BR112017010065A2 - method for detecting a genetic polymorphism associated with susceptibility or resistance of a tick, c-dna isolated nucleic acid molecule, amplified polynucleotide, use of an isolated nucleic acid molecule or amplified polynucleotide, use of genetic markers and kit for determination of the susceptibility of a tick to amitraz - Google Patents
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Abstract
a invenção provê um método para detectar um polimorfismo genético associado com suscetibilidade, ou resistência de um ectoparasita a um acaricida, o método compreendendo a etapa de triagem de uma amostra de dna do ectoparasita quanto à presença de um ou mais marcadores no gene receptor octopamina/tiramina.The invention provides a method for detecting a genetic polymorphism associated with susceptibility or resistance of an ectoparasite to an acaricide, the method comprising the step of screening an ectoparasite DNA sample for the presence of one or more markers in the octopamine / receptor gene. tyramine.
Description
Método para Detectar um Polimorfismo Genético Associado com SUSCETIBILIDADE OU RESISTÊNCIA DE UM CARRAPATO, POLINUCLEOTÍDEO Amplificado, Uso de Uma Molécula de Ácido Nucleico Isolado ou UM POLINUCLEOTÍDEO AMPLIFICADO, USO DE MARCADORES GENÉTICOS E Kit Para Determinação da Suscetibilidade de Um Carrapato ao AmitrazMethod for Detecting a Genetic Polymorphism Associated with SUSCETIBILITY OR STRENGTH OF A TICK, Amplified POLYNUCLEOTIDE, Use of an Isolated Nucleic Acid Molecule or AN AMPLIFIED POLYNUCLEOTIDE, USE OF GENETIC MARKERS AND Kit for Determining the Susceptibility of a Tick to a Tick
Campo da Invenção [0001] Essa invenção refere-se ao controle de ectoparasitas. Mais particularmente, a invenção refere-se a um método de identificação de resistência ao amitraz em um ectoparasita, para polimorfismos/marcadores genéticos associados com tal resistência e para sequências de nucleotídeo úteis para detectar tais marcadores de resistência.Field of Invention [0001] This invention relates to the control of ectoparasites. More particularly, the invention relates to a method of identifying resistance to amitraz in an ectoparasite, for polymorphisms / genetic markers associated with such resistance and for nucleotide sequences useful for detecting such resistance markers.
Histórico da Invenção [0002] O carrapato Rhipicephalus microplus (form alm ente Boophilus microplus) é um ectoparasita amplamente invasivo de grande importância econômica devido ao efeito negativo que ele tem na pecuária agrícola em uma escala global. As doenças transmitidas pelo carrapato (babesiose e anaplasmose) transmitidas por R. microplus são alarmantes já que diminuem a qualidade da pecuária. Na África subsaariana, o gado representa uma fonte maior de carne e leite, mas essa região do mundo é gravemente afetada pelo carrapato Rhipicephalus microplus. O método principal para controle de carrapato é o uso de acaricidas químicos, notavelmente amitraz, que foi implementado na década de 1990 após surgir resistência a outros acaricidas. Entretanto, a eficácia do controle químico é impedida por um aumento na frequência de alelos de resistência mutante para amitraz em populações de carrapato. Presentemente, a única maneira de avaliar a resistência ao amitraz é por meio de teste de pacote de larvas, mas essa técnica é demorada e não particularmente rentável.History of the Invention [0002] The Rhipicephalus microplus tick (form of Boophilus microplus) is a widely invasive ectoparasite of great economic importance due to the negative effect it has on agricultural livestock on a global scale. The diseases transmitted by the tick (babesiosis and anaplasmosis) transmitted by R. microplus are alarming since they reduce the quality of livestock. In sub-Saharan Africa, cattle represent a greater source of meat and milk, but this region of the world is severely affected by the tick Rhipicephalus microplus. The main method for tick control is the use of chemical mites, notably amitraz, which was implemented in the 1990s after resistance to other mites. However, the effectiveness of chemical control is hindered by an increase in the frequency of mutant resistance alleles for amitraz in tick populations. At present, the only way to assess resistance to amitraz is by testing the larval pack, but this technique is time-consuming and not particularly cost-effective.
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2/42 [0003] Os carrapatos Rhipicephalus microplus são ectoparasitas hematófagos de importância veterinária e são capazes de parasitar uma variedade de hospedeiros, embora o gado seja sua preferência primária (Walker et al. 2003). Esses carrapatos são especialistas na transmissão de uma variedade de doenças transmitidas pelo carrapato ao gado, mais notavelmente Babesia bovis, que causa babesiose asiática ou água vermelha (Walker et al. 2003; Horak, Golezardv, Uvs 2007). A falta de estratégias eficazes de controle de carrapato e programas de gerenciamento resulta em um grave fardo econômico, ameaçando a sustentabilidade da indústria de pecuária na África do Sul e globalmente. O uso de acaricidas químicos ainda é o método mais preferido para controle de carrapato, mas se tornou menos eficaz devido ao surgimento de resistência. Até o momento, a resistência foi relatada para todas as classes principais de acaricidas, incluindo piretróides sintéticos (He et al. 1999; Aguilar-Tipacamú et al. 2008; Chen et al. 2009; Morgan et al. 2009; Jonsson et al. 2010a), organofosfatos e carbamatos (Guerrero, Pruett, Li 2003; Li, Davey, George 2005; Guerrero, Lovis, Martins 2012), formamidinas (Soberanes et al. 2002; Fernández-Salasa, RodríguezVivas, Alonso-Díaza 2012; Guerrero, Lovis, Martins 2012) e lactonas macrocíclicas (Pohl et al. 2011; Fernández-Salasa, Rodríguez-Vivas, AlonsoDíaza 2012; Fernández-Salasa et al. 2012). A resistência aos acaricidas foi atribuída à insensibilidade de local de destino, bem como desintoxicação metabólica, dependendo do modo de ação do acaricida.2/42 [0003] Rhipicephalus microplus ticks are hematophagous ectoparasites of veterinary importance and are capable of parasitizing a variety of hosts, although cattle are their primary preference (Walker et al. 2003). These ticks are specialists in transmitting a variety of tick-borne diseases to cattle, most notably Babesia bovis, which causes Asian babesiosis or red water (Walker et al. 2003; Horak, Golezardv, Uvs 2007). The lack of effective tick control strategies and management programs results in a serious economic burden, threatening the sustainability of the livestock industry in South Africa and globally. The use of chemical acaricides is still the most preferred method for tick control, but it has become less effective due to the emergence of resistance. So far, resistance has been reported for all major classes of acaricides, including synthetic pyrethroids (He et al. 1999; Aguilar-Tipacamú et al. 2008; Chen et al. 2009; Morgan et al. 2009; Jonsson et al. 2010a), organophosphates and carbamates (Guerrero, Pruett, Li 2003; Li, Davey, George 2005; Guerrero, Lovis, Martins 2012), formamidines (Soberanes et al. 2002; Fernández-Salasa, RodríguezVivas, Alonso-Díaza 2012; Guerrero, Lovis, Martins 2012) and macrocyclic lactones (Pohl et al. 2011; Fernández-Salasa, Rodríguez-Vivas, AlonsoDíaza 2012; Fernández-Salasa et al. 2012). Resistance to acaricides was attributed to insensitivity to the destination, as well as metabolic detoxification, depending on the mode of action of the acaricide.
[0004] Os carrapatos de Rhipicephalus microplus adquiriram a habilidade de evitar os efeitos tóxicos de acaricidas químicos pelo desenvolvimento de diferentes mecanismos de resistência. A cutícula que envolve o carrapato, que reduz o acesso do acaricida ao ambiente interno do corpo do carrapato, confere resistência à penetração. Entretanto, outras investigações nesse tipo de resistência em R. microplus não foram relatadas desde 1983 (Schnitzerling, Nolan, Hughes 1983). Um mecanismo de resistência adicional comum em artrópodes é insensibilidade de local de destino. Esse mecanismo adaptativo[0004] Rhipicephalus microplus ticks have acquired the ability to avoid the toxic effects of chemical acaricides by developing different resistance mechanisms. The cuticle that surrounds the tick, which reduces the acaricide's access to the internal environment of the tick's body, provides resistance to penetration. However, other investigations into this type of resistance in R. microplus have not been reported since 1983 (Schnitzerling, Nolan, Hughes 1983). An additional mechanism of resistance common in arthropods is destination insensitivity. This adaptive mechanism
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3/42 envolve a alteração do local de destino do fármaco no nível de DNA pela alteração do alelo tipo selvagem para uma forma mutante, que torna o tratamento acaricida ineficaz. Por último, a resistência metabólica ao tratamento com acaricida envolve a habilidade aumentada de desintoxicar ou sequestrar o acaricida. Isso envolve o aumento das enzimas de desintoxicação comuns incluindo citocromo P450s, esterases e glutationa-S-transferases (Guerrero, Lovis, Martins 2012). Todos os mecanismos mencionados acima mostraram desempenhar um papel vital na resistência do carrapato aos acaricidas químicos.3/42 involves changing the drug's destination site at the DNA level by changing the wild-type allele to a mutant form, which makes the acaricidal treatment ineffective. Finally, metabolic resistance to acaricide treatment involves the increased ability to detoxify or sequester the acaricide. This involves increasing common detoxification enzymes including cytochrome P450s, esterases and glutathione-S-transferases (Guerrero, Lovis, Martins 2012). All of the mechanisms mentioned above have been shown to play a vital role in the tick's resistance to chemical acaricides.
[0005] Amitraz é um acaricida de formamidina, que é extensivamente usado para controle de carrapato na África do Sul. O local de destino para amitraz em R. microplus ainda não foi definido, o que, em última instância, atrasa qualquer desenvolvimento adicional com relação aos ensaios de triagem para diagnóstico. Foi proposto que monoamina oxidase, alfa-2-adrenoceptores e o receptor octopamina são bons candidatos para locais de destino potenciais, com o último sendo o mais provável em carrapatos (Jonsson, Hope 2007). Pensa-se que o amitraz é um agonista potencial do sistema octopaminérgico localizado no carrapato sinaganglion. Foi mostrado que na presença de amitraz, o receptor octopamina é ativado e sua superestimulação nas sinapses tem efeitos letais no carrapato (Booth 1989; Lees, Bowman 2007). Os receptores octopaminérgicos foram classificados em três classes distintas a saber tipo α-adrenérgicos (aOCT), tipo β-adrenérgicos (βΟΟΤ), e octopamina/tiramina (OCT/Tyr) ou tiraminérgicos (Evans, Maqueira 2005).[0005] Amitraz is a formamidine acaricide, which is used extensively for tick control in South Africa. The destination location for amitraz in R. microplus has not yet been defined, which ultimately delays any further development with regarding screening tests for diagnosis. It has been proposed that monoamine oxidase, alpha-2-adrenoceptors and the octopamine receptor are good candidates for potential target sites, with the latter being the most likely in ticks (Jonsson, Hope 2007). Amitraz is thought to be a potential agonist of the octopaminergic system located in the synaganglion tick. It has been shown that in the presence of amitraz, the octopamine receptor is activated and its over-stimulation at synapses has lethal effects on the tick (Booth 1989; Lees, Bowman 2007). Octopaminergic receptors have been classified into three distinct classes namely α-adrenergic (aOCT), β-adrenergic (βΟΟΤ), and octopamine / tyramine (OCT / Tyr) or tyramaminergic (Evans, Maqueira 2005).
[0006] A resistência ao amitraz é complexa e sugere-se que seja de natureza multigênica, envolvendo herança recessiva de alelos de resistência (Li et al. 2004; Li et al. 2005; Fraqoso-Sanchez et al. 2011). Até o momento, não foram mostrados mecanismos de resistência adequada contra amitraz para R. microplus, mas vários desses mecanismos foram sugeridos. Li et al. (2004) ilustraram, por meio de estudos sinérgicos com inibidores de enzima, que desintoxicação metabólica desempenha um papel na resistência ao amitraz.[0006] Resistance to amitraz is complex and it is suggested to be of a multigenic nature, involving recessive inheritance of resistance alleles (Li et al. 2004; Li et al. 2005; Fraqoso-Sanchez et al. 2011). So far, mechanisms of adequate resistance against amitraz for R. microplus have not been shown, but several of these mechanisms have been suggested. Li et al. (2004) illustrated, through synergistic studies with enzyme inhibitors, that metabolic detoxification plays a role in resistance to amitraz.
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Entretanto, esses resultados foram variáveis através de diferentes cepas de R. microplus, e as contribuições gerais de enzimas de desintoxicação foram difíceis de avaliar. Foi confirmado que a cepa de carrapato Pesqueria Mexicana transmite resistência metabólica ao amitraz pelo aumento de glutationa-Stransferase (Saldivar et al. 2008). Ainda foi sugerido que a insensibilidade de local de destino talvez podería ser o mecanismo principal de resistência ao amitraz. Infelizmente, estudos conclusivos para ilustrar esse mecanismo não foram bem sucedidos (Fraqoso-Sanchez et al. 2011; Guerrero, Lovis, Martins 2012).However, these results were variable across different strains of R. microplus, and the overall contributions of detoxification enzymes were difficult to assess. It was confirmed that the Pesqueria Mexicana tick strain transmits metabolic resistance to amitraz by increasing glutathione-Stransferase (Saldivar et al. 2008). It has also been suggested that destination site insensitivity could perhaps be the main mechanism of resistance to amitraz. Unfortunately, conclusive studies to illustrate this mechanism have not been successful (Fraqoso-Sanchez et al. 2011; Guerrero, Lovis, Martins 2012).
[0007] Baxter, Barker (1999) sequenciou o receptor de octopamina putativa de uma cepa australiana resistente ao amitraz e suscetível ao R. microplus. A análise de sequência não revelou diferenciação entre os dois. Foi proposto mais tarde que dois polimorfismos de nucleotídeo únicos (SNPs) no receptor de octopamina foram ligados à resistência ao amitraz (Chen, He, Davev 2007). Entretanto, esses SNPs foram inferidos apenas pelo alinhamento de sequência entre uma cepa australiana suscetível, a cepa suscetível American Gonzalez e a cepa resistente Santa Luiza (Chen, He, Davev 2007). Ο sequenciamento do gene de receptor de octopamina dessas cepas revelou 37 SNPs, dos quais nove foram substituições não sinônimas. Sete desses foram atribuídos a diferenças geográficas entre as cepas, enquanto os dois SNPs restantes foram potencialmente ligados à resistência ao amitraz. Esses dois SNPs ocorrem na posição 8 do aminoácido (treonina para prolina) e 22 (leucina para serina) da proteína do receptor octopamina (Chen, He, Davev 2007). Estudos recentes indicaram então que o trabalho anterior foi realizado provavelmente em um receptor do tipo OCT/Tyr, em vez do receptor octopamina nativo (Corley, Piper, Jonsson 2012). Isso consequentemente levou à descoberta de um SNP (I61F) no receptor de octopamina tipo βadrenérgico de R. microplus (Corley et al. 2013). Esse SNP em particular foi localizado apenas na região central de Queensland (Austrália) e ausente nas regiões norte e sudeste, minimizando, assim, sua probabilidade de ser a razão[0007] Baxter, Barker (1999) sequenced the putative octopamine receptor of an Australian strain resistant to amitraz and susceptible to R. microplus. Sequence analysis revealed no differentiation between the two. It was later proposed that two unique nucleotide polymorphisms (SNPs) at the octopamine receptor were linked to resistance to amitraz (Chen, He, Davev 2007). However, these SNPs were inferred only by the sequence alignment between a susceptible Australian strain, the susceptible American Gonzalez strain and the resistant strain Santa Luiza (Chen, He, Davev 2007). Sequencing the octopamine receptor gene for these strains revealed 37 SNPs, of which nine were non-synonymous substitutions. Seven of these were attributed to geographical differences between the strains, while the remaining two SNPs were potentially linked to resistance to amitraz. These two SNPs occur at position 8 of the amino acid (threonine to proline) and 22 (leucine to serine) of the octopamine receptor protein (Chen, He, Davev 2007). Recent studies then indicated that the previous work was probably carried out on an OCT / Tyr type receptor, instead of the native octopamine receptor (Corley, Piper, Jonsson 2012). This consequently led to the discovery of a SNP (I61F) in the R. microplus βadrenergic octopamine receptor (Corley et al. 2013). This particular SNP was located only in central Queensland (Australia) and absent in the north and southeast regions, thus minimizing its probability of being the reason
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5/42 principal para a resistência ao amitraz na Austrália. Atualmente, a única maneira de avaliar de forma eficaz a resistência ao amitraz é por meio de testes de pacote de larvas (LPTs) (Stone, Havdock 1962); entretanto, esses ensaios são limitados em praticidade, já que levam aproximadamente seis semanas para se obter os resultados.5/42 major for resistance to amitraz in Australia. Currently, the only way to effectively assess resistance to amitraz is through packet larvae tests (LPTs) (Stone, Havdock 1962); however, these trials are limited in practicality, as they take approximately six weeks to obtain the results.
