BR112016025972B1 - Métodos para selecionar um clone celular/linhagem celular e método para a produção de um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA SELECIONAR UM CLONE CELULAR/LINHAGEM CELULAR E PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO. No presente pedido é relatado um método para determinar a metilação de um ácido nucleico promotor ligado de maneira funcional a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo e, através disso, determinar a produtividade em longo prazo de uma célula. Também um aspecto é um método para selecionar uma célula para produzir um polipeptídeo determinando a metilação do ácido nucleico promotor ligado de maneira funcional ao gene estrutural que codifica o polipeptídeo.

Description

[001] O método relatado no presente pedido está no campo de seleção de células e expressão/produção de polipeptídeo. Em mais detalhes, no presente pedido é relatado um método para a seleção de uma célula que expressa ou secreta polipeptídeo em longo prazo com base na determinação de acilação de histona.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O DNA é uma macromolécula que codifica as instruções de todos os organismos vivos conhecidos (Avery, O.T., et al., J. Exp. Med. 79 (1944) 137-158). O DNA de células humanas tem um comprimento de aproximadamente dois metros e é armazenado principalmente no núcleo que tem um diâmetro de 10 μm (Turner, B.M., Cell 111 (2002) 285-291). Para organizar essa quantidade de informação, o DNA precisa ser altamente compactado. Um grupo de proteínas básicas pequenas conservadas denominadas histonas formam complexos com o DNA para gerar uma estrutura ordenada e compacta denominada cromatina. Essas proteínas carregadas positivamente interagem com o esqueleto de fosfodiéster carregado negativamente da dupla hélice do DNA (Alberts, B.J.A., et al., Molecular Biology of the Cell; Meyers, R.A., Epigenetic Regulation and Epigenomics, WILEY-BLACKWELL, 1; Olins, E. D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2003)). As quatro histonas do “núcleo” H2A, H2B, H3 e H4 combinam com o DNA para formar a unidade de repetição básica de cromatina, denominada nucleossomo (Thomas, J. O. e Kornberg, R. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 26262630). A estrutura de núcleo nucleossomo de 225 kDa consiste em aproximadamente 147 bp de DNA empacotado ao redor de um octâmero de histona, que compreende dois dímeros H2A/H2B e um tetrâmero H3/H4 em 1,67 voltas superhelicoidais para esquerda (Arents, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 10148-10152; Arents, G. e Moudrianakis, E. N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 10489-10493; Richmond, T. J., Scientist 13 (1999) 15-15). Dependendo da acessibilidade do DNA, a cromatina é distinguida por dois tipos. Heterocromatina altamente compactada, que é menos acessível para transcrição, e eucromatina transcricionalmente ativa livremente empacotada. A heterocromatina facultativa pode se formar em qualquer lugar do núcleo, com frequência localizada para promotores e é estabelecida tanto de uma maneira regulada no desenvolvimento como em resposta a acionadores ambientais (Chen, T. e Dent, S. Y., Nat. Rev. Genet. 15 (2014), 93-106).

[003] A perda gradual de produtividade na cultura em longo prazo é um problema comum no desenvolvimento de linhagens celulares de fabricação. A diminuição da expressão de proteínas recombinantes pode ser devido a uma perda de cópias do transgene e/ou silenciamento do transgene. O silenciamento é causado por modificações epigenéticas da cromatina, como direcionar a metilação do DNA promotor nos sítios CpG e modificações pós- traducionais de histonas que são os principais componentes proteicos da cromatina. As modificações de inativação de histonas são compensadas por outras modificações que são de ativação.

[004] Barnes, L.M., et al., relatam a definição molecular de indicadores preditivos de expressão de proteína estável em células de mieloma NS0 recombinantes (Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121). A correlação relatada por Barnes et al. é fraca e não é suficiente para uma predição de estabilidade.

[005] No documento WO 2004/056986, meios e métodos para produzir uma proteína através de abridores (openers) na cromatina que são capazes de tornar a cromatina mais acessível aos fatores de transcrição são relatados.

[006] No documento WO 2011/128377 foi relatado que direcionar a metilação do promotor inicial imediatamente principal de citomegalovírus humano (MIE de hCMV) pode ser usada como marcador inicial para predizer a instabilidade de produção de linhagens celulares CHO recombinantes.

[007] Osterlehner, A., et al., relatam metilação de promotor e números de cópias de transgene que predizem produção de proteína recombinante instável em linhagens celulares de ovário de hamster chinês (Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] Descobriu-se que a determinação do grau de metilação de um sítio CpG específico no ácido nucleico promotor ligado de maneira funcional a um gene estrutural que codifica um polipeptídeo em uma célula ou linhagem celular usada para a produção do respectivo polipeptídeo, em combinação com a determinação de acilação de histona perto do promotor, isto é, na cromatina promotora, pode ser usada para predizer uma diminuição na produtividade durante o cultivo em longo prazo. Adicionalmente, o número de cópias do cassete de expressão de cadeia leve integrado no genoma pode ser determinado.

[009] Um aspecto conforme relatado no presente pedido é um método para selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor, que compreende as seguintes etapas: a) determinar o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor para uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e b) selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem um nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 conforme determinado na etapa a) de 0,1 ou maior.

[010] Um aspecto conforme relatado no presente pedido é um método para selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que compreende as seguintes etapas: a) determinar para cada clone celular/linhagem celular de uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone celular/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor, o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor com base no nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) determinado em pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, e b) selecionar um clone celular/linhagem celular que tem um nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) de 0,1 ou maior.

[011] Um aspecto conforme relatado no presente pedido, é um método para selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que compreende as seguintes etapas: a) determinar o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 para cada clone de uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e b) determinar a frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 de SEQ ID NO: 1 para cada clone de uma segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e c) selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, que tem um nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histonas 3 conforme determinado na etapa a) de 0,1 ou maior, e que tem uma frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 conforme determinado na etapa b) menor que 5%.

[012] Um aspecto conforme relatado no presente pedido, é um método para selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que compreende as seguintes etapas: a) determinar para cada clone celular/linhagem celular de uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 com base no nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) determinado em pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, b) determinar para cada clone celular/linhagem celular de uma segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, a média da frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 de SEQ ID NO: 1 com base na metilação determinada para pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, c) selecionar um clone celular/linhagem celular que tem um nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) de 0,1 ou maior, e que tem uma frequência de metilação na posição 425 abaixo de 5%.

[013] Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,2 ou maior. Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,5 ou maior. Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,75 ou maior. Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 1,0 ou maior.

[014] Em uma realização preferencial, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,5 ou maior.

[015] Em uma realização, o ácido nucleico promotor tem a sequência de SEQ ID NO: 1 ou compreende um fragmento funcional do mesmo, ou uma variante funcional do mesmo. Em uma realização, o sítio CpG está na posição 425 de SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente a esse no fragmento ou variante do mesmo.

[016] Em uma realização de todos os aspectos, o método ainda compreende as seguintes etapas: ab) determinar o número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados, - através do qual a etapa c) é: - selecionar um clone celular/linhagem celular que tem um nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 conforme determinado na etapa a) maior que 0,5, que tem uma frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 conforme determinado na etapa b) menor que 5%, e que tem um número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados conforme determinado na etapa ab) de 10 ou menos.

[017] Em uma realização preferencial, o número de cópias de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados conforme determinado na etapa ab) é 6 ou menos.

[018] Em uma realização, o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 é o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 nos resíduos de lisina na posição 4 e/ou 9 e/ou 14 e/ou 18 e/ou 27. Em uma realização, os resíduos de lisina estão na posição 9 e/ou 14 e/ou 27.

[019] Em uma realização de todos os aspectos, o método compreende como primeira etapa: - transferir uma população de células com um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, e a partir disso uma primeira, uma segunda e opcionalmente uma terceira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares.

[020] Em uma realização, a linhagem celular (selecionada) tem uma taxa de produção após 30 a 60 gerações em cultivo de mais de 60% da taxa de produção no início do cultivo.

[021] Um aspecto conforme relatado no presente pedido, é um método para selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica pelo menos uma cadeia leve do anticorpo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que compreende as seguintes etapas: a) determinar o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 para cada clone de uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e b) determinar o número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados para cada clone de uma segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e c) determinar a frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 de SEQ ID NO: 1 para cada clone de uma terceira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e d) selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, i) que tem um nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 conforme determinado na etapa a) de 0,1 ou maior, ii) que tem uma frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 conforme determinado na etapa b) menor que 5%, e iii) que tem um número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados conforme determinado na etapa ab) de 10 ou menos.

[022] Um aspecto conforme relatado no presente pedido, é um método para selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica pelo menos uma cadeia leve do anticorpo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que compreende as seguintes etapas: a) determinar para cada clone celular/linhagem celular de uma grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 com base no nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) determinado em pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, b) determinar para cada clone celular/linhagem celular da grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares o número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados em pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, e c) determinar para cada clone celular/linhagem celular da grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, a média da frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 de SEQ ID NO: 1 com base na metilação determinada para pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, d) selecionar um clone celular/linhagem celular i) que tem um nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) de 0,1 ou maior, ii) que tem uma frequência de metilação na posição 425 abaixo de 5%, e iii) que tem um número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados conforme determinado na etapa ab) de 10 ou menos.

[023] Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,2 ou maior. Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,5 ou maior. Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,75 ou maior. Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 1,0 ou maior.

[024] Em uma realização preferencial, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 é 0,5 ou maior.

[025] Em uma realização, o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 é o nível médio (relativo) de acetilação de histona 3 nos resíduos de lisina na posição 4 e/ou 9 e/ou 14 e/ou 18 e/ou 27. Em uma realização, os resíduos de lisina estão na posição 9 e/ou 14 e/ou 27.

[026] Em uma realização, o ácido nucleico promotor tem a sequência de SEQ ID NO: 1 ou compreende um fragmento funcional do mesmo, ou uma variante funcional do mesmo. Em uma realização, o sítio CpG está na posição 425 de SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente a esse no fragmento ou variante do mesmo.

[027] Em uma realização preferencial, o número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados conforme determinado na etapa b) é 6 ou menos.

[028] Em uma realização, a determinação do nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) compreende as seguintes etapas: 1) isolar a cromatina a partir de cada um dos clones celulares/linhagens celulares, 2) tratar uma primeira alíquota da cromatina por um anticorpo que é adequado para determinar o nível (relativo) de acetilação de histona 3 como, por exemplo, um anticorpo específico de acetilação de histona 3, e formar um precipitado anticorpo-cromatina, e tratar uma segunda alíquota da cromatina por um anticorpo que é adequado para determinar o nível de histona 3 como, por exemplo, um anticorpo específico de histona 3, e formar um precipitado anticorpo-cromatina, 3) amplificar o DNA genômico a partir de uma terceira alíquota não tratada da cromatina, e a partir da primeira e segunda alíquotas tratadas com PCR quantitativa em tempo real, 4) determinar com o resultado obtido na etapa 3) o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3.

[029] Em uma realização, a determinação da frequência de metilação compreende as seguintes etapas: 1) isolar o DNA a partir de cada um dos clones celulares/linhagens celulares, 2) realizar, para cada DNA isolado individualmente, uma reação em cadeia da polimerase específica para metilação, 3) determinar, com os resultados obtidos na etapa 2), a frequência de metilação.

[030] Em uma realização, a etapa 2) é: 4) realizar, para cada DNA isolado individualmente, uma reação em cadeia da polimerase com um primer específico para metilação e um primer universal.

[031] Também em uma realização a etapa 2) é: a) digerir individualmente o DNA isolado com uma enzima de restrição e realizar uma reação em cadeia da polimerase para cada DNA digerido com um primer específico para metilação e um primer universal.

[032] Em uma realização, os primers são independentemente entre si selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6 a 20.

[033] Em uma realização, um primer é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, 14 e 15, o primer universal tem a sequência de SEQ ID NO: 9, e um primer específico para metilação é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 18 e 19.

[034] Em uma realização, os primers universais têm a sequência de SEQ ID NO: 9 e 11, e os primers específicos para metilação têm a sequência de SEQ ID NO: 11 e 18.

[035] Em uma realização, o nível (relativo) de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) é normalizado para um gene de referência. Em uma realização, o gene de referência é Gusb.

[036] Em uma realização, a segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares compreende pelo menos um clone celular/linhagem celular também compreendido na primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares. Em uma realização, a segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares é idêntica à primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares.

[037] Em uma realização, o clone celular/linhagem celular é um clone de célula/linhagem celular eucarionte. Em uma realização, o clone celular/linhagem celular é um clone celular/linhagem celular de mamífero. Em uma realização, o clone celular/linhagem celular é selecionado a partir de CHO, BHK, HEK e SP2/0. Em uma realização, o clone celular/linhagem celular é um clone celular/linhagem celular de CHO. Em uma realização, o clone celular/linhagem celular é um clone celular/linhagem celular de CHO K1.

[038] Em uma realização preferencial, o clone celular/linhagem celular é um clone celular/linhagem celular de CHO.

[039] Em uma realização, o polipeptídeo é i) um anticorpo, ou ii) um fragmento de anticorpo, ou iii) um conjugado de anticorpo, ou iv) uma cadeia leve de anticorpo e uma cadeia pesada de anticorpo. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

[040] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para a produção de um polipeptídeo que compreende as seguintes etapas: b) selecionar um clone celular/linhagem celular com um método conforme relatado no presente pedido, c) cultivar o clone celular/linhagem celular selecionado, e d) recuperar o polipeptídeo a partir do meio de cultivo e/ou do clone celular/linhagem celular e, através disso, produzir o polipeptídeo.

[041] Em uma realização, o método compreende antes da etapa a) as seguintes etapas: a-3) fornecer uma célula de mamífero, não humana, a-2) transferir a célula fornecida com um ácido nucleico, a qual compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, a-1) i) opcionalmente cultivar o clone celular/linhagem celular na presença de um agente de seleção, ii) depositar individualmente as células transfectadas, e iii) cultivar as células transfectadas individualmente na presença de um agente de seleção.

[042] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para a produção de um polipeptídeo que compreende as seguintes etapas: e) selecionar um clone celular/linhagem celular com um método conforme relatado no presente pedido, f) cultivar a célula/clone selecionado, e g) recuperar o polipeptídeo a partir do meio de cultura e/ou das células e, através disso, produzir um polipeptídeo.

[043] Em uma realização, o método compreende uma etapa adicional: h) purificar o polipeptídeo recuperado.

[044] Em uma realização, o método compreende antes da etapa a) as seguintes etapas: a-3) fornecer uma célula, a-2) transfectar a célula fornecida com um ácido nucleico contendo um gene estrutural que codifica o polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor, a-1) i) opcionalmente cultivar e propagar a célula transfectada na presença de um agente de seleção, ii) depositar individualmente as células, e iii) cultivar as células transfectadas depositadas individualmente na presença de um agente de seleção.

[045] Em uma realização, a etapa a) compreende: i) fornecer pelo menos uma célula que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica o polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor, ii) determinar a metilação do sítio CpG na posição 425 dentro do ácido nucleico promotor de SEQ ID NO: 1, e iii) selecionar uma célula que produz um polipeptídeo em que a metilação determinada na etapa b) está abaixo de um valor de limiar.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[046] As linhagens celulares econômicas são necessárias para fornecer alta produtividade e níveis de produção estáveis durante a propagação de pequena para grande escala. A diminuição de produtividade durante o aumento de escala constitui um risco grave durante o desenvolvimento da linhagem celular (Barnes, L. M. et al., Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 631-639). Uma das principais razões para a instabilidade de produção é uma redução do número de cópias ativas ao longo de ciclos celulares, que pode ser atribuída a ruptura/rearranjo cromossômico como uma característica inerente de células CHO (Kim, M. et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2434-2446.) e/ou uma indução pelo processo de amplificação do gene (Kaufman, R. J., et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 699-711). A diminuição de mRNA em um número constante de cópias de genes recombinantes é outra causa principal de queda de produtividade (Barnes, L. M. et al., Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121; Chusainow, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1182-1196; Strutzenberger, K., et al., J. Biotechnol. 69 (1999) 215-226). Uma explicação razoável para essa ocorrência é o silenciamento epigenético por metilação de promotor (Osterlehner, A., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185) e modificações de histona como tipificado por desacetilação e metilação específica (Mutskov, V. e Felsenfeld, G., EMBO J. 23 (2004) 138-149; Paredes, V., et al., Biotechnol. Lett. 35 (2013) 987-993). Além disso, a própria sequência recombinante, a formação de repetições em tandem de sequência e a localização genômica do transgene são iniciadores propostos para o silenciamento do gene (Kaufman, W. L. et al., Nuc. Acids Res. 36 (2008) e111). A partir disso, a influência da cromatina adjacente sobre sítios de integração é denominada ‘efeito de posição’ (Lattenmayer, C.,et al., Cytotechnol. 51 (2006) 171-182; Yin, Z., et al., Genet. Mol. Res. 11 (2012) 355-369).

[047] O promotor a montante do gene recombinante inicia a transcrição do gene e é capaz de afetar o nível de expressão gênica e estabilidade (Kaufman, W. L. et al., Nuc. Acids Res. 36 (2008) e111). O principal promotor de gene inicial imediato do citomegalovírus humano (MIE de hCMV) é comumente usado para dirigir expressão recombinante em células de mamíferos para pesquisa e fabricação para obter altos níveis de expressão em transfecções temporárias e estáveis (Boshart, M., et al., Cell 41 (1985) 521530; Chapman, B. S., et al., Nuc. Acids Res. 19 (1991) 3979-3986; Foecking, M. K. e Hofstetter, H. Gene 45 (1986) 101-105; Wright, A., et al., Hum. Gene Ther. 16 (2005) 881-892). Embora o promotor MIE de hCMV forneça altos níveis de expressão gênica, muitos estudos relataram uma diminuição de produtividade ao longo da cultura em longo prazo (Bailey, L. A., et al., Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 2093-2103; Barnes, L. M., et al., Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 261-270; He, L., et al., Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 17131722.). O silenciamento do promotor MIE de hCMV é (em adição à perda do número de cópias) amplamente atribuído para eventos epigenéticos de metilação de DNA promotor e modificação de histona (Brooks, A. R. et al., J. Gene Med. 6 (2004) 395-404; Kim, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2434-2446; Osterlehner, A., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681; Paredes, V., et al., Biotechnol. Lett. 35 (2013) 987-993; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185).

[048] A cromatina é conhecida por estar envolvida na regulação de expressão gênica. A modificação do DNA ou da cromatina e/ou de proteínas associadas à cromatina, como histonas, tem um impacto sobre a estrutura da cromatina e, portanto, na expressão gênica. Modificação de DNA em células de mamíferos pode ser por metilação de resíduos de citosina em dinucleotídeos CpG. Histonas, especialmente a sua porção N-terminal, podem ser modificadas por acetilação, metilação, fosforilação ou ubiquitinilação.

[049] O conteúdo de ácido nucleico de uma célula, isto é, seu DNA, está presente no núcleo de células em forma compactada juntamente com histonas. As histonas empacotam e ordenam o DNA em nucleossomos. Existem cinco principais proteínas histonas em humanos. Histonas são proteínas altamente alcalinas. A histona H3 (histona 3) tem um domínio globular principal e uma cauda N-terminal. Ela tem um tamanho de 137 resíduos de aminoácidos. Histonas, em geral, têm a função de fornecer uma estrutura de núcleo ao redor do qual o ADN está localizado e regular a expressão gênica.

[050] As histonas podem ser modificadas de muitas maneiras diferentes, principalmente ocorrendo ao longo dos resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal que varia de 13 a 40 aminoácidos de comprimento dependendo da histona específica. Esse grande número de modificações ainda aumenta devido ao fato de que algumas modificações como metilação de lisina compreendem até três estados diferentes (Kouzarides, T., Cell 128 (2007) 693-705). Mais de 100 modificações de histona foram descobertas (Zentner, G. E. e Henikoff, S., Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (2013) 259-266). A acetilação e metilação de resíduos de cauda de histona H3 e histona H4 são as melhores modificações estudadas. Geralmente, 14 tipos distintos de modificações foram encontrados (Dawson, M. A. e Kouzarides, T., Cell 150 (2012) 12-27) e são listados na Tabela a seguir.

TABELA

[051] K, lisina; R, arginina; S, serina; T, treonina; E, ácido glutâmico; P, prolina; ac, acetilação; me, metilação; cit, citrulina; cr, crotonilação; pr, propionilação; bu, butirilação; fo, formilação; oh, hidroxilação; a, assimétrico; s, simétrico; >, conversão. Adoptada a partir de (Dawson & Kouzarides, 2012).

[052] A combinação dessas modificações, designadas como motivos PTM (modificação pós-traducional) são de preferência associadas com funções que o indivíduo marca. A pesquisa em combinação de modificações sugere mais de 200 diferentes motivos PTM (Feller, C., et al., Mol. Cell 57 (2015) 559-571). As modificações são reversíveis.

[053] Sabe-se que a metilação de histona H3 em lisina 9 (H3K9) e 27 (H3K27) são modificações resultantes na repressão gênica. As modificações de histona parecem fornecer repressão transcricional lábil enquanto que a metilação de DNA é uma marca de silenciamento altamente estável que não é facilmente revertida (Cedar, H. e Bergman, Y., Nat. Rev. Gen. 10 (2009) 295-304).

[054] A acetilação de histona foi descoberta em 1961 como a primeira modificação de histona (Phillips, D. M., Biochem. J. 87 (1963) 258263). Os primeiros estudos associaram genes transcritos ativos com a hiperacetilação de histonas, que indica uma função de acetilação no processo de transcrição (Allfrey, V. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51 (1964) 786794). Durante a fase S um aumento global de sítios de acetilação, como H3K56ac, foi observado seguido por uma diminuição durante a fase G2. Isso levou à conclusão de que a acetilação de histona pode facilitar a incorporação de histonas recentemente sintetizadas (Miller, K. M. et al., Cell Cycle 5 (2006) 2561-2565). Em adição a sua função global durante a replicação de DNA, a acetilação de histona forma padrões genômicos específicos que se correlacionam com a transcrição ativa. Assim, as regiões de heterocromatina são hipoacetilados e genes transcricionalmente ativos de eucromatina são altamente acetilados (Kouzarides, T., Cell 128 (2007) 693-705). Picos de acetilação são encontrados em sítios específicos no promotor próximo aos sítios de iniciação de transcrição (TSS) (Wang, Z., et al., Nat. Genet. 40 (2008) 897-903). Os resíduos de lisina de histona da cauda N-terminal de histona 3 na posição 4, 9, 14, 18 e de histona 4 em lisinas 5, 8 e 12 são predominantemente propensas a acetilação. Tomadas em conjunto, a regulação de expressão gênica, replicação de DNA, reparação e recombinação são influenciadas por diferentes estados de acetilação de histonas (Dawson, M. A. e Kouzarides, T., Cell 150 (2012) 12-27).

[055] Histonas acetiltransferases (HATS) geralmente mediam expressão gênica e ativação transcricional (Cheung, P., et al., Cell 103 (2000) 263-271). Com o uso de imunoprecipitação de cromatina descobriu-se que o DNA não metilado é predominantemente montado em nucleossomos que contêm histonas acetiladas, que são associadas com cromatina aberta, enquanto que a presença de grupos metila em sequências de DNA idênticas se correlaciona com o conjunto de nucleossomos contendo histona H3 e H4 não acetilada levando a mais cromatina compacta (Cedar, H. e Bergman, Y., Nat. Rev. Gen. 10 (2009) 295-304; Eden, S., et al., Nature 394 (1998) 842-843; Hashimshony, T., et al., Nat. Gen. 34 (2003) 187-192). A histona H3 é a histona mais excessivamente modificada das cinco histonas que ocorrem naturalmente.

[056] Em regiões de alta atividade transcricional pode ser encontrado um alto grau de acetilação de histona. A acetilação de histona é catalisada pela enzima histona-acetil-transferase (HAT) que transfere a parte acetila de acetil-CoA para o grupo ε-amino de resíduos de lisina de histona na região N-terminal. A acetilação de histona acontece exclusivamente em resíduos de lisina, como por exemplo, H3K9 (lisina na posição 9 de histona 3), H3K14 e H3K27 (Koch, C.M., et al., Gen. Res. 17 (2007) 691-707; Creyghton, M.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 21931-21936).

[057] É comumente observado durante o desenvolvimento da linhagem celular e em produção de grande escala que ocorre o silenciamento de expressão gênica recombinante durante cultivo de célula hospedeira (grande escala) prolongado. Em células de mamíferos isso pode ser devido, por exemplo, à formação de derivados de cromatina, que previnem a transcrição do gene recombinante.

[058] Isso resulta em uma população de células heterogêneas após tempos de cultivo mais longos, como em produção em grande escala (incluindo fermentações de expansão em série (seed train) e fermentação principal). Nessa população de células heterogêneas algumas células continuam a expressar níveis altos da proteína de interesse recombinante enquanto outras células expressam baixo ou até mesmo nenhuma proteína de interesse (consulte, por exemplo, Martin, D.I. and Whitelaw, E., Bioessays 18, (1996) 919-923; McBurney, M.W., et al., Exp. Cell. Res. 274 (2002) 1-8).

