BR112016013511B1

BR112016013511B1 - CUTINASE VARIANTS, COMPOSITION, POLYNUCLEOTIDES THAT CODE THEM, NUCLEIC ACID CONSTRUCTION, EXPRESSION VECTOR, HOST CELL, METHOD OF PRODUCING AND OBTAINING A CUTINASE VARIANT, POLYESTER MODIFICATION METHOD, CYCLIC OLIGOMER HYDROLYSIS METHOD POLY THOSE ( ETHYLENE TEREPHTHALATE) AND METHOD OF REDUCING THE PROPENSION TO FORMATION OF TISSUE LIMBS

Info

Publication number: BR112016013511B1
Application number: BR112016013511-3A
Authority: BR
Inventors: Ting Sun; Leonardo De Maria; Rakhi Saikia; Santhosh Mepadam Vasu
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2023-07-11

Abstract

VARIANTES DE CUTINASE, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEOS QUE AS CODIFICAM, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO E DE OBTENÇÃO DE UMA VARIANTE DE CUTINASE, MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE POLIÉSTER, MÉTODO DE HIDRÓLISE DE OLIGÔMEROS CÍCLICOS DE POLI (TEREFTALATO DE ETILENO) E MÉTODO DE REDUÇÃO DA PROPENSÃO À FORMAÇÃO DE BORBOTOS DE TECIDOS. A presente invenção refere-se a variantes com atividade de cutinase de uma cutinase genitora, compreendendo uma alteração de uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições: 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79, ou 5 de SEQ ID NO: 2, em que a alteração é uma substituição para as posições 181, 115, 161, 43, 55, 79, e 5, e uma deleção para as posições 1, 2 e 182, e em que a variante tem pelo menos 75%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam as variantes; construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de obtenção e métodos de produção das variantes. Também se refere a composições compreendendo a variante e a métodos de uso da variante.CUTINASE VARIANTS, COMPOSITION, POLYNUCLEOTIDES THAT CODE THEM, NUCLEIC ACID CONSTRUCTION, EXPRESSION VECTOR, HOST CELL, METHOD OF PRODUCING AND OBTAINING A CUTINASE VARIANT, POLYESTER MODIFICATION METHOD, CYCLIC OLIGOMER HYDROLYSIS METHOD POLY THOSE ( ETHYLENE TEREPHTHALATE) AND METHOD OF REDUCING THE PROPENSION TO FORMATION OF TISSUE LIMBS. The present invention relates to variants with cutinase activity of a parent cutinase, comprising a change of one or more (e.g., several) positions corresponding to positions: 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43 , 55, 79, or 5 of SEQ ID NO: 2, wherein the change is a substitution for positions 181, 115, 161, 43, 55, 79, and 5, and a deletion for positions 1, 2, and 182 , and wherein the variant has at least 75%, but less than 100%, sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2. The present invention also relates to polynucleotides encoding the variants; nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the polynucleotides; and methods of obtaining and methods of producing the variants. It also relates to compositions comprising the variant and methods of using the variant.

Description

Reference to a Sequence Listing

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é aqui incorporada por referência.[001] This application contains a Sequence Listing in computer-readable form, which is incorporated herein by reference.

Background of the Invention Invention Area

[002] A presente invenção refere-se a variantes de cutinase, polinucleotídeos que codificam as variantes, métodos de produção das variantes, e métodos de uso das variantes. Descrição da Técnica Relacionada[002] The present invention relates to cutinase variants, polynucleotides encoding the variants, methods of producing the variants, and methods of using the variants. Description of Related Technique

[003] As fibras de poli(tereftalato de etileno), abreviado como PET, representam a maior parte do poliéster usado pela indústria têxtil. As fibras são produzidas por, por exemplo, policondensação de ácido tereftálico e etilenoglicol, e estiramento das fibras a partir de uma massa fundida.[003] Polyethylene terephthalate fibers, abbreviated as PET, represent the majority of polyester used by the textile industry. Fibers are produced by, for example, polycondensation of terephthalic acid and ethylene glycol, and drawing the fibers from a melt.

[004] O poliéster tem certas vantagens importantes incluindo elevada resistência, toque macio, resistência ao estiramento, resistência às nódoas, lavabilidade em máquina, resistência às rugas e resistência à abrasão. No entanto, o poliéster não é tão ótimo em termos da sua hidrofobicidade, formação de borbotos, estática, capacidade corante, superfície inativa como um meio para adesão, ou seja, compostos intensificadores do amaciamento ou molhabilidade, falta de respirabilidade e elevado brilho ou aparência lustrosa indesejável.[004] Polyester has certain important advantages including high strength, soft touch, stretch resistance, stain resistance, machine washability, wrinkle resistance and abrasion resistance. However, polyester is not as optimal in terms of its hydrophobicity, pilling, statics, coloring ability, surface inactive as a medium for adhesion, i.e. softening or wettability enhancing compounds, lack of breathability and high gloss or appearance. undesirable glossy.

[005] Devido à sua resistência, os tecidos e/ou peças de roupa de poliéster estão sujeitos à formação de borbotos, e possivelmente os mais importantes processos de acabamento de roupas aplicados a materiais com feixes de fibras de poliéster são aqueles desenvolvidos para controle da formação de borbotos. Todos os materiais com feixe de fibras tendem a formar pequenas bolas ou "borbotos" de fibras emaranhadas na superfície do tecido, quando sujeitos a abrasão ligeira durante lavagem e uso. Se o tecido conter uma proporção substancial de fibras com elevada resistência à abrasão flexional, os borbotos podem ficar retidos na superfície do tecido em números suficientes para produzir um toque e aparência desagradáveis.[005] Due to their resistance, polyester fabrics and/or garments are subject to the formation of pilling, and possibly the most important clothing finishing processes applied to materials with polyester fiber bundles are those developed to control the pilling formation. All fiber bundle materials tend to form small balls or "pills" of tangled fibers on the surface of the fabric when subjected to light abrasion during washing and use. If the fabric contains a substantial proportion of fibers with high resistance to flexural abrasion, pilling may be retained on the surface of the fabric in sufficient numbers to produce an unpleasant feel and appearance.

[006] Outro problema com o poliéster é que, durante a síntese de PET, são formados oligômeros cíclicos ou lineares de poli(tereftalato de etileno), tais como ácido tereftálico- bis-2-benzoiloxi-etiléster (BETEB) e/ou tri(tereftalato de etileno) cíclico. Uma parte destes oligômeros é depositada na maquinaria e uma parte fica sobre as/nas fibras. Os oligômeros tendem a dar aos tecidos uma aparência acinzentada. Isto é devido aos depósitos de oligômeros na superfície do tecido, o que é particularmente visível após processos úmidos a elevada temperatura como tingimento a elevada temperatura. Os oligômeros podem ser removidos por tratamento alcalino severo, que resulta em uma perda significativa de material fibroso. A extração orgânica dos oligômeros é uma possibilidade técnica, mas não industrialmente praticável.[006] Another problem with polyester is that, during the synthesis of PET, cyclic or linear oligomers of poly(ethylene terephthalate) are formed, such as terephthalic acid-bis-2-benzoyloxy-ethylester (BETEB) and/or tri (ethylene terephthalate) cyclic. A part of these oligomers is deposited in the machinery and a part remains on the fibers. Oligomers tend to give tissues a grayish appearance. This is due to oligomer deposits on the fabric surface, which is particularly visible after high-temperature wet processes such as high-temperature dyeing. Oligomers can be removed by severe alkaline treatment, which results in a significant loss of fibrous material. Organic extraction of oligomers is a technical possibility, but not industrially feasible.

[007] A indústria tem feito grandes esforços para melhorar as características do poliéster, um destes sendo a aplicação de cutinases.[007] The industry has made great efforts to improve the characteristics of polyester, one of these being the application of cutinases.

[008] As cutinases são conhecidas de vários fungos, tal como uma cutinase de fungo filamentoso, por exemplo, nativa em uma cepa de Humicola ou Fusarium, especificamente H. insolens como, por exemplo, H. insolens cepa DSM1800 (US5827719), ou F. solani pisi. Foram divulgados métodos de redução da propensão à formação de borbotos em tecidos e/ou peças de roupa de poliéster usando uma enzima hidrolítica do éster dietílico do ácido tereftálico (enzima hidrolítica de ETE) e/ou uma enzima hidrolítica do éster dibenzílico de etilenoglicol (enzima hidrolítica de BEB) (WO99/001604), métodos de modificação do poliéster compreendendo tratar o poliéster com uma enzima poliesterase (WO2001/34899), e a hidrólise enzimática de oligômeros cíclicos de poli(tereftalato de etileno), que compreende sujeitar o oligômero cíclico à ação de uma ou mais hidrolases de éster carboxílico (WO97/27237).[008] Cutinases are known from various fungi, such as a filamentous fungal cutinase, for example, native in a strain of Humicola or Fusarium, specifically H. insolens such as, for example, H. insolens strain DSM1800 (US5827719), or F. solani pisi. Methods of reducing the propensity for pilling in polyester fabrics and/or garments using a terephthalic acid diethyl ester hydrolytic enzyme (ETE hydrolytic enzyme) and/or an ethylene glycol dibenzyl ester hydrolytic enzyme (ETE hydrolytic enzyme) have been disclosed. hydrolysis of BEB) (WO99/001604), methods of modifying the polyester comprising treating the polyester with a polyesterase enzyme (WO2001/34899), and the enzymatic hydrolysis of cyclic oligomers of poly(ethylene terephthalate), which comprises subjecting the cyclic oligomer to the action of one or more carboxylic ester hydrolases (WO97/27237).

