BR112016025096B1

BR112016025096B1 - Métodos para administração de um agente de tratamento de plantas e para criação de uma planta de milho de duplo haploide

Info

Publication number: BR112016025096B1
Application number: BR112016025096-6A
Authority: BR
Inventors: Huachun LARUE; Fenggao Dong
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2014-05-01
Filing date: 2015-05-01
Publication date: 2024-01-02
Also published as: EP3136840A4; EP3136840A1; EP3136840B1; BR112016025096A2; US20170055475A1; MX2016014307A; CN106413388B; BR112016025096A8; WO2015168659A1; CA2947163A1; CN106413388A; US10588280B2

Abstract

métodos para administração de um agente de tratamento de plantas e de criação de uma planta de milho de duplo haploide. a invenção refere-se a métodos de distribuição de um agente para tratamento de plantas a um tecido de uma planta, em que o tecido é posto em contato com um agente para tratamento de plantas e a distribuição é auxiliada por uma força centrífuga aplicada à planta. é fornecida aqui a descoberta de que melhorias drásticas na distribuição do tratamento ocorrem quando as plantas são centrifugadas depois do contato, submersão, não submersão, encharcadas ou etc. em uma solução contendo um agente de tratamento da planta. em uma modalidade plantas haploides contatadas com uma solução de colchicina são centrifugadas para revelar as aprimoradas classificações duplicadas de cromossomos quando comparado com as plantas de controle.

Description

ANTECEDENTES

[001] Controle confiável e eficaz de desenvolvimento da planta, incluindo o crescimento e reprodução, continua a ser um desafio para os cientistas de plantas. Uma maneira de alcançar este controle é a aplicação de vários agentes de tratamento de plantas que fazem com que as plantas apresentem características desejadas. Infelizmente, esta é muitas vezes apenas um método confiável quando o tratamento completamente contata um ou tecidos mais específicos que são difíceis de alcançar, como tecidos dentro da planta.

[002] Embebendo plantas por um período prolongado pode entregar alguns agentes aos tecidos desejados. No entanto, esta abordagem conduz muitas vezes a efeitos indesejados, tais como aumento da mortalidade devido ao agente ser tóxico para a planta numa exposição prolongada ou não específica.

[003] A utilização de duplo haploide, (DH) permite que os criadores gerem linhas completamente homozigotas e homogêneas em menos gerações de retrocruzamento tradicional (Eder e Chalyk, 1002; Rober et al, 1005; Chang e Coe, 1009; Geiger, 1009). Técnicas DH têm sido desenvolvidas para mais de 250 espécies de culturas (Forster e Thomas, 1005) e as linhas DH têm sido utilizadas para genômica estrutural e funcional, estudos de associação de marcador-traço, e citogenética molecular (Chang e Coe, 1009; Geiger, 1009). Incorporando tecnologias DH em uma tubulação de criação de plantas pode aumentar a eficácia da seleção (Rober et al, 1005;. Geiger, 1009; Geiger e Gordillo, 1009), reduzir a duração do ciclo de reprodução (Szarejko e Forster, 1007; Chang e Coe, 1009; Geiger e Gordillo, 1009), e reduzir os esforços necessários para a manutenção de linha (Rober et al., 1005).

[004] Embora a duplicação cromossômica espontânea ocorra, a frequência é tão baixa (tipicamente menos de 5%), que os pesquisadores tentando criar plantas duplo haploides, (coletivamente denominadas DH) com frequência sujeitam plantas haploides muitas vezes a um tratamento que promove duplicação cromossômica. Mudas haploides submetidas a um tratamento de duplicação cromossômica (denominadas plantas DH0) podem produzir embriões e/ou esperma haploide, e se aa plantas DH0 são autofecundadas com sucesso, o número de cromossomos zigóticos podem ser recuperados em prole substancialmente homozigótica (denominadas plantas DH1) que exibem o vigor e a fertilidade esperados de esporófitos 2n.

[005] Um método comum de provocar artificialmente duplicação cromossômica é aplicar o agente anti-microtúbulo colchicina (Chase, 1952, 1969; Gayen et al, 1994;. Bordes et al, 1997;. Chalyk, 1000; Eder e Chalyk, 1002; Han et al., 1006). No entanto, esta foi considerada uma abordagem pouco confiável porque os efeitos foram muitas vezes de genótipo específico (Geiger, 1009) e as concentrações de colchicina necessárias à realização da melhoria das taxas de duplicação provaram ser tóxicas para mudas tratadas (Jensen, 1974). Hoje, as instituições que tentam provocar a duplicação cromossômica estão explorando ativamente tratamentos que são menos tóxicos para tecido vegetal e menos perigosos para os técnicos humanos que realizam os tratamentos (Geiger e Gordillo, 1009).

[006] Gayen et al. (1994) removeu as pontas do coleóptilos das mudas e submeteu o corpo restante das mudas a uma imersão de maior duração (superior a 6 horas) numa concentração de baixa colchicina (0,1% ou menos) para gerar uma taxa de duplicação de 18,05%. Deimling et al. (1997) melhorou este método ao esperar para remover as pontas dos coleóptilos até que tivessem, pelo menos, 1 cm de comprimento e de imergindo as plantas em 0,06% de colchicina e DMSO durante 12 horas em um ambiente escuro. Eder e Chalyk (1002) demonstraram que este procedimento funciona em uma gama de genótipos, com uma taxa média de sucesso de quase 50%. No entanto, nenhum destes métodos é passíveis do tipo de processo de alto rendimento necessário num ambiente industrial, nem geram a taxa de duplicação necessária para tornar a prática um procedimento industrial altamente eficiente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] É aqui divulgada a constatação de que as melhorias drásticas na administração de tratamento ocorrem quando as plantas são centrifugadas depois de terem sido contatadas, submersas, emersas, imersas, etc., em uma solução contendo um agente para tratamento de plantas. Numa modalidade, as plantas haploides em contato com uma solução de colchicina são centrifugadas para revelar taxas de duplicação cromossômica melhoradas, em comparação com as plantas de controle.

[008] Certas modalidades são atraídas a um método para administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta em que, pelo menos, 1% da superfície de uma planta é posta em contato com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas. A força centrífuga é então aplicada à planta. Em certas modalidades, a planta é uma planta germinada. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho. Em certas modalidades do método, o tecido da planta é um meristema, por exemplo, um meristema apical de broto (SAM). Em certas modalidades do método, a planta está no interior da semente ou germinando ou dentro ou entre os estágios de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5 ou V6. Em certas modalidades do método, a planta é uma planta de milho haploide e o agente para tratamento de plantas é um agente de duplicação cromossômica, por exemplo, o agente de duplicação é colchicina. Em certas modalidades do método, a força centrífuga que é aplicada a uma planta é de cerca de 10 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades do método, o tempo de duração da força centrífuga aplicada é de cerca de 30 segundos a cerca de 180 minutos. A fim de, por exemplo, minimizar os potenciais efeitos tóxicos de certos agentes de tratamento de plantas, em certas modalidades do método a planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas por menos de cerca de 1 hora de duração antes da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades do método, pelo menos 10% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades da invenção, pelo menos 80% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da força centrífuga.

[009] Certas modalidades são atraídas a um método para a administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta em que a planta se mantém em contato com uma quantidade mínima de uma solução de tratamento das plantas durante a aplicação de uma força centrífuga. O método compreende primeiro o contato de pelo menos 1% da superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas. A força centrífuga é então aplicada à planta, em que pelo menos 1% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta é uma planta germinada. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho. Em certas modalidades do método, o tecido da planta é um meristema, por exemplo, um meristema apical de broto. Em certas modalidades do método, a planta está no interior da semente ou germinando ou dentro ou entre os estágios de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5 ou V6. Em certas modalidades do método, a planta é uma planta de milho haploide e o agente para tratamento de plantas é um agente de duplicação cromossômica, por exemplo, o agente de duplicação é colchicina. Em certas modalidades dos métodos, a força centrífuga que é aplicada a uma planta é de cerca de 10 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades do método, o tempo de duração da força centrífuga aplicada é de cerca de 30 segundos a cerca de 180 minutos. A fim de, por exemplo, minimizar os potenciais efeitos tóxicos de certos agentes de tratamento de plantas, em certas modalidades do método a planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas por menos de cerca de 1 hora de duração antes da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades do método, pelo menos 10% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades do método, pelo menos 80% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades do método, substancialmente a totalidade da solução que compreende o agente para tratamento de plantas é removida do contato com a superfície da planta, após a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades do método, a solução que compreende o agente de tratamento da plantas é posta em contato com a planta por menos do que cerca de 4 horas de duração antes da remoção do agente para tratamento de plantas.

[0010] Certas modalidades são atraídas a um método para a administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta, compreendendo o método duas aplicações separadas de uma força centrífuga. O método compreende primeiro o contato de pelo menos 1% da superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas. A força centrífuga é então aplicada à planta, em que pelo menos 1% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas durante a aplicação da força centrífuga. Seguindo a aplicação da força centrífuga, a força centrífuga é removida. Uma força centrífuga subsequente é então aplicada, em que pelo menos uma parte de, ou a maioria dos, ou significativamente toda a solução de tratamento de plantas contatando a planta pode ser removida antes ou durante a aplicação da força centrífuga subsequente. Em certas modalidades, a planta é uma planta germinada. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho. Em certas modalidades do método, o tecido da planta é um meristema, por exemplo, um meristema apical de broto. Em certas modalidades do método, a planta está no interior da semente ou germinando ou dentro ou entre os estágios de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5 ou V6. Em certas modalidades do método, a planta é uma planta de milho haploide e o agente para tratamento de plantas é um agente de duplicação cromossômica, por exemplo, o agente de duplicação é colchicina. Em certas modalidades do método, quer do primeiro, subsequente, ou ambas as forças centrífugas aplicadas são de cerca de 10 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades do método, pelo menos 10% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da primeira força centrífuga. Em certas modalidades do método, pelo menos 80% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da primeira força centrífuga. Em certas modalidades do método, pelo menos 10% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, durante a aplicação da primeira força centrífuga. Em certas modalidades do método, pelo menos 80% da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, durante a aplicação da primeira força centrífuga. Como observado, seguindo a aplicação da primeira força centrífuga e a remoção da primeira força centrífuga, alguma porção de, incluindo substancialmente toda ou mais de, a solução que compreende o agente para tratamento de plantas pode ser removida antes da aplicação da segunda aplicação (subsequente) de força centrífuga. Em certas modalidades do método, a solução que compreende o agente de tratamento da plantas é posta em contato com a planta por menos do que cerca de 1 hora de duração antes da remoção do agente para tratamento de plantas.

[0011] Certas modalidades fornecem métodos de administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido selecionado de uma planta, em que a planta possui uma superfície e o tecido selecionado é localizado na, e/ou por baixo, de uma porção da superfície da planta. Tais métodos compreendem a aplicação de uma força centrífuga para a planta para transportar, migrar, empurrar, e semelhantes, uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas para o tecido selecionado. Em certas modalidades, a força ou forças empurra a solução para o tecido vegetal selecionado. Em certas modalidades, a força empurra ou força a solução para as células do tecido selecionado. Em certas modalidades, pelo menos, 5% da superfície da planta teve contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, incluindo tecidos de plantas que não o tecido selecionado. Em certas modalidades, a planta está germinada. Em certas modalidades, o tecido selecionado permanece em contato com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas que não é absorvido pela planta, durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos, 5% da superfície da planta permanecem em contato com a solução durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades onde, pelo menos, o tecido selecionado permanece em contato com a solução durante a aplicação da força centrífuga, uma força centrífuga aplicada é aplicada a partir de cerca de 10 g a cerca de 500 g. Em certas modalidades, o tecido selecionado é mantido em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas que não é absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga por meio de um suporte de centrifugação da planta, durante, pelo menos, uma porção da aplicação de força centrífuga. Em certas modalidades, o tecido selecionado é separado a partir do agente para tratamento de plantas não absorvidos pelas plantas durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades em que o tecido selecionado é separado a partir do agente de tratamento, uma força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 4000 g, tal como de cerca de 500 g até cerca de 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3500 g, ou 4000 g. Em certas modalidades, o tecido selecionado é mantido separado do agente para tratamento de plantas que não é absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga por meio de um suporte de centrifugação da planta, durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta tem um eixo que se encontra alinhado com o sentido da força centrífuga durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o eixo está alinhado com o sentido da força centrífuga durante toda a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o eixo da planta está alinhado com a direção da força centrífuga por meio de um suporte de centrifugação da planta durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta contata o suporte de centrifugação da planta e em outras modalidades, a planta não entra em contato com o suporte de centrifugação da planta.

[0012] Certas modalidades fornecem para métodos de administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta selecionado de uma planta, em que a planta possui uma superfície e o tecido selecionado é localizado na, e/ou por baixo, de uma porção da superfície da planta. Tais métodos compreendem a aplicação de uma força centrífuga para a planta para transportar, migrar, empurrar, e semelhantes, uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas para o tecido selecionado, em que a planta tenha sido posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, incluindo tecidos de plantas que não o tecido selecionado, e em que o eixo da planta está alinhado por um suporte da planta centrifugação durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a força ou forças empurra a solução para o tecido vegetal selecionado. Em certas modalidades, a força empurra ou força a solução para as células do tecido selecionado. Em certas modalidades, a planta está germinada. Em certas modalidades, o suporte de centrifugação de planta mantém o alinhamento do eixo da planta com o sentido da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta contata o suporte de centrifugação da planta e em outras modalidades, a planta não entra em contato com o suporte de centrifugação da planta. Em certas modalidades, é aplicada uma força centrífuga compreendida entre cerca de 10 g a cerca de 4000 g, tal como de cerca de 10 g a cerca de 500 g ou de cerca de 500 g a cerca de 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3500 g, ou 4000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aumenta o contato do agente de duplicação cromossômica com o meristema de broto em relação ao contato com o agente de duplicação cromossômica conseguido sem centrifugação. Em certas modalidades, a planta é posta em contato com a solução que compreende o agente de duplicação cromossômica para menos do que cerca de 3 horas ou menos do que cerca de 1 hora de duração antes da aplicação da força centrífuga.

[0013] Certas modalidades preveem métodos de criação de uma planta de milho duplo haploides, oferecendo um agente de duplicação cromossômica para um tecido de meristema apical de broto. Tais métodos compreendem a aplicação de uma força centrífuga a uma planta haploide, por exemplo, uma planta mãe DH0 , para transportar, migrar, empurrar, e semelhantes, uma solução que compreende o agente de duplicação cromossômica para o meristema apical do broto, em que a planta haploide foi contatada com a solução que compreende o agente de duplicação cromossômica, incluindo tecido da planta outro do que o do meristema apical do broto. Em certas modalidades, a força empurra ou força o agente de duplicação cromossômica para dentro do tecido do meristema apical do broto. Em certas modalidades, as forças ou empurra o agente de duplicação cromossômica para as células do meristema apical do broto. Em certas modalidades a eficiência da duplicação resultante da administração do agente de duplicação cromossômica é aumentada em comparação com a administração do agente de duplicação cromossômica para o meristema apical do broto apenas colocando em contato com a solução que compreende a duplicação cromossômica e sem aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta está germinada. Em certas modalidades, o meristema apical do broto permanece em contato com a solução que compreende o agente de duplicação cromossômica que não é absorvido pela planta, durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos, 5% da superfície da planta permanecem em contato com a solução durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 500 g. Em certas modalidades, o meristema apical do broto é mantido em contato com a solução que compreende o agente de duplicação do cromossomo que não é absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga por meio de um suporte de centrifugação da planta, durante pelo menos uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o tecido do meristema apical do broto é separado a partir da solução que compreende o agente de duplicação cromossômica não absorvido pela planta durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 4000 g, por exemplo desde cerca de 500 g a cerca de 2000, 2500 g, 3000 g, 3500 g, ou 4000 g. Em certas modalidades, o meristema apical do broto é mantido separado do agente de duplicação cromossômica não absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga por meio de um suporte de centrifugação da planta, durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta tem um eixo que se encontra alinhado com o sentido da força centrífuga durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o eixo está alinhado com o sentido da força centrífuga durante toda a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o eixo da planta está alinhado com a direção da força centrífuga por meio de um suporte de centrifugação da planta durante, pelo menos, uma porção da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta contata o suporte de centrifugação da planta e em outras modalidades, a planta não entra em contato com o suporte de centrifugação da planta. Em certas modalidades, a força centrífuga aumenta o contato do agente de duplicação cromossômica com o meristema apical do broto sobre o contato com o agente de duplicação cromossômica conseguido sem centrifugação. Em certas modalidades, a planta é posta em contato com a solução que compreende o agente de duplicação cromossômica por menos do que cerca de 3 horas ou menos do que 1 hora de duração antes da aplicação da força centrífuga.

[0014] Certas modalidades fornecem métodos para a administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta selecionado, compreendendo o método as etapas de: (a) contatar a superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas, em que a planta tenha germinado; (b) aplicar uma força centrífuga para a planta na etapa (a) em contato com a solução; (c) a seguir a aplicação da força centrífuga na etapa (b), remover as plantas da força centrífuga e solução de tratamento; e (d) aplicar uma força centrífuga subsequente à planta submetida à força centrífuga na etapa (b), fornecendo assim o agente para tratamento de plantas para o tecido da planta.

[0015] Certas modalidades fornecem métodos para a criação de uma planta de milho duplo haploide de uma planta haploide que compreende: (a) contatar a planta haploide com uma soluçãocompreendendo um agente de duplicação cromossômica; (b) aplicar uma força centrífuga para a planta haploide contatada da etapa (a), em que a força centrífuga provoca, pelo menos, uma porção da solução que compreende o agente de duplicação do cromossomo de contatar com pelo menos uma célula de um meristema de broto da planta haploide e em que um embrião haploide é formado a partir da, pelo menos uma célula do meristema de broto, criando, assim, uma planta de milho duplo haploide.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] Figura 1. A Figura 1 mostra os resultados exemplificativos de administração auxiliada de agentes de tratamento de plantas. Duas concentrações diferentes de uniconazol foram administradas ao meristema apical de broto de várias mudas como mostrado em comparação para controlar plantas.

[0017] Figura 2. A Figura 2 mostra um resumo dos estágios de crescimento e desenvolvimento de milho descritos por Abendroth, et al. 1011 e aqui referidos.

[0018] Figura 3. A Figura 3 mostra uma comparação de sistemas de estadiamento de milho. *Não aplicável. O método Horizontal Leaf é difícil de converter com o método Leaf Collar em V1 e especialmente em estágios vegetativos mais tardios por causa da orientação vertical das folhas superiores em V1 Os valores para o método Horizontal Leaf em relação ao método Leaf Collar são diferentes do publicado pela USDA-FCIC. **Não aplicável. O método Leaf Tip é difícil de correlacionar com o método Leaf Collar após V14.

[0019] Figura 4. A Figura 4 mostra um melhor sucesso de polinização, o sucesso da fertilização, e eficiências de duplicação alcançadas pela administração auxiliada de agentes de tratamento de plantas para as plantas em diferentes estágios da vida.

[0020] Figura 5. A Figura 5 mostra um exemplo de uma muda de planta 1 individualmente associada com (por exemplo, envolvido a) uma centrífuga de suporte de única planta (PCS) 2 e revela como mudas 1 podem ser posicionadas em relação a uma PCS 2 e em relação à força de aceleração gerada durante centrifugação 4, como quando administrando agentes de tratamento de plantas para os meristemas de mudas de milho. A caixa tracejada 3 representa uma área da planta onde mudas podem ser fixadas a uma PCS 2. Outras orientações da planta 1 em relação à força de aceleração 4 podem ser utilizadas quando certos outros tecidos da planta são segmentados. A linha horizontal pontilhada de cabeça dupla 5 indica que a muda e PCS podem ser postos em contato um com o outro.