[059] A produção de linhagens celulares é em geral descendente de uma célula parental única. Essas células são com frequência aumentadas em escala durante o cultivo e cultivadas por muito tempo em fermentações em grande escala (fermentações de expansão em série (seed train) e produção) resultando em volumes de cultivo de até 25.000 litros e, com frequência, densidades celulares de mais de um milhão de células por mililitro. Essas fermentações em grande escala podem apresentar reduções drásticas na produtividade (Migliaccio, A.R., et al., Gene 256 (2000) 197-214; Strutzenberger, K., etal., J. Biotechnol. 69 (1999) 215-226).

[060] Para a seleção de produção de linhagens celulares/clones celulares, isto é, clone celular/linhagens celulares cuja intenção é serem usados para a produção recombinante em grande escala de um polipeptídeo, isto é, a perda de produtividade de geração por geração, do clone celular/linhagem celular é importante. Dessa forma, as linhagens celulares de mamíferos para produção de proteína recombinante precisam manter a produtividade ao longo das vezes de cultivo estendido. Geralmente a estabilidade de produção de um clone celular/linhagem celular é determinada cultivando o clone celular/linhagem celular durante um longo período de tempo, isto é, gerações múltiplas. Em intervalos regulares o meio é diluído com meio fresco e a produtividade específica por célula é determinada com base no título de produto e da densidade de células viáveis. A alteração (normalmente uma redução) da produtividade específica é indicativo de estabilidade de produção em longo prazo do clone celular/linhagem celular.

[061] Os estudos de estabilidade em longo prazo são tempo e recurso intensivos, mas são amplamente realizados para identificar e eliminar candidatos instáveis durante o desenvolvimento da linhagem celular. Dependendo do critério alvo o estudo abrange 30 a 60 divisões celulares, que corresponde geralmente a 30 a 70 dias. Dessa forma, o material necessário e o tempo de trabalho é pronunciado. Isso pode ser visto ainda mais pelo fato de que até 75% das linhagens celulares/clones celulares testados não são estáveis e, dessa forma, um número alto de linhagens celulares/clones celulares têm de ser avaliados.

[062] Além da perda da produção do transgene, a instabilidade de linhagens celulares de fabricação pode estar associada com a metilação e silenciamento do promotor heterólogo usado para a expressão do transgene (consulte, por exemplo, Escher, G., et al. J. Lipid Res. 46 (2005) 356-365; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185). O silenciamento do promotor pode resultar de modificação epigenética da cromatina (combinação ou complexo de DNA e proteínas que constituem o conteúdo do núcleo de uma célula). Essa pode ser a metilação direta de dinucleotídeos CpG dentro do promotor como, por exemplo, promotor/enhancer principal-imediato-inicial de citomegalovírus humano (MIE de hCMV) e/ou a modificação pós-traducional de histonas. Além das modificações de inativação de histona, como a metilação de lisina 9 ou 27 de histona 3, modificações de ativação, como a metilação de lisina 4 de histona 3, ou a acetilação global de histona 3 e 4, são conhecidas (consulte, por exemplo, Cedar, H. e Bergman, Y., Nat. Rev. Genet. 10 (2009) 295-304).

[063] A modificação epigenética de metilação de CpG do promotor MIE de hCMV foi usada como um indicador para a estabilidade de produção em longo prazo (consulte Osterlehner et al.).

[064] No presente pedido, a acetilação de lisina local (H3ac) como marcadores de predição potenciais de silenciamento de transgene em longo prazo foi identificada.

[065] Descobriu-se que o dinucleotídeo CpG na posição 425 do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de citomegalovírus humano (hCMV) (SEQ ID NO: 1) é frequentemente metilado em linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO) produtor de anticorpo instável. Um qPCR em tempo real específico para metilação foi estabelecido para permitir a medição rápida e sensível de metilação MIE de hCMV.

[066] Descobriu-se ainda que a modificação pós-traducional de histona adjacente ao promotor pode ser usada como marcador adicional para identificar linhagens celulares de expressão/produção estáveis. A presença de uma modificação de inativação é um marcador que o respectivo clone celular/linhagem celular é muito instável e apresentará um declínio em produtividade durante o curso futuro do cultivo que está acima da média (clone celular/linhagem celular de produção instável em longo prazo). Por outro lado, a presença de uma modificação de ativação é um marcador que o respectivo clone celular/linhagem celular é muito estável e apresentará um declínio em produtividade durante o curso futuro do cultivo que está abaixo da média (clone celular/linhagem celular de produção instável em longo prazo).

[067] Descobriu-se que usando uma combinação de ambos os marcadores acima, isto é, a metilação na posição 425 de SEQ ID NO: 1 e do nível relativo de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor, pode ser obtido um aprimoramento adicional na determinação de linhagens celulares recombinantes/clones celulares de produção estável em longo prazo. Um aprimoramento adicional é possível se também o número (cópias) de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados é incluído no caso de um anticorpo.

[068] Dessa forma, são relatados no presente pedido, métodos para a seleção de um clone celular/linhagem celular bem como um método para a produção de um polipeptídeo com o uso desse clone celular/linhagem celular. O clone celular/linhagem celular selecionado é uma célula de produção em longo prazo. Esse clone celular/linhagem celular pode ser selecionado, conforme relatado no presente pedido, baseado em i) no nível relativo de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) próximo do ácido nucleico promotor, ou ii) na metilação do promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano (MIE de hCMV) na posição 425 ligado de maneira funcional ao gene estrutural que codifica o polipeptídeo, ou iii) uma combinação de i) e ii).

A. DEFINIÇÕES

[069] O termo “quase” denota que o valor após essa expressão é um valor central com certa variabilidade. Em uma realização, a variabilidade é de ± 40% do valor, em outra realização, a variabilidade é de ± 30% e em uma realização adicional a variabilidade é de ± 20%. Dessa forma, o termo quase constante denota que um valor está em uma realização, na faixa de 60% a 140%, em outra realização, na faixa de 70% a 130% e em uma realização adicional, na faixa de 80% a 120%.

[070] O termo “anticorpo” denota uma molécula que compreende pelo menos dois também conhecidos como polipeptídeos de cadeia leve (cadeia leve) e dois também conhecidos como polipeptídeos de cadeia pesada (cadeia pesada). Cada um dos polipeptídeos da cadeia pesada e leve compreende um domínio variável (região variável) (geralmente a porção terminal amino da cadeia polipeptídica) que compreende as regiões de ligação que são capazes de interagir com um antígeno. Cada um dos polipeptídeos da cadeia pesada e leve compreende uma região constante (geralmente a porção carbóxi-terminal). A região constante da cadeia pesada medeia a ligação do anticorpo i) às células portadoras de um receptor Fc gama (FCYR), como células fagocitárias, ou ii) às células portadoras do receptor Fc neonatal (FcRn) também conhecido como receptor Brambell. Ela também media a ligação a alguns fatores, incluindo fatores do sistema complemento clássico, como componente (C1q).

[071] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.

[072] Dependendo das sequências de aminoácidos da região constante das cadeias pesadas, os anticorpos são divididos em diferentes classes: Classe IgA, classe IgD, classe IgE, classe IgG e cIasse IgM. Algumas dessas classes são ainda divididas em subclasses (isotipos), isto é, IgG em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, ou IgA em IgA1 e IgA2. De acordo com a classe à qual um anticorpo pertence as regiões constantes da cadeia pesada são chamadas de α gA), δ (IgD), ε (IgE)Y (IgG) e μ (IgM), respectivamente. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo da classe IgG. Em outra realização, o anticorpo tem uma região constante humana ou uma região constante derivada de origem humana. Em uma realização adicional, o anticorpo é da subclasse IgG4 ou da subclasse IgG1, IgG2 ou IgG3, que é modificado de tal forma que nenhuma ligação do receptor FCY (por exemplo, FcYRIIIa) e/ou nenhuma ligação de C1q possa ser detectada. Em uma realização, o anticorpo é da subclasse IgG4 humana ou de uma subclasse IgG1 humana mutada. Em uma realização, o anticorpo é da subclasse IgG1 humana com mutações L234A e L235A. Em outra realização, o anticorpo é em relação à ligação de receptor FCY de subclasse IgG4 ou de subclasse IgG1 ou IgG2, com uma mutação em L234, L235 e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Em uma realização adicional, o anticorpo tem uma mutação selecionada a partir de S228P, L234A, L235A, L235E, SPLE (S228P e L235E) e/ou PVA236 (PVA236 significa que a sequência de aminoácidos ELLG (fornecida em código de aminoácido de uma letra) da posição de aminoácido 233 a 236 de IgG1 ou EFLG de IgG4 é substituída por PVA). Em uma realização, o anticorpo é da subclasse IgG4 e tem a mutação S228P de IgG4 ou o anticorpo é da subclasse IgG1 e tem as mutações L234A e L235A.

[073] O domínio variável de uma cadeia leve ou pesada da imunoglobulina, por sua vez, compreende diferentes segmentos, ou seja, quatro regiões de estrutura (FR) e três regiões hipervariáveis (CDR).

[074] O termo “tratamento de bissulfito” denota uma reação para a conversão de bases citosina em um ácido nucleico para bases uracila na presença de íons de bissulfito através do qual bases 5-metil-citosina não são significativamente convertidas. Essa reação para a detecção de citosina metilada é descrita em detalhes por Frommer et al. (Frommer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 1827-1831) e Grigg e Clark (Grigg, G.W e Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-436; Grigg, G.W., DNA Seq. 6 (1996) 189198). A reação de bissulfito contém uma etapa de desaminação e uma etapa de dessulfonação que podem ser conduzidas separadamente ou simultaneamente. A afirmação de que bases 5-metil-citosina não são significativamente convertidas deve somente levar em conta o fato de que não pode ser excluída uma pequena porcentagem de bases 5-metil-citosina que é convertida para uracila, embora se tenha a intenção de converter somente e exclusivamente as bases citosina (não metiladas).

[075] O termo “célula” denota uma célula na qual um ácido nucleico, por exemplo, que codifica um polipeptídeo, opcionalmente heterólogo, pode ser ou é introduzido/transfectado. O termo “célula” inclui tanto células procariontes, que são usadas para propagação de plasmídeos, como células eucariontes, que são usadas para a expressão de um ácido nucleico. Em uma realização, a célula é uma célula eucarionte e em uma realização adicional, a célula eucarionte é uma célula de mamífero. Em outra realização, a célula de mamífero é selecionada a partir do grupo de células de mamíferos que compreendem células CHO (por exemplo, CHO K1, CHO DG44), células BHK, células NS0, células SP2/0, células HEK 293, células HEK 293 EBNA, células PER.C6® e células COS. Como usado no presente pedido, a expressão “célula” inclui a célula sujeito e sua progênie. Dessa forma, o termo “célula” denota a célula sujeito principal e culturas derivadas a partir dessa, sem considerar o número de transferências. Entende-se também que toda progênie pode não ser precisamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. São incluídas, progênies variantes que têm a mesma função ou atividade biológica conforme selecionada para a célula originalmente transformada.

[076] O termo “sítio CpG” denota o dinucleotídeo CG dentro de um ácido nucleico que podem ser reconhecido pelas enzimas de metilação de uma célula e em que a citosina pode ser convertida em 5-metil citosina. Em uma realização, o sítio CpG está dentro de um ácido nucleico promotor.

[077] O termo “cassete de expressão” denota um construto que contém os elementos reguladores necessários, como promotores e sítios de poliadenilação, para expressão, pelo menos, do ácido nucleico contido em uma célula.

[078] O termo “plasmídeo de expressão” denota um ácido nucleico que fornece todos os elementos necessários para a expressão do(s) gene(s) estrutural(ais) compreendido(s) em uma célula. Tipicamente, um plasmídeo de expressão compreende uma unidade de propagação de plasmídeo procarionte, por exemplo, para E. coli, que compreende uma origem de replicação, e um marcador de seleção, um marcador de seleção eucarionte, e um ou mais cassetes de expressão para a expressão do(s) gene(s) estrutural(ais) de interesse em que cada um compreende um ácido nucleico promotor, um gene estrutural e um terminador de transcrição que inclui um sinal de poliadenilação. A expressão gênica é geralmente colocada sob o controle de um ácido nucleico promotor, e esse gene estrutural é conhecido por ser “ligado de maneira funcional” ao ácido nucleico promotor. De maneira similar, um elemento regulador e um ácido nucleico promotor central são ligados de maneira funcional se o elemento regulador modular a atividade do ácido nucleico promotor central.

[079] O termo “tempo de geração” denota o tempo necessário por uma célula para dividir e para produzir uma célula filha. Dessa forma, uma célula que se dividiu uma vez tem uma idade de uma geração. O termo “geração” denota o número de divisões celulares de uma célula.

[080] O termo “alta frequência” denota que nesse sítio de metilação a citosina é metilada com mais frequência que em outros sítios de metilação com base na análise da metilação de um número de significância estatística de células individuais ou clones de DNA, respectivamente. Esse número de significância estatística é, em uma realização, pelo menos 10 células individuais ou clones de DNA, respectivamente, em uma realização adicional pelo menos 15 células individuais ou clones de DNA, respectivamente, e em outra realização pelo menos 20 células individuais ou clones de DNA, respectivamente. Em uma realização, no máximo 400 células ou clones de DNA, respectivamente, são analisados.

[081] O termo “célula de produção em longo prazo” denota uma célula que produz um polipeptídeo, em uma realização um polipeptídeo heterólogo, de modo que a taxa de produção específica da célula seja quase constante por pelo menos 30 gerações. Em uma realização, a célula de produção em longo prazo tem uma produção específica que é quase constante por pelo menos 30 gerações, em outra realização por pelo menos 45 gerações e em uma realização adicional por pelo menos 60 gerações. Em uma realização, a célula de produção em longo prazo tem uma produção específica que é quase constante por pelo menos 60 gerações, em uma realização adicional por pelo menos 75 gerações e em outra realização adicional por pelo menos 90 gerações.

[082] O termo “metilação” denota um processo dentro de uma célula que foi transfectada com um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um promotor no qual uma citosina do ácido nucleico promotor é convertida para 5- metil citosina. Um ácido nucleico promotor em que pelo menos uma citosina é convertida em 5-metil citosina é denotada como ácido nucleico “metilado”.

[083] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes de anticorpos, por exemplo, que contêm mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo tudo ou parte dos loci da imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplares para produção de anticorpos monoclonais são descritos no presente pedido. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[084] O termo “ligado de maneira funcional” denota uma justaposição de dois ou mais componentes, em que os componentes então descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor e/ou enhancer são ligados de maneira funcional a uma sequência codificadora, se este atua em cis para controlar ou modular a transcrição da sequência ligada. Geralmente, mas não necessariamente, as sequências de DNA que são “ligadas de maneira funcional” são contíguas e, quando necessário para união a regiões codificadoras de proteínas como líder secretório e um polipeptídeo, contíguas e no quadro (de leitura). No entanto, embora um promotor ligado de maneira funcional esteja geralmente localizado a montante da sequência codificadora, ele não é necessariamente contíguo a ela. Enhancers não precisam ser contíguos. Um enhancer é ligado de maneira funcional a uma sequência codificadora se o enhancer aumentar a transcrição da sequência codificadora. Enhancers ligados de maneira funcional podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante das sequências codificadoras e a uma distância considerável do promotor. Um sítio de poliadenilação é ligado de maneira funcional a uma sequência codificadora se estiver localizado na extremidade a jusante da sequência codificadora de modo que a transcrição prossiga através da sequência codificadora na sequência de poliadenilação. Um códon de parada de tradução é ligado de maneira funcional a uma sequência de ácido nucleico exônica, se esta estiver localizada na extremidade a jusante (extremidade 3’) da sequência codificadora, de modo que a tradução prossiga através da sequência codificadora até o códon de parada e é finalizada lá. A ligação é realizada por métodos recombinantes conhecidos na técnica, por exemplo, com o uso da metodologia de PCR e/ou por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios de restrição convenientes não existem, então os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são usados de acordo com as práticas convencionais.

[085] O termo “polipeptídeo” denota um polímero que consiste em aminoácidos unidos por pontes peptídicas, tanto produzidos naturalmente como sinteticamente. Polipeptídeos menores que cerca de 20 resíduos de aminoácidos podem ser citados como “peptídeos”, enquanto que moléculas que consistem em dois ou mais polipeptídeos ou que compreendem um polipeptídeo de mais de 100 resíduos de aminoácidos podem ser citados como “proteínas”. Um polipeptídeo também pode compreender componentes não aminoácidos, como os grupos de carboidrato, íons metálicos ou ésteres de ácido carboxílico. Os componentes não aminoácidos podem ser adicionados pela célula, na qual o polipeptídeo é expresso, e podem variar com o tipo de célula. Polipeptídeos são definidos no presente pedido em termos de sua estrutura de esqueleto de aminoácidos ou do ácido nucleico que codifica o mesmo. Adições como grupos de carboidratos, geralmente não são especificadas, mas podem estar presentes apesar de tudo.

[086] O termo “variante” de um ácido nucleico promotor denota que dentro do ácido nucleico promotor um ou mais nucleotídeos são alterados sem interferir com a função do ácido nucleico promotor. Essa alteração pode ser para a remover ou introduzir um sítio de restrição.

[087] O termo “produzir” denota a expressão de um gene estrutural inserido em um cassete de expressão em uma célula. O termo inclui os processos de transcrição e tradução do ácido nucleico. A produção é realizada em células procariontes ou eucariontes apropriadas e o polipeptídeo expresso, isto é, produzido, pode ser recuperado a partir das células após a lise ou a partir do sobrenadante da cultura.

[088] O termo “ácido nucleico promotor” denota a uma sequência de polinucleotídeo que controla transcrição de um gene/gene estrutural ou sequência de ácido nucleico ao qual ele é ligado de maneira funcional. Um ácido nucleico promotor inclui sinais para ligação de RNA polimerase e iniciação da transcrição. O ácido nucleico promotor usado será funcional na célula em que a expressão do gene estrutural selecionado é contemplada. Um grande número de ácidos nucleicos promotores, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e repressíveis de uma variedade de fontes diferentes, são bem conhecidos na técnica (e identificados no banco de dados como GenBank) e estão disponíveis como, ou dentro de polinucleotídeos clonados (por exemplo, de depósitos como ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais).

[089] Tipicamente, um ácido nucleico promotor está localizado na região codificadora ou não traduzida 5’ de um gene, próximo ao sítio de iniciação da transcrição do gene estrutural. Elementos de sequência dentro de ácidos nucleicos promotores que funcionam na iniciação da transcrição são muitas vezes caracterizados por sequências de nucleotídeos consenso. Esses elementos incluem sítios de ligação de RNA polimerase, sequências TATA, sequências CAAT, elementos específicos de diferenciação (DSEs), elementos de resposta de AMP cíclico (CREs), elementos de resposta de soro (SREs), elementos de resposta de glicocorticoide (GREs) e sítios de ligação para outros fatores de transcrição, como CRE/ATF, AP2, SP1, proteína de ligação de elemento resposta cAMP (CREB) e fatores de octâmeros. Se um ácido nucleico promotor é um ácido nucleico promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução, como um ácido nucleico promotor de CMV seguido por dois sítios operadores de tet, a metalotioneína e ácidos nucleicos promotores de choque térmico. A taxa de transcrição não é regulada por um agente de indução se o ácido nucleico promotor é um ácido nucleico promotor constitutivamente ativo. Entre os ácidos nucleicos promotores eucariontes que têm sido identificados como ácidos nucleicos promotores fortes para expressão estão o ácido nucleico promotor inicial de SV40, o ácido nucleico promotor final principal de adenovírus, o ácido nucleico promotor de metalotioneína-I de camundongo, a repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous, o fator de alongamento de hamster chinês alfa 1 (CHEF-1), EF-1 alfa humano, ubiquitina, ácido nucleico promotor principal-imediato-inicial de citomegalovírus humano (MIE de hCMV).

[090] O termo “marcador de seleção” denota um ácido nucleico que permite que as células que carregam o mesmo sejam especificamente selecionadas para ou contra, na presença de um agente de seleção correspondente. Tipicamente, um marcador de seleção irá conferir resistência a uma droga ou compensar para um defeito metabólico ou catabólico na célula em que é introduzido. Um marcador de seleção pode ser positivo, negativo ou bifuncional. Um marcador de seleção positiva útil é um gene de resistência a antibiótico que permite a seleção de células transformadas com isto na presença do agente de seleção correspondente, por exemplo, o antibiótico. Uma célula não transformada não é capaz de crescer ou sobreviver sob as condições seletivas, isto é, na presença do agente de seleção. Marcadores de seleção negativos permitem que as células carreguem o marcador a ser seletivamente eliminado. Marcadores de seleção usados com células eucariontes incluem, por exemplo, os genes estruturais que codificam aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), como por exemplo, a higromicina (hyg), neomicina (neo) e marcadores de seleção G418, diidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (tk), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (agente de seleção indol), histidinol desidrogenase (agente de seleção histidinol D) e ácidos nucleicos que conferem resistência à puromicina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, Zeocin e ácido micofenólico.

[091] O termo “taxa de produção em curto prazo” denota a quantidade de polipeptídeo produzido por uma célula única dentro de um dia conforme determinado a partir da quantidade de polipeptídeo produzido dentro de um dado período de tempo e a densidade de células viáveis, em que o período de tempo é curto. Em uma realização, o cultivo de curto prazo é para 2 a 20 dias, em outra realização, para 4 a 15 dias, e ainda em uma realização adicional, para 10 a 14 dias.

[092] O termo “taxa de produção específica” ou “ taxa de produção” denota a quantidade de polipeptídeo produzido por uma célula única dentro de um dia conforme determinado a partir da quantidade de polipeptídeo produzido dentro de um dado período de tempo e a densidade de células viáveis. A taxa de produção específica (SPR) pode ser calculada com o uso da seguinte fórmula: SPR = P2-P1/((D2+D1)/2*Δt) (Fórmula 2)

[093] Com: - SPR (pg/célula/d): taxa de produção específica, - Pi (μg/mL): concentração de polipeptídeo no início do período de tempo, - P2 (μg/mL): concentração de polipeptídeo no fim do período de tempo, - Di (células/mL): densidade de células viáveis no início do período de tempo, - D2 (células/mL): densidade de células viáveis no fim do período de tempo, - Δt (d): duração do período de tempo. -

[094] O termo “gene estrutural” denota a região de um gene sem uma sequência sinal, isto é, a região codificadora.

B. OS MÉTODOS CONFORME RELATADO NO PRESENTE PEDIDO

[095] Linhagens celulares/clones celulares que produzem um polipeptídeo, isto é, células transfectadas com um ácido nucleico que compreende um cassete de expressão que contém um gene estrutural que codifica um polipeptídeo heterólogo, podem ser agrupados em diferentes classes: Em uma primeira classe de células a taxa de produção específica é quase constante ao longo de gerações múltiplas. Ao contrário disto, na segunda classe de células a taxa de produção específica está diminuindo, especialmente diminuindo de forma monótona, com cada geração ao longo de múltiplas gerações. Sem se ater a essa teoria, a diminuição de produtividade de células que produzem polipeptídeo e linhagens celulares, respectivamente, é causado pelo menos em parte pela constantemente crescente metilação e com isto inativação/silenciamento do ácido nucleico promotor ligado de maneira funcional ao gene estrutural que codifica o polipeptídeo de interesse. Além disso, a diminuição pode ser por perda de cópias do gene estrutural que codifica a proteína de interesse.

[096] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na constatação de que o dinucleotídeo CpG na posição 425 do promotor/ enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano (MIE de hCMV) (SEQ ID NO: 1) é frequentemente metilado em linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO) produtor de anticorpo instável. Isso pode ser usado como marcador para a predição de estabilidade de produção recombinante em longo prazo de um clone celular recombinante/linhagem celular que expressa uma proteína de interesse codificada por um gene estrutural ligado de maneira funcional a um promotor MIE de hCMV (por exemplo, de SEQ ID NO: 1).

[097] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que a modificação pós-traducional de histona adjacente ao promotor pode ser usada como marcador adicional para identificar linhagens celulares de expressão/produção estáveis. A presença de uma modificação de inativação é um marcador que o respectivo clone celular/linhagem celular é muito instável e apresentará um declínio em produtividade durante o curso futuro do cultivo que está acima da média (clone celular/linhagem celular de produção instável em longo prazo). Por outro lado, a presença de uma modificação de ativação é um marcador que o respectivo clone celular/linhagem celular é muito estável e apresentará um declínio em produtividade durante o curso futuro do cultivo que está abaixo da média (clone celular/linhagem celular de produção instável em longo prazo).

[098] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que usando uma combinação da metilação na posição 425 de SEQ ID NO: 1 e do nível relativo de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor, pode ser obtido um aprimoramento adicional na determinação de linhagens celulares recombinantes/clones celulares de produção estável em longo prazo.

8.1. METILAÇÃO DO PROMOTOR

[099] Descobriu-se que a presença de metilação detectável no ácido nucleico promotor do promotor MIE de CMV humano na posição 425 que é ligado de maneira funcional ao gene estrutural que codifica um polipeptídeo fornece informação relativa à produtividade em longo prazo da linhagem celular ou clone celular, respectivamente.

[0100] Cada ácido nucleico promotor usado para a expressão de um gene estrutural compreende sítios que tendem a metilação pelas enzimas das células, nas quais ele foi introduzido mesmo que o ácido nucleico promotor não esteja protegido por elementos protetores. Um sítio receptivo a metilação é denominado sítio CpG e compreende/consiste no dinucleotideo CG. Mas nem todos os sítios CpG são metilados com a mesma frequência relativa - alguns dos sítios CpG são metilados com mais frequência do que outros. Descobriu-se que certos sítios, por exemplo, dentro do promotor MIE de CMV humano são metilados com frequência diferente e têm um impacto diferente no silenciamento do promotor.