[009] Variantes de cutinase foram descritas como no documento WO0192502, no qual variantes de H. insolens foram divulgadas para o tratamento de têxtil de poliéster.[009] Cutinase variants were described as in document WO0192502, in which H. insolens variants were disclosed for the treatment of polyester textile.

[010] No entanto, existe continuamente uma necessidade de benefício melhorado de tratamento enzimático de tecidos e/ou peças de roupa de poliéster, incluindo uma melhor eficácia das enzimas sobre os seus substratos. Portanto, seria desejável a identificação de tais enzimas com propriedades aprimoradas para uso em métodos de tratamento de tecidos.[010] However, there is continually a need for improved benefit from enzymatic treatment of polyester fabrics and/or garments, including improved effectiveness of enzymes on their substrates. Therefore, it would be desirable to identify such enzymes with improved properties for use in tissue treatment methods.

Summary of the Invention

[011] A presente invenção refere-se a variantes com atividade de cutinase de uma cutinase genitora, compreendendo uma alteração de uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições: 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79, ou 5 de SEQ ID NO: 2, em que a alteração é uma substituição para as posições 181, 115, 161, 43, 55, 79, e 5, e uma deleção para as posições 1, 2 e 182, e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[011] The present invention relates to variants with cutinase activity of a parent cutinase, comprising a change in one or more (e.g., several) positions corresponding to positions: 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79, or 5 of SEQ ID NO: 2, wherein the change is a substitution for positions 181, 115, 161, 43, 55, 79, and 5, and a deletion for positions 1, 2 and 182, and wherein the variant is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[012] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam as variantes; construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de obtenção e métodos de produção das variantes.[012] The present invention also relates to polynucleotides that encode the variants; nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the polynucleotides; and methods of obtaining and methods of producing the variants.

[013] A presente invenção se refere ainda a composições compreendendo a variante, e se refere a métodos de modificação do poliéster compreendendo o uso da variante; métodos de hidrólise de oligômeros cíclicos de poli(tereftalato de etileno) compreendendo o uso da variante; e métodos de redução da propensão à formação de borbotos de tecidos compreendendo ou consistindo de poliéster usando a variante.[013] The present invention further relates to compositions comprising the variant, and relates to methods of modifying polyester comprising the use of the variant; methods of hydrolysis of cyclic poly(ethylene terephthalate) oligomers comprising the use of the variant; and methods of reducing the pilling propensity of fabrics comprising or consisting of polyester using the variant.

Definitions

[014] Cutinase: O termo "Cutinase" significa uma enzima lipolítica com atividade de cutinase (EC3.1.1.74) que catalisa a reação: Cutina + H2O ■ Monômeros de cutina. Para propósitos da presente invenção, a atividade de cutinase é determinada como descrito no exemplo 3 usando o oligômero Ácido tereftálico-bis-2-benzoiloxi-etiléster (BETEB) como substrato. BETEB é um subproduto durante a síntese de PET e permanece geralmente no tecido ou peça de roupa durante a fabricação de têxteis. BETEB é produzido, por exemplo, por condensação de ácido tereftálico, ácido benzoico e etilenoglicol, que tem a mesma unidade de benzoiloxi-etiléster que o PET.[014] Cutinase: The term "Cutinase" means a lipolytic enzyme with cutinase activity (EC3.1.1.74) that catalyzes the reaction: Cutin + H2O ■ Cutin monomers. For purposes of the present invention, cutinase activity is determined as described in example 3 using the terephthalic acid-bis-2-benzoyloxy-ethylester (BETEB) oligomer as a substrate. BETEB is a by-product during PET synthesis and generally remains in the fabric or garment during textile manufacturing. BETEB is produced, for example, by condensation of terephthalic acid, benzoic acid and ethylene glycol, which has the same benzoyloxy-ethylester unit as PET.

[015] Em um aspecto, as variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade de cutinase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[015] In one aspect, the variants of the present invention have at least 20%, for example, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50% , at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 100 % cutinase activity of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[016] Em algumas formas de realização, a cutinase pode ser variantes compreendendo uma substituição e/ou uma deleção de um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, o número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 ou 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.[016] In some embodiments, the cutinase may be variants comprising a substitution and/or a deletion of one or more (e.g., several) amino acids of SEQ ID NO: 2. Preferably, the total number of substitutions, amino acid deletions and/or insertions of SEQ ID NO: 2 is 1 to 20, for example, 1 to 10 or 1 to 5, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.

[017] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.[017] Allelic variant: The term "allelic variant" means any one of two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic variation arises naturally through mutation, and can result in polymorphism within populations. Genetic mutations may be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode polypeptides having altered amino acid sequences. An allelic variant of a polypeptide is a polypeptide encoded by an allelic variant of a gene.

[018] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, encadeada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo encadeamento, antes de aparecer como mRNA maduro encadeado.[018] cDNA: The term "cDNA" means a DNA molecule that can be prepared by reverse transcription of a mature, stranded mRNA molecule obtained from a eukaryotic or prokaryotic cell. cDNA lacks intron sequences that may be present in the corresponding genomic DNA. The early primary RNA transcript is an mRNA precursor that is processed through a series of steps, including threading, before appearing as threaded mature mRNA.

[019] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma fase de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificadora pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma combinação destes.[019] Coding sequence: The term "coding sequence" means a polynucleotide, which directly specifies the amino acid sequence of a variant. The boundaries of the coding sequence are generally determined by an open reading frame, which begins with an initiation codon such as ATG, GTG, or TTG and ends with a termination codon such as TAA, TAG, or TGA. The coding sequence may be genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, or a combination of these.

[020] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (ou seja, do mesmo gene) ou estranha (ou seja, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica a variante ou nativas ou estranhas entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sequências de terminação da transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo que codifica uma variante.[020] Control sequences: The term "control sequences" means nucleic acid sequences necessary for expression of a polynucleotide encoding a variant of the present invention. Each control sequence can be native (i.e., from the same gene) or foreign (i.e., from a different gene) to the polynucleotide encoding the variant, or native or foreign to each other. Such control sequences include, but are not limited to, a leader, polyadenylation sequence, propeptide sequence, promoter, signal peptide sequence, and transcription terminator. At a minimum, control sequences include a promoter, and transcription and translation termination sequences. The control sequences can be provided with linkers for the purpose of introducing specific restriction sites, facilitating the binding of the control sequences to the coding region of the polynucleotide that encodes a variant.

[021] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução, e secreção.[021] Expression: The term "expression" includes any step involved in the production of a variant including, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.

[022] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.[022] Expression vector: The term "expression vector" means a linear or circular DNA molecule that comprises a polynucleotide that encodes a variant and is operably linked to control sequences that provide its expression.

[023] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo que tem um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de cutinase. Em um aspecto, um fragmento consiste em ou compreende pelo menos 172 resíduos de aminoácidos (p.ex., que correspondem aos aminoácidos 17 a 188 de SEQ ID NO: 2). Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 172 resíduos de aminoácidos (p.ex., os aminoácidos 17 a 188 de SEQ ID NO: 2) e pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.[023] Fragment: The term "fragment" means a polypeptide that has one or more (e.g., several) amino acids missing from the amino and/or carboxyl terminus of a mature polypeptide; wherein the fragment has cutinase activity. In one aspect, a fragment consists of or comprises at least 172 amino acid residues (e.g., corresponding to amino acids 17 to 188 of SEQ ID NO: 2). In one aspect, a fragment comprises at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96 %, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of amino acids of SEQ ID NO: 2. In one aspect, a fragment comprises at least 172 amino acid residues ( e.g., amino acids 17 to 188 of SEQ ID NO: 2) and at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of amino acids of SEQ ID NO: 2.

[024] Condições de elevada estringência: O termo "condições de elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos de Southern blot padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 65 °C.[024] High stringency conditions: The term "high stringency conditions" means, for probes at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms /mL of sheared and denatured salmon sperm DNA and 50% formamide, following standard Southern blot procedures for 12 to 24 hours. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 65°C.

[025] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou semelhantes com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.[025] Host cell: The term "host cell" means any type of cell that is susceptible to transformation, transfection, transduction, or the like with a nucleic acid construct or expression vector comprising a polynucleotide of the present invention. The term "host cell" encompasses any offspring of a parent cell that is not identical to the parent cell due to mutations that occur during replication.

[026] Propriedade melhorada: O termo "propriedade melhorada" significa uma característica associada a uma variante que seja aprimorada em comparação com o genitor. Tais propriedades aprimoradas incluem, mas não se limitam a, atividade específica, clivagem de substrato, especificidade do substrato, termoestabilidade, e menor propensão à formação de borbotos.[026] Improved property: The term "improved property" means a characteristic associated with a variant that is improved compared to the parent. Such improved properties include, but are not limited to, specific activity, substrate cleavage, substrate specificity, thermostability, and reduced propensity for pilling.

[027] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.[027] Isolated: The term "isolated" means a substance in a form or environment that does not occur in nature. Non-limiting examples of isolated substances include (1) any substance that does not occur naturally, (2) any substance including, but not limited to, any enzyme, variant, nucleic acid, protein, peptide or cofactor, which is at least partially removed of one or more or all of the naturally occurring constituents with which it is associated in nature; (3) any substance modified by man in relation to that substance found in nature; or (4) any substance modified by increasing the amount of the substance relative to other components with which it is naturally associated (e.g., multiple copies of a gene encoding the substance; use of a stronger promoter than the promoter naturally associated with the substance). gene that codes for the substance). An isolated substance may be present in a sample of fermentation broth.