[0021] Figura 6. A Figura 6 mostra um exemplo de múltiplas mudas 1 individualmente associadas a um suporte de centrífuga de plantas, por exemplo, neste exemplo ilustrativo, embrulhadas e suportadas por um PCS 2 que compreende vários talos. A caixa tracejada 3 representa uma área de unidade em que as mudas podem ser fixadas a um PCS 2, a fim de alinhar as plantas relativamente à força de aceleração 4 gerada durante a centrifugação, tal como quando o tecido alvo é o meristema apical de broto (SAM). Outras orientações da planta 1 em relação à força de aceleração 4 podem ser utilizadas quando certos outros tecidos da planta são segmentados.

[0022] Figura 7. A Figura 7 mostra um exemplo de como uma única muda 1 pode estar associada com um PCS ao ser fixada a uma única PCS 2 e o arranjo de plantas-PCS colocado num recipiente centrifugador 4. Neste caso, o recipiente de centrifugação 4 é um tubo de centrifugação com uma tampa com um orifício para o PCS se prolongar através, mas vários outros tipos de recipientes de centrifugação serão também úteis com a presente invenção. A caixa tracejada 3 representa uma área da planta 1 onde plantas podem ser fixadas a uma PCS 2. Outras orientações da planta 1 em relação à força de aceleração 4 podem ser utilizadas quando certos outros tecidos da planta 1 são segmentados.

[0023] Figura 8. A Figura 8 mostra um exemplo de como múltiplas mudas 1 podem estar associadas com (neste exemplo ilustrativo, ligado a) um único PCS 2 em relação à força de aceleração gerada durante a centrifugação 4 quando administração de agentes de tratamento de plantas com os meristemas de mudas de milho 1. Outras orientações da planta 1 em relação à força de aceleração 4 podem ser utilizadas quando certos outros tecidos da planta 1 são segmentados. A linha horizontal pontilhada de cabeça dupla 5 indica que a muda e PCS podem ser postas em contato uma com a outra.

[0024] Figura 9. A Figura 9 mostra um exemplo de como as plantas 1 podem ser empacotadas em uma PCS 2 que compreende um talo 2a e um envoltório 2b. Na parte superior da figura, o envoltório 2b é transparente e delineado por linhas tracejadas e o espaço entre mudas 1 foi ampliado para maior clareza. Na porção inferior esquerda da figura, o envoltório é mostrado em torno dos caules e outras partes das plantas de uma forma que reflete como uma PCS empacotada utilizada nas experiências descritas aqui apareceu quando foi colocada no recipiente de centrifugação antes da centrifugação. A porção inferior direita da figura é uma representação da vista de cima para baixo da PCS empacotada que é mostrada no canto inferior esquerdo. A letra P (para planta) na visualização de cima para baixo é utilizada para mostrar um possível arranjo dos caules das plantas em relação um ao outro e o envoltório e talo (círculo preto cheio) da PCS empacotada. Uma PCS empacotada como esta poderia incluir mais de um talo de apoio.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0025] É para ser notado que o termo "um" ou "uma" entidade se refere a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, "uma molécula de ligação," é entendida como representando uma ou mais moléculas de ligação. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser utilizados de forma intercambiável aqui.

[0026] Além disso, "e/ou", onde utilizado aqui, deve ser tomado como a divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como utilizado em uma frase tal como "A e/ou B" aqui se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" (por si só) e "B" (por si só). Da mesma forma, o termo "e/ou" como utilizado em uma frase tal como "A, B e/ou C" destina-se a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (por si só); B (por si só); e C (por si só).

[0027] A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por alguém ordinariamente versado na técnica ao qual é relatada esta divulgação. A menos que de outra forma especificado, unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita pelo Système International de Unites (SI). Intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo.

[0028] Os cabeçalhos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos da divulgação, os quais podem ser obtidos por referência no relatório descritivo como um todo.

VISÃO GERAL

[0029] Aqui fornecidos são métodos exemplificativos de administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de uma planta, em que a planta é posta em contato, em pelo menos uma porção da sua superfície com um agente para tratamento de planta e uma força centrífuga é aplicada para auxiliar na administração do agente para tratamento de plantas para o tecido da planta.

[0030] Em certas modalidades para administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta, pelo menos uma porção da superfície de uma planta é posta em contato com uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas. A força centrífuga é então aplicada à planta. A planta pode ser lavada, se desejado, tais como com água, quer antes ou após a aplicação da força centrífuga para lavar o excesso de agente para tratamento de plantas. Após o tratamento, as plantas podem ser recuperadas, transplantadas, e cultivadas num campo ou num ambiente protegido, utilizando métodos convencionais.

AGENTES DE TRATAMENTO DE PLANTAS ÚTEIS

[0031] Nas várias modalidades aqui fornecidas, uma planta pode ser posta em contato com uma grande variedade de "agentes de tratamento de plantas." Assim, tal como aqui utilizado, um "agente de estação de tratamento de", ou "agente de tratamento", ou "agente" pode referir-se a qualquer composto exogenamente fornecido que pode ser introduzido à superfície de uma planta e migrar para um tecido de planta. Em algumas modalidades, o agente para tratamento de plantas atua extracelularmente no interior do tecido da planta, tal como interagindo com receptores na superfície celular externa. Em algumas modalidades, o agente para tratamento de plantas entra em células no interior do tecido. Em algumas modalidades, o agente para tratamento de planta está contido dentro de um líquido. Tais líquidos incluem, mas não estão limitados a, soluções, suspensões, emulsões e dispersões coloidais.

[0032] Em algumas modalidades, os líquidos utilizados aqui serão de natureza aquosa. No entanto, em certas modalidades, tais líquidos aquosos que compreendem água também podem compreender componentes insolúveis em água, podem compreender um componente insolúvel que se torna solúvel em água por adição de um agente tensoativo, ou pode compreender qualquer combinação de componentes solúveis e tensoativos.

[0033] A "solução de tratamento de plantas" ou "solução de tratamento" pode se referir a qualquer solução de líquido que compreende um agente para tratamento de plantas. Em certas modalidades, uma solução de tratamento de plantas compreende um agente para tratamento de plantas e os dois termos podem ser frequentemente utilizados como sinônimos. Por exemplo, administrar uma solução de tratamento de plantas que compreende o agente para tratamento de plantas agente colchicina a um meristema da planta é essencialmente sinônimo de administrar um agente para tratamento de plantas compreendendo colchicina a um meristema da planta.

[0034] Agentes de tratamento de plantas incluem, mas não estão limitados a, macromoléculas, incluindo polinucleotídeos, incluindo os ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e/ou RNA), polipeptídeos, polissacarídeos, policetídeos, e semelhantes. Os polinucleotídeos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla e podem incluir moléculas anti-sense e RNAs interferentes. Os polinucleotídeos podem incluir mutações e/ou várias outras modificações, tais como a suas estruturas, que são bem conhecidas na técnica. Os polinucleotídeos incluem "elementos genéticos", que compreendem construtos de DNA recombinante (vulgarmente referidos como "transgenes") que tenham sido inseridos no genoma de uma planta, ou uma sequência de nucleotídeos, ou um locus genético do genoma de uma planta. Assim, em certas modalidades, um utilizador da presente invenção pode administrar uma sequência de DNA ou RNA de um tecido alvo para alterar a expressão ou a herança de uma característica vegetal, por exemplo, para efetivamente "transformar" uma planta através da inserção de um elemento genético no seu genoma.

[0035] Em certas modalidades, um agente para tratamento de plantas compreende um regulador de crescimento de plantas (PGR). PGRs são uma classe de compostos que afetam o processo celular, crescimento, desenvolvimento ou comportamento de uma parte de planta ou planta. Em algumas modalidades uma PGR é responsável por acelerar ou retardar a taxa de crescimento ou maturação ou de outro modo alterar o comportamento de uma parte de planta ou planta. Em algumas modalidades, um PGR é um hormônio vegetal que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, um PGR é um produto químico que provoca efeitos semelhantes aos de pelo menos um hormônio de planta, o que induz, entre outras coisas, a floração, comprimento do entrenó, dominância apical, amadurecimento, raízes para formar determinada arquitetura, fruta para dar em certos períodos, a floração a ocorrer, incluindo qualquer substância que afete o crescimento das plantas, o desenvolvimento, comportamento, ou reprodução.

[0036] Tal como aqui utilizado, uniconazol é (e)-(+/-)-beta-((4- clorofenil) metileno)-alfa-(1,1-dimetiletil)-1h-1,2,4-triazol-1-etanol , também escrito como C15H18CIN3O, também conhecido como uniconazol-P. É um retardador de crescimento da planta do tipo triazol e conhecido antagonista do hormônio de planta giberelina que reduz o crescimento internodal.

[0037] Tal como aqui utilizado, PBZ é paclobutrazol, (2S, 3S) -1- (4- clorofenil) -4,4-dimetil-2- (1,2,4-triazol-1-il) pentan-3-ol, também escrito como C15H10CIN30, um regulador de crescimento de plantas e fungicida triazol. É um antagonista conhecido dos hormônios de planta giberelinas que inibe a biossíntese de giberelina, reduz o crescimento e aumenta perímetro internodal do caule. BAP é 6-Benzilaminopurina, N- (Fenilmetil) -7H-pruin-6-amina, também escrito como C12H11N5. IAA é o ácido indol-3-acético, e ácido IBA é inodol-3-butírico. Ambos são formas de ocorrência natural de uma classe de hormônios de plantas chamado auxinas. Outras variações de auxina poderão ser utilizadas com esta invenção, incluindo auxinas sintéticas, tais como 2,4-D (ácido 2,4- Diclorofenoxiacético) e NAA (ácido acético a 1-naftaleno).

[0038] Em certas modalidades, os agentes de tratamento de plantas de macromolécula são moléculas de menos de cerca de 10 kD, 5 kD, 4kD, 2kD, ou 1kD em peso molecular. Em certas modalidades, os agentes de tratamento de plantas de macromolécula são moléculas de mais de 10 kD em peso molecular. Os agentes de tratamento de plantas também podem compreender vários monossacarídeos e dissacarídeos, incluindo, mas não se limitando a, glucose e sacarose.

[0039] Os agentes de tratamento de plantas também podem compreender várias fito-hormônios, agonistas, antagonistas de fito- hormônios, ou agentes que estimulam ou inibem a percepção, a sinalização ou a síntese de fito-hormônios. Os agentes de tratamento de plantas também compreendem as auxinas (por exemplo, IAA) e inibidores da auxina, as citocininas (por exemplo, BAP) e inibidores da citocinina, compostos que podem estimular a produção de etileno (isto é, ACC e semelhantes) e os compostos que podem inibir a produção de etileno (AVG e semelhantes), e compostos que inibem a percepção de etileno (de prata e semelhantes). Os agentes de tratamento de plantas também compreendem compostos que modulam a percepção, sinalização, e/ou comportamento da planta, tais como giberrelinas e seus inibidores (por exemplo, paclobutrazol (PBZ) ou uniconazol), ácido abscísico e os seus inibidores, e o ácido jasmônico e os seus inibidores. Outros exemplos incluem hormônios peptídicos, por exemplo, sistemina, fitossulfoquina, fator de alcalinização rápida e semelhantes.

[0040] Os agentes de tratamento de plantas de polinucleotídeos, tais como, mas não limitado a aqueles que funcionam como agonistas, antagonistas fito-hormônios, ou agentes que estimulam ou inibem o movimento, percepção ou síntese de fito-hormônios e/ou influenciam outras funções reguladoras do gene, também estão aqui contemplados.

[0041] Os agentes de tratamento de plantas incluem assim, mas não estão limitados a, vários polinucleotídeos que inibem a expressão de genes envolvidos na síntese ou percepção de fito-hormônios. Em certas modalidades, os agentes de tratamento de plantas que compreendem qualquer um dos acima mencionados podem ser utilizados em conjunto com outros agentes de tratamento de plantas. Por exemplo, agentes de tratamento de plantas que compreendem qualquer um dos fito-hormônios acima mencionados, agonistas de fito- hormônios, antagonistas de fito-hormônios, ácidos nucleicos, ou agentes que estimulam ou inibem o movimento, percepção ou síntese de fito-hormônios, quer direta ou indiretamente, pode ser utilizado em combinação com agentes de duplicação cromossômica e esta invenção.

[0042] Tal como aqui utilizado, a frase "agente de duplicação cromossômica" se refere a qualquer agente que pode fazer com que uma célula contenha um conjunto de cromossomos duplicados. Em certas modalidades, um agente de duplicação cromossômica é colchicina. Em certas modalidades, mais do que um agente de duplicação é administrado a um tecido segmentado ou selecionado através da utilização da presente invenção, quer em simultâneo ou em série.

[0043] Ao se referir a um tecido de uma planta aqui, os termos "segmentado" e "selecionado" podem ser utilizados alternadamente. Por exemplo, um alvo ou tecido alvo é sinônimo de um tecido selecionado. Um tecido alvo pode ser qualquer célula ou tecido que um utilizador deseja tratar com um agente para tratamento de plantas, por exemplo, o meristema apical de broto.

[0044] Em certas modalidades, os agentes de tratamento de plantas são agentes solúveis em água. Em certas modalidades, no entanto, a utilização de agentes de tratamento de plantas com alta, média, baixa ou desprezível solubilidade em água pode ser facilitada pela utilização de composições líquidas que compreendem vários agentes de transferência ou de condicionamento. Agentes de transferência ou de condicionamento podem compreender qualquer agente que facilita a migração de agentes de tratamento de plantas em tecidos de plantas e/ou que facilitem a absorção de agentes de tratamento de plantas pela planta. Agentes de transferência ou de condicionamento incluem, mas não estão limitados a, (a) agentes tensoativos, (b) um solvente orgânico ou com soluções aquosas ou misturas aquosas de solventes orgânicos, (c) agentes de oxidação, (d) ácidos, (e) bases, (f) óleos, (g), enzimas ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, a utilização de agentes de transferência ou de condicionamento inclui qualquer de uma etapa de incubação, uma etapa de neutralização (por exemplo, para neutralizar o ácido, base, ou um agente oxidante, ou para inativar uma enzima), uma etapa de enxágue, uma etapa de descanso ou de recuperação, ou combinações das mesmas em que o agente de tratamento de líquidos e de plantas nelas contidas são tratados antes, durante, ou após a administração para o tecido da planta. Agentes de condicionamento ou transferência, portanto, incluem, mas não estão limitadas a, emulsões, emulsões reversas, lipossomas e outras composições semelhantes a micelas. Agentes de transferência ou de condicionamento incluem adjuvantes, agentes tensoativos, e as moléculas eficazes nele contidas, que incluem sais de sódio ou de lítio de ácidos graxos (tais como o sebo ou aminas de sebo ou fosfolipídios). Agentes de transferência ou de condicionamento podem compreender sais incluindo, mas não limitados a, sódio, amônio, cálcio, potássio, lítio, magnésio, cloreto, sulfureto, e sais de sulfato. Em certas modalidades dos métodos, é fornecida a utilização de contraíons, ou outras moléculas que são conhecidas por associar com agentes de tratamento de plantas. Para certos agentes de tratamento de plantas com carga negativa, tais como polinucleotídeos, cátions, tais como íons inorgânicos de amônio, íons de amônio, íons de alquil de lítio, poliaminas, tais como espermina, espermidina, ou a putrescina, e semelhantes podem ser utilizados. Os solventes orgânicos úteis no condicionamento de uma célula de planta a permeação com certos agentes de tratamento de plantas, incluindo, mas não limitados a polinucleotídeos, são solventes, tais como DMSO, DMF, piridina, N- pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrila, dioxano, polipropileno- glicol, ou outros solventes que são miscíveis com água. Óleos sintéticos ou naturalmente derivados com ou sem surfactantes ou emulsificantes podem ser usados, por exemplo, óleos de origem vegetal, óleos agrícolas (tais como aqueles listados no 9° Compêndio de Adjuvantes Herbicidas, disponível publicamente na world wide web (internet) em herbicide.adjuvants.com) podem ser usados. Os óleos úteis em certas composições líquidas usadas nos métodos fornecidos neste documento incluem, mas não estão limitados a, óleos parafínicos, ésteres de ácido graxo de poliol, ou óleos com moléculas de cadeia curta modificadas com amidas ou poliaminas, tais como polietileneimina ou N-pirrolidina.

[0045] Uma "solução compreendendo um agente para tratamento de plantas", como usado neste documento, abrange todas as formas de soluções que contêm um agente para tratamento de plantas. Exemplos não limitantes incluem soluções que compreendem colchicina e/ou uniconazol e/ou amiprofós-metil (APM). Em certas modalidades, a solução que compreende um agente para tratamento de plantas compreende, por exemplo, colchicina.

[0046] Em certas modalidades, um agente para tratamento de planta é um agente de duplicação cromossômica. Esses agentes de duplicação cromossômica podem permitir a produção de plantas haploides duplicadas quando usados pelos métodos fornecidos neste documento. Os agentes de duplicação cromossômica podem compreender vários inibidores mitóticos que causam a duplicação cromossômica. Em certas modalidades, o agente de duplicação cromossômica pode ser um composto, tal como colchicina, amiprofós metil, trifluralina, orizalina, pronamida, ou cloroprofam.

[0047] Em certas modalidades, o agente de duplicação cromossômica pode ser um agente de duplicação cromossômica de baixa toxicidade a mamíferos. Agentes de duplicação cromossômica de baixa toxicidade a mamíferos que podem ser usados nas diversas modalidades fornecidas neste documento incluem, mas não estão limitados a, compostos, tais como: i) 1,2,3-trimetóxi-4-((1S,6R)-6-nitro- ciclohex-3-enil)-benzeno e outros compostos relacionados divulgados na Publicação de Pedido de Patente US 1010/0169999; e ii) compostos divulgados na Patente U.S. n° 5.866.513 para Michelotti et al. Os compostos divulgados na Publicação de Pedido de Patente U.S. 1010/0169999 e na Patente U.S. n° 5.866.513 estão incorporadas neste documento por referência. Em particular, 76 compostos divulgados na Tabela I e 1a nas colunas 3-4, 5-6, e 7-8 da Patente U.S. n° 5.866.513 estão incorporados neste documento por referência. Em certas modalidades, o agente de duplicação cromossômica compreende um polinucleotídeo.

[0048] Em certas modalidades, a solução que compreende um agente para tratamento de plantas compreende a colchicina numa quantidade tão alta quanto cerca de 4000 partes por milhão (ppm) de colchicina na solução. Em certas modalidades, a concentração de colchicina está numa quantidade tão baixa quanto cerca de 50 ppm de colchicina na solução. Em certas modalidades, a concentração de colchicina está numa quantidade de cerca de 50 ppm a cerca de 4000 ppm de colchicina na solução. Em certas modalidades, a colchicina está numa quantidade de cerca de 50 ppm a cerca de 2500 ppm, ou de cerca de 50 ppm a cerca de 1000 ppm, ou de cerca de 50 ppm a cerca de 1500 ppm, ou de cerca de 50 ppm a cerca de 1000 ppm, ou de cerca de 50 ppm a cerca de 500 ppm, ou de cerca de 50 ppm a cerca de 250 ppm, ou de cerca de 50 ppm a cerca de 100 ppm de colchicina na solução. Em certas modalidades, a colchicina está numa quantidade de cerca de 100 ppm a cerca de 4000 ppm, ou de cerca de 250 ppm a cerca de 4000 ppm, ou de cerca de 500 ppm a cerca de 4000 ppm, ou de cerca de 1000 ppm a cerca de 4000 ppm, ou de cerca de 1000 ppm a cerca de 4000 ppm, ou de cerca de 2500 ppm a cerca de 4000 ppm de colchicina na solução. Em certas modalidades, a colchicina está numa quantidade de cerca de 1100 ppm a cerca de 1500 ppm de colchicina na solução. Em certas modalidades, a colchicina está numa quantidade de cerca de 300 ppm a cerca de 3000 ppm.