[0101] O seguinte método pode ser usado para identificar um sítio CpG em uma sequência de ácido nucleico: 1) fornecer uma célula com uma taxa de produção de um polipeptídeo que tem depois de um tempo de cultivo de 30 gerações da célula na ausência de um agente de seleção menos que 90% da taxa de produção da célula após a primeira geração de cultivo, 2) isolar separadamente o DNA de pelo menos 10 células de um cultivo da célula de 1), 3) modificar a citosina do DNA isolado por tratamento de bissulfito, 4) identificar um sítio CpG dentro do ácido nucleico promotor ligado de maneira funcional ao gene estrutural que codifica o polipeptídeo com uma frequência de metilação de pelo menos 0,2 com base no DNA obtido na etapa 3) e identificar assim um sítio CpG.

[0102] Um critério, isto é, em uma realização, para um clone celular/linhagem celular instável é uma taxa de produção do clone celular/linhagem celular após um tempo de cultivo de 30 a 60 gerações de 60% ou menor que a taxa de produção do clone celular/linhagem celular após a primeira geração de cultivo.

[0103] Em uma realização, a linhagem celular tem uma taxa de produção após 30 a 60 gerações em cultivo de mais de 60% da taxa de produção no início do cultivo.

[0104] A etapa de modificar a citosina do DNA isolado por tratamento de bissulfito pode incluir as seguintes etapas: 3-a) incubar o DNA isolado na presença de íons de sulfito através do qual o DNA é desaminado, e 3-b) incubar o DNA desaminado sob condições alcalinas através do qual o DNA é dessulfonado.

[0105] Um método para obter um clone celular/linhagem celular que produz um polipeptídeo é um processo que compreende pelo menos uma etapa de transfecção e pelo menos uma etapa de seleção incluindo depósito de célula única de células transfectadas com êxito tanto diretamente após a transfecção como depois de crescimento na presença de um agente de seleção. Na etapa de seleção, as células são identificadas com base na sua taxa de produção específica em curto prazo, por exemplo, com base na concentração de polipeptídeo no sobrenadante após um cultivo em curto prazo. Entre as células selecionadas, algumas têm uma taxa de produção específica que é quase constante ao longo de múltiplas gerações e outras têm uma taxa de produção específica que é decrescente de maneira monótona ao longo de múltiplas gerações. Portanto, com os critérios de seleção geralmente aplicados (curto prazo), nenhuma seleção específica de uma célula ou células com uma produtividade em longo prazo estável pode ser feita.

[0106] Nos métodos, conforme relatado no presente pedido, qualquer clone celular/linhagem celular obtido por transfecção com um plasmídeo de expressão que compreende um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico promotor ligado de maneira funcional a um gene estrutural que codifica um polipeptídeo de interesse a ser produzido pela célula transfectada pode ser analisado. O plasmídeo de expressão geralmente compreende também um marcador de seleção. Dessa forma, as células são cultivadas na presença de um agente de seleção após a etapa de transfecção e antes da etapa de seleção. De maneira alternativa, o método pode compreender cultivar as células sem a deposição prévia de uma célula única ou diluição limitada, isto é, como grupo, na presença de um agente de seleção. Ainda de maneira alternativa, o método pode compreender cultivar as células após a deposição de célula única ou diluição limitada.

[0107] Após o cultivo/seleção de grupo, uma deposição de célula única tem de ser realizada. Se a deposição de célula única é realizada após uma etapa de cultivo de grupo, as células também são ainda cultivadas após a deposição da célula única.

[0108] A fim de identificar linhagens celulares ou clones celulares com uma taxa de produção específica que é quase constante ao longo de múltiplas gerações, a concentração de polipeptídeo no sobrenadante e a densidade celular viável têm de ser determinada em tempos de cultivo definidos em um cultivo em longo prazo ao longo de múltiplas gerações. Portanto, os métodos adequados são conhecidos para um técnico no assunto, como ELISA e FACS, respectivamente.

[0109] Um sítio CpG com uma frequência de metilação alta pode ser identificado por tratamento com bissulfito de DNA de fita simples, por exemplo, em pH 5,0, com posterior dessulfurização alcalina. No presente pedido, sítios CpG metilados e não metilados podem ser discriminados. Sob condições de tratamento específicas, citosina, mas não 5-metil-citosina é desamidada na posição 4 do N-heterociclo e convertida em uracila. Fitas de DNA complementares são convertidas em duas fitas, fita A e fita B, que não são mais complementares. A determinação pode ser baseada em qualquer uma dessas fitas.

[0110] Esse cultivo em longo prazo deve ser realizado apenas uma vez para o ácido nucleico promotor ou combinação de ácido nucleico e linhagem celular. Se o mesmo ácido nucleico promotor ou uma combinação de célula e promotor for usada uma segunda vez, a seleção pode ser baseada nos dados já coletados.

[0111] Uma série de técnicas pode ser aplicada para revelar diferenças de sequência entre alelos metilados e não metilados após tratamento com bissulfito. Por exemplo, a sequência de interesse (tanto a fita A como fita B) pode ser amplificada por PCR sob condições específicas de não metilação, isto é, com primer não sensível a sítios metilados e subsequentemente analisado por métodos como sequenciamento de DNA (com ou sem clonagem), análise de ponto de fusão de alta resolução ou análise de microarranjo. Em outra realização, pode ser realizada uma PCR quantitativa (qPCR) com primer ou sondas sensíveis à metilação ou específicas para metilação. Em uma abordagem alternativa, o DNA metilatado é precipitado com anticorpos específicos para 5-metil citosina seguido por uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.

[0112] A PCR específica para metilação (MSP) também pode ser usada para endereçar a sequência de DNA tratado com bissulfito diretamente sem amplificação por PCR anterior da região de interesse. Os primers usados em MSP devem compreender um ou mais sítios CpG. Eles são tanto complementares para 5-metil-citosina não convertida para a detecção de DNA metilado como complementares para uracila convertida a partir de citosina para a detecção de DNA não metilado.

[0113] A metilação do sítio CpG é determinada para uma série de células. Em uma realização, o número de células é pelo menos 10, em outra realização, pelo menos 15, e em uma realização adicional, pelo menos 20. Depois a frequência de metilação para o sítio CpG é calculada, isto é, o número de células metiladas naquele sítio CpG dividido pelo número total de células analisadas é calculado. Um sítio CpG com uma frequência de metilação alta é um sítio CpG que tem uma frequência de metilação de no mínimo 0,2, em uma realização, de pelo menos 0,25, em uma realização, de pelo menos 0,4 e em uma realização preferencial, de pelo menos 0,5.

[0114] Descobriu-se que mesmo níveis baixos de ácido nucleico promotor metilado, isto é, acima de um valor de limiar pré-determinado, em uma célula ou linhagem celular usada para a produção de um polipeptídeo pode ser usado para prever uma diminuição na produtividade durante o cultivo em longo prazo.

[0115] Na Figura 1, é mostrado o número de sítios CpG metilados do mesmo ácido nucleico promotor obtido a partir de células diferentes.

[0116] O promotor MIE de CMV humano como uma sequência de ácido nucleico conforme representado a seguir (sítios CpG estão sublinhados): ATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTA CGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGAC GTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCA AGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATG GCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAGCATGGTGATGCGGTTTTG GCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAA GTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAAC GGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGC GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCCGTTTAGTGA ACG.

[0117] (SEQ ID NO: 1).Na SEQ ID NO: 1 trinta e três sítios CpG estão presentes, os quais são sítios potenciais para metilação de ácido nucleico. Com o método conforme esboçado acima, podem ser identificados resíduos de citosina dentro do promotor MIE CMV humano que são predominantemente metilados.

[0118] A fita A com todos os sítios CpG preservados tem a sequência de nucleotídeos: ATGTTGATATTGATTATTGATTAGTTATTAATAGTAATTAATTAC GGGGTTATTAGTTTATAGTTTATATATGGAGTTTCGCGTTATATAATTTACG GTAAATGGTTCGTTTGGTTGATCGTTTAACGATTTTCGTTTATTGACGTTAA TAATGACGTATGTTTTTATAGTAACGTTAATAGGGATTTTTTATTGACGTTAA TGGGTGGAGTATTTACGGTAAATTGTTTATTTGGTAGTATATTAAGTGTATT ATATGTTAAGTACGTTTTTTATTGACGTTAATGACGGTAAATGGTTCGTTTG GTATTATGTTTAGTATATGATTTTATGGGATTTTTTTATTTGGTAGTATATTTA CGTATTAGTTATCGTTATTAGTATGGTGATGCGGTTTTGGTAGTATATTAAT GGGCGTGGATAGCGGTTTGATTTACGGGGATTTTTAAGTTTTTATTTTATTG ACGTTAATGGGAGTTTGTTTTGGTATTAAAATTAACGGGATTTTTTAAAATG TCGTAATAATTTCGTTTTATTGACGTAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTG GGAGGTTTATATAAGTAGAGTTTCGTTTAGTGAACG.

[0119] (SEQ ID NO: 2) e a fita A completamente desaminada tem a sequência de nucleotídeos: ATGTTGATATTGATTATTGATTAGTTATTAATAGTAATTAATTAT GGGGTTATTAGTTTATAGTTTATATATGGAGTTTTGTGTTATATAATTTATGG TAAATGGTTTGTTTGGTTGATTGTTTAATGATTTTTGTTTATTGATGTTAATA ATGATGTATGTTTTTATAGTAATGTTAATAGGGATTTTTTATTGATGTTAATG GGTGGAGTATTTATGGTAAATTGTTTATTTGGTAGTATATTAAGTGTATTATA TGTTAAGTATGTTTTTTATTGATGTTAATGATGGTAAATGGTTTGTTTGGTAT TATGTTTAGTATATGATTTTATGGGATTTTTTTATTTGGTAGTATATTTATGTA TTAGTTATTGTTATTAGTATGGTGATGTGGTTTTGGTAGTATATTAATGGGT GTGGATAGTGGTTTGATTTATGGGGATTTTTAAGTTTTTATTTTATTGATGTT AATGGGAGTTTGTTTTGGTATTAAAATTAATGGGATTTTTTAAAATGTTGTAA TAATTTTGTTTTATTGATGTAAATGGGTGGTAGGTGTGTATGGTGGGAGGT TTATATAAGTAGAGTTTTGTTTAGTGAATG.

[0120] (SEQ ID NO: 3). A fita B com todos os sítios CpG preservados tem a sequência de nucleotídeos: CGTTTATTAAACGGAGTTTTGTTTATATAGATTTTTTATCGTAT ACGTTTATCGTTTATTTGCGTTAATGGGGCGGAGTTGTTACGATATTTTGGA AAGTTTCGTTGATTTTGGTGTTAAAATAAATTTTTATTGACGTTAATGGGGT GGAGATTTGGAAATTTTCGTGAGTTAAATCGTTATTTACGTTTATTGATGTA TTGTTAAAATCGTATTATTATGTTAATAGCGATGATTAATACGTAGATGTATT GTTAAGTAGGAAAGTTTTATAAGGTTATGTATTGGGTATAATGTTAGGCGG GTTATTTATCGTTATTGACGTTAATAGGGGGCGTATTTGGTATATGATATAT TTGATGTATTGTTAAGTGGGTAGTTTATCGTAAATATTTTATTTATTGACGTT AATGGAAAGTTTTTATTGGCGTTATTATGGGAATATACGTTATTATTGACGT TAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTTAGTTAGGCGGGTTATTTATCGTAA GTTATGTAACGCGGAATTTTATATATGGGTTATGAATTAATGATTTCGTAAT TGATTATTATTAATAATTAGTTAATAATTAATGTTAATAT.

[0121] (SEQ ID NO: 4) e a fita B na forma completamente desaminada tem a sequência de nucleotídeos: TGTTTATTAAATGGAGTTTTGTTTATATAGATTTTTTATTGTATA TGTTTATTGTTTATTTGTGTTAATGGGGTGGAGTTGTTATGATATTTTGGAA AGTTTTGTTGATTTTGGTGTTAAAATAAATTTTTATTGATGTTAATGGGGTG GAGATTTGGAAATTTTTGTGAGTTAAATTGTTATTTATGTTTATTGATGTATT GTTAAAATTGTATTATTATGTTAATAGTGATGATTAATATGTAGATGTATTGT TAAGTAGGAAAGTTTTATAAGGTTATGTATTGGGTATAATGTTAGGTGGGTT ATTTATTGTTATTGATGTTAATAGGGGGTGTATTTGGTATATGATATATTTGA TGTATTGTTAAGTGGGTAGTTTATTGTAAATATTTTATTTATTGATGTTAATG GAAAGTTTTTATTGGTGTTATTATGGGAATATATGTTATTATTGATGTTAATG GGTGGGGGTTGTTGGGTGGTTAGTTAGGTGGGTTATTTATTGTAAGTTATG TAATGTGGAATTTTATATATGGGTTATGAATTAATGATTTTGTAATTGATTAT TATTAATAATTAGTTAATAATTAATGTTAATAT.

[0122] (SEQ ID NO: 5).

[0123] Na Figura 4, é mostrada a frequência de metilação em sítios CpG individuais em diferentes linhagens celulares. Os números foram determinados por análise de 19 a 22 clones diferentes obtidos a partir de diferentes linhagens celulares parentais de CHO após transfecção com um plasmídeo que compreende um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse. É mostrado o padrão de metilação de DNAs únicos (inferior) e a frequência de metilação em sítios CpG únicos (superior) para cada linhagem celular. A linhagem celular K18.1, por exemplo, é altamente metilada (Figura 4A). A frequência de metilação não é igual nos sítios CpG diferentes, mas parece ter centros em 3 agrupamentos, isto é, na extremidade 5’, na extremidade 3’ e ao redor da posição (ou nucleotídeo, respectivamente) 400. Quatorze dentre 22 insertos sequenciados tinham uma citosina na posição 425. A metilação do ácido nucleico promotor na linhagem celular 43-16 A10 é mostrada na Figura 4E. A distribuição de metilação é similar à distribuição observada na linhagem celular K18.1. Assim como K18.1 a posição 425 foi metilada a maioria das vezes: cinco de vinte insertos sequenciados continham uma citosina nessa posição.

[0124] Em três outras linhagens celulares analisadas, a citosina é detectada esporadicamente, isto é, como eventos únicos, em diferentes sítios CpG (Figuras 4B, 4C e 4D). Para obter significância estatística para linhagens celulares com uma frequência de metilação global baixa, seria necessário o sequenciamento de centenas de insertos. Adicionalmente, esses eventos únicos também podem representar eventos falsos positivos devido à desaminação de citosina incompleta ao invés de metilação do promotor real.

[0125] Para determinação confiável de metilação específica da posição de CpG, foi desenvolvido um método de PCR específica para metilação. Para os primers de PCR específicos para metilação, conforme mostrado na Tabela 1 a seguir podem ser usados. Esses primers tanto sozinhos como em combinação também são aspectos conforme relatados no presente pedido. TABELA 1

[0126] No curso da avaliação do primer, descobriu-se que os pares de primers específicos para metilação, que são altamente seletivos para o DNA promotor de CMV desamidado com uma citosina na posição 425, diferem em suas propriedades (consulte a Figura 6). Em uma realização, os primers para a PCR específico para metilação têm a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 18.

[0127] Dessa forma, em uma realização dos métodos, conforme relatado no presente pedido, é o ácido nucleico promotor do ácido nucleico promotor de CMV humano de SEQ ID NO: 1. Em uma realização, o sítio CpG com frequência de metilação alta são os sítios CpG na posição (bp) 425 de SEQ ID NO: 1. TABELA 2 RESULTADOS ESPERADOS PARA PARES DE PRIMERS ESPECÍFICOS PARA METILAÇÃO (MSP) E PAR DE PRIMERS UNIVERSAL EM QPCR

[0128] O par de primers universal deve amplificar todos os quatro moldes, enquanto o par de primers MSP deveria amplificar seletivamente o molde n° 62 (SEQ ID NO: 22) e molde n° 01 (SEQ ID NO: 23). O valor de ΔCp deveria tão pequeno quanto possível entre o par de primers MSP e o par de primers universal no molde n° 62 e no molde n° 01. Por contraste, os valores de Cp obtidos com o par de primers MSP nos moldes n° 11 (SEQ ID NO: 21) e n° 04 (SEQ ID NO: 24) deveriam ser tão alto quanto possível, isto é, ΔCp em comparação à amplificação com o par de primers universal deveria ser máximo.

[0129] O primer específico para metilação deveria ser capaz de detectar 5-metil citosina na posição 425 de maneira seletiva, apesar de duas posições de metilação adicionais estarem presentes na posição 416 e 437.

[0130] A determinação da metilação é possível com uma frequência de metilação de 1% a 100%.

[0131] Resultados comparáveis em relação à extensão de metilação foram observados com uma PCR específica para metilação e por clonagem e sequenciamento, através do qual a PCR específica para metilação é muito mais sensível. Linhagens celulares com uma produtividade decrescente na produção em longo prazo têm uma metilação na posição 425 com uma frequência de metilação acima de um valor de limiar. O valor de limiar é, em uma realização, duas vezes o ruído de fundo do método de determinação. Uma linhagem celular com produtividade estável em longo prazo tem uma frequência de metilação no sítio CpG que está abaixo do valor de limiar.

[0132] Para a análise de ponto de fusão de alta resolução, o ácido nucleico promotor é amplificado, a partir da posição 334 até a posição 487, isto é, 154 bps. Uma análise de ponto de fusão exemplar é mostrada na Figura 10A e sua primeira derivada na Figura 10B. Pode-se notar que com uma análise do ponto de fusão de alta resolução, um ácido nucleico promotor metilado (molde n° 16, SEQ ID NO: 25) pode ser distinguido de um ácido nucleico promotor não metilatado (molde n° 11). O fragmento de ácido nucleico promotor metilado pode ser detectado em uma frequência relativa de 50% ou mais. O fragmento promotor não metilado pode ser detectado em uma frequência relativa de 10% ou mais.

[0133] Esses dados mostram que a estabilidade de produção de linhagens celulares CHO recombinantes que contêm genes introduzidos de maneira recombinante, cuja expressão é dirigida pelo promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano pode ser previsto medindo do status de metilação da citosina na posição 425.

[0134] Dessa forma, descobriu-se que a determinação da metilação C425 pode ser usada como um marcador preditivo para determinar a estabilidade da expressão de polipeptídeos em clones celulares recombinantes gerados. Isso permite a seleção de clones estáveis com produtividade estável durante o desenvolvimento da linhagem celular. Descobriu-se ainda que a metilação C425 de 5% ou menos é um critério adequado para a seleção de clones celulares estáveis (isto leva em conta o limiar do método de detecção usado). Descobriu-se também que a fração de clones celulares que são falsamente previstos (clones celulares falso negativos) pode ser reduzida cultivando-os por algum tempo na ausência de MTX antes de testar.

[0135] Dessa forma, no presente pedido é relatado um método para o enriquecimento de linhagens celulares que expressam polipeptídeos recombinantes em longo prazo (estáveis) a partir de uma população de células transfectadas por seleção de células que têm uma metilação de promotor relativa na posição 425 de SEQ ID NO: 1 de 5% ou menos. Essa frequência de metilação relativa pode ser determinada com o uso de um método de qPCR específico para metilação, conforme relatado no presente pedido com os primers, conforme relatado no presente pedido.

[0136] Tendo estabelecido um método de PCR sensível e preciso para quantificar a metilação de nucleotídeo MIE de hCMV no sítio CpG 425, a metilação em linhagens celulares CHO recombinantes K18.1, 43 16 A10 e G45-2 foi avaliada. O DNA tratado com bissulfito que foi analisado por sequenciamento foi usado como molde na qPCR em tempo real específica para metilação, tanto diretamente como após amplificação por PCR da região MIE de hCMV completa (Figuras 8A e 8B). As duas estruturas de ensaio forneceram resultados comparáveis. De maneira mais importante, os resultados se correlacionaram bem com os resultados de sequenciamento de bissulfito. Isso demonstra que o ensaio de qPCR específico para metilação do sítio CpG 425 pode ser usado para medir a metilação MIE de hCMV no sítio CpG 425 nas linhagens celulares CHO recombinantes e pode ser usado sem amplificação por PCR prévia do DNA alvo.

[0137] No principal, outros sítios CpG dentro do DNA do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV poderiam ser explorados para prever instabilidade de produção. No entanto, descobriu-se que a metilação em C425 é aproximadamente 5 vezes maior do que a metilação média em todos os sítios CpG. Além disso, alguns sítios não foram metilados na totalidade, mesmo em clones celulares altamente metilados, por exemplo, C280 e C289 (Figura 4F, 4J e 13). Ao escolher o correto, isto é, sítio CpG frequentemente modificado para análise de metilação do promotor, o ensaio torna-se mais sensível. A metilação significativa dos clones C25-17, G25-10 e 43-16 A10 que é de cerca de 10% poderia provavelmente ser perdida, se um sítio CpG fosse escolhido aleatoriamente para análise.

[0138] A predição de estabilidade abordando o estado de metilação de sítios CpG relevantes dentro de um ácido nucleico promotor também pode ser usada com outros ácidos nucleicos promotores heterogênicos.

[0139] Para avaliar uma correlação potencial de metilação do promotor inicial e instabilidade de produção, a metilação do sítio CpG 425 no início de um estudo de estabilidade foi plotada contra a alteração relativa de qP na presença ou na ausência de um agente de seleção (MTX). As plotagens de correlação são mostradas nas Figuras 11A (com MTX) e 11B (sem MTX). Para a avaliação, as áreas plotadas foram divididas em quatro compartimentos com limites a 5% de metilação - igualando as duas a três vezes o fundo da medição de metilação, isto é, o limite de detecção - e 40% de diminuição em qP - que representa o limite de aceitação de estabilidade de produção (isto também é uma realização do método, conforme relatado no presente pedido). Foi determinado o número de clones nos diferentes compartimentos. A análise de contingência do estado de estabilidade por estado de metilação com o uso de um teste chi-quadrado de Pearson demonstrou uma associação significativa com um valor-p de 0,05 para cultivo com MTX e uma tendência com um valor-p de 0,13 para cultivo sem MTX. Constatou-se que a maioria dos clones com menos de 5% de metilação no sítio CpG 425 foram encontrados na fração de clones estáveis (menos de 40% de diminuição em qP com ou sem MTX, mostrado nos compartimentos superior esquerdo).

[0140] Dessa forma, resumindo o acima, a perda de produtividade durante o cultivo em longo prazo e o aumento de escala é um risco maior no desenvolvimento de linhas celulares de fabricação. Portanto, existe uma necessidade para marcadores moleculares de instabilidade de produção que possam ser determinados e examinados rapidamente e facilmente. Descobriu- se que a metilação do promotor pode ser empregada para prever uma perda de produtividade em linhagens celulares CHO recombinantes. Para avaliar isso, foi analisada a metilação de DNA de sítios CpG 33 dentro de uma região de 603 bp do amplamente usado promotor/enhancer MIE de hCMV. O nível de metilação total da região investigada variou entre aproximadamente 1% e 18% de todos os sítios CpG. Um por cento de metilação aparente representa o fundo realizável de tecnicamente que resulta de desaminação incompleta de citosinas não metiladas. Além disso, dentro dos promotores metilados, o nível de metilação varia consideravelmente entre os sítios CpG individuais e acumula-se em três agrupamentos com um máximo no sítio CpG 425. A metilação no sítio CpG 425 é aproximadamente 5 vezes maior do que o grau médio de metilação de todos os outros sítios CpG. Por outro lado, alguns sítios CpG aparentam estar completamente não metilados, mesmo em linhagens celulares altamente metiladas. A metilação total de MIE de hCMV, bem como a distribuição da metilação entre sítios CpG individuais pode variar consideravelmente entre os tipos de células e tecidos (consulte, por exemplo Kong, Q., et al., PLoS One 4 (2009) e6679; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Mehta, A.K., et al., Gene 428 (2009) 20-24).

[0141] Descobriu-se que a metilação dominante do sítio CpG 425 é adequada como marcador para metilação de MIE de hCMV. Estabeleceu-se uma qPCR específica para metilação do sítio CpG 425 como um método rápido e sensível com rendimento médio. Ao analisar um grande número de linhagens celulares por qPCR específica para metilação do sítio CpG 425, descobriu-se que a maioria dos produtores instáveis exibiu mais de 5% de metilação no sítio CpG 425, mesmo antes do cultivo em longo prazo, enquanto que a maioria dos produtores estáveis demonstrou menos de 5% de metilação nesse sítio.

[0142] A metilação precoce do sítio CpG 425 foi exclusivamente encontrada com clones que carregam mais de dez cópias do plasmídeo heterólogo. Os relatórios anteriores forneceram alguma evidência de que as repetições em tandem de cópias do transgene múltiplas são mais suscetíveis à metilação e silenciamento em células de mamíferos (Garrick, D., et al., Nat. Genet. 18 (1998) 56-59, McBurney, M.W., et al., Exp. Cell Res. 274 (2002) 1-8).

8.2. ACILAÇÃO DE HISTONA

[0143] As quantidades relativas de modificações de histona próximas ao promotor MIE de hCMV foram determinadas. Os marcadores H3ac e H3K4me3 (marcadores de ativação) e H3K9me3 bem como os marcadores H3K27me3 (marcadores de repressão) foram examinados. Essas modificações de histona foram examinadas nas posições 404 a 507 de SEQ ID NO: 1 (sequência promotora de MIE de CMV humano; tacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactt), que indica uma sequência de -97 a -200 bp a montante do sítio de iniciação de transcrição e contém o sítio CpG na posição C-425 (por exemplo, - 179 bp a montante do sítio de iniciação de transcrição) e que pode ser amplificada com um par de primers 396/397.

