BR112017000591B1

BR112017000591B1 - Peptideomimético e composição compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BR112017000591B1
Application number: BR112017000591-3A
Authority: BR
Inventors: Berta Levavi-Sivan; Chaim Gilon
Original assignee: Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2024-03-05
Also published as: AU2015291155A1; BR112017000591A2; IL249940B; CN106661088A; WO2016009439A1; US20170204141A1; US10155790B2; JP6587677B2; EP3169700A1; JP2017527538A; CA2954607A1; AU2015291155B2; CA2954607C; IL249940A0; CN106661088B; CL2017000074A1; PH12017500088A1

Abstract

antagonistas da neurocinina b na reprodução de peixes. antagonistas de neurocinina à base de peptídeos de reprodução de peixes são divulgados. as composições que compreendem os antagonistas de neurocinina de peixes e métodos de inibir ou retardar a puberdade, a maturação dos peixes ou processos de reprodução utilizando estes compostos também são fornecidos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção é o campo da reprodução de peixes e especificamente relacionada com peptideomiméticos que são ativos como antagonistas de neurocinina B (NKB) e neurocinina F (NKF) e sua utilização na inibição ou atraso da maturação do sistema reprodutor dos peixes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A função reprodutiva é rigidamente controlada por uma complexa rede de fatores centrais e periféricos, onde o mais importante é GnRH. Recentemente, os neuropeptídeos kisspeptinas (codificados por Kiss1) e neurocinina B (NKB, codificada por Tac3) foram atribuídos como cruciais em diferentes estágios de reprodução (Navarro VM. Front Endocrinol. 2012; 3: 48). Estudos em humanos têm revelado que as mutações de perda de função nos genes que codificam NKB ou receptor da neurocinina 3 (NK3R) levam a hipogonadismo hipogonadotrópico e infertilidade.

[0003] A neurocinina B (NKB) é um membro da família dos peptídeos taquiquinina. Inativação de mutações na taquiquinina 3 (tac3) ou receptor do gene tac3 (NKBR) estão associadas com o fracasso da puberdade e hipogonadismo hipogonadotrófico congênito em seres humanos. Isto sugere que a NKB pode desempenhar um papel crítico na reprodução humana.

[0004] Os NKBs têm ação direta através de receptores na hipófise e indireta através de receptores em neurônios de hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). NKBs se ligam aos seus receptores cognatos, estimulam a sua atividade, que por sua vez fornece um sinal obrigatório para secreção de gonadotrofina assim modulando eventos a jusante que apoiam a reprodução. NKB é um importante regulador do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal e é alvo de uma série de reguladores, tais como a regulação de feedback hormônio esteroide, nutricional e metabólica.

[0005] Homeostase energética e reprodução são os processos mais importantes na vida de um animal e estão intimamente relacionadas. Regulação da homeostase energética e reprodução são fundamentais para a aptidão e sobrevivência. A reprodução é um processo que consome muita energia, e interação precisa de reguladores para o equilíbrio de energia e reprodução permite a regulação coordenada desses dois processos. Na maioria das espécies de peixes estudadas, variações sazonais em tamanho gonadal são negativamente correlacionadas com as concentrações (GH) de hormônio de crescimento no soro - por exemplo, quando as concentrações do hormônio luteinizante (LH) são elevadas, devido ao aumento de tamanho gonadal, as concentrações de GH são baixas, acompanhadas por crescimento somático muito lento.

[0006] Os peixes possuem uma grande diversidade de estratégias de reprodução, podem ser encontradas em diferentes nichos ambientais e utilizar diferentes regimes de tempo de maturação sexual. Quando comparado com outros vertebrados, os peixes têm várias características únicas. Em contraste com tetrapode, onde as células na pituitária são misturadas, em peixes existe uma organização única de chamadas específicas em determinadas áreas. Peixes possui um duplo modo de regulação de gonadotropo por GnRH, que combina componentes neurovasculares e neuroglandulares. Além disso, os terminais nervosos que secretam diferentes neuropeptídeos diferentes inervam a pituitária. No entanto, ainda é desconhecido se neurônios NKB ou NKF se projetam para a pituitária em peixes.

[0007] Até à data, um grande número de taquiquininas foram identificadas em uma ampla gama de espécies de invertebrados a mamíferos. Tac1 codifica tanto a substância P (SP) e NKA através de splicing alternativo. Tac2/Tac3 produz o peptídeo NKB, e Tac4 codifica hemoquinina-1.

[0008] Três classes de receptores de taquiquinina de mamíferos (NK1, NK2, e NK3) foram identificadas, e estes têm afinidades de ligação preferenciais para SP, NKA, e NKB, respectivamente. O TAC1 e TAC4 de mamíferos dão origem a 2 neuropeptídeos ativos, ao passo que o TAC3 é o único TAC que dá origem a apenas 1 neuropeptídeo, ou seja, NKB.

[0009] Taquiquinina (tac) e genes receptores de tac foram recentemente identificados a partir de muitas espécies de peixes (Biran 2012, PNAS 109: 10.269-10274). A análise filogenética mostrou que Tac3s písceos e genes de neurocininas de mamíferos surgem a partir de uma linhagem. Alta identidade foi encontrada entre diferentes espécies de peixes da região que codifica a NKB; todos partilhavam a sequência C- terminal comum. Embora o gene písceo Tac3 codifique para dois peptídeos de taquiquinina putativos, o ortólogo de mamífero codifica para apenas um. O segundo peptídeo putativo de peixe, referido como neurocinina F (NKF), é único e verificado como estando conservado entre todas as espécies testadas.

[0010] Os níveis de mRNA de tac3a de Peixe-zebra aumentaram gradualmente durante as primeiras semanas de vida e atingiram o ápice na puberdade. No cérebro do peixe-zebra, mRNA de tac3a e tac3b foi observado em áreas específicas do cérebro que estão relacionadas com a reprodução (Biran et al, 2008, Biol Reprod. 79: 776-786). Além disso, uma única injeção ip de NKBA ou NKF aumentou significativamente os níveis de LH no peixe-zebra fêmea maduro, e o tac3a e ambos os genes tac3r foram supra-regulados pelo estrogênio (Biran et al., 2012, ibid), sugerindo que o sistema NKB/NKBR pode participar em controle neuroendócrino de reprodução de peixes e de que o papel do sistema de NKB no controle neuroendócrino de reprodução é evolutivamente conservado em vertebrados.

[0011] A tilápia se tornou um dos peixes mais comercialmente importantes de água doce cultivados, devido ao seu elevado potencial de crescimento, tempo de geração curto, facilidade de desova, e resistência a doenças.

[0012] Foi demonstrado (Biran et al., 2014, Endocrinology 155, 483142) que os neuropeptídeos recentemente identificados denotaram neurocinina B (NKB) e neurocinina F (NKF), que são secretadas pelo cérebro do peixe e envolvidas na reprodução, podem estimular a liberação do fator folículo-estimulante (FSH) e LH por mecanismos diretos (através da ativação de receptores específicos ao nível da pituitária) ou indiretos (através do cérebro).

[0013] O documento WO 2013/018097, a alguns dos inventores da presente invenção, divulga agonistas de NKB e NKF para a regulação hormonal em peixes e, especificamente, para o avanço do início da puberdade, que regulamenta o tempo e a quantidade de ovulação e desova, sincronização ou estimulação da reprodução, melhorando o desenvolvimento de gametas, aumentando vitelogênese, indução de GnRH, a indução de Kisspeptina, aumento dos níveis de neuro-hormônios hipotalâmicos, aumentando o nível de LH ou FSH e indução de maturação dos oócitos.

[0014] G. Drapeau et al., (Regul. Peptides, 31, 125, 1990) descreve o composto SR142801 (Trp, -Ala-neurocinina A, 10/4) na forma de um potente antagonista do receptor de NK3 da taquiquinina nos mamíferos.

[0015] O'Harte, F. (J. Neurochem. 57 (6), 2086-2091, 1991) descreve o análogo peptídico denotado Ranakinina, um agonista do receptor de NK1 de taquiquinina isolado com neurocinina B do cérebro do sapo Rana ridibunda.

[0016] Vários antagonistas de NKB não peptídicos de moléculas pequenas, são conhecidos em mamíferos, por exemplo: SB-222200 (Sarau et al., 2000, J Pharmacol Exp Ther 295:373-381); Osanetant (SR-142801) e talnetanto (SB 223412) (Sarau et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281:1303-1311).

[0017] Enquanto publicações anteriores divulgaram agonistas peptídicos de NKB de peixes para aumentar a fertilização e encurtando o tempo de maturação ou antagonistas de NK-3 de mamíferos, nenhuma das publicações anteriores descreve antagonistas de NKB nos peixes. Há uma necessidade não satisfeita de tais antagonistas para utilização em retardar a maturação e controle de parâmetros reprodutivos em peixes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0018] A presente invenção é baseada na descoberta de que a inibição da atividade do receptor de tac-3 em peixes por antagonistas NKB pode atrasar ou inibir a maturação e reprodução. Foi surpreendentemente descoberto que a alteração de resíduos de aminoácidos específicos na sequência de peptídeos NKB e NKF resultam na alteração da sua atividade de agonista para antagonista para a maturação do sistema reprodutivo dos peixes. Método para inibir a maturação dos peixes e para o tratamento de problemas ou processos dependentes de hormônios em peixes, utilizando antagonistas de NKB e NKF também são fornecidos, bem como a utilização de antagonistas de NKB e NKF em composições farmacêuticas ou alimentares. Antagonistas de NKB e NKF à base de peptídeos perifericamente ativos (aqui denotados como peptideomiméticos) ou outros antagonistas que inibem ou eliminam a reprodução de peixes podem levar, entre outros processos, a taxas de crescimento aumentadas e alteração na determinação do sexo.

