou mais dos itens listados associados.

[085] Embora os termos primeiro, segundo, terceiro, etc. possam ser usados no presente documento para descrever diversos elementos, componentes, regiões, camadas e/ou seções, esses elementos, componentes, regiões, camadas e/ou seções não devem ser limitados por esses termos. Esses termos podem ser apenas usados para distinguir um elemento, componente, região, camada ou seção de outra região, camada ou seção. Os termos como “primeiro”, “segundo” e outros termos numéricos quando usados no presente documento não implicam uma sequência ou ordem a menos que seja claramente indicado pelo contexto. Desse modo, um primeiro elemento, componente, região, camada ou seção discutidos abaixo poderia ser denominado um segundo elemento, componente, região, camada ou seção sem se afastar dos ensinamentos das modalidades exemplificativas.

[086] Os termos espacialmente relacionados, como "interno", "externo", "sob", "abaixo", "inferior", "sobre", "superior" e semelhantes, podem ser usados no presente documento para facilitar a descrição de um elemento ou relação do recurso com outro elemento (ou elementos) ou recurso (ou recursos) conforme ilustrado nas Figuras. Os termos espacialmente relacionados podem se destinar a abranger orientações diferentes do dispositivo em uso ou operação além da orientação retratada nas Figuras. Por exemplo, se o dispositivo nas Figuras for virado, os elementos descritos como “abaixo” ou “sob” outros elementos ou recursos seriam, então, orientados “sobre” os outros elementos ou recursos. Desse modo, o termo exemplificativo "abaixo" pode abranger uma orientação tanto acima quanto abaixo. O dispositivo pode ser orientado de outro modo (girado 90 graus ou em outras orientações) e os descritores espacialmente relacionados usados no presente documento são interpretados em conformidade.

