BR112017009321B1 - Sonda, mistura reacional, e, kit de teste - Google Patents
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Abstract
iniciadores e sondas, mistura reacional, e, kit de teste. iniciadores e sondas para detecção in vitro de parvovírus humano 4 compreendem sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que compreende ou quaisquer combinações dos mesmos: uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da seq id no: 1 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo o mínimo de 90% de identidade de sequência com a seq id no: 1; uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da seq id no: 2 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo o mínimo de 90% de identidade de sequência com a seq id no: 2; e uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da seq id no: 3 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo o mínimo de 90% de identidade de sequência com a seq id no: 3; em que as sequências de nucleotídeos permitem alta detecção de todos os genótipos de parvovírus humano 4.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo de detecção IN VITRO de Parvovírus Humano 4 no plasma humano, soro, CSF, amostras de material coletado da garganta e nasal. Mais particularmente, a invenção refere-se aos iniciadores e sondas específicos e altamente sensíveis para PCR em Tempo Real, que permite a detecção de Parvovírus Humano 4. A presente invenção também provê as sondas e os iniciadores que vantajosamente ajudam na detecção de todos os genótipos e subtipos de Parvovírus humano 4 e também proveu sondas e iniciadores que são eficientes o suficiente para detectar amostra com os baixos números de cópias de vírus. Adicionalmente, a invenção se estende para prover uma mistura reacional para a PCR em tempo real que permite a detecção de Parvovírus humano 4.
[002] O Parvovírus Humano 4 (Parv4) é um vírus novo na família PARVOVIRIDAE, descoberta em 2005 no sangue de um usuário de drogas injetáveis (IVDU). O Parvovírus Humano 4 é um vírus do DNA de filamento único, de ~5,3kb de comprimento, de partículas esféricas, não desenvolvidas, com diâmetro de 20-25nm. O genoma compreende duas estruturas de leitura aberta principais, mas ao contrário o Parvovírus humano B 19, as duas ORFs não se sobrepõem. É esperado que devido à semelhança com o Parvovírus Humano B 19 e outros parvovírus, possa ter propriedades similares.
[003] O Parvovírus 4 e os vírus tipo Parvovírus 4 de outros primatas e suínos têm sido categorizados juntos em um novo gênero, o Partetravírus. Os genótipos 1 e 2 de Parv4 foram detectados no hemisfério norte ao mesmo tempo que o genótipo 3 foi descoberto na África. No hemisfério norte os anticorpos de Parv4 e DNA de Parv4 são encontrados na maioria das vezes nos IVDUs e outros que são parenteralmente expostos.
[004] Na África, a infecção por Parv4 parece ser mais frequente. A patogenicidade de Parv4 é desconhecida, mas o Parv4 tem sido associado à meningite nas crianças, hydrops fetalis e também tem sido constatada na coinfecção com o Vírus da imunodeficiência humana, Vírus da hepatite C e Vírus da hepatite B. A via exata de transmissão ainda é para ser estabelecida, mas as vias respiratórias, transplacentais e parenterais são implicadas na causa da propagação.
[005] A incidência crescente e a possível associação de Parvovírus humano 4 com muitas das doenças clínicas aumenta a demanda para um kit altamente sensível, específico para a detecção de parvovírus humano 4. Não existe FDA aprovada atualmente empregada nos métodos para a diagnose de parvovírus humano 4, de qualquer modo, poucos ensaios da PCR e testes de anticorpos IgG e IgM foram desenvolvidos pelos laboratórios acadêmicos. Além do mais, devido à diversidade genotípica muitos dos ensaios têm limitações na escolha de todos os genótipos existentes. Os ensaios com base na PCR em Tempo Real para a detecção ácidos nucleicos de parvovírus humano 4 no plasma humano, soro, CSF, amostras de material coletado da garganta e nasal de um indivíduo infectado pode prover uma vantagem.
[006] O EP 2251441 A1 (Stefan Schorling, 2010) descreve um método de detecção e kit para a detecção de Parvovírus humano B19 em uma amostra de teste. De qualquer modo, o teste não detecta a presença de parvovírus humano 4.
[007] O WO 2003002753 a2 (Sergio Pichuantes, Venkatakrishna Shyamala, 2003) descreve um método para a detecção de detectar o parvovírus humano b19 em uma amostra de teste. De qualquer modo, este teste também não detecta a presença de parvovírus humano 4.