[0144] Os níveis de acetilação relativa de histona 3 relativos ao nível de histona 3 próximo ao fragmento de promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano foram investigados como marcadores de predição para a estabilidade de produção com e sem agente de seleção.

[0145] Duas linhagens celulares congeladas exemplares do ponto inicial (Banco de Semente Primário) de cultivo foram descongeladas e foram determinadas as quantidades relativas de modificações de histona especificada próximas ao promotor MIE de hCMV. O projeto T e o projeto H foram executados de maneira independente e cada linhagem celular foi cultivada por pelo menos 60 gerações sob condições com (+) e sem (-) agente de seleção (metotrexato 250 nM).

[0146] Os dados da taxa de metilação do promotor MIE de hCMV (mC-425), o número de cópias por célula a partir de (PSB), bem como a porcentagem de alteração ao longo de 60 gerações de produtividade específica (ΔqP) foram determinados. O registro de dados foi feito conforme descrito previamente por Osterlehner et al.

TABELA DADOS DE 12 LINHAGENS CELULARES DO PROJETO T

[0147] mC-425 é a média de porcentagem de metilação de citosina na posição 425 a montante do sítio de iniciação de transcrição (TSS; - 179 relativo a TSS) de MIE de hCMV no início da fase de cultivo (PSB); ΔqP é a porcentagem de alteração de produtividade específica (qP) ao longo de um período de tempo de 60 gerações celulares; o número médio de cópias da cadeia leve (LC) do transgene de IgG foi medido no início do cultivo (PSB).

TABELA DADOS DE 20 PROJETOS DE LINHAGENS DE CÉLULAS H

[0148] mC-425 é a média de porcentagem de metilação de citosina na posição 425 a montante de TSS de MIE de hCMV no início da fase de cultivo (PSB); ΔqP é a porcentagem de alteração de produtividade específica (qP) ao longo de um período de tempo de 60 gerações celulares; o número médio de cópias da cadeia leve (LC) do transgene de IgG foi medido no início do cultivo (PSB).

[0149] Para investigação da quantidade relativa de modificação de histona, foram coletadas células CHO viáveis, que carregam o gene recombinante dirigido pelo promotor MIE de hCMV. Após fixação em cromatina lisada por formaldeído 3,7% foi sonicada e complexos DNA-histona reticulados foram purificados de acordo com a modificação de histona apropriada. Subsequentemente, os complexos DNA-histona acumulados foram degradados com proteinase K e fragmentos de DNA foram eluídos. As quantidades de vários fragmentos de DNA foram comparadas com qPCR com o uso de pares de primers específicos.

[0150] Para verificar a consistência de ligação anticorpo- histona em relação à modificação correspondente da região de referência, vários genes foram testados quanto a acúmulo de uma modificação de histona específica. Em primeiro, a quantidade de modificação de histona filtrada por anticorpo próxima às regiões de referência foi comparada com a amostra purificada de um controle sem anticorpo não específico (simulado) no projeto T e projeto H em uma amostra cada. Os fragmentos de DNA de amostras purificadas de anticorpo, simulado e amostra de entrada não tratada foram usadas como moldes para qPCR. Os pares de primers de regiões de referência potencial foram adicionados para cada amostra e qPCR foi realizada em triplicatas. Os valores Cq obtidos foram comparados como porcentagem da amostra de entrada. Em ambos os projetos, as amostras purificadas de anticorpo obtiveram valores mais altos do que o simulado na região apropriada. Isto confirmou a ligação adequada. Além disso, os marcadores de ativação H3ac e H3K4me3 se acumularam nas regiões ativas Eif3i e Gusb. Ao contrário, a região silenciada Fox2a teve concentração mais alta de H3K9me3 enquanto que H3K27me3 estava visivelmente localizada na região Gata5. As modificações de histona diferentes compatibilizaram com as regiões de controle correspondentes em ambos os projetos.

[0151] A estimativa de quantidade relativa de modificação de histona na região alvo é estritamente dependente de uma região de referência modificada estável.

[0152] A normalização de uma modificação de histona específica próxima ao promotor MIE de hCMV para uma sequência de referência permite a comparação de diferentes linhagens celulares. Para esse propósito, a sequência de referência tem que ter níveis robustos e reprodutíveis da respectiva modificação de histona.

[0153] Na tabela a seguir, os valores médios de Cq e o coeficiente de variação (CV) de todas as linhagens celulares, incluindo as três replicatas biológicas, são exibidos para o projeto T e o projeto H.

TABELA REGIÕES DE REFERÊNCIA NO PROJETO T E H

[0154] As médias e o coeficiente de variação (CV) apropriado dos valores de Cq de todas as amostras ChIP, incluindo as triplicatas biológicas, foram calculados para ambos os projetos; as linhas exibem as diferentes regiões de referência dentro do genoma; as colunas contêm as modificações de histona específicas; as regiões de controle escolhidas para as modificações epigenéticas apropriadas são marcadas em negrito; portanto, a distância de Cq para simulado e CV foi decisiva; em ambos os projetos, os marcadores de ativação H3ac, H3K4me3, bem como a histona 3 total são acumulados de maneira estável nas regiões Gusb e na EiF3i (CV de 2%); os valores inferiores de Cq determinam Gusb como referência para os marcadores de ativação; todas as regiões de referência potenciais tiveram valores estáveis totais de histona 3.

[0155] Gusb como a região de referência para modificação ativa de histona H3ac e H3K4me3 e Gata5 como uma região estável para H3K27me3 diferem para o controle simulado apropriado e tiveram valores de Cq consistentes. As regiões de controle ativas Eif3i e Gusb são altamente estáveis. Para todas as regiões de controle, foi observado um acúmulo estável de histona 3 total (H3).

[0156] As triplicatas biológicas das linhagens celulares CHO que expressam de maneira recombinante um projeto de anticorpo foram analisadas quanto à modificação da histona perto do local do promotor MIE de hCMV. Para isso, fragmentos de cromatina foram purificados com o uso de anticorpos contra modificações de histona específicas, digeridos para obter DNA genômico livre de proteína e quantificados por PCR em tempo real (consulte Figura 26). A normalização foi executada para cada região de referência usada. Para determinar a eficiência da amplificação de cada par de primers, foi usado o programa de computação LinReg PCR versão 2014.5 (Ruijter, 2009, LinRegPCR). As eficiências de amplificação de todos os pares de primers molde são bastante similares. Portanto, o método Livak foi usado para normalização, que assume eficiências de amplificação similares. TABELA EFICIÊNCIAS DE PRIMER

[0157] As eficiências de amplificação foram determinadas para todas as linhagens celulares, incluindo triplicatas biológicas; o par de primers (396/397) foi usado; para esse propósito os dados brutos de qPCR foram aplicados ao programa de computação LingRegPCR, versão 2014.5 e as eficiências foram calculadas; as linhas são diferenciadas pelos pares de primers diferentes; a coluna de média contém as médias de eficiências de amplificação de cada par de primers molde e a coluna Stdev contém o desvio padrão apropriado; as distâncias entre todas as eficiências de amplificação são menores que 2%, dessa forma, o método Livak foi usado para normalização.

[0158] A normalização por Livak compreende duas etapas de normalização: - na primeira etapa, a quantidade (Cq) de modificação de histona 3 próxima do promotor MIE de hCMV é normalizada para a quantidade (Cq) de modificação de histona 3 na região de referência — ΔCq - na segunda etapa, a modificação de histona 3 normalizada é ajustada para a histona 3 total normalizada próxima ao promotor MIE de hCMV —— ΔΔCq.

[0159] Isso finalmente exibe a quantidade relativa de modificação por histona 3 próxima ao promotor MIE de hCMV.

[0160] A histona 3 total é e estável em todas as regiões de referência, o que permite a normalização da modificação de histona e de histona 3 total com a mesma região de referência. Isso minimiza a variação dentro do processo de normalização. Por exemplo, a acetilação de Histona relativa por Histona 3 foi normalizada com a região de controle Gusb, já que a região Gusb compreende uma quantidade estável da histona modificada e da Histona 3 total. A seguinte fórmula foi usada para cálculo:

[0161] As quantidades relativas de modificação de histona por histona 3 (ΔΔCq) e histona 3 total (ΔCq) perto do promotor MIE de hCMV foram plotadas contra os valores de ΔqP. A histona 3 total próxima ao promotor MIE de hCMV foi normalizada para Gusb e filtrada contra os valores de ΔqP. Além disso, histona 3 por número de cópias relativo (H3/rCN) e de simulado por histona 3 (Mock/H3) foram examinados. Para os substratos H3/rCN, idealmente, o número de cópias é uma medição da densidade de histona 3 relativa (H3D) perto do promotor MIE de hCMV. Simulado/H3 é o efeito não específico de ruído de fundo por histona 3.

[0162] As correlações foram examinadas com um modelo padrão de ajuste de mínimos quadrados. Para essa finalidade, o programa de computação JMP10 (JMP®10.0.1 Release: 2, edição de 64 bits; SAS Institute Inc.) foi usado. TABELA MEDIÇÃO DO EFEITO DE MODIFICAÇÕES EPIGENÉTICAS NA ESTABILIDADE DE PRODUÇÃO EM LONGO PRAZO

[0163] Os valores-P do efeito no ΔqP com (+) e sem (-) pressão de seleção (250 nM MTX) são exibidos nas colunas; todos os efeitos são medidos perto do promotor MIE de hCMV e ordenados em linhas; os efeitos da histona 3 normalizada (H3), densidade da histona 3 por número relativo de cópias (H3/rCN), ruído de fundo por histona 3 (Simulado/H3) e modificações por histona 3 (H3ac/H3, H3K4me3/H3, H3K27me3/H3 e H3K9me3/H3) foram calculadas em um modelo padrão de quadrados mínimos com o software JMP10; no projeto H, a acetilação por histona 3 (H3ac/H3) teve um efeito altamente significativo sobre ΔqP se as células foram cultivadas sob pressão de seleção (+), e também os eventos H3/rCN, Mock/H3, H3K4me3, H3K27me3 e H3 resultaram em efeitos de significância moderada a alta sob ΔqP+ condição.

n.d. = não determinado

[0164] O grau de acetilação por histona 3 (H3ac/H3) no promotor MIE de hCMV teve um efeito altamente significante sobre a perda de produtividade, obtido ao longo de 60 gerações na presença do agente de seleção MTX.

[0165] Mais efeitos significativos (listados a partir do efeito mais fraco até o mais forte) foram observados para H3/rCN, Mock/H3, H3K4me3/H3, H3K27me3/H3 e H3. Em consideração aos níveis de efeito para Simulado/H3 e H3 sozinho, H3 sozinho teve uma influência dominante sobre o efeito combinado X/H3. Eventos epigenéticos com efeitos maiores do que o H3 sozinho foram descobertos como sendo um bom marcador de predição: ^H3ac/H3.

[0166] Foi realizada uma análise de valores discrepantes Jackknife. Através disso, um valor discrepante em triplicata foi descoberto em comparação a ΔqP de ambas as condições do agente de seleção. Em relação à análise, a linhagem celular H-18 foi excluída das medições de efeitos. Posteriormente, as amostras do projeto H foram analisadas novamente com o modelo de triagem de efeitos após a exclusão da linhagem celular H-18. Descobriu-se que a perda de acetilação por histona 3 (H3ac/H3) no promotor MIE de hCMV teve o efeito mais significante sobre a perda de produtividade, obtida ao longo de 60 gerações sob ambas as condições de seleção. TABELA MEDIÇÕES DE EFEITO DE MODIFICAÇÕES NA ESTABILIDADE EM LONGO PRAZO NO PROJETO H APÓS EXCLUSÃO DE LINHAGEM CELULAR DE VALOR DISCREPANTE H-18

[0167] Os valores P de efeito no ΔqP com (+) e sem (-) pressão de seleção (250 nM de MTX) são exibidos nas colunas; todos os efeitos são medidos perto promotor MIE de hCMV e ordenados em linhas; os efeitos de histona 3 normalizada (H3), densidade de histona 3 por número relativo de cópias (H3/rCN), ruído de fundo por histona 3 (Simulado/H3) e modificações por histona 3 (H3ac/H3, H3K4me3/H3, H3K27me3/H3 e H3K9me3/H3) foram calculados em um modelo padrão de mínimos quadrados com o programa de computação JMP10; o efeito mais significativo em ΔqP pode ser observado para H3ac/H3 sob ambas as condições de seleção.

[0168] No projeto T, a plotagem de H3ac/H3 contra ΔqP mostra um aumento simultâneo de estabilidade em longo prazo e da acetilação por histona 3, particularmente sob pressão de seleção.

[0169] Para contabilizar os diferentes níveis de histona 3 no promotor MIE de hCMV, a acetilação de histona 3 foi ainda normalizada para histona 3 (H3ac/H3).

[0170] Os níveis relativos de acetilação de histona 3 (H3ac/H3) foram comparados com as alterações na produtividade específica (ΔqP) ao longo de 60 gerações na presença (+) e na ausência (-) de agente de seleção MSX. Após a análise de valores discrepantes, o modelo padrão de regressão de mínimos quadrados foi alimentado com os valores de H3ac/H3 de replicatas biológicas e os valores de ΔqP de 19 linhagens celulares CHO. Uma correlação significativa de H3ac/H3 e ΔqP foi detectada.

[0171] Para os valores de H3ac/H3, uma árvore de decisão foi calculada com o programa de computação jmp. Melhor nó de divisão e, portanto, melhor filtro foi calculado com a estatística LogWorth. A melhor divisão sob a condição MSX (+) foi calculada como sendo 0,58 de acetilação de histona 3 em relação ao nível de Histona 3 (H3ac/H3) para as amostras H. Para reduzir o número de amostras de falsos negativos o filtro foi ajustado para o valor mais baixo de A >0,5 H3ac/H3.

[0172] Foram calculadas as médias de delta SPR (ΔqP) em condições com ou sem agente de seleção MTX or MSX, respectivamente, para cada porta positiva e em comparação com a média não filtrada e são apresentadas abaixo:

[0173] O filtro A > 0,5 H3ac/H3 aumenta a média de delta SPR em comparação a condição não filtrada.

B.3. COMBINAÇÃO DE METILAÇÃO DE PROMOTOR E ACETILAÇÃO DE HISTONA

[0174] Os níveis relativos de acetilação de histona 3 relativos ao nível de histona 3 perto do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano e a porcentagem de metilação de C-425 do fragmento do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano foram investigados como marcadores preditivos para a estabilidade de produção com e sem agente de seleção.

[0175] Foram calculadas as médias de delta SPR em condições com ou sem agente de seleção para cada porta positiva em comparação com a média não filtrada e são apresentadas abaixo:

[0176] A combinação de filtro A > 0,5 H3ac/H3 com filtro B < 5%mC-425(%) PSB aumenta a média de delta SPR em comparação a condição não filtrada.

[0177] Em mais detalhes, a árvores de decisões foi calculada com o uso do programa de computação Jmp 10 para determinar o valor de limiar da razão H3ac/H3 para permitir a exclusão de maus produtores. A estatística LogWorth foi usada para identificar o melhor nó de divisão. O LogWorth é calculado como: -log10 (valor p), onde o valor p ajustado é calculado de uma maneira complexa que leva em conta que grande quantidade de diferentes formas de divisão possa ocorrer (Sall, 2002, Monte Carlo Calibration of Distributions of Partition Statistics; SAS white paper.). A melhor divisão para a condição ΔqP+ foi 0,47 de acetilação por histona 3. Para minimizar os valores falsos positivos, o valor de limiar foi definido como 0,5 H3ac/H3 e transferido para ambas as condições nos projetos H e T.

[0178] Além disso, o limiar de 5% para a metilação de promotor MIE de hCMV (%mC-425) foi determinado a partir dos dados de metilação registrados (consulte as Tabelas acima) para usar a combinação (sinérgica) de ambos os marcadores de predição. Dessa forma, foram excluídas as amostras com mais de 5% de metilação de DNA ou menos que 0,5 de acetilação por histona 3 no promotor MIE de hCMV.

[0179] A média de ΔqP foi calculada para amostras filtradas positivas e comparadas com o ΔqP médio de amostras não filtradas. Isso foi realizado em consideração ao fato de MTX ter sido adicionado ou não ao meio de cultura.

[0180] O uso do marcador de predição H3ac/H3 resulta em um aumento da estabilidade em longo prazo das amostras incluídas.

[0181] O ΔqPs médio após a filtração foi quase idêntico em ambos os projetos.

TABELA EXCLUSÃO DE PRODUTORES RUINS

[0182] Amostras com valores acima de 0,5 H3ac/H3 e abaixo de 5% mC-425 foram usadas para calcular a média de ΔqP; curiosamente ΔqPs filtrados foram quase idênticos para ambos os projetos.

[0183] O grau de acetilação de histona 3 no promotor MIE de hCMV apresentou um efeito significativo na estabilidade. Também a quantidade de H3 total e o grau de metilação na posição C-425 (%mC-425) teve efeitos sobre a estabilidade em longo prazo. Além disso, a correlação negativa encontrada de H3ac/H3 e %mC-425 confirma a confiabilidade desses marcadores.

[0184] O ajuste do limiar leva à exclusão de todos os maus produtores. As células acima desse valor são predominantemente estáveis.

B.4. COMBINAÇÃO DE METILAÇÃO DE PROMOTOR E ACETILAÇÃO DE HISTONA E NÚMERO DE CÓPIAS DO TRANSGENE

[0185] A correlação da acetilação de histona 3 com a metilação do DNA e o número de cópias foi significativa, o que fornece evidência para a inter-relação do número de cópias, a metilação de DNA e a acetilação de histona 3. Descobriu-se que o grau de metilação de DNA foi contrário à acetilação de histona 3. Descobriu-se ainda que o número de cópias versus acetilação de histona 3 e metilação de DNA prevê o fato de que as linhagens celulares com um número mais alto de cópias são na maioria não acetiladas e tendem para a metilação de DNA. Descobriu-se correlações do número de cópias e a alteração de produtividade em longo prazo na presença e ausência do agente de seleção. Dessa forma, o número de cópias interage no grau de marcadores que, por sua vez, influencia na estabilidade da produção em longo prazo.

[0186] Além disso, um acúmulo não intencional de linhagens celulares instáveis é promovido no desenvolvimento de linhagem celular padrão pela seleção inicial de linhagens celulares de acordo com seus títulos de anticorpos. Assume-se que as linhagens celulares com um número baixo de cópias precisam ser predominantemente ativas, enquanto que produtores com um número alto de cópias podem ter uma abundância de diferentes estados epigenéticos a partir da não ativação até a ativação alta de cada transgene individual desde que a soma dos transcritos seja comparável. Considerando isso, a primeira seleção, de acordo com o título do anticorpo, prefere tanto linhagens celulares com alto número de cópias, que podem ter sítios de integração estáveis por coincidência, como linhagens celulares com baixo número de cópias, que são ligeiramente forçadas a tê-las. O número de cópias do início da fase de cultivo foi plotado contra a estabilidade e descobriu-se que linhagens celulares com alto número de transgenes tendiam para a instabilidade.

[0187] Dessa forma, no presente pedido é relatado como um aspecto um método/processo de seleção de linhagens celulares de três etapas. Na primeira etapa, células que expressam anticorpo com um baixo número de cópias de cadeia leve são expandidas, na segunda etapa é realizada uma seleção de acordo com seus graus de acetilação de histona 3. Posteriormente, é realizada uma redução rápida do agente de seleção. Através disso, são obtidas linhagens celulares com sítios de integração estável, um risco reduzido para silenciamento de genes e para perda de número de cópias bem como a identificação de subpopulações com mecanismos desestabilizantes pré- estresse.

[0188] Em uma realização, o número de cópias de cassetes de expressão da cadeia leve estavelmente integrados está abaixo de 50. Em outra realização, o número de cópias de cassetes de expressão da cadeia leve estavelmente integrados está abaixo de 25. Em uma realização adicional, o número de cópias de cassetes de expressão da cadeia leve estavelmente integrados está abaixo de 10. Em uma realização adicional, o número de cópias de cassetes de expressão da cadeia leve estavelmente integrados está abaixo de 6.

[0189] Os exemplos a seguir, lista de sequências e figuras são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo deste é apresentado nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0190] Figura 1 - Número do sítio CpG metilado do promotor/enhancer MIE de hCMV obtido a partir de linhagens celulares diferentes.

[0191] Figura 2 - Mapa do plasmídeo de p5057.

[0192] Figura 3 - A: A taxa de produção específica na ausência de um agente de seleção de linhagem celular K18.1 ao longo de gerações múltiplas em uma produção a longo prazo; B: A taxa de produção específica na ausência de um agente de seleção de linhagem celular G25-10 ao longo de gerações múltiplas em uma produção a longo prazo; C: A taxa de produção específica na ausência de um agente de seleção de linhagem celular G25-17 ao longo de gerações múltiplas em uma produção a longo prazo; D: A taxa de produção específica na ausência de um agente de seleção de linhagem celular G42-5 ao longo de gerações múltiplas em uma produção a longo prazo; E: A taxa de produção específica na ausência de um agente de seleção de linhagem celular 43-16 A10 ao longo de gerações múltiplas em uma produção em longo prazo.

[0193] Figura 4 - Figura superior: frequência de metilação dentro do DNA promotor/enhancer MIE de hCMV a partir de linhagens celulares CHO recombinantes em diferentes sítios de metilação determinados pela análise de 19 a 22 ácidos nucleicos promotores individuais; figura inferior: representação esquemática de sítios CpG metilados dentro do DNA promotor/enhancer MIE de hCMV de linhagens celulares CHO recombinantes - sítios metilados são mostrados em preto - posição 425 é realçada por uma seta; A: linhagem celular K18.1 - metilação de todos os sítios CpG: 12%, metilação do sítio C425: 64 %, metilação do sítio C591: 27 %, metilação do sítio C96: 32%; B: linhagem celular G25-10 - metilação de todos os sítios CpG: 0,5 %, metilação do sítio C425: 0 %, metilação do sítio C591: 5 %, metilação do sítio C96: 0%; C: linhagem celular G25-17 - metilação de todos os sítios CpG: 0,3 %, metilação do sítio C425: 0 %, metilação do sítio C591: 0 %, metilação do sítio C96: 0%; D: linhagem celular G42-5 - metilação de todos os sítios CpG: 0,6 %, metilação do sítio C425: 0 %, metilação do sítio C591: 0 %, metilação do sítio C96: 0%; E: linhagem celular 43-16 A10 - metilação de todos os sítios CpG: 4,4 %, metilação do sítio C425: 25 %, metilação do sítio C591: 15 %, metilação do sítio C96: 10%.

[0194] Figura 5 - Discriminação de promoter/enhancer MIE de hCMV que é metilado no sítio 425 de MIE de hCMV que é não metilado no sítio 425 por qPCR em tempo real específica para metilação; curvas de amplificação por PCR para moldes n° 11 (A), n° 62 (B), n° 01 (C) e n° 04 (D).

[0195] Figura 6 - Curvas de amplificação por PCR para diferentes primers e pares de primers específicos de metilação.

[0196] Figura 7 - Recuperação do promotor/enhancer MIE de hCMV metilado no sítio 425 no fundo do promotor/enhancer MIE de hCMV não metilado por qPCR em tempo real específica para metilação.

[0197] Figura 8 - metilação de ácido nucleico promotor/enhancer MIE de hCMV no sítio de metilação 425 obtido com primer n° 239 e n° 267 com pré-amplificação (A) e diretamente de DNA genômico tratado com bissulfito (B).

[0198] Figura 9 - metilação de ácido nucleico promotor/enhancer MIE de hCMV no sítio de metilação 425 obtido com primer (preto) 239 + 237 e 239 + 267, (branco) 263 + 237 e 263 + 267, (linhas horizontais) 264 + 237 e 264 + 267 e (linhas verticais) 239 + 237 e 239 + 266.

[0199] Figura 10 - Análise de curva de fusão normalizada de alta resolução exemplar (A) e primeira derivada da mesma, isto é, picos de fusão (B).

[0200] Figura 11 - Correlação do grau de metilação em C425 antes de cultivo em longo prazo e a alteração relativa do SPR após cultivo de 60 gerações com MTX 250 nM (A) ou sem MTX (B).

[0201] Figura 12 - Correlação do grau de metilação em C425 antes de cultivo em longo prazo e o grau de metilação após cultivo de 60 gerações com MTX 250 nM.

[0202] Figura 13 - Representação esquemática de sítios CpG metilados dentro do DNA promotor/enhancer MIE de hCMV a partir do clone 44-28. Sítios metilados são mostrados em preto. Posição do nucleotídeo 425 é destacada por uma seta. Metilação de todos os sítios CpG: 18%, metilação em C425: 80 %, metilação em C591: 70%, metilação em C96: 60%.

[0203] Figura 14 - Número de cópias do gene da cadeia leve antes e depois do teste de estabilidade sem MTX.

[0204] Figura 15 - Níveis Relativos de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 próximo ao fragmento de promotor/ enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano normalizado para o gene Gusb de referência. As variâncias entre as 3 replicatas biológicas são exibidas pelo desvio padrão.