[0019] A presente invenção fornece, de acordo com um aspecto de um peptideomimético de acordo com a Fórmula I: X1-NMeVal-X4-Leu-Met-Z (Fórmula I) em que: o peptideomimético consiste em 5-10 aminoácidos; X1 é uma extensão de 1-6 resíduos de aminoácidos naturais ou não- naturais e, opcionalmente, uma fração de revestimento (capping) N-terminal ou modificação; NMeVal é um resíduo N-metil-valina ou um resíduo N-metil-D-valina; X4 é -NH(CH2)n-CO- em que n é 2-6; e Z representa o C-terminal do peptídeo que pode ser amidado, acilado, reduzido ou esterificado. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0020] De acordo com algumas modalidades, X1 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido aromático na configuração L ou D.

[0021] De acordo com outras modalidades, X1 compreendia um resíduo D-Trp.

[0022] De acordo com algumas modalidades X1 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido carregado negativamente (ácidos).

[0023] De acordo com algumas modalidades, o C-terminal está amidado.

[0024] De acordo com algumas modalidades, X1 consiste em 2 ou 3 ácidos aminados e um N-terminal revestido. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0025] De acordo com algumas modalidades, X1 consiste em 2 a 3 resíduos de aminoácido, que compreende um resíduo aromático, um resíduo carregado negativamente (ácidos) e uma fração de revestimento N- terminal. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0026] De acordo com algumas modalidades, o X1 compreende um resíduo selecionado a partir de um resíduo de aminoácido alifático e, um resíduo polar não carregado. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0027] De acordo com algumas modalidades, o resíduo alifático é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ala, Ile, Leu. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0028] De acordo com algumas modalidades, o resíduo polar, não carregado é selecionado dentre Ser e Thr. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0029] De acordo com algumas modalidades, X1 compreende um resíduo aromático selecionado a partir do grupo que consiste em Phe, DPhe, Trp e DTrp; um resíduo com carga negativa (ácidos) selecionado de Glu e Asp; e uma fração revestida de succinil (Succ) N-terminal. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0030] De acordo com ainda outras modalidades, X1 compreende um resíduo aromático selecionado dentre Phe, e DTrp; um resíduo de Asp; uma fração revestida de succinil (Succ) N-terminal, e, opcionalmente, um resíduo selecionado a partir de Ile e Ser. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0031] De acordo com algumas modalidades, o peptideomimético está de acordo com a Fórmula II:

[0032] X1-NMeVal-Ala-Leu-Met-NH2 (Fórmula II) em que, X1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: Succ- Asp-Phe; Succ-Asp-DPhe; Succ-Asp-Trp; Succ-Asp-DTrp; Succ-Asp-Ile- Fen; Succ-Asp-Ile-DPhe; Succ-Asp-Ile-Trp; Succ-Asp-Ile-DTrp; Succ-Asp- Ser-Phe; Succ-Asp-Ser-DPhe; Succ-Asp-Ser-Trp; Succ-Asp-Ser-DTrp, Succ-Glu-Phe; Succ-Glu-DPhe; Succ-Glu-Trp; Succ-Glu-DTrp; Succ-Glu- Ile-Phe; Succ-Glu-Ile-DPhe; Succ-Glu-Ile-Trp; Succ-Glu-Ile-DTrp; Succ-Glu- Ser-Phe; Succ-Glu-Ser-DPhe; Succ-Glu-Ser-Trp; e Succ-Glu-Ser-DTrp. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0033] De acordo com algumas modalidades, um peptideomimético é fornecido consistindo em 5-10 resíduos de aminoácidos, compreendendo uma sequência apresentada em SEQ ID NO: 7: NMeVal-Ala-Leu-Met (SEQ ID NO: 7).

[0034] De acordo com algumas modalidades o peptideomimético compreende uma sequência de SEQ ID NO: 7, pelo menos um resíduo de aminoácido aromático e, pelo menos, um resíduo de aminoácido carregado negativamente.

[0035] De acordo com algumas modalidades, o peptideomimético compreende uma sequência de SEQ ID NO: 7, pelo menos um resíduo de aminoácido aromático, pelo menos um resíduo de aminoácido de carga negativa e, pelo menos, um resíduo selecionado a partir de um resíduo de aminoácido alifático e um resíduo polar, não carregado. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0036] De acordo com algumas modalidades, o peptideomimético compreende um N-terminal revestido.

[0037] De acordo com algumas modalidades o peptideomimético compreende um C-terminal amidado.

[0038] De acordo com algumas modalidades o peptideomimético consiste em 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido e um grupo N terminal revestido opcional. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0039] De acordo com algumas modalidades, o peptideomimético consiste em 5-10 resíduos de aminoácidos, um C-terminal amidado e uma fração revestida N-terminal. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0040] De acordo com algumas modalidades, o peptideomimético é constituído por 6-7 resíduos de aminoácidos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 7, e uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: Succ-Asp-Phe; Succ-Asp-DPhe; Succ-Asp-Trp; Succ-Asp- DTrp; Succ-Asp-Ile-Fen; Succ-Asp-Ile-DPhe; Succ-Asp-Ile-Trp; Succ-Asp- Ile-DTrp; Succ-Asp-Ser-Phe; Succ-Asp-Ser-DPhe; Succ-Asp-Ser-Trp; Succ- Asp-Ser-DTrp, Succ-Glu-Phe; Succ-Glu-DPhe; Succ-Glu-Trp; Succ-Glu- DTrp; Succ-Glu-Ile-Phe; Succ-Glu-Ile-DPhe; Succ-Glu-Ile-Trp; Succ-Glu-Ile- DTrp; Succ-Glu-Ser-Phe; Succ-Glu-Ser-DPhe; Succ-Glu-Ser-Trp; e Succ- Glu-Ser-DTrp.

[0041] De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma fração revestida N-terminal é um resíduo de ácido dicarboxílico. De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma fração revestida N-terminal é selecionada dentre o grupo que consiste em: succinil, oxalil, malonil, glutaril, adipoil, pimaloil, suberoil e acetil. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0042] De acordo com algumas modalidades específicas o peptideomimético é selecionado a partir do grupo consistindo em: Succ-Asp-Ile-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 1, Ant- 1); Succ-Asp-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 2, Ant-2; Succ-Asp-Ser-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 3, Ant-3); Succ-Asp-Ile-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 4, Ant- 4); Succ-Asp-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 5, Ant-5); e Succ-Asp-Ser-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 6, Ant-6); em que Succ indica um succinil.

[0043] É para ser entendido expressamente que os peptídeos anteriormente conhecidos são excluídos da presente invenção.

[0044] De acordo com algumas modalidades, o peptideomimético compreende ainda uma fração de aumento de permeabilidade. Qualquer fração conhecida na técnica para facilitar ativamente ou passivamente ou melhorar a permeabilidade do composto para as células pode ser utilizada nos peptideomiméticos de acordo com a presente invenção. A fração de melhoria de permeabilidade pode ser ligada a qualquer posição no fragmento de peptídeo, diretamente ou através de um espaçador ou ligante.

[0045] A presente invenção fornece, de acordo com outro aspecto, uma composição compreendendo um peptideomimético de fórmula I.

[0046] De acordo com algumas modalidades, a composição compreendendo um peptideomimético de acordo com a Fórmula I é selecionada a partir de uma composição farmacêutica e uma composição alimentar.

[0047] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido aromático na configuração L ou D.

[0048] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 compreende um resíduo D-Trp.

[0049] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido carregado negativamente (ácidos).

[0050] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que o C- terminal está amidado.

[0051] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 consiste em 2 ou 3 aminoácidos e um N-terminal revestido. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0052] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 consiste em 2-3 resíduos de aminoácido, que compreendem um resíduo aromático, um resíduo carregado negativamente (ácidos), uma fração C- terminal e N-terminal revestida amidada. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0053] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 compreende um resíduo selecionado a partir de um resíduo de aminoácido alifático e, um resíduo polar não carregado. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0054] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que o resíduo alifático é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ala, Ile e Leu. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0055] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que o resíduo polar, não carregado é selecionado dentre Ser e Thr. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0056] De acordo com algumas modalidades, X1 compreende um resíduo aromático selecionado a partir do grupo que consiste em Phe, DPhe, Trp e DTrp; um resíduo com carga negativa (ácidos) selecionado de Glu e Asp; e uma fração revestida de succinil (Succ) N-terminal. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0057] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a Fórmula I em que X1 compreende um resíduo aromático selecionado dentre Phe, e DTrp; um resíduo de Asp; uma fração revestida de succinil (Succ) N-terminal, e, opcionalmente, um resíduo selecionado a partir de Ile e Ser. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0058] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético de acordo com a fórmula II: X1-NMeVal-Ala-Leu-Met-NH2 (Formula II); em que, X1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: Succ- Asp-Phe; Succ-Asp-DPhe; Succ-Asp-Trp; Succ-Asp-DTrp; Succ-Asp-Ile- Fen; Succ-Asp-Ile-DPhe; Succ-Asp-Ile-Trp; Succ-Asp-Ile-DTrp; Succ-Asp- Ser-Phe; Succ-Asp-Ser-DPhe; Succ-Asp-Ser-Trp; Succ-Asp-Ser-DTrp, Succ-Glu-Phe; Succ-Glu-DPhe; Succ-Glu-Trp; Succ-Glu-DTrp; Succ-Glu- Ile-Phe; Succ-Glu-Ile-DPhe; Succ-Glu-Ile-Trp; Succ-Glu-Ile-DTrp; Succ-Glu- Ser-Phe; Succ-Glu-Ser-DPhe; Succ-Glu-Ser-Trp; e Succ-Glu-Ser-DTrp. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0059] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético que consiste em 5-10 resíduos de aminoácidos compreendendo a sequência NMeVal-Ala-Leu-Met (SEQ ID NO: 7).

[0060] De acordo com algumas modalidades a composição compreende um peptideomimético compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 7, pelo menos um resíduo de aminoácido aromático e, pelo menos, um resíduo de aminoácido carregado negativamente.