[028] Condições de baixa estringência: O termo "condições de baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de Southern blot padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 50 °C.[028] Low stringency conditions: The term "low stringency conditions" means, for probes at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms /mL of sheared and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide, following standard Southern blot procedures for 12 to 24 hours. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 50°C.

[029] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-tradução, como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 1 a 194 de SEQ ID NO: 2, os aminoácidos -35 a -13 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal, e os aminoácidos -12 a -1 de SEQ ID NO: 2 são um pró-peptídeo. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (ou seja, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.[029] Mature polypeptide: The term "mature polypeptide" means a polypeptide in its final form after translation and any post-translational modifications, such as N-terminal processing, C-terminal truncation, glycosylation, phosphorylation, etc. In one aspect, the mature polypeptide consists of amino acids 1 to 194 of SEQ ID NO: 2, amino acids -35 to -13 of SEQ ID NO: 2 are a signal peptide, and amino acids -12 to -1 of SEQ ID NO: :2 are a propeptide. It is known in the art that a host cell can produce a mixture of two or more different mature polypeptides (i.e., with a different C-terminal and/or N-terminal amino acid) expressed by the same polynucleotide.

[030] Sequência codificadora do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de cutinase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro consiste dos nucleotídeos 106 até 687 de SEQ ID NO: 1. Os nucleotídeos 1 a 69 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Os nucleotídeos 70 a 105 de SEQ ID NO: 1 codificam um pró-peptídeo.[030] Mature polypeptide coding sequence: The term "mature polypeptide coding sequence" means a polynucleotide that encodes a mature polypeptide with cutinase activity. In one aspect, the mature polypeptide coding sequence consists of nucleotides 106 to 687 of SEQ ID NO: 1. Nucleotides 1 to 69 of SEQ ID NO: 1 encode a signal peptide. Nucleotides 70 to 105 of SEQ ID NO: 1 encode a propeptide.

[031] Condições de média estringência: O termo "condições de média estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de Southern blot padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 55 °C.[031] Medium stringency conditions: The term "medium stringency conditions" means, for probes at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms /mL of sheared and denatured salmon sperm DNA and 35% formamide, following standard Southern blot procedures for 12 to 24 hours. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 55°C.

[032] Condições de média-elevada estringência: O termo "condições de média-elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 60 °C.[032] Medium-high stringency conditions: The term "medium-high stringency conditions" means, for probes at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, SDS at 0.3 %, 200 micrograms/mL sheared and denatured salmon sperm DNA, and 35% formamide, following standard Southern blotting procedures for 12 to 24 hours. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 60°C.

[033] Mutante: O termo "mutante" significa um polinucleotídeo codificando uma variante.[033] Mutant: The term "mutant" means a polynucleotide encoding a variant.

[034] Constructo de ácido nucleico: O termo "construção de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.[034] Nucleic acid construct: The term "nucleic acid construct" means a nucleic acid molecule, single or double stranded, that is isolated from a naturally occurring gene or is modified to contain nucleic acid segments in a manner that it would not otherwise exist in nature or that it is synthetic, comprising one or more control sequences.

[035] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada relativamente à sequência codificante de um polinucleotídeo de modo que a sequência de controle dirige a expressão da sequência codificante.[035] Operationally linked: The term "operationally linked" means a configuration in which a control sequence is placed in an appropriate position relative to the coding sequence of a polynucleotide so that the control sequence directs the expression of the coding sequence.

[036] Genitor ou cutinase genitora: O termo "genitor" ou "cutinase genitora" significa uma cutinase na qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O genitor pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente (tipo selvagem) ou uma variante ou um fragmento deste.[036] Genitor or parental cutinase: The term "genitor" or "parent cutinase" means a cutinase in which a change is made to produce the enzyme variants of the present invention. The parent may be a naturally occurring polypeptide (wild type) or a variant or fragment thereof.

[037] Têxtil de Poliéster: "Poliéster" como usado aqui significa uma molécula polimérica linear contendo grupos éster dentro da cadeia que são derivados da condensação de um diácido com um diol ou da polimerização de ácidos de hidroxi. A presente invenção se aplica a poliésteres tanto alifáticos como aromáticos. No entanto, são particularmente preferenciais artigos de poliéster aromático que são usados para produzir fibra e resina e que compreendem um polímero de cadeia longa sinteticamente produzido compreendendo pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90% e o mais preferencialmente pelo menos 95%, em peso de um éster de um ácido carboxílico aromático substituído, tal como ácido tereftálico substituído ou hidroxibenzoato parassubstituído. Outros artigos de poliéster úteis incluem aqueles feitos de polímero em massa, fios, tecidos, filmes, resinas e pós. Os principais poliésteres em uso industrial incluem poli(tereftalato de etileno) (PET), tereftalato de tetrametileno (PTMT), poli(tereftalato de butileno) (PBT), poli(tereftalato de trimetileno) (PTT) e poli(naftalato de etileno) (PEN), poli(tereftalato de ciclo- hexanodimetileno) (CHDMT), poli(etileno-4-oxibenzoato), A- Tell, poliglicolídeo, PHBA e 2GN. No entanto, PET é o polímero linear produzido mais comum e é responsável por uma maioria do poliéster usado na indústria hoje.[037] Polyester Textile: "Polyester" as used here means a linear polymer molecule containing ester groups within the chain that are derived from the condensation of a diacid with a diol or the polymerization of hydroxy acids. The present invention applies to both aliphatic and aromatic polyesters. However, particularly preferred are aromatic polyester articles which are used to produce fiber and resin and which comprise a synthetically produced long-chain polymer comprising at least 85%, preferably at least 90% and most preferably at least 95%, by weight. of an ester of a substituted aromatic carboxylic acid, such as substituted terephthalic acid or parasubstituted hydroxybenzoate. Other useful polyester articles include those made from bulk polymers, yarns, fabrics, films, resins, and powders. The main polyesters in industrial use include poly(ethylene terephthalate) (PET), tetramethylene terephthalate (PTMT), poly(butylene terephthalate) (PBT), poly(trimethylene terephthalate) (PTT) and poly(ethylene naphthalate) (PEN), poly(cyclohexanedimethylene terephthalate) (CHDMT), poly(ethylene-4-oxybenzoate), A- Tell, polyglycolide, PHBA and 2GN. However, PET is the most commonly produced linear polymer and accounts for a majority of the polyester used in industry today.

[038] O têxtil de poliéster usado aqui se destina a incluir fibras, fios, tecidos e peças de roupa compreendendo poliéster. O fio ou tecido ou peça de roupa de poliéster pode ser qualquer fio ou tecido ou peça de roupa que seja feito a partir de poli(tereftalato de etileno) puro, ou que seja feito a partir de misturas de fibras de poli(tereftalato de etileno) e qualquer outro material convencionalmente usado para a fabricação de têxteis.[038] The polyester textile used here is intended to include fibers, threads, fabrics and garments comprising polyester. Polyester yarn or fabric or garment may be any yarn or fabric or garment that is made from pure polyethylene terephthalate, or that is made from blends of polyethylene terephthalate fibers ) and any other material conventionally used for the manufacture of textiles.

[039] Em um aspecto, o tecido de poliéster é um tecido misto compreendendo pelo menos 5% (p/p) de poliéster, tal como pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de poliéster. Em um aspecto, o processo da invenção é aplicado a tecidos ou peças de roupa consistindo essencialmente em material de poliéster de poli(tereftalato de etileno), ou seja, material de poliéster de poli(tereftalato de etileno) puro.[039] In one aspect, the polyester fabric is a blended fabric comprising at least 5% (w/w) polyester, such as at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% of polyester. In one aspect, the process of the invention is applied to fabrics or garments consisting essentially of polyethylene terephthalate polyester material, that is, pure polyethylene terephthalate polyester material.

[040] Identidade da sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".[040] Sequence identity: The relationship between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the parameter "sequence identity".

[041] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade por extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)[041] For purposes of the present invention, sequence identity between two amino acid sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the program Needle from the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are open gap penalty of 10, gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 replacement matrix (EMBOSS version of BLOSUM62). The Needle result marked “longest identity” (obtained using the -nobrief option) is used as the percent identity and is calculated as follows: (Identical Residuals x 100)/(Alignment Length - Total Number of Gaps in Alignment )

[042] Para os fins da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), conforme é implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade por extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento).[042] For the purposes of the present invention, the sequence identity between two deoxyribonucleotide sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra), as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are open gap penalty of 10, gap extension penalty of 0.5, and the EDNAFULL substitution matrix (EMBOSS version of NCBI NUC4.4). The Needle result marked "longest identity" (obtained using the -nobrief option) is used as the percent identity and is calculated as follows: (Identical Deoxyribonucleotides x 100)/(Alignment Length - Total Number of Gaps in Alignment ).

[043] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo que tem um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento que tem atividade de cutinase. Em um aspecto, uma subsequência consiste em ou compreende pelo menos 516 nucleotídeos (p.ex., os nucleotídeos 154 a 669 de SEQ ID NO: 1). Em um aspecto, uma subsequência compreende pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 516 nucleotídeos (p.ex., os nucleotídeos 154 a 669 de SEQ ID NO: 1) e pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.[043] Subsequence: The term "subsequence" means a polynucleotide that has one or more (e.g., several) nucleotides missing from the 5' and/or 3' end of a mature polypeptide coding sequence; wherein the subsequence encodes a fragment that has cutinase activity. In one aspect, a subsequence consists of or comprises at least 516 nucleotides (e.g., nucleotides 154 to 669 of SEQ ID NO: 1). In one aspect, a subsequence comprises at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96 %, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of nucleotides of SEQ ID NO: 1. In one aspect, a fragment comprises at least 516 nucleotides (e.g., e.g., nucleotides 154 to 669 of SEQ ID NO: 1) and at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94% , at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of nucleotides of SEQ ID NO: 1.