[0008] Todas as referências às sequências de DNA de carrapato e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) se referem às sequências de nucleotídeo da região de codificação apenas, posições de regiões não codificantes são excluídas.[0008] All references to tick DNA sequences and single nucleotide polymorphisms (SNPs) refer to the nucleotide sequences of the coding region only, positions of non-coding regions are excluded.
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6/42 [0015] Chen, AC, H He, RB Davey. 2007. Mutations in a putative octopamine receptor gene in amitraz-resistant cattle ticks. Veterinary Parasitology 148:379-383.6/42 [0015] Chen, AC, H He, RB Davey. 2007. Mutations in a putative octopamine receptor gene in amitraz-resistant cattle ticks. Veterinary Parasitology 148: 379-383.
[0016] Chen, AC, H He, KB Temeyer, S Jones, P Green, SC Barker. 2009. A Survey of Rhipicephalus microplus Populations for Mutations Associated With Pyrethroid Resistance. J Econ Entomol 102:373-380.[0016] Chen, AC, H He, KB Temeyer, S Jones, P Green, SC Barker. 2009. A Survey of Rhipicephalus microplus Populations for Mutations Associated With Pyrethroid Resistance. J Econ Entomol 102: 373-380.
[0017] Corley, SW, NN Jonsson, EK Piper, C Cutullè, MJ Stear, JM Seddon. 2013. Mutation in the RrrfiAOR gene is associated with amitraz resistance in the cattle tick Rhipicephalus microplus. PNAS 110:16772-16777.[0017] Corley, SW, NN Jonsson, EK Piper, C Cutullè, MJ Stear, JM Seddon. 2013. Mutation in the RrrfiAOR gene is associated with amitraz resistance in the cattle tick Rhipicephalus microplus. PNAS 110: 16772-16777.
[0018] Corley, SW, EK Piper, NN Jonsson. 2012. Generation of fulllength cDNAs for eight putative GPCnR from the cattle tick, R. microplus using a targeted degenerate PCR and sequencing strategy. . Pios One 7:e32480.[0018] Corley, SW, EK Piper, NN Jonsson. 2012. Generation of full length cDNAs for eight putative GPCnR from the cattle tick, R. microplus using a targeted degenerate PCR and sequencing strategy. . Pios One 7: e32480.
[0019] Evans, PD, B Maqueira. 2005. Insect octopamine receptors: a new classification scheme based on studies of cloned Drosophila G-protein coupled receptors. Invertebrate Neuroscience 5:111-118.[0019] Evans, PD, B Maqueira. 2005. Insect octopamine receptors: a new classification scheme based on studies of cloned Drosophila G-protein coupled receptors. Invertebrate Neuroscience 5: 111-118.
[0020] Farooqui, T. 2012. Review of octopamine in insect nervous systems. Insect Physiology 4:1-17.[0020] Farooqui, T. 2012. Review of octopamine in insect nervous systems. Insect Physiology 4: 1-17.
[0021] Faza, AP, IS Pinto, I Fonseca, GR Antunes, CM Monteiro, E Daemon, S Muniz Mde, MF Martins, J Furlong, MC Prata. 2013. A new approach to characterization of the resistance of populations of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) to organophosphate and pyrethroid in the state of Minas Gerais, Brazil. Experimental Parasitology 134:519-523.[0021] Faza, AP, IS Pinto, I Fonseca, GR Antunes, CM Monteiro, E Daemon, S Muniz Mde, MF Martins, J Furlong, MC Prata. 2013. A new approach to characterization of the resistance of populations of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) to organophosphate and pyrethroid in the state of Minas Gerais, Brazil. Experimental Parasitology 134: 519-523.
[0022] Fernández-Salasa, A, Rl Rodriguez-Vivas, MA Alonso-Diaza. 2012. First report of a Rhipicephalus microplus tick population multi-resistant to acaricides and ivermectin in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology 183:338- 342.[0022] Fernández-Salasa, A, Rl Rodriguez-Vivas, MA Alonso-Diaza. 2012. First report of a Rhipicephalus microplus tick population multi-resistant to acaricides and ivermectin in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology 183: 338- 342.
[0023] Fernández-Salasa, A, Rl Rodriguez-Vivas, MA Alonso-Diaza, H Basurto-Camberosa. 2012. Ivermectin resistance status and factors associated in Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) populations from Veracruz, Mexico. Vet Parasitol.[0023] Fernández-Salasa, A, Rl Rodriguez-Vivas, MA Alonso-Diaza, H Basurto-Camberosa. 2012. Ivermectin resistance status and factors associated in Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) populations from Veracruz, Mexico. Vet Parasitol.
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7/42 [0024] Fragoso-Sanchez, Η, Z Garcia-Vazquez, A Tapia-Perez, A OrtizNajera, R Rosario-Cruz, I Rodriguez-Vivas. 2011. Response of Mexican Rhipicephalus (Boophilus) microplus Ticks to Selection by Amitraz and Genetic Analysis of Attained Resistance. Journal of Entomology 8:218-228.7/42 [0024] Fragoso-Sanchez, Η, Z Garcia-Vazquez, A Tapia-Perez, A OrtizNajera, R Rosario-Cruz, I Rodriguez-Vivas. 2011. Response of Mexican Rhipicephalus (Boophilus) microplus Ticks to Selection by Amitraz and Genetic Analysis of Attained Resistance. Journal of Entomology 8: 218-228.
[0025] Gibson, G, SP Muse. 2009. A primer of Genome Science. Sunderland, Massachusetts USA: Sinauer Associates, Inc. Pubishers.[0025] Gibson, G, SP Muse. 2009. A primer of Genome Science. Sunderland, Massachusetts USA: Sinauer Associates, Inc. Pubishers.
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[0033] Hernandez, R, FD Guerrero, JE George, GG Wagner. 2002. Allele frequency and gene expression of a putative carboxylesterase-encoding gene in a pyrethroid resistant strain of the tick Boophilus microplus. Insect Biochemistry and Molecular Biology 32:1009-1016.[0033] Hernandez, R, FD Guerrero, JE George, GG Wagner. 2002. Allele frequency and gene expression of a putative carboxylesterase-encoding gene in a pyrethroid resistant strain of the tick Boophilus microplus. Insect Biochemistry and Molecular Biology 32: 1009-1016.
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8/42 [0034] Holsinger, KE, BS Weir. 2009. Genetics in geographically structured populations: defining, estimating and interpreting FST. Nature Reviews, Genetics 10:639-650.8/42 [0034] Holsinger, KE, BS Weir. 2009. Genetics in geographically structured populations: defining, estimating and interpreting FST. Nature Reviews, Genetics 10: 639-650.
[0035] Horak, IG, H Golezardy, AC Uys. 2007. Ticks associated with the three largest wild ruminant species in southern Africa. Onderstepoort J Vet Res 74:231-242.[0035] Horak, IG, H Golezardy, AC Uys. 2007. Ticks associated with the three largest wild ruminant species in southern Africa. Onderstepoort J Vet Res 74: 231-242.
[0036] Jonsson, NN, C Cutullè, SW Corley, JM Seddon. 2010a. Identification of a mutation in the para-sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus microplus associated with resistance to flumethrin but not to cypermethrin. International Journal for Parasitology 40:1659-1664.[0036] Jonsson, NN, C Cutullè, SW Corley, JM Seddon. 2010a. Identification of a mutation in the para-sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus microplus associated with resistance to flumethrin but not to cypermethrin. International Journal for Parasitology 40: 1659-1664.
[0037] Jonsson, NN, M Hope. 2007. Progress in the epidemiology and diagnosis of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus. Veterinary Parasitology 146:193-198.[0037] Jonsson, NN, M Hope. 2007. Progress in the epidemiology and diagnosis of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus. Veterinary Parasitology 146: 193-198.
[0038] Jonsson, NN, RJ Miller, DH Kemp, A Knowles, AE Ardila, RG Verrail, JT Rothwell. 2010b. Rotation of treatments between spinosad and amitraz for the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus populations with amitraz resistance. Veterinary Parasitology 169:157-164.[0038] Jonsson, NN, RJ Miller, DH Kemp, A Knowles, AE Ardila, RG Verrail, JT Rothwell. 2010b. Rotation of treatments between spinosad and amitraz for the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus populations with amitraz resistance. Veterinary Parasitology 169: 157-164.
[0039] Katoh, Standley. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability, (outlines version 7). Molecular Biology and Evolution 30:772-780.[0039] Katoh, Standley. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability, (outlines version 7). Molecular Biology and Evolution 30: 772-780.
[0040] Kliot, A, M Ghanim. 2012. Fitness costs associated with insecticide resistance. Pest Management Science 68:1431-1437.[0040] Kliot, A, M Ghanim. 2012. Fitness costs associated with insecticide resistance. Pest Management Science 68: 1431-1437.
[0041] Lees, K, AS Bowman. 2007. Tick neurobiology: recent advances and the post-genomic era. Invertebrate Neuroscience 7:183-198.[0041] Lees, K, AS Bowman. 2007. Tick neurobiology: recent advances and the post-genomic era. Invertebrate Neuroscience 7: 183-198.
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[0043] Li, AY, RB Davey, JE George. 2005. Carbaryl Resistance in Mexican Strains of the Southern Cattle Tick (Acari: Ixodidae). J Econ Entomol 98:552-556.[0043] Li, AY, RB Davey, JE George. 2005. Carbaryl Resistance in Mexican Strains of the Southern Cattle Tick (Acari: Ixodidae). J Econ Entomol 98: 552-556.
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9/42 [0044] Li, AY, RB Davey, RJ Miller, JE George. 2004. Detection and Characterization of Amitraz Resistance in the Southern Cattle Tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). JOURNAL OF MEDICAL ENTOMOLOGY 41.9/42 [0044] Li, AY, RB Davey, RJ Miller, JE George. 2004. Detection and Characterization of Amitraz Resistance in the Southern Cattle Tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). JOURNAL OF MEDICAL ENTOMOLOGY 41.
[0045] Li, AY, RB Davey, RJ Miller, JE George. 2005. Mode of inheritance of amitraz resistance in a Brazilian strain of the southern cattle tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Experimental and Applied Acarology 37:183-198.[0045] Li, AY, RB Davey, RJ Miller, JE George. 2005. Mode of inheritance of amitraz resistance in a Brazilian strain of the southern cattle tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Experimental and Applied Acarology 37: 183-198.
[0046] Lyngso, RB, YS Song, J Hein. 2005. Minimum Recombination Histories by Branch and Bound.239-250.[0046] Lyngso, RB, YS Song, J Hein. 2005. Minimum Recombination Histories by Branch and Bound.239-250.
[0047] M’diaye, K, M Bounias. 1991. Sublethal effects of the formamidine amitraz on honeybees gut lipids, following in vivo injections. Biomedical and Environmental Science 4:376-383.[0047] M’diaye, K, M Bounias. 1991. Sublethal effects of the formamidine amitraz on honeybees gut lipids, following in vivo injections. Biomedical and Environmental Science 4: 376-383.
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[0049] Maqueira, B, H Chatwin, PD Evans. 2005. Identification and characterization of a novel family of Drosophila β-adrenergic-like octopamine Gprotein coupled receptors. Journal of Neurochemistry 94:547-560.[0049] Maqueira, B, H Chatwin, PD Evans. 2005. Identification and characterization of a novel family of Drosophila β-adrenergic-like octopamine Gprotein coupled receptors. Journal of Neurochemistry 94: 547-560.
[0050] Morgan, JAT, SW Corley, LA Jackson, AE Lew-Tabor, PM Moolhuijzen, NN Jonsson. 2009. Identification of a mutation in the para-sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus associated with resistance to synthetic pyrethroid acaricides. International Journal for Parasitology 39:775-779.[0050] Morgan, JAT, SW Corley, LA Jackson, AE Lew-Tabor, PM Moolhuijzen, NN Jonsson. 2009. Identification of a mutation in the para-sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus associated with resistance to synthetic pyrethroid acaricides. International Journal for Parasitology 39: 775-779.
[0051] Nachman, MW. 2006. Detecting selection at the molecular level. Evolutionary Genetics, Concepts and Case Studies.[0051] Nachman, MW. 2006. Detecting selection at the molecular level. Evolutionary Genetics, Concepts and Case Studies.
[0052] Paris, M, F Roux, A Bérard, X Reboud. 2008. The effects of the genetic background on herbicide resistance fitness cost and its associated dominance in Arabidopsis thaliana. Heredity (Edinb) 101:499-506.[0052] Paris, M, F Roux, A Bérard, X Reboud. 2008. The effects of the genetic background on herbicide resistance fitness cost and its associated dominance in Arabidopsis thaliana. Heredity (Edinb) 101: 499-506.
[0053] Pohl, PC, GM Klafke, DD Carvalho, JR Martins, S Daffre, IdSV Jr., A Masuda. 2011. ABC transporter efflux pumps: A defense mechanism against[0053] Pohl, PC, GM Klafke, DD Carvalho, JR Martins, S Daffre, IdSV Jr., A Masuda. 2011. ABC transporter efflux pumps: A defense mechanism against
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 14/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 14/71
10/42 ivermectin in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. International Journal for Parasitology 41:1323-1333.10/42 ivermectin in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. International Journal for Parasitology 41: 1323-1333.
[0054] Price, EW, I Carbone. 2005. SNAP: workbench management tool for evolutionary population genetic analysis. Bioinformatics 21:402-404.[0054] Price, EW, I Carbone. 2005. SNAP: workbench management tool for evolutionary population genetic analysis. Bioinformatics 21: 402-404.
[0055] Robb, S, TR Cheek, FL Hannan, LM Hall, JM Midgley, PD Evans. 1994. Agonist-specific coupling of cloned Drosophila octopamine/tyramine receptor to multiple second messenger systems. EMBO Journal 16:1325-1330.[0055] Robb, S, TR Cheek, FL Hannan, LM Hall, JM Midgley, PD Evans. 1994. Agonist-specific coupling of cloned Drosophila octopamine / tyramine receptor to multiple second messenger systems. EMBO Journal 16: 1325-1330.
[0056] Rosado-Aguilar, JA, RI Rodriguez-Vivas, Z Garcia-Vazquez, H Fragoso-Sanchez, A Ortiz-Najera, R Rosario-Cruz. 2008. Development of amitraz resistance in field populations of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) undergoing typical amitraz exposure in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology 152:349-353.[0056] Rosado-Aguilar, JA, RI Rodriguez-Vivas, Z Garcia-Vazquez, H Fragoso-Sanchez, A Ortiz-Najera, R Rosario-Cruz. 2008. Development of amitraz resistance in field populations of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) undergoing typical amitraz exposure in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology 152: 349-353.
[0057] Saldivar, L, FD Guerrero, RJ Miller, KG Bendele, C Gondro, KA Brayton. 2008. Microarray analysis of acaricide-inducible gene expression in the southern cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Insect Molecular Biology 17:597-606.[0057] Saldivar, L, FD Guerrero, RJ Miller, KG Bendele, C Gondro, KA Brayton. 2008. Microarray analysis of acaricide-inducible gene expression in the southern cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Insect Molecular Biology 17: 597-606.
[0058] Schnitzerling, HJ, J Nolan, S Hughes. 1983. Toxicology and metabolism of some synthetic pyrethroids in larvae of susceptible and resistant strains of the cattle tick Boophilus microplus (Can.). Pesticide Science 14:64-72. [0059] Shin, DH, WH Hsu. 1994. Influence of the formamidine pesticide amitraz and its metabolites on porcine myometrial contractility: involvement of alpha 2-adrenoceptors and Ca2+ channels. Toxicology and Applied Pharmacology 128:45-49.[0058] Schnitzerling, HJ, J Nolan, S Hughes. 1983. Toxicology and metabolism of some synthetic pyrethroids in larvae of susceptible and resistant strains of the cattle tick Boophilus microplus (Can.). Pesticide Science 14: 64-72. [0059] Shin, DH, WH Hsu. 1994. Influence of the formamidine pesticide amitraz and its metabolites on porcine myometrial contractility: involvement of alpha 2-adrenoceptors and Ca2 + channels. Toxicology and Applied Pharmacology 128: 45-49.
