BR112016026092B1 - Composições compreendendo aav expressando constructos de anticorpos duais e seus usos - Google Patents

Abstract

VÍRUS ADENOASSOCIADO (AAV) RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE E SEUS USOS. É descrito um vírus adenoassociado (AAV) recombinante tendo uma capsida de AAV e empacotado aí um ácido nucleico heterólogo que expressa dois constructos de anticorpos funcionais em uma célula. São também descritos anticorpos compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo heterólogo. Em uma modalidade, os anticorpos são coexpressos a partir de um vetor contendo: um primeiro cassete de expressão que codifica pelo menos uma primeira grelha de leitura aberta (ORF) para um a primeira imunoglobulina sob o controle de sequências de controle reguladoras que dirigem a sua expressão; e um segundo cassete de expressão que compreende uma segunda ORF, um ligante, e uma terceira ORF sob o controle de sequências de controle reguladoras que dirigem a sua expressão, em que a segunda e terceira ORF para um segundo e terceiro constructo de imunoglobulina. O vetor coexpressando estes constructos de anticorpos é em uma modalidade um AAV no qual as 5' e 3' ITRs flanqueiam os cassetes de expressão e sequências reguladoras.

Description

INCORPORAÇÃO-POR-REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO EM FORMA ELETRÔNICA

[001] O requerente incorpora deste modo por referência o mate rial de Listagem de Sequências depositado em forma eletrônica aqui. Este ficheiro é marcado "14-7032PCT_Seq Listing_ST25.txt".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os anticorpos monoclonais têm provado ser terapêuticos eficazes para o câncer e outras doenças. A terapia corrente com anticorpos envolve administração repetida e regimes de tratamento a longo prazo, que estão associados a um número de desvantagens, tais como níveis inconsistentes no soro e duração limitada da eficácia por administração tal que é requerida readministração frequente e elevado custo. O uso de anticorpos como ferramentas de diagnóstico e modalidades terapêuticas tem encontrado uso crescente em anos recentes. O primeiro anticorpo monoclonal aprovado pela FDA para tratamento do câncer, Rituxan® (Rituximab), foi aprovado em 1997 para o tratamento de pacientes com linfoma não de Hodgkin e logo depois em 1995, Herceptin®, um anticorpo monoclonal humanizado para trata-mento de pacientes com câncer da mama metastático, foi aprovado. Numerosas terapias à base de anticorpos que estão em várias etapas de desenvolvimento clínico estão mostrando promessa. Dado o sucesso de várias terapias com anticorpos monoclonais foi sugerido que a próxima geração de biofarmacêuticos envolverá cocktails, i.e., misturas, de anticorpos.

[003] Uma limitação à aplicação clínica disseminada de tecnolo gia de anticorpos é que são tipicamente requeridas grandes quantidades de anticorpo para eficácia terapêutica e os custos associados à produção são significativos. As células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de mieloma SP20 e NSO2 são as linhas de células de mamífero o mais comummente usadas para a produção à escala comercial de proteínas humanas glicosiladas tais como anticorpos. Os rendimentos obtidos a partir da produção de linhas de células de mamífero variam tipicamente de 50-250 mg/L durante cultura de 5-7 dias em um fermentador descontínuo ou 300-1000 mg/L em 7-12 dias em fermentadores semicontínuos.

[004] O vírus adenoassociado (AAV) é um vetor desejável para distribuição de genes terapêuticos devido ao seu perfil de segurança e capacidade de expressão de genes a longo prazo in vivo. Vetores de AAV recombinantes (rAAV) foram previamente usados para expressar anticorpos de cadeia única e comprimento total in vivo. Devido à capacidade de empacotamento de transgenes limitada de AAV tem sido um desafio técnico ter um sistema estritamente regulado para expressar cadeias pesadas e leves de um anticorpo usando um único vetor de AAV de modo a gerar anticorpos de comprimento total.

[005] Permanece uma necessidade na técnica de distribuição de dois anticorpos em uma única composição para uso terapêutico. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] É proporcionado aqui um vírus adenoassociado (AAV) re- combinante tendo um capsídeo de AAV que tem empacotado aí um ácido nucleico heterólogo que expressa dois anticorpos funcionais em uma célula. Em uma modalidade, o AAV recombinante contém um ORF codificando uma cadeia leve de imunoglobulina, um segundo ORF codificando uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e um terceiro ORF codificando uma segunda cadeia pesada, por meio do que os construtos de anticorpos funcionais expressos têm duas cadeias pesadas diferentes com diferentes especificidades que partilham uma cadeia leve. Em uma modalidade, os dois anticorpos com diferen- tes especificidades são coexpressos, com um terceiro anticorpo, bies- pecífico tendo as especificidades dos dois anticorpos monoespecíficos.

[007] Em uma modalidade, o rAAV compreende: uma 5’ repetição terminal invertida (ITR) de AAV; um primeiro cassete de expressão que codifica pelo menos um primeiro quadro de leitura aberta (ORF) para uma primeira imunoglobulina sob o controle de sequências de controle reguladoras que dirigem a sua expressão; um segundo cassete de expressão que compreende um segundo ORF, um ligante, e um terceiro ORF sob o controle de sequências de controle reguladoras que dirigem a sua expressão, em que o segundo e terceiro ORF codificam um segundo e terceiro construto de imunoglobulina; e uma 3’ ITR de AAV.

[008] É proporcionada uma composição farmacêutica que com preende um AAV recombinante que expressa pelo menos dois cons- trutos de anticorpos funcionais e veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, os pelo menos dois anticorpos funcionais têm diferentes especificidades. Opcionalmente é também coexpresso um anticorpo biespecífico.

[009] É proporcionada uma composição compreendendo pelo me nos dois anticorpos funcionais tendo diferentes especificidades, em que cada um dos anticorpos tem a mesma cadeia leve e uma cadeia pesada diferente. A cadeia leve é de uma fonte diferente que a cadeia pesada para um dos ou ambos os anticorpos. Em uma modalidade são expressos dois anticorpos monoespecíficos funcionais e um anticorpo bifunci- onal. Em uma modalidade, a razão de anticorpos é cerca de 25: cerca de 50: cerca de 25, homodiméricos: biespecíficos: homodiméricos.

[0010] É proporcionado um método de distribuição de dois anticor pos funcionais a um indivíduo que compreende administração de um AAV recombinante ao indivíduo.

[0011] Ainda outros aspetos e vantagens da invenção serão pronta mente aparentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura 1A é um desenho ilustrando um arranjo exemplar para um vetor expressando dois construtos de anticorpos monoespecí- ficos contendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada e uma cadeia leve, que podem ser de um anticorpo heterólogo a um dos ou ambos os anticorpos a partir dos quais a primeira e segunda cadeia pesada têm origem, e um terceiro anticorpo, biespecífico. Este arranjo utiliza um potenciador partilhado que é bidirecional e que separa um primeiro cassete de expressão e um segundo cassete de expressão. Três quadros de leitura aberta (ORF) estão ilustradas. L se refere a um ligante. pA1 se refere a um primeiro poliA e pA2 se refere a um segundo poliA. MP1 se refere a um primeiro promotor mínimo e MP2 se refere a um segundo promotor mínimo. O poliA e o MP podem ser os mesmos ou diferentes para cada cassete de expressão.

[0013] A Figura 1B é um desenho ilustrando um arranjo exemplar alternativo para um vetor expressando dois construtos de anticorpos contendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada e uma cadeia leve, que podem ser de um anticorpo heterólogo a um dos ou ambos os anticorpos a partir dos quais a primeira e segunda cadeia pesada têm origem, e um terceiro anticorpo, biespecífico. Este arranjo utiliza um poliA partilhado. E1 se refere a um primeiro potenciador e E2 se refere a um segundo potenciador. Estes podem ser os mesmos ou diferentes potenciadores para cada um dos cassetes de expressão. Similarmente, MP1 e MP2 podem ser os mesmos ou diferentes.

[0014] A Figura 2 ilustra uma molécula de ácido nucleico transpor tada por um plasmídeo para empacotamento em um capsídeo de AAV, que é usada para coexpressão de uma cadela pesada anti-TSG 101, cadeia pesada de gripe FI6, e cadeia leve de FI6. Estas cadeias de anticorpos utilizam líder heterólogo de interleucina 2 (IL2). O potenciador de CMV de humano foi usado em conjunção com promotores de CMV. O cassete de expressão bicistrônico contém um local de reconhecimento de furina e uma sequência ligante 2A separando o ORF contendo as regiões VL e CL de FI6 do ORF contendo a cadeia pesada de FI6. O poliA para o cassete de expressão à direita é um poliA de timi- dina cinase encurtado. O poliA para o cassete de expressão à esquerda é uma sequência de poliA sintética.

[0015] A Figura 3 ilustra a capacidade de ligação de um anticorpo FI6v3k2 coexpresso com um anticorpo C05 de um AAV8 recombinante preparado como descrito aqui. Os resultados demonstram a ligação esperada a HA de comprimento total e o tronco de HA característico de FI6 e ligação a HA e somente cabeça de HA (nenhum tronco) característica de C05.

[0016] As FIGURAS 4A-4B ilustram a capacidade de ligação de um anticorpo FI6v3k2 coexpresso com um anticorpo 1A6 (anti-TSG 101) de um AAV8 recombinante como descrito aqui. A Figura 4A é um gráfico de barras mostrando que a ligação à proteína A captura o anticorpo monoclonal total na mistura (o controle negativo é representado pela barra à esquerda, a mistura de anticorpos pela barra à direita). A Figura 4B é um gráfico mostrando que a ligação ao peptídeo TSG101 captura somente o MAB contendo cadeia pesada de 1A6 (linha superior). Estes dados demonstram que, quando coexpresso com FI6v3k2, o anticorpo 1A6 reteve a especificidade de ligação do anticorpo a partir do qual as suas cadeias pesadas tiveram origem.

[0017] A Figura 5 ilustra níveis de expressão sistêmica em camun dongos a quem foi administrado FI6 coexpresso a partir de um vetor de AAV com um anticorpo secundário a doses de 1 x 1011 cópias de genoma (GC) ou 1 x 1010 GC.

[0018] As FIGURAS 6A-6B ilustram a avaliação do mAb AAV9.BiD.FI6v3_CR8033 distribuído intramuscularmente (IM) a 1 x 1011 GC para proteção contra desafio com estirpe da gripe PR8. A Fi- gura 6A é um gráfico de linhas mostrando a percentagem de mudança no peso. O círculo representa o construto de AAV9 com um promotor bidirecional expressando anticorpo monoclonais FI6v3 e CR8033 sintéticos tendo a mesma cadeia leve heteróloga. O quadrado representa um controle positivo, i.e., AAV9 expressando um anticorpo único tipo FI6 também distribuído a 1 x 1011 GC, e o triângulo representa animais ingênuos. A Figura 6B mostra a sobrevivência pós-desafio.

[0019] As FIGURAS 7A-7B ilustram a avaliação do mAb AAV9.BiD.FI6v3_CR8033 distribuído intramuscularmente (IM) a 1 x 1011 GC para proteção contra desafio com estirpe da gripe B/Lee/40. A Figura 7A é um gráfico de linhas mostrando a percentagem de mudança no peso. O círculo representa o construto de AAV9 com um promotor bidirecional expressando anticorpos monoclonais FI6 e CR8033 sintéticos tendo a mesma cadeia leve heteróloga. O quadrado representa um controle positivo, i.e., AAV9 expressando um anticorpo único tipo CR8033 também distribuído a 1 x 1011 GC, e o triângulo representa animais ingênuos. A Figura 7B mostra a sobrevivência pós-desafio.

[0020] A FIG 8A é um gráfico mostrando proteína em um modelo de camundongo após administração de um AAV que expressa anticorpos monoclonais tanto FI6v3 como TCN, como expressa por peso do camundongo ao longo dos dias. A linha do topo (diamantes) representa uma dose de 25 microgramas (μg/mL) e a linha do fundo representa 0,4 μg/mL.

[0021] A FIG 8B é um gráfico mostrando proteína em um modelo de camundongo após administração de um AAV que expressa anticorpos monoclonais tanto FI6v3 como IA6, como expressa por peso do camundongo ao longo dos dias. A linha do topo (diamantes) representa uma dose de 263,2 microgramas (μg/mL) e a linha do fundo representa 36,5 μg/mL.

[0022] A FIG 8C é um gráfico mostrando proteína em um modelo de camundongo após administração de um AAV que expressa anticorpos monoclonais tanto FI6v3 como CR8033, como expressa por peso do camundongo ao longo dos dias. A linha do topo (diamantes) representa uma dose de 126,3 microgramas (μg/mL) e a linha do fundo representa 6,9 μg/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] É proporcionado um vetor que distribui pelo menos dois an ticorpos funcionais por coexpressão de duas cadeias pesadas diferentes e única cadeia leve que, quando expressas em uma célula, formam dois anticorpos funcionais com diferentes especificidades, i.e., que reconhecem diferentes antígenos (ou ligandos). Um terceiro anticorpo funcional pode ser também expresso e é biespecífico, tendo a cadeia pesada de cada um dos dois anticorpos monoespecíficos. Tipicamente, o terceiro anticorpo é expresso a um nível mais baixo do que os dois anticorpos monoespecíficos. Um vetor pode ser usado in vivo para produção eficaz de composições que utilizarão os pelo menos dois anticorpos ou uma célula hospedeira produtora de anticorpos pode ser manipulada para conter os cassetes de expressão para as duas ca-deias pesadas, diferentes e um único tipo de cadeia leve. Assim sendo, a invenção engloba também uma célula hospedeira expressando uma mistura de dois anticorpos monoespecíficos, em que cada anticorpo tem uma especificidade distinta mas contém a mesma cadeia leve, e um terceiro anticorpo que é biespecífico. Em uma modalidade desejada, o vetor é concebido para distribuir os três construtos de anticorpos diferentes em um indivíduo ao qual o vetor é administrado.

[0024] Em uma modalidade, o vetor é um AAV recombinante que tem empacotado dentro de um capsídeo de AAV uma molécula de ácido nucleico contendo sequências codificando duas cadeias pesadas diferentes e uma única cadeia leve, que, quando coexpressas, formam dois anticorpos monoespecíficos funcionais, i.e., primeiro anticorpo com uma primeira cadeia pesada e a cadeia leve e um segundo anticorpo com a segunda cadeia pesada e a cadeia leve, e um terceiro anticorpo que tem uma de cada uma das cadeias pesadas e a mesma cadeia leve para preparar um anticorpo biespecífico.