[044] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade de cutinase compreendendo uma alteração, ou seja, uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa uma substituição do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido que ocupa uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade de cutinase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[044] Variant: The term "variant" means a polypeptide that has cutinase activity comprising a change, that is, a substitution, insertion, and/or deletion, in one or more (e.g., several) positions. A substitution means a replacement of the amino acid occupying a position with a different amino acid; a deletion means the removal of the amino acid that occupies a position; and an insertion means the addition of an amino acid adjacent to and immediately following the amino acid occupying a position. Variants of the present invention have at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75% , at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 100% of the cutinase activity of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[045] Condições de muito elevada estringência: O termo "condições de muito elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos de Southern blot padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 70 °C.[045] Very high stringency conditions: The term "very high stringency conditions" means, for probes at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/mL of sheared and denatured salmon sperm DNA and 50% formamide, following standard Southern blot procedures for 12 to 24 hours. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 70°C.

[046] Condições de muito baixa estringência: O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de Southern blot padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 45 °C.[046] Very low stringency conditions: The term "very low stringency conditions" means, for probes at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42 ° C in SSPE 5X, 0.3% SDS, 200 micrograms/mL sheared and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide, following standard Southern blot procedures for 12 to 24 hours. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 45°C.

[047] Cutinase de tipo selvagem: O termo cutinase de "tipo selvagem" significa uma cutinase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura, ou fungo filamentoso encontrado na natureza.[047] Wild-type cutinase: The term "wild-type" cutinase means a cutinase expressed by a naturally occurring microorganism, such as a bacterium, yeast, or filamentous fungus found in nature.

Conventions for Assigning Variants

[048] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro revelado na SEQ ID NO: 2 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra cutinase. A sequência de aminoácidos de outra cutinase é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2, e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade por extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).[048] For purposes of the present invention, the mature polypeptide disclosed in SEQ ID NO: 2 is used to determine the corresponding amino acid residue in another cutinase. The amino acid sequence of another cutinase is aligned with the mature polypeptide disclosed in SEQ ID NO: 2, and, based on the alignment, the amino acid position number corresponding to any amino acid residue in the mature polypeptide disclosed in SEQ ID NO: 2 is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al ., 2000, Trends Genet. 16: 276277), preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are open gap penalty of 10, gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 replacement matrix (EMBOSS version of BLOSUM62).

[049] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra cutinase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências polipeptídicas usando vários programas computacionais incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 30593066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.[049] The identification of the corresponding amino acid residue in another cutinase can be determined by an alignment of multiple polypeptide sequences using various computer programs including, but not limited to, MUSCLE (multiple sequence comparison by log expectation; version 3.5 or later; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (version 6.857 or later; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 30593066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), and EMBOSS EMMA employing ClustalW ( 1.83 or later; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), using their respective defining parameters.

[050] Quando a outra enzima tiver divergido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 tal que a comparação tradicional baseada em sequências não consiga detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequência par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa com base em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias (perfis) de polipeptídeos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI- BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. De modo similar, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.[050] When the other enzyme has diverged from the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 such that traditional sequence-based comparison cannot detect their relationship (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615 ), other pairwise sequence comparison algorithms can be used. Greater sensitivity in sequence-based searching can be achieved by using search programs that utilize probabilistic representations of polypeptide families (profiles) to search databases. For example, the PSI-BLAST program generates profiles through an iterative database search process and is capable of detecting remote homologues (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Even greater sensitivity can be achieved if the family or superfamily for the polypeptide has one or more representatives in protein structure databases. Programs such as GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) use information from a variety of sources (PSI-BLAST, secondary structure prediction, structural alignment profiles, and solvation potentials) as input to a neural network that predicts structural folding for a query sequence. Similarly, the method of Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, can be used to align a sequence of unknown structure with the superfamily models present in the SCOP database. These alignments can in turn be used to generate homology models for the polypeptide, and such models can be evaluated for accuracy using a variety of tools developed for this purpose.

[051] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567.[051] For proteins of known structure, several tools and resources are available to recover and generate structural alignments. For example, the SCOP protein superfamilies have been structurally aligned, and these alignments are accessible and downloadable. Two or more protein structures can be aligned using a variety of algorithms such as the distance alignment matrix (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) or combinatorial extension (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), and implementation of these algorithms may additionally be used to query structure databases with a structure of interest in order to discover possible structural homologues (e.g., Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567 .

[052] Ao descrever as variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura aceite de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC.[052] When describing the variants of the present invention, the nomenclature described below is adapted for ease of reference. The accepted IUPAC single-letter or three-letter amino acid abbreviation is used.

[053] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Em conformidade, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como "Thr226Ala" ou "T226A". Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" ou "G205R + S411F", representando substituições nas posições 205 e 411 da glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.[053] Substitutions. For an amino acid substitution the following nomenclature is used: Original amino acid, position, substituted amino acid. Accordingly, the substitution of threonine at position 226 with alanine is designated as "Thr226Ala" or "T226A". Multiple mutations are separated by plus signs ("+"), for example, "Gly205Arg + Ser411Phe" or "G205R + S411F", representing substitutions at positions 205 and 411 of glycine (G) for arginine (R) and serine (S ) by phenylalanine (F), respectively.

[054] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição*. Em conformidade, a deleção de glicina na posição 195 é designada como "Gly195*" ou "G195*". Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Gly195* + Ser411*" ou "G195* + S411*".[054] Deletions. For an amino acid deletion the following nomenclature is used: Original amino acid, position*. Accordingly, the glycine deletion at position 195 is designated as "Gly195*" or "G195*". Multiple deletions are separated by plus signs ("+"), for example, "Gly195* + Ser411*" or "G195* + S411*".

[055] Diferentes alterações. Quando alterações diferentes puderem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa as seguintes variantes: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly”, e “Tyr167Ala+Arg170Ala”.[055] Different changes. When different changes can be introduced at a position, the different changes are separated by a comma, for example, "Arg170Tyr,Glu" represents a substitution of arginine at position 170 with tyrosine or glutamic acid. Thus, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designates the following variants: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly”, and “Tyr167Ala+Arg170Ala”.

Detailed Description of the Invention Variants

[056] A presente invenção proporciona variantes com atividade de cutinase de uma cutinase genitora, compreendendo uma alteração de uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições: 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79, ou 5 de SEQ ID NO: 2, em que a alteração é uma substituição para as posições 181, 115, 161, 43, 55, 79, e 5, e uma deleção para as posições 1, 2 e 182, e em que a variante tem pelo menos 75%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[056] The present invention provides variants with cutinase activity of a parent cutinase, comprising a change in one or more (e.g., several) positions corresponding to positions: 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43 , 55, 79, or 5 of SEQ ID NO: 2, wherein the change is a substitution for positions 181, 115, 161, 43, 55, 79, and 5, and a deletion for positions 1, 2, and 182 , and wherein the variant has at least 75%, but less than 100%, sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[057] Em um aspecto, a variante tem identidade de sequência de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência de aminoácidos da cutinase genitora.[057] In one aspect, the variant has sequence identity of at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% but less than 100%, with the amino acid sequence of the parent cutinase.

[058] Em um aspecto, a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 1 a 194 de SEQ ID NO: 2.[058] In one aspect, the variant is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, such as at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% but less than 100%, sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 or amino acids 1 to 194 of SEQ ID NO: 2.

[059] Em um aspecto, o número de alterações nas variantes da presente invenção é 1-20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 alterações.[059] In one aspect, the number of changes in the variants of the present invention is 1-20, for example, 1 to 10 and 1 to 5, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 changes.

[060] Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em três posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em quatro posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em cinco posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em seis posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em sete posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em oito posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em nove posições correspondendo a qualquer uma das posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5. Em outro aspecto, uma variante compreende uma alteração em cada uma das posições correspondendo às posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 e 5.[060] In another aspect, a variant comprises a change in one or more (e.g., several) positions corresponding to positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another In another aspect, a variant comprises a change in two positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in three positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in four positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in five positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in six positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in seven positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in eight positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in nine positions corresponding to any of positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5. In another aspect, a variant comprises a change in each of the positions corresponding to positions 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79 and 5.