[0060] Soberanes, N, MS Vargas, HF Sanchez, ZG Vazquez. 2002. First case reported of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus in Mexico. Tecnica Pecuaria en Mexico 40:81-92.[0060] Soberanes, N, MS Vargas, HF Sanchez, ZG Vazquez. 2002. First case reported of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus in Mexico. Tecnica Pecuaria en Mexico 40: 81-92.
[0061] Stone, BF, KP Haydock. 1962. A method for measuring the acaricide susceptibility of the cattle tick Boophilus microplus (Can.). Bulletin of Entomological Research:563-578.[0061] Stone, BF, KP Haydock. 1962. A method for measuring the acaricide susceptibility of the cattle tick Boophilus microplus (Can.). Bulletin of Entomological Research: 563-578.
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 15/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 15/71
11/42 [0062] Walker, AR, A Bouattour, JL Camicas, A Estrada-Pena, IG Horak, AA Latif, RG Pegram, PM Preston. 2003. Ticks of Domestic Animals in Africa: a Guide to Identification of Species. Edinburgh: Bioscience Reports.11/42 [0062] Walker, AR, A Bouattour, JL Camicas, A Estrada-Pena, IG Horak, AA Latif, RG Pegram, PM Preston. 2003. Ticks of Domestic Animals in Africa: a Guide to Identification of Species. Edinburgh: Bioscience Reports.
[0063] Yeh, FC, RC Yang, T Boyle, ZH Ye, JX Mao. 1997. POPGENE: the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Canada.[0063] Yeh, FC, RC Yang, T Boyle, ZH Ye, JX Mao. 1997. POPGENE: the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Center, University of Alberta, Canada.
Sumário da Invenção [0064] Amplamente de acordo com um aspecto da invenção, é provido um método para detectar um polimorfismo genético associado com a suscetibilidade ou resistência de um ectoparasite a um acaricida, o método compreendendo a etapa de triagem de uma amostra de DNA do ectoparasita para a presença de um ou mais marcadores no gene receptor de octopamina/tiramina.Summary of the Invention [0064] Broadly in accordance with one aspect of the invention, a method is provided for detecting a genetic polymorphism associated with the susceptibility or resistance of an ectoparasite to an acaricide, the method comprising the step of screening a DNA sample from ectoparasite for the presence of one or more markers in the octopamine / tyramine receptor gene.
[0065] O método pode incluir uma etapa adicional de determinação de homozigose e heterozigose do ectoparasita.[0065] The method may include an additional step of determining ectoparasite homozygosity and heterozygosity.
[0066] O acaricida pode estar na forma de qualquer um de piretróides, formamidinas ou similares. O acaricida pode estar na forma de amitraz.[0066] The acaricide can be in the form of any of pyrethroids, formamidines or the like. The acaricide can be in the form of amitraz.
[0067] O ectoparasita pode estar na forma de um carrapato. O ectoparasita pode estar na forma de qualquer um de Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus decoloratus ou similares.[0067] Ectoparasite can be in the form of a tick. The ectoparasite can be in the form of any of Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus decoloratus or the like.
[0068] Os um ou mais marcadores podem estar na forma de polimorfismos. Os um ou mais marcadores podem estar na forma de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).[0068] The one or more markers can be in the form of polymorphisms. The one or more markers can be in the form of single nucleotide polymorphisms (SNPs).
[0069] Os marcadores podem estar na forma de qualquer um ou mais de A22C e T65C, em que a presença de qualquer um ou ambos de A22C e T65C está associada com resistência do ectoparasita ao acaricida.[0069] The markers can be in the form of either one or more of A22C and T65C, in which the presence of either or both of A22C and T65C is associated with ectoparasite resistance to the mite killer.
[0070] Os um ou mais marcadores podem incluir qualquer um ou mais de C39T, G41A, G121A, T138C e C159T, em que sua presença está associada com resistência do ectoparasita ao acaricida.[0070] The one or more markers may include any one or more of C39T, G41A, G121A, T138C and C159T, in which their presence is associated with ectoparasite resistance to acaricide.
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 16/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 16/71
12/42 [0071] Os um ou mais marcadores podem incluir qualquer um ou ambos de T36C e G141C, em que a presença de T36C e/ou G141C está associada com suscetibilidade do ectoparasita ao acaricida.12/42 [0071] The one or more markers can include either or both of T36C and G141C, in which the presence of T36C and / or G141C is associated with ectoparasite susceptibility to acaricide.
[0072] A determinação da homozigose e heterozigose de ectoparasites pode incluir a classificação de ectoparasites que têm todos os marcadores associados com resistência, os marcadores sendo polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na forma de A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C e C159T, como ectoparasites resistentes homozigotos e ectoparasites que têm apenas alguns dos marcadores associados com resistência, como ectoparasites heterozigotos.[0072] The determination of ectoparasite homozygosity and heterozygosity may include the classification of ectoparasites that have all markers associated with resistance, the markers being single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the form of A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C and C159T, as homozygous resistant ectoparasites and ectoparasites that have only some of the markers associated with resistance, such as heterozygous ectoparasites.
[0073] O método pode incluir qualquer técnica adequada para determinação de presença ou ausência do um ou mais marcadores na amostra de DNA do ectoparasita, a técnica inclui qualquer um de: mapeamento de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, reações de amplificação, hibridização de ácidos nucleicos para sondas alelo específicas ou matrizes oligonucleotídicas, várias tecnologias de chip, técnicas de sequência de polinucleotídeo e combinações dessas.[0073] The method can include any technique suitable for determining the presence or absence of one or more markers in the ectoparasite DNA sample, the technique includes any of: restriction fragment length polymorphism mapping, amplification reactions, hybridization from nucleic acids to specific allele probes or oligonucleotide arrays, various chip technologies, polynucleotide sequence techniques and combinations thereof.
[0074] O método pode incluir a etapa de submissão da amostra de DNA para amplificação de polinucleotídeo usando um par de iniciadores compreendendo SEQ. ID NO. 1 e SEQ. ID. NO. 2, e fragmentos funcionais, variantes e mutações de cada.[0074] The method can include the step of submitting the DNA sample for polynucleotide amplification using a pair of primers comprising SEQ. ID NO. 1 and SEQ. ID. AT THE. 2, and functional fragments, variants and mutations of each.
[0075] Além disso, de acordo com a invenção, é provido um método de determinação da suscetibilidade, ou o contrário, de um ectoparasita a um acaricida, o método compreendendo as etapas de:[0075] Furthermore, according to the invention, a method of determining the susceptibility, or the reverse, of an ectoparasite to an acaricide, is provided, the method comprising the steps of:
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 17/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 17/71
13/42 extração de uma amostra de DNA do ectoparasita;13/42 extraction of a DNA sample from ectoparasite;
amplificação de uma sequência da amostra de DNA correspondendo a pelo menos parte de uma sequência de codificação de um receptor de octopamina/tiramina do ectoparasita;amplification of a DNA sample sequence corresponding to at least part of an ectoparasite octopamine / tyramine receptor coding sequence;
obtenção de um produto de amplificação; e análise do produto de amplificação para a presença de um ou mais marcadores associados com a suscetibilidade ou resistência do ectoparasita ao acaricida.obtaining an amplification product; and analysis of the amplification product for the presence of one or more markers associated with the susceptibility or resistance of ectoparasite to acaricide.
[0076] O método pode incluir uma etapa adicional de determinação de homozigose e heterozigose dos ectoparasitas.[0076] The method may include an additional step of determining the homozygosity and heterozygosity of ectoparasites.
[0077] O acaricida pode estar na forma de qualquer um dos piretróides, formamidinas e similares. Especificamente, o acaricida pode estar na forma de amitraz.[0077] The acaricide can be in the form of any of the pyrethroids, formamidines and the like. Specifically, the acaricide can be in the form of amitraz.
[0078] O ectoparasita pode estar na forma de um carrapato. Especificamente, o ectoparasita pode estar na forma de qualquer um de Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus decoloratus e similares.[0078] Ectoparasite can be in the form of a tick. Specifically, ectoparasite can be in the form of any one of Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus decoloratus and the like.
[0079] Os um ou mais marcadores podem ser polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Os SNPs podem ser qualquer um ou mais de A22C e T65C em que a presença de qualquer um ou ambos de A22C e T65C está associada com a resistência do ectoparasita ao acaricida. Os um ou mais SNPs podem incluir qualquer um ou mais de C39T, G41A, G121A, T138C e C159T em que sua presença está associada com resistência do ectoparasita ao acaricida. Os um ou mais SNPs podem incluir T36C e G141C em que a presença de T36C e/ou G141C está associada com suscetibilidade do ectoparasita ao acaricida.[0079] The one or more markers can be single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs can be any one or more of A22C and T65C in which the presence of either or both of A22C and T65C is associated with ectoparasite resistance to acaricide. The one or more SNPs can include any one or more of C39T, G41A, G121A, T138C and C159T in which their presence is associated with ectoparasite resistance to acaricide. The one or more SNPs can include T36C and G141C in which the presence of T36C and / or G141C is associated with ectoparasite susceptibility to acaricide.
[0080] A determinação da homozigose e heterozigose de ectoparasitas pode incluir a classificação de ectoparasitas tendo todos os SNPs associados com resistência (A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C e C159T) como ectoparasitas resistentes homozigotos e ectoparasitas tendo apenas alguns[0080] The determination of ectoparasite homozygosity and heterozygosity may include the classification of ectoparasites having all SNPs associated with resistance (A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C and C159T) as homozygous and ectoparasite resistant ectoparasites having only a few
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 18/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 18/71
14/42 dos SNPs associados com resistência (não todos), como ectoparasites heterozigotos.14/42 of the SNPs associated with resistance (not all), such as heterozygous ectoparasites.
[0081] A amostra de DNA pode ser amplificada usando um par de iniciadores selecionado das sequências de nucleotídeo do SEQ. ID NO. 1, SEQ. ID. NO. 2, e fragmentos funcionais, variantes e mutações de cada.[0081] The DNA sample can be amplified using a primer pair selected from the SEQ nucleotide sequences. ID NO. 1, SEQ. ID. AT THE. 2, and functional fragments, variants and mutations of each.
[0082] A etapa de análise do produto de amplificação para a presença de um ou mais marcadores associados com resistência do ectoparasite ao acaricida pode ser a título de sequenciamento do produto de amplificação, quantificação do produto de amplificação, detecção de uma sonda ligada ao produto de amplificação, e uso de uma reação de extensão do iniciador (PEXT) visualizada através de um ensaio de imersão ou similar.[0082] The step of analyzing the amplification product for the presence of one or more markers associated with ectoparasite resistance to acaricide can be by way of sequencing the amplification product, quantifying the amplification product, detecting a probe attached to the product amplification, and use of a primer extension reaction (PEXT) visualized through an immersion test or similar.
[0083] A etapa de análise do produto de amplificação pode incluir exposição do produto de amplificação para digestão da enzima de restrição.[0083] The step of analysis of the amplification product may include exposure of the amplification product for digestion of the restriction enzyme.
[0084] Tipicamente, a digestão de restrição pode ser realizada pelo uso de uma enzima de restrição tendo um local de reconhecimento correspondendo a pelo menos parte dos um ou mais marcadores. Em uma realização, a digestão de restrição pode ser realizada por uma enzima de restrição tendo uma sequência de reconhecimento compreendendo 5’-GGCGGA-3’ (SEQ. ID. NO. 3). A enzima de restrição pode ser Ec/1.[0084] Typically, restriction digestion can be performed by using a restriction enzyme having a recognition site corresponding to at least part of one or more markers. In one embodiment, restriction digestion can be performed by a restriction enzyme having a recognition sequence comprising 5'-GGCGGA-3 '(SEQ. ID. NO. 3). The restriction enzyme can be Ec / 1.
[0085] Alternativa ou adicionalmente, a restrição pode ser realizada pelo uso de uma enzima de restrição tendo uma sequência de reconhecimento compreendendo 5’- GGACG -3’ (SEQ. ID. NO. 4). Consequentemente, a enzima de restrição pode ser selecionada do grupo consistindo em qualquer um ou mais de: BseG\, BstF5\, BsíPZ418l, Fok\, Sfôl e qualquer enzima que reconhece um local correspondendo a pelo menos parte do um ou mais marcadores.Alternatively or additionally, restriction can be accomplished by using a restriction enzyme having a recognition sequence comprising 5'-GGACG -3 '(SEQ. ID. NO. 4). Consequently, the restriction enzyme can be selected from the group consisting of any one or more of: BseG \, BstF5 \, BsíPZ418l, Fok \, Sfôl and any enzyme that recognizes a site corresponding to at least part of the one or more markers.
[0086] Após digestão, os fragmentos resultantes podem ser separados pelo menos parcialmente um do outro usando técnicas de separação por tamanho, tais como eletroforese em gel e similar.[0086] After digestion, the resulting fragments can be separated at least partially from each other using size separation techniques, such as gel electrophoresis and the like.
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 19/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 19/71
15/42 [0087] Os marcadores podem ser marcadores à base de DNA selecionados do grupo consistindo em A22C e T65C da sequência de codificação da sequência de DNA amplificada usando o método da invenção.The markers can be DNA-based markers selected from the group consisting of A22C and T65C of the coding sequence of the amplified DNA sequence using the method of the invention.
[0088] Os marcadores podem ser marcadores à base de peptídeo selecionados do grupo consistindo em G14E, T8P e L22S.[0088] The markers can be peptide-based markers selected from the group consisting of G14E, T8P and L22S.
[0089] A invenção se estende ao uso de qualquer um ou mais dos marcadores genéticos C39T, G41A, G121A, T138C e C159T como indicadores de resistência do ectoparasite ao acaricida. A invenção se estende ainda ao uso de qualquer um ou mais dos marcadores genéticos T36C e G141C como indicadores de suscetibilidade do ectoparasita ao acaricida.[0089] The invention extends to the use of any one or more of the genetic markers C39T, G41A, G121A, T138C and C159T as indicators of ectoparasite resistance to acaricide. The invention also extends to the use of any one or more of the genetic markers T36C and G141C as indicators of ectoparasite susceptibility to acaricide.
[0090] A etapa de extração de uma amostra de DNA do ectoparasita pode estar na forma de extração de DNA de qualquer uma das larvas ou carrapatos inteiros.[0090] The stage of extracting a DNA sample from the ectoparasite can be in the form of extracting DNA from any of the larvae or whole ticks.
[0091] Em uma realização em que o DNA é extraído de carrapatos adultos inteiros, um método de extração à base de sal modificado pode ser usado para isolamento de DNA genômico.[0091] In an embodiment in which DNA is extracted from whole adult ticks, a modified salt-based extraction method can be used to isolate genomic DNA.
[0092] O método de extração à base de sal modificado inclui as etapas de:[0092] The modified salt-based extraction method includes the steps of:
fornecimento de amostras de carrapato inteiro;provision of whole tick samples;
homogeneização dos carrapatos inteiros em 200 μΙ_ de tampão de lise (EDTA a 0,5 M, 0,5% (p/v) de lauroil sarcosinato de sódio).homogenization of whole ticks in 200 μΙ_ of lysis buffer (0.5 M EDTA, 0.5% (w / v) sodium lauroyl sarcosinate).
adição de mais 400 μΙ_ de solução de extração de DNA (NaCI a 0,4 M, Tris-HCI a 60 mM, EDTA a 12 mM, 0,25% de SDS, pH 8,0) para as amostras com 2 μΙ_ de proteinase K (15 mg/mL), bem misturados e incubados durante a noite a 55 °C;addition of an additional 400 μΙ_ of DNA extraction solution (0.4 M NaCI, 60 mM Tris-HCI, 12 mM EDTA, 0.25% SDS, pH 8.0) for samples with 2 μΙ_ of proteinase K (15 mg / ml), well mixed and incubated overnight at 55 ° C;
incubação das amostras por 20 min a 65 °C para inativar a proteinase K, após a qual 1 μΙ_ de RNase A (10 mg/mL) é adicionado;incubation of the samples for 20 min at 65 ° C to inactivate proteinase K, after which 1 μΙ_ of RNase A (10 mg / mL) is added;
submissão ao vórtex das amostras de forma breve;briefly vortexing the samples;
incubação das amostras a 37 °C por 15 min;incubation of samples at 37 ° C for 15 min;
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 20/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 20/71
16/42 realização da precipitação da proteína pela adição de 360 μΙ_ de NaCI a 5 M, submissão ao vórtex por 10 segundos, e incubação no gelo por 5 minutos, seguido pela centrifugação a 25500 xg por 20 minutos à temperatura ambiente, para prover um sobrenadante;16/42 carrying out protein precipitation by adding 360 μΙ_ of 5 M NaCI, vortexing for 10 seconds, and incubating on ice for 5 minutes, followed by centrifugation at 25500 xg for 20 minutes at room temperature, to provide a supernatant;
adição de um volume igual de isopropanol ao sobrenadante, submetendo ao vórtex brevemente, seguido por uma incubação de 1 hora a -20 °C;adding an equal volume of isopropanol to the supernatant, vortexing briefly, followed by a 1 hour incubation at -20 ° C;
centrifugação das amostras por 20 minutos a 10000 xg e descarte dos sobrenadantes; lavagem dos péletes de DNA três vezes consecutivas com 500 μΙ_ de 70% de etanol, centrifugados por 5 minutos a 10000 xg, e descarte do sobrenadante; e secagem ao ar dos péletes de DNA final; e ressuspensão dos péletes de DNA secados no ar de 50 μΙ_ de 1 x tampão de TE (Tris-HCI a 1 mM, EDTA a 0,1 mM, pH 7,0).centrifugation of the samples for 20 minutes at 10,000 xg and disposal of supernatants; washing DNA pellets three times in a row with 500 μΙ_ of 70% ethanol, centrifuged for 5 minutes at 10,000 xg, and discarding the supernatant; and air drying the final DNA pellets; and resuspension of 50 μΙ_ air-dried DNA pellets in 1 x TE buffer (1 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 7.0).