[0205] Figura 16 - Níveis Relativos de metilação três vezes de histona 3 Lisina 4 em relação ao nível de histona 3 próximo ao fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano normalizado para o gene Gusb de referência. As variâncias entre as 3 replicatas biológicas são exibidas pelo desvio padrão.

[0206] Figura 17 - Real por Gráfico Previsto de efeito H3K4me3/H3 para amostras H1 a H-20 com 3 replicatas biológicas. Curvas de confiança para a linha de ajuste são mostradas em linhas tracejadas para fornecer indicação visual do teste de interesse ser significativo no nível de 5%. As curvas precisam cruzar a linha horizontal para significância.

[0207] Figura 18 - Real por Gráfico Previsto de efeito H3ac/H3 para as amostras H1 a H-20 com 3 replicatas biológicas. Curvas de confiança para a linha de ajuste são mostradas em linhas tracejadas para fornecer indicação visual do teste de interesse ser significativo no nível de 5%. As curvas precisam cruzar a linha horizontal para significância.

[0208] Figura 19 - Real por Gráfico Previsto de efeito mC 425(%) para as amostras H-1 a H-20. Curvas de confiança para a linha de ajuste são mostradas em linhas tracejadas para fornecer indicação visual do teste de interesse ser significativo no nível de 5%. As curvas precisam cruzar a linha horizontal para significância.

[0209] Figura 20 - Análise de valores discrepantes do projeto H com Distâncias Jackknife para delta SPR com e sem o MSX como condição. Amostra H-18 está muito além do Limite de Controle Superior (UCL), que indica fortemente a amostra como um valor discrepante.

[0210] Figura 21 - Real por Gráfico Previsto de efeito H3K4me3/H3 para amostras H-1 a H-17, H-19 e H-20 com 3 replicatas biológicas. Curvas de confiança para a linha de ajuste são mostradas em linhas tracejadas para fornecer indicação visual do teste de interesse ser significativo no nível de 5%. As curvas precisam cruzar a linha horizontal para significância.

[0211] Figura 22 - Real por Gráfico Previsto de efeito H3ac/H3 para amostras H-1 a H-17, H-19 e H-20 com 3 replicatas biológicas. Curvas de confiança para a linha de ajuste são mostradas em linhas tracejadas para fornecer indicação visual do teste de interesse ser significativo no nível de 5%. As curvas precisam cruzar a linha horizontal para significância.

[0212] Figura 23 - Real por Gráfico Previsto de efeito mC- 425(%) para amostras H-1 a H-17, H-19 e H-20. Curvas de confiança para a linha de ajuste são mostradas em linhas tracejadas para fornecer indicação visual do teste de interesse ser significativo no nível de 5%. As curvas precisam cruzar a linha horizontal para significância.

[0213] Figura 24 - Valores delta SPR de amostras H-1 a H-17, H-19 e H-20 plotados em histogramas. Seleção diferente e condições de filtro são exibidos. A linha horizontal dentro da caixa representa a mediana. O diamante de confiança contém a média, os limites superior e inferior de 95% da média. O meio do diamante representa a média. Os pontos superior e inferior do diamante representam o 1o e o 3o quartis. A caixa tem linhas que se estendem a partir de cada extremidade, denominadas bigodes. Os bigodes se estendem das extremidades da caixa até o ponto de dados mais afastado que cai dentro das distâncias computadas como 1o quartil a 1,5*(distância interquartílica) e 3o quartil + 1,5*(distância interquartílica). Se os pontos de dados não atingem as faixas computadas, então os bigodes são determinados pelos valores de ponto de dados superior e inferior (não incluindo valores discrepantes). O suporte externo da caixa identifica a menor metade, que é a mais densa 50% das observações (Rousseuw e Leroy 1987).

[0214] Figura 25 - Valores de delta SPR do projeto T plotados em histogramas. Seleção diferente e condições de filtro são exibidos.

[0215] Figura 26 - Esquema para imunoprecipitação de cromatina (ChIP) de DNA de linhagem celular CHO.

[0216] Figura 27 - Estudos de correlação de marcas epigenéticas, número de cópias e estabilidade. A: Gráfico de metilação de C- 425 para a acetilação por histona 3 no promotor MIE de hCMV. B: Gráfico da alteração de produtividade específica ao longo de 60 gerações de células CHO na ausência (-) e na presença (+) de agente de seleção MSX após exclusão da linhagem celular H-18. Foi determinado comportamento de estabilidade correlativo alto de linhagens celulares com e sem agente de seleção. C: Gráfico apresenta a correlação do número de cópias e acetilação de histona 3, indicando que somente linhagens celulares com baixo número de cópias foram acetiladas em histona 3. D: Gráfico exibe a correlação de número de cópias e metilação de DNA enquanto que somente linhagens celulares com alto número de cópias são predominantemente metiladas no promotor MIE de hCMV. E e F: Gráfico apresenta a correlação do número de cópias e a alteração de produtividade ao longo de 60 gerações na presença (+) e ausência (-) de agente de seleção. Portanto, o alto número de cópias de linhagens celulares são propensos a silenciar.

[0217] Figura 28 - Anticorpo humano de classe IgG que expressa plasmídeo. Cassete de expressão da cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana estiveram ambos sob o controle de um promotor e enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1) (MIE de hCMV). EXEMPLO 1 TÉCNICAS GERAIS SOLUÇÕES

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[0218] Os métodos padrão foram usados para manipular o DNA, conforme descrito em Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante. DETERMINAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE DNA

[0219] Foi realizado sequenciamento de DNA em SequiServe GmbH (Vaterstetten, Alemanha). ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE DNA E DE PROTEÍNA E GERENCIAMENTO DE DADOS DA SEQUÊNCIA

[0220] O pacote de programa de computação EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) e Vector NTI versão 9.1 da Invitrogen foram usados para criação de sequência, mapeamento, análise, anotação e ilustração. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA

[0221] Um método cromatográfico foi usado para quantificar a quantidade de anticorpo presente em uma amostra. Foi usada uma coluna Poros A que se liga à região FC do anticorpo. O anticorpo se liga a coluna e é subsequentemente eluído por condições de pH baixo. A concentração de proteína foi determinada por determinação da densidade óptica (OD) a 280 nm, com um comprimento de onda de referência de 320 nm, com o uso do coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

[0222] A eletroforese em gel de agarose foi realizada para analisar a qualidade, o tamanho e a quantidade de fragmentos de DNA lineares (Chong, 2001). De acordo com o tamanho dos fragmentos de DNA, soluções de agarose de 1% (p/v) foram dissolvidas em solução de TAE 1 x por ebulição. Os géis continham uma concentração final de 0,5 μg /mL de brometo de etídio. As amostras foram preparadas por adição de 1/6 (v/v) de corante de carregamento de DNA 6x. Um padrão de peso molecular de DNA foi usado como um padrão de tamanho. A eletroforese foi realizada em TAE 1x por aplicação de 10 V/cm de comprimento de gel (não mais de 250 V). Após a separação, o DNA foi analisado sob luz UV (254-366 nm) em um sistema de documentação de gel (Intas Science Imaging Instruments GmbH, Goettingen, Alemanha). EXTRAÇÃO EM GEL

[0223] Após a Eletroforese em Gel de Agarose, a fatia do gel com a banda favorecida foi removida com bisturi e a fatia do gel foi ainda extraída com o kit Gel Extraction QIAquick® (Qiagen, Hilden, Alemanha). Em seguida, três volumes de tampão QG foram adicionados a um volume de gel (100 mg aproximadamente 100 μL) e incubados por 10 minutos a 50°C. Um volume de gel de isopropanol foi adicionado a um volume de gel e misturado no gel dissolvido. Os fragmentos de DNA aderiram-se à coluna de spin QIAquick em um minuto de centrifugação a 13.000 rpm e foram lavados com 0,75 mL de tampão PE e subsequente centrifugação (13.000rpm, 1 minuto). A segunda lavagem, em outro tubo de coleta, removeu o tampão de lavagem residual. Por fim, o DNA foi eluído em 30 μL de H2O livre de RNase para um tubo de amostra por centrifugação (13.000 rpm, 1 minuto). O DNA pôde ser verificado no Flash-gel (FlashGel™ systems, Lonza, Cologne, Alemanha). QUANTIFICAÇÃO DE DNA

[0224] Um Nanodrop 2000 (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha) foi usado para quantificar a concentração de DNA medindo a densidade óptica (OD) a um comprimento de onda de 260 nm. A pureza do DNA pôde ser julgada pelas razões de OD de 260/280 e 260/230. Preparações de DNA puro devem possuir uma razão > 1,8 e 2,0.

TRANSFORMAÇÃO EM BACTÉRIAS COMPETENTES

[0225] Quarenta e cinco microlitros de E. coli NEB 5 alfa (NEB, Alemanha) quimicamente competentes foram descongeladas em gelo por 10 minutos e depois incubadas com 1 pg - 100 ng de DNA plasmidial (1-5 μL) por 30 minutos sobre gelo. A suspensão celular foi a choque térmico a 42°C por 45 segundos e imediatamente resfriada em gelo por 5 minutos. Novecentos e cinquenta microlitros de SOC ou LB à temperatura ambiente foram adicionados e a suspensão foi incubada a 37°C por 60 minutos com agitação (250 rpm). As bactérias transformadas foram plaqueadas em placas de ágar pré-aquecido contendo ampicilina. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEO

[0226] Os plasmídeos foram preparados com o uso dos Kits Qiagen Plasmid Mini e Maxi (Qiagen, Hilden, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. PURIFICAÇÃO DE DNA

[0227] O DNA genômico foi isolado e purificado com o Kit Allprep DNA/RNA Mini (50) (Cat. n° 80204, Qiagen, Hilden, Alemanha) e o Kit DNAse Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as recomendações do fabricante. A purificação de fragmentos foi feita com o Kit de Purificação de Produto de PCR de Alta Pureza (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. EXTRAÇÃO DE FENOL-CLOROFÓRMIO

[0228] A concentração e purificação de plasmídeo foi feita por extração com fenol/clorofórmio. Todas as etapas foram realizada sob uma coifa química. Quinhentos microlitros de plasmídeo linearizado foram misturados com um volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) Roti® (Cat. n° A156, Roth, Alemanha) e vortexados por 30 segundos. Em seguida, a emulsão foi transferida para tubo pré-centrifugado Phase Lock Gel™ Light (Cat. n° 0.032.005,101, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) por centrifugação (13.000 rpm, 1 minuto). A fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo e a extração foi repetida. Em seguida, a fase aquosa superior foi misturada com 500 μL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e as etapas de extração foram repetidas. A fase superior foi transferida para um novo tubo e misturada com 0,1 do volume inicial de 3 mol/L de tampão de acetato de sódio (pH 4,8 a 5,2) e 0,7 do volume inicial de isopropanol 100% (20 a 30°C), por inversão do tubo de 4 a 6 vezes. Após 20 minutos de incubação a -80°C, seguido de centrifugação (13.000 rpm, 30 minutos a 4°C), o sobrenadante foi descartado. O pélete foi lavado com 1 mL de etanol 70% resfriado, centrifugado (13.000 rpm, 5 minutos a 4°C) e o sobrenadante foi descartado. A etapa de lavagem foi repetida em condições estéreis e o sobrenadante residual foi removido completamente. O pélete foi seco por 5 a 10 minutos em ar estéril e, subsequentemente, absorvido em 0,5 do volume inicial de água destilada duas vezes.

DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DE TRANSGENE

[0229] A determinação do número de cópias de transgene bem com a taxa de metilação de C-425 do promotor MIE de hCMV foram realizadas de acordo com as recomendações de Osterlehner et al. (acima). O número de cópias relativo foi calculado por dois para a força da diferença do valor de Cq do valor de referência da amostra de entrada (por exemplo, Gusb) a partir do valor de Cq do alvo da amostra de entrada do promotor MIE de hCMV.

IMUNOPRECIPITAÇÃO DE CROMATINA

[0230] Linhagens celulares CHO foram coletadas com uma viabilidade maior que 90%, preferencialmente maior que 97%. Antes da fixação, microesferas para pré-limpeza e precipitação foram preparadas. As microesferas para pré-limpeza foram geradas por incubação (1 hora, TA com rotação) de 15 μL de pasta fluida de proteína agarose A (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) com 2 μL de IgG de coelho purificada (Cat. n° PP64B, Millipore, Alemanha) em 120 μL de Tampão de Diluição ChIP por amostra. Duas etapas de lavagem, cada uma com um volume de tampão de diluição ChIP foram feitas para purificação, seguido de ressuspensão de microesferas em 85 μL de tampão de diluição ChIP. Quinze microlitros de microesferas de agarose A para precipitação foram bloqueadas em 1 mL de tampão de diluição ChIP com 5 mg/mL de BSA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão pré- aquecido (10 minutos a 95°C e 5 minutos sobre gelo, Cat n° 15632-011, Invitrogen, Alemanha). O pélete ressuspenso foi incubado por 4 a 5 horas a 4°C em rotação, subsequentemente lavado três vezes e montado em 2 volumes de tampão de diluição ChIP.

[0231] Cerca de 1 x 107 células por amostra foram fixadas por adição de formaldeído no meio até uma concentração final de 3,7% e incubadas por 10 minutos em RT, conforme descrito anteriormente (Beneke, S., et al. PLoS One 7 (2012) e32914). A fixação foi interrompida por adição de glicina 1x à solução. Após duas etapas de lavagem com PBS gelado e centrifugação a 2.000 xg por 3 minutos, o pélete foi ressuspenso em 1 mL de PBS contendo inibidor de protease Roche complete (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). A suspensão foi sedimentada por centrifugação (3.000 x g, 5 minutos, 4°C). O sobrenadante foi descartado.

[0232] A lise do pélete foi feita por adição de 1 mL de tampão de lise celular Roche complete (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e incubação em gelo por 10 minutos. Após centrifugação (2.300 x g, 4 minutos, 4°C) o pélete dos núcleos foi ressuspenso em 300 μL de solução de lise de núcleos e sonicado (saída 5, ciclo de trabalho de 90%, 15 segundos de sonicação seguido por 2 a 3 minutos de incubação em gelo, durante 6 ciclos; Branson Sonifier B15, Dietzenbach, Alemanha). Setecentos microlitros de solução de lise de núcleos foram adicionados aos núcleos sonicados, seguido por centrifugação (13.000 rpm, 15 minutos, 4°C). O sobrenadante foi transferido para um novo tubo para armazenamento a -80°C até o uso. O grau de sonificação foi testado após a digestão proteica em um gel de agarose.

[0233] A cromatina foi pré-limpa com 80 μL de preparado de pasta fluida de agarose proteína A por incubação (2 horas a 4°C com rotação) e centrifugação (13.000 rpm, 6 minutos, 4°C, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e a concentração de proteína foi determinada (Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce®, Thermo Scientific, Rockford, EUA). Vinte e cinco a cem microgramas de cromatina por imunoprecipitação (IP) foram montados em 200 μL de tampão de lise de núcleos e adicionados a 30 μL de tampão de diluição ChIP compreendendo 3 μg de anticorpo apropriado. A imunoprecipitação foi feita durante a noite a 4°C, com rotação. As amostras de entrada não diluídas foram armazenadas a - 20°C. Após incubação durante a noite, 40 μL de microesferas de agarose proteína A bloqueadas foram adicionados à solução IP e incubados (1 hora a 4°C com rotação). O precipitado foi lavado duas vezes, uma com tampão de lavagem de baixo teor salino, uma vez com tampão de lavagem de alto teor salino, uma vez com tampão de lavagem de LiCl e uma vez com tampão de lavagem de TE. Cada lavagem foi realizada em 1mL de tampão por 5 minutos na plataforma rotativa, seguido por centrifugação (500 x g, 30 segundos, 4°C). Após a última etapa de lavagem, as microesferas foram centrifugadas a 500 x g por 1 minuto. Os péletes com as microesferas foram combinados com 200 μL de tampão de eluição de IP, enquanto que, simultaneamente, 25 a100 μg da amostra de entrada de cromatina foram preenchidas até 200 μL com tampão de eluição IP e incubadas por 30 minutos a 65°C com agitação. Subsequentemente, os tubos foram incubados por 30 minutos a 37°C após a adição de 0,5 μL de RNase livre de DNase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) para cada tubo. Para a digestão final das proteínas, 10 μL de NaCl 4M (concentração final 0,2M) e 2 μL de proteinase K (concentração final 100-200 μg/mL, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram adicionados às amostras da reação e incubadas por 1,5 hora a 65°C. O DNA foi purificado com o uso de kit de purificação de PCR da Roche (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). CONVERSÃO DE BISSULFITO

[0234] Para a conversão de citosinas não metiladas em uracila, o kit EZ-96 DNA methylation-lightning TM (formato de poços fundos) (ZymoResarch, Freiburg, Alemanha) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, o gDNA foi extraído com kit DNAse blood & tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha) e a concentração foi medida com Nanodrop 2000 (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha) para definir a concentração em 350 ng de gDNA, em 20 μL de água destilada duas vezes. Vinte microlitros gDNA foram misturados com 130 μL de reagente de conversão de luz em uma placa de conversão. As placas foram incubadas a 98°C por 8 minutos, em seguida a 54°C por 60 minutos e, finalmente, temporariamente armazenadas a 4°C. Uma placa de ligação Zymo-Spin™ I-96 contendo 600 μL de tampão de ligação M por poço foi montada sobre uma placa de coleta. As amostras da placa de conversão foram adicionadas à placa de ligação Zymo-Spin ™ I-96, misturadas e centrifugadas (3.000 x g por 5 minutos). As placas foram lavadas com 400 μL de tampão de lavagem e centrifugadas (3.000 x g, 5 minutos). Duzentos microlitros (200 μL) de tampão de L-dessulfonação foram adicionados a cada poço, as placas foram incubadas (20 a 30°C, 20 minutos) e, subsequentemente, centrifugadas (3.000 x g por 5 minutos). Uma etapa de lavagem adicional foi completada com 10 minutos de centrifugação a 3.000 x g e o DNA convertido foi eluído em 30 μL de tampão de eluição M. O DNA convertido foi armazenado a -20°C até o seu uso.

AMPLIFICAÇÃO DO PROMOTOR MIE DE HCMV CONVERTIDO E INTEGRADO

[0235] Para a investigação da metilação de CpG do promotor MIE de hCMV, pares de primers para a região promotora distal (F1 & R1) e proximal (F2 & R2) foram projetados da seguinte forma:

[0236] Dez picomoles de cada primer (0,5 μL) foram adicionados a 12,5 μL da pré-mistura de DNA-polimerase ZymoTaq™ (ZymoResarch, Alemanha), 3 μL de gDNA molde e preenchido até 25 μL com água destilada duas vezes. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi feita com Mastercyler Nexus X1 (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), as condições de PCR foram as seguintes:

[0237] Os amplicons foram purificados com o kit de purificação de PCR da Roche (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) em 30 a 40 μL de tampão de eluição. A concentração foi definida com Nanodrop 2000 (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha) e o tamanho dos amplicons foi visualizado por eletroforese em gel de agarose. PCR INVERSO

[0238] A reação em cadeia da polimerase inversa (iPCR) é um método para determinar os sítios de integração de um vetor integrado aleatoriamente. Essa sequência de vetor conhecida perto do local de corte será usada para gerar os primers de pelo menos 20 bp de comprimento. Esses primers são orientados em direções opostas.

[0239] O genoma foi digerido com enzimas que cortam frequentemente (cortador com 4 bp), mas que não cortam entre os sítios de ligação dos primers e o sítio de linearização do vetor. Os fragmentos resultantes são ligados em condições muito diluídas, de modo a favorecer a ligação intramolecular. A sequência circularizada pode agora ser amplificada com os primers inversos.

[0240] O DNA genômico foi isolado com kit Qiagen blood & cell culture DNA prep. midi (Qiagen, Hilden, Alemanha) sem 2 x 107 células (aproximadamente 90 μg de DNA) por condição (o DNA genômico pode ser armazenado a -20°C por vários meses) e dissolvido em 90 μL de água destilada duas vezes.

[0241] O DNA genômico isolado foi digerido com diferentes endonucleases de restrição em temperatura de trabalho apropriada para um mínimo de 16 horas. Para a digestão do gDNA, foram usadas as enzimas CviQI, MseI e MspI para a iPCR a montante do sítio de integração de Pvul e as enzimas MseI, BfaI e MluCl para a iPCR a jusante do sítio de integração do Pvul. Dez microgramas de DNA genômico foram usados por digestão (3,8 x 106 cópias).

[0242] Digestão:

[0243] O DNA digerido foi purificado com o kit de purificação de PCR da Roche e eluído em x μL (200 μL) de tampão de eluição. O alto grau de diluição do DNA favorece a ligação intramolecular.

[0244] Ligação:

[0245] Para gerar os fragmentos de DNA circular, o DNA digerido foi ligado durante a noite a 16°C com o uso DNA ligase T4 (NEB, Frankfurt/Main, Alemanha).O DNA ligado foi eluído em 50 μL de tampão de eluição do kit high pure PCR purification (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e adicionado a 10 ng de DNA molde. Como grupo de controle, o gDNA não transfectado para a linhagem celular CHO foi investigado.

[0246] A iPCR para condições 5’iPCR são descritas da seguinte forma.

[0247] Cinco microlitros do fragmento de PCR foram misturados com Orange G (5 μL) e água destilada duas vezes (10 μL) e carregados em gel de agarose para verificar a distribuição de fragmentos. Para 5’iPCR de fragmentos cortados de MseI e MluCI, bons resultados foram obtidos e nenhuma banda inespecífica foi detectada nas linhas de amostra de controle.

[0248] Os amplicons 5’ de cada amostra (cortados com MseI e MluCI) foram combinados e purificados com o kit de purifcação de PCR de alta pureza (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) em 40 μL de tampão de eluição. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM TEMPO REAL QUANTITATIVA

[0249] Para cada qPCR o corante fluorescente não específico LightCycler®480 SYBR Green I Master foi usado no Sistema LightCycler®480 Instrument II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). O SYBR Green é excitado com o uso de luz azul (Àmáx = 488 nm) e emite luz verde (Àmáx = 522 nm). O corante SYBR Green se liga a todos os DNAs fita dupla em PCR. Como resultado, a intensidade de fluorescência e a quantidade de produto de DNA aumentam simultaneamente, o que pode ser detectado pelo sistema LightCycler® após cada ciclo. Para a quantificação, a fluorescência foi plotada em função do número de ciclos numa escala logarítmica. Ligeiramente acima do fundo emitido, o limiar para a detecção da fluorescência baseada em DNA foi definido pelo sistema LightCycler®. O número de ciclos em que a fluorescência passa do limiar é denominado ciclo de quantificação (Cq) (Bustin, S. A., et al., Clin. Chem. 55 (2009) 611-22). Durante a fase exponencial de amplificação uma duplicação do DNA alvo é esperada em cada novo ciclo. No entanto, a eficiência de amplificação é muitas vezes variável entre os primers e moldes. Análise da temperatura de fusão de fragmentos de DNA amplificados fornece os primeiros sinais da especificidade dos pares de primers usados e a quantidade de dímeros de primers.

[0250] Uma eficiência de combinação do primer molde pode ser avaliada por um ensaio de titulação para criar uma curva padrão ou pelo programa de eficiência de cálculo LinRegPCR. O programa usa dados de correção de linha de base do Sistema LightCycler®, realiza uma correção de linha de base em cada amostra separadamente, determina uma janela de linearidade e, em seguida, usa a análise de regressão linear para ajustar uma linha reta através do conjunto de dados de PCR. A partir da inclinação dessa linha, a eficiência de PCR de cada amostra individual é calculada.

[0251] Para a quantificação relativa, a quantidade de sequência alvo foi comparada com uma sequência de referência, subtraindo Cq (alvo) de Cq (referência). Essa normalização é denominada método ΔCq (Schefe, J. H., et al., J. Mol Med. (Berlim) 84 (2006) 901-910). A sequência de referência precisa ter valores muito estáveis, consideravelmente mais elevados do que os valores de fundo (Simulado). Portanto, para cada sequência de referência, a média e o coeficiente de variação de todas as amostras de um mesmo projeto foram calculados e comparados com os níveis de fundo. Os valores Cq das diferentes condições foram apresentados em porcentagem (%) da amostra de entrada, visualizando a distância para controle de simulado (mock).

[0252] Independente do grande número de amostras, todas as qPCR foram realizadas em placas de 384 poços. Em cada poço os seguintes ingredientes foram transferidos.

[0253] O programa qPCR foi projetado da seguinte forma:

[0254] No caso da quantificação relativa de modificações de histonas, a normalização da amostra (tratada) para amostra de entrada (não tratada) é diretamente substituída pela normalização da sequência alvo tratada para sequência de referência tratada. Além disso, o cálculo da modificação de histona por histona torna a normalização da amostra de entrada redundante.

[0255] A quantidade relativa de modificações de histonas específicas próximas ao fragmento do promotor/enhancer principal-imediato- inicial de CMV humano foi estimada com o método Livak, também conhecido como método delta-delta Cq (ΔΔCq) (Livak, K. J. e Schmittgen, T. D., Methods 25 (2001) 402-408), desde que a eficiência do primer molde fosse perto de 2 e perto de cada um (diferença da média de Cq < 2%).