[061] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 181. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 181 está substituído por Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Pro. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição R181P do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[061] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution at a position corresponding to position 181. In another aspect, the amino acid at a position corresponding to position 181 is substituted by Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu , Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val, preferably Pro. In another aspect, the variant comprises or consists of the R181P substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[062] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma deleção em uma posição correspondendo à posição 182. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 182 está deletado. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na deleção G182* do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[062] In another aspect, the variant comprises or consists of a deletion in a position corresponding to position 182. In another aspect, the amino acid in a position corresponding to position 182 is deleted. In another aspect, the variant comprises or consists of the G182* deletion of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[063] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 115. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 115 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, ou Tyr, preferencialmente por Ile. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição V115I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[063] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution at a position corresponding to position 115. In another aspect, the amino acid at a position corresponding to position 115 is substituted by Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln , Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, or Tyr, preferably by Ile. In another aspect, the variant comprises or consists of the V115I substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[064] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 161. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição A161L está substituído por Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Leu. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição A161L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[064] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution at a position corresponding to position 161. In another aspect, the amino acid at a position corresponding to position A161L is substituted by Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu , Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val, preferably by Leu. In another aspect, the variant comprises or consists of the A161L substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[065] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma deleção em uma posição correspondendo à posição 1. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 1 está deletado. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na deleção Q1* do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[065] In another aspect, the variant comprises or consists of a deletion in a position corresponding to position 1. In another aspect, the amino acid in a position corresponding to position 1 is deleted. In another aspect, the variant comprises or consists of the Q1* deletion of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[066] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma deleção em uma posição correspondendo à posição 2. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 2 está deletado. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na deleção L2* do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[066] In another aspect, the variant comprises or consists of a deletion in a position corresponding to position 2. In another aspect, the amino acid in a position corresponding to position 2 is deleted. In another aspect, the variant comprises or consists of the L2* deletion of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[067] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 43. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 43 está substituído por Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Cys. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição A43C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[067] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution in a position corresponding to position 43. In another aspect, the amino acid in a position corresponding to position 43 is substituted by Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu , Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val, preferably by Cys. In another aspect, the variant comprises or consists of the A43C substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[068] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 55. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 55 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Cys. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição I55C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[068] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution at a position corresponding to position 55. In another aspect, the amino acid at a position corresponding to position 55 is substituted by Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln , Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val, preferably by Cys. In another aspect, the variant comprises or consists of the I55C substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[069] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 79. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 79 está substituído por Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Ala. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição N79A do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[069] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution at a position corresponding to position 79. In another aspect, the amino acid at a position corresponding to position 79 is substituted by Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu , Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val, preferably by Ala. In another aspect, the variant comprises or consists of the N79A substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[070] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 5. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 5 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Val. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[070] In another aspect, the variant comprises or consists of a substitution in a position corresponding to position 5. In another aspect, the amino acid in a position corresponding to position 5 is substituted by Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln , Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, or Val, preferably Val. In another aspect, the variant comprises or consists of the I5V substitution of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[071] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma alteração em posições correspondendo às posições 181+182, 181+115, 181+161, 181+1, 181+2, 181+43, 181+55, 181+79, 181+5, 182+115, 182+161, 182+1, 182+2, 182+43, 182+55, 182+79, 182+5, 115+161, 115+1, 115+2, 115+43, 115+55, 115+79, 115+5, 161+1, 161+2, 161+43, 161+55, 161+79, 161+5, 1+2, 1+43, 1+55, 1+79, 1+5, 2+43, 2+55, 2+79, 2+5, 43+55, 43+79,43+5, 55+79, 55+5, 79+5, tais como aquelas descritas acima.[071] In another aspect, the variant comprises or consists of a change in positions corresponding to positions 181+182, 181+115, 181+161, 181+1, 181+2, 181+43, 181+55, 181+ 79, 181+5, 182+115, 182+161, 182+1, 182+2, 182+43, 182+55, 182+79, 182+5, 115+161, 115+1, 115+2, 115+43, 115+55, 115+79, 115+5, 161+1, 161+2, 161+43, 161+55, 161+79, 161+5, 1+2, 1+43, 1+ 55, 1+79, 1+5, 2+43, 2+55, 2+79, 2+5, 43+55, 43+79,43+5, 55+79, 55+5, 79+5, such as those described above.

[072] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115, 181+182+161, 181+182+1, 181+182+2, 181+182+43, 181+182+55, 181+182+79, 181+182+5, 181+115+161, 181+115+1, 181+115+2, 181+115+43,181+115+55, 181+115+79, 181+115+5, 181+161+1, 181+161+2, 181+161+43, 181+161+55, 181+161+79, 181+161+5, 181+1+2, 181+1+43, 181+1+55, 181+1+79, 181+1+5, 181+2+43, 181+2+55, 181+2+79, 181+2+5, 181+43+55, 181+43+79, 181+43+5, 181+55+79, 181+55+5, 181+79+5, 182+115+161, 182+115+1, 182+115+2, 182+115+43, 182+115+55, 182+115+79, 182+115+5, 182+161+1, 182+161+2, 182+161+43, 182+161+55, 182+161+79, 182+161+5, 182+1+2, 182+1+43, 182+1+55, 182+1+79, 182+1+5, 182+2+43, 182+2+55, 182+2+79, 182+2+5, 182+43+55, 182+43+79, 182+43+5, 182+55+79, 182+55+5, 182+79+5, 115+161+1, 115+161+2, 115+161+43, 115+161+55, 115+161+79, 115+161+5, 115+1+2, 115+1+43, 115+1+55, 115+1+79, 115+1+5, 115+2+43, 115+2+55, 115+2+79, 115+2+5, 115+43+55, 115+43+79, 115+43+5, 115+55+79, 115+55+5, 115+79+5, 161+1+2, 161+1+43, 161+1+55, 161+1+79, 161+1+5, 161+2+43, 161+2+55, 161+2+79, 161+2+5, 161+43+55, 161+43+79, 161+43+5, 161+55+79, 161+55+5, 161+79+5, 1+2+43, 1+2+55, 1+2+79, 1+2+5, 1+43+55, 1+43+79, 1+43+5, 1+55+79, 1+55+5, 1+79+5, 2+43+55, 2+43+79, 2+43+5, 2+55+79, 2+55+5, 2+79+5, 43+55+79, 43+55+5, 43+79+5, 55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[072] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115, 181+182+161, 181+182+1, 181+182+2, 181+182+43, 181 +182+55, 181+182+79, 181+182+5, 181+115+161, 181+115+1, 181+115+2, 181+115+43, 181+115+55, 181+115+79 , 181+115+5, 181+161+1, 181+161+2, 181+161+43, 181+161+55, 181+161+79, 181+161+5, 181+1+2, 181 +1+43, 181+1+55, 181+1+79, 181+1+5, 181+2+43, 181+2+55, 181+2+79, 181+2+5, 181+43 +55, 181+43+79, 181+43+5, 181+55+79, 181+55+5, 181+79+5, 182+115+161, 182+115+1, 182+115+2 , 182+115+43, 182+115+55, 182+115+79, 182+115+5, 182+161+1, 182+161+2, 182+161+43, 182+161+55, 182 +161+79, 182+161+5, 182+1+2, 182+1+43, 182+1+55, 182+1+79, 182+1+5, 182+2+43, 182+2 +55, 182+2+79, 182+2+5, 182+43+55, 182+43+79, 182+43+5, 182+55+79, 182+55+5, 182+79+5 , 115+161+1, 115+161+2, 115+161+43, 115+161+55, 115+161+79, 115+161+5, 115+1+2, 115+1+43, 115 +1+55, 115+1+79, 115+1+5, 115+2+43, 115+2+55, 115+2+79, 115+2+5, 115+43+55, 115+43 +79, 115+43+5, 115+55+79, 115+55+5, 115+79+5, 161+1+2, 161+1+43, 161+1+55, 161+1+79 , 161+1+5, 161+2+43, 161+2+55, 161+2+79, 161+2+5, 161+43+55, 161+43+79, 161+43+5, 161 +55+79, 161+55+5, 161+79+5, 1+2+43, 1+2+55, 1+2+79, 1+2+5, 1+43+55, 1+43 +79, 1+43+5, 1+55+79, 1+55+5, 1+79+5, 2+43+55, 2+43+79, 2+43+5, 2+55+79 , 2+55+5, 2+79+5, 43+55+79, 43+55+5, 43+79+5, 55+79+5, such as those described above.