[0025] Um "anticorpo funcional" pode ser um anticorpo ou imuno- globulina que se liga a um alvo selecionado (p.ex., um antígeno em uma célula cancerígena ou um patogênio, tal como um vírus, bactéria, ou parasita) com afinidade de ligação suficiente para efetuar um resultado fisiológico desejado, que pode ser protetor (p.ex., imunização passiva) ou terapêutico.

[0026] O vetor de AAV proporcionado aqui pode conter 1, 2, ou 3 quadros de leitura aberta (ORF) para até dez domínios de imunoglobu- lina. Como usado aqui, um "domínio de imunoglobulina" se refere a um domínio de uma cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo como definido com referência a um anticorpo de comprimento total, convencional. Mais particularmente, um anticorpo de comprimento total contém um polipeptídeo de cadeia pesada (H) que contém quatro domínios: uma região variável N-terminal (VH) e três regiões contantes C- terminais (CH1, CH2 e CH3) e um polipeptídeo de cadeia leve (L) que contém dois domínios: uma região variável N-terminal (VL) e uma região constante C-terminal (CL). Uma região de Fc contém dois domínios (CH2 - CH3). Uma região de Fab pode conter um domínio constante e um variável para cada uma das cadeias pesada e leve.

[0027] Em um vetor de AAV descrito aqui, dois polipeptídeos de cadeia pesada de comprimento total podem ser expressos (4 domínios cada um) e um polipeptídeo de cadeia leve (dois domínios). Em uma modalidade desejável, os dois polipeptídeos de cadeia pesada têm diferentes especificidades, i.e., são dirigidos a diferentes alvos. Assim sendo, os vetores são úteis sozinhos ou em combinação, para expressão de misturas de anticorpos.

[0028] Como usadas aqui, "diferentes especificidades" indicam que os construtos de imunoglobulina referenciados (p.ex., um anticorpo de comprimento total, uma cadeia pesada, ou outro construto capaz de ligação a um alvo específico) se ligam a um local alvo diferente. Adequadamente, em um construto de anticorpos expressos duais, as duas especificidades não são sobrepostas e/ou não interferentes, e podem intensificar opcionalmente cada uma. Dois construtos de anticorpos (imunoglobulina) como descritos aqui conferem diferente especificidade por ligação a um local alvo diferente no mesmo patogênio ou local alvo (p.ex., uma proteína de vírus ou tumor). Tais antígenos alvo diferentes podem ser estirpes diferentes do mesmo tipo viral (p.ex., duas estirpes da gripe diferentes), ou dois antígenos diferentes (p.ex., um antiviral e anticancerígeno, dois construtos anticancerígenos diferentes, entre outros). Por exemplo, um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada pode se combinar com a cadeia leve para formar um construto de anticorpo tendo uma primeira especificidade, o segundo polipeptí- deo de cadeia pesada pode se combinar com a cadeia leve para formar um segundo construto de anticorpo tendo uma segunda especificidade, e a primeira e segunda cadeias pesadas podem se combinar com a cadeia leve para formar um anticorpo biespecífico. Os anticorpos podem ser opcionalmente ambos dirigidos a diferentes locais anti- gênicos (epítopos) em um único alvo (p.ex., diferentes locais alvo em um patogênio viral, bacteriano, fúngico ou parasita selecionado) ou para diferentes alvos. Por exemplo, as cadeias pesadas dos dois anticor-pos podem ser dirigidas para o vírus da gripe, e podem ser coexpres- sas para formar dois anticorpos monoespecíficos (p.ex., cadeias pesadas dos vírus da gripe FI6, CR8033 e C05 podem ser selecionadas) e expressas com uma cadeia leve selecionada, e um anticorpo biespecí- fico. Exemplos de anticorpos para a gripe adequados e outros constru- tos de anticorpos antipatogênios com origem aérea e um método para distribuição dos mesmos são descritos em, p.ex., WO 2012/145572A1. Os anticorpos podem ser também dirigidos para diferentes alvos (p.ex., um anticorpo antiviral, incluindo infecções virais crônicas, infecções virais associadas a cânceres, ou diferentes proteínas da superfície celular antineoplásicas ou outros alvos). Exemplos de alvos virais adequados incluem a proteína hemaglutinina da gripe ou outras proteínas virais, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do papiloma humano (HPV), vírus de Epstein-Barr, vírus da herpes humano, vírus sincicial respiratório, entre outros. Assim sendo, a invenção é particularmente bem adequada para uso em terapêuticos e profilaxia passiva para os quais são desejadas combinações de anticorpos.

[0029] O termo "imunoglobulina" é usado aqui para incluir anticor pos, e seus fragmentos funcionais. Os anticorpos podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlo- nais, anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio único cameliza- dos, anticorpos intracelulares ("intracorpos"), anticorpos recombinan- tes, anticorpo multiespecífico (biespecífico), fragmentos de anticorpo, tais como Fv, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv), tandem/bis-scFv, Fc, pFc’, scFvFc (ou scFv-Fc), Fv de dissulfeto (dsfv), anticorpos biespecíficos (bc-scFv) tais como anticorpos BiTE; anticorpos de camelídeo, anticorpos ressurgidos, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos, anticorpo de domínio único (sdAb, também conhecido como NANOBODY®), anticorpos quiméricos, anticorpos quiméricos compreendendo pelo menos uma região constante humana, e similares. "Fragmento de anticorpo" se refere a pelo menos uma porção da região variável da imunoglobulina que se liga ao seu alvo, p.ex., a célula tumoral. Em uma modalidade, a imunoglobulina é uma IgG. No entanto podem ser selecionados outros tipos de imunoglobulina. Em outra modalidade, o subtipo de IgG selecionado é uma IgG1. No entanto podem ser selecionados outros isotipos. Adicionalmente pode ser selecionado qualquer um dos alotipos de IgG1.

[0030] O termo "heterólogo" quando usado com referência a uma proteína ou um ácido nucleico indica que a proteína ou o ácido nuclei- co compreende duas ou mais sequências ou subsequências que não são encontradas na mesma relação umas em relação às outras na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente recombinantemen- te produzido, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos para preparar um novo ácido nucleico funcional. Por exemplo, em uma modalidade, o ácido nucleico tem um promotor de um gene disposto para dirigir a expressão de uma sequência de codificação de um gene diferente. Assim sendo, com referência à sequência de codificação, o promotor é heterólogo. O termo "cadeia leve heteró- loga" é uma cadeia leve contendo um domínio variável e/ou domínio constante de um anticorpo que tem uma especificidade de alvo diferente da especificidade da cadeia pesada.

[0031] Os dois ou mais ORF(s) transportadis pela molécula de ácido nucleico empacotada dentro do vetor podem ser expressos a partir de dois cassetes de expressão, um dos ou ambos os quais podem ser bicistrônicos. Porque os cassetes de expressão contêm cadeias pesadas de dois anticorpos diferentes é desejável introduzir variação de sequências entre as duas sequências de cadeia pesada para minimizar a possibilidade de recombinação homóloga. Tipicamente, existe variação suficiente entre os domínios variáveis dos dois anticorpos (VH-Ab1 e VH-Ab2). No entanto, é desejável assegurar que existe variação de sequências de codificação suficiente entre as regiões constantes do primeiro anticorpo (Ab1) e do segundo anticorpo (Ab2), o mais preferencialmente em cada uma das regiões CH1, CH2, e CH3. Por exemplo, em uma modalidade, as regiões constantes de cadeia pesada de um primeiro anticorpo podem ter a sequência de nt 1 a 705 de SEQ ID NO: 1 (que codifica os aminoácidos 1 - 233 de SEQ ID NO:2) ou uma sequência que é cerca de 95% a cerca de 99% idêntica com a mesma sem qualquer introdução de qualquer mudança nos aminoácidos. Em uma modalidade, a variação na sequência destas regiões é introduzida na forma de códons sinônimos (i.e., variações da sequência de ácidos nucleicos são introduzidas sem quaisquer mudanças ao nível dos aminoácidos). Por exemplo, a segunda cadeia pesada pode ter regiões constantes que são pelo menos 15%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 35%, divergentes (i.e., cerca de 65% a cerca de 85% idênticas) ao longo de CH1, CH2 e/ou CH3.

[0032] Logo que o alvo e imunoglobulina sejam selecionados, as sequências de codificação para a imunoglobulina selecionada (p.ex., cadeia(s) pesada(s) e/ou leve(s)) podem ser obtidas e/ou sintetizadas. Métodos para sequenciação de um ácido nucleico (p.ex., RNA e DNA) são conhecidos daqueles com perícia na técnica. Logo que a sequência de um ácido nucleico seja conhecida, o aminoácido pode ser deduzido e, subsequentemente, existem dois programas de computador com base na web e comercialmente disponíveis, bem como empresas com base em serviços que traduzem de volta as sequências de ami- noácidos em sequências de codificação de ácidos nucleicos. Ver, p.ex., backtranseq por EMBOSS, http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity (http://www.geneinfinity.org/sms/smsbacktranslation.html); Ex- Pasy (http://www.expasy.org/tools/). Em uma modalidade, as sequências de codificação de RNA e/ou cDNA são concebidas para expressão ótima em células humanas. Métodos para síntese de ácidos nu- cleicos são conhecidos daqueles com perícia na técnica e podem ser utilizados para todos os, ou porções dos, construtos de ácidos nuclei- cos descritos aqui.

[0033] Regiões de codificação com otimização de códons podem ser concebidas por vários métodos diferentes. Esta otimização pode ser realizada usando métodos que estão disponíveis online (p.ex., GeneArt,), métodos publicados, ou uma empresa que proporciona serviços de otimização de códons, p.ex., como DNA2.0 (Menlo Park, CA). Um algoritmo de otimização de códons é descrito, p.ex., no Pedido de Patente dos EUA No. WO 2015/012924, que é incorporado por referência aqui. Ver também, p.ex., Patente dos EUA No. de Publicação 2014/0032186 e Patente dos EUA No. de Publicação 2006/0136184. Adequadamente, o comprimento inteiro do quadro de leitura aberta (ORF) para o produto é modificado. No entanto, em algumas modalidades, somente um fragmento do ORF pode ser alterado. Por uso de um destes métodos se podem aplicar as frequências a qualquer dada sequência de polipeptídeos, e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região de codificação com otimização de códons que codifica o polipeptídeo.

[0034] Um número de opções está disponível para realização das mudanças reais aos códons ou para síntese das regiões de codificação com otimização de códons concebidas como descrito aqui. Tais modificações ou síntese podem ser realizadas usando manipulações biológicas moleculares padrão e de rotina bem conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica. Em uma abordagem, uma série de pares de oligonucleotídeos complementares de 80-90 nucleotídeos cada um em comprimento e abrangendo o comprimento da sequência desejada é sintetizada por métodos-padrão. Estes pares de oligonu- cleotídeos são sintetizados tal que, após emparelhamento, formem fragmentos de cadeia dupla de 80-90 pares de bases, contendo extremidades coesivas, p.ex., cada oligonucleotídeo no par é sintetizado para se prolongar 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais bases para além da região que é complementar com o outro oligonucleotídeo no par. As extremidades de cadeia única de cada par de oligonucleotídeos são concebidas para emparelhar com a extremidade de cadeia única de outro par de oligonucleotídeos. Se permite que os pares de oligo- nucleotídeos emparelhem, e se permite que aproximadamente cinco a seis destes fragmentos de cadeia dupla emparelhem em conjunto através das extremidades de cadeia única coesivas, e depois são ligados em conjunto e clonados em um vetor de clonagem bacteriano padrão, por exemplo, um vetor TOPO® disponível da Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif. O construto é depois sequenciado por métodos padrão. São preparados vários destes construtos consistindo em 5 a 6 fragmentos de 80 a 90 fragmentos de pares de bases ligados em conjunto, i.e., fragmentos de cerca de 500 pares de bases, tal que a sequência desejada inteira seja representada em uma série de construtos de plasmídeo. As inserções destes plasmídeos são depois cortadas com enzimas de restrição apropriadas e ligadas em conjunto para formar o construto final. O construto final é depois clonado em um vetor de clonagem bacteriano padrão, e sequenciado. Métodos adicionais seriam imediatamente aparentes ao especialista perito. Adicionalmente, a síntese de genes está prontamente disponível comercialmente.

[0035] Opcionalmente, podem ser introduzidas substituições de aminoácidos em uma região constante de cadeia pesada de modo a aumentar a diversidade de sequências entre as duas cadeias pesadas de anticorpo e/ou para outro propósito. Métodos e programas de computador para preparação de tais alinhamentos estão disponíveis e são bem conhecidos daqueles com perícia na técnica. As substituições podem ser também escritas como: (aminoácido identificado por código de letra única)-# da posição-(aminoácido identificado por código de letra única) onde o primeiro aminoácido é o aminoácido substituído e o segundo aminoácido é o aminoácido substituinte na posição especificada. Os termos "substituição" e "substituição de um aminoácido" e "substituição de aminoácidos" como usados aqui se referem a uma substituição de um aminoácido em uma sequência de aminoácidos por outro, em que este último é diferente do aminoácido substituído. Métodos para substituição de um aminoácido são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, mutações da sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos. Métodos de realização de substituições de aminoácidos em IgG são descritos, p.ex., para WO 2013/046704, que é incorporada por referência quanto à sua discussão de técnicas de modificação de aminoácidos.