[0061] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 7, pelo menos um resíduo de aminoácido aromático, pelo menos um resíduo de aminoácido de carga negativa e, pelo menos, um resíduo selecionado a partir de um resíduo de aminoácido alifático e um resíduo polar, não carregado. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0062] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético que compreende um N-terminal revestido.

[0063] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético que compreende um C-terminal amidado.

[0064] De acordo com algumas modalidades a composição compreende um peptideomimético consistindo em 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido e um grupo N-terminal revestido opcional. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0065] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético consistindo em 5-10 resíduos de aminoácidos, um C-terminal amidado e uma fração revestida N-terminal. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0066] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético consistindo em 6-7 resíduos de aminoácidos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 7, e uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: Succ-Asp-Phe; Succ-Asp-DPhe; Succ-Asp-Trp; Succ-Asp-DTrp; Succ-Asp-Ile-Fen; Succ- Asp-Ile-DPhe; Succ-Asp-Ile-Trp; Succ-Asp-Ile-DTrp; Succ-Asp-Ser-Phe; Succ-Asp-Ser-DPhe; Succ-Asp-Ser-Trp; Succ-Asp-Ser-DTrp, Succ-Glu- Phe; Succ-Glu-DPhe; Succ-Glu-Trp; Succ-Glu-DTrp; Succ-Glu-Ile-Phe; Succ-Glu-Ile-DPhe; Succ-Glu-Ile-Trp; Succ-Glu-Ile-DTrp; Succ-Glu-Ser-Phe; Succ-Glu-Ser-DPhe; Succ-Glu-Ser-Trp; e Succ-Glu-Ser-DTrp.

[0067] De acordo com algumas modalidades a pelo menos uma fração revestida N-terminal é selecionada dentre o grupo que consiste em: succinil, oxalil, malonil, glutaril, adipoil, pimaloil, suberoil, acetil e outros resíduos de ácido dicarboxílico. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0068] De acordo com algumas modalidades específicas a composição compreende um peptideomimético selecionado a partir do grupo consistindo em: Succ-Asp-Ile-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 1, Ant- 1); Succ-Asp-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 2, Ant-2); Succ-Asp-Ser-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 3, Ant- 3); Succ-Asp-Ile-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 4, Ant- 4); Succ-Asp-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 5, Ant-5); e Succ-Asp-Ser-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 6, Ant-6); em que Succ indica um succinil.

[0069] Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0070] Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende um peptideomimético antagonista de NKB ou NKF tal como definido acima e um carreador, diluente, excipiente ou sal opcional aceitável.

[0071] A composição alimentar de acordo com a presente invenção compreende um antagonista de NKB peptidomimético como definido acima e um aditivo alimentar opcional. Qualquer aditivo alimentar conhecido na técnica pode ser utilizado numa composição alimentar de acordo com a invenção. Isto inclui, mas não se limita aos aditivos de cor, aditivos de sabor, etc. Nutrientes, incluindo, mas não se limitando a proteínas, carboidratos, gorduras minerais, vitaminas, etc., podem também ser incluídos nas composições alimentares da presente invenção. A composição alimentar de acordo com a invenção pode compreender nutrientes e aditivos alimentares, além de pelo menos um antagonista de NKB ou NKF ativo.

[0072] De acordo com algumas modalidades, a composição alimentar compreende peletes alimentares que são revestidos com pelo menos um antagonista de NKB ou NKF.

[0073] Uma composição farmacêutica ou alimentar, tal como definido acima, para utilização como um antagonista de NKB também está dentro do escopo da presente invenção.

[0074] Uma composição compreendendo um peptideomimético de acordo com a invenção pode ser administrada aos peixes por qualquer modo ou via conhecida na técnica, incluindo administração parentérica e administração entérica. De acordo com algumas modalidades, a administração parentérica inclui, mas não está limitada a qualquer tipo de injeção. De acordo com algumas modalidades, a administração entérica inclui, mas não está limitada a administração oral, incluindo a administração, como aditivo para o alimento, a administração por imersão, incluindo a administração, como aditivo para a água potável, e a administração por meio de sonda intragástrica.

[0075] De acordo com algumas modalidades a composição é administrada a peixes como parte de comida normal ou o consumo de água.

[0076] De acordo com algumas modalidades, a composição é administrada a peixes num volume de água a ser absorvido pelas guelras.

[0077] A invenção também fornece um outro aspecto de acordo com uma composição que compreende um antagonista de NKB para utilização na inibição de pelo menos um parâmetro de reprodução ou maturação de peixes.

[0078] Um antagonista de NKB de acordo com a invenção é um composto capaz de se ligar a um receptor de taquiquinina píscea 3 (tac3) e inibir a sua atividade. Antagonistas de NKF também são abrangidos pela definição de antagonistas de NKB.

[0079] De acordo com algumas modalidades, a composição para utilização na inibição de pelo menos um parâmetro de reprodução de peixes ou maturação compreende um peptideomimético selecionado a partir do grupo que consiste em: um peptideomimético de Fórmula I, como definido acima; um peptideomimético de Fórmula II, tal como definido acima; e um peptideomimético de 5-10 resíduos de aminoácidos, compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 7.

[0080] De acordo com algumas modalidades, a composição para utilização na inibição de pelo menos um parâmetro de reprodução de peixes ou maturação compreende um peptideomimético selecionado a partir do grupo consistindo em: Succ-Asp-Ile-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 1, Ant- 1); Succ-Asp-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 2, Ant-2); Succ-Asp-Ser-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 3, Ant- 3); Succ-Asp-Ile-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 4, Ant- 4); Succ-Asp-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 5, Ant-5); e Succ-Asp-Ser-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 6, Ant-6); em que Succ indica um succinil.

[0081] Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0082] De acordo com outras modalidades, a composição para utilização na inibição de pelo menos um parâmetro de reprodução de peixes ou maturação compreende um antagonista de NKB não peptídico.

[0083] De acordo com algumas modalidades específicas, a composição para utilização na inibição de pelo menos um parâmetro de reprodução de peixes ou maturação compreende um antagonista de NKB não peptídico selecionado a partir do grupo que consiste em: (S)-(2)-N-(a- etilbenzil)-3-metil-2-fenilquinolina-4-carboxamida (também denotado SB- 222200); (S)-(1)-N-{{3-[1-benzoil-3-(3,4-diclorofenil)piperidin-3-il]prop-1-il}-4- fenilpiperidin-4-il}-N-metilacetamida (também denotada Osanetant e SR- 142,801), e (S)-(2)-N-(a-etilbenzil)-3-hidroxi-2-fenilquinolina-4-carboxamida (também denotada talnetant e SB 223412). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0084] A presente invenção fornece de acordo com ainda um outro aspecto, um método para inibir, pelo menos, um parâmetro de reprodução de peixes ou de maturação, o método compreendendo a administração a peixes de uma composição que compreende um antagonista de NKB.

[0085] De acordo com algumas modalidades, a composição é selecionada a partir do grupo que consiste em uma composição farmacêutica e uma composição alimentar.

[0086] Qualquer composto antagonista de NKB capaz de se ligar a um receptor de tac3 písceo e inibir a sua atividade pode ser utilizado de acordo com este aspecto.

[0087] De acordo com algumas modalidades, o método compreende a administração aos peixes de uma composição compreendendo um peptideomimético selecionado a partir do grupo que consiste em: um peptideomimético de Fórmula I, como definido acima; um peptideomimético de Fórmula II, tal como definido acima; e um peptideomimético de 5-10 resíduos de aminoácidos, compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 7.

[0088] De acordo com algumas modalidades, a composição compreende um peptideomimético selecionado a partir do grupo consistindo em: Succ-Asp-Ile-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 1, Ant- 1); Succ-Asp-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 2, Ant-2); Succ-Asp-Ser-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 3, Ant- 3); Succ-Asp-Ile-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 4, Ant- 4); Succ-Asp-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 5, Ant-5); e Succ-Asp-Ser-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 6, Ant-6); em que Succ indica um succinil.

[0089] Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0090] De acordo com outras modalidades, a composição compreende um antagonista de NKB não peptídico.

[0091] De acordo com algumas modalidades específicas, a composição compreende um antagonista de NKB não peptídico selecionado a partir do grupo consistindo em: (S)-(2)-N-(a-etilbenzil)-3- metil-2-fenilquinolina-4-carboxamida (também denotado SB-222200); (S)- (1)-N-{{3-[1-benzoil-3-(3,4-diclorofenil)piperidin-3-il]prop-1-il}-4-fenilpiperidin- 4-il}-N-metilacetamida (também denotado Osanetant e SR-142,801), e (S)- (2)-N-(a-etilbenzil)-3-hidroxi-2-fenilquinolina-4-carboxamida (também denotado talnetant e SB 223412). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[0092] Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção administrada em um método de inibir, pelo menos, um parâmetro de reprodução de peixes ou de maturação, compreende um antagonista de NKB e um carreador, diluente, excipiente ou sal opcional aceitável.

[0093] A composição alimentar de acordo com a presente invenção administrada em um método de inibir, pelo menos, um parâmetro de reprodução de peixes ou de maturação, compreende um antagonista de NKB e um aditivo alimentar opcional. A composição alimentar de acordo com a invenção pode também incluir nutrientes e aditivos alimentares, incluindo, mas não se limitando a proteínas, carboidratos, gorduras, minerais, vitaminas, etc., podem também ser incluídos nas composições alimentares da presente invenção.

[0094] A inibição de pelo menos um parâmetro de reprodução ou maturação písceo inclui, mas não se limita a: atrasar ou eliminar a puberdade em geral ou puberdade precoce em particular; regular a determinação e diferenciação do sexo (gênero) (o processo de desenvolvimento gonadal após o sexo ter sido determinado) e desova (descarga de óvulos e espermatozoides). Também incluído dentro do escopo é o tratamento de problemas ou processos dependentes de hormônios em peixes, que estão ligados à reprodução.