[073] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161, 181+182+115+1, 181+182+115+2, 181+182+115+43, 181+182+115+55, 181+182+115+79, 181+182+115+5, 181+182+161+1, 181+182+161+2, 181+182+161+43, 181+182+161+55, 181+182+161+79, 181+182+161+5, 181+182+1+2, 181+182+1+43, 181+182+1+55, 181+182+1+79, 181+182+1+5, 181+182+2+43, 181+182+2+55, 181+182+2+79, 181+182+2+5, 181+182+43+55, 181+182+43+79, 181+182+43+5, 181+182+55+79, 181+182+55+5, 181+182+79+5, 181+115+161+1, 181+115+161+2, 181+115+161+43, 181+115+161+55, 181+115+161+79, 181+115+161+5, 181+115+1+2, 181+115+1+43, 181+115+1+55, 181+115+1+79, 181+115+1+5, 181+115+2+43, 181+115+2+55, 181+115+2+79, 181+115+2+5, 181+115+43+55, 181+115+43+79, 181+115+43+5, 181+115+55+79, 181+115+55+5, 181+115+79+5, 181+161+1+2, 181+161+1+43, 181+161+1+55, 181+161+1+79, 181+161+1+5, 181+161+2+43, 181+161+2+55, 181+161+2+79, 181+161+2+5, 181+161+43+55, 181+161+43+79, 181+161+43+5, 181+161+55+79, 181+161+55+5, 181+161+79+5, 181+1+2+43, 181+1+2+55, 181+1+2+79, 181+1+2+5, 181+1+43+55, 181+1+43+79, 181+1+43+5, 181+1+55+79, 181+1+55+5, 181+1+79+5, 181+2+43+55, 181+2+43+79, 181+2+43+5, 181+2+55+79, 181+2+55+5, 181+2+79+5, 181+43+55+79, 181+43+55+5, 181+43+79+5, 181+55+79+5, 182+115+161+1, 182+115+161+2, 182+115+161+43, 182+115+161+55, 182+115+161+79, 182+115+161+5, 182+115+1+2, 182+115+1+43, 182+115+1+55, 182+115+1+79, 182+115+1+5, 182+115+2+43, 182+115+2+55, 182+115+2+79, 182+115+2+5, 182+115+43+55, 182+115+43+79, 182+115+43+5, 182+115+55+79, 182+115+55+5, 182+115+79+5, 182+161+1+2, 182+161+1+43, 182+161+1+55, 182+161+1+79, 182+161+1+5, 182+161+2+43, 182+161+2+55, 182+161+2+79, 182+161+2+5, 182+161+43+55, 182+161+43+79, 182+161+43+5, 182+161+55+79, 182+161+55+5, 182+161+79+5, 182+1+2+43, 182+1+2+55, 182+1+2+79, 182+1+2+5, 182+1+43+55, 182+1+43+79, 182+1+43+5, 182+1+55+79, 182+1+55+5, 182+1+79+5, 182+2+43+55, 182+2+43+79, 182+2+43+5, 182+2+55+79, 182+2+55+5, 182+2+79+5, 182+43+55+79, 182+43+55+5, 182+43+79+5, 182+55+79+5, 115+161+1+2, 115+161+1+43, 115+161+1+55, 115+161+1+79, 115+161+1+5, 115+161+2+43, 115+161+2+55, 115+161+2+79, 115+161+2+5, 115+161+43+55, 115+161+43+79, 115+161+43+5, 115+161+55+79, 115+161+55+5, 115+161+79+5, 115+1+2+43, 115+1+2+55, 115+1+2+79, 115+1+2+5, 115+1+43+55, 115+1+43+79, 115+1+43+5, 115+1+55+79, 115+1+55+5, 115+1+79+5, 115+2+43+55, 115+2+43+79, 115+2+43+5, 115+2+55+79, 115+2+55+5, 115+2+79+5, 115+43+55+79, 115+43+55+5, 115+43+79+5, 115+55+79+5, 161+1+2+43, 161+1+2+55, 161+1+2+79, 161+1+2+5, 161+1+43+55, 161+1+43+79, 161+1+43+5, 161+1+55+79, 161+1+55+5, 161+1+79+5, 161+2+43+55, 161+2+43+79, 161+2+43+5, 161+2+55+79, 161+2+55+5, 161+2+79+5, 161+43+55+79, 161+43+55+5, 161+43+79+5, 161+55+79+5, 1+2+43+55, 1+2+43+79, 1+2+43+5, 1+2+55+79, 1+2+55+5, 1+2+79+5, 1+43+55+79, 1+43+55+5, 1+43+79+5, 1+55+79+5, 2+43+55+79, 2+43+55+5, 2+43+79+5, 2+55+79+5, 43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[073] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161, 181+182+115+1, 181+182+115+2, 181+182+115+43 , 181+182+115+55, 181+182+115+79, 181+182+115+5, 181+182+161+1, 181+182+161+2, 181+182+161+43, 181 +182+161+55, 181+182+161+79, 181+182+161+5, 181+182+1+2, 181+182+1+43, 181+182+1+55, 181+182 +1+79, 181+182+1+5, 181+182+2+43, 181+182+2+55, 181+182+2+79, 181+182+2+5, 181+182+43 +55, 181+182+43+79, 181+182+43+5, 181+182+55+79, 181+182+55+5, 181+182+79+5, 181+115+161+1 , 181+115+161+2, 181+115+161+43, 181+115+161+55, 181+115+161+79, 181+115+161+5, 181+115+1+2, 181 +115+1+43, 181+115+1+55, 181+115+1+79, 181+115+1+5, 181+115+2+43, 181+115+2+55, 181+115 +2+79, 181+115+2+5, 181+115+43+55, 181+115+43+79, 181+115+43+5, 181+115+55+79, 181+115+55 +5, 181+115+79+5, 181+161+1+2, 181+161+1+43, 181+161+1+55, 181+161+1+79, 181+161+1+5 , 181+161+2+43, 181+161+2+55, 181+161+2+79, 181+161+2+5, 181+161+43+55, 181+161+43+79, 181 +161+43+5, 181+161+55+79, 181+161+55+5, 181+161+79+5, 181+1+2+43, 181+1+2+55, 181+1 +2+79, 181+1+2+5, 181+1+43+55, 181+1+43+79, 181+1+43+5, 181+1+55+79, 181+1+55 +5, 181+1+79+5, 181+2+43+55, 181+2+43+79, 181+2+43+5, 181+2+55+79, 181+2+55+5 , 181+2+79+5, 181+43+55+79, 181+43+55+5, 181+43+79+5, 181+55+79+5, 182+115+161+1, 182 +115+161+2, 182+115+161+43, 182+115+161+55, 182+115+161+79, 182+115+161+5, 182+115+1+2, 182+115 +1+43, 182+115+1+55, 182+115+1+79, 182+115+1+5, 182+115+2+43, 182+115+2+55, 182+115+2 +79, 182+115+2+5, 182+115+43+55, 182+115+43+79, 182+115+43+5, 182+115+55+79, 182+115+55+5 , 182+115+79+5, 182+161+1+2, 182+161+1+43, 182+161+1+55, 182+161+1+79, 182+161+1+5, 182 +161+2+43, 182+161+2+55, 182+161+2+79, 182+161+2+5, 182+161+43+55, 182+161+43+79, 182+161 +43+5, 182+161+55+79, 182+161+55+5, 182+161+79+5, 182+1+2+43, 182+1+2+55, 182+1+2 +79, 182+1+2+5, 182+1+43+55, 182+1+43+79, 182+1+43+5, 182+1+55+79, 182+1+55+5 , 182+1+79+5, 182+2+43+55, 182+2+43+79, 182+2+43+5, 182+2+55+79, 182+2+55+5, 182 +2+79+5, 182+43+55+79, 182+43+55+5, 182+43+79+5, 182+55+79+5, 115+161+1+2, 115+161 +1+43, 115+161+1+55, 115+161+1+79, 115+161+1+5, 115+161+2+43, 115+161+2+55, 115+161+2 +79, 115+161+2+5, 115+161+43+55, 115+161+43+79, 115+161+43+5, 115+161+55+79, 115+161+55+5 , 115+161+79+5, 115+1+2+43, 115+1+2+55, 115+1+2+79, 115+1+2+5, 115+1+43+55, 115 +1+43+79, 115+1+43+5, 115+1+55+79, 115+1+55+5, 115+1+79+5, 115+2+43+55, 115+2 +43+79, 115+2+43+5, 115+2+55+79, 115+2+55+5, 115+2+79+5, 115+43+55+79, 115+43+55 +5, 115+43+79+5, 115+55+79+5, 161+1+2+43, 161+1+2+55, 161+1+2+79, 161+1+2+5 , 161+1+43+55, 161+1+43+79, 161+1+43+5, 161+1+55+79, 161+1+55+5, 161+1+79+5, 161 +2+43+55, 161+2+43+79, 161+2+43+5, 161+2+55+79, 161+2+55+5, 161+2+79+5, 161+43 +55+79, 161+43+55+5, 161+43+79+5, 161+55+79+5, 1+2+43+55, 1+2+43+79, 1+2+43 +5, 1+2+55+79, 1+2+55+5, 1+2+79+5, 1+43+55+79, 1+43+55+5, 1+43+79+5 , 1+55+79+5, 2+43+55+79, 2+43+55+5, 2+43+79+5, 2+55+79+5, 43+55+79+5, such like those described above.