[008] As patentes US 2014106337(A1) e US 2003170612(A1) proveem um sistema de detecção para a detecção do parvovírus humano B 19 que não tem nada a ver com o parvovírus humano 4. O parvovírus humano 4 não tem semelhança de genoma com o parvovírus humano B 19 e ambos são vírus diferentes. De qualquer modo, o ensaio intitulado "Analysis of two human parvovirus PARV4 genotypes identified in human plasma for fractionation" é com base na PCR convencional que já tem muitas limitações conhecidas sobre a PCR em Tempo Real. Outro ensaio "A two- step real-time peR assay for quantitation and genotyping of human parvovirus 4" (Vaisanen e outros; 2014) tem técnica similar como empregado pela presente invenção, mas o iniciador e as sondas empregados neste papel têm muitas limitações no contexto da sensibilidade na detecção de parvovírus humano 4.
[009] Consequentemente, não existe método apropriado para a detecção de parvovírus humano 4. É, portanto, desejável prover um método de detecção do ácido nucleico alvo em uma amostra usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real que supera as desvantagens acima mencionadas. Adicionalmente, existe uma necessidade de prover um kit de teste específico e altamente sensível o qual permite a detecção do vírus parvovírus humano 4 superando o problema da ausência de qualquer caso, isto é, que pode ajudar na detecção de todos os genótipos de Parvovírus Humano 4. Também existe uma necessidade de um kit de teste que ajuda na detecção das amostras infectadas com baixo número de cópias de Parvovírus Humano 4.
[0010] É, portanto, um objetivo da presente invenção prover as sondas e os iniciadores para a detecção de Parvovírus Humano 4.
[0011] Outro objetivo da presente invenção é prover um kit de teste específico e altamente sensível usando os iniciadores e sondas supracitados, que permitem a detecção de parvovírus humano 4 superando o problema de ausência de qualquer caso.
[0012] Outro objetivo da presente invenção é prover um kit de teste que pode ajudar na detecção de todos os genótipos de Parvovírus Humano 4.
[0013] Outro objetivo da presente invenção é prócer um kit de teste o qual ajuda na detecção da amostra com vírus com baixo número de cópias.
[0014] Ainda outro objetivo da presente invenção é prover uma mistura reacional para a amplificação de parvovírus humano 4 que permite a detecção específica e sensível de parvovírus humano 4.
[0015] De acordo com esta invenção, são providos iniciadores e sondas para detecção in vitro de parvovírus humano 4, as sondas e os iniciadores compreendem as sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que compreende ou quaisquer combinações dos mesmos: a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo o mínimo de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; b) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo o mínimo de 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 2; c) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo o mínimo de 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 3; em que as sequências de nucleotídeos permitem alta detecção de todos os genótipos de parvovírus humano 4.
[0016] A presente invenção também provê uma mistura reacional para PCR em tempo real compreendendo: água livre de nuclease presente em uma quantidade de 5,625 μl; tampão presente em uma quantidade de 12,5 μl; Iniciador Dianteiro de parvovírus humano 4 (10pm) presente em uma quantidade de 0,35 μl; Iniciador Reverso de parvovírus humano 4 (10pm) presente em uma quantidade de 0,35 μl; Sonda de parvovírus humano 4 (10pm) presente em uma quantidade de 0,175 μl; enzima presente em uma quantidade de 1,0 μl; e modelo presente em uma quantidade de 5 μl; em que a mistura reacional permite igual detecção de intensidade de todos os genótipos de Parvovírus Humano 4.
[0017] A figura 1 mostra o alinhamento da sonda e dos iniciadores de Parvovírus humano 4 com a região do VP1 de todos os três genótipos de Parvovírus humano 4.
[0018] A figura 2 mostra uma plotagem em tempo real das amostras positivas de Parvovírus humano 4 usando a SEQ ID No. 1, 2 e 3. Uma linha A mostrando a amplificação do Parvovírus humano 4 e B mostrando Nenhum Modelo de Controle.
[0019] A figura 3 mostra a plotagem em tempo real de PARVOVÍRUS HUMANO 4 testado nas amostras clínicas usando a SEQ ID No. 1, 2 e 3. Uma linha A mostrando as amostras positivas do DNA do PARVOVÍRUS HUMANO 4 e B mostrando as amostras negativas e NTC
[0020] A presente invenção provê uma reação em cadeia da polimerase em tempo real para a detecção de Parvovírus humano 4 juntamente com um novo conjunto de iniciadores e sondas com alta sensibilidade e especificidade.