[0049] É importante notar que esses métodos podem ser usados em conjunto com qualquer concentração de um agente para tratamento de plantas sugerido ou conhecido na técnica como sendo útil para o tratamento de plantas.

[0050] Para reduzir o estresse das plantas e a mortalidade devido ao manuseio, centrifugação, ou infecção, as plantas podem ser tratadas com hormônios, sais, antibióticos e outros pesticidas adicionais em conjunto com os métodos descritos neste documento, tanto antes, durante, entre, quanto depois das etapas de centrifugação. Esses tratamentos adicionais podem prevenir a infecção enquanto as plantas se recuperam, ou afetar o crescimento das plantas de uma forma que melhore a sobrevida. O Exemplo 5 mostra como os reguladores de crescimento de plantas em uma solução de tratamento podem ser distribuídos aos tecidos vegetais para afetar o desenvolvimento da planta de uma forma que melhore a capacidade de uma planta em sobreviver ao manuseio, transporte e transplante após a aplicação de uma força centrífuga.

CONTATO DAS PLANTAS COM OS AGENTES DE TRATAMENTO

[0051] O contato entre uma planta e uma solução de tratamento pode ocorrer antes, durante ou após a aplicação de uma força centrífuga. Em certas modalidades, o contato entre a superfície da planta e o agente de tratamento é obtido pela imersão, submersão ou outra forma de inserção da planta em um reservatório de líquido compreendendo o agente para tratamento de plantas. Outros métodos de contato de pelo menos uma parte da superfície de uma planta com um agente para tratamento de plantas incluem a pulverização ou nebulização de uma planta com uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas ou agitação ou rolamento de uma planta em uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas. Em certas modalidades, o contato entre a superfície da planta e o agente de tratamento é obtido pela colocação de uma planta em um recipiente e então a adição da solução de tratamento ao recipiente com a planta. O agente de tratamento pode então ser decantado ou de outra forma drenado do recipiente enquanto a planta permanece dentro, se, por exemplo, um usuário desejar executar uma centrifugação em série, ou a planta pode ser removida do recipiente antes ou durante a remoção do agente de tratamento.

[0052] Em certas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou 100% da superfície da planta está em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas antes da aplicação de uma força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou 100% da superfície da planta está em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas quando a aplicação da força centrífuga começa.

[0053] Tal como usado neste documento, um tratamento de plantas em macroescala se refere ao contato de mais de uma área minúscula da superfície da planta com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas. Por exemplo, em certas modalidades, uma planta tratada em macroescala é uma na qual pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou 100% da superfície da planta entrou em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas antes da aplicação de uma força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos uma parte da superfície da planta que está em contato com a solução inclui o tecido vegetal diferente de um tecido vegetal selecionado. Em certas modalidades, o tecido vegetal selecionado não faz parte da superfície da planta que está em contato com a solução. Assim, em certas modalidades, durante a aplicação da força centrífuga, pelo menos uma parte da solução compreendendo o agente para tratamento de plantas migra ou se desloca sob a influência da força centrífuga para o tecido vegetal selecionado.

[0054] Em certas modalidades, pelo menos uma parte da superfície da planta permanece em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas por pelo menos a maior parte da duração da aplicação da força centrífuga, pelo menos uma parte da superfície da planta permanece em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas por substancialmente a duração inteira da aplicação da força centrífuga, e/ou pelo menos uma parte da superfície da planta permanece em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas pela duração inteira da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos uma parte da superfície da planta permanece em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas por pelo menos cerca de 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% da duração da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a quantidade de superfície da planta que permanece em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas durante pelo menos uma parte da aplicação da força centrífuga é pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou 100% da superfície da planta. Em certas modalidades, independentemente da porcentagem da superfície da planta que permanece em contato com a solução, o tecido selecionado permanece submerso na solução. Por exemplo, onde o meristema apical do broto de uma planta de milho está submerso na solução, mas partes das folhas não estão. Em certas modalidades, independentemente da porcentagem da superfície que permanece em contato com a solução, a superfície do tecido selecionado está livre ou se torna livre durante a aplicação da força centrífuga da solução. Por exemplo, onde a superfície do meristema apical do broto de uma planta de milho está livre da solução, mas as raízes permanecem submersas. Entende-se que embora a superfície do tecido selecionado esteja "livre" da solução, quantidades mínimas da solução e/ou do agente para tratamento de plantas ainda podem estar presentes no tecido selecionado.

[0055] Em certas modalidades, toda ou substancialmente toda a solução compreendendo um agente para tratamento de plantas é removida da superfície da planta durante a centrifugação e/ou nenhuma ou substancialmente nenhuma solução permanece na superfície da planta após a remoção da força centrífuga. Em certas modalidades, mais de cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da superfície da planta está livre da solução após a remoção da força centrífuga sem precisar de uma etapa adicional de remoção da solução, isto é, menos de cerca de 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% da superfície da planta permanece em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas ao final da aplicação da força centrífuga sem precisar de uma etapa adicional de remoção da solução.

[0056] Tal como usado neste documento, uma "etapa de contato" é qualquer processo em que uma parte da planta é posta em contato com uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas. Uma ampla gama de durações é possível para a etapa de contato, especialmente considerando quanto da etapa de contato determina o período de incubação e as modalidades descritas neste documento fornecem uma ampla gama de durações de incubação úteis nesta invenção.

[0057] Dependendo de um número de variáveis, e não limitado ao germoplasma em estudo, a atividade ou concentração do agente para tratamento de plantas usado, o local do tecido alvo, a velocidade de centrifugação, ou uma combinação dessas e outras variáveis, a duração de tempo entre quando a superfície da planta está em contato com a solução compreendendo o agente para tratamento de plantas e a aplicação da força centrífuga, como descrito neste documento, podem ser tão curtas quanto o mínimo necessário para garantir que pelo menos um pouco do agente para tratamento de plantas atinja o tecido alvo durante uma centrifugação subsequente. Em certas modalidades, um usuário mergulha brevemente a planta em uma solução que compreende um agente para tratamento de plantas apenas o suficiente para cobrir o tecido selecionado que o usuário tem como alvo, para cobrir os tecidos não-alvo, por exemplo, os tecidos que rodeiam o tecido selecionado, ou ambos os tecidos e tecidos selecionados não sendo alvo. Por exemplo, mergulhando a ponta do broto de uma planta haploide em um líquido que compreende um agente de duplicação apenas o tempo suficiente para assegurar que o meristema apical do broto e/ou os tecidos circundantes que estão em contato com o agente de duplicação. Isto pode ser tão pequeno quanto cerca de um segundo, possivelmente, até mesmo menos, com um limite superior, dependendo de um número de fatores, incluindo os efeitos de toxicidade (por exemplo) do agente sobre as plantas e quanto tempo as plantas podem sobreviver sob tais condições.

[0058] Em certas modalidades, um germoplasma particular pode ser tratado com um agente não tóxico, ou uma baixa concentração de agente de tratamento, por imersão de plantas por vários dias ou talvez até algumas semanas, medidas fornecidas são tomadas para assegurar que as plantas sobrevivem ao tratamento e o usuário está disposto a aceitar quaisquer efeitos adicionais de uma exposição tão prolongada ao agente tem sobre as plantas.

TIPOS ÚTEIS DE PLANTAS

[0059] A menos que especificado de outra forma, esta divulgação não está limitada a qualquer tipo particular de planta. Por exemplo, a planta pode ser considerada um cultivo de mercadoria comercial ou uma planta ornamental. Por exemplo, em certas modalidades, a planta é uma planta monocotiledônea ou é um membro da família Poaceae, planta de trigo, planta de milho, planta de milho doce, planta de arroz, planta de arroz selvagem, planta cevada, centeio, planta de milho, sorgo, planta de cana-de-açúcar, planta de gramado, planta de bambu, planta de aveia, planta de bromus, planta Miscanthus, planta grama de pampas, planta (Panicum), e/ou plantas teosinto, ou é um membro da família Alliaceae, planta de cebola, planta de alho-poró, planta de alho; ou em que a planta é uma planta dicotiledónea ou é um membro da família Amaranthaceae, planta de espinafre, planta de quinoa, um membro da família Anacardiaceae, planta de manga, um membro da família Asteraceae, planta de girassol, planta endívia, planta de alface, planta de alcachofra, um membro da família Brassicaceae, planta de Arabidopsis thaliana, planta de colza, semente oleaginosa de planta de colza, planta de brócolis, planta de couve de Bruxelas, planta de repolho, planta de canola, planta de couve-flor, planta de couve-rábano, planta de nabo, planta de rabanete, um membro da família Bromeliaceae, planta de abacaxi, um membro da família Caricaceae, planta de mamão, um membro da família Chenopodiaceae, planta de beterraba, um membro da família Curcurbitaceae, planta de melão, planta de cantalupo, planta de abóbora, planta de melancia, planta de melão honey dew, planta de pepino, planta de abóbora, um membro da família Dioscoreaceae, planta de inhame, um membro da família Ericaceae, planta de mirtilo, um membro da família Euphorbiaceae, planta de mandioca, um membro da família Fabaceae, planta de alfafa, planta de trevo, planta de amendoim, um membro da família Grossulariaceae, planta de groselha, um membro da família Juglandaceae, planta de noz, um membro da família Lamiaceae, planta de hortelã, um membro da família Lauraceae, planta de abacate, um membro da família Leguminosae, planta de soja, planta de feijão, planta de ervilha, um membro da família Malvaceae, planta de algodão, um membro da família Marantaceae, planta de araruta, um membro da família Myrtaceae, planta de goiaba, planta de eucalípto, um membro da família Rosaceae, planta de pêssego, planta de maçã, planta de cereja, planta de ameixa, planta de pera, planta de ameixa seca, planta de amora preta, planta de framboesa, planta de morango, um membro da família Rubiaceae, planta de café, um membro da família Rutaceae, planta de citrus, planta de laranja, planta de limão, planta de toranja, planta de tangerina, um membro da família Salicaceae, planta de álamo, planta de salgueiro, um membro da família Solanaceae, planta de batata, planta de batata doce, planta de tomate, planta de pimentão, planta de tabaco, planta de tomate de casca, planta de berinjela, planta de Atropa belladona, planta de Datura stramonium, um membro da família Vitaceae, planta de uva, um membro da família Umbelliferae, planta de cenoura, ou um membro da família Musaceae, planta de banana; ou em que a planta é um membro da família Pinaceae, planta de cedro, planta de abeto, planta de cicuta, planta de lariço, planta de pinho, planta de picea.

[0060] A menos que especificado de outro modo, como aqui utilizado, uma planta pode ser qualquer planta inteira, ou parte de uma planta, ou de cultura de tecido derivado de uma planta, ou semente da planta; tendo um tecido para o qual um agente para tratamento de plantas pode ser entregue. Uma planta pode ser de vários conteúdos cromossômicos, como haploides, diploides, triploides, tetraploides, etc. Poliploidia se refere geralmente a uma condição de ter um nível de ploidia superior a triploide. Em certas modalidades, é feita uma distinção entre os tecidos de plantas crescidas em cultura de tecidos e as plantas de cultura não tecido.

[0061] A menos que especificado de outro modo, como aqui utilizado, a superfície de uma planta se refere à superfície que está geralmente exposta ao ambiente externo em torno da planta, sem puxar, o cortar, etc. da planta para expor áreas adicionais. Por exemplo, se uma planta é submersa numa solução completamente, a superfície da planta é geralmente a parte da planta que iria entrar em contato com a solução.

[0062] Um tecido da planta pode ser qualquer tecido vegetal. Em certas modalidades, um tecido de planta pode incluir um meristema funcional ou agrupamento de células capazes de formar um meristema funcional. Um meristema funcional é definido como um centro de células pluripotentes que tem a capacidade de dar origem a novos tecidos ou órgãos da planta. Em certas modalidades, o tecido da planta é um tecido de meristema tal como um meristema apical de raiz ou um meristema apical de broto.

[0063] Em certas modalidades, um agente para tratamento de plantas é entregue a um tecido de planta alvo ou selecionado. Um tecido de planta pode ser segmentado ou selecionado com base na resposta do tecido para o agente para tratamento de planta e/ou a influência sobre o crescimento das plantas, características, genética, rendimento, etc., que se pretende ser alcançada. Por exemplo, o meristema apical de broto, particularmente de uma planta DH0, pode ser selecionado para a entrega de um agente de duplicação cromossômica. O tecido selecionado pode estar localizado na superfície da planta e/ou pode estar localizado por baixo da superfície da planta ou por baixo de uma porção da superfície da planta. Assim, em certas modalidades, em que até mesmo a totalidade da superfície de uma planta é posta em contato com uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas, tais como por submergindo completamente a planta, pelo menos uma porção do tecido selecionado não pode ser contatada pela solução.

[0064] Uma planta para utilização nos métodos aqui descritos podem estar em qualquer uma das várias etapas de desenvolvimento. Por exemplo, plantas de milho podem ser descritas pelas suas etapas de crescimento e reprodução vegetativas, e como aqui utilizado, as etapas de desenvolvimento de grãos de milho (método Leaf Collar: V1- Vn, Vt, R1-R6, etc.) são tal como descrito em Abendroth , L.J., RW Elmore, M.J. Boyer, e S.K. Marlay, 1011, Corn Growth and Development, PMR 1009, Iowa State University Extension, Ames, Iowa (Figuras 2, 3, 14-83) e resumidos na Figura. 2. A escolha de uma fase de desenvolvimento pode depender de diversos fatores, tais como, mas não limitado a, a capacidade do agente para tratamento de plantas para acessar a um determinado tecido em um certo estágio de desenvolvimento, a correlação entre a necessidade do agente para tratamento de plantas e um certo estágio de desenvolvimento, ou o tamanho físico da planta e a praticabilidade de submetê-la a uma força centrífuga. Em algumas modalidades, a planta é uma semente. Em certas modalidades, a planta é uma planta germinada. Em certas modalidades, a planta é uma planta madura.

[0065] Em certas modalidades, antes da germinação, a planta ou de um propágulo da planta é posta em contato com um agente para tratamento de plantas, e submetida à centrifugação a fim de administrar o agente de tratamento a pelo menos um tecido selecionado da planta. Em certas modalidades, as técnicas de resgate de embriões conhecidas na técnica são utilizadas para excisar um embrião da semente antes da germinação da semente, a fim de melhor contatar o embrião para o agente de tratamento. Após a excisão, o embrião pode ser cultivado in vitro ou de outra forma cultivada em condições que promovam a sua sobrevivência e desenvolvimento de uma muda. Assim, a entrega de um agente para tratamento de plantas de tecidos selecionados de uma planta antes da germinação pode ser melhorada utilizando uma variedade de técnicas atualmente conhecidas na técnica, incluindo a técnica de resgate de embriões, permitindo assim que o embrião seja contatado pelo agente para tratamento de plantas durante a centrifugação. Em certas modalidades, estes métodos são utilizados para entregar um agente de duplicação de um meristema de um embrião haploide de modo a criar pelo menos um tecido reprodutivo haploide duplicado capaz de produzir gametas funcionais haploides.

[0066] Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho e o tecido da planta é um meristema. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho e o tecido da planta é um meristema apical de broto (SAM). Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho, o tecido da planta é um meristema apical do broto, e a planta de milho está interior da semente ou germinando ou na ou entre os estágios de crescimento VE, V1, V2, V3, V4, V5, ou V6. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho haploide, o tecido da planta é um meristema apical de broto, a planta de milho está no interior da semente ou germinando ou na ou entre o estágio de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5, ou V6, e o agente para tratamento de plantas é um agente de duplicação cromossômica, tais como colchicina.

CENTRIFUGAÇÃO

[0067] Uma força centrífuga pode ser aplicada em qualquer uma de várias maneiras, mas mais vulgarmente é conseguida utilizando uma centrífuga. Tal como aqui utilizado, referência à centrifugação é sinônimo com a aplicação de uma força centrífuga, e os termos "spin" e "centrifugação" são aqui utilizados como sinônimos.

[0068] Parâmetros centrífugos aqui relatados são consistentes com a fórmula RCF = 1,12R (RPM/1000)2, em que o RCF = força centrífuga relativa, R = o raio de rotação e RPM = a velocidade de rotação medida em rotações por minuto. A magnitude de aceleração representada por RCF também pode ser representada em múltiplos de "g" (ou "x g"), em que g representa o valor normal da gravidade na superfície da Terra. Assim, 50 g ou 50 x g ou 50 RCF representam valores de aceleração equivalentes. Os valores RCF e de g aqui utilizados representam a aceleração aplicada à amostra na ou perto da base do recipiente de centrifugação (RCFmax) da amostra uma vez que o RPM atingiu a velocidade definida pelo usuário. Assim, RCF = RCFmax = 1,12Rmax(RPMmax/1000)2. Espera-se que um de conhecimento comum possa determinar a RCF em qualquer ponto ao longo do raio de rotação para uma dada velocidade. Por exemplo, um de conhecimento comum pode preferir utilizar o RCFmin (RCF aplicado à extremidade mais proximal do recipiente de amostra de centrifugação), ou o RCFmed (o RCF médio aplicado ao longo de todo o recipiente da amostra centrífuga) para a prática da invenção aqui descrita. Modalidades da invenção, em que uma força centrífuga é aplicada a uma planta incluem a utilização de qualquer método de aceleração para gerar forças que são essencialmente equivalentes, com efeito, os aqui descritos, independentemente de como eles são calculados ou alcançados.

[0069] Velocidades de centrifugação aqui descritas foram realizadas utilizando um rotor de cesto giratório SX4750A numa centrífuga Beckman Coulter Allegra série X-14. Quando um valor de 50 RCF (xg) na Allegra X-14 utilizando um rotor SX4750A foi inserido no painel de controle eletrônico, resultou em um Rmax de aproximadamente 463,5 RPM, o que produziu um RCFmax = 50 g, um RCFmed = 34 g, e um RCFmin = 31,3. A inserção de um valor de 10 RCF (xg) resultou em RCFmax = 10, RCFmed = 14, e Rmin = 7,5. Outras configurações de centrifugação poderiam exigir diferentes parâmetros para gerar aproximadamente a mesma aceleração, e prevê-se que os usuários de habilidade padrão nesta área possam traduzir esses valores para outros sistemas ou dispositivos que operam em princípios semelhantes, sem experimentação indevida.

[0070] O ajuste de parâmetros de centrifugação para gerar bons resultados utilizando diferentes configurações ou dispositivos de centrifugação é considerado dentro do escopo da presente invenção.

[0071] Em várias modalidades da invenção, as plantas podem ser tratadas em qualquer forma que permita uma aceleração a ser aplicada à planta, por exemplo por meio de força centrífuga. Geralmente, uma planta é colocada num recipiente que é compatível com ser colocado numa centrífuga (um recipiente de amostra de centrifugação). Em certas modalidades, o recipiente pode ser um recipiente pequeno, tal como um tubo, em que uma ou algumas plantas são colocadas. Em certas modalidades, o recipiente pode ser um recipiente grande, tal como balão, garrafa, caixa, ou líquido do reservatório em que muitas plantas podem ser centrifugadas em conjunto ao mesmo tempo e/ou em contato com um agente para tratamento de plantas.

[0072] Em certas modalidades, as plantas podem ser submetidas a uma força centrífuga enquanto permanecem no mesmo recipiente de centrifugação juntamente ou podem ser separadas e divididas em outros recipientes, tais como colocados isoladamente ou alguns em recipientes separados para centrifugação. Um grande número de plantas colocadas individualmente em recipientes separados pode ser centrifugado de uma vez, ou podem ser centrifugadas algumas de cada vez, ou individualmente e sequencialmente. Em algumas modalidades, mais do que uma planta é tratada em conjunto em uma centrifugação e, em seguida, as plantas são tratadas individualmente em recipientes separados durante uma centrifugação adicional, por exemplo, como durante uma rotação dupla e/ou como parte de um tratamento de centrifugação em série.