[0093] Em uma realização em que o DNA Genômico é extraído das larvas individuais, o método de extração inclui esmagamento das larvas individuais em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 25 μΙ_ de tampão de TE (Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,6) para formar uma suspensão;[0093] In an embodiment in which Genomic DNA is extracted from individual larvae, the extraction method includes crushing the individual larvae in a 1.5 ml microcentrifuge tube containing 25 μΙ_ of TE buffer (10 mM Tris, EDTA at 1 mM, pH 7.6) to form a suspension;
ebulição da suspensão por 5 minutos;boiling the suspension for 5 minutes;
centrifugação a 4000 xg por 30 segundos à temperatura ambiente para prover um sobrenadante; e usando o sobrenadante para PCR.centrifugation at 4000 xg for 30 seconds at room temperature to provide a supernatant; and using the supernatant for PCR.
[0094] A etapa de amplificação da amostra de DNA pode ser realizada pela submissão da amostra de DNA às seguintes condições de aquecimento, recozimento e resfriamento, respectivamente:[0094] The DNA sample amplification step can be performed by submitting the DNA sample to the following heating, annealing and cooling conditions, respectively:
aquecer a 94 °C por 4 minutos;heat to 94 ° C for 4 minutes;
seguido por 40 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 1 minuto; e com uma extensão final de 72 °C por 8 minutos.followed by 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute; and with a final extension of 72 ° C for 8 minutes.
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 21/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 21/71
17/42 [0095] A invenção também se estende para uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada do grupo consistindo em:17/42 [0095] The invention also extends to an isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
(i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ. ID. NO. 1;(i) a nucleic acid molecule comprising the SEQ sequence. ID. AT THE. 1;
(ii) um fragmento de ácido nucleico tendo uma sequência derivada de um gene receptor de octopamina/tiramina e contendo qualquer um ou mais dos marcadores associados com resistência de um ectoparasite a um acaricida, os marcadores selecionados dentre: A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C e C159T;(ii) a nucleic acid fragment having a sequence derived from an octopamine / tyramine receptor gene and containing any one or more of the markers associated with ectoparasite resistance to an acaricide, the markers selected from: A22C, T65C, C39T, G41A , G121A, T138C and C159T;
(iii) um fragmento de ácido nucleico tendo uma sequência derivada de um gene receptor de octopamina/tiramina e contendo qualquer um ou mais dos marcadores associados com suscetibilidade de um ectoparasite a um acaricida, os marcadores selecionados dentre: T36C e G141C; e (iv) sequências complementares a isso.(iii) a nucleic acid fragment having a sequence derived from an octopamine / tyramine receptor gene and containing any or more of the markers associated with an ectoparasite susceptibility to an acaricide, the markers selected from: T36C and G141C; and (iv) sequences complementary to that.
[0096] A molécula de ácido nucleico isolada pode estar na forma de uma sequência de ocorrência não natural.[0096] The isolated nucleic acid molecule may be in the form of an unnaturally occurring sequence.
[0097] A sequência de ocorrência não natural pode estar na forma de cDNA.[0097] The unnaturally occurring sequence may be in the form of cDNA.
[0098] A invenção provê ainda um polinucleotídeo amplificado tendo um polimorfismo na forma de qualquer um ou mais de: A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C, C159T, T36C e G141C.[0098] The invention further provides an amplified polynucleotide having a polymorphism in the form of any one or more of: A22C, T65C, C39T, G41A, G121A, T138C, C159T, T36C and G141C.
[0099] A invenção também se estende ao uso de uma molécula de ácido nucleico isolada conforme descrito ou um polinucleotídeo amplificado conforme descrito em um método de detecção de um polimorfismo genético associado com suscetibilidade ou resistência de um ectoparasite a um acaricida.[0099] The invention also extends to the use of an isolated nucleic acid molecule as described or an amplified polynucleotide as described in a method of detecting a genetic polymorphism associated with susceptibility or resistance of an ectoparasite to an acaricide.
[0100] A invenção ainda provê o uso de qualquer um ou mais dos marcadores genéticos C39T, G41A, G121A, T138C e C159T como indicadores de resistência de um ectoparasite para um acaricida.[0100] The invention further provides for the use of any one or more of the genetic markers C39T, G41A, G121A, T138C and C159T as indicators of ectoparasite resistance to an acaricide.
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 22/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 22/71
18/42 [0101] A invenção se estende para uso de qualquer um ou ambos de marcadores genéticos T36C e G141C como indicadores de suscetibilidade de um ectoparasite a um acaricida.18/42 [0101] The invention extends to the use of either or both of the genetic markers T36C and G141C as indicators of the susceptibility of an ectoparasite to an acaricide.
[0102] A invenção também se estende para uso de qualquer um ou mais dos marcadores genéticos na forma de marcadores à base de peptídeo G14E, T8P e L22S como indicadores de resistência de um ectoparasite a um acaricida.[0102] The invention also extends to use any one or more of the genetic markers in the form of peptides based on G14E, T8P and L22S as indicators of ectoparasite resistance to an acaricide.
[0103] A invenção provê ainda um kit para determinar a suscetibilidade, ou o contrário, de um ectoparasita ou um grupo de parasitas a um acaricida, o kit incluindo:[0103] The invention also provides a kit to determine the susceptibility, or the reverse, of an ectoparasite or a group of parasites to an acaricide, the kit including:
iniciadores na forma de SEQ. ID. NO.1 e SEQ. ID. NO. 2; e um tampão de reagente adequado para permitir a amplificação de uma sequência de DNA para ser amplificada usando os iniciadores.primers in the form of SEQ. ID. NO.1 and SEQ. ID. AT THE. 2; and a suitable reagent buffer to allow amplification of a DNA sequence to be amplified using the primers.
[0104] O kit pode incluir instruções para determinar a suscetibilidade, ou o contrário, de um ectoparasita a um acaricida.[0104] The kit may include instructions for determining the susceptibility, or the reverse, of an ectoparasite to an acaricide.
[0105] Todas as referências às sequências de DNA do carrapato e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) referem-se apenas às sequências de nucleotídeo da região de codificação; posições de regiões de não codificação são excluídas.[0105] All references to tick DNA sequences and single nucleotide polymorphisms (SNPs) refer only to nucleotide sequences in the coding region; positions of non-coding regions are excluded.
[0106] Aspectos adicionais da invenção serão agora descritos a título de exemplos não limitantes apenas com referência aos desenhos anexos.[0106] Additional aspects of the invention will now be described by way of non-limiting examples with reference only to the accompanying drawings.
Desenhos [0107] A Figura 1 mostra alinhamento de sequência de uma porção do gene receptor de OCT/Tyr/tiramina para larvas R. microplus resistentes e suscetíveis ao amitraz. Rhipicephalus (Boophilus) microplus foi a sequência de referência usada para os alinhamentos (Acesso ao GenBank: AJ010743.1) com a cepa resistente Santa Luiza (Acesso ao GenBank: EF490688.1) e a cepa suscetível Gonzalez (Acesso ao GenBank: EF490687.1). As cinco amostras alinhadas abaixo da cepa Santa Luiza são as amostras resistentes, e aquelasDrawings [0107] Figure 1 shows sequence alignment of a portion of the OCT / Tyr / tyramine receptor gene for R. microplus larvae resistant and susceptible to amitraz. Rhipicephalus (Boophilus) microplus was the reference sequence used for the alignments (Access to GenBank: AJ010743.1) with the resistant strain Santa Luiza (Access to GenBank: EF490688.1) and the susceptible strain Gonzalez (Access to GenBank: EF490687. 1). The five samples aligned below the Santa Luiza strain are the resistant samples, and those
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 23/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 23/71
19/42 abaixo da cepa Gonzalez são aquelas suscetíveis. Os blocos cinzas indicam dois SNPs associados à resistência, a saber, A22C e T65C.19/42 below the Gonzalez strain are those susceptible. The gray blocks indicate two SNPs associated with the resistance, namely, A22C and T65C.
[0108] A Figura 2 mostra uma sequência de aminoácido de uma porção do gene receptor de OCT/Tyr/tiramina. A região de não codificação do gene é indicada a partir da posição do aminoácido de 1 a 45. Sete substituições ocorrem dentro das regiões de não codificação e seis no quadro de leitura aberta. Os blocos cinza destacam as duas substituições associadas à resistência.[0108] Figure 2 shows an amino acid sequence of a portion of the OCT / Tyr / tyramine receptor gene. The non-coding region of the gene is indicated from the position of the amino acid from 1 to 45. Seven substitutions occur within the non-coding regions and six in the open reading frame. The gray blocks highlight the two substitutions associated with resistance.
[0109] A Figura 3 mostra a distribuição da diversidade média versus o número de loci para o receptor OCT/Tyr. É mostrada uma comparação de 22 loci diferentes dentro do receptor OCT/Tyr/tiramina. A diversidade de platô implica que existem amostras suficientes para análise adicional.[0109] Figure 3 shows the distribution of mean diversity versus the number of loci for the OCT / Tyr receptor. A comparison of 22 different loci within the OCT / Tyr / tyramine receptor is shown. Plateau diversity implies that there are sufficient samples for further analysis.
[0110] A Figura 4 mostra a distribuição de densidade rd para o receptor OCT/Tyr/tiramina. Os valores rd são colocados no eixo x enquanto a ocorrência relativa de cada um desses valores é exibida no eixo y. O valor observado fica do lado de fora da faixa de distribuição gerada pelo conjunto de dados randomizado.[0110] Figure 4 shows the rd density distribution for the OCT / Tyr / tyramine receptor. The rd values are placed on the x axis while the relative occurrence of each of these values is displayed on the y axis. The observed value is outside the distribution range generated by the randomized data set.
[0111] A Figura 5 mostra o gráfico de recombinação ancestral para carrapatos R. microplus homozigotos resistentes e suscetíveis ao amitraz na África do Sul. H1, H2, H3, H4 e H5 representam as sequências de haplótipos compatíveis com locais infinitos que foram observados. O nó E representa a forma ancestral do gene com pontos adjacentes (A-D) ilustrando haplótipos coalescentes. A tabela adicional indica as associações de amostra/haplótipo para o gráfico. Um evento de recombinação foi detectado como o antecessor do haplótipo H2, e 294 indicando que o evento de recombinação ocorreu entre os nucleotídeos 294 e 295 no alinhamento. O símbolo S significa que o sufixo para o recombinante foi provido pelo antecessor do recombinante e H3, enquanto P significa que o prefixo (os primeiros 294 nucleotídeos) foi provido pelo antecessor do recombinante e H5. As amostras da África do Sul são[0111] Figure 5 shows the ancestral recombination chart for homozygous R. microplus ticks resistant and susceptible to amitraz in South Africa. H1, H2, H3, H4 and H5 represent the sequences of haplotypes compatible with infinite locations that have been observed. The E node represents the ancestral form of the gene with adjacent points (A-D) illustrating coalescent haplotypes. The additional table indicates the sample / haplotype associations for the graph. A recombination event was detected as the predecessor of the H2 haplotype, and 294 indicating that the recombination event occurred between nucleotides 294 and 295 in the alignment. The symbol S means that the suffix for the recombinant was provided by the predecessor of the recombinant and H3, while P means that the prefix (the first 294 nucleotides) was provided by the predecessor of the recombinant and H5. South Africa samples are
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 24/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 24/71
20/42 rotuladas com um número indicando a exploração de origem e MF indica R. microplus fêmeas.20/42 labeled with a number indicating the holding of origin and MF indicates R. microplus females.
[0112] A Figura 6 mostra um eletroferograma de gel agarose do receptor OCT/Tyr/tiramina das larvas de R. decoloratus digeridas com enzima de restrição Ec/1. Os números de faixa representam amostras do conjunto original de 14 amostras anônimas. Faixa 1-amostra 5, faixa 2-amostra 7, faixa 3amostra 8, faixa 4-amostra 6 e faixa 5-amostra 9 (Tabela Suplementar S3).[0112] Figure 6 shows an electropherogram of agarose gel of the OCT / Tyr / tyramine receptor of R. decoloratus larvae digested with Ec / 1 restriction enzyme. The track numbers represent samples from the original set of 14 anonymous samples. Range 1-sample 5, range 2-sample 7, range 3-sample 8, range 4-sample 6 and range 5-sample 9 (Supplementary Table S3).
[0113] A Figura S1 mostra a estrutura de subpopulação dos carrapatos em toda a África do Sul.[0113] Figure S1 shows the subpopulation structure of ticks across South Africa.
Descrição Detalhada da Invenção [0114] Todas as referências para sequências de DNA de carrapato e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) se referem às sequências de nucleotídeo da região de codificação apenas; posições das regiões de não codificação são excluídas.Detailed Description of the Invention [0114] All references to tick DNA sequences and single nucleotide polymorphisms (SNPs) refer to the nucleotide sequences of the coding region only; positions of non-coding regions are excluded.
1. Resultados1. Results
Triagem para SNPs em larvas resistentes e suscetíveis ao amitraz [0115] As larvas de R. microplus resistentes ao amitraz obtidas da área Mnisi no Parque Nacional de Kruger foram rastreadas para a presença dos dois SNPs resistentes publicados por Chen et al. (2007). Vinte e quatro substituições de nucleotídeo foram detectadas dentre as larvas resistentes, larvas suscetíveis e as três cepas de referência de NCBI (Figura 1). Sete das substituições pareceram estar associadas com amostras suscetíveis. As primeiras quatro dessas substituições ocorreram na região de não codificação (posição do nucleotídeo 1-135) do gene consistindo em uma transversão e três mutações de transição. As três substituições restantes dentro do quadro de leitura aberta eram sinônimas, não tendo efeito observável na sequência de aminoácido. Ocorreram quatro substituições em todas as amostras resistentes (Figura 1) e continham dois locais não sinônimos nas posições de nucleotídeo 157 e 200 (Figura 2, T8P e L22S). Essas duas substituições correspondem a dois SNPs publicados. Há sete substituições de nucleotídeo diferenciando oScreening for SNPs in resistant larvae and susceptible to amitraz [0115] The larvae of R. microplus resistant to amitraz obtained from the Mnisi area in Kruger National Park were screened for the presence of the two resistant SNPs published by Chen et al. (2007). Twenty-four nucleotide substitutions were detected among the resistant larvae, susceptible larvae and the three NCBI reference strains (Figure 1). Seven of the substitutions appeared to be associated with susceptible samples. The first four of these substitutions occurred in the non-coding region (position of nucleotide 1-135) of the gene consisting of a transverse and three transition mutations. The three remaining substitutions within the open reading frame were synonymous, having no observable effect on the amino acid sequence. There were four substitutions in all resistant samples (Figure 1) and contained two non-synonymous locations at nucleotide positions 157 and 200 (Figure 2, T8P and L22S). These two substitutions correspond to two published SNPs. There are seven nucleotide substitutions differentiating the
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21/42 receptor acoplado de proteína Boophilus microplus (Acesso ao GenBank AJ010743.1) das outras sequências, três das quais ocorrem na região de codificação e duas alterações não sinônimas na região de codificação (115V e T20A) (Figura 2). Por último, há vários outros SNPs que parecem aparecer com duas substituições não sinônimas que ocorrem nas posições de nucleotídeo 176 e 256 (Figure 1). As amostras contendo esses SNPs adicionais eram resistentes.21/42 Boophilus microplus protein coupled receptor (GenBank Access AJ010743.1) from the other sequences, three of which occur in the coding region and two non-synonymous changes in the coding region (115V and T20A) (Figure 2). Finally, there are several other SNPs that appear to appear with two non-synonymous substitutions that occur at nucleotide positions 176 and 256 (Figure 1). Samples containing these additional SNPs were resistant.