[0095] De acordo com algumas modalidades, a inibição da reprodução ou maturação píscea resulta no aumento do peso do peixe tratado.

[0096] Peixe de acordo com a invenção inclui qualquer tipo de peixe a partir de qualquer classe, subclasse, ordem, gênero ou família, incluindo peixes de viveiro, peixes comestíveis e peixes ornamentais. De acordo com algumas modalidades não limitativas, o peixe é selecionado a partir do grupo que consiste em: tilápia, carpa, salmão, robalo, peixe-gato e tainha.

[0097] A administração dos antagonistas de NKB para os peixes de acordo com os métodos da presente invenção pode ser realizada por qualquer modo conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a administração parentérica, administração oral e administração por imersão.

[0098] De acordo com algumas modalidades os antagonistas de NKB são administrados a peixes como parte do consumo de alimentos ou de água.

[0099] De acordo com algumas modalidades, a composição é administrada a peixes num volume de água a ser absorvido pelas guelras.

[0100] Outras modalidades e o escopo pleno da aplicabilidade da presente invenção se tornarão aparentes na descrição detalhada provida doravante. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e exemplos específicos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são dadas a título de ilustração apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e o escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0101] As Figuras 1A e 1B mostram o efeito de seis peptideomiméticos na inibição da transdução de sinal (Figura 1A ativação de CRE, Figura 1B ativação de SRE) em tilápia. Cada antagonista foi adicionado em diferentes concentrações concomitantemente com NKB em 1*10-8 M (= 0,1 nM). NKB de tilápia aumentou a atividade da luciferase em 1,8 vezes e a redução da resposta pelos vários polipeptídeos é mostrada. Figura 1C demonstra em comparação, a atividade agonista de vários análogos de NKB e NKF no modelo de ativação de CRE.

[0102] As Figuras 2A e 2B mostram o efeito de seis peptideomiméticos na inibição da transdução de sinal em peixes-zebra (Figura 2A ativação de CRE, Figura 2B ativação de SRE). NKB de peixe- zebra aumentou a atividade de transdução de sinal em mais de 3 vezes. O efeito dos peptideomiméticos foi testado quando cada antagonista foi adicionado em diferentes concentrações concomitantemente com NKB em 1*10-8 M (= 0,1 nM).

[0103] As Figuras 3A e 3B demonstram o efeito do antagonista de NKB SB222200 em CRE-Luc em células COS-7 transfectadas com tac3r de tilápia, utilizando o receptor humano e ligando como controle positivo. Figura 3A, o efeito na atividade de luciferase, do antagonista não peptídeo apenas, em comparação com hNKB, NKB de tilápia ou NKF de tilápia. Figura 3B, o efeito sobre a atividade da luciferase de diferentes concentrações do antagonista adicionados concomitantemente com 0,1 nM dos ligandos nativos (NKB ou NKF).

[0104] As Figuras 4A e 4B descrevem o efeito do antagonista de NKB Osanetant (SR-142801) em CRE-Luc em células COS-7 transfectadas com tac3r de tilápia quando o receptor humano e ligando serve como controle positivo. Figura 4A, o efeito do antagonista não peptídico apenas sobre a atividade de luciferase em comparação com hNKB, NKB de tilápia ou NKF de tilápia, a 0,1 nM (10-8 M. Figura 4B, o efeito de diferentes concentrações do antagonista adicionados concomitantemente com 0,1 nM dos ligandos nativos (NKB ou NKF).

[0105] As Figuras 5A e 5B descrevem os resultados de experiências in vivo testando a atividade antagonista de NKB de SB222200 (a 10, 100 ou 500 μg/kg de peso corporal) na liberação de FSH (Figura 5A) e LH (Figura 5B) em tilápia.

[0106] Figura 6 representa observações histológicas de gônadas de testículos de peixes tratados em relação a peixes controle. Testículos de peixes são organizados em cistos.

[0107] A Figura 7 representa volume de sêmen de peixes injetados com antagonistas de NKB de SB222200, antagonista de NKB Ant-4, ou controle.

[0108] A Figura 8 representa níveis de 11-ketotestosterona (11KT) em peixes injetados com SB222200 ou antagonista de NKB Ant-4 durante 14 dias.

[0109] A Figura 9 representa taxas de crescimento de tilápia macho adulto em resposta à injeção de SB2222000, ou antagonistas de NKB Ant-6 (500 μg/kg de peso corporal cada 48 h durante 2 semanas, N = 25 peixes por grupo).

[0110] A Figura 10 representa índice-gônado-somático (GSI) de peixes injetados com SB222200 ou antagonista de NKB Ant-6.

[0111] A Figura 11 representa níveis de expressão de antígeno Nuclear da Proliferação celular (PCNA) nos testículos de peixes injetados no dia 27.

[0112] As Figuras 12A e 12B representam crescimento em resposta à alimentação dos peixes jovens com antagonistas. Figura 12A taxa de crescimento de peixes (gr) com e sem os antagonistas. A Figura 12B fotografias representativas dos peixes da Fig12A. Os três peixes à esquerda são os peixes de controle, e os três peixes à direita foram alimentados com o antagonista Ant-6.

[0113] A Figura 13 mostra o efeito do antagonista de NKB No. 4 e No. 6, em CRE-Luc em células COS-7 transfectadas com tac3r de salmão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0114] A presente invenção fornece inibidores de reprodução de peixes e métodos para controlar a sua maturação e crescimento. A invenção se baseia na inibição do receptor de taquiquinina 3 (receptor de tac-3) pelos antagonistas de atividade à base de peptídeo ou de ligandos de molécula pequena tac-3 NKB e NKF.

[0115] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, os antagonistas de NKB são compostos à base de peptídeos (peptideomiméticos) de acordo com a seguinte fórmula: X1-X2-X3-NMeVal-X4-Leu-Met-NH2 em que i) é qualquer aminoácido ou aminoácido não natural mimético ou, alternativamente, é nulo (sem aminoácidos); X2 é qualquer aminoácido ou aminoácido não natural mimético ou, alternativamente, é nulo (sem aminoácidos); X3 é qualquer aminoácido, aminoácido aromático de preferência D, com maior preferência D-Trp ou, alternativamente, é nulo (sem aminoácidos); X4 é espaçador do tipo -NH(CH2)n-CO- em que n =2-6, ou em alternativa espaçador do tipo - (Pro)n- onde n = 1-6.

[0116] A presente invenção fornece peptideomiméticos de 5-10 aminoácidos e uma fração revestida N-terminal opcional, em que o peptideomimético é selecionado a partir do grupo consistindo em: um composto de Fórmula I: X1-NMeVal-X4-Leu-Met-Z, em que: X1 é uma extensão de 1-6 resíduos de aminoácidos naturais ou não-naturais; NMeVal é um resíduo N-metil-valina ou um resíduo N-metil-D-valina; X4 é - NH(CH2)n-CO- em que n é 2-6; e Z representa o C-terminal do peptídeo que pode ser amidado, acilado, reduzido ou esterificado; um composto de fórmula II: X1-NMeVal-X4-Leu-Met-NH2 em que, X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em: Succ-Asp-Phe; Succ-Asp- DPhe; Succ-Asp-Trp; Succ-Asp-DTrp; Succ-Asp-Ile-Phe; Succ-Asp-Ile- DPhe; Succ-Asp-Ile-Trp; Succ-Asp-Ile-DTrp; Succ-Asp-Ser-Phe; Succ-Asp- Ser-DPhe; Succ-Asp-Ser-Trp; Succ-Asp-Ser-DTrp, Succ-Glu-Phe; Succ- Glu-DPhe; Succ-Glu-Trp; Succ-Glu-DTrp; Succ-Glu-Ile-Phe; Succ-Glu-Ile- DPhe; Succ-Glu-Ile-Trp; Succ-Glu-Ile-DTrp; Succ-Glu-Ser-Phe; Succ-Glu- Ser-DPhe; Succ-Glu-Ser-Trp; and Succ-Glu-Ser-DTrp; e X4 é Ala; e um composto que compreende a sequência de NMeVal-Ala-Leu- Met (SEQ ID NO: 7).

[0117] As composições que compreendem os peptideomiméticos de acordo com a invenção e métodos para a sua utilização também são fornecidas.

[0118] De acordo com algumas modalidades específicas, a composição da invenção compreende, como um ingrediente ativo um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: Ant-1 a Ant-6 Succ-Asp-Ile-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 1, Ant- 1); Succ-Asp-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 2, Ant-2); Succ-Asp-Ser-Phe-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 3, Ant- 3); Succ-Asp-Ile-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 4, Ant- 4); Succ-Asp-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 5, Ant-5); e Succ-Asp-Ser-D-Trp-N(Me)Val-Ala-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 6, Ant-6).

[0119] Os peptídeos da presente invenção são preferencialmente sintetizados utilizando técnicas de síntese convencionais conhecidas na técnica, por exemplo, por técnicas de síntese química incluindo metodologias peptídeomiméticas. Estes métodos incluem a síntese em fase sólida exclusiva, métodos de síntese em fase sólida parcial, condensação de fragmentos, síntese clássica em solução. Procedimentos de síntese de peptídeos em fase sólida são bem conhecidos na técnica. Um versado na técnica pode sintetizar qualquer dos peptídeos da presente invenção utilizando um sintetizador de peptídeos automatizado utilizando química normal tal como, por exemplo, química t-Boc ou Fmoc. Os peptídeos sintéticos podem ser purificados por cromatografia líquida preparativa de elevado rendimento, e cuja composição pode ser confirmada através de sequenciação de aminoácidos. Conjugação de porções peptídicas e de permeabilidade pode ser realizada utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica, quer por fase sólida ou fase de solução química. Alguns dos compostos preferidos da presente invenção podem ser convenientemente preparados utilizando métodos de síntese em fase de solução. Outros métodos conhecidos na técnica para preparar compostos como os da presente invenção podem ser utilizados e estão compreendidos no escopo da presente invenção.