[0256] O método pode ser usado para quantificação relativa de um alvo em relação a uma referência. A quantificação relativa da acetilação da histona 3 e dos níveis de histona 3 perto do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano foi normalizada para a acetilação da histona 3 e para os níveis de histona 3 perto do gene de referência em duas etapas. Primeiro, ΔCq foi calculado da seguinte forma: ΔCq = controle - amostra

[0257] ΔCq é a distância de ciclos de quantificação (Cq) entre o controle (por exemplo, valor da amostra ChIP de Gusb) e o alvo (por exemplo, valor da amostra ChIP deMIE de hCMV) da mesma amostra, amplificada com pares de primers diferentes. Para identificar o nível de modificação da histona 3 por Histona 3, foi usado o método ΔΔCq.

MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO

[0258] O sequenciamento de Sanger foi realizado pela companhia SequiServe (SequiServe GmbH, Vaterstetten, Alemaha).

[0259] O Sequenciamento de Nova Geração foi realizado pela GATC (GATC-biotech, Konstanz, Alemaha) e Active Motif (La Hulpe, Bélgica) com o uso da tecnologia Illumina de sequenciamento. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

[0260] As concentrações proteicas foram estimadas em comparação com a proteína padrão com o kit de ensaio de proteína BCA Pierce® (Thermo Scientific, Rockford, EUA). FRACIONAMENTO DE PROTEÍNA NOS COMPARTIMENTOS

[0261]As proteínas foram fracionadas em membrana/citoplasma e proteínas nucleares (Misawa, Y, 2006). Em seguida essas células CHO (1 x 107 células por amostra) foram sedimentadas por centrifugação (300 x g, 3 minutos a 4°C) e o sedimento foi lavado duas vezes em PBS resfriado em gelo suplementado com Roche Complete (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). O pélete lavado foi lisado com 1 mL de tampão de lise Triton X-100 0,5% e incubado em gelo por 15 minutos. Os núcleos insolúveis foram separados por centrifugação (13.000 rpm, 15 minutos a 4°C). A membrana/citoplasma contendo o sobrenadante foi transferida para um novo tubo e resfriada em gelo. O pélete nuclear foi enxaguado uma vez com tampão de lise e ressuspenso em 300 μL de tampão de lise contendo SDS 0,5%, seguido por sonicação (5 segundos, saída 2, ciclo de trabalho de 90%, sonicador Branson 450, Dietzenbach, Alemanha). Setecentos microlitros de tampão de lise foram adicionados e a amostra foi centrifugada a 13.000 rpm, 15 minutos a 4°C. Os núcleos contendo sobrenadante foram transferidos para novos tubos e as frações proteicas foram armazenadas a -80°C. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E SDS (SDS-PAGE)

[0262] Para a desnaturação da eletroforese em gel de poliacrilamida e SDS, géis NuPAGE (4-12%), foram usados (NuPAGE® Novex® Gel Bis-Tris 10% 1,0 milímetro x 12 poços, Cat. n° NP0302BOX, Invitrogen, Alemanha), em combinação com o sistema de eletroforese NuPAGE®. De acordo com Cartão de Referência Rápida (NuPAGE® Bis-Tris Mini Gel), o gel foi fixado na câmara e o cassete interna foi preenchido com tampão de corrida MOPS 1 x (tampão de corrida NuPAGE MOPS 20 x SDS, Cat. n° NP0001, Invitrogen, Alemanha). A câmara externa também foi preenchida até dois terços do seu volume. O pente foi removido e as linhas foram purgadas com uma pipeta pequena. Trinta microlitros de amostra foram adicionados a 10 μL de tampão de amostra NuPAGE 4x, (Cat. n° NP0007, Invitrogen, Alemanha), dois microlitros de DTT 1M (concentração final 50 mM) e incubados a 95°C por 5 minutos. As amostras (20 μL/linha) e marcadores ((10 μL/linha) Marcador SeeBlue pré-corado, Cat. n° LC 5625, Invitrogen; (5 μL/linha) anti IgG MagicMark XP, Cat. n° LC5602, Invitrogen, Alemanha) foram transferidos para as linhas e o gel foi aplicado a 30 volts por 50 minutos com o sistema de eletroforese NuPAGE®. SDS-PAGE E WESTERN BLOT

[0263] Proteínas separadas induzidas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose ativada com metanol de acordo com o protocolo NuPAGE para eletroforese de desnaturação (NuPAGE® Technical Guide, Manual part n° IM1001, Invitrogen, Alemanha) em um XCell II Blot-Module (Invitrogen, Germany) com os reagentes apropriados. O blotting foi realizado na câmara de SDS-PAGE a 30 volts por 50 minutos. A proteína da membrana submetida a blotting foi transferida para uma nova câmara e lavada 3 vezes por 10 minutos em tampão de lavagem TBS 1x (TBS 10X: Tris-base 0,5 M, NaCl 1,5 M, pH 7,5) seguido por 5 minutos de incubação em solução Ponceau (0,1%) para a detecção de proteínas em geral. A solução Ponceau foi descartada e os resíduos foram lavados duas vezes com etapas de 1 minuto de lavagem com TBS.

[0264] A membrana foi bloqueada por 1 hora a 20 a 30°C em solução de bloqueio a 1% (solução de bloqueio: Caseína 1/10 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), TBS 1x). Subsequentemente, a membrana foi incubada em solução com anticorpo primário (solução de bloqueio a 1% + anticorpo) a 4°C durante a noite com agitação. A membrana foi lavada três vezes em TBST 1x por 10 minutos a 20 a 30°C seguido por uma etapa de lavagem de 1 minuto em TBS 1x. A membrana foi incubada em solução de anticorpo secundário (solução de bloqueio a 1% + anticorpo) por 45 minutos a 20 a 30°C ou a 4°C durante a noite com agitação. A membrana foi lavada três vezes em TBST 1x por 10 minutos a 20 a 30°C seguido de duas etapas de lavagem de 1 minuto em TBS 1x para remover Tween.

[0265] A detecção do anticorpo de ligação foi feita com o sistema de western blotting Lumi-LightPLUS (Roche, Penzberg, Alemanha). DESCONGELAMENTO DAS LINHAGENS CELULARES CHO

[0266] Tubos Falcon foram preparados com 5 mL de um meio apropriado. Crio frascos foram armazenados em gelo seco, até o descongelamento em banho-maria (37°C). Depois, as células CHO foram colocadas em tubos Falcon, preparadas e centrifugadas por 3 minutos a 500 x g para remover o DMSO residual. O pélete foi ressuspenso em 5 mL de meio e propagado em frascos de agitação descartáveis de 125 mL (contém 20mL de meio apropriado) sob condições padrão de umidade (95% de rH, 37°C, e 5% a 8% de CO2) a uma velocidade de agitação constante de 120 rpm/minuto a 150 rpm/minuto. A viabilidade (> 95%) e a concentração das células pode ser testada com Cedex HiRes Analyzer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). CULTIVO DE LINHAGENS CELULARES DE CHO

[0267] As células CHO não transfectadas foram divididas a cada 3 a 4 dias e semeadas com uma concentração de 2 a 3 x 105 células/mL em meio de cultivo. As células transfectadas foram semeadas com várias concentrações de metotrexato (MTX) ou sulfoximina de metionina (MSX) como agentes de seleção. Após a recuperação da viabilidade celular (3 a 4 semanas), as células transfectadas de forma estável foram selecionadas em timidina e meio livre de proteína contendo 20 nM a 1200 nM de metotrexato (MTX) ou 140 a 160 μM de metionina sulfoximina (MSX) como o agente de seleção. As células foram propagadas em frascos de agitação ventilados de 125 mL sob condições padrão de umidade (95% de HR, 37°C, e 5% de CO2), a uma velocidade de agitação constante de 120 rpm/minuto a 150rpm/minuto. A cada 3 a 4 dias, as células foram divididas em meios frescos com uma concentração celular de 2 a 3 x 105 células/mL. A densidade e a viabilidade das culturas foram determinadas com o uso do contador de células CASY TT ou Cedex HiRes (Roche Innovates AG, Bielefeld, Alemanha). TRANSFECÇÃO TEMPORÁRIA E ESTÁVEL

[0268] A transfecção foi feita com o kit V Amaxa® Cell line Nucleofector® (Lonza, Cologne, Alemanha) e as plataformas de transfecção Nucleofector™2b Device e Shuttle™ System de 96 poços (Lonza, Cologne, Alemanha).

[0269]5x106 células CHO por transfecção foram centrifugadas (200 x g, 5 minutos) e o sobrenadante foi descartado. O pélete foi ressuspenso em 100 μL de solução suplementada Nucleofector V e 1,2 pmoles do plasmídeo estéril foram adicionados por pipetagem para cima e para baixo. O plasmídeo foi linearizado para transfecção estável e para transfecção transitória, a forma circular foi mantida. A suspensão foi montada dentro de um cadinho livre de bolhas e o programa U-24 foi ativado para a transfecção da linhagem de células CHO. Após o pulso, 500 μL de meio pré-aquecido foram montados em um cadinho e a suspensão inteira foi transferida em 8 mL de meio pré-aquecido. As células foram transferidas para uma incubadora e as células estavam prontas para os primeiros exames após dois dias. CONTAGEM CELULAR COM CELLAVISTA

[0270] 60 μL de suspensão de células CHO foram misturados com 60 μL de azul de tripano (0,1 μM) em 96 poços de fundo redondo e incubados a 20 a 30°C por 5 minutos. Depois, a suspensão de células CHO tratada foi diluída com meio (1:50) e 200 μL foram transferidos para 96 poços de fundo plano (Greiner, Alemanha). A centrifugação lenta (500 x g, 5 minutos) resultou em sedimentação rápida das células.

[0271] Para uma contagem celular precisa, imagens do meio dos poços foram obtidas próximas às extremidades de cada poço, para evitar o erro na exibição das imagens. O gerador de imagens de células Cellavista (SynenTec, Munique, Alemanha) foi usado para o propósito da contagem celular. Cada amostra foi feita em replicata e todas as 10 imagens foram usadas para calcular a contagem celular. CONTAGEM CELULAR COM CEDEX HIRES ANALYZER

[0272] Para a contagem celular de um número de amostra até 40, foi usado o Cedex HiRes Analyzer (Roche, Alemanha). Em seguida, as células CHO foram diluídas uma razão de 1:5 em meio HiRes e 300 μL foram transferidos para tubos. O cálculo celular foi feito de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras foram analisadas em duplicata para verificar o número de células. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE DE ANTICORPO

[0273] A concentração celular foi calculada e 2 mL por amostra foram centrifugados (500 x g, 5 minutos a 20 a 30°C). O sobrenadante foi transferido para novas placas de 96 poços fundos e armazenado a -20°C até o uso. O sobrenadante congelado foi descongelado durante a noite a 4°C, invertido 6 vezes e centrifugado (4.000 rpm, 30 minutos a 20 a 30°C). Foram filtrados por centrifugação 310 μL com uma placa Millipore multiscreen em cima de uma placa de 96 poços redondos com código de barras (1.200 rpm, 3 minutos a 20 a 30°C). QUANTIFICAÇÃO DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO COM HPLC

[0274] Um método cromatográfico foi usado para quantificar a quantidade de anticorpo presente em uma amostra. Foi usada uma coluna Poros A que se liga à região FC do anticorpo. O anticorpo se liga a coluna e é subsequentemente eluído por condições de pH baixo. A concentração de proteína foi estabelecida determinando a densidade óptica (OD) a 280 nm, com um comprimento de onda de referência de 320 nm, com o uso do coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. QUANTIFICAÇÃO DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO COM ELISA

[0275] A técnica ELISA (Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima) é baseada no princípio sanduíche de anticorpo. Um anticorpo de captura específico para o analito de interesse, por exemplo, a parte Fc de IgG está ligada a uma placa de microtitulação para criar a fase sólida. Após as etapas de bloqueio e lavagem, as amostras, os padrões (séries de diluições de anticorpo de referência) e controlos são então incubados com o anticorpo em fase sólida, o qual captura o analito. Após lavagem do analito não ligado, é adicionado um anticorpo de detecção conjugado (por exemplo POD conjugado). Esse anticorpo de detecção se liga a um epítopo diferente da molécula a ser medida, completando o sanduíche. O BM Chemiluminescence ELISA Substrate POD (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) fornece uma solução de substrato do sistema de detecção secundária à base de peroxidase (POD, HRP). A taxa de geração de sinal em um imunoensaio é diretamente proporcional à quantidade de enzima marcadora ligada à fase sólida. A concentração de anticorpo foi calculada pela inclinação de diluição padrão. GERAÇÃO DA LINHAGEM CELULAR DE CÉLULAS CHO COMPREENDENDO O PROMOTOR MIE DE HCMV

[0276] As linhagens celulares recombinantes expressando constructos de anticorpos humanos de classe IgG foram geradas por transfecção temporária ou estável de células CHO-K1 crescendo em suspensão. Cassetes de expressão da cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana foram colocados sob o controle do promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano.

[0277] O vetor também compreendia uma sequência de ácido nucleico que codifica diidrofolato redutase de murinos (DHFR). A transfecção de células foi realizada pelo sistema Amaxa nucleofection (Lonza Cologne GmbH, Cologne, Alemanha).

[0278] A suspensão de CHO-K1 M foi transfectada com DNA circular de plasmídeo para a expressão temporária do anticorpo, com o uso do dispositivo Nucleofector em combinação com o Kit Nucleofector V (Lonza Cologne GmbH, Cologne, Alemanha) de acordo com os protocolos dos fabricantes. As suspensões de células transfectadas temporariamente foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas por cinco dias.

[0279] As suspensões estáveis de células transfectadas foram semeadas em placas de 384 poços ou de 6 poços contendo meio livre de timidina com 250 a 1600 nM de metotrexato (MTX) como o agente de seleção. Depois de três a quatro semanas, grupos de células expressando o anticorpo foram examinadas quanto à estabilidade em longo prazo durante um período de um a três meses. Os anticorpos que expressam clones celulares individuais foram semeados em placas de 384 e de 96 poços. Após três semanas, as linhagens celulares que expressam anticorpo foram identificadas medindo títulos de anticorpo no meio de cultura por ELISA. Os poços cultivados foram escolhidos aleatoriamente e nos interesses dos ensaios de estabilidade celular em longo prazo, e foram expandidos em volumes mais altos (3 mL por poço em seis poços por placa) e a concentração de anticorpo foi determinada por HPLC de proteína A e ELISA ao final de cada passagem.

[0280] As células foram propagadas em frascos de agitação ventilados descartáveis de 125 mL ou placas de 6 de poços em condições padrão de umidade (rH 95%, 37°C e CO2 5% a 8%), a uma velocidade de agitação constante de 120 rpm/min a 150 rpm/min. A cada 3 a 4 dias, as células foram divididas em meios frescos. A densidade e viabilidade das culturas foram determinadas com o uso do contador celular Cedex HiRes (Roche Inova AG, Bielefeld, Alemanha) ou Cellavista CV3.1 (SynenTec Bio Services GmbH, Munique, Alemanha).

CULTIVO EM LONGO PRAZO E PRODUÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULAS CHO COMPREENDENDO O PROMOTOR MIE DE HCMV

[0281] As células foram testadas quanto à estabilidade do fenótipo (por exemplo, produção) por 2 a 3 meses após a transfecção na presença do agente de seleção MTX. As células foram cultivadas continuamente em frascos de agitação ventilados de 125 mL contendo 20 a 40 mL de meio ou em placas de 6 poços contendo 2-4 mL de meio com agente de seleção e diluídas duas vezes por semana com meio fresco. A densidade da semeadura foi de 2 a 3 x 105 células/mL. Antes da passagem, a densidade e a viabilidade das células foram determinadas.

[0282] A concentração de anticorpo do sobrenadante (título do anticorpo) foi determinada por HPLC da proteína A e ELISA no final de cada passagem. A partir desses dados, a produtividade celular específica (qP) para cada passagem foi calculada com o uso da seguinte fórmula:

- qP (pg/célula/d): produtividade específica de célula, - Pi (μg/mL): título de anticorpo no início da passagem, - P2 (μg/mL): título de anticorpo no fim da passagem, - Di (células/mL): densidade de células viáveis no início da passagem, - D2 (células/mL): densidade de células viáveis no fim da passagem, - Δt (d): duração da passagem.

[0283] Os valores de qP foram plotados contra a idade da cultura no final da respectiva passagem em gerações. Uma linha de tendência linear foi calculada sobre todos os pontos de dados de qP e a alteração relativa do qP (em percentual) durante o período foi calculada internamente, de acordo com a seguinte equação:

- ΔqP (%): porcentagem de alteração de qP, - m (pg/célula/d/geração): inclinação da linha de tendência linear, - a (n° de gerações): idade da cultura, - qPo: eixo y intercepta a linha de tendência linear.

[0284] Quanto ao menor número de pontos de dados obtidos para cada amostra a média dos três últimos valores de qP foi dividida pela média dos dois primeiros valores de qP e exibida em porcentagem para obter ΔqP.

[0285] Média de qP EOS: média dos três últimos valores de qP

[0286] Média de qP PSB: média dos primeiros dois valores de qP TRATAMENTO DAS LINHAGENS DE CÉLULAS CHO RECOMBINANTES, USADO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES EPIGENÉTICOS

[0287] Foram usadas 32 linhagens celulares CHO de dois projetos para identificar marcadores epigenéticos, que predizem expressão gênica alvo com dois meses de antecedência. Para ambos os dados dos projetos, incluindo concentração de anticorpos, estado de metilação de C-425 do promotor MIE de hCMV e número de cópias foram coletados durante um período de 60 gerações (aproximadamente 2 meses). O Projeto H compreende 20 linhagens de células CHO-K1 que expressam um anticorpo humano da classe IgG sob o controle do promotor MIE de hCMV. O vetor ainda compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica glutamina sintetase, tornando as células suscetíveis a seleção de metionina sulfoximina (MSX). O Projeto T compreende 12 linhagens de células CHO-K1 que expressam um anticorpo humano da classe IgG sob o controle do promotor MIE de hCMV. Estas linhagens celulares são propensas à seleção por metotrexato (MTX) por causa do transgene de diidrofolato redutase de murino. As culturas de início congeladas, foram descongeladas e cultivadas em meios apropriados compreendendo 250 nM de MTX ou 140 μM de MSX. Depois de duas semanas (ponto de tempo do PSB) de cultura, as células foram coletadas e a imunoprecipitação da cromatina com os seguintes anticorpos foi realizada. LISTA PARA O PROJETO T

LISTA PARA O PROJETO H

[0288] Foi realizada PCR quantitativa com os seguintes primers.

DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DE TRANSGENE

[0289] Foi realizado exame do número de cópia do transgene conforme descrito anteriormente (Osterlehner, et al. 2011). Cópia do transgene por amostra (LCS ou HCS) foi extrapolada a partir de uma curva padrão de uma série de diluições. Supondo que cada célula contém aproximadamente 6 pg de DNA, o número de transgenes por célula (LCcélula) foi calculado da seguinte forma.

ANÁLISE COMPUTACIONAL COM JMP

[0290] A porcentagem de metilação de C-179 e acetilação das histonas 3 perto de MIE de hCMV no início da fase de cultivo foram plotadas contra a alteração, ao longo de 60 gerações, de produtividade específica (ΔqP) em um modelo padrão de ajuste de mínimos quadrados. Portanto o programa de computação JMP10 (JMP®10.0.1 Release: 2, edição de 64-bits; SAS Institute Inc.) foi usado e os valores p da influência do efeito foram calculados. Além disso, foram realizadas análises de valores discrepantes por meio da técnica de Jackknife. A estatística de LogWorth foi realizada para identificar o melhor nó de divisão para subdividir as populações de células por estabilidade e grau de modificação epigenética (Sall 2002).

EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES DE CHO RECOMBINANTES

[0291] As linhagens celulares recombinantes expressando um anticorpo humano da classe IgG foram geradas por transfecção estável de suspensão de células CHO-K1 ou CHO-DG44 em crescimento em suspensão com um vetor que codifica as cadeias leve e pesada de anticorpo compreendendo uma cadeia leve kappa de imunoglobulina humana e uma cadeia pesada gama 1 ou gama 4 de imunoglobulina humana. O vetor compreende ainda um ácido nucleico que codifica diidrofolato redutase (DHFR) ou glutamina sintetase (GS) de murino. Os cassetes de expressão das cadeias leve e pesada foram colocados sob o controle de promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1). A transfecção das células foi realizada por nucleofecção (Lonza Cologne GmbH or Amaxa Biosystems) ou por eletroporação, com o uso do Gene Pulser XCell (BIO-RAD).

[0292] Por exemplo, as suspensões de CHO-DG44 ou de CHO-K1 foram transfectadas com DNA de plasmídeo linearizado, com o uso do dispositivo Nucleofector em combinação com o kit Nucleofector V (Lonza Cologne GmbH, Cologne, Alemanha) ou por eletroporação, com o uso do Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, Hercules, CA), de acordo com os protocolos dos fabricantes. As células transfectadas foram semeadas em placas de 96 ou 384 poços contendo meio livre de timidina com várias concentrações de metotrexato (MTX) como agente de seleção ou de metionina sulfoximina (MSX) como agente de seleção. Após três semanas, as linhagens celulares que expressam anticorpo foram identificadas medindo títulos de anticorpo no meio de cultura por ELISA. Os principais produtores foram expandidos a volumes mais altos, subclonados por diluição limitante e crio-conservados.

[0293] As células transfectadas estavelmente foram selecionadas em meio livre de timidina e proteínas contendo 20 nM a 1.200 nM de metotrexato (MTX) ou 140 a 160 μM de metionina sulfoximina (MSX) como agentes de seleção. Células ou linhagens celulares expressando o anticorpo foram identificadas medindo os títulos de anticorpo no meio de cultura e subclonadas limitando a diluição e/ou deposição de FACS em células individuais.

[0294] As células foram propagadas em frascos de agitação ventilados descartáveis de 50 mL ou 125 mL em condições padrão de umidade (95% de HR, 37°C, e 5% a 8% de 2), a uma velocidade de agitação constante de 120 rpm/minuto a 150 rpm/minuto. A cada 3 a 4 dias, as células foram divididas em meio fresco. A densidade e a viabilidade das culturas foram determinadas com o uso do contador de células CASY TT ou Cedex HiRes (Roche Innovates AG, Bielefeld, Alemanha).

[0295] Além disso, as técnicas padrão de cultura celular foram aplicadas conforme descrito, por exemplo, em Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino, J.S. et al. et al. (Eds), John Wiley & Sons, Inc., Nova York (2000).

EXEMPLO 3 CULTURA E PRODUÇÃO EM LONGO PRAZO

[0296] As linhagens de células CHO obtidas de acordo com o Exemplo 2 foram investigadas quanto à produtividade em longo prazo.

[0297] As células foram testadas para o fenótipo, por exemplo, produção e estabilidade, por 35 a 70 gerações na ausência de um agente de seleção. As células foram cultivadas continuamente em frascos de agitação ventilados de 125 mL contendo 50 mL de meio sem agente de seleção e diluídas duas vezes por semana com meio fresco. A densidade da cultura foi de 2 a 3 x 105 células/mL. Antes da passagem, a densidade e a viabilidade de células viáveis foram determinadas. A idade da cultura em gerações no fim de cada passagem foi calculada de acordo com a seguinte equação: a2 = a1 + ln(D2/D1)/ln2 (Fórmula 1)

[0298] com: - a2 (n° de gerações): idade da cultura no final da passagem, - a1 (n° de gerações): idade da cultura no início da passagem, isto é, idade da cultura no final da passagem anterior, - D1 (células/mL): densidade de células viáveis no início da passagem, - D2 (células/mL): densidade de células viáveis no fim da passagem.

[0299] A concentração de anticorpo no sobrenadante (título do anticorpo) foi determinada por HPLC da proteína A no final de cada passagem. A partir desses dados, a taxa de produção específica (SPR) para cada passagem foi calculada com o uso da seguinte fórmula: SPR = P2-P1/((D2+D1)/2* Δt) (Fórmula 2)

[0300] com: - SPR (pg/célula/d): taxa de produção específica, - P1 (μg/mL): título de anticorpo no início da passagem, - P2 (μg/mL): título de anticorpo no fim da passagem, - DI (células/mL): densidade de células viáveis no início da passagem, - D2 (células/mL): densidade de células viáveis no fim da passagem, - Δt (d): duração da passagem.

[0301 ] Os valores de SPR foram plotados contra a idade da cultura no final da respectiva passagem em gerações. Uma linha de tendência linear foi calculada sobre todos os pontos de dados de SPR e a alteração relativa do SPR (em percentual) durante o período testado foi calculada, de acordo com a seguinte equação: ΔSPR = m* a/SPR0*100 (Fórmula 3)

[0302] com: - ΔSPR (%): alteração percentual de SPR, - m (pg/célula/d/geração): inclinação da linha de tendência linear, - a (n° de gerações): idade da cultura, - SPR0: eixo y intercepta a linha de tendência linear. -

[0303] Quase todas as linhagens celulares mostraram uma diminuição na produtividade, através do qual a perda de produtividade tende a ser mais forte sob a condição sem agente de seleção. TABELA 3 ALTERAÇÃO EM SPR DURANTE CULTIVO DE CINCO LINHAGENS CELULARES NA PRESENÇA E/OU AUSÊNCIA DE AGENTE DE SELEÇÃO

[0304] n.d. = não determinado.

[0305] n.d. = não determinado.

[0306] e. i. m. = erro na medição

EXEMPLO 4 IDENTIFICAÇÃO SE SÍTIOS CPG METILADOS DENTRO DO DNA PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO POR TRATAMENTO COM BISSULFITO E SEQUENCIAMENTO DE DNA

[0307] O fragmento de promotor/enhancer principal-imediato- inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1) usado para a expressão de genes das cadeias leve e pesada do anticorpo contém 33 sítios CpG.