[074] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161+1, 181+182+115+161+2, 181+182+115+161+43, 181+182+115+161+55, 181+182+115+161+79, 181+182+115+161+5, 181+182+115+1+2, 181+182+115+1+43, 181+182+115+1+55, 181+182+115+1+79, 181+182+115+1+5, 181+182+115+2+43, 181+182+115+2+55, 181+182+115+43+55, 181+182+115+55+79, 181+182+161+1+2, 181+182+161+1+79, 181+182+161+2+55, 181+182+161+43+55, 181+182+161+55+79, 181+182+1+2+43, 181+182+1+2+5, 181+182+1+43+5, 181+182+1+79+5, 181+182+2+43+5, 181+182+2+79+5, 181+182+43+79+5, 181+115+161+1+43, 181+115+161+1+5, 181+115+161+2+79, 181+115+161+43+79, 181+115+161+55+5, 181+115+1+2+55, 181+115+1+43+55, 181+115+1+55+79, 181+115+2+43+55, 181+115+2+55+79, 181+115+43+55+79, 181+115+55+79+5, 181+161+1+2+79, 181+161+1+43+79, 181+161+1+55+5, 181+161+2+43+79, 181+182+115+2+79, 181+182+115+43+79, 181+182+115+55+5, 181+182+161+1+43, 181+182+161+1+5, 181+182+161+2+79, 181+182+161+43+79, 181+182+161+55+5, 181+182+1+2+55, 181+182+1+43+55, 181+182+1+55+79, 181+182+2+43+55, 181+182+2+55+79, 181+182+43+55+79, 181+182+55+79+5, 181+115+161+1+55, 181+115+161+2+43, 181+115+161+2+5, 181+115+161+43+5, 181+115+161+79+5, 181+115+1+2+79, 181+115+1+43+79, 181+115+1+55+5, 181+115+2+43+79, 181+115+2+55+5, 181+115+43+55+5, 181+161+1+2+43, 181+161+1+2+5, 181+161+1+43+5, 181+161+1+79+5, 181+161+2+43+5, 181+182+115+2+5, 181+182+115+43+5, 181+182+115+79+5, 181+182+161+1+55, 181+182+161+2+43, 181+182+161+2+5, 181+182+161+43+5, 181+182+161+79+5, 181+182+1+2+79, 181+182+1+43+79, 181+182+1+55+5, 181+182+2+43+79, 181+182+2+55+5, 181+182+43+55+5, 181+115+161+1+2, 181+115+161+1+79, 181+115+161+2+55, 181+115+161+43+55, 181+115+161+55+79, 181+115+1+2+43, 181+115+1+2+5, 181+115+1+43+5, 181+115+1+79+5, 181+115+2+43+5, 181+115+2+79+5, 181+115+43+79+5, 181+161+1+2+55, 181+161+1+43+55, 181+161+1+55+79, 181+161+2+43+55, 181+161+2+55+79, 181+161+2+55+5, 181+161+2+79+5, 181+161+43+55+79, 181+161+43+55+5, 181+161+43+79+5, 181+161+55+79+5, 181+1+2+43+55, 181+1+2+43+79, 181+1+2+43+5, 181+1+2+55+79, 181+1+2+55+5, 181+1+2+79+5, 181+1+43+55+79, 181+1+43+55+5, 181+1+43+79+5, 181+1+55+79+5, 181+2+43+55+79, 181+2+43+55+5, 181+2+43+79+5, 181+2+55+79+5, 181+43+55+79+5, 182+115+161+1+2, 182+115+161+1+43, 182+115+161+1+55, 182+115+161+1+79, 182+115+161+1+5, 182+115+161+2+43, 182+115+161+2+55, 182+115+161+2+79, 182+115+161+2+5, 182+115+161+43+55, 182+115+161+43+79, 182+115+161+43+5, 182+115+161+55+79, 182+115+161+55+5, 182+115+161+79+5, 182+115+1+2+43, 182+115+1+2+55, 182+115+1+2+79, 182+115+1+2+5, 182+115+1+43+55, 182+115+1+43+79, 182+115+1+43+5, 182+115+1+55+79, 182+115+1+55+5, 182+115+1+79+5, 182+115+2+43+55, 182+115+2+43+79, 182+115+2+43+5, 182+115+2+55+79, 182+115+2+55+5, 182+115+2+79+5, 182+115+43+55+79, 182+115+43+55+5, 182+115+43+79+5, 182+115+55+79+5, 182+161+1+2+43, 182+161+1+2+55, 182+161+1+2+79, 182+161+1+2+5, 182+161+1+43+55, 182+161+1+43+79, 182+161+1+43+5, 182+161+1+55+79, 182+161+1+55+50, 182+161+1+79+5, 182+161+2+43+55, 182+161+2+43+79, 182+161+2+43+5, 182+161+2+55+79, 182+161+2+55+5, 182+161+2+79+5, 182+161+43+55+79, 182+161+43+55+5, 182+161+43+79+5, 182+161+55+79+5, 182+1+2+43+55, 182+1+2+43+79, 182+1+2+43+5, 182+1+2+55+79, 182+1+2+55+5, 182+1+2+79+5, 182+1+43+55+79, 182+1+43+55+5, 182+1+43+79+5, 182+1+55+79+5, 182+2+43+55+79, 182+2+43+55+5, 182+2+43+79+5, 182+2+55+79+5, 182+43+55+79+5, 115+161+1+2+43, 115+161+1+2+55, 115+161+1+2+79, 115+161+1+2+5, 115+161+1+43+55, 115+161+1+43+79, 115+161+1+43+5, 115+161+1+55+79, 115+161+1+55+5, 115+161+1+79+5, 115+161+2+43+55, 115+161+2+43+79, 115+161+2+43+5, 115+161+2+55+79, 115+161+2+55+5, 115+161+2+79+5, 115+161+43+55+79, 115+161+43+55+5, 115+161+43+79+5, 115+161+55+79+5, 115+1+2+43+55, 115+1+2+43+79, 115+1+2+43+5, 115+1+2+55+79, 115+1+2+55+5, 115+1+2+79+5, 115+1+43+55+79, 115+1+43+55+5, 115+1+43+79+5, 115+1+55+79+5, 115+2+43+55+79, 115+2+43+55+5, 115+2+43+79+5, 115+2+55+79+5, 115+43+55+79+5, 161+1+2+43+55, 161+1+2+43+79, 161+1+2+43+5, 161+1+2+55+79, 161+1+2+55+5, 161+1+2+79+5, 161+1+43+55+79, 161+1+43+55+5, 161+1+43+79+5, 161+1+55+79+5, 161+2+43+55+79, 161+2+43+55+5, 161+2+43+79+5, 161+2+55+79+5, 161+43+55+79+5, 1+2+43+55+79, 1+2+43+55+5, 1+2+43+79+5, 1+2+55+79+5, 1+43+55+79+5, 2+43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[074] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161+1, 181+182+115+161+2, 181+182+115+161+43, 181 +182+115+161+55, 181+182+115+161+79, 181+182+115+161+5, 181+182+115+1+2, 181+182+115+1+43, 181 +182+115+1+55, 181+182+115+1+79, 181+182+115+1+5, 181+182+115+2+43, 181+182+115+2+55, 181 +182+115+43+55, 181+182+115+55+79, 181+182+161+1+2, 181+182+161+1+79, 181+182+161+2+55, 181 +182+161+43+55, 181+182+161+55+79, 181+182+1+2+43, 181+182+1+2+5, 181+182+1+43+5, 181 +182+1+79+5, 181+182+2+43+5, 181+182+2+79+5, 181+182+43+79+5, 181+115+161+1+43, 181 +115+161+1+5, 181+115+161+2+79, 181+115+161+43+79, 181+115+161+55+5, 181+115+1+2+55, 181 +115+1+43+55, 181+115+1+55+79, 181+115+2+43+55, 181+115+2+55+79, 181+115+43+55+79, 181 +115+55+79+5, 181+161+1+2+79, 181+161+1+43+79, 181+161+1+55+5, 181+161+2+43+79, 181 +182+115+2+79, 181+182+115+43+79, 181+182+115+55+5, 181+182+161+1+43, 181+182+161+1+5, 181 +182+161+2+79, 181+182+161+43+79, 181+182+161+55+5, 181+182+1+2+55, 181+182+1+43+55, 181 +182+1+55+79, 181+182+2+43+55, 181+182+2+55+79, 181+182+43+55+79, 181+182+55+79+5, 181 +115+161+1+55, 181+115+161+2+43, 181+115+161+2+5, 181+115+161+43+5, 181+115+161+79+5, 181 +115+1+2+79, 181+115+1+43+79, 181+115+1+55+5, 181+115+2+43+79, 181+115+2+55+5, 181 +115+43+55+5, 181+161+1+2+43, 181+161+1+2+5, 181+161+1+43+5, 181+161+1+79+5, 181 +161+2+43+5, 181+182+115+2+5, 181+182+115+43+5, 181+182+115+79+5, 181+182+161+1+55, 181 +182+161+2+43, 181+182+161+2+5, 181+182+161+43+5, 181+182+161+79+5, 181+182+1+2+79, 181 +182+1+43+79, 181+182+1+55+5, 181+182+2+43+79, 181+182+2+55+5, 181+182+43+55+5, 181 +115+161+1+2, 181+115+161+1+79, 181+115+161+2+55, 181+115+161+43+55, 181+115+161+55+79, 181 +115+1+2+43, 181+115+1+2+5, 181+115+1+43+5, 181+115+1+79+5, 181+115+2+43+5, 181 +115+2+79+5, 181+115+43+79+5, 181+161+1+2+55, 181+161+1+43+55, 181+161+1+55+79, 181 +161+2+43+55, 181+161+2+55+79, 181+161+2+55+5, 181+161+2+79+5, 181+161+43+55+79, 181 +161+43+55+5, 181+161+43+79+5, 181+161+55+79+5, 181+1+2+43+55, 181+1+2+43+79, 181 +1+2+43+5, 181+1+2+55+79, 181+1+2+55+5, 181+1+2+79+5, 181+1+43+55+79, 181 +1+43+55+5, 181+1+43+79+5, 181+1+55+79+5, 181+2+43+55+79, 181+2+43+55+5, 181 +2+43+79+5, 181+2+55+79+5, 181+43+55+79+5, 182+115+161+1+2, 182+115+161+1+43, 182 +115+161+1+55, 182+115+161+1+79, 182+115+161+1+5, 182+115+161+2+43, 182+115+161+2+55, 182 +115+161+2+79, 182+115+161+2+5, 182+115+161+43+55, 182+115+161+43+79, 182+115+161+43+5, 182 +115+161+55+79, 182+115+161+55+5, 182+115+161+79+5, 182+115+1+2+43, 182+115+1+2+55, 182 +115+1+2+79, 182+115+1+2+5, 182+115+1+43+55, 182+115+1+43+79, 182+115+1+43+5, 182 +115+1+55+79, 182+115+1+55+5, 182+115+1+79+5, 182+115+2+43+55, 182+115+2+43+79, 182 +115+2+43+5, 182+115+2+55+79, 182+115+2+55+5, 182+115+2+79+5, 182+115+43+55+79, 182 +115+43+55+5, 182+115+43+79+5, 182+115+55+79+5, 182+161+1+2+43, 182+161+1+2+55, 182 +161+1+2+79, 182+161+1+2+5, 182+161+1+43+55, 182+161+1+43+79, 182+161+1+43+5, 182 +161+1+55+79, 182+161+1+55+50, 182+161+1+79+5, 182+161+2+43+55, 182+161+2+43+79, 182 +161+2+43+5, 182+161+2+55+79, 182+161+2+55+5, 182+161+2+79+5, 182+161+43+55+79, 182 +161+43+55+5, 182+161+43+79+5, 182+161+55+79+5, 182+1+2+43+55, 182+1+2+43+79, 182 +1+2+43+5, 182+1+2+55+79, 182+1+2+55+5, 182+1+2+79+5, 182+1+43+55+79, 182 +1+43+55+5, 182+1+43+79+5, 182+1+55+79+5, 182+2+43+55+79, 182+2+43+55+5, 182 +2+43+79+5, 182+2+55+79+5, 182+43+55+79+5, 115+161+1+2+43, 115+161+1+2+55, 115 +161+1+2+79, 115+161+1+2+5, 115+161+1+43+55, 115+161+1+43+79, 115+161+1+43+5, 115 +161+1+55+79, 115+161+1+55+5, 115+161+1+79+5, 115+161+2+43+55, 115+161+2+43+79, 115 +161+2+43+5, 115+161+2+55+79, 115+161+2+55+5, 115+161+2+79+5, 115+161+43+55+79, 115 +161+43+55+5, 115+161+43+79+5, 115+161+55+79+5, 115+1+2+43+55, 115+1+2+43+79, 115 +1+2+43+5, 115+1+2+55+79, 115+1+2+55+5, 115+1+2+79+5, 115+1+43+55+79, 115 +1+43+55+5, 115+1+43+79+5, 115+1+55+79+5, 115+2+43+55+79, 115+2+43+55+5, 115 +2+43+79+5, 115+2+55+79+5, 115+43+55+79+5, 161+1+2+43+55, 161+1+2+43+79, 161 +1+2+43+5, 161+1+2+55+79, 161+1+2+55+5, 161+1+2+79+5, 161+1+43+55+79, 161 +1+43+55+5, 161+1+43+79+5, 161+1+55+79+5, 161+2+43+55+79, 161+2+43+55+5, 161 +2+43+79+5, 161+2+55+79+5, 161+43+55+79+5, 1+2+43+55+79, 1+2+43+55+5, 1 +2+43+79+5, 1+2+55+79+5, 1+43+55+79+5, 2+43+55+79+5, such as those described above.