[0036] O termo "substituição de aminoácidos" e seus sinônimos descritos acima se destinam a englobar modificação de uma sequência de aminoácidos por substituição de um aminoácido por outro, ami- noácido substituinte. A substituição pode ser uma substituição conser- vativa. O termo conservativo, quando se refere a dois aminoácidos, se destina a significar que os aminoácidos partilham uma propriedade comum reconhecida por um com perícia na técnica. O termo não con- servativo, quando se refere a dois aminoácidos, se destina a significar que os aminoácidos têm diferenças em pelo menos uma propriedade reconhecida por um com perícia na técnica. Por exemplo, tais propriedades podem incluir aminoácidos tendo cadeias laterais não ácidas hi- drofóbicas, aminoácidos tendo cadeias laterais hidrofóbicas (que podem ser adicionalmente diferenciadas como ácidas ou não ácidas), aminoácidos tendo cadeias laterais hidrofóbicas alifáticas, aminoácidos tendo cadeias laterais hidrofóbicas aromáticas, aminoácidos com cadeias laterais neutras polares, aminoácidos com cadeias laterais eletricamente carregadas, aminoácidos com cadeias laterais ácidas eletricamente carregadas, e aminoácidos com cadeias laterais básicas eletricamente carregadas. Aminoácidos tanto ocorrendo naturalmente como não ocorrendo naturalmente são conhecidos na técnica e podem ser usados como aminoácidos substituintes em modalidades. Assim sendo, uma substituição de aminoácidos conservativa pode envolver mudança de um primeiro aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofó- bica por um aminoácido diferente tendo uma cadeia lateral hidrofóbica; ao passo que uma substituição de aminoácidos não conservativa pode envolver mudança de um primeiro aminoácido com uma cadeia lateral hidrofóbica ácida por um aminoácido diferente tendo uma cadeia lateral diferente, p.ex., uma cadeia lateral hidrofóbica básica ou uma cadeia lateral hidrofílica. Ainda outras mudanças conservativas ou não conservativas podem ser determinadas por um com perícia na técnica. Em ainda outras modalidades, a substituição em uma dada posição será em um aminoácido, ou um de um grupo de aminoácidos, que será aparente a um com perícia na técnica de modo a se alcançar um objetivo identificado aqui.

[0037] De modo a se expressar um domínio de imunoglobulina se lecionado pode ser concebida uma molécula de ácido nucleico que contém códons que foram selecionados quanto a expressão ótima dos poli- peptídeos de imunoglobulina em uma espécie de mamíferos selecionada, p.ex., seres humanos. Adicionalmente, a molécula de ácido nucleico pode incluir uma sequência líder heteróloga para cada cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo selecionado, que codifica o peptídeo líder de sinal de IL-2 de tipo selvagem ou mutado a montante dos polipeptídeos pesados e leves compostos pelas regiões variáveis e constantes. No entanto, outra sequência líder heteróloga pode ser substituída por um dos ou ambos os peptídeos de sinal de IL-2. Os peptídeos de sinal/líder podem ser os mesmos ou diferentes para cada um dos construtos de imunoglobulina de cadeia pesada e cadeia leve. Estes podem ser sequências de sinal que são nativamente encontradas em uma imunoglo- bulina (p.ex., IgG), ou podem ser de uma fonte heteróloga. Tais fontes heterólogas podem ser uma citocina (p.ex., IL-2, IL12, IL18, ou similares), insulina, albumina, β-glucuronidase, protease alcalina ou os peptí- deos de sinal secretores da fibronectina, entre outros.

[0038] Como usado aqui, um "cassete de expressão" se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende pelo menos um primeiro quadro de leitura aberta (ORF) e opcionalmente um segundo ORF. Um ORF pode conter dois, três, ou quatro domínios de anticorpos. Por exemplo, o ORF pode conter uma cadeia pesada de comprimento total. Alternativamente, um ORF pode conter um ou dois domínios de anticorpos. Por exemplo, o ORF pode conter um domínio variável de cadeia pesada e um único domínio constante de cadeia pesada. Em outro exemplo, o ORF pode conter uma região variável de cadeia leve e uma constante de cadeia leve. Assim sendo, um cassete de expressão pode ser concebido para ser bicistrônico, i.e., para conter sequências reguladoras que dirigem a expressão dos ORFs aí a partir de sequências reguladoras partilhadas. Em este caso, os dois ORFs são tipicamente separados por um ligante. Ligantes adequados, tais como um local de ligação interna de ribozima (IRES) e/ou um li- gante de peptídeo autoclivante de furina-2a (F2a), [ver, p.ex., Radcliffe e Mitrophanous, Gene Therapy (2004), 11, 1673-1674] são conhecidos na técnica. Adequadamente, os ORF são operacionalmente ligados a sequências de controle reguladoras que dirigem a expressão em uma célula alvo. Tais sequências de controle reguladoras podem incluir um poliA, um promotor, e um potenciador. De modo a facilitar a coexpres- são a partir de um vetor de AAV, pelo menos uma da sequência do po- tenciador e/ou poliA pode ser partilhada pelos primeiro e segundo cassetes de expressão.

[0039] Em uma modalidade, o rAAV tem empacotado dentro da capsida de AAV selecionada uma molécula de ácido nucleico compreendendo: uma 5’ ITR, um primeiro cassete de expressão, um potenci- ador bidirecional, e um segundo cassete de expressão, onde o poten- ciador separa os primeiro e segundo cassetes de expressão, e uma 3’ ITR. A Figura 1A é proporcionada aqui como um exemplo desta moda- lidade. Por exemplo, em uma tal modalidade, um primeiro promotor para um primeiro cassete de expressão está localizado à esquerda do potenciador bidirecional, seguido por pelo menos um quadro de leitura aberta, e uma sequência de poliA, e um segundo promotor. Adicionalmente, um segundo promotor para o segundo cassete de expressão está localizado à direta do potenciador bidirecional, seguido por pelo menos um segundo quadro de leitura aberta e um poliA. Os primeiro e segundo promotores e as primeira e segunda sequências de poliA podem ser os mesmos ou diferentes. Um promotor mínimo e/ou uma poliA mínima podem ser selecionados de modo a conservar espaço. Tipicamente, em esta modalidade, cada promotor está localizado adjacente (à esquerda ou à direita (ou 5’ ou 3’)) à sequência do potenciador e as sequências de poliA estão localizadas adjacentes às ITRs, com os ORFs entre elas. Embora a Figura 1A seja ilustrativa, a ordem dos ORFs pode ser variada, como o pode os domínios de imunoglobulina codificados por elas. Por exemplo, as sequências constantes e variáveis de cadeia leve podem estar localizadas à esquerda do potencia- dor e as duas cadeias pesadas podem ser codificadas por ORFs localizados à direita do potenciador. Alternativamente, uma das cadeias pesadas pode estar localizada à esquerda do potenciador e os ORFs à direita do potenciador por codificar uma segunda cadeia pesada e uma cadeia leve. Alternativamente, a configuração oposta é possível, e o cassete de expressão à esquerda do potenciador pode ser bicistrôni- co. Alternativamente, dependendo de quais os domínios são codificados, ambos os cassetes de expressão podem ser monocistrônicos (p.ex., codificando duas imunoadesinas), ou ambos podem ser bicis- trônicos (p.ex., codificando dois FABs completos).

[0040] Em outra modalidade, o rAAV tem empacotado dentro da capsida de AAV selecionada uma molécula de ácido nucleico compreendendo: uma 5’ ITR, um primeiro cassete de expressão, uma poliA que funciona bidireccionalmente, e um segundo cassete de expressão, onde o poliA bidirecional separa e funciona para ambos os primeiro e segundo cassetes de expressão, e uma 3’ ITR. A Figura 1B é proporcionada aqui como um exemplo desta modalidade. Em esta modalidade, um primeiro potenciador e um primeiro promotor (ou combinação potenciador/promotor) estão localizados à direita da 5' ITR, seguidos pelo(s) ORF(s) e o poliA bidirecional. O segundo cassete de expressão é separado do primeiro cassete de expressão pela poliA bidirecional e é transcrito na direção oposta. Em este cassete de expressão, o po- tenciador e promotor (ou combinação promotor/potenciador) estão localizados adjacentes a 3' ITR e o(s) ORF(s) são adjacentes ao poliA bidirecional. Embora a Figura 1B seja ilustrativa, a ordem dos ORFs pode ser variada, como o pode os domínios de imunoglobulina codificados por elas. Por exemplo, as sequências constantes e variáveis de cadeia leve podem estar localizadas à esquerda do poliA e as duas cadeias pesadas podem ser codificadas por ORF(s) localizado(s) à direita do poliA. Alternativamente, uma das cadeias pesadas pode estar localizada à esquerda do poliA e os ORFs à direita do poliA codificam uma segunda cadeia pesada e uma cadeia leve. Alternativamente, a configuração oposta é possível, e o cassete de expressão à esquerda da poliA pode ser bicistrônico. Alternativamente, dependendo de quais os domínios são codificados, ambos os cassetes de expressão podem ser monocistrônicos (p.ex., codificando duas imunoadesinas), ou ambos podem ser bicistrônicos.

[0041] Opcionalmente, a configuração de expressão exemplificada nas FIGS 1A e 1B e descrita aqui pode ser usada para coexpressar outros construtos de imunoglobulina. Por exemplo, duas imunoadesi- nas (IA) podem ser expressas a partir de dois cassetes de expressão monocistrônicos. Uma imunoadesina inclui uma forma de anticorpo que é expressa como único quadro de leitura aberta contendo uma unidade de fragmento variável de cadeia única (scFv) (i.e., VH ligada a VL ou VL ligada a VH) fundido com um domínio de Fc (CH2-CH3), (p.ex., VH-VL-CH2-CH3 ou VL-VH-CH2-CH3). Alternativamente, até quatro scFvs poderiam ser expressos a partir de dois cassetes de expressão bicistrônicos. Em outra alternativa, uma IA pode ser coexpres- sa com um anticorpo de comprimento total. Em outra alternativa, um FABS completo pode ser coexpresso com um anticorpo de comprimento total ou dois FABs completos podem ser coexpressos. Em ainda outra modalidade, outras combinações de anticorpo de comprimento total, IA, ou fragmento FAB podem ser coexpressas.

[0042] Sequências de controle reguladoras adequadas podem ser selecionadas e obtidas a partir de uma variedade de fontes. Em uma modalidade, um promotor mínimo e/ou uma poliA mínima podem ser utilizados para conservar o tamanho.

[0043] Como usado aqui, o termo "promotor mínimo" significa uma curta sequência de DNA compreendida por uma caixa TATA e outras sequências que servem para especificar o local de início da transcrição, à qual elementos reguladores são adicionados para controle da expressão. Em uma modalidade, um promotor se refere a uma sequência de nucleotídeos que inclui um promotor mínimo mais elementos reguladores que são capazes de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Este tipo de sequência do promotor consiste em elementos próximos e a montante mais distantes, estes últimos elementos frequentemente referidos como potencia- dores. Em uma modalidade, o promotor mínimo é um promotor mínimo do Citomegalovírus (CMV). Em outra modalidade, o promotor mínimo é derivado de CMV de humano (hCMV) tal como o promotor mínimo derivado do promotor inicial imediato de hCMV (ver, US 20140127749, e Gossen e Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5547-5551), que são incorporados aqui por referência). Em outra modalidade, o promotor mínimo é derivado de uma fonte viral tal como, por exemplo: promotores iniciais ou tardios de SV40, promotores iniciais imediatos de citomegalovírus (CMV), ou promotores iniciais de Vírus de Sarcoma de Rous (RSV); ou de promotores de células eucarióticas, por exemplo, promotora da beta actina (Ng, Nuc. Acid Res. 17: 601-615, 1989; Quitsche et al., J. Biol. Chem. 264: 9539-9545, 1989), promotor de GADPH (Alexander, M. C. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 50925096, 1988, Ercolani, L. et al., J. Biol. Chem. 263: 15335-15341, 1988), promotor de TK-1 (timidina cinase), promotores de HSP (proteína de choque térmico), promotor de UbB ou UbC, PGK, promotor de Ef1-alfa ou qualquer promotor eucariótico contendo uma caixa TATA (Pedido Publicado dos EUA No. 2014/0094392). Em outra modalidade, o promotor mínimo inclui um minipromotor, tal como o minipromotor de CLDN5 descrito no Pedido Publicado dos EUA No. 2014/0065666. Em outra modalidade, o promotor mínimo é o promotor de Timidina Cinase (TK). Em uma modalidade, o promotor mínimo é específico quanto aos tecidos, tal como um dos promotores específicos quanto a células do músculo: promotor mínimo de TnISlow, um promotor mínimo de TnI- Fast ou um promotor da creatina cinase do músculo (Pedido Publicado dos EUA No. 2012/0282695). Cada um destes documentos é incorporado aqui por referência.

[0044] Em uma modalidade, o sinal de poliadenilação (poli(A)) é um sinal de poli(A) mínimo, i.e., a sequência mínima requerida para poliadenilação eficaz. Em uma modalidade, o poli(A) mínimo é um po- li(A) mínimo, tal como aquele descrito em Levitt et al., Genes Dev., jul de 1989, 3 (7): 1019-25; e Xia et al., Nat Biotechnol. Out de 2002; 20 (10): 1006-10. Epub 16 de set de 2002. Em outra modalidade, o poli(A) é derivado do poli(A) de beta-globina de coelho. Em uma modalidade, o poliA atua bidirecionalmente (An et al., 2006, PNAS, 103 (49): 18662-18667). Em uma modalidade, o poli(A) é derivado da sequên- cia de sinal de poliA inicial de SV40. Cada um destes documentos é incorporado aqui por referência.

[0045] Como descrito aqui, em uma modalidade, um único poten- ciador, ou o mesmo potenciador, pode regular a transcrição de múltiplos genes heterólogos no construto de plasmídeo. Vários potenciado- res adequados para uso na invenção são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, o potenciador inicial de CMV, potenciador de Hoxc8, nPE1 e nPE2. Intensificadores adicionais úteis aqui são descritos em Andersson et al., Nature, março de 2014, 507 (7493): 455-61, que é incorporado aqui por referência. Ainda outros elementos poten- ciadores podem incluir, p.ex., um potenciador de apolipoproteína, um potenciador de peixe-zebra, um elemento potenciador de GFAP, e po- tenciadores específicos quanto a tecidos tal como descrito no WO 2013/1555222, elemento regulador pós-transcricional pós-hepatite da marmota. Adicionalmente, ou alternativamente, outros, p.ex., o promotor inicial imediato (IE)-PDGR do citomegalovírus de humano (HCMV) ou outros elementos promotores - potenciadores podem ser selecionados. Para intensificar a expressão, os outros elementos podem ser ín- trons (como íntron promega ou íntron quimérico de globina de galinha- imunoglobulina de humano). Outros promotores e potenciadores úteis aqui podem ser encontrados na Base de Dados Mammalian Promo- ter/Enhancer encontrada em http://promoter.cdb.riken.jp/.