[0116] Os dados de sequência obtidos para todas as larvas foram comparados aos resultados das LPTs (Tabela Suplementar S1). A comparação revela uma clara correlação entre a presença do SNP (genotípico) e o fenótipo resistente determinado pelas LPTs. A comparação foi feita primariamente entre as larvas que sobreviveram ao ensaio de LPT (resistentes) e aquelas que não sobreviveram (suscetíveis). Os resultados mostram claramente que todas as larvas que não sobreviveram ao ensaio de LPT exibem o genótipo de SS ou RS, e aquelas que sobreviveram à exposição ao amitraz exibem o genótipo de RR.[0116] The sequence data obtained for all larvae were compared to the results of the LPTs (Supplementary Table S1). The comparison reveals a clear correlation between the presence of the SNP (genotype) and the resistant phenotype determined by the LPTs. The comparison was made primarily between the larvae that survived the LPT test (resistant) and those that did not survive (susceptible). The results clearly show that all larvae that did not survive the LPT test exhibit the SS or RS genotype, and those that survived amitraz exposure exhibit the RR genotype.
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 26/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 26/71
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Tabela S1. Correlação entre estado de resistência ao amitraz fenotípico (LPT) e genotípico (sequenciamento)Table S1. Correlation between state of resistance to phenotypic amitraz (LPT) and genotypic (sequencing)
Larvas que não sobreviveram LPTsb Larvae that did not survive LPTs b
significando que elas eram resistentes às concentrações de amitraz aplicadas. bLarvas que eram suscetíveis às concentrações de amitraz usadas e foram mortas após completar o ensaio. CRF é o fator de resistência, e RF de 100 implica que a cepa é resistente ao amitraz. RF de 10 e 28 significa que a cepa é suscetível ao amitraz. dGenótipo foi inferido com base em se as larvas sequenciadas continham ou não os dois SNPs publicados por Chen et al. (2007). RR - resistente ao homozigoto, SS suscetível ao homozigoto, RS - heterozigoto.meaning that they were resistant to the concentrations of amitraz applied. b Larvae that were susceptible to the concentrations of amitraz used and were killed after completing the test. C RF is the resistance factor, and RF 100 implies that the strain is resistant to amitraz. RF of 10 and 28 means that the strain is susceptible to amitraz. d Genotype was inferred based on whether or not the sequenced larvae contained the two SNPs published by Chen et al. (2007). RR - resistant to homozygous, SS susceptible to homozygous, RS - heterozygous.
Triagem nacional para SNPs em carrapatos adultos [0117] Os carrapatos adultos de 108 diferentes explorações agrícolas mostraram uma incidência de 50% de R. microplus. A maioria dos carrapatos coletados foi da Província de Kwazulu-Natal. Portanto, um total de 218 alelosNational screening for SNPs in adult ticks [0117] Adult ticks from 108 different farms showed a 50% incidence of R. microplus. Most of the ticks collected were from Kwazulu-Natal Province. Therefore, a total of 218 alleles
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 27/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 27/71
23/42 (109 carrapatos adultos de toda a África do Sul) foi rastreado para os dois SNPs publicados.23/42 (109 adult ticks from all over South Africa) was tracked for the two published SNPs.
[0118] Vários SNPs adicionais foram encontrados dentro das amostras de campo em toda da África do Sul, pincipalmente dentro da região de não codificação do gene receptor OCT/Tyr (dados não mostrados). As frequências de alelos suscetíveis (S) e de resistência (R) foram calculadas para os SNPs ligados à resistência que ocorre no gene receptor OCT/Tyr para todos os carrapatos adultos. Quase metade da população (48,2%) exibiu os alelos de resistência para amitraz, e a maioria da população era heterozigota nessas posições de nucleotídeo (Tabela Suplementar S2).[0118] Several additional SNPs were found within field samples across South Africa, mainly within the non-coding region of the OCT / Tyr receptor gene (data not shown). The frequencies of susceptible (S) and resistance (R) alleles were calculated for the SNPs linked to the resistance that occurs in the OCT / Tyr receptor gene for all adult ticks. Almost half of the population (48.2%) exhibited resistance alleles for amitraz, and the majority of the population was heterozygous in these nucleotide positions (Supplementary Table S2).
Tabela S2. Frequências de alelo para o gene receptor octopamina das amostras de campo de R. microplus.Table S2. Allele frequencies for the octopamine receptor gene in R. microplus field samples.
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10 alelo R refere-se à forma mutante que dá origem à resistência enquanto o alelo S refere-se à forma suscetível tipo selvagem do gene.0 1 R allele refers to the mutant form which gives rise to resistance as the S allele refers to susceptible wild - type form of the gene.
Desequilíbrio qamético entre SNPs [0119] Nesse estudo, todos os SNPs que estavam presentes no receptor OCT/Tyr foram analisados para determinar se eles estavam em desequilíbrio gamético. Primeiro, a diversidade foi modelada contra o número de loci (posições variáveis nas sequências) (Figura 3). Isso é essencial para determinar se há amostras suficientes para a análise proposta. O gráfico da diversidade média versus o número de loci deve alcançar um platô, significando que há amostras suficientes para análise adicional (que está evidente na Figura 3). Assim, as amostras adicionais ou loci não teriam alterado a diversidade que foi observada no conjunto de amostra.Qametic imbalance between SNPs [0119] In this study, all SNPs that were present at the OCT / Tyr receptor were analyzed to determine whether they were in gametic imbalance. First, diversity was modeled against the number of loci (variable positions in the sequences) (Figure 3). This is essential to determine whether there are sufficient samples for the proposed analysis. The graph of average diversity versus number of loci should reach a plateau, meaning that there are sufficient samples for further analysis (which is evident in Figure 3). Thus, the additional samples or loci would not have altered the diversity that was observed in the sample set.
[0120] Uma análise de desequilíbrio gamético revelou um gráfico com uma curva em forma de sino, com o valor observado rd ficando do lado de fora da distribuição geral (Figura 4). Isso implica que o valor observado rd foi significativamente maior (P < 0,00001; Ho = associação aleatória ou desequilíbrio gamético) do que foi gerado pelo conjunto de dados randomizado, enfatizando assim um desvio da associação aleatória. Portanto, os dados[0120] An analysis of gametic imbalance revealed a graph with a bell-shaped curve, with the observed value rd being outside the general distribution (Figure 4). This implies that the observed rd value was significantly higher (P <0.00001; H o = random association or gametic imbalance) than was generated by the randomized data set, thus emphasizing a deviation from the random association. Therefore, the data
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 29/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 29/71
25/42 observados exibiram um nível significativo de desequilíbrio gamético (associação não aleatória), enquanto o equilíbrio gamético (associação aleatória) estava ausente.25/42 observed exhibited a significant level of gametic imbalance (non-random association), while gametic balance (random association) was absent.
[0121] As comparações iniciais foram feitas para os dois loci de SNP que mostraram estar envolvidos na resistência ao amitraz (loci 11 e 17). Locus 11 corresponde à posição do nucleotídeo 157, e locus 17 com aquele de 200. Uma comparação pareada desses dois loci resultou em um valor rd de 0,804 (P < 0,00001), indicando que esses dois locais estão em desequilíbrio gamético. As amostras resistentes homozigotas mostraram que ambas as substituições estavam presentes. As comparações pareadas foram então feitas para todos os loci variáveis dentro do gene (dados não mostrados). A Tabela 1 apenas mostra os resultados de loci que estavam significativamente associados com os dois loci resistentes.[0121] Initial comparisons were made for the two SNP loci that were shown to be involved in amitraz resistance (loci 11 and 17). Locus 11 corresponds to the position of nucleotide 157, and locus 17 to that of 200. A paired comparison of these two loci resulted in an rd value of 0.804 (P <0.00001), indicating that these two sites are in gametic imbalance. The homozygous resistant samples showed that both substitutions were present. Paired comparisons were then made for all variable loci within the gene (data not shown). Table 1 only shows the results of the loci that were significantly associated with the two resistant loci.
Tabela 1 .Loci significativamente associados com loci resistente 11 e 17.Table 1. Loci significantly associated with resistant loci 11 and 17.
SNP 1 SNP 2 valor a Agregadob Valor de PSNP 1 SNP 2 value a Aggregate b Value of P
a Valor rd representa o desequilíbrio gamético que é observado entre os dois SNPs sendo comparados um ao outro. a rd value represents the gametic imbalance that is observed between the two SNPs being compared to each other.
b Valor agregado é o valor médio dos valores rd que foram obtidos para os loci 11 e 17 associados com os outros loci para determinar qual associação exibiu o maior desequilíbrio gamético. b Added value is the average value of the rd values that were obtained for loci 11 and 17 associated with the other loci to determine which association exhibited the greatest gametic imbalance.
[0122] Locus 12 corresponde à posição de nucleotídeo 171 no alinhamento do receptor OCT/Tyr (Figura 1), locus 13 àquela da posição 174, e locus 19 àquele de 273. O valor agregado de rd foi calculado para determinar qual dos três loci estavam mais fortemente associados com os dois loci[0122] Locus 12 corresponds to nucleotide position 171 in the alignment of the OCT / Tyr receptor (Figure 1), locus 13 to that of position 174, and locus 19 to that of 273. The aggregated rd value was calculated to determine which of the three loci were more strongly associated with the two loci
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 30/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 30/71
26/42 resistentes (11 e 17). Os resultados mostram que os loci resistentes estão igualmente associados com ambos 12 e 13. Ao comparar os dados de sequência, está evidente que uma substituição de nucleotídeo no locus 12 apenas ocorre quando o carrapato é suspeito de ser suscetível ao amitraz. Uma substituição no locus 13, entretanto, ocorre toda vez que o carrapato é suspeito de ser resistente. Portanto, talvez se possa considerar essa associação particular como um marcador molecular para resistência no gene.26/42 resistant (11 and 17). The results show that the resistant loci are equally associated with both 12 and 13. When comparing the sequence data, it is evident that a nucleotide substitution at locus 12 only occurs when the tick is suspected of being susceptible to amitraz. A replacement at locus 13, however, occurs every time the tick is suspected of being resistant. Therefore, it may be possible to consider this particular association as a molecular marker for resistance in the gene.
[0123] A estrutura da população também foi analisada pela medida de diferenciação Fst de Wright para o conjunto de dados, e gerou um valor de 0,0253 (Holsinger, Weir 2009). Esse valor implica que a subdivisão da população representa 2,5% da variação genética total vista dentro da população total. Adicionalmente, a heterozigose observada (Ho) e esperada (He) para cada subpopulação foi calculada, com o coeficiente de endogamia (Fis) (Tabela 2). Todos os valores de Fis eram negativos, com a exceção da população 3. A análise global em todas a populações também foi feita e gerou um coeficiente de endogamia global de -0,137, indicando excesso de heterozigose em comparação com o que foi esperado.[0123] The population structure was also analyzed by Wright's Fst differentiation measure for the data set, and generated a value of 0.0253 (Holsinger, Weir 2009). This value implies that the population subdivision represents 2.5% of the total genetic variation seen within the total population. Additionally, the observed (H o ) and expected (H e ) heterozygosis for each subpopulation was calculated, with the inbreeding coefficient (Fis) (Table 2). All Fis values were negative, with the exception of population 3. The global analysis in all populations was also performed and generated a global inbreeding coefficient of -0.137, indicating excess heterozygosity compared to what was expected.
Tabela 2. Variação genética dentre as populações de carrapato na África do SulTable 2. Genetic variation among tick populations in South Africa
Heterozigose observada (Ho), esperada (He) e índices de fixação (F,s) para cada subpopulação.Observed heterozygosis (H o ), expected (H e ) and fixation indices (F, s ) for each subpopulation.
Recombinacão no gene receptor OCT/TyrRecombination in the OCT / Tyr receptor gene
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 31/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 31/71
27/42 [0124] Os gráficos de recombinação ancestral foram construídos pela incorporação de informação de sequência do gene receptor OCT/Tyr de ambos os carrapatos homozigotos resistentes e suscetíveis (Figura 5).27/42 [0124] The ancestral recombination graphs were constructed by incorporating sequence information from the OCT / Tyr receptor gene of both resistant and susceptible homozygous ticks (Figure 5).
[0125] Um evento de recombinação ocorreu na posição de nucleotídeo 294. Não ocorreram mutações entre o evento de recombinação e o haplótipo H2, portanto H2 é o recombinante. Ao olhar nos dados de sequência, a substituição de nucleotídeo que ocorre nesse local é C para T. Essa substituição é sinônima e apenas aparece nas amostras suspeitas de serem resistentes. Essa substituição ocorreu em uma frequência de 0,61 na população de carrapatos R. microplus na África do Sul (dados não mostrados), especialmente dentro das amostras heterozigotas onde ambos os alelos suscetíveis e resistentes estavam presentes. Nenhuma significância geográfica foi encontrada com os agrupamentos de amostra de haplótipo e a área na África do Sul onde as amostras se originaram.[0125] A recombination event occurred at nucleotide position 294. There were no mutations between the recombination event and the H2 haplotype, so H2 is the recombinant. When looking at the sequence data, the nucleotide substitution that occurs at that location is C to T. This substitution is synonymous and only appears in samples suspected of being resistant. This replacement occurred at a frequency of 0.61 in the R. microplus tick population in South Africa (data not shown), especially within heterozygous samples where both susceptible and resistant alleles were present. No geographical significance was found with the haplotype sample clusters and the area in South Africa where the samples originated.
Ferramenta de diagnóstico com base em RFLP para resistência ao amitraz:Diagnostic tool based on RFLP for resistance to amitraz:
[0126] Locus 13, correspondendo à posição de nucleotídeo 174, estava significativamente associado com os dois loci resistentes no gene receptor OCT/Tyr (Tabela 1). Uma substituição de nucleotídeo de um C para T estava presente sempre que o carrapato era resistente de forma fenotípica e genotípica, isto é, ambos os SN Ps associados à resistência estavam presentes. Esse foi o caso para ambos os alelos de SNP homozigotos e heterozigotos. Entretanto, essa substituição não resultou em uma mudança de aminoácido, devido à degeneração da terceira posição do códon. Tal associação apertada entre loci no gene podería potencialmente representar um marcador molecular para resistência ao amitraz.[0126] Locus 13, corresponding to nucleotide position 174, was significantly associated with the two resistant loci in the OCT / Tyr receptor gene (Table 1). A nucleotide substitution from a C to a T was present whenever the tick was resistant in a phenotypic and genotypic way, that is, both SN Ps associated with the resistance were present. This was the case for both homozygous and heterozygous SNP alleles. However, this substitution did not result in an amino acid change, due to the degeneration of the third position of the codon. Such a tight association between loci in the gene could potentially represent a molecular marker for resistance to amitraz.
[0127] Os carrapatos R. decoloratus com resistência e suscetibilidade conhecidas ao amitraz foram usados para testar a eficácia da enzima de restrição Ec/Ί como uma possível ferramenta de diagnóstico. Catorze amostras[0127] R. decoloratus ticks with known resistance and susceptibility to amitraz were used to test the effectiveness of the Ec / Ί restriction enzyme as a possible diagnostic tool. Fourteen samples
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 32/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 32/71
28/42 anônimas foram obtidas, cada uma contendo múltiplas larvas. Dessas, cinco amostras foram usadas para análises de RFLP (Figura 6).Anonymous 28/42 were obtained, each containing multiple larvae. Of these, five samples were used for RFLP analysis (Figure 6).