[0073] Em certas modalidades, não é necessário manter o tecido alvo separado do agente de tratamento de reserva nem é necessário alinhar o tecido alvo no que diz respeito à força de aceleração gerada durante a centrifugação planejada, por exemplo, durante uma centrifugação submersa em que o tecido alvo é contatado e/ou submerso em agente de tratamento de reserva durante a centrifugação. Em certas modalidades em que o tecido alvo esteja em contato ou submerso durante a aplicação de uma força centrífuga, alguma porção da superfície da planta, é também contatada ou submersa na solução de tratamento de reserva durante a centrifugação.

[0074] Em certas modalidades, é necessário impedir que o tecido alvo contate e/ou submerja no agente de tratamento de reserva durante a centrifugação e necessário para alinhar o tecido alvo com respeito a forças aceleradoras geradas durante a centrifugação, por exemplo, durante uma centrifugação emersa em que o tecido alvo é impedido de se tornar submergir e/ou o contatar o agente de tratamento de reserva e o tecido alvo está alinhado em relação à força de aceleração gerada durante a centrifugação. A manutenção de uma determinada orientação pode ser feita por um número de razões, tal como para facilitar a circulação do agente para tratamento de plantas em um tecido alvo ou região da planta, ou para remover o agente a partir da superfície da planta, ou simplesmente para ajudar na o tratamento das plantas durante as etapas à montante ou à jusante de uma determinada etapa de centrifugação.

FORÇAS CENTRÍFUGAS ÚTEIS

[0075] Em certas modalidades, depois de que pelo menos uma porção da superfície de uma planta é posta em contato com um agente para tratamento de plantas, uma força centrífuga de pelo menos cerca de 10 g é aplicada à planta. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 50 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 50 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 100 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 100 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 500 g. . Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 1.000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 1000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 500 g a cerca de 1000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 1.250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 1250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 750 g a cerca de 1250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 1.500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 1500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1,000 g a cerca de 1500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 1.750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 1750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1,250 g a cerca de 1750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 1.000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 1000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1500 g a cerca de 1000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 2000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 1000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 2000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 300 g a cerca de 2000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 2250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 2250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1750 g a cerca de 2250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 2500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 2500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1000 g a cerca de 2500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que de 2750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 2750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2250 g a cerca de 2750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 3000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 3000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2500 g a cerca de 3000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 3250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 3250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2750 g a cerca de 3250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 3500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 3500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 3000 g a cerca de 3500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 3750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 3750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 3250 g a cerca de 3750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada não é maior do que cerca de 4000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 3500 g a cerca de 4000 g.

DURAÇÕES DE CENTRIFUGAÇÃO ÚTEIS

[0076] Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 1 segundo. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 5 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 10 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 15 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 10 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 30 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 40 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 50 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 60 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 90 segundos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 2 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 3 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 5 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 10 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 15 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 10 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 30 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 45 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 60 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 90 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 110 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 150 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante pelo menos cerca de 180 minutos.

[0077] Em certas formas de realização, a força centrífuga é aplicada durante entre cerca de 1 segundo e cerca de 60 minutos ou cerca de 10 segundos e cerca de 60 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada durante entre cerca de 1 segundo e cerca de 45 minutos ou cerca de 1 segundo e cerca de 45 minutos, ou dentre cerca de 1 segundo e cerca de 30 minutos ou cerca de 1 segundo e cerca de 30 minutos, ou dentre cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos ou cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos, ou dentre cerca de 1 segundo e cerca de 15 minutos ou cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos, ou de entre cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos, ou de entre cerca de 1 segundo e cerca de 5 minutos ou cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos, ou de entre cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos ou cerca de 1 segundo e cerca de 10 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada dentre cerca de 1 segundo e cerca de 180 minutos.

TEMPOS DE INCUBAÇÃO ÚTEIS

[0078] Os métodos de administração de agentes de tratamento de plantas envolvem geralmente a exposição da planta para o agente de tratamento. Isto pode exigir que a exposição ao agente para tratamento de plantas por um período prolongado de tempo, a fim de permitir migração suficiente do agente para os tecidos selecionados e/ou células da planta. Por uma variedade de razões, incluindo efeitos colaterais potencialmente tóxicos de alguns agentes de tratamento e/ou porque é mais eficiente, pode ser desejável limitar o tempo em que a planta é posta em contato com o agente para tratamento de plantas. Certas modalidades que compreendem a aplicação de uma força centrífuga para a planta podem encurtar o tempo requerido para a planta ser contatada com um agente para tratamento de planta para alcançar uma administração suficiente do agente para tratamento de plantas a um tecido de planta, tal como para alcançar uma mudança desejada na a planta ou tecido de planta.

[0079] Em certas modalidades, uma planta é posta em contato com a solução que compreende um agente para tratamento de plantas por menos do que cerca de 3,5 horas, ou menos do que cerca de 2 horas, ou menos de cerca de 1 hora, ou menos do que cerca de 45 minutos, ou menos do que cerca de 30 minutos, ou menos do que cerca de 10 minutos, ou menos de cerca de 10 minutos, ou menos de cerca de 5 minutos, ou menos de cerca de 1 minuto antes da aplicação de uma força centrífuga.

[0080] Em certas modalidades, a planta é contatada pelo agente de tratamento para apenas a quantidade de tempo necessária para contatar a planta com o agente e colocar a planta na centrífuga e começar a centrifugação. Em certas outras modalidades, a planta pode permanecer num recipiente, enquanto um agente de tratamento é adicionado, e em seguida removido. Por exemplo, uma (centrífuga de suporte da planta) combinação de planta e PCS, tal como mostrado na Figura 7, pode ser utilizada em conjunto com um sistema automatizado que obriga agente de tratamento em, ou remove agente de tratamento a partir do recipiente enquanto a planta mantém-se no interior da recipiente. Em certas modalidades, uma planta de milho pode ser colocada em um recipiente de centrifugação e protegida por um PCS, tal como mostrado na Figura 7, em que um sistema manual ou automatizado administrou um agente de tratamento ao recipiente até ao ponto em que o tecido selecionado, ou tecidos que o rodeia, é contatado e/ou submerso. Em certas modalidades, um sistema automatizado ou manual remove ainda mais a massa de agente de tratamento do recipiente, deixando algum agente de tratamento ainda sobre ou dentro da planta, preparando assim a planta para uma centrifugação subsequente emersa. Em algumas modalidades, um tecido alvo é posto em contato com um agente de duplicação de líquido compreendendo, por exemplo, colchicina por menos de um segundo, antes de aplicar uma força centrífuga.

[0081] Em certas modalidades, pelo menos uma porção da superfície de uma planta pode ser contatada com um agente para tratamento de plantas por colocar, submergir, ou mergulhar uma planta em um reservatório de líquido que compreende um agente para tratamento de plantas e, em seguida, removendo a planta da solução antes de submeter a planta à centrifugação. Em certas modalidades, um agente para tratamento de plantas pode ser adicionado a um recipiente que contém uma planta, e, em seguida, o agente para tratamento de planta pode ser removido após um período de tempo, deixando a planta no recipiente com um pouco de agente de tratamento residual ainda no ou sobre a planta. A planta pode permanecer na solução por menos de um segundo, cerca de um segundo, ou, pelo menos, cerca de 5 segundos, ou pelo menos cerca de 10 segundos, ou, pelo menos, cerca de 30 segundos, ou, pelo menos, cerca de um minuto, pelo menos cerca de cinco minutos, pelo menos cerca de dez minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos aproximadamente 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas ou mais.

[0082] Em certas modalidades, uma planta haploide é posta em contato com uma solução que compreende um agente de duplicação cromossômica, tal como colchicina, por entre cerca de 5 minutos e cerca de 1 hora antes da aplicação de uma força centrífuga.

TÉCNICAS DE CENTRIFUGAÇÃO

[0083] Em certas modalidades, durante a centrifugação, gotículas de agente de tratamento em contato com a superfície da planta ou de outra forma no interior do recipiente de centrifugação com a planta no início da centrifugação serão empurradas por forças aceleradoras geradas durante a centrifugação, quer para a planta ou empurradas através do recipiente da centrífuga até que sejam paradas por uma parede e/ou fundo do recipiente de centrifugação. Uma vez parada, a solução irá começar a acumular-se na forma previsível que os líquidos fazem, dependendo da forma da(s) superfície(s) interna(s) do recipiente de centrifugação. O volume de agente de tratamento que é centrifugado com uma planta e que acumula fora da planta durante a aplicação da força centrífuga é chamado de agente de tratamento "reserva". O volume de agente de tratamento absorvido pela planta durante a aplicação de uma força centrífuga é chamado de agente de tratamento "absorvido".

[0084] Em certas modalidades, dependendo de como as plantas são orientadas durante a centrifugação e/ou da quantidade de solução de tratamento que está no recipiente de centrifugação com as plantas durante a centrifugação, quer o tecido alvo, e/ou os tecidos superficiais que rodeiam o tecido alvo, serão submergidos ou emersos no agente de tratamento de reserva durante a aplicação de uma força de centrifugação.

[0085] Certas modalidades fornecem métodos para a administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta em que o método compreende o contatar, pelo menos, a superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas. A menos que indicado de outra forma, todos os parâmetros descritos aqui noutro local para o contato de uma planta com uma solução que compreende um agente para tratamento de plantas e aplicação de uma força centrífuga são aplicáveis a tais métodos. Em certas modalidades, a quantidade de superfície de planta é contatada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, ou mais. Em certas modalidades, a planta germinou. Depois de contatar a planta, uma força centrífuga é aplicada à planta que tenha sido posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas. Durante a aplicação da força centrífuga, a força tenderá a dirigir a solução na direção da força. Dependendo da quantidade de força, a duração da força, e as características físicas da planta e o recipiente, pelo menos uma porção da solução ligada à planta antes da aplicação da força centrífuga pode ser removida a partir da superfície da planta durante a aplicação da força centrífuga. No entanto, em algumas modalidades, uma quantidade de solução suficiente para manter pelo menos uma porção da planta, tais como o tecido selecionado ou os tecidos que o rodeiam, contatado e/ou submergido, está presente. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, ou mais da superfície da planta permanece em contato com a solução durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, mais do que cerca de 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% da solução é removida do contato com a superfície da planta durante a etapa de centrifugação. Em certas modalidades, uma força centrífuga compreendida entre cerca de 10 g a cerca de 4000 g, como especificado em mais pormenor aqui noutro local, é aplicada. Em certas modalidades, o eixo da planta é alinhado em relação ao sentido da força centrífuga durante a etapa. Em certas modalidades, a planta está alinhada com o sentido da força centrífuga num certo grau. Em certas modalidades, uma planta é associada a uma centrífuga de suporte de planta (PCS), que é descrita em pormenor aqui noutro local. Uma planta associada com um PCS pode ser centrifugada completamente submersa numa solução de, substancialmente submersa em uma solução, parcialmente submersa numa solução, ou substancialmente livre de solução, em que a planta não é submersa na solução (por exemplo, onde a solução contatando a planta é somente aquela que adere à superfície da planta, após o contato com a solução), etc. Em certas modalidades, uma planta é ligada a um PCS tais como embrulhada a, unida a, ligada a, etc. Em certas modalidades, o eixo de uma planta é mantido por um PCS durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o PCS mantém o alinhamento do eixo da planta com o sentido da força centrífuga num certo grau. Em certas modalidades, a planta está em contato direto com o suporte de centrifugação da planta enquanto em outras modalidades a planta não está em contato direto com o suporte de centrifugação da planta. Em certas modalidades, a força centrífuga provoca a migração do agente para tratamento de plantas de tal modo que o agente para tratamento de plantas contata um tecido da planta não contatado quando a planta foi contatada com o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o tecido da planta é um meristema, tal como um meristema apical de broto (SAM). Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho, por exemplo, uma planta de milho no estágio de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5 ou V6.

[0086] A menos que indicado de outra forma, todos os parâmetros descritos aqui noutro local para contatar uma planta com uma solução que compreende um agente para tratamento de plantas e aplicação de uma força centrífuga são aplicáveis a métodos que envolvem a criação de plantas duplo-haploides, aumentando a eficiência de duplicação, e semelhantes. Certas modalidades fornecem métodos para a criação de uma planta de milho duplo-haploide. A superfície de uma planta haploide tal como uma planta mãe DH0 é contatada com uma solução compreendendo um agente de duplicação cromossômica. A quantidade de superfície contatada pode ser qualquer quantidade, tal como descrito em mais pormenor aqui noutro local. A força centrífuga é então aplicada à planta mãe DH0. Em certas modalidades, pelo menos uma certa quantidade de eficiência de duplicação é conseguida como evidenciado por certos exemplos aqui divulgados. Além de criar uma planta duplo haploide, o método pode também aumentar a eficiência de duplicação conseguida em relação a outros métodos, tal como evidenciado por certos exemplos aqui divulgados. Durante a criação de uma planta duplo haploide, a planta mãe DH0 produz, pelo menos, um embrião de milho haploide, criando, assim, uma planta de milho duplo haploide. Em certas modalidades, pelo menos, 5% da superfície da planta, ou outra quantidade especificada em mais pormenor aqui noutro local, permanece em contato com a solução que compreende o agente de duplicação cromossômica durante a aplicação da força centrífuga. Em outras modalidades, mais do que 99% da solução que compreende o agente de duplicação cromossômica, ou outra quantidade especificada em mais pormenor aqui noutro local, é removida do contato com a superfície da planta durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, uma força centrífuga compreendida entre cerca de 10 g a cerca de 4000 g, como especificado em mais pormenor aqui noutro local, é aplicada. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada à planta a partir de cerca de 1 segundo a cerca de 180 minutos de duração, tal como especificado em mais pormenor aqui noutro local. Em certas modalidades, a planta está alinhada com o sentido da força centrífuga durante tal como descrito em pormenor aqui noutro local. Em certas modalidades, o eixo de uma planta é mantido por uma centrífuga de suporte de planta durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a centrífuga de suporte de planta mantém o alinhamento do eixo da planta com o sentido da força centrífuga num certo grau. Em certas modalidades, a planta está em contato direto com suporte de centrifugação da planta enquanto em outras modalidades a planta não está em contato direto com o suporte de centrifugação da planta. Em certas modalidades, a força centrífuga aumenta o contato do agente de duplicação cromossômica com o meristema do broto sobre o contato do meristema do broto com o agente de duplicação cromossômica conseguido por contato sem centrifugação. Em certas modalidades, a força centrífuga provoca a migração do agente para tratamento de plantas de tal modo que o agente para tratamento de plantas contata um tecido da planta não contatado quando a planta foi contatada com o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, a planta de milho está na fase de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5 ou V6. Em certas modalidades, o agente de duplicação cromossômica é colchicina. Em certas modalidades, a planta é posta em contato com a solução que compreende o agente de duplicação cromossômica por menos do que cerca de 1 hora ou de 3 horas de duração, ou para uma duração descrita aqui noutro local, antes da aplicação da força centrífuga.

[0087] Certas modalidades fornecem métodos para a administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta, compreendendo o contatar a superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas e aplicação de uma força centrífuga para a planta em contato com a solução, em que o eixo da planta é mantido por uma centrífuga de suporte de planta (PCS) durante a aplicação da força centrífuga, entregando assim o agente para tratamento de plantas para o tecido da planta. A menos que indicado de outra forma, todos os parâmetros descritos aqui noutro local para o contato de uma planta com uma solução que compreende um agente para tratamento de plantas e aplicação de uma força centrífuga são aplicáveis a tais métodos. Em certas modalidades, o PCS mantém o alinhamento do eixo da planta com o sentido da força centrífuga durante a etapa. Em certas modalidades, a planta está em contato direto com suporte de centrifugação da planta enquanto em outras modalidades a planta não está em contato direto com o suporte de centrifugação da planta. Em certas modalidades, é aplicada uma força centrífuga compreendida entre cerca de 10 g a cerca de 500 g. Em certas modalidades, é aplicada uma força centrífuga compreendida entre cerca de 500 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga provoca a migração do agente para tratamento de plantas de tal modo que o agente para tratamento de plantas contata um tecido da planta não contatado com o agente para tratamento de plantas quando a planta é posta em contato com o agente para tratamento de plantas, antes da centrifugação. Em certas modalidades, a aplicação da força centrífuga aumenta o contato de um tecido de planta selecionado com o agente de tratamento da planta ao longo do seu contato com o agente para tratamento de plantas, antes da aplicação da força. Em certas modalidades, o tecido da planta é um meristema de broto. Em certas modalidades, a planta é uma planta de milho, por exemplo, uma planta de milho no estágio de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4, V5 ou V6. Em certas modalidades, a planta é uma planta DH0 . Em certas modalidades, o agente para tratamento de plantas é um agente de duplicação cromossômica, por exemplo, colchicina. Em certas modalidades, a força centrífuga aumenta o contato do agente de duplicação cromossômica com o meristema de broto sobre o contato do meristema de broto com o agente de duplicação cromossômica conseguido antes da aplicação da força centrífuga.

[0088] Certas modalidades fornecem métodos para a administração de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta em que um método compreende colocar em contato a superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente para tratamento de plantas e a aplicação de uma primeira força centrífuga para a planta. Seguindo a aplicação da primeira força centrífuga, a força centrífuga é removida. Então, uma força centrífuga subsequente é aplicada à planta submetida à primeira força centrífuga. Todos os parâmetros descritos aqui noutro local para o contato de uma planta com uma solução que compreende um agente para tratamento de plantas e aplicação de uma força centrífuga são aplicáveis para o contato da planta e ambos as primeiras e subsequentes aplicações de força centrífuga.

CENTRIFUGAÇÃO EMERSA

[0089] Durante uma centrifugação emersa, o tecido alvo é separado da solução de tratamento de reserva substancialmente em toda a aplicação de força centrífuga. Isto é, em certas modalidades, pode haver um período, em geral, relativamente breve, em que o tecido selecionado é submerso, por exemplo, no início e/ou no fim de uma centrifugação quando uma centrífuga de cesto giratório está construindo velocidade ou desacelerando e a solução reserva não tenha ainda atingido o local fora da planta onde se vai descansar durante a centrifugação e/ou re- acumular sobre a planta.

[0090] Uma vez que uma planta tenha sido posta em contato com uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas, tais como por imersão num corpo de líquido, a planta pode ser separada do corpo principal da solução utilizada para contatar a planta. Embora o corpo principal da solução utilizada para contatar a planta é separada a partir da planta, alguma solução irá tipicamente ficar em contato com a superfície da planta, tipicamente na forma de gotas que se aderem à superfície, por exemplo, "revestindo" a superfície da planta, ou de outra maneira mantidas por um período de tempo após o corpo principal de a solução ser removido.

[0091] Quando o tecido selecionado, ou a superfície da planta em torno do tecido selecionado, é/são postos em contato com a solução de tratamento e devidamente alinhados durante a centrifugação, uma parte do agente de tratamento restante sobre ou dentro da planta vai ser forçado para dentro do tecido selecionado da planta pela força da aceleração gerada durante a centrifugação emersa. Este alinhamento dependerá do tecido selecionado e requer apenas a aplicação de princípios físicos básicos para determinar uma orientação eficaz. Agente de tratamento que deixa a planta durante uma centrifugação emersa irá mover-se através do recipiente de centrifugação para se juntar ao agente de tratamento de reserva numa extremidade do recipiente de centrifugação na forma previsível que os líquidos fazem.