[0308] O DNA genômico foi isolado a partir das linhagens celulares CHO K18.1, G25-10, G25-17, G42-5 e 43-16 A10 com o uso do Kit Allprep DNA/RNA Mini da Qiagen (Hilden, Alemanha). Cinco microgramas de DNA foram clivados com a enzima DraI e quantificados medindo a extinção a 260 nm. Cem nanogramas de DNA foram submetidos a tratamento de bissulfito e purificado com o uso do Kit EpiTect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA tratado com bissulfito foi recuperado em 20 μL de RNAse livre de água (Qiagen, Hilden, Alemanha).

[0309] A fim de amplificar a fita A (forward) do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 2), 1 μL de DNA tratado com bissulfito foi combinado com 24 μL de PCR master mix e submetido a PCR com o uso do GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc., EUA).

[0310] 24 μL de PCR master mix compreendeu: - 1 μL de primer forward 227 de SEQ ID NO: 6 (10 pmol/μL), - 1 μL de primer reverse 229 de SEQ ID NO: 8 (10 pmol/μL), - 22 μL de Platinum® PCR SuperMix HighFidelty (Invitrogen Corp., EUA).

[0311] O primer forward 227 é complementar à extremidade 5’ do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano. O primer reverse 229 se liga a jusante no interior da 5’-UTR dos genes de imunoglobulina. -

[0312] As condições de PCR foram da seguinte forma: temp. duração

[0313] O produto de PCR foi verificado para o tamanho e pureza por eletroforese em gel de agarose e clonado no vetor pCR4 (Invitrogen Corp., EUA) com o uso do kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen Corp., EUA). Os clones de plasmídeos foram isolados e analisados por digestão de restrição e eletroforese em gel de agarose. Para cada linhagem celular, 19 a 22 plasmídeos contendo a inserção foram sequenciados. Para estimar a eficiência de desaminação do tratamento com bissulfito em sítios não CpG, foi determinado o número de citosinas residuais em sítios não CpG. A eficiência de desaminação percentual foi calculada da seguinte forma: Emod = 100-(Cres/Ctotal*100) (Fórmula 4)

[0314] com: - Emod(%): eficiência de desaminação, - Cres: número de citosina residual em sítio não-CpG em todos os insertos analisados, sítios de primers PCR excluídos, - Ctotal: número de citosina no fragmento de promotor/enhancer de CMV tratado sem bissulfito, sítios de primer PCR excluídos, multiplicado pelo número de inserções analisadas, isto é, 107 * 20.

[0315] Descobriu-se que a eficiência de desaminação em citosina sem-CpG foi maior que 99% em todas as amostras (Tabela 4). TABELA 4 EFICIÊNCIA DE DESAMINAÇÃO EM CITOSINA SEM CPG

[0316]A proteção da citosina 5-metil da desaminação foi confirmada por tratamento com bissulfito e subsequente clonagem e sequenciamento do DNA plasmidial isolado a partir de E.coli dcm +. A E.coli dcm+ metila os resíduos internos de citosina dentro das sequências CCAGG ou CCTGG (sítios dcm). Verificou-se que a eficiência de desaminação foi de 99% em sítios não dcm e menor do que 5% em citosinas internas nos sítios dcm.

[0317] Para quantificar a extensão da metilação do DNA em sítios CpG nos fragmentos do promotor/enhancer de CMV tratados com bissulfito, o número de citosinas encontradas em cada sítio CpG foi determinado e representado graficamente para cada célula analisada.

[0318] A linhagem celular K18.1 é altamente metilada (Figura 3A). A frequência de metilação se acumula em 3 agrupamentos, um na extremidade 5’, um na extremidade 3’ e um por volta da posição 400. O maior grau de metilação foi encontrado na posição 425. Quatorze das vinte e duas inserções sequenciadas continham uma citosina nessa posição.

[0319] A metilação do promotor de CMV a partir das linhagens celulares 43-16 A10 foi notável (Figura 3E). A distribuição de metilação foi similar à distribuição observada na linhagem celular K18.1. A posição 425 foi metilada na maioria das vezes. Cinco das vinte inserções sequenciadas continham uma citosina nessa posição.

[0320] Nas outras três linhagens celulares investigadas, as citosinas foram detectadas somente de modo esporádico nos sítios CpG (Figuras 3B, 3C e 3D).

EXEMPLO 5 PCR QUANTITATIVA ESPECÍFICA PARA METILAÇÃO DO DNA DE PROMOTOR/ ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO TRATADO COM BISSULFITO

[0321] Nesse exemplo, é relatada uma qPCR em tempo real específica para metilação, como método para detectar a metilação de CpG em uma posição, para ser mais preciso na posição 425 do ácido nucleico do promotor de CMV.

[0322] Dois conjuntos de primers foram projetados:

[0323] um par de primers específico para metilação (par de primers MSP) amplificando seletivamente o DNA do promotor de CMV desaminado com uma citosina na posição 425 representando o DNA que é metilado na posição 425, e

[0324] um par de primers universal que amplifica o DNA do promotor de CMV desaminado, independentemente do estado de metilação.

[0325] O par de primers universal foi usado para normalização. Para serem usados na mesma corrida de PCR, ambos os pares de primers deveriam ter pontos de fusão similares.

[0326] O desenho de primers de detecção de metilação na posição 425 foi complicado pela presença de dois sítios CpG adicionais em estreita proximidade (posição 416 e posição 437). Primers sensíveis à metilação deveriam detectar 5mC425 independente do estado de metilação da posição 416 e da posição 437.

[0327] Quatro fragmentos isolados desaminados do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano no Exemplo 4 representando as possíveis variações das sequências nas posições 425 e 437: n° 11, n° 62, n° 01 e n° 04 (Tabela 5, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22) foram usadas como moldes qPCR para PCR específico para metilação e pares de primers universais. TABELA 5 RESULTADOS EXPERADOS PARA MSP E PARES DE PRIMERS UNIVERSAIS EM QPCR

[0328] Com o primer universal, todos os quatro moldes podem ser comparavelmente amplificados, enquanto que o par de primers específico para metilação pode amplificar seletivamente o molde n° 62 e o molde n° 01. ΔCp deveria ser o menor possível entre o par de primers específico para metilação e o par de primers universal nos moldes n° 62 e n° 01. Os valores de Cp obtidos com o par de primers específico para metilação nos moldes n° 11 e n° 04 deveriam ser os maiores possíveis, isto é, ΔCp em comparação à amplificação com o par de primers universal deveriam ser máximos.

[0329] Para qPCR o Sistema LightCycler® 480 II foi empregado (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e as amostras foram preparadas com o uso de LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Cinco microlitros da solução molde contendo 0,05 ng de DNA foram combinados com 15 μL de PCR master mix em um poço de uma placa com 96 poços.

[0330] 15 μL de PCR master mix compreendeu: - 4,2 μL de água, - 0,4 μL primer forward 239, 263 ou 264 (também possível primer 227, 228, 240, 238) (10 pmol/μL), - 0,4 μL primer reverse 237, 254, 262, 265, 266, 267 ou 268 (também possível primer 229) (10 pmol/μL), - 10 μL de SYBR Green I Master. -

[0331] A placa multipoço foi selada com uma folha de vedação LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e centrifugada a 1.500 x g por 2 minutos. Depois a placa foi montada no sistema LightCycler® 480 e submetida a qPCR. Cada amostra foi testada em duplicata, triplicata ou quadruplicata. Para permitir a determinação de números de cópias absolutas, foram geradas curvas padrão para a LC e a transgene da HC, com o uso do plasmídeo de expressão linearizado como padrão. As diluições padrão continham 2,5 x 107, 2,5 x 106, 2,5 x 105, 2,5 x 104 ou 2,5 x 103 cópias de plasmídeos. O DNA genômico foi testado em triplicata; foram executados padrões em quadruplicata.

[0332] As condições de PCR usadas foram: mCapp = 2Cp(t)-Cp(m)*100 (Fórmula 5

[0333] A coleta e análise dos dados foi feita com o programa de computação LightCycler® 480 versão 1.5. O grau evidente de metilação foi calculado com o uso da seguinte fórmula, onde a eficiência de amplificação ideal foi assumida (E = 2).

[0334] com: - mCapp (%): grau aparente de metilação, - Cp(t): Valor Cp obtido com primers universais, - Cp(m): Valor Cp obtido com primers específicos para metilação.

[0335] Durante a avaliação do primer, verificou-se que projetar primers específicos para metilação, que são altamente seletivos para o DNA do promotor de CMV desaminado com uma citosina na posição 425 (“metilado”), tem que ser realizado com cuidado. Os primers 266 e 267 mostraram diferença máxima entre Cp (n° 11) e Cp (n° 62), isto é, a maior seletividade para DNA “metilado”. Os primers 265, 268 e 254 mostraram seletividade menor. Os pares de primers universais 263/237 foram testados como controles para ΔCp mínimo (Figura 6 e Tabela 6). TABELA 6 RESULTADOS DE AVALIAÇÃO DE PRIMER Primer Molde Média de Cp STD Cp ΔCp [Cp(n° 11) -

[0336] Na Figura 5 os resultados obtidos com os pares de primers específicos para metilação 239/267 (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18) em combinação com os pares de primers universais 239/237 (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 9) são mostrados. Os pares de primers universais 239/237 amplificaram todos os quatro moldes igualmente bem, enquanto que os pares de primers específicos para metilação 239/267 amplificaram os moldes n° 62 e n° 01. Os moldes n° 11 e n° 4 são fracamente amplificados pelos pares de primers 239/267.

[0337] A frequência de metilação calculada a partir dos valores Cp era quase 100% para os moldes n° 62 e n° 01 e quase 0% para os moldes n° 11 e n° 04 (Tabela 7A). Isso mostra que os pares de primers específicos para metilação 239/267 em combinação com os pares de primers universais 239/237 podem ser usados para discriminar o DNA do promotor de CMV, que é metilado na posição 425 a partir do DNA do promotor de CMV, que é não metilado na posição 425 por qPCR em tempo real.

[0338] Pares de primers adicionais, universais e específicos para metilação, foram encontrados e são caracterizados nas Tabelas 7A e 7B. TABELA 7A PRIMER 267 REVERSE ESPECÍFICO PARA METILAÇÃO E PRIMER 237 REVERSE ESPECÍFICO PARA NÃO METILAÇÃO COMBINADO COM TRÊS DIFERENTES PRIMERS FORWARD

TABELA 7B PRIMER 266 REVERSE ESPECÍFICO PARA METILAÇÃO E PRIMER 237 REVERSE ESPECÍFICO PARA NÃO METILAÇÃO COMBINADO COM DOIS DIFERENTES PRIMERS FORWARD

[0339] Para a quantificação do grau de metilação sobre uma ampla gama, o molde n° 62 foi misturado em diferentes razões com o molde n° 11. A qPCR foi realizada conforme descrito acima com o uso dos pares de primers 239/237 e 239/267 e a recuperação do molde n° 62 no fundo do molde n° 11 foi calculada.

[0340] Para o cálculo da fração de DNA do molde n° 62, foram determinadas as eficiências de amplificação dos pares de primers sob as condições usadas. As diluições em série dos moldes n° 62 e n° 11 a partir de n = 0,005 ng a 0,5 ng de DNA foram submetidas à qPCR e os valores de Cp determinados foram plotados contra log (n). A linha de regressão linear foi calculada com o uso de XLfit (Microsoft). A eficiência de amplificação foi calculada com o uso da seguinte fórmula: E = 10-1/m (Fórmula 6)

[0341] com - E: eficiência de amplificação, - m: inclinação da linha de tendência linear.

[0342] As eficiências de amplificação de ambos os pares de primers foram calculadas para ser aproximadamente 1,7. A seguinte fórmula foi empregada para calcular a fração do DNA molde n° 62: mC = 1,7Cp(t)-cp(m)*100 (Fórmula 7)

[0343] com - mC (%): fração de DNA metilado na posição 425, - Cp(t): Valor Cp obtido com par de primers universal, - Cp(m): Valor Cp obtido com par de primers específico para metilação.

[0344] As frações determinadas de DNA molde n° 62 a partir de dois experimentos independentes foram plotadas contra os valores esperados (Figura 7). Quantificação de metilação entre 1% e 100% pode ser executada. EXEMPLO 6 IDENTIFICAÇÃO DO ESTADO DE METILAÇÃO DE C-425 DENTRO DO DNA DO PROMOTOR/ ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO POR TRATAMENTO COM BISSULFITO E PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL TRATAMENTO COM BISSULFITO DE DNA GENÔMICO DE LINHAGENS CELULARES CHO

[0345] O ensaio foi realizado conforme descrito em Osterlehner et al. (acima). O DNA genômico foi isolado a partir das linhagens celulares CHO com o uso do Kit Allprep DNA/RNA Mini da Qiagen (Hilden, Alemanha). Cinco microgramas de DNA foram clivados com a enzima DraI e quantificados medindo a extinção a 260 nm. Cem nanogramas de DNA foram submetidos a tratamento de bissulfito e purificado com o uso do Kit EpiTect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA tratado com bissulfito foi recuperado em 20 μL de RNAse livre de água (Qiagen, Hilden, Alemanha).

[0346] A fim de amplificar a fita A (forward) do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 2), 1 μL de DNA tratado com bissulfito foi combinado com 24 μL de PCR master mix e submetido a PCR com o uso do GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc., EUA).

[0347] 24 μL de PCR master mix compreendeu: - 1 μL de primer forward 227 de SEQ ID NO: 6 (10 pmol/μL), - 1 μL de primer reverse 229 de SEQ ID NO: 8 (10 pmol/μL), - 22 μL de Platinum® PCR SuperMix HighFidelty - (Life Technologies, Carlsbad, CA).

[0348] O primer forward 227 é complementar à extremidade 5’ do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano. O primer reverse 229 se liga a jusante no interior da 5’-UTR dos genes de imunoglobulina.

[0349] As condições de PCR foram da seguinte forma:

[0350] O produto de PCR foi verificado quanto ao tamanho e pureza por eletroforese em gel de agarose. PCR EM TEMPO REAL QUANTITATIVA ESPECÍFICA PARA METILAÇÃO

[0351] Os sistemas LightCycler 480 II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) em combinação com LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram usados para realizar qPCR. Cinquenta picogramas de DNA plasmidial, 3 μL de DNA genômico tratado com bissulfito ou 5 μL de uma diluição 1:50000 do produto de PCR com os primers 227 e 229 (SEQ ID NO: 6/8) com DNA genômico tratado com bissulfito foram usados como moldes. Para a qPCR, os moldes foram misturados com 4 ou 12 pmol de primer forward e primer reverse, 10 μL de LightCycler 480 SYBR Green I Master, e água livre de nuclease, para fazer um volume total de 20 μL. Para quantificar o total de fragmentos de DNA de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano os pares de primers 239/237 (SEQ ID NO: 11/9) foram usados, o DNA metilado na posição C-425 (SEQ ID NO: 1) foi detectado com os pares de primers 239/267 (SEQ ID NO: 11/18). A mistura de PCR foi adicionada a uma placa multipoços.

[0352] A placa multipoço foi selada com uma folha de vedação LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e centrifugada a 1.500 x g por 2 minutos. Depois a placa foi montada no sistema LightCycler® 480 e submetida a qPCR. Cada amostra foi testada em duplicata, triplicata ou quadruplicata.

[0353] As condições de PCR foram da seguinte forma:

[0354] A coleta e análise dos dados foram realizadas com o programa de computação LightCycler 480 versão 1.5 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). A metilação de mC foi expressa em porcentagem com a seguinte equação: mC = ECq(t)-cq(m) * wo (Fórmula 8)

[0355] Sendo Cq(t) o ciclo de quantificação obtida com os pares de primers universais, Cq(m) representa o ciclo de quantificação obtido com os pares de primers específicos para metilação 239/267, e E sendo a eficiência de amplificação (MIQE Guidelines). E foi de aproximadamente 1,7 para 0,2 pmol/μL de concentração do primers e 2,0 para 0,6 pmol/μL de concentração do primers.

EXEMPLO 7 CORRELAÇÃO DE METILAÇÃO DE PROMOTOR/ ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO- INICIAL DE CMV HUMANO COM PRODUTIVIDADE EM LONGO PRAZO QPCR ESPECÍFICA PARA METILAÇÃO COM A FITA A DE PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO PRÉ AMPLIFICADA

[0356] Conforme relatado no Exemplo 4, o DNA genômico foi isolado a partir de linhagens celulares CHO K18.1, G25-10, G25-17, G42-5 e 43-16 A10, clivado com a enzima DraI e desaminado por tratamento com bissulfito. A fita A do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano foi amplificada com o uso dos primers 227 e 229.

[0357] O produto de PCR foi diluído a 1:50.000. Cinco microlitros de cada uma das diluições foram usados para a qPCR em tempo real. Os primers 239 e 237 foram empregados para a quantificação total do DNA promotor de CMV; os primers 239 e 267 foram empregados para a quantificação do DNA promotor/enhancer de CMV metilado na posição 425. As amostras foram testadas em triplicatas. Os moldes n° 11, n° 62 e n° 01 foram usados como controles.

[0358] A qPCR foi elaborada conforme relatado no Exemplo 5 combinando 5 μL do molde com 15 μL de PCR master mix. As condições da PCR foram conforme relatadas no Exemplo 5. A temperatura de anelamento do primer foi de 58°C. QPCR ESPECÍFICA PARA METILAÇÃO COM DNA GENÔMICO TRATADO COM BISSULFITO

[0359] O DNA genômico foi extraído a partir de linhagens celulares CHO K18.1, G25-10, G25-17, G42-5 e 43-16 A10, clivado com a enzima Dra I e desaminado por tratamento com bissulfito. Dois microlitros de DNA desaminado, diluídos em 3 μL de água, foram usados como molde para a qPCR em tempo real aplicando os pares de primers 239/237 para a amplificação total da fita A do CMV promotor/enhancer e os pares de primers 239/267 para a amplificação da fita A de promotor/enhancer de CMV metilado na posição 425. As amostras foram testadas em triplicatas. Os moldes n° 11 e n° 62 foram usados como controles.

[0360] A PCR foi montada e a qPCR foi realizada conforme relatado no Exemplo 5. A temperatura de anelamento do primer foi de 58°C.

[0361] Para a) e b) a fração de DNA promotor metilado na posição 425 foi calculada da seguinte forma: mC = 1,7Cp(t)-Cp(m)*100 (Fórmula 7)

[0362] com: mC (%): fração de DNA metilado na posição 425, Cp(t): Valor Cp obtido com par de primers universal 239/237, Cp(m): Valor Cp obtido com primer específico para metilação 239/267.

[0363] Ambas as estruturas de ensaios forneceram resultados comparáveis. O desvio padrão das triplicatas foi maior sem pré-amplificação da fita A do promotor de CMV (Figuras 8A e 8B). A metilação da posição 425 do ácido nucleico promotor de CMV nas linhagens celulares K18.1, G25-10, G25- 17 e 43-16 A10 foi maior do que o valor de fundo de desaminação incompleta, que foi encontrado como sendo cerca de 1%. A metilação na linhagem celular G42-5 foi inferior ou máxima a nível de fundo. Para a linhagem celular K18.1 foi determinada a maior metilação (mais de 60%).

[0364] A configuração do ensaio a) foi realizada com outros pares de primers universais e específicos para metilação. Para o cálculo da fração de DNA metilado na posição 425, assumiu-se a eficiência de amplificação para todos os pares de primers como 2: mC = 2Cp(t)-Cp(m)*100 (Fórmula 5’)

[0365] com: - mC (%): fração de DNA metilado na posição 425, - Cp(t): Valor Cp obtido com par de primers universal, - Cp(m): Valor Cp obtido com par de primers específico para metilação. -

[0366] A Tabela 8 mostra um resumo de combinações de pares de primers que foram testados tanto em moldes de DNA clonado como no DNA genômico com ou sem pré-amplificação do DNA promotor de CMV. TABELA 8 COMBINAÇÕES DE PARES DE PRIMERS

EXEMPLO 8 METILAÇÃO DO PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO E PREDIÇÃO DE INSTABILIDADE DE PRODUÇÃO DA LINHAGEM CELULAR CHO RECOMBINANTE

[0367] As células CHO-K1 foram transfectadas com um plasmídeo que codifica um anticorpo de IgG4 humano e os clones estáveis foram selecionados com o uso do sistema DHFR/MTX. Os clones parentais com alta produção foram subclonadas por diluição limitante. MTX foi mantido em meio de crescimento durante todo o processo de geração de linhagens celulares. Foram selecionados 16 subclones de 10 clones parentais.

[0368] As células selecionadas foram recultivadas com 250 nM de MTX. Assim que elas mostraram um crescimento estável, foram testadas quanto à estabilidade de produção em longo prazo acima de 60 a 80 gerações, na presença e na ausência de MTX. A alteração relativa de SPR acima de 60 gerações foi calculada. A metilação do C435 foi determinada no início do estudo com células cultivadas com MTX e no final do estudo, a partir de células que tinham sido cultivadas sem MTX.

[0369] A metilação de C425 no início do estudo foi representada graficamente contra a alteração relativa de SPR na presença (Figura 11A) e na ausência de MTX (Figura 11B). A maioria dos clones com menos de 5% de metilação em C425 pode ser encontrada na fração de clones estáveis (menos de 40% de decréscimo de SPR com ou sem MTX), enquanto que a maioria dos clones com mais de 5% de metilação em C425 agrupado na fração dos clones instáveis. Isto foi independente do fato da metilação estar correlacionada com a estabilidade na presença ou na ausência de MTX (consulte também a Tabela 9). A maioria dos clones estáveis, que perdem menos que 20% da produtividade com MTX e menos de 30% da produtividade sem MTX, exibem menos de 5% de metilação de C425. TABELA 9 CORRELAÇÃO DA METILAÇÃO COM ESTABILIDADE NA PRESENÇA OU NA AUSÊNCIA DE MTX (A) E NÚMERO DE CÓPIAS DE PLASMÍDEO (B)

[0370] Este achado mostra que a determinação da metilação de C425 pode ser usada como um marcador preditivo para determinar a estabilidade da expressão do polipeptídeo em clones de células geradas e, através disso, permitindo a seleção de clones estáveis com produtividade estável durante o desenvolvimento das linhagens celulares. Verificou-se que a metilação de C425 de 5% ou menos é um critério adequado para a seleção de clones celulares estáveis.

[0371]Verificou-se ainda que dois clones de células intermediariamente estáveis, bem como dois clones muito instáveis que não foram metilados, no início do estudo, aumentaram a metilação acima de 5% durante os testes de estabilidade sem MTX (consulte também a Figura 12). Isso mostra que a fração de clones de células que são preditas como falsamente estáveis (clones de células falso-negativas) pode ser reduzida por cultivo durante algum tempo na ausência de MTX antes do teste.

[0372] A fim de confirmar metilação C425 por um segundo método, realizamos sequenciamento com bissulfito com clone altamente metilado 44-28 (Figura 13). O grau de metilação de C425 mostrou ser de 80%. Isso foi consistente com o resultado da PCR específica para metilação, considerando-se a variação de ambos os ensaios. Assim como acontece com os clones K18.1 e 43-16 A10 (Figura 4), C425 foi metilada na maioria das vezes entre todos os sítios CpG dentro do DNA promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano. Outros eventos de metilação foram agrupados na extremidade 5’ e na extremidade 3’. O grau médio de metilação em todos os sítios foi de 18%. EXEMPLO 9 METILAÇÃO PRECOCE COINCIDE COM OS ALTOS NÚMEROS DE CÓPIAS DO TRANSGENE

[0373]As cópias integradas de genes de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina no início e no fim do teste de estabilidade foram determinadas com o uso de um ensaio qPCR multiplex baseado no princípio de TaqMan. Dois conjuntos de primers que consistem em um primer forward, um primer reverse e uma sonda de hidrólise foram usados: um sendo específico para o gene da cadeia kappa humana, o outro sendo específico para os genes da cadeia pesada gama humanos. Para permitir a determinação absoluta do número de cópias, o plasmídeo de expressão linearizado, que havia sido usado para a transfecção, foi usado como um padrão. Eficiência de amplificação igual de amostras e padrão foi assegurada.

[0374] Para a qPCR, o sistema LightCycler® 480 II foi empregado (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e as amostras foram preparadas com o uso de LightCycler® 480 Probes Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha).

[0375] Cinco microlitros (5 μL) de solução molde contendo 50 ng de DNA genômico foram combinados com 15 μL de PCR master mix no poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. No caso do padrão, a solução molde continha 2,5 x 107, 2,5 x 106, 2,5 x 105, 2.5 x 104 e 2.5 x 103 cópias do DNA plasmidial linearizado correspondente.

[0376] 15 μL de PCR master mix compreendeu: - 10 μL de LightCycler® 480 Probes Master - 1 μL de primer forward n°133 (10 pmol/μL) - 1 μL de primer reverse n°132 (10 pmol/μL) - 0,5 μL de sonda n°166 (10 pmol/μL) - 1 μL de primer forward n°178 (10 pmol/μL) - 1 μL de primer reverse n°180 (10 pmol/μL) - 0,5 μL de sonda n°185 (10 pmol/μL). -

[0377] A placa foi selada com uma folha de vedação LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e centrifugada a 1.500 g por 2 minutos. Depois a placa foi montada no sistema LightCycler® 480 e submetida a qPCR. Cada amostra foi testada em triplicata, foram executados padrões em quadruplicata.