[0046] Os construtos descritos aqui podem adicionalmente conter outras sequências de controle da expressão ou reguladoras tais como, p.ex., incluindo sequências de início da transcrição, terminação, promotoras e potenciadoras apropriadas; sinais de processamento de RNA eficazes tais como processamento e sinais de poliadenilação (poliA); sequências que estabilizam mRNA citoplasmático; sequências que intensificam a eficácia de tradução (i.e., sequência de consenso de Kozak); sequências que intensificam a estabilidade das proteínas; e, quando desejado, sequências que intensificam a secreção do produto codificado. Um promotor pode ser selecionado de entre um promotor constitutivo, um promotor específico quanto aos tecidos, um promotor específico quanto às células, um promotor responsivo a indicações fisiológicas, ou um promotor regulável [ver, p.ex., WO 2011/126868 e WO 2013/049492].

[0047] Estas sequências de controle estão "operacionalmente li gadas" às sequências de gene do construto de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo "operacionalmente ligado" se refere tanto a sequências de controle da expressão que são contíguas com o gene de interesse como as sequências de controle da expressão que atua em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.

[0048] Exemplos de promotores constitutivos adequados para con trole da expressão dos domínios de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, β-actina de galinha (CB) ou promotores de beta actina de outras espécies, promotor de citomegalovírus (CMV) de humano, os promotores iniciais e tardios do vírus símio 40 (SV40), promotor de U6, promotores de metalotioneína, promotor de EFlα, promotor de ubiquiti- na, promotor de hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT), promotor de diidrofolato reductase (DHFR) (Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630 (1991)), promotor de adenosina deaminase, promotor de fosfoglicerol cinase (PGK), promotor de piruvato cinase, promotor de fosfoglicerol mutase, o promotor de β-actina (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989)), UbB, UbC, as repetições terminais longas (LTR) do Vírus da Leucemia de Moloney e outros retrovírus, o promotor de timidina cinase do Vírus da Herpes Simplex e outros promotores constitutivos conhecidos daqueles com perícia na técnica. Exemplos de promotores específicos quanto a tecidos ou células adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, endotelina-I (ET-I) e Flt-I, que são específi- cos quanto a células endoteliais, FoxJ1 (que visa células ciliadas).

[0049] Promotores induzíveis adequados para controle da expres são dos domínios de anticorpo incluem promotores responsivos a agentes exógenos (p.ex., agentes farmacológicos) ou a indicações fisiológicas. Estes elementos de resposta incluem, mas não estão limitados a, elemento de resposta à hipóxia (HRE) que se liga a HIF-Iα e β, um elemento de resposta a íons de metal tal como descrito em Mayo et al. (1982, Cell 29: 99-108); Brinster et al. (1982, Nature 296: 3942) e Searle et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1480-1489); ou um elemento de resposta ao choque térmico tal como descrito por Nouer et al. (em: Heat Shock Response, ed. Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., pp 167-220, 1991)

[0050] Em uma modalidade, a expressão de um quadro de leitura aberta é controlada por um promotor regulável que proporciona controle estrito sobre a transcrição do ORF (gene), p.ex., um agente farmacológico, ou fatores de transcrição ativados por um agente farmacológico ou, em modalidades alternativas, indicações fisiológicas. Exemplos de promotores reguláveis que são complexos de fatores de transcrição dependentes de ligandos que podem ser usados incluem, sem limitação, membros da superfamília de receptores nucleares ativada pelos seus respectivos ligandos (p.ex., glucocorticoide, estrogênio, progestina, reti- noide, ecdisona, e seus análogos e miméticos) e rTTA ativada pela te- traciclina. Exemplos de tais sistemas incluem, sem limitação, a Tecnologia Transcricional ARGENT™ (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, Mass.). Exemplos de tais sistemas promotores são descritos, p.ex., no WO 2012/145572, que é incorporada por referência aqui.

[0051] Ainda outros promotores podem incluir, p.ex., potencia- dor/promotor imediato-inicial de citomegalovírus (CMV) de humano, o potenciador/promotor inicial de SV40, o promotor de polimovírus JC, promotores da proteína básica da mielina (MBP) ou proteína ácida fi- brilar glial (GFAP), promotor associado à latência (LAP) do vírus da herpes simplex (HSV-1), promotor da repetição terminal longa (LTR) do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor específico quanto aos neurônios (NSE), promotor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), hSYN, promotor do hormônio de concentração da me- lanina (MCH), CBA, promotor da proteína ácida fibrilar glial (GFAP), promotor de metaloproteína da matriz (MPP), e o promotor da beta- actina da galinha. Os promotores podem ser os mesmos ou diferentes para cada cassete de expressão.

[0052] Para uso na produção de um vetor viral de AAV (p.ex., um AAV recombinante (r)), os cassetes de expressão podem ser transportados em qualquer vetor adequado, p.ex., um plasmídeo, que é distribuído a uma célula hospedeira de empacotamento. Os plasmídeos úteis em esta invenção podem ser manipulados tal que sejam adequados para replicação e empacotamento em células procarióticas, células de mamífero, ou ambas. Técnicas de transfecção e células hospedeiras de empacotamento adequadas são conhecidas e/ou podem ser prontamente concebidas por um com perícia na técnica.

[0053] Métodos para geração e isolamento de AAVs adequados para uso como vetores são conhecidos na técnica. Ver geralmente, p.ex., Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications", Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology", J. Gene Med. 10: 717-733; e as referências citadas em baixo, cada uma das quais é incorporada aqui por referência na sua totalidade. Para empacotamento de um transgene em vírions, as ITRs são os únicos componentes de AAV requeridos em cis no mesmo construto que a molécula de ácido nucleico contendo os cassetes de expressão. Os genes cap e rep podem ser fornecidos em trans.

[0054] Como descrito acima, o termo "cerca de" quando usado pa ra modificar um valor numérico significa uma variação de ±10%, a não ser que de outro modo especificado.

[0055] Como usados ao longo desta especificação e das reivindi cações, os termos "compreendem" e "contêm" e suas variantes incluindo "compreende", "compreendendo", "contém" e "contendo", entre outras variantes, são inclusivos de outros componentes, elementos, números inteiros, passos e similares. O termo "consiste em" ou "consistindo em" são exclusivos de outros componentes, elementos, números inteiros, passos e similares.

[0056] Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipep- tídeos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (i.e., cerca de 70% de identidade, preferencialmente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou identidade mais elevada ao longo de uma região especificada (p.ex., qualquer um dos ORFs modificadas proporcionadas aqui quando comparada e alinhada quanto à correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designada) como medida usando um algoritmo de comparação de sequências BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros padrão descritos em baixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, p.ex., website do NCBI ou similares). Como outro exemplo, as sequências de polipeptídeos podem ser comparadas usando Fasta, um programa em GCG Versão 6.1. Fasta proporciona alinhamentos e percentagem de identidade de sequências das regiões da melhor sobreposição entre as sequências query e de pesquisa. Por exemplo, a percentagem de identidade de sequências entre sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada usando Fasta com os seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) como proporcionado em GCG Versão 6.1, aqui incorporado por referência. Geralmente, estes programas são usados com parâmetros- padrão, embora um perito na técnica possa alterar estes parâmetros como necessário. Alternativamente, um com perícia na técnica pode utilizar outro algoritmo ou programa de computador que proporcione pelo menos o nível de identidade ou alinhamento como aquele proporcionado pelos algoritmos e programas referenciados. Esta definição se refere também, ou pode ser aplicada, ao complemento de uma sequência. A definição inclui também sequências que têm deleções e/ou adições, bem como aquelas que têm substituições. Como descrito em baixo, os algoritmos preferenciais podem ter em conta intervalos e similares. Preferencialmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 150, 200 aminoácidos ou nucleotídeos em comprimento, e frequentemente ao longo de uma região que tem 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos ou nu- cleotídeos em comprimento ou ao longo do comprimento total de uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos.

[0057] Tipicamente, quando um alinhamento é preparado com base em uma sequência de aminoácidos, o alinhamento contém inserções e deleções que são tão identificadas no que diz respeito a uma sequência de AAV de referência e a numeração dos resíduos de aminoácidos é baseada em uma escala de referência proporcionada para o alinhamento. No entanto, qualquer dada sequência de AAV pode ter menos resíduos de aminoácidos do que a escala de referência. Na presente invenção, quando se discute a sequência genitora, o termo "a mesma posição" ou a "posição correspondente" se refere ao aminoácido localizado no mesmo número de resíduo em cada uma das sequências, no que diz respeito à escala de referência para as sequências alinhadas. No entanto, quando tiradas do alinhamento, cada uma das proteínas pode ter es tes aminoácidos localizados em diferentes números de resíduos. Os ali-nhamentos são realizados usando qualquer um de uma variedade de Programas de Alinhamento de Sequências Múltiplas comercialmente disponíveis. Programas de alinhamento de sequências estão disponíveis para sequências de aminoácidos, p.ex., os programas "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", e "Match-Box". Geralmente, qualquer um destes programas é usado com parâmetros padrão, embora um com perícia na técnica possa alterar estes parâmetros como necessário. Alternativamente, um com perícia na técnica pode utilizar outro algoritmo ou programa de computador que proporcione pelo menos o nível de identidade ou alinhamento como aquele proporcionado pelos algoritmos e programas referenciados. Ver, p.ex., J. D. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27 (13): 2682-2690 (1999).

[0058] Em uma modalidade, os cassetes de expressão descritos aqui são manipulados em um elemento genético (p.ex., um plasmídeo de vai-vem) que transfere as sequências de construto de imunoglobu- lina transportadas nele para uma célula hospedeira de empacotamento para produção de um vetor viral. Em uma modalidade, o elemento genético selecionado pode ser distribuído a uma célula de empacotamento de AAV por qualquer método adequado, incluindo transfecção, ele- troporação, distribuição em lipossomos, técnicas de fusão de membrana, péletes revestidos com DNA de elevada velocidade, infeção viral e fusão com protoplastos. Células de empacotamento de AAV adequadas podem ser também preparadas. Alternativamente, os cassetes de expressão podem ser usados para gerar um vetor viral sem ser AAV, ou para produção de misturas de anticorpos in vitro. Os métodos usados para preparar tais construtos são conhecidos daqueles com perícia na manipulação de ácidos nucleicos e incluem manipulação genética, manipulação recombinante, e técnicas sintéticas. Ver, p.ex., Mo lecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NI (2012). Vetores de AAV

[0059] Um vetor de AAV recombinante (partícula viral de AAV) po de compreender, empacotada dentro de um capsídeo de AAV, uma molécula de ácido nucleico contendo 5’ ITR de AAV, os cassetes de expressão descritos aqui e uma 3’ ITR de AAV. Como descrito aqui, um cassete de expressão pode conter elementos reguladores para um quadro(s) de leitura aberta dentro de cada cassete de expressão e a molécula de ácido nucleico pode conter opcionalmente elementos reguladores adicionais.

[0060] O vetor de AAV pode conter uma 5' repetição terminal in vertida (ITR) de AAV de comprimento total e uma 3’ ITR de comprimento total. Foi descrita uma versão encurtada da 5’ ITR, denominada ΔITR, na qual a sequência D e local de resolução terminal (trs) estão eliminados. A abreviatura "sc" se refere a autocomplementar. "AAV au- tocomplementar" se refere a um construto no qual uma região de codificação transportada por uma sequência de ácidos nucleicos de AAV recombinante foi concebida para formar um molde de DNA de cadeia dupla intramolecular. Após infeção, ao invés de se esperar pela síntese mediada por células da segunda cadeia, as duas metades complementares de scAAV se associarão para formar uma unidade de DNA de cadeia dupla (dsDNA) que está pronta para replicação e transcrição imediatas. Ver, p.ex., D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (agosto de 2001), Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254. AAVs autocomplemen- tares são descritos em, p.ex., Patentes dos E.U.A. Nos. 6,596,535; 7,125,717; e 7,456,683, cada uma das quais é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

[0061] Onde é para ser produzido um AAV pseudotipado, as ITRs são selecionadas de uma fonte que difere da fonte de AAV da capsida. Por exemplo, as ITRs de AAV2 pode ser selecionadas para uso com um capsídeo de AAV tendo uma eficácia particular para um receptor celular, tecido alvo ou alvo viral selecionado. Em uma modalidade, as sequências de ITR de AAV2, ou a sua versão eliminada (ΔITR), são usadas por conveniência e para acelerar a aprovação reguladora. No entanto podem ser selecionadas ITRs de outras fontes de AAV. Onde a fonte das ITRs é de AAV2 e a capsida de AAV é de outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado. No entanto podem ser utilizadas outras fontes de ITRs de AAV.

[0062] Uma variedade de capsidas de AAV foi descrita. Métodos de geração de vetores de AAV foram descritos extensivamente na literatura e documentos de patente, incluindo, p.ex., WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2. A fonte de cap- sidas de AAV pode ser selecionada de um AAV que vise um tecido desejado. Por exemplo, AAV adequados podem incluir, p.ex., AAV9 [US 7,906,111; US 2011-0236353-A1], rh10 [WO 2003/042397] e/ou hu37 [ver, p.ex., US 7,906,111; US 2011-0236353-A1]. No entanto, outros AAV, incluindo, p.ex., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, [Patente dos EUA 7790449; Patente dos EUA 7282199] e outros. No entanto, outras fontes de capsidas de AAV e outros elementos virais podem ser selecionados, como podem ser outros construtos de imunoglobulina e outros elementos do vetor.