[0092] Em certas modalidades desta invenção, menos de 99%, ou menos do que 98%, ou menos do que 97%, ou menos do que 96%, ou menos do que 95%, ou menos do que 94%, ou menos do que 93%, ou menos do que 92%, ou menos do que 91%, ou menos do que 90%, ou menos do que 89%, ou menos do que 88%, ou menos do que 87%, ou menos do que 86%, ou menos do que 85%, ou menos do que 84 %, ou menos do que 83%, ou menos do que 82%, ou menos do que 81%, ou menos do que 80% da superfície da planta permanece em contato com o agente para tratamento de plantas durante uma centrifugação ou no fim de uma centrifugação.

[0093] Em certas modalidades, a solução que compreende o agente para tratamento de plantas é removida ou substancialmente removida a partir da superfície da planta, antes e/ou durante a aplicação da força centrífuga, de modo a que menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, ou menos do que cerca de 1% da superfície da superfície da planta permanece em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, até ao final da aplicação da força centrífuga, sem necessidade de remoção adicional da solução.

[0094] Por exemplo, durante as centrifugações emersas como descrito nos exemplos aqui apresentados, todos os agentes de tratamento de plantas que migraram a partir da superfície da planta durante a centrifugação acumularam contra a parede do recipiente de centrifugação perto das raízes da planta quando a centrifugação acabou. Uma vez que algumas das raízes também estavam em contato com esta parede do recipiente de centrifugação, o líquido de reserva se espalhou para uma porção das raízes, e assim permaneceram em contato com a solução de tratamento no final da centrifugação. Foi tomado cuidado para limitar este contato durante uma rotação emersa, incluindo a limitação da solução de tratamento utilizada durante a etapa de contato de modo a que apenas alguns mililitros de solução de tratamento recolhidos no recipiente de centrifugação durante e/ou após a aplicação da força centrífuga, em uma rotação típica emersa.

[0095] Certas modalidades fornecem para separação adicional do agente de tratamento de reserva a partir do tecido selecionado utilizando uma variedade de métodos, incluindo a incorporação de materiais que absorvem o agente de tratamento de reserva. Prevê-se também que se pode utilizar um recipiente de centrifugação conformado de tal modo que se reserva a solução de tratamento durante a centrifugação num local onde o agente de tratamento de reserva não volta a contatar o tecido selecionado após migrar para longe das plantas durante a aplicação de forças centrífugas, ou utilizar uma partição inserível para alcançar resultados semelhantes. Prevê-se também que o agente de tratamento de reserva sai do recipiente de centrifugação, durante a centrifugação, por exemplo, com uma abertura numa extremidade do recipiente de centrifugação para o líquido sair durante a centrifugação. Nesse caso, o agente de tratamento de reserva não assenta no interior do recipiente de centrifugação durante a aplicação de uma força centrífuga, mas sai para um local onde ele não contata com o tecido selecionado durante a aplicação de uma força centrífuga.

[0096] Em certas modalidades, um eixo da planta é alinhado em relação com a força centrífuga. Uma planta pode ser descrita como tendo múltiplos eixos. Um deles é o eixo broto-raiz que corre no sentido a partir da extremidade da raiz até a extremidade do broto e vice-versa. Em certas modalidades, o eixo do broto-raiz da planta está alinhado com o sentido da força centrífuga. Em certas modalidades, o eixo de broto- raiz da planta está substancialmente alinhado com, por exemplo, dentro de 3° de, o sentido da força centrífuga. Em certas modalidades, o eixo de broto-raiz da planta está alinhado dentro de 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, ou 30° do sentido da força centrífuga.

[0097] Em certas modalidades, o eixo do broto-raiz das plantas está alinhado com o sentido da força centrífuga durante a centrifugação e as plantas são fornecidas com um PCS para impedir as plantas de dobrar, deformar, colapsar, etc., durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, o suporte evita que as plantas sejam danificadas pelas forças geradas durante a centrifugação. Em certas modalidades, o suporte permite que uma planta se recuperar a partir da aplicação de uma força centrífuga, em que a mesma planta sem o suporte seria danificada sem recuperação. Em certas modalidades, o suporte mantém ou pelo menos mantém geralmente o eixo do broto-raiz da planta, impedindo-o de se dobrar, deformar, colapsar, etc.

[0098] Em certas modalidades, o suporte mantém o alinhamento de um eixo de uma planta, tal como o alinhamento do eixo do broto-raiz, em relação à direção da força centrífuga. Em certas modalidades, o suporte mantém o alinhamento de um eixo de uma planta, tal como o alinhamento do eixo do broto-raiz, com o sentido da força centrífuga ou, pelo menos, substancialmente alinhado com o sentido da força centrífuga, por exemplo, dentro de 3° do sentido da força centrífuga. Em certas modalidades, o suporte mantém o alinhamento de um eixo de uma planta, tal como o alinhamento do eixo do broto-raiz, dentro de 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, ou 30° do sentido da força centrífuga.

[0099] Em certas modalidades, o suporte fornece para a utilização de velocidades/forças de centrifugação maiores que as previstas, impedindo a planta de dobrar, deformar, colapsar, etc. Em certas modalidades, o suporte fornece a utilização de velocidades/forças de centrifugação maiores do que as previstas, impedindo a planta de ser danificada pelas forças geradas durante a centrifugação. Em certas modalidades, o suporte fornece a utilização de velocidades/forças de centrifugação maiores do que as previstas, permitindo a uma planta se recuperar a partir da aplicação de uma força centrífuga, em que a mesma planta sem o suporte seria danificada sem recuperação.

[00100] Em certas modalidades, a utilização de uma estrutura de suporte tal como descrito neste documento permite uma força centrífuga de, pelo menos, em torno de 500 g, 750 g, 1000 g, 1250 g, 1500 g, 1750 g, 2000 g, 2250 g, 2500 g, 2750 g, 3000 g, 3500 g ou 4000 g a ser aplicada à planta. Em certas modalidades, a utilização de uma estrutura de suporte tal como descrito neste documento permite uma força centrífuga em torno de 10 g ou 20 g ou 100 g ou de 300 g até 500 g, 750 g, 1000 g, 1250 g, 1500 g, 1750 g, 2000 g, 2250 g, 2500 g, 2750 g, 3000 g, 3500 g ou 4000 g a ser aplicada à planta. Em certas modalidades, a utilização de uma estrutura de suporte tal como descrito neste documento permite uma força centrífuga de, pelo menos, em torno de 500 g, 750 g, 1000 g, 1250 g, 1500 g, 1750 g, 2000 g, 2250 g, 2500 g, 2750 g, 3000 g ou 4000 g a ser aplicada à planta. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 10 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 300 g a cerca de 2000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 500 g a cerca de 2000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 750 g a cerca de 1250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1000 g a cerca de 1500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1250 g a cerca de 1750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1500 g a cerca de 2000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 1750 g a cerca de 2250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2000 g a cerca de 2500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2250 g a cerca de 2750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2500 g a cerca de 3000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 2750 g a cerca de 3250 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 3000 g a cerca de 3500 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 3250 g a cerca de 3750 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é de cerca de 3500 g a cerca de 4000 g. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada é qualquer de cerca de 500 g, 750 g, 1000 g, 1250 g, 1500 g, 1750 g, 2000 g, 2250 g, 2500 g, 2750 g, 3000 g, ou 3500 g até qualquer de cerca de 750 g, 1000 g, 1250 g, 1500 g, 1750 g, 2000 g, 2250 g, 2500 g, 2750 g, 3000 g, 3500 g ou 4000 g.

[00101] Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada a uma planta e estrutura de suporte por pelo menos 1 segundo, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada a uma planta e estrutura de suporte por não mais do que 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada a uma planta e estrutura de suporte para entre qualquer de cerca de 1 segundo, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos ou 120 minutos até qualquer um de cerca de 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos.

[00102] Após uma centrifugação não imersa, as plantas podem ser submetidas a tratamentos subsequentes (isto é, uma centrifugação em série) ou enxaguadas, se desejado, tal como com água, para remover qualquer solução remanescente de tratamento de planta, e em seguida recuperadas por serem transplantadas em meio de crescimento e supervisionadas em um ambiente protegido (por exemplo, estufa, casa de sombra, sala de crescimento ou câmara de crescimento, sala de cultura de tecidos, etc.) ou transplantadas diretamente para um campo.

CENTRIFUGAÇÃO SUBMERSA

[00103] Durante uma rotação submersa, o tecido alvo é submerso e/ou permanece em contato com o agente de tratamento de reserva, por exemplo, o corpo do agente de tratamento no recipiente da centrifuga que não migra para a planta. Em certas modalidades, o resto do corpo da planta também é submerso e/ou permanece em contato com o agente de tratamento de reserva no recipiente da centrifuga durante a aplicação de uma força centrífuga. Em certas modalidades, um PCS é utilizado para suportar o tecido alvo de uma planta, e/ou o resto do corpo da planta, de tal modo que o tecido alvo é submerso no agente de tratamento durante a aplicação de uma força centrífuga, enquanto o resto do corpo da planta não é submerso de forma significativa.

[00104] Em certas modalidades após o contato inicial da superfície da planta com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, uma solução adicional pode ser adicionada para garantir que, significativamente, a maior parte da planta e/ou o tecido alvo permaneçam submersos e ou em contato com a solução de tratamento de reserva durante a aplicação da força centrífuga.

[00105] Apesar da referência geral a submerso neste documento, o método não se limita à exigência de que toda a planta seja submersa durante a centrifugação. Nos centrifugações submersas conduzidas neste documento, verificou-se que, desde que o tecido alvo foi submerso e/ou que os tecidos sobre a superfície da planta em torno do tecido alvo foram submersos, uma boa administração do agente para o tecido pode ser obtida. Em certas modalidades, em que pelo menos o tecido alvo foi submerso e/ou que os tecidos sobre a superfície da planta em torno do tecido alvo foram submersos, uma boa administração do agente para o tecido pode ser obtida.

[00106] Em certas modalidades, uma planta ou plantas são colocadas em um recipiente e a solução que compreende o agente para tratamento de plantas é derramada sobre elas até que fiquem suficientemente submersas. Em certas modalidades, apenas o tecido selecionado e/ou tecidos de superfície que rodeiam o tecido alvo permanecem em contato com o agente de tratamento durante a centrifugação.

[00107] Por exemplo, onde o tecido selecionado é meristema de broto apical, menos do que cerca de 1% da área de superfície total da planta é posta em contato durante uma centrifugação submersa para conseguir a administração de um agente a tecidos do SAM. Em certas modalidades, menos que cerca de 1% da superfície de uma planta necessita estar em contato com o agente para tratamento de plantas durante uma centrifugação submersa a fim de administrar o agente para tratamento de plantas para o tecido alvo.

[00108] Em certas modalidades, pelo menos cerca de 1% ou mais da superfície da planta necessita permanecer em contato com a solução de tratamento de plantas durante uma centrifugação submersa. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou 100% da superfície da planta é submersa no agente para tratamento de plantas durante a centrifugação.

[00109] Em certas modalidades, uma pluralidade de plantas é colocada em um recipiente que também contém um reservatório da solução compreendendo um agente para tratamento de plantas de tal modo que a pluralidade de plantas é empacotada junta na solução. Embora as plantas sejam geralmente submersas, algumas das plantas podem não ter todas as suas superfícies cobertas em todos os momentos. Em certas modalidades, as plantas são misturadas ou agitadas no agente de tratamento pelo menos uma vez antes da centrifugação para ajudar a assegurar que todas as superfícies das plantas são postas em contato com o agente de tratamento em algum momento antes ou durante a centrifugação.

[00110] Em certas modalidades, as plantas e/ou os eixos das plantas não necessitam de ser dispostos ou alinhados em relação uns aos outros e/ou em relação à força de aceleração durante a centrifugação. Por exemplo, em certas modalidades, uma pluralidade tal como cerca de uma dúzia, cerca de várias dúzias, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, etc., mudas podem ser colocadas no reservatório de líquido compreendendo a solução de tratamento de plantas e misturadas antes e/ou durante a centrifugação. Em certas modalidades, nenhuma atenção é dada ao alinhamento das plantas. Em certas modalidades, duas ou mais da pluralidade de plantas ou seus eixos são intencionalmente alinhados em relação uns aos outros. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99 %, ou 100% da pluralidade de plantas ou seus eixos estão alinhados em relação uns aos outros durante a centrifugação, seja intencional ou não. Por exemplo, o alinhamento e/ou agregação de plantas em conjunto de modo que estarão prontas para as etapas adicionais a jusante, tais como uma ou mais etapas adicionais de centrifugação, depois da primeira centrifugação. O alinhamento e/ou agregação antes da primeira centrifugação resultar na realização das etapas subsequentes, tais como a centrifugação em certas modalidades em que o alinhamento das plantas também é realizado de forma mais eficiente.

[00111] Em certas modalidades, a quantidade de área superficial da planta que está em contato com um agente para tratamento de plantas pode variar com o tipo de planta e/ou a estrutura da planta, o tamanho da planta, o tecido ao qual o agente para tratamento de plantas deve ser distribuído, o estágio de desenvolvimento da planta, e a quantidade de solução que compreende o agente para tratamento de plantas disponível para utilização, entre outros fatores. Em certas modalidades, entre cerca de 1% e 100% da superfície da planta é posta em contato com o agente para tratamento de plantas. Em certas modalidades, entre cerca de 5% e 100% da superfície da planta é posta em contato com o agente para tratamento de plantas. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 2%, ou pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40 %, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou cerca de 100% (por exemplo, a planta está completamente submersa na solução) da superfície da planta permanece em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas durante a centrifugação.

[00112] Em certas modalidades em que pelo menos uma porção da superfície da planta continua em contato ou submersa durante a centrifugação, uma força centrífuga de até cerca de 20 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 75 g, 80 g, 90 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g, 500 g, 550 g, 600 g, 650 g, 700 g, 750 g, 800 g, 850 g, 900 g, 950 g, 1000 g, 1050 g, 1100 g, 1150 g, 1200 g, 1250 g, 1300 g, 1350 g, 1400 g, 1450 g, 1500 g, 1550 g, 1600 g, 1650 g, 1700 g, 1750 g, 1800 g, 1850 g, 1900 g, 1950 g, 2000 g, 2050 g, 2100 g, 2150 g, 2200 g, 2250 g, 2300 g, 2350 g, 2400 g, 2450 g, 2500 g, 2550 g, 2600 g, 2650 g, 2700 g, 2750 g, 2800 g, 2850 g, 2900 g, 2950 g, 3000 g, 3050 g, 3100 g, 3150 g, 3200 g, 3250 g, 3300 g, 3350 g, 3400 g, 3450 g, 3500 g, 3550 g, 3600 g, 3650 g, 3700 g, 3750 g, 3800 g, 3850 g, 3900 g, 3950 g, 4000 g ou pode ser aplicada. Em certas modalidades em que pelo menos uma porção da superfície da planta continua em contato ou submersa durante a centrifugação, uma força centrífuga de pelo menos cerca de 10 g, 20 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 75 g, 80 g, 90 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g, 500 g, 550 g, 600 g, 650 g, 700 g, 750 g, 800 g, 850 g, 900 g, 950 g, 1000 g, 1050 g, 1100 g, 1150 g, 1200 g, 1250 g, 1300 g, 1350 g, 1400 g, 1450 g, 1500 g, 1550 g, 1600 g, 1650 g, 1700 g, 1750 g, 1800 g, 1850 g, 1900 g, 1950 g, 2000 g, 2050 g, 2100 g, 2150 g, 2200 g, 2250 g, 2300 g, 2350 g, 2400 g, 2450 g, 2500 g, 2550 g, 2600 g, 2650 g, 2700 g, 2750 g, 2800 g, 2850 g, 2900 g, 2950 g, 3000 g, 3050 g, 3100 g, 3150 g, 3200 g, 3250 g, 3300 g, 3350 g, 3400 g, 3450 g, 3500 g, 3550 g, 3600 g, 3650 g, 3700 g, 3750 g, 3800 g, 3850 g, 3900 g, 3950 g, ou 4000 g pode ser aplicada. Em certas modalidades, a força centrífuga aplicada e de qualquer uma de cerca de 10 g, 20 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 75 g, 80 g, 90 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g, 500 g, 550 g, 600 g, 650 g, 700 g, 750 g, 800 g, 850 g, 900 g, 950 g, 1000 g, 1050 g, 1100 g, 1150 g, 1200 g, 1250 g, 1300 g, 1350 g, 1400 g, 1450 g, 1500 g, 1550 g, 1600 g, 1650 g, 1700 g, 1750 g, 1800 g, 1850 g, 1900 g, 1950 g, 2000 g, 2050 g, 2100 g, 2150 g, 2200 g, 2250 g, 2300 g, 2350 g, 2400 g, 2450 g, 2500 g, 2550 g, 2600 g, 2650 g, 2700 g, 2750 g, 2800 g, 2850 g, 2900 g, 2950 g, 3000 g, 3050 g, 3100 g, 3150 g, 3200 g, 3250 g, 3300 g, 3350 g, 3400 g, 3450 g, 3500 g, 3550 g, 3600 g, 3650 g, 3700 g, 3750 g, 3800 g, 3850 g, 3900 g, 3950 g ou 4000 g.

[00113] Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada por pelo menos 1 segundo, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada a uma planta e estrutura de suporte por não mais do que 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos. Em certas modalidades, a força centrífuga é aplicada a uma planta e estrutura de suporte para entre qualquer de cerca de 1 segundo, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos ou 120 minutos até qualquer um de cerca de 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos.

[00114] Em certas modalidades, a duração de tempo a partir de quando a superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, e quando é removido, é de pelo menos cerca de um segundo, 5 segundos, 30 segundos, um minuto, cinco minutos, dez minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas ou mais. Em certas modalidades, a duração de tempo a partir de quando a superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas e quando ela é removida não é maior do que cerca de 5 segundos, 30 segundos, de um minuto, cinco minutos, dez minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas ou mais. Em certas modalidades, a duração de tempo a partir de quando a superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas e quando ele é removido é a partir de qualquer um de cerca de um segundo, 5 segundos, 30 segundos, de um minuto, cinco minutos, dez minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas ou 2,5 horas a cerca de 5 segundos, 30 segundos, um minuto, cinco minutos, dez minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas ou 3 horas.

[00115] A quantidade da superfície da planta que é posta em contato com o agente para tratamento de plantas pode variar de acordo com, por exemplo, o método através do qual a superfície da planta é posta em contato com o agente para tratamento de plantas e/ou, por exemplo, pela quantidade, tais como o volume, do agente para tratamento de plantas que é usado. Por exemplo, um agente para tratamento de plantas pode ser pulverizado ou aspergido em geral sobre toda a superfície de uma planta ou apenas sobre certas porções.

[00116] Se uma solução de tratamento de líquidos é usado, quanto maior o volume do agente para tratamento de plantas adicionado ao recipiente, mais fácil será garantir que as plantas tratadas no recipiente sejam suficientemente postas em contato, até que as plantas estejam significativamente e completamente submersas e/ou começam a flutuar à superfície do líquido. Além disso, como plantas adicionais são adicionadas ao recipiente de centrifugação, o volume no recipiente disponível para o agente de tratamento irá diminuir, diminuindo assim o volume de agente de tratamento necessário para contatar a superfície necessária em cada planta. Além disso, se o recipiente contendo as(s) planta(s) e o agente para tratamento de plantas for agitado, tal como por agitação ou rolamento, para administrar o agente para tratamento de plantas em todo o recipiente, geralmente maior será a área superficial da planta que será contatada com o agente para tratamento de plantas.