[0378] As condições de PCR foram da seguinte forma:

[0379] A coleta e análise dos dados foi realizada com o uso do programa de computação LightCycler® 480 versão 1.5. Basicamente, a média de valores de Cp das diluições padrão de plasmídeo foram plotadas contra o número de cópias do respectivo gene para gerar uma curva padrão a partir da qual o número de transgenes na amostra foi extrapolado.

[0380] O número de transgenes por célula foi calculado supondo que a média de conteúdo de DNA por célula é jpg: - Nc = Ns/50000*6 - Nc: número de cópias de transgene por célula - Ns: número de cópias de transgene na amostra TABELA 10 SEQUÊNCIAS DE PRIMER

[0381] A Figura 14 representa os números de cópias do gene de cadeia leve de células metiladas e não metiladas antes e depois do teste de estabilidade. Não surpreendentemente, os números de cópias idênticas foram encontrados no gene da cadeia pesada porque as células haviam sido transfectadas com um vetor duplo do gene que carrega ambos os genes (dados não mostrados). A metilação inicial, isto é, metilação antes do teste de estabilidade, foi encontrada exclusivamente com células carregando mais de 10 cópias do transgene, enquanto alguns clones com menos de 10 cópias do transgene adquiriram a metilação durante o teste de estabilidade. Como consequência, a seleção de clones com baixo número de cópias do transgene antes do teste de estabilidade enriquece igualmente os clones com uma produtividade estável (Tabela 11). TABELA 11 CORRELAÇÃO DE CÓPIAS DO TRANSGENE COM ESTABILIDADE NA PRESENÇA OU NA AUSÊNCIA DE MTX

[0382] Observou-se ainda que a instabilidade na produção não estava geralmente associada com a perda de cópias do transgene. Clones 1A5-05, 1A5-21, 1A5-24 e 2B1-02 perderam cópias de transgene, 2B-13 foi estável e 14-13 bem como 14-23 aumentaram em cópias do gene (consulte também a Figura 11B).

EXEMPLO 10 IDENTIFICAÇÃO DAS MODIFICAÇÕES DE HISTONAS PERTO DO DNA PROMOTOR/ ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO POR IMUNOPRECIPITAÇÃO DE CROMATINA E PCR EM TEMPO REAL IMUNOPRECIPITAÇÃO DE CROMATINA DE LINHAGENS DE CÉLULAS CHO

[0383] O fragmento de promotor/enhancer principal-imediato- inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1) usado para a expressão das cadeias leve e pesada do anticorpo está perto das histonas que compactam o DNA (cromatina) em linhagens celulares produtoras estáveis. Um acúmulo de histonas modificadas perto do fragmento promotor/enhancer principal-imediato- inicial de CMV humano será medido com o ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP).

[0384] Trinta e duas linhagens de células CHO (amostras H-1 a H- 20 e T-1 a T-12, consulte Tabela 3) foram fixadas em formaldeído 3,7% por 10 minutos em temperatura ambiente. A fixação foi interrompida em glicina 10% por 5 minutos. As células foram lisadas por 10 minutos em gelo em tampão de lise celular, centrifugadas com 5000 rpm, 4 minutos a 4°C. Os péletes foram ressuspensos em tampão de Lise de Núcleos e a cromatina foi sonicada até um tamanho médio de fragmento de 200 a 50bp com Branson Sonifier B15. As concentrações dos fragmentos de cromatina foram determinadas com kit Pierce® BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, EUA). Foram adicionados 2,5 μg a 100 μg de fragmentos de cromatina a 1,5 volume de tampão de diluição IP contendo 3 μL a 12 μL de anticorpo e incubados durante a noite a 4°C com rotação de 25 rpm.

[0385]Microesferas de proteína A Agarose (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram bloqueadas em tampão de diluição IP com 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e 5mg/mL de BSA (Albumina de Soro Bovino, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) durante a noite a 4°C. Precipitados anticorpo- cromatina foram purificados por incubação em microesferas de agarose bloqueadas por 1 hora, seguido por incubação por 5 minutos a 4°C, 2x com baixo teor de sal, 1x com alto teor de sal, 1x com LiCl e 1x com tampão de lavagem. Os anticorpos foram eluídos a partir das microesferas de agarose com 200 μL de tampão de eluição IP por 30 minutos a 65°C. 0,5 μL de RNAse e DNAse livres (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram adicionados para digerir o RNA a 37°C por 30 minutos. Para a digestão de proteínas, NaCl (concentração final de 0,2 M) e proteinase K (concentração final de 100 a 200 μg/mL) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram adicionados e a solução foi incubada por 1,5 hora a 65°C. O DNA foi recuperado com o kit de purificação de PCR da Roche em 150 μL de H2O de grau de PCR (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). TABELA 12

TABELA 13 ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA HISTONA OU MODIFICAÇÕES DE HISTONA

PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL DE DNA DE CHIP

[0386] PCR em tempo real quantitativa foi usada para detectar um acúmulo de modificações de histonas específicas no fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1) em linhagens de células CHO, por medição da quantidade relativa dos fragmentos promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano por imunoprecipitação da cromatina.

[0387] O DNA genômico da Amostra de Entrada não tratada (IS) e os fragmentos de cromatina do anticorpo purificado foram amplificados por PCR em tempo real quantitativa com o uso de LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) com o uso do sistema LightCycler 480 II (Roche Diagnostics GmbH , Mannheim, Alemanha). Para quantificar a quantidade do fragmento de promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1) foram usados primers específicos para possíveis genes de referência e para o fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano. TABELA 14 SEQUÊNCIAS DE PRIMERS PARA PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL

[0388] 2,5 μL de fragmentos de DNA eluídos, 1 μL (10 pmol/μL) de primer forward 396 (SEQ ID NO: 32) e 1 μL (10 pmol/μL) de primer reverse 397 (SEQ ID NO: 33) para o fragmento de promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano (SEQ ID NO: 1), 5 μL de LightCycler 480 SYBR Green I Master e nuclease livre de água foram misturados até um volume total de 10 μL. Os genes de referência foram quantificados na mesma placa. A mistura foi aplicada em placas de 384 poços (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha).

[0389]A placa foi selada com uma folha de vedação LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e centrifugada a 1.200 g por 3 minutos. Depois a placa foi montada no sistema LightCycler® 480 e submetida a qPCR em tempo real. Cada amostra foi testada em triplicata.

[0390] As condições de PCR foram da seguinte forma:

[0391] A coleta e análise dos dados foi feita com o programa de computação LightCycler® 480 versão 1.5.

EXEMPLO 11 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE FRAGMENTO DE PROMOTOR/ ENHANCER PRINCIPAL- IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO EM MODIFICAÇÕES DE HISTONAS EM PCR EM TEMPO REAL ESTABILIDADE DE GENES DE REFERÊNCIA

[0392] Nesse exemplo foi calculada a estabilidade de genes de referência potenciais para modificações específicas de histona com o programa “Normfinder”. O modelo e a estrutura estatística subjacente “NormFinder” são descritas em Andersen, C.L., et al. Cancer Res. 64 (2004) 5245-5250.

[0393] O “NormFinder add on” para excel fornece o valor de estabilidade para cada gene, que é uma medida direta para a variação de expressão estimada. O gene com o menor valor de estabilidade é o gene mais estável. É suposto que os dados de entrada estejam em uma escala linear, dessa forma, o Método de Entrada Percentual foi usado para linearizar quantidades de expressão de escala com o uso da seguinte fórmula: % de Amostra de Entrada = 100* 2ΔCq (Amostra de Entrada - Amostra ChIP) (Fórmula 9)

[0394] Cinco genes (consulte Tabela 15) foram testados com “Normfinder”. Vinte amostras (H-1 a H20) em três replicatas biológicas foram investigados quanto à estabilidade da acetilação de histona 3, metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona 3 perto do fragmento do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano e aos genes de referência. TABELA 15 VALORES DE ESTABILIDADE DE POSSÍVEIS GENES DE REFERÊNCIA E DO FRAGMENTO PROMOTOR/ ENHANCER PRINCIPAL-INTERMEDIÁRIO-INICIAL DE CMV HUMANO

[0395] O gene de referência Gusb é mais estável do que os outros controles em condições de ChIP escolhidas. Gusb foi usado como gene de referência para a normalização da acetilação da histona 3, metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona 3 e níveis de histona 3. ESTIMATIVA DA EFICIÊNCIA DE AMPLIFICAÇÃO DE PARES DE PRIMERS COM O PROGRAMA DE COMPUTAÇÃO LINREGPCR

[0396] Nesse exemplo, a eficiência da amplificação do par de primers para fragmento do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano e do par de primers para o gene de referência 386/387 Gusb foram estimados com o programa de computação LinRegPCR (http://www.hartfaalcentrum.nl) para as amostras H-1 a H20. O programa determina a correção de linha de base de fluorescência e faz a subtração da linha de base. Em seguida, uma “Janela-de-Linearidade” é definida e as eficiências da PCR por amostra são calculada (consulte Ramakers, et al., NeuroSci Lett. 2003; Ruijter et al., Nucleic Acids Research 2009). Eff = 1 0coeficiante angular (Fórmula 11)

[0397] A eficiência individual da PCR (Eff) é deduzida a partir da inclinação da linha de regressão linear e são definidas as vezes de aumento por ciclo. Esta pode variar entre 1 e 2. Uma eficiência de 2 representa uma duplicação perfeita do amplicon em cada ciclo. TABELA 16 EFICIÊNCIA DE AMPLIFICAÇÃO DO PAR DE PRIMERS GUSB DE REFERÊNCIA E PAR DE PRIMERS MIE DE HCMV

[0398] Os pares de primers 396/397 e 386/387 produziram eficiências de amplificação estáveis e comparáveis com 20 amostras e 3 replicatas biológicas independentemente das amostras de entrada de ChIP terem sido medidas ou o DNA precipitado com anticorpos contra histona 3, histona 3 acetilada ou metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona 3. Os pares de primers 396/397 e 386/387 foram usados para a quantificação relativa da acetilação da histona 3, metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona 3 e níveis de histona 3 perto do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano relativos à histona 3 e níveis de modificação de histona 3 perto do gene de referência Gusb. MÉTODO DELTA DELTA CQ PARA QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE HISTONA EM RELAÇÃO AO NÍVEL DE HISTONA

[0399] As quantificações relativas de acetilação da histona 3, metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona 3 e níveis de histona 3 perto do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano foram estimadas com o método Livak também conhecido como método delta delta Cq (ΔΔCq).

[0400] O método pode ser usado para quantificação relativa de um alvo em relação a uma referência. Nesse exemplo, a quantificação relativa da acetilação de histona 3, metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona 3 e níveis de histona 3 perto dos níveis de histona 3 perto do fragmento de promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano foi normalizada para a modificação da histona 3 e para os níveis de histona 3 perto do gene de referência Gusb em duas etapas. Primeiro, o delta Cq foi calculado da seguinte forma: ΔCq = amostra de entrada - amostra (Fórmula 12)

[0401] Delta Cq (ΔCq) é a diferença entre os ciclos de quantificação (Cq) de condição de não tratada (amostra de entrada) e tratada (amostra de ChIP) da mesma amostra, amplificada com o mesmo par de primers. O delta Cq é usado para representar um valor relativo à condição não tratada dentro da mesma amostra. Para comparar diferentes amostras, o método delta delta Cq foi usado.

(Fórmula 13)

[0402] Nesse exemplo delta delta Cq é a diferença entre delta Cq do alvo MIE de hCMV e delta Cq da referência Gusb para todas as amostras H- 1 a H-20. As quantidades relativas de DNA determinadas com o uso dos valores Delta Cq podem ser comparadas entre as amostras.

[0403] Finalmente, os níveis de acetilação da histona 3 e metilação em 3 vezes de lisina 4 da histona foram normalizados para o nível de histona 3 para as 20 linhagens celulares CHO H-1 a H-20 em três replicatas biológicas. Os resultados com o desvio padrão são exibidos nas Figuras 15 e 16.

EXEMPLO 12 ACETILAÇÃO DA HISTONA 3 E METILAÇÃO EM 3 VEZES DE LISINA 4 DA HISTONA 3 PERTO DO FRAGMENTO DO PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO BEM COMO METILAÇÃO DE C425 DO FRAGMENTO DO PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO CORRELACIONADAS COM ESTABILIDADE EM LONGO PRAZO

[0404] A acetilação relativa e os níveis de metilação em três vezes de lisina 4 relacionados ao nível de histona 3 (H3ac/H3 & H3K4me3/H3) perto do fragmento do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano bem como a porcentagem de metilação de C425 do fragmento do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano (mC-425[%]) foram investigados em um modelo de ajuste com a personalidade “Mínimos Quadrados Padrão” ou e a ênfase “modelo de efeito alavancagem” para detectar os efeitos que influenciam a estabilidade em longo prazo das linhagens de células produtoras H-1 a H-20. Para o cálculo foi usado o programa de computação JMP versão 10 (SAS, Boeblingen, Alemanha).

[0405] Os valores de modificação de histonas e a porcentagem de metilação de C-425 das amostras de H-1 a H-20 foram alimentadas individualmente como um efeito no modelo. O percentual de alteração da taxa de produção específica (delta SPR) após 60 gerações foi alimentado como resposta. As plotagens de alavancagem resultantes são mostradas nas Figuras 17 a 19. O número de parâmetros associados com o efeito (Nparm) e os graus de liberdade são 1.

[0406] “RQuadrado” (RSq) estima a proporção da variação na resposta que pode ser atribuída ao modelo ao invés do erro aleatório. Um R2 mais próximo de 1 indica um melhor ajuste. Um R2 mais próximo de 0 indica que o ajuste prediz a resposta pior que a média da resposta global. Quadrado Médio do Erro (RMSE) estima o desvio padrão do erro aleatório. Ele é a raiz quadrada do Quadrada Médio do Erro na Análise do Relatório de Variância. Prob>F lista o valor-p para o teste de Efeito, que informa sobre a significância de um efeito. TABELA 17 VALORES-P DE EFEITOS ALIMENTADOS H3K4ME3/H3 AND H3AC/H3 CALCULADOS NO TESTE DE EFEITO. CALCULADO EM TRÊS REPLICATAS BIOLÓGICAS PARA AMOSTRAS H

* valores de 0,05 ou menores foram considerados evidências de efeito significativo no modelo.

[0407] A Tabela 17 mostra a significância de mC-425[%] sob condições (-) MTX. O efeito de H3ac/H3 e H3K4-me3/H3 são significantes sob condições (+) MSX.

[0408] Os valores reais de delta SPR foram plotados contra os valores preditos em plotagens de alavancagem, em relação ao efeito e a condição de seleção com mais de 60 gerações (Figuras 17 a 19). Essas plotagens Reais por Predita mostra quanto o modelo se ajusta aos dados. Os menores valores de p foram detectados para o efeito H3ac/H3 com agente de seleção (Figura 18), seguido pelo efeito mC 425[%] sem agente de seleção (Figura 19). ANÁLISE DE VALORES DISCREPANTES EM COMPARAÇÃO A CONDIÇÕES COM E SEM AGENTE DE SELEÇÃO MSX PARA OS VALORES DELTA SPR DAS AMOSTRAS H-1 A H- 20

[0409] As plotagens de alavancagem da condição sem agente de seleção ((-) MSX) tiveram valores consideravelmente aberrantes para delta SPR na amostra H-18. Portanto, foi feita análise de valores discrepantes mostrando Distâncias Jackknife (Figura 20).

[0410] Isso verifica que o aumento de delta SPR na amostra H-18 sob a condição de (-) MSX é anormal em comparação a todas as outras amostras. Portanto, as análises de alavancagem foram repetidas sem a amostra H-18. Os valores de p calculados do efeito do teste para as 19 amostras H-1 a H-17 e H-19 a H-20 são exibidos na Tabela 18. TABELA 18 VALORES-P DE EFEITOS ALIMENTADOS H3K4ME3/H3 AND H3AC/H3 CALCULADOS NO TESTE DE EFEITO. VALORES-P CALCULADOS DE 19 AMOSTRAS H-1 A H-17, H- 19, H-20) EM TRÊS REPLICATAS BIOLÓGICAS

* valores de 0,05 ou menores foram considerados evidências de efeito significativo no modelo.

[0411] A Tabela 18 mostra a alta significância de H3ac/H3 em ambas as condições de seleção. O efeito de H3K4-me3/H3 é significante na condição (+) MSX.

[0412] Os valores reais de delta SPR foram plotados contra os valores preditos em parcelas de alavancagem, sobre o efeito e a condição de seleção com mais de 60 gerações (Figuras 20 a 22). As plotagens Reais por Preditas mostram quanto o modelo se ajusta aos dados. O melhor ajuste foi observado para o efeito H3ac/H3 (Figura 21).

EXEMPLO 13 PREDIÇÃO DA INSTABILIDADE DE PRODUÇÃO EM LINHAGENS DE CÉLULAS CHO RECOMBINANTES COM O USO DE MODIFICAÇÕES DE HISTONA PERTO DO PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO E METILAÇÃO DE C425 DO FRAGMENTO DE PROMOTOR/ENHANCER PRINCIPAL-IMEDIATO-INICIAL DE CMV HUMANO COMO MARCADOR AUMENTO DA MÉDIA DELTA SPR DE AMOSTRAS DO PROJETO H, REJEITANDO LINHAGENS PRODUTORAS DE CÉLULAS RUINS COM CONFIGURAÇÕES DE FILTRO

[0413] Conforme relatado no Exemplo 12, os valores de amostras discrepantes da amostra H-18 foram excluídos das investigações adicionais de estabelecimento do marcador de predição.

[0414] Os níveis de acetilação de histona 3 relativos ao nível de histona 3 perto do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano e a porcentagem de metilação de C-425 do fragmento do promotor/enhancer principal-imediato-inicial de CMV humano foram investigados como marcadores preditivos para a estabilidade de produção com e sem agente de seleção.

[0415] Conforme descrito em Osterlehner et al., o filtro para os valores de mC-425[%] foram definidos como 5%. Valores acima de 5% foram rejeitados para aumentar a média de delta SPR das amostras restantes.

[0416] Para os valores de H3ac/H3 das amostras H-1 a H-17, H- 19 e H-20 uma árvore de decisão foi calculada com o programa de computação com jmp. Melhor nó de divisão e, portanto, melhor filtro foi calculado com a estatística LogWorth. A LogWorth é calculada como: -log10(valor-p) (Fórmula 14)

[0417] O valor p ajustado é calculado de uma maneira complexa que leva em conta o número em que diferentes formas de divisões podem ocorrer. Esse cálculo é muito justo em comparação ao valor p não ajustado, o que favorece X’s com muitos níveis, e o valor p de Bonferroni, o que favorece X’s com pequenos números de níveis (white paper. “Monte Carlo Calibration of Distributions of Partition Statistics”).

[0418] A melhor decisão sob condição (+) MSX para as amostras H-1 a H-17, H-19 e H-20 foi 0,58 de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3). Para reduzir o número de amostras de falsos negativos o filtro foi ajustado para o valor mais baixo de A >0,5 H3ac/H3.

[0419] Ambos os filtros foram usados separadamente e em combinação. Foram calculadas as médias de delta SPR em condições com ou sem agente de seleção MSX para cada porta positiva em comparação com a média não filtrada (Tabela 19). TABELA 19 MÉDIAS CALCULADAS DE DELTA SPR COM E SEM AGENTE DE SELEÇÃO E SOB CONDIÇÕES DE FILTRO A> 0.5 H3AC/H3 AND B < 5 % MC-425 (%) PSP. Os VALORES FORAM CALCULADOS PARA AMOSTRAS H-1 A H-17, H-19 E H-20 REFERENTES A CONFIGURAÇÕES DE FILTRO

[0420] Cada filtro pode aumentar a média de delta SPR em comparação a condição não filtrada. A interseção dos filtros A e B aumenta a média delta SPR do filtro A >0,5 H3ac/H3. Para visualização de valores de delta SPR alterados, histogramas de cada condição e filtro são exibidos na Figura 23.

[0421] Configurações de filtro estabelecidas do projeto H foram adotadas para o projeto T para confirmar os efeitos positivos.

[0422] Vinte linhagens celulares (T-1 a T-12) também foram analisadas com configurações de filtro, conforme determinado acima (consulte Tabela 20). Para visualização de valores de delta SPR alterados, histogramas de cada condição e filtro são exibidos na Figura 25. TABELA 20 MÉDIAS CALCULADAS DE DELTA SPR COM E SEM AGENTE DE SELEÇÃO. OS VALORES FORAM CALCULADOS PARA 12 AMOSTRAS T 1 A T-12 REFERENTES A CONFIGURAÇÕES DE FILTRO

[0423] Aumento observado na média de delta de SPR filtrada comparada as amostras não filtradas em condição de (-) MTX. Com o uso da configuração de filtro de A>0.5 H3ac/H3 resulta em um aumento da média de delta SPR em comparação com os dados não filtrados.

[0424] Isso demonstra que a acetilação da histona 3 em relação ao nível de histona 3 perto do fragmento do promotor/enhancer principal- imediato-inicial de CMV humano é um marcador valioso de predição.

Claims (17)

1. MÉTODO PARA SELECIONAR UM CLONE CELULAR/LINHAGEM CELULAR, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) determinar o nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 para uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e b) determinar a frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 de SEQ ID NO: 1 para uma segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, e c) selecionar um clone celular/linhagem celular, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, que tem um nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 conforme determinado na etapa a) maior que 0,5, e que tem uma frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 conforme determinado na etapa b) menor que 5%.

2. MÉTODO PARA SELECIONAR UM CLONE CELULAR/LINHAGEM CELULAR, que compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) determinar, para cada clone celular/linhagem celular de uma primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o nível médio de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) perto do ácido nucleico promotor que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 com base no nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) determinado em pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, b) determinar para cada clone celular/linhagem celular de uma segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares, de modo que cada clone/linhagem celular compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, a média da frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 de SEQ ID NO: 1 com base na metilação determinada para pelo menos 10 células obtidas a partir de um cultivo de cada clone celular/linhagem celular, c) selecionar um clone celular/linhagem celular que tem um nível médio de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) de 0,5 ou maior, e que tem uma frequência de metilação na posição 425 abaixo de 5%.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo polipeptídeo ser uma cadeia leve de anticorpo e ainda compreender a seguinte etapa: ab) determinar o número de cópias de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados, em que a etapa c) é: selecionar um clone celular/linhagem celular que tem um nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 conforme determinado na etapa a) maior que 0,5, que tem uma frequência de metilação do sítio CpG na posição 425 conforme determinado na etapa b) menor que 5%, e que tem um número de cópias de cassetes de expressão de cadeia leve estavelmente integrados conforme determinado na etapa ab) de 10 ou menos.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela primeira grande quantidade de células e da segunda grande quantidade de células serem as mesmas grandes quantidades de células.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela determinação do nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) compreender as seguintes etapas: 1) isolar a cromatina a partir de cada um dos clones celulares/linhagens celulares, 2) tratar uma primeira alíquota da cromatina por um anticorpo específico para acetilação de histona 3 ou um anticorpo específico de histona 3 e formar um precipitado anticorpo-cromatina, e tratar uma segunda alíquota da cromatina por um anticorpo específico de histona 3 e formar um precipitado anticorpo-cromatina, 3) amplificar o DNA genômico a partir de uma terceira alíquota não tratada da cromatina, e a partir da primeira e segunda alíquotas tratadas com PCR quantitativa em tempo real, 4) determinar com o resultado obtido na etapa 3) o nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela determinação da frequência de metilação compreender as seguintes etapas: 1) isolar o DNA a partir de cada um dos clones celulares/linhagens celulares, 2) realizar, para cada DNA isolado individualmente, uma reação em cadeia da polimerase específica para metilação, 3) determinar, com os resultados obtidos na etapa 2), a frequência de metilação.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela etapa 2) ser: 2) realizar, para cada DNA isolado individualmente, uma reação em cadeia da polimerase com um primer específico para metilação e um primer universal.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelos primers universais terem a sequência de SEQ ID NO: 9 e 11, e os primers específicos para metilação terem a sequência de SEQ ID NO: 11 e 18.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo nível de acetilação de histona 3 em relação ao nível de histona 3 (H3ac/H3) ser normalizado para um gene de referência.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo gene de referência ser Gusb.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares compreender pelo menos um clone celular/linhagem celular também compreendido na primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela segunda grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares ser idêntica à primeira grande quantidade de clones celulares/linhagens celulares.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo clone celular/linhagem celular ser um clone celular/linhagem celular CHO.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4 a 13, caracterizado pelo polipeptídeo ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um conjugado de anticorpo.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo biespecífico.

16. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) selecionar um clone celular/linhagem celular com um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, b) cultivar o clone celular/linhagem celular selecionado, e c) recuperar o polipeptídeo a partir do meio de cultivo e/ou do clone celular/linhagem celular e, através disso, produzir o polipeptídeo.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender, antes da etapa a), as seguintes etapas: ) transferir uma célula de mamífero com um ácido nucleico, a qual compreende um ácido nucleico que compreende um gene estrutural que codifica um polipeptídeo ligado de maneira funcional a um ácido nucleico promotor que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, ) i) opcionalmente cultivar o clone celular/linhagem celular na presença de um agente de seleção, ii) depositar individualmente as células transfectadas, e iii) cultivar as células transfectadas depositadas individualmente na presença de um agente de seleção.

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