[0128] A Amostra 5 (Faixa 1, Figura 6) mostrou uma banda proeminente a 400 bp, indicando um genótipo homozigoto e fenótipo resistente. Esse resultado foi corroborado por um teste de pacote de larva independentemente realizado (Tabela Suplementar S3). Essa amostra particular exibiu 13,2% de controle em uma concentração de campo de 250 ppm de amitraz. As Amostras 7 e 8 (Faixas 2 e 3 respectivamente, Figura 6) produziram produtos de digestão idênticos. Além do produto de digestão de 400 bp, um produto de 223 bp e 186 bp também foi detectado. Esse resultado significa que essas amostras eram heterozigotas e estavam potencialmente mais suscetíveis ao tratamento com amitraz. De fato, os testes de pacote larval independentes revelaram que essas amostras eram 100% suscetíveis às concentrações de campo do amitraz. A Amostra 6 (Faixa 4, Figura 6) mostrou potencial de resistência da mesma maneira como a Amostra 5, e isso foi corroborado por um nível de 30% de controle durante os testes de pacote de larvas independentes (Tabela Suplementar S3). Por último, a Amostra 9 (faixa 5, Figura 6) mostrou heterozigose da mesma maneira como nas Amostras 7 e 8, e foi 100% suscetível às concentrações de campo de amitraz (Tabela Suplementar S3).[0128] Sample 5 (Range 1, Figure 6) showed a prominent band at 400 bp, indicating a homozygous genotype and resistant phenotype. This result was corroborated by an independently carried out larval pack test (Supplementary Table S3). This particular sample exhibited 13.2% control at a field concentration of 250 ppm amitraz. Samples 7 and 8 (Lanes 2 and 3 respectively, Figure 6) produced identical digestion products. In addition to the 400 bp digest product, a 223 bp and 186 bp product was also detected. This result means that these samples were heterozygous and were potentially more susceptible to treatment with amitraz. In fact, independent larval package tests revealed that these samples were 100% susceptible to amitraz field concentrations. Sample 6 (Range 4, Figure 6) showed resistance potential in the same way as Sample 5, and this was corroborated by a 30% level of control during the independent larval packet tests (Supplementary Table S3). Finally, Sample 9 (lane 5, Figure 6) showed heterozygosity in the same way as in Samples 7 and 8, and was 100% susceptible to amitraz field concentrations (Supplementary Table S3).
Petição 870170044737, de 28/06/2017, pág. 33/71Petition 870170044737, of 06/28/2017, p. 33/71
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Tabela S3. Resultados de teste de pacote larval Rhipicephalus microplusTable S3. Rhipicephalus microplus larval pack test results
2 90 a 100% - Amitraz considerado como eficaz, 80 a 90% - eficaz com reserva, 50 a 80% - indicações de resistência em desenvolvimento, 0 a 50% - indicações de resistência. Concentração de amitraz foi a 250 ppm. 2 90 to 100% - Amitraz considered to be effective, 80 to 90% - effective with reserve, 50 to 80% - indications of resistance in development, 0 to 50% - indications of resistance. Amitraz concentration was 250 ppm.
2. Discussão [0129] Nesse estudo, foi investigada a evolução da resistência ao amitraz nos carrapatos Rhipicephalus microplus sul-africanos. Dois loci de SNP previamente conhecidos no receptor OCT/Tyr (Chen et ai., 2007) estavam significativamente associados um com o outro, e com resistência ao amitraz. Por último, foi explorado o alto nível de desequilíbrio gamético entre esses dois SNPs e um SNP adicional, que muda um local de ligação da enzima de restrição, a fim de inventar uma enzima de restrição acessível e fácil com base na ferramenta de avaliação para resistência ao amitraz nas amostras de campo de carrapatos.2. Discussion [0129] In this study, the evolution of resistance to amitraz in South African Rhipicephalus microplus ticks was investigated. Two SNP loci previously known at the OCT / Tyr receptor (Chen et al., 2007) were significantly associated with each other, and with resistance to amitraz. Finally, the high level of gametic imbalance between these two SNPs and an additional SNP, which changes a restriction enzyme binding site, was explored in order to invent an accessible and easy restriction enzyme based on the resistance assessment tool amitraz in tick field samples.
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30/42 [0130] Conforme anteriormente mencionado, os receptores octopaminérgicos foram classificados nessas três classes. Os receptores de octopamina tipo α-adrenérgicos exibem uma afinidade aumentada para octopamina, em vez de tiramina, o que leva a um aumento nas concentrações de Ca2+ intracelular com um pequeno aumento nos níveis de cAMP intracelular (Balfanz et al. 2005; Farooqui 2012). Os receptores de octopamina do tipo βadrenérgico, por outro lado, são especificamente ativados em resposta à octopamina diretamente resultando no aumento nos níveis de cAMP intracelulares (Maqueira, Chatwin, Evans 2005; Farooqui 2012). Por último, os receptores octopaminérgicos/tiraminérgicos (OCT/Tyr) mostraram similaridade imensas em termos de estrutura e farmacologia com os receptores a2adrenérgicos vertebrados (Evans, Maqueira 2005). As preferências agonísticas podem resultar nos receptores que são estimulados por octopamina ou tiramina. Em resposta à octopamina, haverá um aumento nas concentrações de Ca2+ intracelular. Inversamente, uma resposta à tiramina resultará na redução nos níveis de cAMP intracelular (Farooqui 2012). Robb et al. (1994) também demonstraram esse princípio em Drosophila, onde um receptor pode exibir diferentes perfis farmacológicos com relação a sistemas de segundo mensageiro implementado.30/42 [0130] As previously mentioned, octopaminergic receptors have been classified into these three classes. Α-adrenergic octopamine receptors exhibit an increased affinity for octopamine, rather than tyramine, which leads to an increase in intracellular Ca 2+ concentrations with a small increase in intracellular cAMP levels (Balfanz et al. 2005; Farooqui 2012). Βadrenergic type octopamine receptors, on the other hand, are specifically activated in response to octopamine directly resulting in increased levels of intracellular cAMP (Maqueira, Chatwin, Evans 2005; Farooqui 2012). Finally, octopaminergic / tyramergic receptors (OCT / Tyr) showed immense similarity in terms of structure and pharmacology with vertebrate α2adrenergic receptors (Evans, Maqueira 2005). Agonistic preferences can result in receptors that are stimulated by octopamine or tyramine. In response to octopamine, there will be an increase in intracellular Ca 2+ concentrations. Conversely, a response to tyramine will result in a reduction in intracellular cAMP levels (Farooqui 2012). Robb et al. (1994) also demonstrated this principle in Drosophila, where a recipient can display different pharmacological profiles with respect to implemented second messenger systems.
[0131] Estudos anteriores feitos em abelhas (M’diave, Bounias 1991) e mamíferos (Shin, Hsu 1994) sugeriram que o local de destino proposto para amitraz fosse os receptores do tipo α-adrenérgicos e os receptores a2adrenérgicos, respectivamente. Isso, junto aos SN Ps descobertos por Chen, He, Davev (2007), sugere fortemente o envolvimento de receptores tipo OCT/Tyr na resistência ao amitraz. A mutação relatada por Corley et al. (2013) no receptor de octopamina do tipo β-adrenérgico parece promissora; entretanto, sua localização restrita apenas à parte central de Queensland na Austrália substanciou mais a noção para investigar o receptor OCT/Tyr como alternativa.[0131] Previous studies on bees (M'diave, Bounias 1991) and mammals (Shin, Hsu 1994) suggested that the proposed target site for amitraz was α-adrenergic receptors and a2adrenergic receptors, respectively. This, together with the SN Ps discovered by Chen, He, Davev (2007), strongly suggests the involvement of OCT / Tyr type receptors in amitraz resistance. The mutation reported by Corley et al. (2013) in the β-adrenergic type octopamine receptor seems promising; however, its location restricted only to central Queensland in Australia further substantiated the notion to investigate the OCT / Tyr receptor as an alternative.
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31/42 [0132] Uma triagem nacional dos dois SNPs associados à resistência no gene receptor OCT/Tyr revelou um alto nível de heterozigose. Supõe-se que a seleção de equilíbrio positivo está agindo na população a fim de manter a alta prevalência de heterozigose (Nachman 2006). A pressão de seleção é imposta na população de carrapatos pela aplicação de amitraz, e isso aciona alelos que conferem resistência à homozigose (Soberanes et al. 2002; Rosado-Aquilar et al. 2008). Por outro lado, as vantagens potenciais de heterozigose sem pressão de seleção de amitraz podem fazer com que subseções da população, que escapam do tratamento com amitraz, permaneçam heterozigotas. Essa observação podería ser mais explicada por uma taxa lenta de fixação durante pressão seletiva constante, tal como nas populações de carrapato que estavam sob pressão de seleção de piretróide (Faza et al. 2013). Estudos também mostraram que há uma falta de aptidão com cepas resistentes ao amitraz (Jonsson et al. 2010b), provendo assim visão sobre a desvantagem seletiva que pode estar associada com carrapatos resistentes homozigotos. Esse custo de aptidão particular contribuiría amplamente para o excesso de heterozigotos encontrados dentro do estudo. Tais interações entre pressão de seleção e custo de aptidão determinarão a frequência de alelo associada à resistência e podem ocorrer através de efeitos diretos ou pleiotrópicos (Kliot, Ghanim 2012).31/42 [0132] A national screening of the two SNPs associated with resistance in the OCT / Tyr receptor gene revealed a high level of heterozygosity. It is assumed that the selection of positive equilibrium is acting in the population in order to maintain the high prevalence of heterozygosis (Nachman 2006). The selection pressure is imposed on the tick population by the application of amitraz, and this triggers alleles that confer resistance to homozygosis (Soberanes et al. 2002; Rosado-Aquilar et al. 2008). On the other hand, the potential advantages of heterozygosis without amitraz selection pressure can make subsections of the population that escape amitraz treatment remain heterozygous. This observation could be further explained by a slow rate of fixation during constant selective pressure, such as in tick populations that were under pyrethroid selection pressure (Faza et al. 2013). Studies have also shown that there is a lack of fitness with strains resistant to amitraz (Jonsson et al. 2010b), thus providing insight into the selective disadvantage that can be associated with homozygous resistant ticks. This particular fitness cost would largely contribute to the excess heterozygotes found within the study. Such interactions between selection pressure and fitness cost will determine the frequency of allele associated with resistance and can occur through direct or pleiotropic effects (Kliot, Ghanim 2012).
[0133] Os dois loci de SNP associados com resistência putativa estavam em desequilíbrio gamético e estavam positivamente associados com o fenótipo resistente. Assim, se ambos os loci de SNP exibem substituições de nucleotídeo específicas, pode ser inferido que o carrapato é resistente ao amitraz. Embora exista desequilíbrio gamético significativo para esses SNPs, há um pequeno, porém importante, desvio do desequilíbrio completo. O desequilíbrio gamético entre loci pode ser gerado de uma variedade de fatores, a saber: mutação, mistura de população, fluxo de gene, deriva genética, alguns tipos de seleção natural, bem como heterogeneidade genética (Halliburton 2003; Gibson, Muse 2009). A interação coalescente dessas forças dentro da[0133] The two SNP loci associated with putative resistance were in gametic imbalance and were positively associated with the resistant phenotype. Thus, if both SNP loci exhibit specific nucleotide substitutions, it can be inferred that the tick is resistant to amitraz. Although there is a significant gametic imbalance for these SNPs, there is a small but important deviation from the complete imbalance. The gametic imbalance between loci can be generated by a variety of factors, namely: mutation, population mix, gene flow, genetic drift, some types of natural selection, as well as genetic heterogeneity (Halliburton 2003; Gibson, Muse 2009). The coalescing interaction of these forces within the
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32/42 população de carrapato é provavelmente responsável pelo desequilíbrio incompleto observado.32/42 tick population is probably responsible for the incomplete imbalance observed.
[0134] Uma terceira posição de SNP no gene receptor OCT/Tyr estava significativamente associada com os dois SNPs previamente mencionados. Isso ilustra que a resistência ao amitraz está potencialmente associada com alelos completos do gene, em vez de com posições de SNP individuais. Portanto, associações entre posições de SNP poderíam ser potencialmente atribuídas à herança intacta de alelos. Isso é demonstrado ainda por posições variáveis adicionais que pareciam distinguir fenótipos resistentes de suscetíveis. Mediante constante pressão de seleção, essas posições variáveis chegaram à fixação na população. Portanto, parece que a exposição ao amitraz consequentemente afeta uma faixa mais ampla de loci substanciando ainda a probabilidade de herança intacta de alelos. Um processo evolutivo clássico que podería ser responsável por tal observação é interação epistática, onde esses alelos de combinação dentro do gene poderíam compensar o custo de aptidão mencionado anteriormente (Paris et al. 2008).[0134] A third SNP position in the OCT / Tyr receptor gene was significantly associated with the two SNPs previously mentioned. This illustrates that resistance to amitraz is potentially associated with complete alleles of the gene, rather than with individual SNP positions. Therefore, associations between SNP positions could potentially be attributed to intact allele inheritance. This is further demonstrated by additional variable positions that seemed to distinguish resistant from susceptible phenotypes. Through constant selection pressure, these variable positions reached the population. Therefore, it appears that exposure to amitraz consequently affects a wider range of loci, further substantiating the probability of intact allele inheritance. A classic evolutionary process that could be responsible for such an observation is epistatic interaction, where these combination alleles within the gene could offset the fitness cost mentioned earlier (Paris et al. 2008).
[0135] Foi investigado se a recombinação intragênica podería ser inferida de uma amostra de população do gene receptor OCT/Tyr. De fato, a recombinação foi detectada, e é improvável que seja um artefato de análise, uma vez que o local de recombinação inferido é 294 bp na seção sequenciada do gene. A recombinação no gene receptor OCT/Tyr permitiría novas combinações do prefixo e do sufixo do gene, o que permitiría novas combinações de SNP, bem como o surgimento de homozigotos duplos na população. Nossos resultados também mostraram que tais homozigotos duplos exibiram um nível muito alto de resistência ao amitraz. Portanto, é provável que sob constante pressão de seleção de amitraz, a recombinação no gene receptor OCT/Tyr podería desempenhar um papel importante no surgimento de resistência a esse acaricida. Adicionalmente, a recombinação pode agir para gerar ou decair combinações alélicas (Halliburton 2003); com seleção natural agindo nessas combinações de alelos que eles podem ser mantidos na[0135] It was investigated whether intragenic recombination could be inferred from a population sample of the OCT / Tyr receptor gene. In fact, the recombination has been detected, and is unlikely to be an analysis artifact, since the inferred recombination site is 294 bp in the sequenced section of the gene. The recombination in the OCT / Tyr receptor gene would allow new combinations of the prefix and suffix of the gene, which would allow new combinations of SNP, as well as the appearance of double homozygotes in the population. Our results also showed that such double homozygotes exhibited a very high level of resistance to amitraz. Therefore, it is likely that under constant pressure of amitraz selection, recombination in the OCT / Tyr receptor gene could play an important role in the emergence of resistance to this acaricide. In addition, recombination can act to generate or decay allelic combinations (Halliburton 2003); with natural selection acting on these combinations of alleles that they can be kept in
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33/42 população (Gibson, Muse 2009). Isso explica a herança de alelo completo observado dentro dessa população. A força relativa desses dois processos determinará a força do desequilíbrio entre os loci (Halliburton 2003).33/42 population (Gibson, Muse 2009). This explains the inheritance of complete allele observed within this population. The relative strength of these two processes will determine the strength of the imbalance between the loci (Halliburton 2003).
[0136] O desequilíbrio gamético será transitório na ausência de pressão de seleção de amitraz agindo para mantê-lo, facilitando assim a recombinação que quebrará as associações alélicas não aleatórias (Hartl, Clarke 1989; Halliburton 2003). Isso podería explicar os locais variáveis adicionais que foram detectados nos heterozigotos que exibiram associações mínimas com outros loci (dados não mostrados). Conforme previamente mencionado, as subseções heterozigóticas da população poderíam escapar da pressão de amitraz, impedindo, assim, o desequilíbrio e auxiliando a recombinação que dá origem a essas novas combinações de alelos.[0136] Gametic imbalance will be transitory in the absence of amitraz selection pressure acting to maintain it, thus facilitating the recombination that will break non-random allelic associations (Hartl, Clarke 1989; Halliburton 2003). This could explain the additional variable sites that were detected in heterozygotes that exhibited minimal associations with other loci (data not shown). As previously mentioned, the heterozygous subsections of the population could escape the pressure of amitraz, thus preventing the imbalance and assisting the recombination that gives rise to these new combinations of alleles.