Claims

Aparelho para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana, em que a membrana define superfícies planas opostas e é compreendida de pelo menos uma camada dielétrica caracterizado por compreender:
um primeiro substrato que tem um microcanal comum formado em uma superfície exposta do primeiro substrato;
uma estrutura de suporte disposta sobre a superfície exposta do primeiro substrato e configurada para hospedar uma membrana;
um segundo substrato que tem um ou mais canais microfluídicos formados em uma superfície interna do segundo substrato, sendo que o segundo substrato é disposto sobre a estrutura de suporte com a superfície interna voltada para a estrutura de suporte de modo que o um ou mais canais microfluídicos sejam fluidamente separados pela membrana do microcanal comum;
um conjunto de eletrodos incluindo um eletrodo de referência posicionado em um lado da membrana e dois ou mais eletrodos adicionais posicionados em um lado oposto da membrana, em que o conjunto de eletrodos gera um potencial elétrico através da membrana entre o eletrodo de referência em um lado da membrana e os dois ou mais eletrodos adicionais no lado oposto da membrana e em que os dois ou mais eletrodos adicionais são dispostos em relação à membrana de modo que o campo elétrico através da membrana seja simétrico em relação ao plano perpendicular à superfície planar da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a grandeza do potencial elétrico através da membrana resultar no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente:
um sensor de corrente eletricamente acoplado a um dos eletrodos e operável para medir a corrente que flui entre um dentre o um ou mais canais microfluídicos e o microcanal comum; e
um controlador interfaceado com o sensor de corrente, em que o controlador detecta um aumento abrupto na corrente medida que indica a formação de um poro através da membrana e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os dois ou mais eletrodos adicionais incluírem um primeiro eletrodo disposto no um ou mais canais microfluídicos a montante da membrana e um segundo eletrodo disposto no um ou mais canais microfluídicos a jusante da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o conjunto de eletrodos incluir dois eletrodos de referência dispostos no microcanal comum, de modo que um dos eletrodos de referência esteja a montante da membrana e o outro eletrodo de referência esteja a jusante da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estrutura de suporte incluir adicionalmente uma reentrância afunilada formada em uma área adjacente à membrana e fluidamente acoplada ao microcanal comum no primeiro substrato.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente múltiplos conjuntos de eletrodos e uma pluralidade de canais microfluídicos formados na superfície interna do segundo substrato, em que cada microcanal na pluralidade de canais microfluídicos tem um conjunto de eletrodos associado.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma camada intermediária disposta diretamente sobre a estrutura de suporte e disposta entre a estrutura de suporte e o segundo substrato, sendo que a camada intermediária tem pelo menos uma via formada na mesma e configurada para criar um campo elétrico que é uniforme próximo da via.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o um ou mais canais microfluídicos terem dimensão na ordem de mícrons.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o um ou mais canais microfluídicos terem dimensão na ordem de nanômetros.
Aparelho para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana, em que a membrana define superfícies planas opostas e é compreendida de pelo menos uma camada dielétrica caracterizado por compreender:
um primeiro substrato que tem um microcanal comum formado em uma superfície exposta do primeiro substrato;
uma estrutura de suporte disposta sobre a superfície exposta do primeiro substrato e configurada para hospedar uma membrana;
uma camada intermediária disposta sobre a estrutura de suporte e que tem pelo menos uma via formada na mesma;
um segundo substrato que tem dois ou mais canais microfluídicos formados em uma superfície interna do segundo substrato, sendo que o segundo substrato é disposto na camada intermediária com a superfície interna do segundo substrato voltada para a estrutura de suporte de modo que os dois ou mais canais microfluídicos sejam fluidamente separados pela membrana do microcanal comum;
um par de eletrodos dispostos nos lados opostos da membrana, em que o par de eletrodos gera um potencial elétrico através da membrana, tal qual um eletrodo do par de eletrodos é disposto no microcanal comum e o outro eletrodo do par de eletrodos é disposto em um dos dois ou mais canais microfluídicos, em que pelo menos uma via na camada intermediária acopla fluidamente os dois ou mais canais microfluídicos com uma superfície exposta da membrana e é configurada para criar um campo elétrico que é uniforme a medida que alcança a membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a grandeza do potencial elétrico através da membrana resultar no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender adicionalmente:
um sensor de corrente eletricamente acoplado a um dos eletrodos e operável para medir a corrente que flui entre um dentre o um ou mais canais microfluídicos e o microcanal comum; e
um controlador interfaceado com o sensor de corrente, em que o controlador detecta um aumento abrupto na corrente medida que indica a formação de um poro e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a profundidade da pelo menos uma via ser maior que o diâmetro da pelo menos uma via.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o segundo substrato incluir uma matriz de canais microfluídicos formada na superfície interna do mesmo e a camada intermediária incluir uma pluralidade de vias, de modo que cada via na pluralidade de vias se alinhe com um dos canais microfluídicos na matriz de canais microfluídicos.
Aparelho para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana caracterizado por compreender:
um primeiro substrato que tem um microcanal comum formado em uma superfície exposta do primeiro substrato;
uma membrana disposta sobre a superfície exposta do primeiro substrato, em que a membrana define superfícies planas opostas e é compreendida de pelo menos uma camada dielétrica;
um segundo substrato que tem um ou mais canais microfluídicos formados em uma superfície interna do segundo substrato, sendo que o segundo substrato é disposto na membrana com a superfície interna voltada para a membrana de modo que o um ou mais canais microfluídicos sejam fluidamente separados pela membrana do microcanal comum;
um conjunto de eletrodos incluindo dois eletrodos de referência posicionados em um lado da membrana e dois eletrodos adicionais posicionados em um lado oposto da membrana, em que o conjunto de eletrodos gera um potencial elétrico através da membrana e são dispostos em relação à membrana de modo que o campo elétrico através da membrana seja simétrico em relação ao plano perpendicular à superfície planar da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a grandeza do potencial elétrico através da membrana resultar no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente:
um sensor de corrente eletricamente acoplado a um dos eletrodos e operável para medir a corrente que flui entre um dentre o um ou mais canais microfluídicos e o microcanal comum; e
um controlador interfaceado com o sensor de corrente, em que o controlador detecta um aumento abrupto na corrente medida que indica a formação de um poro e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por os dois eletrodos adicionais incluírem um primeiro eletrodo disposto no um ou mais canais microfluídicos a montante da membrana e um segundo eletrodo disposto no um ou mais canais microfluídicos a jusante da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por os dois eletrodos de referência serem dispostos no microcanal comum, de modo que um dos eletrodos de referência esteja a montante da membrana e o outro eletrodo de referência esteja a jusante da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente uma pluralidade de canais microfluídicos formada na superfície interna do segundo substrato e múltiplos conjuntos de eletrodos, em que cada microcanal na pluralidade de canais microfluídicos tem um conjunto de eletrodos associado.
Aparelho para fabricar um ou mais nanoporos em uma membrana caracterizado por compreender:
um primeiro substrato que tem um microcanal comum formado em uma superfície exposta do primeiro substrato;
uma membrana disposta sobre a superfície exposta do primeiro substrato, em que a membrana define superfícies planas opostas e é compreendida de pelo menos uma camada dielétrica;
uma camada intermediária disposta na membrana e que tem pelo menos uma via formada na mesma;
um segundo substrato que tem dois ou mais canais microfluídicos formados em uma superfície interna do segundo substrato, sendo que o segundo substrato é disposto na camada intermediária com a superfície interna voltada para a estrutura de suporte de modo que os dois ou mais canais microfluídicos sejam fluidamente separados pela membrana do microcanal comum;
um par de eletrodos dispostos nos lados opostos da membrana, em que o par de eletrodos gera um potencial elétrico através da membrana e a pelo menos uma via na camada intermediária acopla fluidamente os dois ou mais canais microfluídicos com uma superfície exposta da membrana e é configurada para criar um campo elétrico que é uniforme na via ou ao redor da mesma.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a grandeza do potencial elétrico através da membrana resultar no campo elétrico que tem um valor maior que 0,1 volt por nanômetro.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por compreender adicionalmente:
um sensor de corrente eletricamente acoplado a um dos eletrodos e operável para medir a corrente que flui entre um dentre o um ou mais canais microfluídicos e o microcanal comum; e
um controlador interfaceado com o sensor de corrente, em que o controlador detecta um aumento abrupto na corrente medida que indica a formação de um poro e, em resposta à detecção do aumento abrupto na corrente medida, remove o potencial elétrico aplicado através da membrana.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a profundidade da pelo menos uma via ser maior que o diâmetro da pelo menos uma via.
Aparelho, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o segundo substrato incluir uma matriz de canais microfluídicos formada na superfície interna do mesmo e a camada intermediária incluir uma pluralidade de vias, de modo que cada via na pluralidade de vias se alinhe com um dos canais microfluídicos na matriz de canais microfluídicos.