[00117] Em certas modalidades, a planta é uma semente de milho com as folhas que formam um copo ou verticilo que vai se desdobrando. Esta área na base das folhas que se desdobram é capaz de reter o líquido. Em certas modalidades, a solução que compreende o agente de tratamento da planta é posta em contato com a planta de milho, sem levar em conta se o líquido é colocado dentro do copo ou verticilo. Em certas modalidades, onde a solução que compreende o agente para tratamento de plantas que está contido dentro do copo ou verticilo, uma área de superfície adicional da planta de milho também é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas. Em certas modalidades, a área adicional de superfície da planta de milho que também está em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de planta é maior do que cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, ou 5% mais do que a área da superfície de contato dentro copo/verticilo. Em certas modalidades, pelo menos uma porção da superfície da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas, mas nenhuma solução é colocada no copo/verticilo formado na base das folhas que se desdobram, isto é, o copo/verticilo é desprovido de solução antes da aplicação de uma força centrífuga.

TRATAMENTOS DE CENTRIFUGAÇÃO

[00118] Certas modalidades da invenção empregam "centrifugações em série" que incluem mais de uma centrifugação realizada em série e podem incluir pelo menos uma centrifugação não submersa e/ou uma centrifugação submersa. Durante uma centrifugação em série, as plantas são submetidas a pelo menos uma centrifugação adicional após a aplicação de uma primeira centrifugação. A centrifugação em série pode incluir múltiplas centrifugações de qualquer tipo, em qualquer ordem, com várias etapas antes, depois ou entre as centrifugações. Uma centrifugação em série pode incorporar o uso de um PCS durante a aplicação de uma força de aceleração gerada durante, pelo menos, um tratamento de centrifugação. A "centrifugação dupla" é um tipo de centrifugação em série que compreende duas centrifugações realizadas em série ou em momentos diferentes. Em certas modalidades, uma centrifugação em série compreende uma primeira rotação submersa seguida por uma rotação não submersa.

[00119] Em certas modalidades, uma força centrífuga é aplicada a uma planta em que o tecido alvo é submerso no agente de tratamento reserva durante a aplicação de uma força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos 1% da superfície total da planta é posta em contato com a solução que compreende o agente para tratamento de plantas durante a aplicação da força centrífuga. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 2%, ou pelo menos cerca de 3%, ou pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40 %, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98% , ou, pelo menos, cerca de 99%, ou cerca de 100% da superfície da planta permanece em contato com a solução que compreende a solução de tratamento de plantas durante aplicação da força centrífuga.

[00120] Em certas modalidades, a solução que compreende o agente para tratamento de plantas é removida ou substancialmente removida da superfície da planta antes e/ou durante a aplicação da força centrífuga subsequente, de modo a que menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, ou menos do que cerca de 1% da superfície da superfície da planta permanece em contato com a solução até ao final da aplicação da força centrífuga subsequente.

[00121] As forças centrífugas aplicadas a uma planta durante uma centrifugação que faz parte de uma centrifugação em série pode ser qualquer força centrífuga conhecida na técnica. Em certas modalidades, os parâmetros de centrifugação de, pelo menos, um tratamento de centrifugação são consistentes com aqueles descritos aqui em local, tais como a centrifugação submersa ou uma centrifugação não submersa ou uma centrifugação em série, tal como descrita aqui em outro local. Estas incluem as faixas de forças centrífugas entre 10-4000 g durante uma rotação não submergida e/ou 10-500 g durante uma rotação submergida e a duração da força centrífuga aplicada às plantas poderia incluir uma variedade de cerca de um segundo a cerca de 180 minutos.

[00122] Após um primeiro tratamento de centrifugação , as plantas podem ser submetidas a tratamentos subsequentes, ou enxaguadas, tal como com água, para remover qualquer solução remanescente de tratamento de plantas, e em seguida recuperadas por serem transplantadas em meio de crescimento e supervisionadas em um ambiente protegido (por exemplo, estufa, casa de sombra, sala de crescimento ou câmara de crescimento, sala de cultura de tecidos, etc.) ou transplantadas diretamente para um campo.

SUPORTES À CENTRIFUGAÇÃO DE PLANTAS

[00123] Em certas modalidades, o suporte estrutural no interior do recipiente de centrifugação está incluído com as plantas quando elas são centrifugadas. Em certas modalidades, um suporte de centrifugação de planta (PCS) mantém uma orientação desejada do tecido alvo relativa a força de aceleração gerada pela centrifugação de modo que pelo menos uma parte do agente de tratamento em contato com a planta migra para e/ou é forçado para dentro do tecido selecionado pela força de aceleração gerada durante a centrifugação, ou seja, para "alinhar adequadamente" o tecido alvo e/ou planta. Em certas modalidades, um PCS suporta pelo menos uma parte de uma planta durante a centrifugação de modo a que as células do tecido do alvo não entram em contato com o agente de tratamento de reserva. Em certas modalidades, um PCS elimina ou mitiga o dano da célula, tecido, ou órgão para a planta causado durante a aplicação de uma força centrífuga, embora isto não seja necessariamente sempre requerido, pois um usuário pode encontrar utilidade na recuperação de plantas danificadas que contêm células ou tecidos em que o agente de tratamento foi entregue com sucesso durante a centrifugação.

[00124] Em certas modalidades, um PCS é fixo no interior do recipiente de centrifugação, quer se trate de uma inserção conectável de forma removível ou seja moldado ou montado em ou de outro modo permanentemente ligado ao recipiente da centrífuga. Em certas modalidades, o PCS compreende pelo menos um talo, pólo, ponta ou aleta que é acoplável a um caule da planta. Em algumas modalidades, o PCS compreende, pelo menos, um de aproximadamente 1/8"de diâmetro do talo que é acoplável a, pelo menos, uma planta, tal como uma semente de planta. Em algumas modalidades, mais de uma planta está associada, tal como ligado, a um PCS. A Figura 5 mostra um exemplo de um PCS. Em algumas modalidades, mais de uma planta está ligada a um PCS, se cada planta está assegurada de forma individual a diferentes partes de um PCS comum, conforme mostrado na Figura 8, ou se mais do que uma planta está ligada com a mesmo parte de um PCS comum, como mostrado na Figura 6.

[00125] Em certas modalidades, um PCS compreende um talo de madeira com aproximadamente 1/8" de diâmetro. Em certas modalidades, o PCS é aproximadamente o comprimento de uma planta a ser centrifugada. Em certas modalidades, este comprimento do PCS inclui o comprimento da planta acrescido de um comprimento ou largura de uma semente ainda ligada a uma muda.

[00126] Em certas modalidades, o PCS compreendendo um talo situa-se no recipiente da amostra da centrífuga com uma extremidade, ponta ou bico do talo apoiado de encontro à parede interior do recipiente de amostragem da centrífuga de modo que alguma parte do talo se estende para dentro ou através do interior do recipiente da amostra da centrífuga. As Figuras 5-9 revelam várias modalidades exemplificativas disto.

[00127] Em certas modalidades, regiões substanciais tais como pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% , 98%, 99%, ou 100%, de um caule de planta é suportado por um lado do PCS com o qual a planta está associada, por exemplo, ligada a ou protegida por, e o PCS situa-se dentro do recipiente de amostra da centrífuga tal que quando a planta é centrifugada, o PCS prende o eixo do comprimento do caule da planta paralelo à aceleração causada pela centrifugação. Em certas modalidades, o eixo longo é o eixo raiz-parte aérea da planta. Em certas modalidades, pelo menos uma planta está associada com, tal como ligada a, pelo menos um PCS e a combinação de plantas-PCS é centrifugada. Em certas modalidades, o PCS entra em contato com todas as plantas que ele suporta. Em certas modalidades, o PCS fornece suporte suficiente para as plantas que ele entra em contato de modo que as plantas em contato com ele são capazes de fornecer apoio suficiente para outras plantas próximas que não estão em contato com o PCS, de tal forma que mesmo as plantas que não estão em contato direto com os PCS são suficientemente suportadas durante a centrifugação para satisfazer os requisitos de uma centrifugação não submergida, descrito em várias partes deste documento.

[00128] Tal como provido neste documento, um PCS pode compreender qualquer material suficientemente robusto de modo a evitar que o tecido alvo entre em contato com o agente de tratamento de reserva durante a centrifugação e/ou para manter um alinhamento desejado do tecido alvo durante a centrifugação. Em certas modalidades, o PCS também evita danos mortíferos a planta que de outro modo seriam causados pelo colapso, dobramento, rasgo, corte ou quebra dos órgãos e/ou tecidos da planta durante a centrifugação. Da mesma forma, uma planta pode ser associada com um PCS em qualquer forma, desde que a combinação planta-PCS proporcione um suporte estrutural suficiente para a planta de forma a impedir que o tecido entre em contato com o agente de tratamento de reserva durante a centrifugação e/ou para manter um alinhamento desejado do tecido alvo durante a centrifugação. Em certas modalidades, o PCS também evita que as forças aceleradoras geradas durante a centrifugação danifiquem o órgãos ou tecidos da planta para além de recuperação.

[00129] Em certas modalidades, o PCS é pelo menos tão longo como o caule da planta ao qual está associado. Em certas modalidades, o comprimento do PCS também depende do fato de a semente permanecer ligada a uma muda. Em certas modalidades, o caule de uma muda está ligado ao longo do comprimento de um PCS compreendendo um talo de madeira tão longo quanto a muda ou maior. Em certas modalidades, um caule de uma planta ligado a um PCS com um envoltório que compreende um material flexível, tal como uma parafina plástica, filme plástico, folha de alumínio, ou qualquer outro material utilizado para ligar um item ao outro de forma não destrutiva e removível, incluindo os circuitos de cadeia, fios, fio elástico, etc. Outras formas de associar, ligar ou fixar uma planta a um PCS são previstos, enquanto a combinação de PCS e planta fornecer fricção suficiente para a superfície da planta, de modo a impedir que o tecido alvo fique submerso no agente de tratamento de reserva durante a aplicação de uma força centrífuga e/ou desde que a combinação de PCS e planta mantenha um alinhamento do tecido alvo de tal modo que, pelo menos, um agente de tratamento é posto em contato com, pelo menos, uma célula do tecido alvo durante a aplicação de uma força centrífuga.

[00130] Em certas modalidades, a fricção que mantém a planta no lugar durante a centrifugação é criada entre a planta e o PCS diretamente, por exemplo, quando as plantas são embalados individualmente em um único PCS. Em certas modalidades, a associação entre o PCS e a planta pode ser indireta, tal como onde o atrito que mantém a planta no lugar ocorre entre, pelo menos, duas plantas que são agrupadas juntas. Em certas modalidades, este agrupamento é rígido o suficiente para fornecer o atrito necessário para evitar que o tecido alvo fique submerso no agente de tratamento de reserva durante a aplicação de uma força centrífuga e/ou mantenha um alinhamento do tecido alvo de tal modo que, pelo menos, algum agente alvo é posto em contato com, pelo menos, uma célula do tecido alvo durante a aplicação de uma força centrífuga.

[00131] Em certas modalidades, um PCS pode ser uma espuma de apoio que preenche os espaços em torno de uma planta tal que proporciona o atrito necessário para evitar que o tecido alvo fique submerso no agente de tratamento de reserva durante a aplicação de uma força centrífuga e/ou fornece a fricção necessária para manter um alinhamento do tecido alvo de tal modo que, pelo menos, algum agente alvo é posto em contato com, pelo menos, uma célula do tecido alvo durante a aplicação de uma força centrífuga. Em uma modalidade preferencial, um PCS compreendendo uma espuma também vai impedir que as plantas sofram danos mortíferos durante a centrifugação. Qualquer outro tipo de matriz de suporte e/ou adesiva que satisfaça a descrição geral de um PCS mencionada anteriormente neste documento poderia ser usada em conjunto com esta invenção.

[00132] Em certas modalidades, um PCS está associado com um conjunto de muitas plantas agrupadas e rodeado por um invólucro, que nesta modalidade também é um componente do PCS que ajuda a fornecer o atrito necessário para o PCS desempenhar a sua função (por exemplo, um sistema PCS envoltório-talo). Em certas modalidades, os talos são envolvidos com as plantas de tal modo para melhorar ainda mais o desempenho do sistema PCS envoltório-talo. A Figura 9 ilustra uma modalidade exemplificativa de um sistema de PCS.

[00133] Estes métodos não estão limitados a qualquer alinhamento específico de um tecido-alvo ou da planta durante a centrifugação. Em certas modalidades, diferentes tecidos exigem diferentes orientações do tecido alvo e ou diferentes orientações do corpo da planta em relação à força de aceleração gerada durante uma centrifugação. Por exemplo, se o tecido alvo é um SAM, um PCS poderia ser utilizado para prevenir que o SAM fique submerso ou entre em contato com o agente de tratamento de reserva durante a aplicação de uma força centrífuga. O PCS também poderia ser usado para garantir que pelo menos alguma parte do agente de tratamento entre em contato com o SAM, ou que os tecidos circundantes do SAM, por exemplo, folha jovem e/ou folhas mais velhas que circundam o SAM no início de uma centrifugação sejam empurrados pelo menos para dentro de uma célula do SAM.

[00134] Por exemplo, são descritos neste documento métodos em que um agente de tratamento é distribuído para os SAMs de milho. Como ilustrado por exemplos neste documento, as plantas foram dispostas em uma centrífuga Beckman Coulter Allegra X-14 series de tal forma que os PCS iria segurar o eixo broto-raiz das plantas relativamente em paralelo com a força da aceleração gerada pela centrifugação com as extremidades do SAM das plantas mais próximas do centro da centrífuga e as extremidades de raízes das plantas mais distantes do centro da centrífuga. Desta forma, a força de aceleração gerada durante a centrifugação vai empurrará alguma parte do agente de tratamento perto ou na superfície da SAM em pelo menos uma célula do SAM durante a centrifugação.

[00135] Em certas modalidades de uma centrifugação não submergida de segmentação do tecido SAM, várias dezenas de mudas haploides são agrupadas em conjunto em um PCS compreendendo um envoltório e talo, e alinhadas significativamente na mesma orientação, semelhante ao mostrado na Figura 9. As plantas são então contatadas por uma solução de agente de duplicação (por exemplo, colchicina) durante vários minutos, em seguida, colocadas em um recipiente de centrifugação e centrifugadas de tal modo que as SAM não entram em contato com o agente de duplicação da reserva e ainda alguma parte do agente de duplicação que estava em contato com a planta no início da centrifugação é forçado para dentro, pelo menos, de uma célula do SAM durante a aplicação de uma força centrífuga, proporcionando assim um agente de duplicação para as células dentro do SAM das plantas. Em uma modalidade preferencial, o PCS do conjunto também evita danos mortíferos para as plantas causados por forças aceleradoras geradas durante a centrifugação. Em algumas modalidades, um PCS pode compreender um envoltório ou cobertura, enquanto servir como uma função de um PCS descrito neste documento.

[00136] Um PCS pode ser utilizado em conjunto com, significativamente, qualquer tratamento de centrifugação, independentemente do fato de ele executar as funções descritas acima. Por exemplo, um usuário pode optar por usar um PCS durante uma rotação submergida mesmo que o PCS, neste caso, não impeça que o tecido alvo seja submerso na solução de reserva e embora o alinhamento do tecido alvo durante uma centrifugação submersa não seja necessário. Em certas modalidades, um PCS é usado durante uma centrifugação submersa para alinhar as plantas e/ou o tecido alvo e permite a administração mais eficiente da solução de tratamento para um tecido de planta alvo. Em certas modalidades, um PCS é usado durante uma centrifugação submersa para manter o tecido alvo submerso no agente de tratamento de reserva durante a centrifugação, enquanto mantém o resto, ou significativamente o resto, do corpo de planta para fora do agente de tratamento de reserva. Em certas modalidades, um PCS é usado durante uma centrifugação submersa porque faz com que o processamento de plantas, antes ou depois de uma centrifugação, ou antes ou depois de uma centrifugação subsequente, seja mais fácil ou mais eficaz.

MELHORAR A EFICIÊNCIA DE DUPLICAÇÃO

[00137] Os métodos aqui proporcionados podem ser usados para ajudar a entrega do agente para tratamento de planta compreendendo agentes de duplicação de cromossomas para tecidos selecionados de plantas haploides, melhorando assim a eficiência da duplicação.

[00138] "Eficiência de Duplicação" (DE) é um indicador geral de sucesso DH calculado pela divisão do número de plantas DH0 de uma designação que produzem sementes DH1 pelo número total de plantas DH0 que designação que foram submetidas para um tratamento de duplicação cromossômica.

[00139] Tal como aqui utilizado, plantas haploides, tais como mudas haploides, submetidos a um cromossoma de duplicação tratamento são denominadas plantas DH0. Plantas duplicadas com sucesso DH0 podem produzir ovos e/ou esperma haploide, e se as plantas DH0 são de autofecundação com sucesso, o número de cromossomos zigóticos podem ser recuperados em prole substancialmente homozigóticos (denominado DH1 plantas no presente documento), com o vigor e a fertilidade esperada de um esporófito 2n.

[00140] Certas modalidades proporcionam métodos de obtenção de um duplo-haploide de embriões de milho, que compreendem: realizar qualquer um dos métodos de entrega de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta, em que a planta é uma planta haploide acima mencionada, e em que o agente de tratamento é um agente de duplicação do cromossoma e em que o agente de duplicação induz a formação de pelo menos uma planta de duplo haploide. Além disso proporcionam-se aqui métodos para a obtenção de uma planta de duplo haploide compreendendo: colheita de um embrião de duplo haploide de uma semente obtida a partir dos métodos aqui descritos. Em certas modalidades, a semente está ligada à espiga de milho como o embrião é colhido a partir da semente. Em outras modalidades, a semente não está ligada para a espiga de milho assim como o embrião é colhido. Certas modalidades também proporcionam o fornecimento de nutrientes suficientes para um embrião de duplo haploide para permitir o desenvolvimento do embrião de duplo haploide numa planta de duplo haploide.

[00141] Certas modalidades também proporcionam métodos para a obtenção de uma planta de milho de duplo haploide que compreende: a obtenção de um embrião de duplo haploide de milho derivada de qualquer um dos métodos aqui proporcionados e o fornecimento de nutrientes suficientes ao embrião para permitir o desenvolvimento do embrião na semente da planta de milho de duplo haploide. Um embrião de milho de duplo haploide pode ser formado por métodos compreendendo: a realização de qualquer dos métodos de fornecimento de uma solução compreendendo um agente para tratamento de plantas do meristema apical do broto, em que o agente para tratamento de plantas é um agente de duplicação do cromossoma, e permitindo que o agente de duplicação acima mencionado induza a duplicação cromossômica.

[00142] São também proporcionados métodos de obtenção de uma semente compreendendo um embrião de milho de duplo haploide compreendendo: colheita de uma semente compreendendo um embrião de duplo haploide obtido pelos métodos de obtenção de um embrião de milho de duplo haploide. Um embrião de milho de duplo haploide pode ser obtido por métodos compreendendo: realização de qualquer um dos métodos de entrega de um agente para tratamento de plantas a um tecido de planta, em que o agente de tratamento de embrião é um agente de duplicação do cromossoma, e permitindo que o agente de duplicação induza a formação acima mencionada, pelo menos, um embrião de duplo haploide em pelo menos uma das sementes. Em certas modalidades, a semente colhida é uma semente fisiologicamente madura.

[00143] Também são proporcionados métodos para a obtenção de uma planta de milho de duplo haploide que compreende: semeando uma semente que compreende um embrião de milho de duplo haploide obtido pelos métodos de obtenção de uma semente compreendendo um embrião de milho de duplo haploide e permitindo que a semente semeada desenvolva uma planta de milho de duplo haploide. Em certas modalidades, a semente que compreende o embrião de milho de duplo haploide é obtida a partir de uma terceira parte. Em outras palavras, o partido que colheu a semente não é necessariamente ao partido que semeou a semente compreendendo o embrião de duplo haploide e permitiu que a semente lançada desenvolvesse na planta de milho de duplo haploide.