[0063] É proporcionado um vetor viral de AAV de cadeia única. Métodos para geração e isolamento de vetores virais de AAV adequados para distribuição a um indivíduo são conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Patente dos EUA 7790449; Patente dos EUA 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; e US 7588772 B2. Em um sistema, uma linha de células produtoras é transientemente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITRs e um construto(s) que codifica rep e cap. Em um segundo sistema, uma linha de células de empacotamento que fornece estavel- mente rep e cap é transientemente transfectada com o construto codificando o transgenes flanqueado por ITRs. Em cada um destes sistemas, são produzidos vírions de AAV em resposta à infeção com ade- novírus ajudantes ou herpesvírus, requerendo a separação dos rAAVs dos vírus contaminantes. Mais recentemente foram desenvolvidos sistemas que não requerem infeção com vírus ajudantes para recuperar o AAV - as funções ajudantes requeridas (i.e., adenovirus E1, E2a, VA, e E4 ou herpesvírus UL5, UL8, UL52, e UL29, e polimerase de her- pesvírus) são também fornecidas, in trans, pelo sistema. Em estes sistemas mais novos, as funções ajudantes podem ser fornecidas por transfecção transiente das células com construtos que codificam as funções ajudantes requeridas, ou as células podem ser manipuladas para conter estavelmente genes codificando as funções ajudantes, a expressão dos quais pode ser controlada ao nível transcricional ou pós-transcricional. Em ainda outro sistema, o transgenes flanqueado por ITRs e genes rep/cap são introduzidos em células de inseto por infeção com vetores à base de baculovírus. Para revisões sobre estes sistemas de produção ver geralmente, p.ex., Zhang et al., 2009, "Ade- novirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production", Human Gene Therapy 20: 922929, os conteúdos de cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Métodos de preparação e uso destes e outros sistemas de produção de AAV são também descritos nas seguintes patentes dos E.U.A., os conteúdos das quais são incorporados aqui por referência na sua totalidade: 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; e 7,439,065.

USOS e REGIMES

[0064] O rAAV, preferencialmente suspenso em um veículo fisiologi- camente compatível, pode ser administrado a um paciente humano ou mamífero não humano. Transportadores adequados podem ser prontamente selecionados por um com perícia na técnica tendo em vista a indicação para a qual o vírus de transferência é dirigido. Por exemplo, um veículo adequado inclui salino, que pode ser formulado com uma variedade de soluções de tamponamento (p.ex., salino tamponado com fosfato). Outros veículos exemplares incluem salino estéril, lactose, sacarose, maltose, e água. A seleção do veículo não é uma limitação da presente invenção. Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, adicionalmente ao rAAV e veículo(s), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes, ou estabilizantes químicos.

[0065] Métodos para uso destes rAAV, p.ex., para imunização passiva são descritos, p.ex., no WO 2012/145572. Outros métodos de distribuição e usos serão aparentes a um com perícia na técnica. Por exemplo, um regime como descrito aqui pode compreender, adicionalmente a uma ou mais das combinações descritas aqui, combinação adicional com um ou mais de um fármaco biológico, um agente quimio- terapêutico, potenciadores imunes, radiação, cirurgia, e similares. Um fármaco biológico como descrito aqui é baseado em um peptídeo, poli- peptídeo, proteína, enzima, molécula de ácido nucleico, vetor (incluindo vetores virais), ou similares.

[0066] Em uma terapia de combinação, o construto de imunoglo- bulina distribuído por AAV descrito aqui é administrado antes do, durante o, ou após o início da terapia com outro agente, bem como qualquer sua combinação, i.e., antes do e durante o, antes do e após o, durante e após o, ou antes do, durante o e após o início da terapia. Por exemplo, o AAV pode ser administrado entre 1 e 30 dias, preferencialmente 3 e 20 dias, mais preferencialmente entre 5 e 12 dias antes do início da terapia de radiação. Em outra modalidade da invenção é administrada quimioterapia concorrentemente com a ou, mais preferencialmente, subsequente à terapia de imunoglobulina (anticorpo) mediada por AAV. Em ainda outras modalidades, as composições da invenção podem ser combinadas com outros biológicos, p.ex., fármacos de anticorpos monoclonais recombinantes, conjugados anticorpo-fármaco, ou similares. Adicionalmente, combinações de diferentes construtos de imunoglobulina distribuídos por AAV tais como são discutidos acima podem ser usadas em tais regimes.

[0067] Pode ser usado qualquer método ou via adequado para administrar composições contendo AAV como descritas aqui, e, opcio-nalmente, para coadministrar outros fármacos ativos ou terapias em conjunção com os anticorpos mediados por AAV descritos aqui. As vias de administração incluem, por exemplo, administração sistêmica, oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular.

[0068] Os alvos para os construtos de imunoglobulina descritos aqui podem ser selecionados de uma variedade de patogênios, incluindo, p.ex., agentes infeciosos bacterianos, virais, fúngicos e parasíti- cos. Os alvos adequados podem adicionalmente incluir antígenos cancerígenos ou associados ao câncer, ou similares. Outros alvos ainda podem incluir uma condição autoimune tal como artrite reumatoide (RA) ou esclerose múltipla (MS).

[0069] Exemplos de alvos virais incluem vírus da gripe da família Orthomyxoviridae, que inclui: Gripe A, Gripe B, e Gripe C. Os vírus do Tipo A são os patogênios humanos mais virulentos. Os serotipos da gripe A que foram associados a pandemias incluem H1N1, que causou a Gripe Espanhola em 1918, e Gripe Suína em 2009; H2N2, que causou a Gripe Asiática em 1957; H3N2, que causou a Gripe de Hong Kong em 1968; H5N1, que causou a Gripe Aviária em 2004; H7N7; H1N2; H9N2; H7N2; H7N3; e H10N7.

[0070] Anticorpos amplamente neutralizantes contra a gripe A fo ram descritos. Como usado aqui, um "anticorpo amplamente neutrali- zante" se refere a um anticorpo neutralizante que consegue neutralizar múltiplas estirpes de múltiplos subtipos. Por exemplo, CR6261 [The Scripps Institute/Crucell] foi descrito como um anticorpo monoclonal que se liga a uma ampla gama de vírus da gripe incluindo a "gripe espanhola" de 1918 (SC1918/H1) e a um vírus da classe H5N1 da gripe aviária que saltou das galinhas para um humano no Vietnã em 2004 (Viet04/H5). CR6261 reconhece uma região helicoidal altamente conservada no tronco próximo da membrana da hemaglutinina, a proteína predominante na superfície do vírus da gripe. Este anticorpo é descrito em WO 2010/130636, incorporada por referência aqui. Outro anticorpo neutralizante, F10 [XOMA Ltd], foi descrito como sendo útil contra H1N1 e H5N1. [Sui et al., Nature Structural and Molecular Biology (Sui, et al. 2009, 16 (3): 265-73)]. Outros anticorpos contra a gripe, p.ex., Fab28 e Fab49, podem ser selecionados. Ver, p.ex., WO 2010/140114 e WO 2009/115972, que são incorporadas por referência. Ainda outros anticorpos, tais como aqueles descritos no WO 2010/010466, Patente Publicada dos EUA Publicação US/2011/076265, e WO 2008/156763, podem ser prontamente selecionados.

[0071] Outros vírus patogênicos alvo incluem arenavírus (incluindo funina, machupo, e Lassa), filovírus (incluindo Marburgo e Ébola), han- tavírus, Picornoviridae (incluindo rinovírus, ecovírus), coronavírus, pa- ramixovírus, morbilivírus, vírus sincicial respiratório, togavírus, cox- sackievírus, parvovírus B19, paragripe, adenovírus, reovírus, varíola (Varíola major (Varíola)) e Vaccínia (Varíola bovina) da família dos poxvírus, e varicela-zoster (pseudorraiva).

[0072] As febres hemorrágicas virais são causadas por membros da família dos arenavírus (febre de Lassa) (cuja família está também associada à coriomeningite linfocítica (LCM)), filovírus (vírus do Ébola), e hantavírus (puremala). Os membros dos picornavírus (uma subfamí- lia dos rinovírus) estão associados ao resfriado comum em humanos. A família dos coronavírus, que inclui um número de vírus não humanos tais como vírus da bronquite infecciosa (aves domésticas), vírus gas- troentérico transmissível porcino (porco), vírus da encefalomielite de hemaglutinina porcina (porco), vírus da perionite infecciosa felina (gato), coronavírus entérico felino (gato), coronavírus canino (cão). Os co- ronavírus respiratórios humanos foram putativamente associados ao resfriado comum, hepatite não A, B ou C, e síndrome respiratória aguda súbita (SARS). A família dos paramixovírus inclui Vírus da paragripe Tipo 1, Vírus da paragripe Tipo 3, Vírus da paragripe bovina Tipo 3, rubulavírus (vírus da papeira), Vírus da paragripe Tipo 2, vírus da paragripe Tipo 4, vírus da doença de Newcastle (galinhas), peste bovina, morbilivírus, que inclui sarampo e esgana canina, e pneumovírus, que inclui vírus sincicial respiratório (RSV). A família dos parvovírus inclui parvovírus felino (enterite felina), vírus da panleucopenia felina, parvo- vírus canino, e parvovírus porcino. A família dos adenovírus inclui vírus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causam doença respiratória.

[0073] Um construto de anticorpo neutralizante contra um patogê- nio bacteriano pode ser também selecionado para uso na presente invenção. Em uma modalidade, o construto de anticorpo neutralizante é dirigido contra a própria bactéria. Em outra modalidade, o construto de anticorpo neutralizante é dirigido contra uma toxina produzida pela bactéria. Exemplos de patogênios bacterianos transportados pelo ar incluem, p.ex., Neisseria meningitidis (meningite), Klebsiella pneumonia (pneumonia), Pseudomonas aeruginosa (pneumonia), Pseudomonas pseudomallei (pneumonia), Pseudomonas mallei (pneumonia), Acinetobacter (pneumonia), Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Alkaligenes, Cardiobacterium, Haemophilus influenzae (gripe), Hae-mophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis (tosse convulsa), Franci- sella tularensis (pneumonia/febre), Legionella pneumonia (doença dos Legionários), Chlamydia psittaci (pneumonia), Chlamydia pneumoniae (pneumonia), Mycobacterium tuberculosis (tuberculose (TB)), Mycobacterium kansasii (TB), Mycobacterium avium (pneumonia), Nocardia asteroides (pneumonia), Bacillus anthracis (antraz), Staphylococcus aureus (pneumonia), Streptococcus pyogenes (escarlatina), Streptococcus pneumoniae (pneumonia), Corynebacteria diphtheria (difteria), Mycoplasma pneumoniae (pneumonia).

[0074] O agente causador do antraz é uma toxina produzida por Bacillus anthracis. Foram descritos anticorpos neutralizantes contra o agente protetor (PA), um dos três peptídeos que formam o toxoide. Os outros dois polipeptídeos consistem em fator letal (LF) e fator de edema (EF). Foram descritos anticorpos neutralizantes anti-PA como sendo eficazes em imunização passiva contra o antraz. Ver, p.ex., Patente dos EUA número 7,442,373; R. Sawada-Hirai et al., J Immune Based Ther Vaccines. 2004; 2: 5. (online 12 de maio de 2004). Ainda outros anticorpos neutralizantes antitoxina do antraz foram descritos e/ou podem ser gerados. Similarmente, anticorpos neutralizantes contra outras bactérias e/ou toxinas bacterianas podem ser usados para gerar um construto antipatogênios distribuídos por AAV como descrito aqui.

[0075] Outras doenças infecciosas podem ser causadas por fun gos transportados pelo ar incluindo, p.ex., espécies de Aspergillus, Ab- sidia corymbifera, Rhixpus stolonifer, Mucor plumbeaus, Cryptococcus neoformans, Histoplasm capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Cocci- dioides immitis, espécies de Penicillium, Micropolyspora faeni, Ther- moactinomyces vulgaris, Alternaria alternate, espécies de Cladospo- rium, Helminthosporium, e espécies de Stachybotrys.

[0076] Adicionalmente, a imunização passiva pode ser usada para prevenir infecções fúngicas (p.ex., pé de atleta), micose, ou vírus, bactérias, parasitas, fungos, e outros patogênios que podem ser transmiti- dos por contato direto. Adicionalmente, uma variedade de condições que afetam animais de estimação, gado bovino e outro gado, e outros animais. Por exemplo, nos cães, a infeção do trato respiratório superior por aspergilose sinonasal canina causa doença significativa. Nos gatos, a doença respiratória superior ou complexo de doença respiratória felina tendo origem no nariz causa morbilidade e mortalidade se deixado não tratado. O gado bovino é propenso a infecções pela rinotra- queíte bovina infecciosa (comummente chamada IBR ou nariz vermelho) é uma doença viral contagiosa, aguda do gado bovino. Adicionalmente, o gado bovino é propenso ao Vírus Sincicial Respiratório Bovino (BRSV) que causa doença respiratória ligeira a grave e pode perturbar a resistência a outras doenças. Ainda outros patogênios e doenças serão aparentes a um com perícia na técnica. Ver, p.ex., US 5,811,524, que descreve geração de anticorpos neutralizantes antivírus sincicial respiratório (RSV). As técnicas descritas aí são aplicáveis a outros patogênios. Um tal anticorpo pode ser usado intacto ou as suas sequências modificadas (molde) modificadas para gerar um cons- truto de anticorpo neutralizante artificial ou recombinante. Tais métodos foram descritos [ver, p.ex., WO 2010/13036; WO 2009/115972; WO 2010/140114].

[0077] As imunoglobulinas antineoplásicas descritas aqui podem visar um receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER), tal como HER2. Por exemplo, trastuzumab é um anticorpo monoclonal humanizado, IgG1 kapa recombinante que se liga seletivamente com elevada afinidade em um ensaio à base de células (Kd = 5 nM) ao domínio extracelular da proteína do receptor do fator de crescimento epidérmico humano. O produto comercialmente disponível é produzido em cultura de células CHO. Ver, p.ex., http://www.drugbank.ca/drugs/DB00072. As sequências de aminoáci- dos das cadeias leves 1 e 2 e cadeias pesadas 1 e 2 do trastuzumab, bem como sequências obtidas a partir de um estudo da estrutura em raios X do trastuzumab, são proporcionadas em esta base de dados no número de acesso DB00072, cujas sequências são incorporadas aqui por referência. Ver, também, 212-Pb-TCMC-trastuzumab [Areva Med, Bethesda, MD]. Outro anticorpo de interesse inclui, p.ex., per- tuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado recombinante que visa o domínio de dimerização extracelular (Subdomínio II) da proteína 2 do receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves que têm 448 e 214 resíduos respectivamente. A FDA aprovou-o em 8 de junho, 2012. As sequências de aminoácidos da sua cadeia pesada e cadeia leve são proporcionadas, p.ex., em www.drugbank.ca/drugs/DB06366 (sinônimos incluem 2C4, MOAB 2C4, anticorpo monoclonal 2C4, e rhuMAb- 2C4) em esta base de dados no número de acesso DB06366. Adicionalmente a HER2 podem ser selecionados outros alvos de HER.