[0137] Os estudos de diferenciação da população mostraram que o coeficiente de endogamia (Fis) dentro das subpopulações foi negativo para todas menos uma população, significando que a maioria dos indivíduos são heterozigotos. O coeficiente de endogamia global foi de -0,137, e indicou um excesso de heterozigotos sobre todas as populações analisadas (Holsinger, Weir 2009). Isso podería ser devido a diversos fatores incluindo acasalamento dissociado, quebra de isolamento ou um efeito de Wahlund onde excesso de heterozigotos é observado sobre a expectativa de HWE (Hartl 2000). O grau geral de diferenciação genética (Fst) revelou que 2,5% da variação genética foram distribuídos entre as subpopulações, enquanto os 97,5% restantes foram devido à variação dentro das subpopulações.[0137] Population differentiation studies showed that the inbreeding coefficient (Fis) within subpopulations was negative for all but one population, meaning that most individuals are heterozygous. The global inbreeding coefficient was -0.137, and indicated an excess of heterozygotes over all analyzed populations (Holsinger, Weir 2009). This could be due to a number of factors including dissociated mating, breach of isolation or a Wahlund effect where excess heterozygotes are observed on the expectation of HWE (Hartl 2000). The general degree of genetic differentiation (Fst) revealed that 2.5% of the genetic variation was distributed among the subpopulations, while the remaining 97.5% was due to the variation within the subpopulations.
[0138] A exploração da existência de SN Ps associados resultou em detecção precisa de resistência ao amitraz em amostras sinônimas. Foi mostrado que a detecção molecular usando uma técnica de RFLP é mais econômica, mais fácil e mais rápida do que os testes de pacote de larvas tradicionais. Os heterozigotos foram caracterizados como suscetíveis, fundamentando as reivindicações anteriores de que a resistência ao amitraz é necessariamente herdada (Fragoso-Sanchez et al. 2011). A maioria da[0138] The exploration of the existence of associated SN Ps resulted in the accurate detection of resistance to amitraz in synonymous samples. Molecular detection using an RFLP technique has been shown to be cheaper, easier and faster than traditional larval packet testing. Heterozygotes have been characterized as susceptible, substantiating previous claims that resistance to amitraz is necessarily inherited (Fragoso-Sanchez et al. 2011). Most of the
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34/42 população exibiu heterozigose, através de extrapolação dos resultados obtidos das avaliações de RFLP, pode-se sugerir que essa população ainda é suscetível ao amitraz (com a exceção das amostras resistentes de homozigotos). Esse protocolo desempenhará um importante papel futuro no monitoramento do surgimento de resistência ao amitraz nos carrapatos R. microplus and R. decoloratus sul-africanos. Tal informação podería auxiliar na orientação do uso de químicos de controle eficazes, bem como prever quando e onde a resistência ao amitraz pode aparecer.34/42 population exhibited heterozygosity, through extrapolation of the results obtained from RFLP evaluations, it can be suggested that this population is still susceptible to amitraz (with the exception of resistant samples of homozygotes). This protocol will play an important future role in monitoring the emergence of resistance to amitraz in South African R. microplus and R. decoloratus ticks. Such information could assist in guiding the use of effective control chemicals, as well as predicting when and where resistance to amitraz may appear.
[0139] A novidade desse trabalho inclui a primeira confirmação dos dois SNPs publicados por Chen et al. (2007) nas larvas resistentes ao amitraz, bem como populações de campo dos carrapatos. Também foi o primeiro relatório de quaisquer estudos de associação conduzidos para o receptor OCT/Tyr nos carrapatos. A descoberta de um evento de recombinação que podería possivelmente ser o ‘comutador’ de fenótipos suscetíveis a resistentes nas populações expostas ao amitraz é um avanço significativo em direção a uma perspectiva mais completa na evolução da resistência ao acaricida. Por último, esse estudo é a primeira indicação de que as populações de campo heterozigóticas são suscetíveis ao tratamento com amitraz, permitindo estratégias alternativas e melhoradas para serem implementadas nas fazendas antes da resistência total desenvolvida ser adquirida.[0139] The novelty of this work includes the first confirmation of the two SNPs published by Chen et al. (2007) in larvae resistant to amitraz, as well as field populations of ticks. It was also the first report of any association studies conducted for the OCT / Tyr receptor in ticks. The discovery of a recombination event that could possibly be the 'switcher' of resistant and susceptible phenotypes in populations exposed to amitraz is a significant advance towards a more complete perspective on the evolution of resistance to acaricide. Finally, this study is the first indication that heterozygous field populations are susceptible to treatment with amitraz, allowing for alternative and improved strategies to be implemented on farms before the total developed resistance is acquired.
3. Materiais e Métodos3. Materials and Methods
Coleções, identificação e extração de DNA de carrapato [0140] Os carrapatos adultos foram coletados por Zoetis (Pty) Ltd. de 108 fazendas diferentes em toda a África do Sul, das quais 53 fazendas continham carrapatos R. microplus. A classificação de carrapatos coletados nos seus respectivos gêneros foi feita de acordo com autores anteriores (Walker et al. 2003; Madder, Horak 2010). Outra diferenciação entre espécie de Rhipicephalus (Boophilus) foi feita usando técnicas de microscopia. Para distinguir entre R. microplus e R. decoloratus fêmeas, a dentição hipostoma foi examinada, com as esporas adanais para os carrapatos machos (Walker et al.Collections, identification and extraction of tick DNA [0140] Adult ticks were collected by Zoetis (Pty) Ltd. from 108 different farms across South Africa, of which 53 farms contained R. microplus ticks. The classification of ticks collected in their respective genera was made according to previous authors (Walker et al. 2003; Madder, Horak 2010). Another differentiation between species of Rhipicephalus (Boophilus) was made using microscopy techniques. To distinguish between R. microplus and R. decoloratus females, the hypostoma dentition was examined, with adanal spurs for male ticks (Walker et al.
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2003; Madder, Horak 2010). A identificação molecular dos carrapatos também foi realizada com base nas análises de polimorfismo de comprimento de fragmento der restrição (RFLP) (Lempereur, Gevsen, Madder 2010).2003; Madder, Horak 2010). The molecular identification of ticks was also performed based on the analysis of restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Lempereur, Gevsen, Madder 2010).
[0141] As amostras de controle de larvas resistentes ao amitraz foram obtidas da área Mnisi no Parque Nacional Kruger da Dr. Rosalind Malan. Foram providas doze cepas diferentes, das quais três foram classificadas como resistentes com base em seus fatores de resistência, que foram determinados por testes de pacote de larvas convencionais (Stone, Havdock 1962).[0141] Control samples of larvae resistant to amitraz were obtained from the Mnisi area in Dr. Rosalind Malan's Kruger National Park. Twelve different strains were provided, of which three were classified as resistant based on their resistance factors, which were determined by conventional larval pack tests (Stone, Havdock 1962).
[0142] Um método de extração à base de sal modificado publicado por Aljanabi, Martinez (1997) foi usado para isolamento de DNA genômico de carrapatos adultos inteiros (carrapatos predominantemente fêmeas). Os carrapatos inteiros foram homogeneizados em 200 μΙ_ de tampão de lise (a 0,5 M, 0,5% (p/v) de lauroil sarcosinato de sódio). Mais 400 μΙ_ de solução de extração de DNA (NaCl a 0,4 M, Tris-HCl a 60 mM, EDTA a 12 mM, 0,25% de SDS, pH 8,0) foram adicionados às amostras com 2 μΙ_ de proteinase K (15 mg/mL), bem misturados e incubados durante a noite a 55 °C. As amostras foram incubadas por 20 minutos a 65 °C para inativar a proteinase K, após a qual 1 μΙ_ de RNase A (10 mg/mL) foi adicionado. As amostras foram brevemente submetidas a vórtex e incubadas adicionalmente a 37 °C por 15 minutos. A precipitação de proteína foi realizada pela adição de 360 μΙ_ de NaCl a 5 M, submissão ao vórtex por 10 segundos, e incubação no gelo por 5 minutos, seguido por centrifugação a 25500 xg por 20 minutos à temperatura ambiente. Um volume igual de isopropanol foi adicionado ao sobrenadante, brevemente submetido a vórtex, seguido por uma incubação de 1 hora a -20 °C. As amostras foram então centrifugadas por 20 minutos a 10000 xg e os sobrenadantes descartados. Os péletes de DNA foram lavados três vezes consecutivas com 500 μΙ_ de 70% de etanol, centrifugados por 5 minutos a 10000 xg, e o sobrenadante descartado. Os péletes de DNA final foram secados com ar e então ressuspensos em 50 μΙ_ de 1 x tampão de TE (Tris-HCl a 1 mM, EDTA a 0,1 mM, pH 7,0).[0142] A modified salt-based extraction method published by Aljanabi, Martinez (1997) was used to isolate genomic DNA from whole adult ticks (predominantly female ticks). The whole ticks were homogenized in 200 μΙ_ of lysis buffer (0.5 M, 0.5% (w / v) sodium lauroyl sarcosinate). An additional 400 μΙ_ of DNA extraction solution (0.4 M NaCl, 60 mM Tris-HCl, 12 mM EDTA, 0.25% SDS, pH 8.0) was added to the samples with 2 μΙ_ of proteinase K (15 mg / mL), well mixed and incubated overnight at 55 ° C. The samples were incubated for 20 minutes at 65 ° C to inactivate proteinase K, after which 1 μΙ_ of RNase A (10 mg / mL) was added. The samples were briefly vortexed and further incubated at 37 ° C for 15 minutes. Protein precipitation was performed by adding 360 μΙ_ of 5 M NaCl, vortexing for 10 seconds, and incubating on ice for 5 minutes, followed by centrifugation at 25500 xg for 20 minutes at room temperature. An equal volume of isopropanol was added to the supernatant, briefly vortexed, followed by a 1 hour incubation at -20 ° C. The samples were then centrifuged for 20 minutes at 10,000 xg and the supernatants discarded. The DNA pellets were washed three times in a row with 500 μΙ_ of 70% ethanol, centrifuged for 5 minutes at 10,000 xg, and the supernatant discarded. The final DNA pellets were dried with air and then resuspended in 50 μΙ of 1 x TE buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.0).
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36/42 [0143] O DNA genômico foi extraído de larvas individuais usando uma modificação do protocolo por Hernandez et al. (2002). Resumidamente, as larvas individuais foram esmagadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 25 μΙ_ de tampão de TE (Tris a 10 mM, EDTA de 1 mM, pH 7,6). A suspensão foi então fervida por 5 min e centrifugada a 4000 xg por 30 segundos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi diretamente usado para PCR.36/42 [0143] Genomic DNA was extracted from individual larvae using a modification of the protocol by Hernandez et al. (2002). Briefly, the individual larvae were crushed in a 1.5 ml microcentrifuge tube containing 25 μΙ of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6). The suspension was then boiled for 5 min and centrifuged at 4000 xg for 30 seconds at room temperature. The supernatant was used directly for PCR.
Amplificação de PCR e sequenciamento do gene receptor OCT/Tyr [0144] Os iniciadores publicados (Chen et al. 2007) foram usados para amplificação de PCR de um fragmento de 417 bp do gene receptor OCT/Tyr em uma temperatura de recozimento de 55 °C. Esse método funcionou suficientemente para algumas amostras, mas devido às diferenças da cepa do carrapato, um novo iniciador direto foi projetado. O novo iniciador direto, OARF172 (5’- AGC ATT CTG CGG TTT TCT AC-3’), foi projetado com base nos dados de sequência das novas amostras que amplificaram com sucesso. Esse iniciador direto foi usado para a maioria das amostras de carrapato com as mesmas condições de reação. O uso foi feito do seguinte iniciador reverso: OAR-R587 (5’ - GCA GAT GAC CAG CAC GTT ACC G - 3’).PCR amplification and OCT / Tyr receptor gene sequencing [0144] Published primers (Chen et al. 2007) were used for PCR amplification of a 417 bp fragment of the OCT / Tyr receptor gene at an annealing temperature of 55 ° Ç. This method worked sufficiently for some samples, but due to differences in the tick strain, a new direct primer was designed. The new direct primer, OARF172 (5'- AGC ATT CTG CGG TTT TCT AC-3 '), was designed based on the sequence data from the new samples that have successfully amplified. This direct primer was used for most tick samples with the same reaction conditions. The use was made of the following reverse primer: OAR-R587 (5 '- GCA GAT GAC CAG CAC GTT ACC G - 3').
[0145] Todos os produtos PCR foram sequenciados por Macrogen Inc. (Holanda) em uma placa de 96 poços de acordo com a estratégia de sequenciamento do terminador de corante padrão. As sequências foram analisadas usando editor de alinhamento de sequência BioEdit versão 7.2.0 (Hall 2007), e múltiplos alinhamentos de sequência foram realizados usando o programa MAFFT online (http://mafft.cbrc.iD/aliqnment/software/) (Katoh, Standlev 2013). As sequências foram alinhadas com sequência de NCBI publicadas para determinar se quaisquer SN Ps estavam presentes. As sequências de aminoácido inferidas foram usadas para identificar mutações sinônimas ou não sinônimas.[0145] All PCR products were sequenced by Macrogen Inc. (The Netherlands) in a 96-well plate according to the standard dye terminator sequencing strategy. Sequences were analyzed using BioEdit sequence alignment editor version 7.2.0 (Hall 2007), and multiple sequence alignments were performed using the MAFFT online program (http://mafft.cbrc.iD/aliqnment/software/) (Katoh , Standlev 2013). The sequences were aligned with published NCBI sequences to determine whether any SN Ps were present. The inferred amino acid sequences were used to identify synonymous or non-synonymous mutations.
Estrutura e análise de populaçãoPopulation structure and analysis
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37/42 [0146] Todas as amostras da pesquisa nacional foram efetivamente colocadas em subpopulações relativas à área em que elas foram coletadas. As subpopulações foram estabelecidas por seccionamento do país em blocos de 300 x 300 km. As subpopulações foram então designadas com números de 1 a 15 (Figura Suplementar S1). Apenas as subpopulações 2, 7, 8, 11 e 12 foram usadas para determinar a estrutura da população devido à falta de dados de sequência disponíveis nas outras subpopulações. Os parâmetros genéticos de população foram estimados usando POPGENE versão 1.31 (Yeh et al. 1997). Desequilíbrio qamético e recombinacão ancestral [0147] Os estudos de desequilíbrio gamético foram realizados para determinar a associação intragênica (ligação) entre alelos de SNP dentro do gene receptor OCT/Tyr. Essa análise foi executada usando o programa Multilocus 1.2b1 (Aqapow, Burt 2001). Para essas análises, 100.000 randomizações de dados foram realizadas para comparar os dados observados com dados randomizados que imitam equilíbrio gamético. Se o conjunto de dados observado exibiu aumento de desequilíbrio gamético comparado aos conjuntos de dados randomizados, presumiu-se que há associação entre os loci. Isso também foi apoiado pelos valores de P. As funções executadas usando Multilocus incluíam análise de diversidade genotípica versus o número de loci, desequilíbrio de ligação e análise de diferenciação de população.37/42 [0146] All samples from the national survey were effectively placed in subpopulations relative to the area in which they were collected. Subpopulations were established by sectioning the country into blocks of 300 x 300 km. The subpopulations were then designated with numbers from 1 to 15 (Supplementary Figure S1). Only subpopulations 2, 7, 8, 11 and 12 were used to determine the population structure due to the lack of sequence data available in the other subpopulations. The population genetic parameters were estimated using POPGENE version 1.31 (Yeh et al. 1997). Qametic imbalance and ancestral recombination [0147] Gametic imbalance studies were performed to determine the intragenic association (link) between SNP alleles within the OCT / Tyr receptor gene. This analysis was performed using the Multilocus 1.2b1 program (Aqapow, Burt 2001). For these analyzes, 100,000 data randomizations were performed to compare the observed data with randomized data that mimic gametic balance. If the observed data set exhibited an increase in gametic imbalance compared to randomized data sets, it was assumed that there is an association between the loci. This was also supported by the P values. Functions performed using Multilocus included analysis of genotypic diversity versus number of loci, linkage imbalance and population differentiation analysis.
[0148] Para determinar as histórias evolucionárias dentro dos genes de resistência, os gráficos de recombinação ancestral foram construídos usando SNAP Workbench (Price, Carbone 2005). Os alinhamentos de sequência foram convertidos em haplótipos através de exclusão de indels e infinitas violações de local. O algoritmo de ramificação e de Beagle vinculado em SNAP Workbench foi implementado para inferir o número mínimo de eventos de recombinação dentro do gene que podería explicar os dados (Lynqso, Song, Hein 2005).[0148] To determine the evolutionary histories within the resistance genes, the ancestral recombination plots were constructed using SNAP Workbench (Price, Carbone 2005). The sequence alignments were converted into haplotypes by excluding indels and infinite location violations. The branching and Beagle algorithm linked in SNAP Workbench was implemented to infer the minimum number of recombination events within the gene that could explain the data (Lynqso, Song, Hein 2005).