[0120] O revestimento N-terminal ou a modificação de acordo com a presente invenção, indica a alteração da sequência do peptídeo por ligação covalente de uma fração química para o terminal de amina resultante em carga modificada, atividade e/ou a sua estabilidade à clivagem por amino peptidases.

[0121] Exemplos não limitativos de uma fração de reforço da permeabilidade incluem: porções hidrofóbicas, tais como ácidos graxos, esteroides e compostos aromáticos ou alifáticos volumosos; porções que podem ter receptores ou transportadores da membrana celular, tais como esteroides, vitaminas e açúcares, aminoácidos naturais e não naturais e peptídeos transportadores. De acordo com algumas modalidades, a fração hidrofóbica é um radical lipídico ou uma fração de aminoácido.

[0122] Uma fração de melhoria de permeabilidade pode ser ligada a qualquer posição na fração de peptídeo, diretamente ou através de um espaçador. De acordo com modalidades específicas, a fração de célula de permeabilidade está ligada ao terminal amino da fração de peptídeo. O espaçador conjuntivo opcional pode ser de comprimentos variados e conformações compreendendo qualquer química adequada, incluindo, mas não se limitando a amina, amida, carbamato, tioéter, oxiéter, ligação de sulfonamida e semelhantes. Exemplos não limitativos de tais espaçadores incluem aminoácidos, derivados de sulfonamida, derivados de amino-tiol e derivados de amino álcool.

[0123] O termo "peptídeo" ou "peptídeo com base em" como aqui utilizado destina-se a abranger os resíduos de aminoácidos naturais (geneticamente codificados), não-naturais, e/ou quimicamente modificados, cada resíduo sendo caracterizado por ter um grupo amino e um terminal carboxil, ligado um para o outro por peptídeo ou ligações não peptídicas. Os resíduos de aminoácidos estão representados ao longo do relatório descritivo e reivindicações por um ou códigos de três letras, como é vulgarmente conhecido na técnica. Os peptídeos e peptideomiméticos da presente invenção são de preferência utilizados numa forma linear, embora seja apreciado que nos casos em que a ciclização não interfere gravemente com características peptídicas, formas cíclicas do peptídeo também podem ser utilizadas.

[0124] Os aminoácidos utilizados nesta invenção são aqueles que estão comercialmente disponíveis ou estão disponíveis por métodos sintéticos de rotina. Certos resíduos podem requerer métodos especiais para a incorporação no peptídeo, e abordagens sintéticas sequenciais, divergentes ou convergentes em relação à sequência do peptídeo são úteis na presente invenção. Aminoácidos naturais codificados e seus derivados são representados pelos códigos de três letras de acordo com as convenções da IUPAC. Quando não existe nenhuma indicação, pode ser utilizado quer os isômeros L ou D. Quando um "D" - precede o aminoácido, um isômero D é utilizado.

[0125] a substituição conservativa de aminoácidos, como conhecida dos especialistas na técnica, está dentro do escopo da presente invenção. As substituições conservativas de aminoácidos incluem a substituição de um aminoácido por outro com o mesmo tipo de grupo funcional da cadeia lateral ou, por exemplo, alifático, aromático, carregado positivamente, carregado negativamente. Estas substituições podem aumentar a biodisponibilidade oral, a afinidade para a proteína alvo, a estabilidade metabólica, a penetração no sistema nervoso central, tendo como alvo populações de células específicas e semelhantes. Um versado reconhecerá que substituições individuais, deleções ou adições ao peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína que alterem, adicionem ou eliminem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante conservativamente modificada" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica.

[0126] O seguinte é um exemplo de classificação dos aminoácidos em seis grupos, cada um contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), (Y) Tirosina, Triptofano (W).

[0127] Outras classificações de alguma forma em diferentes grupos (por exemplo, alifáticos, polares, não-polares, hidrofílicos, etc. hidrofóbicos) também são conhecidas na técnica e podem ser utilizados para as substituições conservativas de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[0128] Também incluídos dentro do escopo da invenção são os sais dos peptídeos, análogos e derivados químicos dos peptídeos da invenção.

[0129] Tal como aqui utilizado o termo "sais" refere-se a sais de grupos carboxil como a sais de adição de ácido dos grupos amino ou guanido da molécula de peptídeo. Os sais de grupos carboxil podem ser formados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo de sódio, de cálcio, de amônio, sais férricos ou de zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas tais como os sais formados por exemplo com aminas tais como trietanolamina, piperidina, procaína e semelhantes. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Sais descrevem aqui também componentes iônicos adicionados à solução de peptídeo para melhorar a formação de hidrogel e/ou a mineralização de minerais de cálcio.

[0130] Um "derivado químico" tal como aqui utilizado refere-se a peptídeos contendo uma ou mais porções químicas que não são normalmente uma parte da molécula de peptídeo, tais como ésteres e amidas de grupos carboxi livres, derivados acil e alquil de grupos amina livres, fosfoésteres e éteres de grupos hidroxi livres. Tais modificações podem ser introduzidas na molécula fazendo reagir resíduos de aminoácidos alvo do peptídeo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Derivados químicos preferidos incluem peptídeos que foram fosforilados, C-terminais amidados ou N-terminais acetilados.

[0131] "Derivados funcionais" dos peptídeos da invenção, tal como aqui utilizado abrange derivados que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou nos grupos N- ou C-terminais, por meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invenção desde que eles permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, eles não destruam a atividade do peptídeo, não confiram propriedades tóxicas às composições que o contêm e não afetem de forma adversa as propriedades antigênicas dos mesmos. Estes derivados podem, por exemplo, incluir ésteres alifáticos dos grupos carboxil, amidas dos grupos carboxil produzidas por reação com amoníaco ou com aminas primárias ou secundárias, derivados N-acil de grupos amino livres dos resíduos de aminoácidos formados por reação com porções de acil (por exemplo, alcanoil ou grupos aroil carbocíclicos) ou derivados O-acil de grupos hidroxil livres (por exemplo, os de resíduos seril ou treonil) formados por reação com porções de acil.

[0132] O termo "análogo peptídico" indica molécula que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, exceto para uma ou mais alterações de aminoácidos ou um ou mais alterações/substituições de uma ligação amida. Os análogos peptídicos incluem substituições de aminoácidos e/ou adições com resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais, e as modificações químicas que não ocorrem na natureza. Os análogos peptídicos incluem peptídeos miméticos. Um peptídeo mimético ou "peptideomimético" significa que um peptídeo de acordo com a invenção é modificado de tal forma que inclui pelo menos um resíduo não codificado ou uma ligação não peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, alquilação e metilação mais específica de um ou mais resíduos, inserção ou substituição de aminoácido natural, aminoácidos não-naturais, a substituição de uma ligação amida com a outra ligação covalente. Um peptidomimético de acordo com a presente invenção pode compreender opcionalmente pelo menos uma ligação que é uma ligação de substituição de amida, tais como ligação de ureia, ligação de carbamato, ligação de sulfonamida, ligação de hidrazina, ou de qualquer outra ligação covalente. A concepção de "análogos" apropriada pode ser assistida por computador. Análogos de peptídeos adicionais de acordo com a presente invenção compreendem uma sequência de peptídeo ou análogo peptídico específico numa ordem inversa, ou seja, os aminoácidos são acoplados na sequência do peptídeo em uma ordem inversa à ordem dos aminoácidos, que aparece na proteína nativa ou num peptídeo ou análogo específico identificado como ativo. Se completamente ou parcialmente não- peptídeo, peptideomiméticos de acordo com a presente invenção fornecem um arranjo espacial de porções químicas que se assemelha ao arranjo tridimensional de grupos do peptídeo em que o peptideomimético se baseia. Como resultado desta estrutura do sítio ativo similar, o peptideomimético tem efeitos sobre sistemas biológicos que são similares à atividade biológica do peptídeo.

[0133] Um resíduo de aminoácido modificado é um resíduo de aminoácido em que qualquer grupo ou ligação foi modificado por deleção, adição ou substituição por um grupo ou ligação diferente, desde que a funcionalidade do resíduo de aminoácido esteja preservada ou se a funcionalidade foi alterada (por exemplo a substituição de tirosina por fenilalanina substituída), desde que a modificação não prejudique a atividade do peptídeo que contém o resíduo modificado.

[0134] "Um conjugado de peptídeo", de acordo com a presente invenção, indica uma molécula que compreende uma sequência de um vaso sanguíneo que promove peptídeo ao qual outra fração, tanto peptídica ou não peptídica, está ligada de forma covalente, diretamente ou através de um ligante.

[0135] O termo "ligante" significa uma fração química, uma ligação química direta de qualquer tipo, ou um espaçador, cuja finalidade é a de ligar, covalentemente, uma fração de célula de permeabilidade e um peptídeo ou peptideomimético. O espaçador pode ser utilizado para permitir a distância entre a fração de reforço da permeabilidade e o peptídeo.

[0136] "Permeabilidade" se refere à capacidade de um agente ou uma substância de penetrar, impregnar, ou se difundir através de uma barreira, membrana, ou uma camada de pele. A "permeabilidade celular" ou uma fração de "penetração de célula" se refere a qualquer molécula conhecida na técnica, que é capaz de facilitar ou intensificar a penetração de moléculas através de membranas. Exemplos não limitativos incluem: porções hidrofóbicas, tais como lipídios, ácidos graxos, esteroides e compostos aromáticos ou alifáticos volumosos; porções que podem ter receptores ou transportadores da membrana celular, tais como esteroides, vitaminas e açúcares, aminoácidos naturais e não naturais e peptídeos transportadores, nanopartículas e lipossomas.