[0078] Por exemplo, MM-121/SAR256212 é um anticorpo mono clonal totalmente humano que visa o receptor de HER3 [Merrimack’s Network Biology] e que foi relatado como sendo útil no tratamento do câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer da mama e câncer dos ovários. SAR256212 é um anticorpo monoclonal totalmente humano em investigação que visa o receptor de HER3 (ErbB3) [Sanofi Oncology]. Outro anticorpo anti-Her3/EGFR é RG7597 [Genentech], descrito como sendo útil em cânceres da cabeça e pescoço. Outro anticorpo, margetuximab (ou MGAH22), um anticorpo monoclonal (mAb) otimizado quanto a Fc, de próxima geração que visa HER [MacroGenics], pode ser também utilizado.

[0079] Alternativamente podem ser visados outros marcadores da superfície de células epiteliais humanas e/ou outros receptores ou an- tígenos tumorais. Exemplos de outros alvos marcadores da superfície de células incluem, p.ex., 5T4, CA-125, CEA (p.ex., visados por labe- tuzumab), CD3, CD19, CD20 (p.ex., visados por rituximab), CD22 (p.ex., visado por epratuzumab ou veltuzumab), CD30, CD33, CD40, CD44, CD51 (também integrina αvβ3), CD133 (p.ex., células do glioblastoma), CTLA-4 (p.ex., Ipilimumab usado no tratamento de, p.ex., neuroblastoma), Receptor 2 de Quimiocina (Motivo C-X-C) (CXCR2) (expresso em diferentes regiões no cérebro; p.ex., Anticorpo anti-CXCR2 (extracelular) #ACR-012 (Alomene Labs)); EpCAM, proteína de ativação dos fibroblastos (FAP) [ver, p.ex., WO 2012020006 A2, cânceres do cérebro], receptor alfa de folato (p.ex., tumores cerebrais ependimários pediátricos, cânceres da cabeça e pescoço), receptor do fator de crescimento de fibroblastos 1 (FGFR1) (ver, et al., WO2012125124A1 para discussão de tratamento de cânceres com anticorpos anti-FGFR1), FGFR2 (ver, p.ex., anticorpos descritos em WO2013076186A e WO2011143318A2), FGFR3 (ver, p.ex., anticorpos descritos nos US8187601 e WO2010111367A1), FGFR4 (ver, p.ex., anticorpos anti-FGFR4 descritos no WO2012138975A1), fator de crescimento de hepatócitos (HGF) (ver, p.ex., anticorpos em WO2010119991A3), integrina α5β1, receptor de IGF-1, gangliosídeo GD2 (ver, p.ex., anticorpos descritos no WO2011160119A2), ganglio- sídeo GD3, glicoproteína da transmembrana NMB (GPNMB) (associa-da a gliomas, entre outros, e alvo do anticorpo glembatumumab (CR011), mucina, MUC1, fosfatidilserina (p.ex., visada por bavituxi- mab, Peregrine Pharmaceuticals, Inc], células de carcinoma prostático, PD-L1 (p.ex., nivolumab (BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), uma gG4 totalmente humana, p.ex., melanoma metastático], receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, alfa (PDGFR α) ou CD140, glicoproteína associada a tumores 72 (TAG-72), tenascina C, receptor do fator de necrose tumoral (TNF) (TRAIL-R2), fator do crescimento endotelial vascular (VEGF)-A (p.ex., visado por bevacizumab) e VEGFR2 (p.ex., visado por ramucirumab).

[0080] Outros anticorpos e seus alvos incluem, p.ex., APN301 (hu14.19-IL2), um anticorpo monoclonal [melanoma maligno e neuroblastoma em crianças, Apeiron Biologics, Viena, Áustria]. Ver, também, p.ex., anticorpo monoclonal, 8H9, que foi descrito como sendo útil para o tratamento de tumores sólidos, incluindo câncer cerebral metas- tático. O anticorpo monoclonal 8H9 é um anticorpo para IgG1 de camundongo com especificidade para o antígeno B7H3 [United Therapeutics Corporation]. Este anticorpo de camundongo pode ser humanizado. Ainda outros construtos de imunoglobulina visando o antígeno B7-H3 e/ou B7-H4 podem ser usados na invenção. Outro anticorpo é S58 (anti- GD2, neuroblastoma). Cotara™ [Peregrine Pharmaceuticals] é um anticorpo monoclonal descrito para tratamento de glioblastoma recorrente. Outros anticorpos podem incluir, p.ex., avastina, ficlatuzumab, medi- 575, e olaratumab. Ainda outros construtos de imunoglobulina ou anticorpos monoclonais podem ser selecionados para uso na invenção. Ver, p.ex., Medicines in Development Biologics, Relatório 2013, pp. 1 - 87, uma publicação do Communications & Public Affairs Department de PhRMA. (202) 835-3460, que é incorporada por referência aqui.

[0081] Por exemplo, os imunogênios podem ser selecionados de uma variedade de famílias virais. Exemplos de famílias virais contra as quais uma resposta imune seria desejável incluem a família dos picor- navírus, que inclui os gêneros rinovírus, que são responsáveis por cerca de 50% dos casos do resfriado comum; os gêneros enterovírus, que incluem poliovírus, coxsackievírus, ecovírus, e enterovírus humanos tais como vírus da hepatite A; e os gêneros aptovírus, que são responsáveis por doenças dos pés e boca, principalmente em animais não humanos. Dentro da família de vírus dos picornavírus, os antígenos alvo incluem o VP1, VP2, VP3, VP4, e VPG. Outra família viral inclui a família dos cal- civírus, que engloba o grupo Norwalk de vírus, que são um agente causador importante da gastroenterite epidémica. Ainda outra família viral desejável para uso no direcionamento de antígenos para indução de respostas imunes em humanos e animais não humanos é a família dos togavírus, que inclui os gêneros alfavírus, que inclui vírus de Sindbis, vírus do Rio de Ross, e encefalite equina venezuelana, oriental & ocidental, e rubívirus, incluindo vírus da Rubéola. A família Flaviviridae inclui vírus da dengue, febre-amarela, encefalite japonesa, encefalite de St. Louis e encefalite transmitida pela carraça. Outros antígenos alvo podem ser gerados a partir da Hepatite C ou da família dos coronavírus, que inclui um número de vírus não humanos tais como vírus da bronquite infecciosa (aves domésticas), vírus gastroentérico transmissível porcino (porco), vírus da encefalomielite hemaglutinante porcina (porco), vírus da peritonite infecciosa felina (gatos), coronavírus entérico felino (gato), coronavírus canino (cão), e coronavírus respiratórios humanos, que podem causar o resfriado comum e/ou hepatite não A, B ou C. Dentro da família dos coronavírus, os antígenos alvo incluem o E1 (também chamado M ou proteína da matriz), E2 (também chamado S ou proteína Spike), E3 (também chamado HE ou hemaglutina-elterose), glicoproteí- na (não presente em todos os coronavírus), ou N (nucleocapsida). Ainda outros antígenos podem ser visados contra a família dos rabdovírus, que inclui o gênero vesiculovírus (p.ex., Vírus da Estomatite Vesicular), e o lissavírus geral (p.ex., raiva).

[0082] Dentro da família dos rabdovírus, antígenos adequados po dem ser derivados da proteína G ou proteína N. A família Filoviridae, que inclui vírus da febre hemorrágica tais como vírus de Marburgo e Ébola, pode ser uma fonte adequada de antígenos. A família dos pa- ramixovírus inclui Vírus da paragripe Tipo 1, Vírus da paragripe Tipo 3, Vírus da paragripe bovina Tipo 3, rubulavírus (vírus da papeira), Vírus da paragripe Tipo 2, vírus da paragripe Tipo 4, vírus da doença de Newcastle (galinhas), peste bovina, morbilivírus, que inclui varicela e esgana canina, e pneumovírus, que inclui vírus sincicial respiratório. O vírus da gripe é classificado dentro da família dos ortomixovírus e é uma fonte adequada de antígeno (p.ex., a proteína HA, a proteína N1). A família dos buniavírus inclui os gêneros buniavírus (encefalite da Califórnia, La Crosse), flebovírus (Febre do Vale do Rift), hantavírus (pu- remala é um vírus da febre hemorrágica), nairovírus (doença das ovelhas de Nairobi) e vários bungavírus não atribuídos. A família dos are- navírus proporciona uma fonte de antígenos contra LCM e vírus da febre de Lassa. A família dos reovírus inclui os gêneros reovírus, rotaví- rus (que causa gastroenterite aguda em galinhas), orbivírus, e cultiví- rus (febre da Carraça do Colorado, Lebombo (humanos), encefalose equina, língua azul).

[0083] A família dos retrovírus inclui a subfamília oncorivirinal que engloba tais doenças humanas e veterinárias como vírus da leucemia felina, HTLVI e HTLVII, lentivirinal (que inclui vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da imunodeficiência humana (SIV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da anemia infecciosa equina, e espu- mavirinal). Entre os lentivírus, muitos antígenos adequados foram descritos e podem ser prontamente selecionados como alvos. Exemplos de antígenos de HIV e SIV adequados incluem, sem limitação, as proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef, e Rev, bem como vários seus fragmentos. Por exemplo, fragmentos adequados da proteína Env podem incluir qualquer uma das suas subunidades tais como gp120, gp160, gp41, ou seus fragmentos menores, p.ex., com pelo menos cerca de 8 aminoácidos em comprimento. Similarmente, fragmentos da proteína tat podem ser selecionados [Ver, Patente dos EUA 5,891,994 e Patente dos EUA 6,193,981]. Ver, também, as proteínas de HIV e SIV descritas em D. H. Barouch et al., J. Virol., 75 (5): 24622467 (março de 2001), e R. R. Amara, et al., Science, 292: 69-74 (6 de abril de 2001). Em outro exemplo, as proteínas ou peptídeos imunogê- nicos de HIV e/ou SIV podem ser usados para formar proteínas de fu- são ou outras moléculas imunogénicas. Ver, p.ex., as proteínas de fusão HIV-1 Tat e/ou Nef e regimes de imunização descritos no WO 01/54719, publicada a 2 de agosto, 2001, e WO 99/16884, publicada a 8 de abril, 1999. A invenção não está limitada às proteínas ou peptí- deos imunogénicos de HIV e/ou SIV descritos aqui. Adicionalmente, uma variedade de modificações a estas proteínas foi descrita ou poderia ser prontamente feita por um com perícia na técnica. Ver, p.ex., a proteína gag modificada que está descrita na Patente dos EUA 5,972,596.

[0084] A família dos papovavírus inclui a subfamília poliomavírus (vírus BKU e JCU) e a subfamília papilomavírus (associada a cânceres ou progressão maligna do papiloma). A família dos adenovírus inclui vírus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causam doença respiratória e/ou enterite. A família dos parvovírus parvovírus felino (enterite felina), vírus da panleucopenia felina, parvovírus canino, e parvovírus porcino. A família dos herpesvírus inclui a subfamília Alfaherpesvirinae, que engloba os gêneros simplexvírus (HSVI, HSVII), varicelovírus (pseudorraiva, varicela-zoster) e a subfamília Betaherpesvirinae, que inclui os gêneros citomegalovírus (HCMV, muromegalovírus) e a subfamília Gam- maherpesvirinae, que inclui os gêneros linfocriptovírus, EBV (linfoma de Burkitt), rinotraqueíte infecciosa, vírus da doença de Marek, e ra- dinovírus. A família dos poxvírus inclui a subfamília Chordopoxvirinae, que engloba o gênero ortopoxvírus (Varíola (Varíola) e Vaccínia (Varíola bovina)), parapoxvírus, avipoxvírus, capripoxvírus, leporipoxvírus, suipoxvírus, e a subfamília Entomopoxvirinae. A família dos hepadna- vírus inclui o vírus da Hepatite B. Um vírus não classificado que pode ser fonte adequada de antígenos é o vírus delta da Hepatite. Ainda outras fontes virais podem incluir vírus da doença bursal infecciosa aviária e vírus da síndrome respiratória e reprodutiva porcina. A família dos alfavírus inclui vírus da arterite equina e vários vírus da Encefalite.

[0085] Outros alvos patogênicos para anticorpos podem incluir, p.ex., bactérias, fungos, microrganismos parasíticos ou parasitas mul- ticelulares que infetam vertebrados humanos e não humanos, ou de uma célula cancerígena ou célula tumoral. Exemplos de patogênios bacterianos incluem cocos Gram-positivos patogênicos incluindo pneumococos; estafilococos; e estreptococos. Cocos Gram-negativos patogênios incluem meningococo; gonococo. Bacilos Gram-negativos entéricos patogênicos incluem Enterobacteriaceae; Pseudomonas, Acinetobacteria e Eikenella; Melioidosis; Salmonella; Shigella; Haemophilus; Moraxella; H. ducreyi (que causa cancroide); Brucella; Frani- sella tularensis (que causa tularemia); Yersinia (Pasteurella); Strepto- bacillus moniliformis e spirillum; Bacilos Gram-positivos incluem Listeria monocytogenes; Erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (difteria); Cólera; B. anthracis (antraz); Donovanose (granuloma inguinal); e Bartonelose. As doenças causadas por bactérias anaeróbicas patogênicas incluem tétano; botulismo; outras Clostridia; tuberculose; lepra; e outras micobactérias. Doenças espiroquetais patogênicas incluem sífilis; treponematoses: bouba, pinta e sífilis endémica; e leptospirose. Outras infecções causadas por bactérias patogênicas superiores e fungos patogênicos incluem actinomicose; nocardi- ose; criptococcose, blastomicose, histoplasmose e coccidioidomicose; candidíase, aspergilose, e mucormicose; esporotricose; paracoccidio- domicose, petrielidiose, torulopsose, micetoma e cromomicose; e der- matofitose. As infecções Rickettsiais incluem febre do Tifo, febre maculosa das Montanhas Rochosas, febre Q, e Rickettsialpox. Exemplos de infecções do micoplasma e clamídia incluem: Mycoplasma pneumoniae; Lymphogranuloma venereum; psitacose; e infecções perina- tais da clamídia. Os eucariotas patogênicos englobam protozoários e helmínteos patogênicos e infecções produzidas por eles incluem: amebíase; malária; leishmaniose; tripanossomíase; toxoplasmose; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiose; giardí- ase; triquinose; filaríase; esquistossomose; nematódeos; trematódeos ou solhas; e infecções por cestódeos (tênia).