Ensaio diagnóstico à base de RFLP [0149] O teste diagnóstico rápido para resistência ao amitraz foi avaliado na forma de uma análise de RFLP. As larvas de R. decoloratus suscetíveis eDiagnostic assay based on RFLP [0149] The rapid diagnostic test for resistance to amitraz was evaluated in the form of an RFLP analysis. The susceptible R. decoloratus larvae and
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38/42 resistentes (confirmadas através de testes de pacote de larvas) foram obtidas da Universidade do Estado Livre, África do Sul (Sra. Ellie van Dalen), para a finalidade de um estudo duplo-cego. As larvas foram rotuladas de um até 14, com o status de sua resistência desconhecido até após o experimento. O gene receptor OCT/Tyr foi amplificado de DNA larval volumoso, e amplicons foram subsequentemente tratados com 4 U de enzima de restrição Ec/1. Dependendo do padrão particular que foi observado após digestão, as amostras foram classificadas como suscetíveis ou resistentes ao tratamento com amitraz. Esses testes foram comparados aos estados de resistência avaliados independentemente, a fim de comparar a precisão do teste diagnóstico.38/42 resistant (confirmed by larval packet tests) were obtained from the University of the Free State, South Africa (Mrs. Ellie van Dalen), for the purpose of a double-blind study. The larvae were labeled from 1 to 14, with their resistance status unknown until after the experiment. The OCT / Tyr receptor gene was amplified from large larval DNA, and amplicons were subsequently treated with 4 U of Ec / 1 restriction enzyme. Depending on the particular pattern that was observed after digestion, the samples were classified as susceptible or resistant to treatment with amitraz. These tests were compared to the resistance states evaluated independently, in order to compare the accuracy of the diagnostic test.
[0150] O objetivo desse estudo foi avaliar os SNPs no receptor OCT/Tyr (Chen, He, Davev 2007) nas populações de campo sul-africanas de R. microplus. As larvas resistentes e suscetíveis ao amitraz de uma área controlada e fechada no Parque Nacional de Kruger, na África do Sul, foram rastreadas para esses dois SNPs. Uma correlação foi então feita entre a presença desses SNPs e resultados de LPT. Consequentemente, uma pesquisa nacional para detectar a presença desses SNPs foi então conduzida. A fim de melhor compreender a natureza complexa da resistência ao amitraz em carrapatos, outra análise foi feita para testar a presença de desequilíbrio gamético entre esses SNPs, e para investigar a contribuição de recombinação em direção ao surgimento de resistência ao amitraz. Finalmente, os resultados dessas análises levaram ao desenvolvimento de uma ferramenta de diagnóstico baseada em RFLP para avaliar a resistência ao amitraz nas populações de carrapato sul-africanas.[0150] The aim of this study was to evaluate SNPs at the OCT / Tyr receptor (Chen, He, Davev 2007) in South African field populations of R. microplus. Resistant larvae and susceptible larvae from a controlled and enclosed area in Kruger National Park, South Africa, have been tracked for these two SNPs. A correlation was then made between the presence of these SNPs and LPT results. Consequently, a national survey to detect the presence of these SNPs was then conducted. In order to better understand the complex nature of amitraz resistance in ticks, another analysis was done to test for the presence of gametic imbalance between these SNPs, and to investigate the contribution of recombination towards the emergence of amitraz resistance. Finally, the results of these analyzes led to the development of an RFLP-based diagnostic tool to assess resistance to amitraz in South African tick populations.
[0151] Os objetivos principais desse estudo foram triplicados. Primeiro, foi feita uma tentativa de correlacionar dois SNPs conhecidos no receptor octopaminérgico com resistência ao amitraz nas amostras de campo sulafricanas de R. microplus. Segundo, o desequilíbrio gamético para esses SNPs foi calculado para determinar se eles estão aleatoriamente associados. Por último, foi lançada uma investigação para avaliar os efeitos evolutivos de[0151] The main objectives of this study were tripled. First, an attempt was made to correlate two known SNPs at the octopaminergic receptor with resistance to amitraz in South African field samples of R. microplus. Second, the gametic imbalance for these SNPs was calculated to determine whether they are randomly associated. Finally, an investigation was launched to assess the evolutionary effects of
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39/42 recombinação dentro do receptor octopaminérgico. Os resultados apresentados aqui confirmaram que os SN Ps da invenção estão associados com resistência ao amitraz, e que eles estão em desequilíbrio gamético. Adicionalmente, a recombinação no receptor octopaminérgico pode estar correlacionada ao surgimento de resistência ao amitraz. Esses resultados são úteis a fazendeiros na África subsaariana, e o surgimento de resistência ao amitraz deveria ser intimamente monitorado no futuro. Portanto, o depositante apresente uma técnica de diagnóstico à base de RFLP rápida e acessível para avaliar a resistência ao amitraz nas amostras de campo de R. microplus.39/42 recombination within the octopaminergic receptor. The results presented here confirmed that the SN Ps of the invention are associated with resistance to amitraz, and that they are in gametic imbalance. Additionally, recombination at the octopaminergic receptor may be correlated with the emergence of resistance to amitraz. These results are useful to farmers in sub-Saharan Africa, and the emergence of resistance to amitraz should be closely monitored in the future. Therefore, the depositor presents a fast and accessible RFLP-based diagnostic technique to assess resistance to amitraz in R. microplus field samples.
4. Conclusão [0152] A invenção provê um teste de diagnóstico rápido para avaliar a resistência ao amitraz em R. microplus. O teste inclui as etapas de:4. Conclusion [0152] The invention provides a rapid diagnostic test to assess resistance to amitraz in R. microplus. The test includes the steps of:
extração de uma amostra de DNA do ectoparasita;extraction of a DNA sample from ectoparasite;
amplificação de uma sequência da amostra de DNA que corresponde a pelo menos parte de uma sequência de codificação de um receptor octopamina/tiramina do ectoparasita;amplification of a DNA sample sequence that corresponds to at least part of an ectoparasite octopamine / tyramine receptor coding sequence;
obtenção de um produto de amplificação; e análise do produto de amplificação para a presença de um ou mais marcadores associados com resistência do ectoparasita ao acaricida.obtaining an amplification product; and analysis of the amplification product for the presence of one or more markers associated with ectoparasite resistance to acaricide.
Extração de DNA qenômico de carrapatos e larvas [0153] Um método de extração à base de sal modificado publicado por Aljanabi, Martinez (1997) foi usado para isolamento de DNA genômico de carrapatos adultos inteiros (carrapatos predominantemente fêmeas). Os carrapatos inteiros foram homogeneizados em 200 μΙ_ de tampão de lise (EDTA a 0,5 M, 0,5% (p/v) de lauroil sarcosinato de sódio). Mais 400 μΙ_ de solução de extração de DNA (NaCI a 0,4 M, Tris-HCI a 60 mM, EDTA a 12 mM, 0,25% de SDS, pH 8,0) foram adicionados às amostras com 2 μΙ_ de proteinase K (15 mg/mL), bem misturados e incubados durante a noite a 55 °C. As amostras foram incubadas por 20 minutos a 65 °C para inativar a proteinase K, após a qual 1 μΙ_ de RNase A (10 mg/mL) foi adicionado. As amostras foramExtraction of qenomic DNA from ticks and larvae [0153] A modified salt-based extraction method published by Aljanabi, Martinez (1997) was used to isolate genomic DNA from whole adult ticks (predominantly female ticks). The whole ticks were homogenized in 200 μΙ_ of lysis buffer (0.5 M EDTA, 0.5% (w / v) sodium lauroyl sarcosinate). An additional 400 μΙ_ of DNA extraction solution (0.4 M NaCI, 60 mM Tris-HCI, 12 mM EDTA, 0.25% SDS, pH 8.0) was added to the samples with 2 μΙ_ of proteinase K (15 mg / mL), well mixed and incubated overnight at 55 ° C. The samples were incubated for 20 minutes at 65 ° C to inactivate proteinase K, after which 1 μΙ_ of RNase A (10 mg / mL) was added. The samples were
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40/42 resumidamente submetidas a vórtex e ainda incubadas a 37 °C por 15 minutos. A precipitação de proteína foi realizada pela adição de 360 μΙ_ de NaCl de 5 M, submissão a vórtex por 10 segundos, e incubação no gelo por 5 minutos, seguido pela centrifugação a 25500 xg por 20 min à temperatura ambiente. Um volume igual de isopropanol foi adicionado ao sobrenadante, brevemente submetido a vórtex, seguido por uma incubação de 1 hora a -20 °C. As amostras foram então centrifugadas por 20 minutos a 10000 xg e os sobrenadantes descartados. Os péletes de DNA foram lavados três vezes consecutivas com 500 μΙ_ de 70% de etanol, centrifugados por 5 minutos a 10000 xg, e o sobrenadante descartado. Os péletes de DNA final foram secados com ar e então ressuspensos em 50 μΙ_ de 1 x tampão de TE (Tris-HCI a 1 mM, EDTA a 0,1 mM, pH 7,0).40/42 briefly vortexed and further incubated at 37 ° C for 15 minutes. Protein precipitation was performed by adding 360 μΙ_ of 5 M NaCl, vortexing for 10 seconds, and incubating on ice for 5 minutes, followed by centrifugation at 25500 xg for 20 min at room temperature. An equal volume of isopropanol was added to the supernatant, briefly vortexed, followed by a 1 hour incubation at -20 ° C. The samples were then centrifuged for 20 minutes at 10,000 xg and the supernatants discarded. The DNA pellets were washed three times in a row with 500 μΙ_ of 70% ethanol, centrifuged for 5 minutes at 10,000 xg, and the supernatant discarded. The final DNA pellets were air dried and then resuspended in 50 μΙ of 1 x TE buffer (1 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 7.0).
[0154] O DNA genômico foi extraído de larvas individuais usando uma modificação do protocolo por Hernandez et al. (2002). Resumidamente, as larvas individuais foram esmagadas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 25 μΙ_ de tampão de TE (Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,6). A suspensão foi então fervida por 5 minutos e centrifugada a 4000 xg por 30 segundos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi diretamente usado para PCR.[0154] Genomic DNA was extracted from individual larvae using a modification of the protocol by Hernandez et al. (2002). Briefly, the individual larvae were crushed in a 1.5 mL centrifuge tube containing 25 μΙ of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6). The suspension was then boiled for 5 minutes and centrifuged at 4000 xg for 30 seconds at room temperature. The supernatant was used directly for PCR.
Amplificação de PCR do receptor octopamina/tiramina [0155] Um novo iniciador direto foi projetado SEQ. ID. NO. 1(OAR-F172 (5’- AGC ATT CTG CGG TTT TCT AC-3’)) e um iniciador reverso SEQ. ID. NO. 2 (OAR-R587 (5’ - GCA GAT GAC CAG CAC GTT ACC G - 3’)) foi usado para amplificação do gene.PCR amplification of the octopamine / tyramine receptor [0155] A new direct primer was designed SEQ. ID. AT THE. 1 (OAR-F172 (5'-AGC ATT CTG CGG TTT TCT AC-3 ')) and a SEQ reverse primer. ID. AT THE. 2 (OAR-R587 (5 '- GCA GAT GAC CAG CAC GTT ACC G - 3')) was used for gene amplification.
[0156] Novas condições de PCR foram desenvolvidas para a amplificação, a saber:[0156] New PCR conditions have been developed for amplification, namely:
°C por 4 minutos, seguido por 40 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 1 minuto, com uma extensão final de 72 °C por 8 minutos.° C for 4 minutes, followed by 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute, with a final extension of 72 ° C for 8 minutes.
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A amplificação desses genes foi feita para detectar os dois SN Ps publicados:The amplification of these genes was done to detect the two published SN Ps:
A22C (sequência de nucleotídeo)/T8P (sequência de aminoácido)A22C (nucleotide sequence) / T8P (amino acid sequence)
T65C (sequência de nucleotídeo)/L22S (sequência de aminoácido) [0157] Esses dois SN Ps foram encontrados também com uma variedade de outros. Os estudos de desequilíbrio de ligação mostraram que certas posições variáveis estavam intimamente associadas com os dois SN Ps resistentes, e poderíam, portanto, potencialmente ser bons marcadores diagnósticos de resistência.T65C (nucleotide sequence) / L22S (amino acid sequence) [0157] These two SN Ps were also found with a variety of others. The linkage imbalance studies showed that certain variable positions were closely associated with the two resistant SN Ps, and could therefore potentially be good diagnostic markers of resistance.
Digestão de enzima de restrição de produto de gene amplificado com Ecil [0158] (Toda nomeação de mutação é baseada nas sequências de nucleotídeo da região de codificação apenas; posições de região de não codificação são excluídas).Restriction enzyme digestion of amplified gene product with Ecil [0158] (All mutation naming is based on the nucleotide sequences of the coding region only; positions of the non-coding region are excluded).
[0159] Um dos locais de mutação que são direcionados foi relatado por Chen et al. 2007, mas desconsiderado porque não resultou em uma mudança de aminoácido. O local de mutação é C39T. O local de mutação adicional G41A (nucleotídeo)/G14E (aminoácido) é novo e nunca foi relatado antes. A enzima escolhida (Ec/1) reconhecerá as mutações em ambos os locais. Adicionalmente, a mutação G41A está intimamente ligada à mutação de recombinação encontrada na posição C159T (região de codificação), que também é nova e sugere-se que seja o comutador de suscetível para resistente.[0159] One of the mutation sites that are targeted was reported by Chen et al. 2007, but disregarded because it did not result in an amino acid change. The mutation site is C39T. The additional G41A (nucleotide) / G14E (amino acid) mutation site is new and has never been reported before. The chosen enzyme (Ec / 1) will recognize the mutations at both sites. Additionally, the G41A mutation is closely linked to the recombination mutation found at position C159T (coding region), which is also new and is suggested to be the susceptible to resistant switch.
[0160] Os fragmentos amplificados do receptor octopamina foram subsequentemente tratados com 4 U de enzima de restrição de Ec/1 em uma reação de 50 pL contendo 5 pL do tampão CutSmart™ (acetato de potássio a 50 mM, Tris-acetato a 20 mM, acetato de magnésio a 10 mM e 100 pg/mL de BSA, pH 7,9).[0160] The amplified fragments of the octopamine receptor were subsequently treated with 4 U of Ec / 1 restriction enzyme in a 50 pL reaction containing 5 pL of CutSmart ™ buffer (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate , 10 mM magnesium acetate and 100 pg / ml BSA, pH 7.9).
[0161] Outras enzimas que poderíam ser usadas para diagnóstico reconhecem a sequência 5’- GGATG -3’, que pegaria uma mutação na posição T36C (sequência de nucleotídeo). Essa mutação está intimamente associada com suscetibilidade, em vez de resistência, mas ainda podería ser usada para[0161] Other enzymes that could be used for diagnosis recognize the 5'-GGATG -3 'sequence, which would take a mutation at the T36C position (nucleotide sequence). This mutation is closely associated with susceptibility rather than resistance, but it could still be used to
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42/42 diagnóstico. A lista de enzimas inclui: BseGI, BstF5l, BstPZ418l, Fokl, Stsl. Uma enzima que reconhece a sequência 5’- GGACG -3’ também podería ser usada para o teste.42/42 diagnosis. The list of enzymes includes: BseGI, BstF5l, BstPZ418l, Fokl, Stsl. An enzyme that recognizes the 5'-GGACG -3 'sequence could also be used for the test.
[0162] Essas mudanças na sequência podem ser detectadas ou diagnosticadas por sequenciamento, bem como por RFLP, conforme mencionado acima. Pode ainda ser detectada com um método de detecção de ensaio ‘vareta’. O teste pode incluir detecção de enzimas aumentadas (isto é, glutationa-s-transferases, citocromo P450s, carboxilesterases). Os métodos de detecção desses incluem ensaios qPCR e Taqman.[0162] These changes in the sequence can be detected or diagnosed by sequencing, as well as by RFLP, as mentioned above. It can also be detected with a 'rod' test detection method. The test may include detection of increased enzymes (i.e., glutathione-s-transferases, cytochrome P450s, carboxylesterases). Detection methods for these include qPCR and Taqman assays.
[0163] O teste pode detectar resistência aos piretróides e formamidinas (amitraz). A resistência ao piretróide já está bem documentada. Já foi mostrado que esse teste pode ser aplicado ao Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus decoloratus, e outras espécies de carrapato.[0163] The test can detect resistance to pyrethroids and formamidines (amitraz). Pyrethroid resistance is well documented. It has already been shown that this test can be applied to Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus decoloratus, and other tick species.
[0164] O inventor acredita que a invenção provê um novo método para testar se um carrapato se tornou resistente ao amitraz.[0164] The inventor believes that the invention provides a new method for testing whether a tick has become resistant to amitraz.
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