[0137] O termo "veículo fisiologicamente aceitável" ou "diluente" ou "excipiente" refere-se a um fluido aquoso ou não aquoso que é bem adequado para preparações farmacêuticas. Além disso, o termo "um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável" se refere a pelo menos um veículo ou excipiente e inclui misturas de transportadores e ou excipientes. O termo "terapêutico" se refere a qualquer agente farmacêutico, droga ou profilático que pode ser utilizado no tratamento (incluindo a prevenção, diagnóstico, alivio ou cura) de um mal, dor, doença ou lesão, em um paciente.

Farmacologia

[0138] Para além de outras considerações, o fato de que os ingredientes ativos da invenção são peptídeos, análogos de peptídeos ou peptideomiméticos, dita que a formulação pode ser adequada para distribuição destes tipos de compostos. Embora em geral peptídeos são menos adequados para a administração oral, devido à suscetibilidade à digestão por ácidos gástricos ou enzimas intestinais novos métodos estão sendo utilizados, a fim de desenhar e fornecer análogos peptideomiméticos biodisponíveis metabolicamente estáveis e orais.

[0139] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por quaisquer meios adequados, tais como oralmente, topicamente, intranasalmente, subcutaneamente, intramuscularmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intra articularmente, intra lesionalmente, por inalação ou por via parentérica, e são especificamente formulados para a via de administração. As composições são formuladas de acordo com a via de administração.

[0140] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, moagem, pulverização, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização.

[0141] As composições farmacêuticas para utilização de acordo com a presente invenção podem assim ser formuladas de modo convencional utilizando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação apropriada é dependente da via de administração escolhida.

[0142] As composições farmacêuticas, que podem ser utilizadas oralmente, incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas, moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes ativos em mistura com enchimento tal como lactose, aglutinantes, tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizantes.

[0143] Para injeção, os compostos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Esses penetrantes, por exemplo, polietileno-glicol são geralmente conhecidos na técnica.

[0144] Os núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados. Para este fim, soluções concentradas de açúcar que podem ser utilizadas podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos das drágeas para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de composto ativo.

[0145] Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de modo convencional.

[0146] Para administração por inalação, as variantes para utilização de acordo com a presente invenção são convenientemente distribuídas na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de uma embalagem pressurizada ou um nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para distribuir uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do peptídeo e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

[0147] As composições farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos ingredientes ativos na forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeções oleosas apropriadas. Transportadores naturais ou sintéticos adequados são bem conhecidos na técnica (Pillai et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 447, 2001). Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos, para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, isenta de pirogênios, antes da utilização.

[0148] As composições farmacêuticas adequadas para utilização no contexto da presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos numa quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de um composto eficaz para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas de uma doença do indivíduo a ser tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos versados na técnica.

[0149] A toxicidade e eficácia terapêutica dos peptídeos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, através da determinação do IC50 (a concentração que fornece uma inibição de 50%) e o LD50 (dose letal que causa a morte de 50% dos animais testados) para um composto em questão. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. A formulação exata, a via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico tendo em vista a condição do paciente (por exemplo, Fingl, et al., 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

[0150] As doses para a administração de tais composições farmacêuticas que variam de acordo com algumas modalidades da presente invenção desde cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal.

[0151] Dependendo da gravidade e capacidade de resposta da condição a ser tratada, a dosagem pode também ser uma única administração de uma composição de liberação lenta, com o curso de tratamento que dura desde vários dias a várias semanas ou até a cura ser efetuada ou a diminuição do estado de doença ser conseguida. A quantidade de uma composição a ser administrada irá, claro, ser dependente do indivíduo a ser tratado, da gravidade da dor, do modo de administração, a decisão do médico que prescreve, e todos os outros fatores relevantes.

[0152] Em certas modalidades, a distribuição de peptídeos pode ser melhorada pela utilização de excipientes de proteção. Isto é tipicamente conseguido ou por complexação do peptídeo com uma composição para o tornar resistente à hidrólise acídica e enzimática ou por embalagem do polipeptídeo num veículo adequadamente resistente, tal como um lipossoma. Meios de proteção dos polipeptídeos para a administração oral são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Pat. No. 5.391.377 descreve composições lipídicas para distribuição oral de agentes terapêuticos).

[0153] Meia-vida elevada de soro pode ser mantida pela utilização de sistemas de liberação sustentada de proteínas de "empacotamento". Tais sistemas de liberação controlada são bem conhecidos dos versados na técnica. Numa modalidade preferida, o sistema de distribuição de microesferas biodegradáveis ProLease para proteínas e peptídeos (Tracy, 1998, Biotechnol. Prog. 14, 108; Johnson et al., 1996, Nature Med. 2, 795; Herbert et al., 1998, Pharmaceut. Res. 15, 357) de um pó seco composto por microesferas poliméricas biodegradáveis contendo a proteína numa matriz de polímero que pode ser combinada como uma formulação seca com ou sem outros agentes.

[0154] Em certas modalidades, formas de dosagem das composições da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a sistemas de reservatório injetáveis biodegradáveis, tais como, sistemas de reservatório injetáveis com base em PLGA; sistemas de depósito injetáveis com base em não PLGA, e géis ou dispersões biodegradáveis injetáveis. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. O termo "biodegradável", tal como aqui utilizado refere-se a um componente que erode ou degrada nas suas superfícies ao longo do tempo devido, pelo menos em parte, ao contato com substâncias encontradas nos fluidos dos tecidos circundantes ou por ação celular. Em particular, o componente biodegradável é um polímero tal como, mas não se limitando a polímeros à base de ácido lático, tais como polilactídeos, por exemplo poli (D, L- lactídeo), ou seja PLA; polímeros à base de ácido glicólico tais como poliglicólidos (PGA), por exemplo a Lactel® a partir de Durect; poli (D, L- lactídeo-co-glicólico) ou seja, PLGA, (Resomer® RG-504, Resomer® 1^RG- 502, Resomer® RG-504H, Resomer® RG-502H, Resomer® RG-504S, Resomer® RG- 502S, a partir de Boehringer, Lactel® a partir de Durect); policaprolactonas, tais como poli (e-caprolactona) ou seja PCL (Lactel® a partir de Durect); polianidridos; poli(ácido sebácico) SA; poli(ácido ricenólico) RA; poli(ácido fumárico), FA; poli(dimmer de ácidos graxos), FAD; poli(ácido tereftálico), TA; poli(ácido isoftálico), IPA; poli(p- carboxifenoxi}{metano), CPM; poli(p-carboxifenoxi} {propano), CPP; poli(p- {carboxifenoxi}hexano)s CPH; poliaminas, poliuretanos, poliesteramidas, poliortoésteres {CHDM: cis/trans- ciclo-hexil dimetanol, HD:l, 6-hexanodiol. DETOU: (3,9-dietilideno-2,4,8,10- tetraoxaespiro undecano)}; polidioxanonas; polihidroxibutirats; oxalatos de polialquileno; poliamidas; poliesteramidas; poliuretanos; poliacetais; policetais; policarbonatos; poliortocarbonatos; polissiloxanos; polifosfazenos; succinatos; ácido hialurônico; poli (ácido málico); poli (aminoácidos); poli-hidroxivaleratos; succinatos de polialquileno; polivinilpirrolidona; poliestireno; ésteres de celulose sintéticos; ácidos poliacrílicos; ácido polibutírico; copolímeros tribloco (PLGA-PEG-PLGA), copolimeros tribloco (PEG-PLGA-PEG), poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), poli (óxido de etileno) - (óxido de propileno) de poli - (óxido de etileno) poli tri-bloco copolímeros (PEO-PPO- PEO), poli ácido valérico; polietileno glicol; polihidroxialquilcelulose; quitina; quitosana; poliortoésteres e copolímeros, terpolímeros; lípidos, tais como colesterol, lecitina; poli (ácido glutâmico glutamato-co-acetato) e semelhantes, ou misturas dos mesmos.

[0155] Em algumas modalidades, as composições da presente invenção compreendem um polímero biodegradável selecionado dentre, mas não se limitando a, PLGA, PLA, PGA, policaprolactona, poli- hidroxibutirato, poliortoésteres, polialcanoanidridos, gelatina, colágeno, celulose oxidada, polifosfazeno e semelhantes. Cada possibilidade representa uma modalidade separada.

Composições de comida de peixe

[0156] As composições alimentares da presente invenção podem ser parte de, ou misturado com comida de peixe convencional ou especial. Comida de peixe normalmente consiste em uma ração utilizada para o tipo de peixe a ser alimentado e inclui proteínas, óleos, vitaminas e outros aditivos.

[0157] De acordo com alguns exemplos não-limitantes, as composições de antagonistas da presente invenção são incluídas em composições de peletes, sólidos contendo, cerca de 15 a 50 por cento de proteína ou hidrolisado de proteínas, cerca de 2 a 5 por cento de gordura, e cerca de 3 a 10 por cento de fibra bruta em conjunto com quantidades menores de adjuvantes, tais como minerais, vitaminas e/ou elementos vestigiais.

[0158] Composição alimentar para peixes compreendendo os antagonistas da presente invenção são preparados utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, peletes, tipicamente 0,5-20 mm de diâmetro, são feitos a partir da composição e secos antes do armazenamento e utilização. A coerência dos peletes pode ser melhorada através da dissolução numa pequena quantidade de gelatina em água. Se soro de leite em pó solúvel em água fornece a maior parte do teor de proteína, as superfícies de peletes estão de preferência revestidas com um pouco de óleo ou gordura para impedir desintegração prematura dos peletes em contato com a água. As composições de gelatina de suporte podem ser de espuma de uma maneira convencional para produzir peletes celulares cuja densidade global é semelhante à da água. Esses peletes flutuam na água e se mantem acessíveis para os peixes por um período relativamente longo. Peletes que descem para o fundo estão perdidos para muitos peixes. Os antagonistas da invenção também podem ser misturados com rações para peixes comerciais de composição convencional, distribuindo uniformemente a adição da composição de base e, subsequentemente, fazendo peletes a partir da mistura obtida. De acordo com algumas modalidades, peletes alimentares são revestidos com os compostos da invenção e utilizados para alimentar os peixes.