[0021] A invenção também provê um kit de teste com base na PCR em tempo real para a detecção de Parvovírus humano 4, o dito kit compreende sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que compreende ou quaisquer combinações dos mesmos: a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 1; (Por favor, verifique se 90% de identidade de sequência é apropriado) b) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 2; (Por favor, verifique se 90% de identidade de sequência é apropriado) c) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 3; (Por favor, verifique se 90% de identidade de sequência é apropriado) em que as ditas sequências de nucleotídeos permitem alta detecção de todos os genótipos de parvovírus humano 4.
[0022] As sequências de nucleotídeos permitem a detecção de Parvovirus Humano 4 presente em baixo número de cópias (de até >100 cópias/ml.]
[0023] A invenção também provê os iniciadores e as sondas para a detecção do vírus Parvovírus Humano 4 em uma amostra compreendendo: a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 representa o iniciador dianteiro para amplificar o Parvovírus Humano 4; b) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 representa o iniciador reverso para amplificar o Parvovírus Humano 4; c) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou uma parte dela ou um nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a dita SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 representa as sondas para detectar o Parvovírus Humano 4; em que as ditas sequências de nucleotídeos permitem alta detecção de todos os genótipos de parvovírus humano 4.
[0024] As sequências de nucleotídeos permitem a detecção de Parvovirus Humano 4 presente em baixo número de cópias (de até >100 cópias/ml.]
[0025] A invenção adicionalmente provê uma mistura reacional para PCR em tempo real para a detecção do vírus Parvovírus Humano 4 compreendendo: a) Água livre de nuclease presente em uma quantidade de 5,625 μl. b) Tampão presente em uma quantidade de 12,5 μl. c) Iniciador Dianteiro de parvovírus humano 4 (10pm) presente em uma quantidade de 0,35 μl. d) Iniciador Reverso de Parvovírus humano 4 (10pm) presente em uma quantidade de 0,35 μl. e) Sonda de Parvovírus Humano 4 (10pm) presente em uma quantidade de 0,175 μl. f) Enzima presente em uma quantidade de 1,0 μl. g) Modelo presente em uma quantidade de 5 μl.
[0026] A mistura reacional vantajosamente permite igual detecção de intensidade de todos os genótipos do vírus Parvovírus Humano 4.
[0027] A mistura reacional também vantajosamente permite a detecção de parvovírus humano 4 com alta sensibilidade e também de todos os genótipos de Parvovírus Humano 4.
[0028] Sequências representando todos os três genótipos (1-3) do Parvovírus humano 4 no. de acesso (genótipo 1: EU546204.1, genótipo 2: EU175855.1, genótipo 3: JN183925.1) e muitas outras sequências representando o parvovírus humano 4 foram transferidas da base de dados de nucleotídeo GenBank e alinhadas usando o programa Mega5.1. Uma região altamente conservada do gene de VP1 é selecionada para o projeto dos iniciadores e sonda de PCR em tempo real. Todos os três genótipos do Parvovírus humano 4 que foram estudados são apresentados na figura 1. O iniciador e a sonda foram projetados em um tal modo que não deve haver qualquer degeneração entre os iniciadores ou sondas tornando-os mais estáveis e também os iniciadores e sonda adequados para todos os genótipos. A sonda é rotulada com FAM como um repórter e IABkFQ como um extintor na extremidade 3’. As sequências de iniciadores e sondas para o Parvovírus humano 4 são mencionados na tabela 1: Tabela 1:
[0029] Embora as invenções aqui sejam descritas com várias modalidades específicas, será óbvio para uma pessoa versada na técnica praticar as modalidades aqui com modificações. De qualquer modo, todas as modificações são consideradas estarem dentro do escopo das reivindicações. Também deve ser entendido que as reivindicações que seguem são destinadas a revestir todas as características específicas e genéricas das modalidades descritas aqui e todas as afirmações do escopo das modalidades que como uma matéria da linguagem poderiam ser ditas caírem entre elas.
[0030] Uma amostra conhecida do Parvovírus humano 4 foi amplificada como os iniciadores supracitados e clonados no vetor de clonagem pTZ57R/T usando o kit comercial e em seguida o plasmídeo clonado foi amplificado usando os iniciadores de sequenciamento M13/pUC (Fwd e Rvs), e em seguida o produto amplificado foi sequenciado usando a sequenciador capilar para obter a sequência clonada exata. Adicionalmente, o segmento sequenciado foi verificado para a semelhança da sequência usando o programa NCBI Blast e foi confirmado que a sequência clonada pertencida ao Parvovírus humano 4.