DEFINIÇÕES E DESCRIÇÕES ADICIONAIS

[00144] A "população de vegetais" ou "população de plantas" denota um conjunto que compreende qualquer quantidade, incluindo uma, de indivíduos, objetos ou dados a partir dos quais as amostras são retiradas para avaliação, por exemplo, estimar os efeitos de QTL. Mais comumente, os termos se relacionam a uma população de cultivo de vegetais a partir da qual os membros são selecionados e cruzados para produzir uma progênie em um programa de cultivo. Uma população de plantas pode incluir a progênie de um único cruzamento de cultivo ou uma pluralidade de cruzamentos de cultivo e pode ser de vegetais em si ou de materiais derivados de vegetais ou representações in silico das plantas. Os membros da população não precisam ser idênticos aos membros da população selecionados para utilização em ciclos subsequentes de análises ou aqueles em última análise selecionados para obter as plantas de progênie final. Muitas vezes, uma população de planta é derivada de um único cruzamento biparental, mas também pode ser derivado de dois ou mais cruzamentos entre os mesmos ou diferentes progenitores. Apesar de uma população de plantas poder compreender qualquer quantidade de indivíduos, aqueles versados na técnica reconhecerão que os cultivados de plantas geralmente utilizam tamanhos de populações que variam de cem a duzentos indivíduos a milhares e que o maior desempenho de 5-10% de uma população é o que geralmente é selecionado para ser usado em cruzamentos subsequentes a fim de melhorar o desempenho das gerações subsequentes da população.

[00145] Tal como aqui utilizado, "cultivar" descreve qualquer atividade que promova ou melhora o crescimento de uma planta em qualquer ponto do seu ciclo de vida, incluindo a germinação. "Tendem" é aqui usado como sinônimo de cultivar, por exemplo, cuidar de plantas em uma estufa é equivalente a cultivar plantas em uma estufa.

[00146] Um "meio de crescimento", tal como aqui utilizado compreende qualquer substrato capaz de suportar o desenvolvimento de uma planta, incluindo o solo de envasamento, solo de campo, e meios de comunicação de laboratório, incluindo, mas não se limitando a meios de cultura de tecidos de plantas com base em MS ou N6.

[00147] Tal como aqui utilizado, "germinação" descreve um ponto num ciclo de vida da planta, que começa quando o primeiro radical raiz emerge a partir do revestimento de semente. Este período de tempo pode sobrepor-se ao período de tempo reconhecido como "brotando", durante o qual a semente começa a colocar para fora brotos.

[00148] As seguintes modalidades descritas são meramente representativas da invenção, que pode ser concretizada de outras formas. Assim, detalhes estruturais, funcionais e processuais específicos divulgados neste documento não devem ser interpretados como limitantes.

EXEMPLOS

[00149] Plantas de milho haploides aqui utilizadas foram obtidas por polinização das plantas de milho F1 ou F2 com pólen de uma linha de indutores haploides. Espigas foram colhidas quando as sementes estavam maduras, sem casca e as sementes haploides recuperadas por métodos convencionais da técnica.

[00150] Exemplos de linhas de indutores haploides que podem ser utilizados para repetir as experiências abaixo não limitativas incluem Bolsa 6 (Coe 1959), SMR (Rober et al. 1005), KEMS (Deimling et al. 1997), KMS ou ZMS (Chalyk et al. 3994; Chalyk e Chebotar 1000), ou outras linhas de indutores derivados destes. A linha de indutor também pode transportar pelo menos uma característica marcadora para facilitar a identificação da prole haploide. A pureza do pool haploide pode ser feito para ser 95% ou superior e pode ser verificada utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica.

Exemplo 1. A rotação não submersa individual com o agente para tratamento de plantas Colchicina melhora com sucesso a Eficiência de Duplicação.

[00151] Sementes de milho de quatro variedades de milho F1 derivadas de híbridos haploides foram utilizadas no experimento; duas das populações, Macho 1 e Macho 2, foram obtidos a partir de duas linhagens de machos diferentes e as duas populações restantes, Fêmea 1 e Fêmea 2, foram obtidas a partir de duas linhagens de fêmeas diferentes. Sementes de cada germoplasma foram germinadas em solo e as mudas subsequentes cultivadas em uma estufa em condições normais de milho crescendo até que as mudas atingiram os estágios de crescimento V1 para V2.

[00152] Em seguida, várias mudas aleatoriamente selecionadas de cada germoplasma foram então removidas do solo, lavado para remover o solo residual e depois sujeito a uma etapa de contato que inclui as mudas imersas durante 10 minutos num agente de duplicação líquido compreendendo 1250 ppm de colchicina.

[00153] Após a etapa de contato, as mudas foram empacotadas em um PCS com talos de madeira, semelhante ao descrito na Figura 9. As mudas e talos foram enrolados juntamente com várias camadas de papel alumínio. Foi tomado cuidado para embrulhar as mudas firmemente, mas não tão apertada como a danificar os tecidos da muda. As dobras e camadas do embrulho foram dispostas de tal modo que qualquer agente líquido ainda agarrado à superfície da planta não seria aprisionado no interior do embrulho, durante a centrifugação.

[00154] Uma vez providenciado na centrífuga, as mudas foram submetidas a uma centrifugação não submersa a 335 g durante 3 min.

[00155] Após centrifugação, as mudas foram removidas do recipiente de centrifugação, lavada com água para remover qualquer agente para tratamento de planta remanescente e, em seguida transplantadas para vasos de 25,4 cm (10 polegadas) em uma câmara de crescimento onde foram cuidadas sob condições normais de cultivo de milho até que cresceram até maturidade e floresceram.

[00156] Autopolinizações foram tentadas com cada planta que sobreviveu ao tratamento de produzir pólen e durante o crescimento que se seguiu o sucesso da polinização, o sucesso de fertilização e eficiência de duplicação final foram determinados em cada amostra.

[00157] As amostras de controle de várias mudas aleatoriamente selecionadas de cada germoplasma recebeu nenhuma exposição ao agente para tratamento de plantas, mas foram de outra forma tratadas de forma idêntica como os seus homólogos tratados.

[00158] A Tabela 1 revela que todas as plantas de controle não produziram pólen. Por conseguinte, não podiam ser autopolinizadas ou produzirem sementes autofecundadas, e assim produziram um DE igual a zero. Por outro lado, todas as amostras que receberam o tratamento de centrifugação emersa exibiram bom conjunto de sementes globais e DEs de população média que variam entre 42% a 71%, dependendo do germoplasma.TABELA 1. Efeitos sobre sucesso DH quando diversos germoplasmas de milho haploides são submetidos a uma única centrifugação não submersa. Sucessos de polinização são os números de plantas que produziam sedas e pólen e por isso poderiam ser autopolinizados; Sucessos de Fertilização são os números de plantas de duplo haploides tratados que produziram uma espiga com, pelo menos, uma semente. DE é a eficiência de duplicação, igual ao sucesso de fertilização, dividido pelo número de plantas tratadas dentro de cada germoplasma e tratamento.

[00159] Este exemplo demonstra que estes métodos eficazmente entregam agentes duplicados para plantar meristemas e aumentar a eficiência em relação aos métodos atuais de duplicação em uma ampla gama de germoplasma de milho. Em certas modalidades, outros agentes de tratamento de plantas podem ser entregues a uma vasta gama de tecidos alternativos em germoplasma de milho adicionais e em outras espécies que não o milho. Sempre que a entrega de um agente químico de um tecido de planta específico é desejada, especialmente se o tecido é difícil de alcançar, pois é interna ou coberta e/ou protegida por outros tecidos, como um meristema do broto, estes métodos vão fornecer mais sucesso do que aqueles que utilizam métodos atuais.

[00160] A colchicina é tóxica, de modo que um mergulho de 10 minutos foi escolhido para a etapa de contato neste exemplo, e revelou uma diferença dramática na DE. Entende-se que, dependendo da idade das plantas, a velocidade de centrifugação, concentração de colchicina, e/ou outros parâmetros, etapas que compreendem o contato de duração mais longo ou mais curto pode ser otimizado para alcançar os resultados desejados sob outras condições.

Exemplo 2 A centrifugação não submersa individual com o agente para tratamento de plantas Colchicina melhora com sucesso a Eficiência de Duplicação.

[00161] Sementes de 5 linhas de milho de haploides derivados de diferentes F1 híbridos comerciais foram aleatoriamente selecionados e germinados em uma estufa. As mudas resultantes foram removidas a partir do solo ou meios de crescimento na fase de crescimento V1-V2 e o solo ou meios de crescimento das plantas enxaguadas com água. Uma amostra de várias mudas aleatórias dentro de cada linha haploide foi colocada num recipiente de amostra de centrífuga sem ter em conta a forma como o eixo de broto-raiz das plantas seria orientado em relação à força de aceleração gerada durante a centrifugação planejada. Em seguida, uma solução de tratamento de planta compreendendo 1000 ppm de colchicina foi vertida para dentro do recipiente de tal modo que a solução submersa de cada planta SAM, e, em seguida, a amostra centrifugada a 50 g durante 10 min com as SAMs submersas no agente para tratamento de plantas.

[00162] Após centrifugação, as plantas foram removidas, enxaguadas com água para remover qualquer solução restante de colchicina, e, em seguida, recuperadas e tendiam em uma de estufa luz, umidade, e temperatura controladas durante vários dias antes de serem transplantadas para uma estufa de viveiro.

[00163] A amostra de controle não recebeu nenhuma exposição de centrifugação ou colchicina, mas foi de outra forma tratada de forma idêntica como a amostra de tratamento. Durante o subsequente crescimento das plantas, a sobrevivência inicial, a polinização de sucesso, sucesso de fertilização e eficiência de duplicação (DE) foram determinadas em cada amostra.

[00164] Cada linha pura submetida a entrar em contato com o agente para tratamento de plantas durante a centrifugação mostrou grandes melhorias na polinização sucesso, o sucesso da fertilização, e DE quando comparados com os controles não tratados correspondentes (Tabela 2). A média global DE melhorou em 25% nas amostras centrifugadas com apenas uma queda de 15% na sobrevivência inicial, em comparação com os respectivos controles. Verificou-se também que, para cada amostra, a sobrevivência inicial igualou a sobrevivência final e que ao mesmo tempo, pelo menos, 25% de todos os indivíduos nas amostras puras receberam o tratamento experimental produzido por pólen e sedas, 3 dessas mesmas 5 linhagens tinha um sucesso de polinização de 0% quando eles receberam o tratamento controle.TABELA 2. Resultados de submeter diversos genótipos haploides a uma única centrifugação submersa. Sucessos de polinização são o número de plantas que produziam sedas e pólen e por isso poderiam ser autopolinizados; Sucessos de Fertilização são os números de plantas de duplo haploides tratados que produziram uma espiga com, pelo menos, uma semente. DE é a eficiência de duplicação, igual ao sucesso de fertilização, dividido pelo número de plantas tratadas dentro de cada germoplasma e tratamento.

[00165] Estes dados revelam que um único tratamento de centrifugação submerso proporcionam eficazmente os agentes de tratamento de plantas para os tecidos das plantas. Neste caso, um agente de duplicação foi efetivamente entregue aos meristemas de plantas haploides com o efeito de melhorar drasticamente a duplicação da eficácia destas plantas com muito pouco impacto sobre a sobrevivência das plantas.Exemplo 3. Um Tratamento de Centrifugação Serial com Sucesso Melhora a Eficiência de Duplicação.

[00166] Sementes de 5 linhas de milho de haploides derivados de diferentes F1 híbridos foram aleatoriamente selecionados e germinados em uma estufa. As mudas resultantes foram removidas a partir do solo ou meios de crescimento na fase de crescimento V1-V3 e o solo ou meios de crescimento das plantas enxaguadas com água. As mudas foram então alinhadas e montadas juntamente com vários talos em um PCS empacotados semelhante ao que é mostrado na Figura 9 e uma solução de tratamento de planta compreendendo 1000 ppm de colchicina foi vertida para dentro do recipiente de tal modo que a solução foi submersa ao SAM de cada planta e, em seguida, a totalidade da amostra foi centrifugada a 50 g durante 3 minutos, enquanto se manteve o SAM submerso no agente para tratamento de plantas.

[00167] Após a centrifugação em primeiro lugar, a solução de tratamento das plantas foi decantada e as mudas submetidas a uma centrifugação não submersa a 335 g durante 3 min. Durante a segunda centrifugação, o PCS e as mudas foram alinhadas de tal modo que SAM de cada planta não entre em contato com o agente de tratamento de reserva durante a aplicação da força centrífuga.

[00168] Após a segunda centrifugação, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e enxaguadas com água para remover qualquer solução restante de colchicina, e, em seguida, recuperadas e tendiam em uma estufa de luz, umidade e temperatura controlada por vários dias antes de ser transplantada para uma estufa de sementeira.

[00169] A amostra de controle não recebeu qualquer exposição de colchicina, mas foi de outro modo manuseado identicamente como as amostras experimentais. Durante o subsequente crescimento das plantas, a sobrevivência inicial, a polinização de sucesso, sucesso de fertilização, sobrevivência final, e eficiência de duplicação foi determinada em cada amostra, como descrito no Exemplo 2.

[00170] Todos os cinco genótipos submetidos à centrifugação de série mostraram sucesso de polinização significativamente melhor, sucesso da fertilização, e eficiência de duplicação sem diminuição na sobrevivência inicial, em comparação com os controles não tratados correspondentes (Tabela 3). Para cada amostra, a sobrevivência inicial igualou a sobrevivência final. Observou-se um aumento de 67% na DE global entre as amostras que receberam o tratamento experimental, em comparação com os respectivos controles. Além disso, enquanto que pelo menos 62% de todos os indivíduos nas amostras puras recebem o tratamento experimental produziram pólen e sedas, 3 dessas mesmas 5 linhagens geraram sucesso polinização de 0% quando receberam o tratamento controle.TABELA 3. Resultados da submissão de diversos genótipos haploides a uma primeira centrifugação submersa seguida de uma segunda centrifugação não submersa. Sucessos de polinização são os números de plantas que produziam sedas e pólen e por isso poderiam ser autopolinizados; Sucessos de Fertilização são os números de plantas de duplo haploides tratados que produziram uma espiga com, pelo menos, uma semente. DE é a eficiência de duplicação, igual ao sucesso de fertilização, dividido pelo número de plantas tratadas dentro de cada germoplasma e tratamento.

[00171] Estes dados revelam que o tratamento de centrifugação emsérie eficazmente proporciona os agentes de tratamento de plantas para os tecidos das plantas. Neste caso, um agente de duplicação foi efetivamente entregue aos meristemas de plantas haploides com o efeito de melhorar drasticamente a duplicação da eficácia destas plantas com essencialmente nenhum impacto sobre a sobrevivência. Exemplo 4. Outros agentes de tratamento de plantas.

[00172] Para demonstrar a capacidade de centrifugação para ajudar a entrega de agentes de tratamento de uma planta para tecidos, o uniconazol regulador de crescimento (um inibidor de ácido giberélico), sob a forma da mistura comercial Sumagic® (0,055% uniconazol) foi misturado numa solução de tratamento de plantas e em contato com plantas sujeitas a centrifugação.

[00173] Três amostras de plantas de milho haploides derivadas de F1 na fase de crescimento V1-3 cada foram sujeitas a uma única centrifugação submersa a 50 g durante 10 min durante as quais as SAMs de cada planta permaneceram em contato com um agente de tratamento de reserva que compreende a) uma solução de tratamento de plantas sem Sumagic (o controle), b) uma solução de tratamento de plantas contendo um Sumagic adicional a 1% (vol: vol), ou c) uma solução de tratamento de plantas contendo 2% adicionais.

[00174] Após centrifugação, as plantas foram removidas, enxaguadas com água para remover qualquer agente para tratamento de plantas, e, em seguida, recuperadas e tendiam em uma de estufa luz, umidade, e temperatura controladas durante vários dias antes de serem transplantadas para uma estufa de viveiro. Depois de três semanas de crescimento, cada planta foi visualmente avaliada pela sua capacidade de sobreviver ao seu respectivo tratamento. A Figura 1 mostra os representantes exemplares de plantas recuperadas a partir de cada um dos três tratamentos.

[00175] A Figura 1 revela que as amostras centrifugadas quando em contato com Sumagic a 1% ou 2% eram mais curtas, apresentavam folhas maiores que eram de cor mais escura, exibiam talos mais espessas e exibiam mais biomassa radicular. Isto sugere não só a capacidade destes métodos para proporcionar a administração eficiente de agentes de tratamento de plantas diferentes dos agentes de duplicação para os tecidos de plantas, mas também que a adição de reguladores de crescimento na solução de tratamento pode melhorar a saúde das plantas.

Exemplo 5. As plantas exibem sobrevivência surpreendente nas Configurações do Campo

[00176] Mudas de milho haploides derivadas de um cruzamento entre o comercial 01DKD2 puro e o indutor KHI1 ou comercial 83IDI1 e KHI1 foram tratadas por centrifugação de centrifugação simples ou por centrifugação em série e recuperadas num ambiente controlado por luz, umidade e temperatura durante aproximadamente 15 horas. As plantas foram então transplantadas em um campo e tendiam por três semanas, após o qual as taxas de sobrevivência de plantas foram avaliadas (Tabela 5).TABELA 5. Taxas de sobrevivência de transplante de duas linhas haploides derivadas de linhagens após tratamentos de centrifugação de centrifugação única ou submersa em série, em combinação com três soluções de tratamento diferentes com diferentes concentrações de colchicina.

[00177] Tabela 5 revela que as linhas de milho haploides derivados de duas linhagens geneticamente divergentes demonstram as taxas de sobrevivência excelentes quando transplantadas para configurações de campo após o tratamento. A taxa de sobrevivência pós-transplante de 3 semanas da linha haploide foi superior a 80% independentemente da concentração de colchicina ou se foi aplicado uma segunda rotação. Exemplo 6. As plantas podem sobreviver a forças fortes da centrifugação seguidas pelo transplante de campo

[00178] Mudas haploides de várias populações de indução haploide derivadas de híbridos F1 diferentes foram cultivadas em estufa até o estágio V1-V2, em que foram removidas do solo, enxaguadas com água para remover o solo residual, divididas em duas amostras de igual número de plantas e, em seguida, cada amostra foi agrupada juntamente com vários talos em dois PCSs semelhantes aos mostrados na Figura 9. As plantas foram, em seguida, submetidas a uma centrifugação submersa a 50 g durante 3 minutos, enquanto o SAM permaneceu submerso no agente de tratamento.

[00179] Após a primeira centrifugação submersa, as mudas foram submetidas a uma centrifugação não submersa mais lenta e mais curta durante 3 min a 335 g e a outra amostra submetida a uma centrifugação mais rápida e mais submersa durante 10 min a 500 g.

[00180] A seguir à centrifugação, todas as mudas foram removidas do recipiente de centrifugação, lavadas com água para remover qualquer agente para tratamento de planta remanescente e, em seguida transplantadas para um campo de milho exterior, onde foram cultivadas em condições normais de cultivo de milho até que cresceram até maturidade e floresceram. As autopolinizações foram tentadas com cada planta que sobreviveu ao tratamento bem o suficiente para produzir pólen e sedas e durante o crescimento assegurando o número de grãos que se formaram em cada espiga e em cada planta foi registrado. As taxas de sobrevivência de todas as mudas submetidas ao mesmo tratamento foram combinadas em todas as germoplasmas e em média para produzir uma taxa de sobrevivência global dentro de cada tratamento. Da mesma forma, as eficiências de duplicação entre todas as germoplasmas foram combinadas e a média para obter um DE global dentro de cada tratamento.

[00181] A Tabela 6 revela que as plantas submetidas a ambos os tratamentos de centrifugação produziram boas taxas de sobrevivência e duplicação de eficiências após o transplante para um campo.TABELA 6. Taxas médias de sobrevivência e eficiências de duplicação entre endogâmicos de diversos germoplasmas sujeitos a um de dois diferentes tratamentos de centrifugação não- submersos como parte de um tratamento de centrifugação em série global.