[0159] Embora a presente invenção tenha sido descrita com respeito a várias modalidades específicas da mesma, a fim de ilustrar isso, tais modalidades especificamente divulgadas não devem ser consideradas como limitativas. Muitas outras modalidades específicas irão ocorrer aos versados na técnica com base na divulgação dos requerentes aqui, e os requerentes propõem ser ligados pelo espírito e escopo da sua invenção, tal como definido nas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[0160] Os exemplos seguintes demonstram a atividade in vitro e in vivo dos compostos da presente invenção como antagonistas de NKB de peixe.

Exemplo 1: Concepção e síntese de peptideomiméticos

[0161] Alguns dos peptideomiméticos da presente invenção foram de desenho baseado nas seguintes considerações: ii) O N-terminal do peptídeo foi modificado pela adição de uma fração de revestimento tal como succinil (Succ) acoplado ao resíduo Asp, de tal modo que o peptídeo não tem o grupo amino terminal que é suscetível de degradação por amino peptidases. Este inesperadamente resultou na capacidade de encurtamento do peptídeo ativo a partir de 11 a 7 aminoácidos; iii) A substituição de um resíduo Phe por D-Trp impediu encaixe justo do agonista ao receptor de NK. Isto alterou a atividade do peptídeo de agonista para antagonista e também estabilizou o peptídeo à degradação por endopeptidases. iv) ) O resíduo Val foi N-metilado para impor restrição conformacional que estabiliza a conformação bioativa assim impondo seletividade de receptor e estabilidade metabólica, prevenindo degradação por endopeptidases. v) ) O resíduo Gly foi substituído por Ala (betta alanina) resultando em flexibilidade conformacional aumentada da conformação bioativa assim impõem seletividade de receptor e estabilidade metabólica, prevenindo degradação por endopeptidases. vi) O grupo carboxamida no terminal carboxil é essencial para ligação e ativação do receptor e evita a degradação por carboxipeptidases.

[0162] O peptideomimético foi sintetizado por um método automático em fase sólida de Fmoc aplicando química éster ativa. Acoplamento difícil de aminoácidos hidrofóbicos, tais como Fmoc-D-Trp-OH para NMe-Val- peptidilo-resina foi realizado duas vezes, utilizando HATU por 5 horas em DMF. Os compostos foram purificados por HPLC para 95% de pureza.

Exemplo 2: Testes in vitro

[0163] Há duas vias de transdução de sinal, uma retransmitida através de cAMP/PKA (proteína quinase A), e a segunda através de Ca2/PKC. A via de PKA é ativada por CRE (elemento de resposta cAMP) e a PKC através de SRE (elemento de resposta esteroide).

[0164] A fim de diferenciar entre as vias de transdução de sinal de PKC e PKA, um ensaio do gene repórter da luciferase sensível (LUC) foi utilizado utilizando o LUC transcricionalmente regulado por um elemento de resposta de soro (SRE; Invitrogen) ou elemento de resposta AMP cíclico (AMPc) (CRE; Invitrogen). Tac3ra de tilápia e tac3rb (GenBank número de acesso KF471674 e KF471675, respectivamente) ou tac3ra de peixe-zebra e tac3rb (JF317292, e JF317293, respectivamente) foram clonados no vetor de expressão pcDNA3.1 (Zeo-; Invitrogen) sob o controle do promotor de CMV.

[0165] Transfecção transiente, procedimentos e protocolos de estimulação de células foram geralmente de acordo com (Levavi-Sivan et al., 2005, Mol Cell Endocrinol 236:17-30; Biran et al., 2008, ibid, Biran et al., 2012, ibid, Biran et al., 2014 ibid). Resumidamente, as células COS-7 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de glutamina, 100 U/ml de penicilina, e 100 mg/ml de estreptomicina (Biological Industries), sob 5% de CO2 até confluência. A cotransfecção de qualquer pc-tac3ra, pc-tac3rb (a 3 μg/placa), um plasmídeo repórter (a 2 μg/placa), e pCM.

[0166] A transfecção foi realizada com o reagente FuGENE 6.0 (Roche). As células foram privadas de soro durante 36 horas, estimuladas com veículo ou várias concentrações quer NKB de humano, NKB de tilápia, NKF de tilápia, NKBA de peixe-zebra, NKBB de peixe-zebra ou NKF durante 6 h, e, em seguida, colhidas e analisadas.

[0167] Os lisados preparados a partir das células colhidas foram testados tanto para a atividade de luciferase e a atividade -galactosidase, o qual foi utilizado como um padrão interno para normalizar a atividade da luciferase dirigida pelo plasmídeo de teste, conforme descrito anteriormente. As experiências de transfecção foram realizadas em triplicado com três conjuntos isolados independentemente.

[0168] As concentrações de ligando utilizadas eram de 1 nM a 1μM. Os tratamentos foram realizados em quadruplicado em três experiências independentes.

[0169] Cada antagonista foi adicionado em diferentes concentrações, com uma concentração constante do tipo selvagem NKF ou NKB, a uma dose de ligando (10-8M) que deu uma resposta perto do ED50. Os resultados foram analisados pelo software Prism, de acordo com uma regressão não-linear de uma curva de competição local.

[0170] O efeito dos antagonistas de NKB foi testado em tilápia quando cada antagonista foi adicionado em diferentes concentrações concomitantemente com NKB em 10-8 M (= 0,1 nM). NKB de tilápia aumentou a atividade da luciferase em 1,8 vezes. Os vários antagonistas reduziram esta resposta em aproximadamente 60% (Figura 1A). Resultados semelhantes foram obtidos utilizando a resposta SRE (Figura 1B). Em contraste, NKB de tilápia e análogos de NKF (divulgado no documento WO 2013/018097) mostraram ter atividade agonista em ambos os ensaios, como demonstrado na Figura 1C para o ensaio CRE.

[0171] O NKB de peixe-zebra foi mais eficiente do que o peptídeo de tilápia na indução da atividade de transdução de sinal, e aumentou a CRE- LUC em mais de 3 vezes. O efeito dos antagonistas de NKB foi testado quando cada antagonista foi adicionado em diferentes concentrações concomitantemente com NKB em 10-8 M (= 0,1 nM). Os vários antagonistas reduziram esta resposta em aproximadamente 60% (Figura 2A). Resultados semelhantes foram obtidos utilizando a resposta SRE (Figura 2B), ao passo que os agonistas de NKB não foram inibidores mas estimuladores e deram resultados semelhantes à Figura 1C.

[0172] Para concluir, antagonistas de NKB peptideomiméticos de acordo com a presente invenção são capazes de inibir a transdução de sinal de NKB.

Exemplo 3. Os antagonistas não-peptídicos para NKB

[0173] O efeito dos antagonistas de NKB de pequena molécula conhecidos foram testados in vitro e in vivo. Os compostos são: SB-222200 (Sarau et al., 2000 ibid); Osanetant (SR-142,801) e talnetant (SB 223412,(Sarau et al., 1997 ibid).

[0174] O efeito do antagonista de NKB SB222200 em CRE-Luc em células COS-7 transfectadas com tac3r de tilápia foi testado quando o receptor e ligando humano serviu como um controle positivo.

[0175] Como mostrado na Figura 3A, o antagonista não peptídico apenas não teve efeito sobre a atividade de luciferase, enquanto hNKB, NKB de tilápia ou NKF de tilápia, a 0,1 nM (10 =-8 H), aumentou a atividade da luciferase de 1,7 e 2,3 vezes, respectivamente.

[0176] Quando diferentes concentrações de antagonista foram adicionadas concomitantemente com 0,1 nM dos ligandos nativos (NKB ou NKF) uma curva de inibição típica foi alcançada, demonstrando a potência do antagonista do SB222200 sobre o receptor de NKB de tilápia (Figura 3B).

[0177] O efeito do antagonista de NKB Osanetant (SR-142801) foi testado em CRE-Luc em células COS-7 transfectadas com tac3r de tilápia quando o receptor humano e ligando serviu como um controle positivo. O antagonista não peptídico apenas não teve qualquer efeito na atividade de luciferase, enquanto hNKB, NKB de tilápia ou NKF de tilápia, a 0,1 nM (10 =-8 H), aumentou a atividade da luciferase de 2,5 e 1,6 vezes, respectivamente (Figura 4A). No entanto, quando diferentes concentrações de antagonista foram adicionadas concomitantemente com 0,1 nM dos ligandos nativos (NKB ou NKF) uma curva de inibição foi tipicamente obtida, mostrando a potência do antagonista de Osanetant (SR-142801) sobre o receptor de NKB de tilápia (Figura 4B).

[0178] SB222200 foi ainda testado in vivo para a sua atividade de antagonista de NKB em liberação de gonadotropina em tilápia. Tilápias fêmeas sexualmente maduras (0,62±0,22%; n=10/tratamento) foram injetadas com doses diferentes de antagonista de NKB não peptídico SB222200 (10, 100 ou 500 μg/kg de peso corporal) no tempo 0. 1, 2, 4 e 8 horas após a injeção os peixes foram sangrados a partir de sua vasculatura caudal. Os níveis de gonadotropinas FSH e LH foram determinados utilizando ELISA específico de acordo com Aizen et al., 2007 (Aizen et al., 2007, Gen Comp Endocrinol, vol. 153, pp 323-332). Os resultados mostram que, embora nenhuma alteração significativa foi registrada no grupo de controle, um declínio gradual significativo foi registrado em ambos os níveis de LH e (Figura 5B) FSH (Figura 5A) e já começando 1 hora após a injeção.

Exemplo 4. Experiências in vivo

[0179] Antagonistas selecionados que foram mostrados eficazes no ensaio de transativação in vitro são testados in vivo.