[0086] Muitos destes organismos e/ou toxinas produzidas por eles foram identificados pelos Centers for Disease Control [(CDC), Department of Health and Human Services, EUA], como agentes que têm potencial para uso em ataques biológicos. Por exemplo, alguns destes agentes biológicos incluem Bacillus anthracis (antraz), Clostridium botulinum e sua toxina (botulismo), Yersinia pestis (praga), varíola major (varíola), Francisella tularensis (tularemia), e febres hemorrágicas virais [filovírus (p.ex., Ébola, Marburgo], e arenavírus [p.ex., Lassa, Ma- chupo]), todos os quais estão correntemente classificados como agentes de Categoria A; Coxiella burnetti (febre Q); espécies de Brucella (brucelose), Burkholderia mallei (mormo), Burkholderia pseudomallei (melioidose), Ricinus communis e sua toxina (toxina do rícino), Clostridium perfringens e sua toxina (toxina épsilon), espécies de Staphylococcus e suas toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psittaci (psitacose), ameaças à segurança da água (p.ex., Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), febre do Tifo (Richettsia powazekii), e encefalite viral (alfaví- rus, p.ex., encefalite equina venezuelana; encefalite equina oriental; encefalite equina ocidental); todos os quais estão correntemente classificados como agentes de Categoria B; e vírus de Nipah e hantavírus, que estão correntemente classificados como agentes de Categoria C. Adicionalmente, outros organismos, que estão assim classificados ou diferentemente classificados, podem ser identificados e/ou usados para um tal propósito no futuro. Será prontamente entendido que os vetores virais e outros construtos descritos aqui são úteis para visar antí- genos destes organismos, vírus, suas toxinas ou outros subprodutos, que prevenirão e/ou tratarão infeção ou outras reações adversas com estes agentes biológicos.

[0087] Os seguintes exemplos são somente ilustrativos e não são uma limitação sobre a invenção descrita aqui. EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE VETORES CONTENDO CASSETES DE COEXPRESSÃO DE ANTICORPOS DE COMPRIMENTO TOTAL

[0088] Uma série de cis-plasmídeos foi preparada para uso na ge ração de uma partícula viral de AAV contendo uma molécula de ácido nucleico para distribuição a uma célula alvo hospedeira. A molécula de ácido nucleico compreende sequências 5’ e 3’ ITR de AAV2 em cada terminal, um potenciador de CMV partilhado flanqueado por dois cassetes de expressão em orientações opostas, onde um primeiro cassete de expressão é controlado por um primeiro promotor mínimo de CMV e um segundo cassete de expressão é controlado por um segundo promotor mínimo de CMV. Todas as sequências localizadas entre as ITRs de AAV2 foram sintetizadas de novo por um vendedor comercial (GeneArt). Todas as sequências de codificação para os domínios variáveis de imunoglobulina foram flanqueadas com as enzimas de restrição únicas para permitir movimentação conveniente dos domínios variá-veis desejáveis. Para criar construtos com sequência de cadeia leve heteróloga (kgl), uma sequência codificando cadeia leve da linha germinal (IGKV4-1*01) foi sintetizada de novo e usada para substituir a sequência leve variável de FI6.

[0089] Um vai-vem de coexpressão de anticorpo exemplar está ilustrado na Figura 2. Este vai-vem contém à esquerda do potenciador um primeiro cassete de expressão que contém, da direita para a esquerda, um promotor mínimo de CMV, uma sequência líder heteróloga de IL2 ligada a um domínio pesado variável (VH) do anticorpo anti- TSG101 (1A6), um domínio CH’1, e um domínio CH’2-3 que foi otimizado quanto à expressão em humanos, e um poliA sintético. À direita do potenciador estão localizados um promotor mínimo de CMV, uma sequência líder heteróloga de IL2, um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve de FI6k2 (anticorpo antigripe), local de clivagem de furina, o ligante 2a do vírus da doença dos pés e boca, uma sequência líder de IL2, o VH de FI6v3, CH1, CH2-3, e uma curta sequência de poliA de timidina cinase. As designações de CH se referem ao alotipo de anticorpo conhecido G1m17,1.

[0090] SEQ ID NO: 1 proporciona sequências das regiões cons tantes de FI6. As sequências de aminoácidos da cadeia leve de ami- noácidos de FI6 são proporcionadas em SEQ ID NO: 2.

[0091] O cis-plasmídeo de FIG2 foi usado em um método de trans- fecção tripla como previamente descrito, p.ex., no Pedido de Patente dos EUA No. 12/226,558, para gerar vetores de AAV8 e AAV9 que foram usados em estudos subsequentes descritos aqui. O plasmídeo resultante, pN509_ACE Fi6-1A6 MAB_p3160, tem 7722 pb em comprimento, a sequência do qual é proporcionada em SEQ ID NO: 3, que é incorporada aqui por referência em conjunto com suas características. As sequências codificadas para a cadeia leve variável (VL) de FI6 [SEQ ID NO: 4], pesada variável de FI6 [SEQ ID NO: 5], CH1 (SEQ ID NO: 6), CH2-3 [SEQ ID NO: 7] são também proporcionadas.

[0092] Cis-plasmídeos de coexpressão de anticorpos similares fo ram gerados por subclonagem de um anticorpo para a gripe sazonal (CR8033) ou um anticorpo para a gripe pandêmica (C05), ou um anticorpo anti-M2e (TCN-032) em lugar do domínio variável pesado de 1A6 na Figura 2 usando locais de restrição únicos pré-posicionados que permitem movimentação fácil dos domínios variáveis. Estes cis- plasmídeos foram por seu turno usados em transfecção tripla (p.ex., realizada como descrito do Pedido de Patente dos EUA No. 12/226,588) para gerar vetores de AAV8 e AAV9 usados para estudos subsequentes. As sequências para o vai-vem de MAB pN510_ACE Fi6-C05 são proporcionadas em SEQ ID NO: 8; a sequência de ami- noácidos da cadeia leve variável é proporcionada em SEQ ID NO: 9, a leve constante é proporcionada em SEQ ID NO: 10, a cadeia pesada variável de FI6 é proporcionada em SEQ ID NO: 11, o CH1 é proporcionado em SEQ ID NO:12 e o CH2-3 é proporcionado em SEQ ID NO: 13. As sequências para o vai-vem de MAB pN514_ACE Fi6-C05 MAB são proporcionadas em SEQ ID NO: 19; a sequência de aminoácidos da leve constante é proporcionada em SEQ ID NO: 20, a cadeia pesada variável de FI6 é proporcionada em SEQ ID NO: 21, o CH1 é proporcionado em SEQ ID NO:22 e o CH2-3 é proporcionado em SEQ ID NO: 23. Estes vai-véns foram por seu turno usados para gerar vetores de AAV8 e AAV9 que foram usados para estudos subsequentes. EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO DE PRODUTOS EXPRESSOS A PARTIR DE VETORES DE AAV8 COEXPRESSANDO ANTICORPO MONOCLONAL (MAB) F16 E MAB IA6

[0093] Uma série de ensaios ELISA foi realizada para caracterizar os níveis de expressão e para se avaliar a ligação do MAB FI6 coex- presso com o MAB IA6 a partir do cis-plasmídeo gerado como descrito no Exemplo 1 após transfecção em células HEK 293. O peptídeo TSG101 foi sintetizado usando química de f-Moc pela Mimotopes. Todos os antígenos da gripe foram adquiridos de um fornecedor comercial, ImmuneTechnologies, Inc. A Proteína A foi adquirida da Sigma- Aldrich e foi usada para monitorizar a expressão de IgG1 humana total. A detecção de IgG1 humana em sobrenadantes de cultura de tecidos foi medida por ELISA específica quanto a antígenos ou de captura de proteína A. Placas de ELISA de elevada afinidade foram revestidas com 2 μg/mL de proteínas ou peptídeos HA, ou com 5 μg/mL de proteína A diluída em PBS e incubada durante a noite a 4 °C. Os poços foram lavados 5-8 vezes e bloqueados com EDTA a 1 mM, PBS inativa- do pelo calor a 5%, Tween 20 a 0,07% em PBS durante uma hora à temperatura ambiente. Os sobrenadantes de cultura de tecidos foram adicionados às placas a várias diluições em duplicados e incubados a 37 °C durante uma hora. As placas foram lavadas, bloqueadas, e anticorpo Anti-IgG humana de Cabra Affinipures conjugado com Bio-SP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, EUA) foi adicionado a uma diluição 1:10.000. Após uma hora, as placas foram lavadas e peroxidase de rábano-silvestre (HRP) conjugado com estreptavidina foi adicionada a uma diluição de 1:30.000. Após uma hora, as placas foram lavadas 3,3‘,5,5‘-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada. A reação foi parada após 30 minutos à temperatura ambiente usando ácido sulfúrico a 2 N e as placas foram lidas a 450 nm usando um leitor de placas BioTek μQuant (Winooski, VT, EUA).

[0094] Como esperado, não é observada nenhuma ligação de FI6 ao peptídeo TSG101, à HA (B/Malásia/2506/2/004), ou à HA (Somente região da cabeça da estripe de gripe A/Brisbane/59/2007). A ligação de FI6 é observada para esta mesma estirpe de gripe quando está presente a HA se comprimento total, bem como para a estirpe de gripe HA(dTM) (A/Pequim/01/2009, H1N1). Como esperado, a ligação de FI6 é também observada para a Proteína A.

[0095] De acordo com relatórios publicados, FI6 produzido de acordo com métodos da técnica prévia se liga a HA de comprimento total e ao tronco de HA, mas não somente à região da cabeça. O anticorpo monoclonal FI6 retém o seu perfil de ligação característico. EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO DE PRODUTOS EXPRESSOS A PARTIR DE VETORES DE AAV8 COEXPRESSANDO ANTICORPO MONOCLONAL (MAB) F16 E MAB PARA A GRIPE PANDÊMICA C05

[0096] A possibilidade de detecção diferencial de dois anticorpos monoclonais diferentes foi avaliada em um ensaio de captura. Os anticorpos monoclonais FI6 e C05 coexpressos a partir de um cis- plasmídeo preparado como descrito no Exemplo 1 e transfectados em células HEK293 foram avaliados quanto à ligação. Se espera que FI6 se ligue a HA de comprimento total e ao tronco de HA, mas não so- mente à região da cabeça. Os resultados do estudo de ligação ilustrados na Figura 3 demonstram que os anticorpos coexpressos retêm a sua ligação característica. Mais particularmente é observada ligação a HA de comprimento total e tronco de HA característica de FI6 e é também observada ligação a HA e somente cabeça de HA (nenhum tronco) característica de C05. Os ensaios de ELISA foram realizados como descrito no Exemplo 2. EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO DE PRODUTOS EXPRESSOS A PARTIR DE VETORES DE AAV8 COEXPRESSANDO ANTICORPO MONOCONAL (MAB) F16 E UM SEGUNDO MAB DE COMPRIMENTO TOTAL

[0097] Camundongos KNO RAG machos de 6-8 semanas de ida de (The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME, EUA) foram alojados sob condições isentas de patogênios nos Translational Research Laboratories da University of Pennsylvania. Todos os procedimentos e protocolos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee. Os camundongos foram sacrificados por asfi- xiação com dióxido de carbono e a morte foi confirmada por deslocamento cervical. Para a administração dos vetores, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de 70 mg/kg de peso corporal de cetamina e 7 mg/kg de peso corporal de xilazina por injeção intraperitoneal (IP). Os vetores foram diluídos em salino tamponado com fosfato (PBS) e as injeções IM foram realizadas usando uma seringa Hamilton. O soro foi coletado semanalmente através de hemorragias retro-orbitais.

[0098] A detecção de IgG1 humana em sobrenadantes de cultura de tecidos foi medida por ELISA de captura de proteína A. As placas de ELISA de elevada ligação foram revestidas com 5 μg/mL de proteína A diluída em PBS e incubadas durante a noite a 4 °C. Os poços foram lavados 5-8 vezes e bloqueados com EDTA a 1 mM, PBS inativa- do por calor a 5%, Tween 20 a 0,07% em PBS. As amostras de soro de camundongo foram inativadas por calor e adicionadas às placas a várias diluições em duplicados e incubadas a 37 °C durante uma hora. As placas foram lavadas, bloqueadas, e anticorpo Anti-IgG humana de Cabra Affinipures conjugado com Bio-SP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, EUA) foi adicionado a uma diluição 1:10.000. Após uma hora, as placas foram lavadas e peroxidase de rábano-silvestre (HRP) conjugado com estreptavidina foi adicionada a uma diluição de 1:30.000. Após uma hora, as placas foram lavadas e 3,3‘,5,5‘-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada. A reação foi interrompida após 30 minutos à temperatura ambiente usando ácido sulfú- rico a 2 N e as placas foram lidas a 450 nm usando um leitor de placas BioTek μQuant (Winooski, VT, EUA).