[0031] Um lote de 80 amostras foi preparado por meio de misturação de diferentes vírus em diferentes combinações, incluindo Parvovírus humano 4, assim como, HBV, HCV, Parvovírus humano B19, Adenovírus, Dengue, Encefalite Japonesa, HSV-1, HSV-2, Vírus Varicela-Zoster e foi testado para o Parvovírus humano 4 por meio de iniciador e sondas atualmente projetados. Os resultados mostraram que não existe reatividade cruzada dos iniciadores e sondas projetados com os vírus acima mencionados.
[0032] A sensibilidade deste ensaio com base em Tempo Real foi estimada com base em um DNA do parvovírus 4 padronizado e clonado com o número conhecido de cópias. A detecção de amostras positivas contendo 500 cópias/ml, 200 cópias/ml e 100 cópias/ml do parvovírus 4 padrão no ensaio foi de 100 % (10 de 10 testes) respectivamente, ao mesmo tempo que as amostras com < 10 cópias /ml foram testadas 9 de 10 vezes. Estes resultados mostram que o ensaio tem uma especificidade e sensibilidade muito alta requeridas para a detecção do parvovírus humano 4.
[0033] Para determinar a especificidade do ensaio dos iniciadores e da sonda para a detecção do DNA do Parvovírus humano 4, o ensaio com base em Tempo Real foi realizado (usando os oligômeros de amplificação das SEQ ID Nos. 1, 2 e 3) nas amostras clínicas de plasma/soro disponíveis. O ensaio foi realizado em 95 amostras dos cinco diferentes subgrupos de amostras de pacientes armazenada na seção de virologia, departamento de Microbiologia, King George's Medical University, Lucknow, U.P., Índia. Das amostras clínicas totais testadas 33 foram positivas para o parvovírus 4. Todas as amostras positivas proveram resultados positivos quando foram retestadas três vezes usando o mesmo ensaio (figura 3 mostrando as amostras clínicas testadas para o parvovírus 4).
[0034] Poucas amostras positivas para o parvovírus humano 4 foram clonadas sequenciadas usando o sequenciador ABI 3130 usando iniciadores de sequenciamento M13/pUC. Os resultados de sequenciamento mostraram todas as sequências amplificadas pertencidas ao parvovírus humano 4 (figura 3).
[0035] Na presente modalidade, a invenção foi descrita em relação à detecção de Parvovírus humano 4 do plasma humano, soro, CSF, amostras de material coletado da garganta e nasal, de qualquer modo, tal descrição não deve ser considerada como a restrição do escopo da presente invenção. Adicionalmente, seria possível para uma pessoa versada na técnica praticar a presente invenção considerando outra amostra para a detecção de Parvovírus humano 4 sem o afastamento do escopo da presente invenção.
Claims (5)
1. Sonda para detecção in vitro de parvovírus humano 4, caracterizada pelo fato de que consiste da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, um repórter de carboxifluoresceína na extremidade 5’ da mesma e um extintor localizado na extremidade 3’ da mesma.
2. Mistura reacional para PCR em tempo real, caracterizada pelo fato de que compreende: água livre de nuclease presente em uma quantidade de 5,625 μl; tampão presente em uma quantidade de 12,5 μl; uma molécula de ácido nucleico consistindo da sequência de SEQ ID NO: 1 presente em uma quantidade de 0,35 μl; uma molécula de ácido nucleico consistindo da sequência de SEQ ID NO: 2 presente em uma quantidade de 0,35 μl; uma molécula de ácido nucleico consistindo da sequência de SEQ ID NO: 3, um repórter de carboxifluoresceína na extremidade 5’ da mesma e um extintor localizado na extremidade 3’ da mesma, e presente em uma quantidade de 0,175 μl; enzima presente em uma quantidade de 1,0 μl; e modelo presente em uma quantidade de 5 μl; em que a mistura reacional permite igual detecção de intensidade de todos os genótipos de Parvovírus Humano 4.
3. Mistura reacional de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 respectivamente representam o iniciador dianteiro e reverso para amplificar o parvovírus humano 4.
4. Mistura reacional de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a SEQ ID NO: 3 representa uma sonda para a detecção de parvovírus humano 4.
5. Kit de teste para detecção in vitro de parvovírus humano 4, caracterizado pelo fato de que o kit compreende: a) uma molécula de ácido nucleico consistindo da sequência de SEQ ID NO: 1; b) uma molécula de ácido nucleico consistindo da sequência de SEQ ID NO: 2; e c) uma molécula de ácido nucleico consistindo da sequência de SEQ ID NO: 3, um repórter de carboxifluoresceína na extremidade 5’ da mesma e um extintor localizado na extremidade 3’ da mesma em que as moléculas de ácido nucleico permitem detecção de todos os genótipos de parvovírus humano 4.
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