[0180] Tilápias macho adultas (BW 90 g) foram injetadas ip com soro fisiológico e DMSO a 25%, SB2222000, ou os antagonistas de NKB Ant-4 (500 μg/kg de peso corporal cada 48 h durante 2 semanas, N = 20 peixes por grupo). Os peixes foram sangrados a partir dos vasos sanguíneos caudais em seringas heparinizadas a cada 2 dias após a injeção. Nos dias 7 e 14 cinco peixes de cada grupo foram sangrados, marcados para o volume de esperma e gônadas foram levadas para Histologia. O plasma foi analisado para LH, FSH e 11KT. As amostras de sangue foram recolhidas a partir da vasculatura caudal e centrifugadas (3000 rpm durante 20 minutos a 4°C) para se obter amostras de plasma, que foram armazenadas a -20°C até serem ensaiadas. ELISAs foram realizados de acordo com (Aizen et al., 2007, Gen Comp Endocrinol, vol. 153, pp 323-332) para FSH e LH e de acordo com Hurvitz et al., 2005 (Gen Comp Endocrinol 140:61-73) para 11KT (11-Cetotestosterona, o principal androgênio no peixe que está envolvido na espermatogênese).

[0181] Figura 6 representa observações histológicas de gônadas de testículos de peixes tratados em relação a peixes controle. Testículos de peixes são organizados em cistos. Tal como demonstrado na figura, peixes expostos ao antagonista de NKB-Ant-4 continham parcialmente mais cistos vazios com espermatozoides maduros (esperma maduro). Volume de sêmen de peixes injetados com antagonistas de NKB são apresentados na Figura 7. Da direita para a esquerda: sêmen de peixes injetados com SB222200; sêmen de peixes de controle; sêmen de peixes injetados com antagonista de NKB #4. Níveis de 11KT em peixes injetados com SB222200 ou antagonista de NKB Ant-4 são mostrados na Figura 8. 11KT é o principal androgênio em peixes e está envolvido na espermatogênese. Durante o período de tratamento, os níveis de plasma 11KT aumentaram gradualmente a partir de 0 a 12 dias para os peixes de controle, enquanto que para os peixes que foram injetados com SB222200 ou antagonista de NKB Ant-4 (# 4), esse aumento foi significativamente inibido.

Exemplo 5. Crescimento da Tilapia in-vivo

[0182] Tilápias macho adultas (BW 60 g) foram injetadas ip com soro fisiológico e DMSO a 25%, SB2222000, ou os antagonistas de NKB Ant-6 (500 μg/kg de peso corporal cada 48 h durante 2 semanas, N = 25 peixes por grupo). Peixes foram pesados a cada 7 dias. Tal como indicado na Figura 9, o crescimento significativo foi observado no dia 21, sete dias após o tratamento estar terminado.

[0183] O índice gonadossomático (GSI), é o cálculo da massa das gônadas como uma proporção da massa corporal total. O valor GSI do peixe injetado também foi calculado (Figura 10). No dia 27, os peixes foram sacrificados e o RNA total foi extraído a partir de seus testículos. Antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma braçadeira de DNA que atua como um fator para DNA polimerase em células eucarióticas e é essencial para a replicação. A expressão gênica de PCNA foi determinada nos testículos dos peixes injetados após 27 dias (Figura 11).

Exemplo 6. Alimentação de jovens Tilápias

[0184] Tilápias fêmeas em idade de 105 dias foram utilizadas neste estudo. Alimentação, por peletes de peixe revestidos com os antagonistas peptideomiméticos, foi iniciada na idade de 3 meses e 12 dias. A dieta de antagonistas de NKB (Ant-2, Ant-3, Ant-6) foi aplicado a 7,5 mg/kg de ração (2% a 3% do peso de peixe). Os peixes foram alimentados duas vezes ao dia durante as horas de luz do dia. Foi determinada a taxa de crescimento dos peixes. Como indicado nas Figuras 12A e 12B peixes que foram alimentados numa dieta contendo os antagonistas de NKB cresceram significativamente mais rápido (aumento de cerca de 25% em peso do corpo) do que os peixes de controle. Não foram observadas alterações nos seus órgãos internos (como determinado pela fotografia dos órgãos).

Exemplo 7. Experimentos in vitro em salmão

[0185] Semelhante às experiências in-vitro realizadas no Exemplo 2 em Tilápias e Peixes-zebra, a inibição da atividade de NKB foi testada em Peixes salmão. Receptor tac3 de salmão foi clonado no vetor de expressão pcDNA3.1 (Zeo-; Invitrogen) sob o controle do promotor de CMV. A transfecção foi realizada com o reagente FuGENE 6.0 (Roche). As células foram privadas de soro durante 36 horas, estimuladas com concentrações diferentes de veículos ou de qualquer NKB de tilápia durante 6 h, e, em seguida, colhidas e analisadas. Os lisados preparados a partir das células colhidas foram testados tanto para a atividade de luciferase e a atividade - galactosidase, o qual foi utilizado como um padrão interno para normalizar a atividade da luciferase dirigida pelo plasmídeo de teste. As experiências de transfecção foram realizadas em triplicado com três conjuntos isolados independentemente. As concentrações de ligando utilizadas eram de 1 nM a 1μM. Os tratamentos foram realizados em quadruplicado em três experiências independentes. Cada antagonista (NKB-ant 4 e NKB-ant 6) foi adicionado em diferentes concentrações com uma concentração constante de NKB do tipo selvagem (10-8M) que deu uma resposta perto do ED50. Os resultados foram analisados pelo software Prism, de acordo com uma regressão não-linear de uma curva de competição local.

[0186] Quando tac3 de salmão foi transfectado, NKB aumentou a atividade da luciferase em 1,8 vezes. Como demonstrado na Figura 13, ambos os antagonistas #4 e #6 reduziram com sucesso esta resposta em aproximadamente 60%.

Claims

1. Peptideomimético, de acordo com a fórmula I: X1-NMeVal-X4-Leu- Met-Z (Fórmula I), caracterizado pelo fato de que: o peptideomimético consiste em 5-10 aminoácidos; X1 é uma extensão de 1-6 resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais e, opcionalmente, uma fração de revestimento N-terminal ou modificação; NMeVal é um resíduo N-metil-valina ou um resíduo N-metil-D-valina; X4 é -NH-(CH2)n-CO- em que n é 2-6; e Z representa o C-terminal do peptídeo que pode ser amidado, acilado, reduzido ou esterificado.

2. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X1 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido aromático na configuração L ou D.

3. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X1 compreende pelo menos um resíduo ácido de aminoácido carregado negativamente.

4. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X1 consiste em 2 ou 3 resíduos de aminoácido que compreendem um resíduo aromático, um resíduo ácido carregado negativamente e uma fração de revestimento N-terminal.

5. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que X1 compreende um resíduo selecionado a partir de um resíduo de aminoácido alifático e um resíduo polar não carregado.

6. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X1 compreende um resíduo aromático selecionado a partir do grupo que consiste em Phe, DPhe, Trp e DTrp; um resíduo ácido com carga negativa selecionado de Glu e Asp; e uma fração revestida de succinil (Succ) N-terminal.

7. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X1 compreende um resíduo aromático selecionado dentre Phe e DTrp; um resíduo de Asp; uma fração revestida de succinil (Succ) N- terminal e, opcionalmente, um resíduo selecionado a partir de Ile e Ser.

8. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptideomimético está de acordo com a Fórmula II: X1- NMeVal-βAla-Leu-Met-NH2 (Fórmula II), e X1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: Succ-Asp-Phe; Succ-Asp-DPhe; Succ-Asp-Trp; Succ-Asp- DTrp; Succ-Asp-Ile-Phe; Succ-Asp-Ile-DPhe; Succ-Asp-Ile-Trp; Succ-Asp- Ile-DTrp; Succ-Asp-Ser-Phe; Succ-Asp-Ser-DPhe; Succ-Asp-Ser-Trp; Succ- Asp-Ser-DTrp, Succ-Glu-Phe; Succ-Glu-DPhe; Succ-Glu-Trp; Succ-Glu- DTrp; Succ-Glu-Ile-Phe; Succ-Glu-Ile-DPhe; Succ-Glu-Ile-Trp; Succ-Glu-Ile- DTrp; Succ-Glu-Ser-Phe; Succ-Glu-Ser-DPhe; Succ-Glu-Ser-Trp; e Succ- Glu-Ser-DTrp.

9. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em 5-10 resíduos de aminoácidos compreendendo a sequência: NMeVal-βAla-Leu-Met (SEQ ID NO: 7).

10. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o peptideomimético compreende uma sequência de SEQ ID NO: 7, pelo menos um resíduo de aminoácido aromático, pelo menos um resíduo de aminoácido com carga negativa, pelo menos um resíduo selecionado a partir de um resíduo de aminoácido alifático e um resíduo polar, sem carga e um N-terminal revestido.

11. Peptideomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptideomimético é selecionado a partir do grupo consistindo em: Succ-Asp-Ile-Phe-N(Me)Val-βAla-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 1); Succ-Asp-Phe-N(Me)Val-βAla-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 2); Succ-Asp-Ser-Phe-N(Me)Val-βAla-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 3); Succ-Asp-Ile-D-Trp-N(Me)Val-βAla-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 4); Succ-Asp-D-Trp-N(Me)Val-βAla-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 5); e Succ-Asp-Ser-D-Trp-N(Me)Val-βAla-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 6); em que Succ indica um succinil.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um peptideomimético conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que está na forma de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um carreador, diluente, sal ou excipiente aceitável ou uma composição alimentar compreendendo pelo menos um nutriente.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que está na forma de uma composição alimentar compreendendo pelo menos um aditivo alimentar, em que o aditivo alimentar é selecionado a partir de um aditivo de cor e um aditivo de sabor.

15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de ser formulada para administração aos peixes por uma via selecionada a partir do grupo que consiste em: administração intraparietal, administração oral e administração por imersão, ou como parte do consumo regular de alimentos ou de água.