[0099] A Figura 5 ilustra os níveis de expressão sistêmica para IgG1 humana total em camundongos aos quais foi administrado um vetor de AAV coexpressando FI6 com anticorpo IA6. Os camundongos foram injetados intramuscularmente a doses de 1 x 1011 cópias do ge- noma (GC) ou 1 x 1010 GC. Os níveis de expressão foram avaliados aos dias 7, 15, 21, 28, 34, 42, 49 e 56 e medidos a uma concentração de microgramas/mL. Foi observado um aumento dependente da dose na expressão. EXEMPLO 5: CARACTERIZAÇÃO DE PRODUTOS EXPRESSOS A PARTIR DE VETORES DE AAV8 COEXPRESSANDO ANTICORPO MONOCLONAL (MAB) FI6 E TRÊS ANTICORPOS MONOCLONAIS DE COMPRIMENTO TOTAL DIFERENTES

[00100] As tabelas em baixo mostram níveis de expressão em camundongos aos quais foi administrado um vetor de AAV coexpressan- do FI6 com anticorpo monoclonal CR8033, C05, ou 1A6 de comprimento total. Camundongos nocaute (KO) RAG foram injetados intramuscularmente a doses de 1 x 1011 cópias do genoma (GC) ou 1 x 1010 GC como descrito no exemplo prévio. Os níveis de expressão foram avaliados semanalmente aos dias 7, 15, 21, 28, 34, 42, e 49 e medidos a uma concentração de microgramas/mL. Foi observado um aumento dependente da dose na expressão para os anticorpos expressos. O antígeno de captura usado para o ensaio é ELISA de Proteína A como descrito no exemplo prévio. EXEMPLO 6: O EFEITO ANT VIRAL É CONFER DO POR ANTICORPOS DE COMPRIMENTO TOTAL DUAIS EXPRESSOS A PARTIR DE UM VETOR ÚNIVO DE AAV9 e/ou AAV8 INTRAMUSCULARMENTE A. mAb AAV9.BiD.FI6_CR8033 e Desafio com Gripe A

[00101] Camundongos BALB/c foram injetados intramuscularmente com mAb AAV9.BiD.FI6_CR8033 distribuído intramuscularmente (IM) a 1 x 1011 GC. Duas semanas mais tarde, os camundongos foram desafiados intranasalmente com 5LD50 de PR8 adaptada para camundongo (gripe A). O círculo representa o construto AAV9 com um promotor bidirecional expressando anticorpos monoclonais FI6 e CR8033 sintéticos tendo a mesma cadeia leve heteróloga. O quadrado representa um controle positivo, i.e., AAV9 expressando um único anticorpo tipo FI6 também distribuído a 1 x 1011 GC, e o triângulo representa animais ingênuos. A Figura 6B mostra a sobrevivência pós-desafio. A administração de mAb AAV9.BiD.FI6_CR8033 à dose de 1011 GC/camundongo permitiu proteção parcial com um atraso significativo na perda de peso. B. mAb AAV9.BiD.FI6_CR8033 e Desafio com Gripe B

[00102] Para injeção do vetor de AAV9: Camundongos fêmeas BALB/c foram anestesiados por uma injeção intramuscular de uma mistura de 100 mg/kg de cetamina/10 mg/kg de xilazina em PBS, e vetor de mAb AAV9.BiD.FI6_CR8033 foi injetado intramuscularmente (IM) a 1 x 1011 GC por camundongo. O vetor BiD foi comparado com um AAV9 expressando um único anticorpo tipo CR8033 também distribuído a 1 x 1011 GC, e um controle negativo (animais ingênuos). A Figura 7B mostra a sobrevivência pós-desafio. Para o desafio com gripe, duas semanas após tratamento com vetor, os camundongos BALB/c tratados com AAV e ingênuos foram pesados e as caudas codificadas por cor, anestesiados como descrito acima, suspensos pelos seus incisores dorsais com os seus membros posteriores suportados em uma plataforma, e administrados intranasalmente com 5LD50 de B/Lee/40 (gripe B) em um volume total de 50 μL de PBS como descrito acima. Os camundongos foram depois pesados diariamente e monitorizados quanto a sinais de doença ou aflição. Os animais que exibiram sinais comportamentais de aflição ou perderam 30% do seu peso corporal inicial foram eutanizados por asfixiação com CO2.

[00103] A Figura 7A é um gráfico de linhas mostrando a percentagem de mudança no peso. Estes dados mostram que foi conferido efeito protetor total pelos anticorpos expressos duais a esta dose. A Figura 7B mostra a sobrevivência pós-desafio. C. Vetores de AAV8.FI6-TCN032, AAV8.FI6-1A6, e AAV8.FI6- CR8033 administrados IM e desafio com Gripe A PR8 adaptada a camundongo.

[00104] Estes vetores foram preparados como descrito no Exemplo 1. Camundongos KNO RAG machos de 6-8 semanas de idade (The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME, EUA) foram alojados sob condições isentas de patogênios nos Translational Research Laboratories da University of Pennsylvania. Todos os procedimentos e protocolos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee. Para a administração dos vetores, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de 70 mg/kg de peso corporal de cetamina e 7 mg/kg de peso corporal de xilazina por injeção intraperitoneal (IP). Os vetores foram diluídos em salino tamponado com fosfato (PBS) e as injeções IM foram realizadas usando uma seringa Hamilton. O soro foi coletado semanalmente através de hemorragias retro-orbitais.

[00105] A detecção de IgG1 humana em sobrenadantes de cultura de tecidos foi medida por ELISA de captura de proteína A. As placas de ELISA de elevada ligação foram revestidas com 5 μg/mL de proteína A diluída em PBS e incubadas durante a noite a 4 °C. Os poços foram lavados 5-8 vezes e bloqueados com EDTA a 1 mM, PBS inativa- do por calor a 5%, Tween 20 a 0,07% em PBS. As amostras de soro de camundongo foram inativadas por calor e adicionadas às placas a várias diluições em duplicados e incubadas a 37 °C durante uma hora. As placas foram lavadas, bloqueadas, e anticorpo Anti-IgG humana de Cabra Affinipures conjugado com Bio-SP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, EUA) foi adicionado a uma diluição 1:10.000. Após uma hora, as placas foram lavadas e peroxidase de rábano silvestre (HRP) conjugado com estreptavidina foi adicionada a uma diluição de 1:30.000. Após uma hora, as placas foram lavadas 3,3‘,5,5‘-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada. A reação foi parada após 30 minutos à temperatura ambiente usando ácido sulfúrico a 2 N e as placas foram lidas a 450 nm usando um leitor de placas BioTek μQuant (Winooski, VT, EUA).

[00106] Com referência à Figura 8C, em todos os painéis, os níveis de expressão estão indicados ao Dia 56 após administração dos vetores. Um par de dias após a última hemorragia orbital ao Dia 56, os camundongos foram pesados e as caudas codificadas por cor, anestesiados como descrito acima, suspensos pelos seus incisores dorsais com os seus membros posteriores suportados em uma plataforma, e administrados intranasalmente com 5LD50 de PR8 adaptada a camundongo (gripe A) em um volume total de 50 μL de PBS como descrito acima. Os camundongos foram depois pesados diariamente e monitorizados quanto a sinais de doença ou aflição. Os animais que exibiram sinais comportamentais de aflição ou perderam 30% do seu peso corporal inicial foram eutanizados por asfi- xiação com CO2 e a morte foi confirmada por deslocamento cervical. A Figura 8A mostra que a expressão sistêmica de tão pouco quanto 25 μg/mL de anticorpo antigripe é suficiente para originar proteção no desafio com PR8, mas a expressão de 0,4 μg/mL é insuficiente para a proteção. D. mAbs AAV9. FI6_IA6 e Desafio com Gripe A

[00107] Um vetor de AAV9 expressando FI6 artificial e uma anti- imunoadesina de HIV, IA6, foi avaliado quanto à proteção contra desafio com gripe A como descrito acima. A Figura 8B mostra que a expressão de 36,5 μg/mL de anticorpo antigripe é suficiente para proporcionar proteção completa contra desafio com PR8. A Figura 8C mostra que a expressão de 6,9 ug/mL de anticorpos antigripe não é suficiente para proteger contra desafio com PR8. EXEMPLO 8 - GERAÇÃO DE VETORES CONTENDO DOIS CASSETES DE EXPRESSÃO DE IMUNOADESINA

[00108] Usando um vetor de vai-vem similar àquele ilustrado na Figura 2 foram gerados vetores contendo duas imunoadesinas.

[00109] Em uma modalidade foi criado um vetor contendo imuno- adesinas FI6 e C05. As sequências de um plasmídeo transportando os cassetes de expressão de imunoadesinas FI6 e C05 são proporcionadas em SEQ ID NO: 36; com as sequências codificadas traduzidas proporcionadas em SEQ ID NO: 37 (cadeia pesada variável de FI6), SEQ ID NO: 38 (cadeia leve variável de FI6), e SEQ ID NO: 39 (CH2-3). Estas sequências e suas características são incorporadas por referência.

[00110] Em outra modalidade foi criado um vetor contendo imunoa- desinas FI6 e CR8033. As sequências de um plasmídeo transportando os cassetes de expressão de imunoadesinas FI6 e CR8033 são proporcionadas em SEQ ID NO: 40; com as sequências codificadas traduzidas proporcionadas em SEQ ID NO: 41 (VH de FI6) e SEQ ID NO: 42 (leve variável de FI6). Estas sequências e suas características são incorporadas por referência.

[00111] Os AAV podem ser gerados a partir dos plasmídeos de vai- vem de imunoadesina descritos acima usando técnicas conhecidas daqueles com perícia na técnica.

[00112] Plasmídeos de vai-vem ilustrativos adicionais são como se segue.

[00113] A sequência de um plasmídeo pN512_ACE FI6v3kgl-1A6 MAB_p3184 contendo uma cadeia leve da linha germinal kapa que é heteróloga em relação à fonte de ambas as cadeias pesadas, 1A6 e FI6v3, é proporcionada em SEQ ID NO: 14. As sequências codificadas traduzidas são proporcionadas em SEQ ID NO: 15 (leve constante), SEQ ID NO: 16 (pesada variável de FI6), SEQ ID NO: 17 (CH1), e SEQ ID NO: 18 (CH2-3).

[00114] As sequências de um vetor intermediário que transporta as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve de TCN032 são proporcionadas em SEQ ID NO: 30. As sequências de aminoácidos traduzidas codificadas por este plasmídeo incluem a cadeia pesada de TCN032 em SEQ ID NO: 31; a sequência de CH1 em SEQ ID NO: 32; a cadeia VH de FI6 em SEQ ID NO: 33; a sequência de CH1 em SEQ ID NO: 34 e a sequência de CH2-3 em SEQ ID NO: 35.

[00115] A sequência de um plasmídeo transportando as cadeias pesadas de TCN032 e FI6 e coexpressando dois anticorpos tendo estas especificidades é proporcionada em SEQ ID NO: 43. Os aminoáci- dos traduzidos da cadeia pesada variável de TCN032 estão em SEQ ID NO: 44, o CH1 está em SEQ ID NO: 45, o charneira-CH2'-CH3' está em SEQ ID NO: 46, o VH de FI6 está em SEQ ID NO: 47, o CH1 está em SEQ ID NO: 48, o CH2-3 está em SEQ ID NO: 49, e o gene da resistência à ampicilina está em SEQ ID NO: 50. Estas sequências e suas características são incorporadas aqui por referência. (Texto Livre de Listagem de Sequências)

[00116] A seguinte informação é proporcionada para sequências contendo texto livre sob o identificador numérico <223>.

[00117] Este pedido contém sequências e uma listagem de sequências, que é deste modo incorporada por referência. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes citados em este pedido, e o Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 61/992,649, depositado a 13 de maio, 2014, a prioridade do qual é reivindicado, são deste modo incorporados por referência nas suas totalidades como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado por referência. Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento será prontamente aparente àqueles com perícia ordinária na técnica à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas a ela sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

Claims (20)

1. Vírus adenoassociado (AAV) recombinante apresentando um capsídeo de AAV e empacotado neste um ácido nucleico heterólo- go que expressa pelo menos dois anticorpos monoespecíficos funcionais em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: uma repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV; um primeiro cassete de expressão que codifica pelo menos um primeiro quadro de leitura aberta (ORF) para uma primeira imuno- globulina sob o controle de sequências de controle reguladoras que dirigem a sua expressão; um segundo cassete de expressão que compreende um segundo ORF, um ligante, e um terceiro ORF sob o controle de sequências de controle reguladoras que dirigem a sua expressão, em que o segundo e terceiro ORF são para um segundo e terceiro cons- truto de imunoglobulina; e uma ITR 3’ de AAV.

2. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que expressa ainda um anticorpo biespe- cífico.

3. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que compreende um potenciador bidirecional localizado entre o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão.

4. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o primeiro ORF codifica uma cadeia leve de imunoglobulina, o segundo ORF codifica uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e o terceiro ORF codifica uma segunda cadeia pesada, em que os construtos de anticorpos funcionais expressos apresentam duas cadeias pesadas diferentes com diferentes especificidades que partilham uma cadeia leve.

5. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que pelo menos um dos segundo e terceiro ORF contém sequências de codificação de Fc modificadas.

6. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o ligante no segundo cassete compreende um ligante selecionado dentre um IRES ou um F2A.

7. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que as sequências de controle reguladoras para o primeiro cassete de expressão e/ou o segundo cassete de expressão compreendem um promotor mínimo.

8. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que as sequências de controle reguladoras para o primeiro cassete de expressão e/ou o segundo cassete de expressão compreendem uma poliA mínima ou sintética.

9. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o primeiro cassete de expressão é bicis- trônico e compreende um ORF adicional.

10. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que cada um dos ORF compreende um scFv.

11. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende uma poliA bidirecional entre o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão.

12. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro cassete de expressão compreende um potenciador e um promotor mínimo.

13. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo cassete de expressão compreende um potenciador e um promotor mínimo.

14. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo cassetes expressam em conjunto dois Fabs.

15. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois construtos de anticorpos apresentam diferentes especificidades.

16. AAV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois construtos de anticorpos são independentemente selecionados dentre um anticorpo monoclonal, uma imunoadesina, um Fab, um anticorpo bifuncional, e combinações dos mesmos.

17. Vírus adenoassociado (AAV) recombinante, caracterizado pelo fato de que apresenta um capsídeo de AAV e um ácido nucleico heterólogo empacotado neste, em que o AAV recombinante compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que expressa um primeiro anticorpo monoclonal apresentando uma primeira especificidade, um segundo anticorpo monoclonal apresentando uma especificidade diferente do primeiro anticorpo monoclonal e um anticorpo biespecífico, e em que o AAV recombinante ainda compreende: uma repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV; um primeiro cassete de expressão que codifica pelo menos um primeiro quadro de leitura aberta (ORF) para uma primeira imuno- globulina sob o controlo de sequências de controle regulador que dirigem a sua expressão; um segundo cassete de expressão que compreende um segundo ORF, um ligante e um terceiro ORF sob o controle de sequências de controle regulador que dirigem a expressão das mesmas, em que o segundo e o terceiro ORF são para uma segunda e terceira cadeia de construto de imunoglobulina; em que uma cadeia leve de imunoglobulina, uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina são codificadas e os construtos de anticorpos funcionais expressos apresentam duas cadeias pesadas diferentes com especificidades diferentes que compartilham uma cadeia leve e um ITR 3’ de AAV.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um AAV recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de distribuição de pelo menos dois anticorpos funcionais a um indivíduo.

20. Uso de AAV recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 18 para distribuição de pelo menos dois anticorpos funcionais a um indivíduo.