[00182] Este exemplo demonstra que os utilizadores podem obter um excelente fornecimento de agentes de tratamento para tecidos alvo (como evidenciado pelos DEs elevados) e taxas de sobrevivência excelentes mesmo quando as plantas são transplantadas diretamente para o campo após o tratamento. Além disso, demonstra que o aumento substancial da duração e velocidade da centrifugação, em comparação com outros exemplos aqui apresentados, em que os tratamentos de centrifugação são tipicamente 3 min a 335 g, tem pouco efeito sobre as taxas de sobrevivência e eficiências de duplicação. Pretende-se assim que outras durações e tempos de centrifugação serão úteis entre uma ampla gama de parâmetros de centrifugação e métodos de recuperação de plantas pós-tratamento (por exemplo, transplante direto em campo vs. câmara de crescimento, etc.).

Exemplo 7. Administração de Agentes de Tratamento e Boa Sobrevivência É Possível Entre Uma Ampla Faixa De Estágios De Crescimento De Plantas.

[00183] Para demonstrar como estes métodos podem ser processados entre uma vasta gama de estágios de crescimento de plantas, as plantas haploides foram sujeitas a um tratamento de centrifugação em série idêntico compreendendo uma primeira centrifugação submersa seguida de uma segunda centrifugação não- submersa. Foram comparados três estágios de crescimento diferentes e os efeitos nos indicadores de sucesso relacionados com DH entre os três estágios de vida.

[00184] Mudas haploides derivadas de híbridos F1 derivadas da linhagem da fêmea 91DUQ1 ou da linhagem do macho 83IDI1 foram germinadas em solo numa estufa em condições de cultura de milho padrão. Para assegurar que as mudas mais antigas encaixassem no recipiente da amostra da centrífuga, e para garantir que todas as mudas receberam os mesmos tratamentos químicos, todas as mudas foram submetidas a um tratamento com solo de paclobutrazol a 1% (PBZ) aos 6 dias após o plantio, 10 ml por planta.

[00185] Esta população de mudas foi subdividida em 3 amostras, cada uma compreendendo várias dezenas de mudas. Metade das mudas em cada amostra foram obtidas a partir de 91DUQ1 e a outra metade derivada de 83IDI1. Uma primeira amostra foi removida do solo na fase de crescimento V1-V2 (1 semana após o plantio), uma segunda amostra retirada do solo no estágio V3-V4 (2 semanas após o plantio) e uma terceira amostra retirada do solo à fase de crescimento V4-V5 (3 semanas após o plantio).

[00186] Após a remoção do solo, as mudas de cada amostra foram enxaguadas em água para remover o solo residual, depois envolvidas num PCS juntamente com vários talos de madeira, semelhante à mostrada na Figura 9 e sujeitas a uma primeira centrifugação submersa em 1250 ppm de colchicina a 50 g durante 3 min.

[00187] Após a primeira centrifugação, submersa, a solução de tratamento de plantas foi decantada. As mudas, com algum agente residual agarrando-se às suas superfícies, foram devolvidas ao recipiente de centrífuga vazia e sujeitas a uma centrifugação não submersa a 335 g durante 3 min.

[00188] Após a segunda centrifugação, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e lavadas com água para remover qualquer solução de colchicina remanescente e depois recuperadas e tratadas numa estufa de luz, umidade e temperatura controlada durante vários dias antes de serem transplantadas para uma estufa do viveiro onde elas foram tratadas sob condições de cultivo de milho padrão até que elas cresceram até a maturidade e floresceu.

[00189] Autopolinizações foram tentadas com cada planta que sobreviveram ao tratamento de produzir pólen e sedas e durante o crescimento que se seguiu o sucesso da polinização, o sucesso de fertilização e eficiência de duplicação final foram determinados em cada amostra. Nesta experiência, a eficiência de duplicação dentro de cada amostra de estágio de crescimento foi calculada dividindo o número de plantas que produziram pelo menos uma espiga compreendendo pelo menos quatro amêndoas pelo número total de plantas tratadas.

[00190] Uma clara tendência na Fig. 4 é que as amostras tratadas nos estágios iniciais da vida tendem a exibir maior sucesso de polinização, sucesso de fertilização e eficiência de duplicação. No entanto, é de notar que os dados testemunham claramente a utilidade de utilizar estes métodos em plantas pelo menos através de V4-V5, uma vez que a amostra de estágio de crescimento aqui produziu boas pontuações nos três critérios avaliados. Particularmente encorajador é o fato de que a eficiência de duplicação deste grupo atingiu a média de quase 30%, com uma média de 36,7%, revelando que esses métodos podem ser usados para entregar agentes duplicativos também para plantas mais velhas, pelo menos tão altas quanto V6.

[00191] A Fig. 4 também sugere claramente que estes métodos podem ser utilizados para administrar agentes de duplicação para plantas muito mais jovens do que V1, uma vez que a amostra V1-V2 exibiu um DE de mais de 70%. Espera-se que esta tendência de entrega efetiva de agente a tecidos alvo em plantas jovens possa estender-se para tão cedo no ciclo de vida como o ponto quando a germinação começa pela primeira vez. Estes dados revelam também que estes métodos poderiam ser utilizados em plantas ainda mais jovens empregando métodos conhecidos na técnica para excisar embriões de sementes antes da germinação (por exemplo, resgate de embriões) ou empregando um método de penetração do revestimento de semente com um agente de tratamento para facilitar o contato entre uma planta não germinada e um agente de tratamento.

Exemplo 8. As plantas podem sobreviver a forças de centrifugação muito fortes

[00192] Mudas haploides derivadas de híbridos F1 derivados a partir de qualquer linhagem de milho fêmea 91DUQ1 ou linhagem de milho macho 83IDI1 foram germinadas em solo em uma estufa em condições de cultivo de milho convencionais e cresceu para o estágio de crescimento V1-V2 (1 semana após o plantio). As mudas foram então removidas do solo, lavadas para remover o solo residual e divididas em 5 amostras compreendendo várias dezenas de mudas cada.

[00193] As plantas de uma amostra foram agrupadas em conjunto, juntamente com vários talos de madeira, para um PCS semelhante ao mostrado na Figura 9. Esta amostra PCS empacotada foi colocada num recipiente de centrifugação, raízes primeiro. Cada planta das outras quatro amostras foi envolvida individualmente para um PCS compreendendo um talo com um revestimento de parafina e colocada num recipiente de centrífuga separado, uma montagem de planta-PCS por recipiente, semelhante à mostrada na Figura 7.

[00194] Uma vez ligado ao seu respectivo PCS e colocadas nos respectivos recipientes de centrifugação, uma solução compreendendo 1250 ppm de colchicina foi adicionada a cada recipiente, até que cada planta foi submersa pelo menos, até a SAM de cada planta ser submersa. Todas as amostras foram então centrifugadas, com as SAM submersas na solução de tratamento durante 3 min a 50 g.

[00195] Após a primeira centrifugação, a solução de tratamento foi drenada a partir de cada recipiente de centrifugação e, em seguida, cada amostra foi sujeita a uma centrifugação não suja durante 3 minutos a uma de seis taxas diferentes, variando de 340 g a 2000 g, como mostrado na Tabela 9.

[00196] Após a segunda centrifugação, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e lavadas com água para remover qualquer solução de colchicina remanescente e depois transplantadas para vasos de 25,4 cm (10 polegadas) e tendidas numa sala de crescimento sob condições de crescimento de milho padrão até que elas crescessem até à maturidade e florescessem.

[00197] As autopolinizações foram tentadas com cada planta que sobreviveu ao tratamento para produzir pólen e uma espiga, e o sucesso da polinização como determinado dentro de cada amostra.TABELA 7. Comparação de cinco diferentes tratamentos de velocidade de centrifugação nas amostras de plantas haploides. Sobrevivência inicial é a parte das plantas que sobreviveram à floração. Sucesso de Polinização é o número de plantas que produziram pólen e sedas e, portanto, poderia ser egoísta; O sucesso da fertilização é o número de plantas haploides tratadas com duplicação que produziram uma espiga com pelo menos uma semente. DE é a eficiência de duplicação, igual ao sucesso de fertilização, dividido pelo número de plantas tratadas dentro de cada germoplasma e tratamento.

[00198] A Tabela 7 revela que mesmo plantas centrifugadas a 2000 g durante 3 min exibiram excelentes taxas de sobrevivência. Também revela que foram obtidas excelentes taxas de duplicação e resultados consistentes quando as plantas foram individualmente suportadas por um PCS durante a centrifugação.

[00199] Assim, é razoável concluir que estes métodos irão ser úteis para velocidades superiores a 2000 g e que um utilizador poderia esperar para recuperar, pelo menos, algumas sementes DH1 utilizando uma ampla gama de taxas de centrifugação, incluindo, pelo menos, até 4000 ou 5000 g, ainda que as taxas mais elevadas de centrifugação ainda possam produzir resultados aceitáveis.

Exemplo 9. A Eficiência da Entrega do Agente para tratamento de plantas pode ser otimizada com incubações

[00200] Esta experiência demonstrou que uma etapa de incubação entre as centrifugações pode melhorar a entrega de agentes de tratamento de plantas.

[00201] Mudas haploides derivadas de híbridos F1 derivados a partir de qualquer linhagem de fêmea 91DUQ1 ou linhagem de macho 83IDI1 foram germinadas em solo em uma estufa em condições de cultivo de milho convencionais e cresceu para o estágio de crescimento V1 (1 semana após o plantio). Em seguida, as mudas foram removidas a partir do solo, enxaguada com água para remover o solo residual que formam as plantas, e, em seguida, dividida em 4 amostras que compreendem várias mudas de cada germoplasma por amostra.

[00202] Cada amostra foi então empacotada em um PCS compreendendo um embrulho de folha de alumínio e talos de madeira de apoio, semelhante ao mostrado na Fig. 9. Uma vez empacotado em um PCS, cada amostra foi contatada por uma solução de tratamento de planta compreendendo ou 600 ppm, ou 800 ppm de colchicina de tal modo que o SAM de cada planta foi inteiramente submerso, e, em seguida, cada amostra foi centrifugada a 100 g durante 3 min com as SAM submersas na reserva do agente de duplicação durante a centrifugação.

[00203] Após a centrifugação submersa, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e enquanto alguma solução de duplicação da primeira centrifugação permaneceu agarrada às plantas, as raízes e a metade inferior de cada talo foram lavadas em água para remover qualquer agente de duplicação a partir dessa extremidade da planta. Em seguida, cada amostra empacotada foi incubada num ambiente fechado e úmido para um dos quatro períodos de incubação listados na Tabela 8.

[00204] Seguindo cada período de incubação respectivo, as amostras empacotadas foram removidas do revestimento úmido e submetidas a uma centrifugação não-submersa a 340 g durante 3 min, em que a única solução de duplicação que contatou as plantas foi a que permaneceu nas plantas a partir da centrifugação submersa anterior, isto é, nenhuma solução de duplicação adicional foi adicionada às plantas após a primeira centrifugação.

[00205] Após a segunda centrifugação, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e lavadas com água para remover qualquer solução de colchicina remanescente e depois recuperadas e tratadas numa estufa de luz, umidade e temperatura controlada durante vários dias antes de serem transplantadas para uma estufa do viveiro onde elas foram tratadas sob condições de cultivo de milho padrão até que elas cresceram até a maturidade e floresceu.

[00206] As autopolinizações foram tentadas com cada planta que sobreviveu ao tratamento para produzir pólen e as eficiências de duplicação final foram determinadas dentro de cada tratamento. Nesta experiência, a eficiência de duplicação da amostra dentro de cada tratamento foi calculada através da divisão do número de plantas de cada amostra de tratamento que produziu, pelo menos, uma espiga que compreende, pelo menos, quatro núcleos pelo número total de plantas submetidas a esse conjunto de condições de tratamento.

[00207] Tabela 8 revela que foram obtidas boas eficiências de duplicação com períodos de incubação crescentes, mesmo a concentrações relativamente baixas do agente para tratamento de plantas.TABELA 8. Os efeitos na duplicação de eficiências de quatro combinações de tratamento diferentes compreendendo duas concentrações de agente para tratamento de plantas diferentes e dois períodos de incubação diferentes em plantas haploides. As plantas foram submetidas a uma primeira centrifugação submersa a uma concentração de agente para tratamento de plantas (colchicina) de 600 ou 800 ppm, seguindo um período de incubação de 3 min ou 3 horas, e depois submetidas a uma centrifugação não- submersa.

[00208] Tabela 8 revela que estes métodos são úteis entre uma vasta gama de concentrações de tratamento de plantas e períodos de incubação em que as plantas estão em contato com um agente para tratamento de plantas. Estes resultados são consistentes com a conclusão de que os períodos de incubação antes ou entre as etapas de centrifugação que podem melhorar o fornecimento de agentes de tratamento de plantas aos tecidos alvo. Em certas modalidades, um utilizador pode contatar uma planta com um agente para tratamento de plantas e depois adiar propositadamente uma centrifugação subsequente de modo a obter eficiências de duplicação melhoradas.

Exemplo 10. Uma Ampla Gama de Durações de Centrifugação é eficaz com esta Invenção.

[00209] As mudas de uma das duas linhagens geneticamente diversas endogâmicas (83IDI1 ou 91DUQ1) foram germinadas em estufa e removidas do solo ou meio de crescimento na fase de crescimento V1-V3 e lavadas com água para remover o solo residual. Todas as mudas foram então fixadas em PCS compreendendo bandagens e talos, como o mostrado na Figura 9, e submetida a uma rotação submersa em 50 g de uma solução de tratamento de líquidos compreendendo 1250 ppm de colchicina durante 3 min.

[00210] Após a primeira centrifugação submersa, a solução de tratamento de plantas foi decantada e as mudas empacotadas foram submetidas a uma centrifugação não submetida a 340 g durante 3 ou 180 min.

[00211] Após a segunda centrifugação, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e lavadas com água para remover qualquer solução de colchicina remanescente e depois recuperadas e tratadas numa estufa de luz, umidade e temperatura controlada durante uma semana, depois o número de plantas sobreviventes foram contadas para determinar a taxa de sobrevivência dentro de cada tratamento.TABELA 10. Taxas de sobrevivência de mudas de dois germoplasmas diferentes submetidas a centrifugações não submersas para duas durações diferentes.

[00212] Tabela 10 revela que os tempos de centrifugação podem ser dramaticamente aumentados sem diminuir as taxas de sobrevivência, mesmo entre diversos germoplasmas. Mesmo em rotações de 3 horas, este método produz uma excelente capacidade de sobrevivência. É assim claro que estes métodos são muito eficazes em amplas gamas de centrifugação, testemunhando a sua utilidade quando utilizados com durações de centrifugação para além das aqui diretamente testadas.

Claims

1. Método para administração de um agente de tratamento de plantas a uma célula de um tecido selecionado de uma planta de milho, sendo que a planta possui uma superfície, sendo que o tecido selecionado é localizado em, e/ou por baixo, de uma porção da superfície da planta, caracterizado pelo fato de compreende contatar da superfície da planta com uma solução que compreende o agente de tratamento de planta, incluindo o contato de tecidos vegetais que não sejam os tecidos selecionados, e aplicar uma força centrífuga na planta para o transporte da solução que compreende o agente de tratamento de plantas para o tecido selecionado, sendo que a planta é suportada dentro de um recipiente de centrifugação por um suporte de centrifugação da planta, de modo que o eixo raiz-parte aérea da planta esteja alinhado com a direção da força centrífuga durante a centrifugação, sendo que o suporte de centrifugação da planta compreende um suporte estrutural separado da parede ou paredes do recipiente de centrifugação, sendo que a planta germinou e sendo que a força centrífuga aplicada é de 340 g a 2.000 g, administrando desta forma o agente de tratamento de plantas à célula do tecido selecionado da planta.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, pelo menos, 5% da superfície da planta permanecem em contato com a solução que compreende o agente de tratamento de planta durante a aplicação da força centrífuga.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tecido selecionado é mantido em contato, pelo uso de o suporte para centrifugação da planta, com a solução que compreende o agente de tratamento de plantas que não é absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga durante pelo menos uma parte da aplicação da força centrífuga.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tecido selecionado é mantido separado, pelo uso do suporte de centrifugação da planta, do agente de tratamento da planta não absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga, durante pelo menos uma porção da aplicação da força centrífuga.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o agente de tratamento de plantas é um polinucletídeo.

6. Método para criação de uma planta de milho de duplo haploide, fornecendo um agente de duplicação dos cromossomos para uma célula do tecido do meristema do caule, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma planta mãe DH0 com uma solução que compreende o agente de duplicação dos cromossomos, incluindo contatar o tecido da planta diferente do tecido do meristema do caule, e a aplicar uma força centrífuga à planta-mãe DH0, sendo que a planta é suportada dentro de um recipiente de centrifugação por um suporte de centrifugação da planta, de modo que o eixo broto-raiz da planta esteja alinhado com a direção da força centrífuga durante a centrifugação, sendo que o suporte de centrifugação da planta compreende um suporte estrutural separado da parede ou paredes do recipiente de centrifugação, administrando assim uma solução que compreende o agente de duplicação de cromossomos à célula do tecido do meristema do caule, em que a planta de milho germinou, e sendo que a força centrífuga aplicada à planta é de 340 g a 2.000 g.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a eficiência da duplicação resultante da administração do agente de duplicação de cromossomos é aumentada em comparação com a administração do agente de duplicação de cromossomos para a célula do tecido do meristema do caule apenas colocando em contato a planta mãe DH0 com a solução que compreende o agente de duplicação de cromossomos sem aplicação da força centrífuga.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a força centrífuga aplicada é de 340 g a 500 g.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o tecido do meristema do caule é mantido em contato, por meio do uso do suporte de centrifugação de planta, com a solução que compreende o agente de duplicação de cromossomos que não é absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga, durante pelo menos uma parte da aplicação da força centrífuga.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o tecido do meristema de broto é mantido separado, pelo uso do suporte de centrifugação da planta, do agente duplicador de cromossomos não absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga, durante pelo menos uma porção da aplicação da força centrífuga.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que a planta de milho está na fase de crescimento vegetativo VE, V1, V2, V3, V4 ou V5.

12. Método para administração de um agente de tratamento de plantas a uma célula de um tecido de planta de milho selecionado, em que a planta possui uma superfície, em que o tecido está localizado na, e/ou sob, uma porção da planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) colocar em contato a superfície de uma planta com uma solução que compreende o agente de tratamento de plantas, em que a planta tenha germinado; (b) aplicar uma força centrífuga sobre a planta da etapa (a) em contato com a solução, sendo que a planta é suportada dentro de um contêiner de centrifugação por um suporte de centrifugação da planta, de modo que o eixo broto-raiz da planta esteja alinhado com a direção da força centrífuga durante a centrifugação, sendo que o suporte de centrifugação da planta compreende um suporte estrutural separado da parede ou paredes do recipiente de centrifugação, e sendo que a força centrífuga aplicada à planta é de 340 g a 2.000 g; (c) após a aplicação da força centrífuga na etapa (b), remover as plantas da força centrífuga e da solução de tratamento; e (d) aplicar uma força centrífuga subsequente sobre a planta submetida à força centrífuga na etapa (b), fornecendo, desta forma, o agente de tratamento de plantas ao tecido da planta.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tecido selecionado é mantido em contato, por meio do uso do suporte de centrifugação de planta, com a solução compreendendo o agente de tratamento de planta que não é absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga, durante pelo menos uma porção da aplicação da força centrífuga na etapa (b).

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tecido selecionado é mantido separado, pelo uso do suporte de centrifugação da planta, do agente de tratamento da planta não absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga, durante pelo menos uma porção da aplicação da força centrífuga na etapa (b).