[075] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161+1+2, 181+182+115+161+1+43, 181+182+115+161+1+55, 181+182+115+161+1+79, 181+182+115+161+1+5, 181+182+115+161+2+43, 181+182+115+161+2+55, 181+182+115+161+2+79, 181+182+115+161+2+5, 181+182+115+161+43+55, 181+182+115+161+43+79, 181+182+115+161+43+5, 181+182+115+161+55+79, 181+182+115+161+55+5, 181+182+115+161+79+5, 181+182+115+1+2+43, 181+182+115+1+2+55, 181+182+115+1+2+79, 181+182+115+1+2+5, 181+182+115+1+43+55, 181+182+115+1+43+79, 181+182+115+1+43+5, 181+182+115+1+55+79, 181+182+115+1+55+5, 181+182+115+1+79+5, 181+182+115+2+43+55, 181+182+115+2+43+79, 181+182+115+2+43+5, 181+182+115+2+55+79, 181+182+115+2+55+5, 181+182+115+2+79+5, 181+182+115+43+55+79, 181+182+115+43+55+5, 181+182+115+43+79+5, 181+182+115+55+79+5, 181+182+161+1+2+43, 181+182+161+1+2+55, 181+182+161+1+2+79, 181+182+161+1+2+5, 181+182+161+1+43+55, 181+182+161+1+43+79, 181+182+161+1+43+5, 181+182+161+1+55+79, 181+182+161+1+55+5, 181+182+161+1+79+5, 181+182+161+2+43+55, 181+182+161+2+43+79, 181+182+161+2+43+5, 181+182+161+2+55+79, 181+182+161+2+55+5, 181+182+161+2+79+5, 181+182+161+43+55+79, 181+182+161+43+55+5, 181+182+161+43+79+5, 181+182+161+55+79+5, 181+182+1+2+43+55, 181+182+1+2+43+79, 181+182+1+2+43+5, 181+182+1+2+55+79, 181+182+1+2+55+5, 181+182+1+2+79+5, 181+182+1+43+55+79, 181+182+1+43+55+5, 181+182+1+43+79+5, 181+182+1+55+79+5, 181+182+2+43+55+79, 181+182+2+43+55+5, 181+182+2+43+79+5, 181+182+2+55+79+5, 181+182+43+55+79+5, 181+115+161+1+2+43, 181+115+161+1+2+55, 181+115+161+1+2+79, 181+115+161+1+2+5, 181+115+161+1+43+55, 181+115+161+1+43+79, 181+115+161+1+43+5, 181+115+161+1+55+79, 181+115+161+1+55+5, 181+115+161+1+79+5, 181+115+161+2+43+55, 181+115+161+2+43+79, 181+115+161+2+43+5, 181+115+161+2+55+79, 181+115+161+2+55+5, 181+115+161+2+79+5, 181+115+161+43+55+79, 181+115+161+43+55+5, 181+115+161+43+79+5, 181+115+161+55+79+5, 181+115+1+2+43+55, 181+115+1+2+43+79, 181+115+1+2+43+5, 181+115+1+2+55+79, 181+115+1+2+55+5, 181+115+1+2+79+5, 181+115+1+43+55+79, 181+115+1+43+55+5, 181+115+1+43+79+5, 181+115+1+55+79+5, 181+115+2+43+55+79, 181+115+2+43+55+5, 181+115+2+43+79+5, 181+115+2+55+79+5, 181+115+43+55+79+5, 181+161+1+2+43+55, 181+161+1+2+43+79, 181+161+1+2+43+5, 181+161+1+2+55+79, 181+161+1+2+55+5, 181+161+1+2+79+5, 181+161+1+43+55+79, 181+161+1+43+55+5, 181+161+1+43+79+5, 181+161+1+55+79+5, 181+161+2+43+55+79, 181+161+2+43+55+5, 181+161+2+43+79+5, 181+161+2+55+79+5, 181+161+43+55+79+5, 181+1+2+43+55+79, 181+1+2+43+55+5, 181+1+2+43+79+5, 181+1+2+55+79+5, 181+1+43+55+79+5, 181+2+43+55+79+5, 182+115+161+1+2+43, 182+115+161+1+2+55, 161+2+43+55+79+5, 1+2+43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[075] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161+1+2, 181+182+115+161+1+43, 181+182+115+161 +1+55, 181+182+115+161+1+79, 181+182+115+161+1+5, 181+182+115+161+2+43, 181+182+115+161+2 +55, 181+182+115+161+2+79, 181+182+115+161+2+5, 181+182+115+161+43+55, 181+182+115+161+43+79 , 181+182+115+161+43+5, 181+182+115+161+55+79, 181+182+115+161+55+5, 181+182+115+161+79+5, 181 +182+115+1+2+43, 181+182+115+1+2+55, 181+182+115+1+2+79, 181+182+115+1+2+5, 181+182 +115+1+43+55, 181+182+115+1+43+79, 181+182+115+1+43+5, 181+182+115+1+55+79, 181+182+115 +1+55+5, 181+182+115+1+79+5, 181+182+115+2+43+55, 181+182+115+2+43+79, 181+182+115+2 +43+5, 181+182+115+2+55+79, 181+182+115+2+55+5, 181+182+115+2+79+5, 181+182+115+43+55 +79, 181+182+115+43+55+5, 181+182+115+43+79+5, 181+182+115+55+79+5, 181+182+161+1+2+43 , 181+182+161+1+2+55, 181+182+161+1+2+79, 181+182+161+1+2+5, 181+182+161+1+43+55, 181 +182+161+1+43+79, 181+182+161+1+43+5, 181+182+161+1+55+79, 181+182+161+1+55+5, 181+182 +161+1+79+5, 181+182+161+2+43+55, 181+182+161+2+43+79, 181+182+161+2+43+5, 181+182+161 +2+55+79, 181+182+161+2+55+5, 181+182+161+2+79+5, 181+182+161+43+55+79, 181+182+161+43 +55+5, 181+182+161+43+79+5, 181+182+161+55+79+5, 181+182+1+2+43+55, 181+182+1+2+43 +79, 181+182+1+2+43+5, 181+182+1+2+55+79, 181+182+1+2+55+5, 181+182+1+2+79+5 , 181+182+1+43+55+79, 181+182+1+43+55+5, 181+182+1+43+79+5, 181+182+1+55+79+5, 181 +182+2+43+55+79, 181+182+2+43+55+5, 181+182+2+43+79+5, 181+182+2+55+79+5, 181+182 +43+55+79+5, 181+115+161+1+2+43, 181+115+161+1+2+55, 181+115+161+1+2+79, 181+115+161 +1+2+5, 181+115+161+1+43+55, 181+115+161+1+43+79, 181+115+161+1+43+5, 181+115+161+1 +55+79, 181+115+161+1+55+5, 181+115+161+1+79+5, 181+115+161+2+43+55, 181+115+161+2+43 +79, 181+115+161+2+43+5, 181+115+161+2+55+79, 181+115+161+2+55+5, 181+115+161+2+79+5 , 181+115+161+43+55+79, 181+115+161+43+55+5, 181+115+161+43+79+5, 181+115+161+55+79+5, 181 +115+1+2+43+55, 181+115+1+2+43+79, 181+115+1+2+43+5, 181+115+1+2+55+79, 181+115 +1+2+55+5, 181+115+1+2+79+5, 181+115+1+43+55+79, 181+115+1+43+55+5, 181+115+1 +43+79+5, 181+115+1+55+79+5, 181+115+2+43+55+79, 181+115+2+43+55+5, 181+115+2+43 +79+5, 181+115+2+55+79+5, 181+115+43+55+79+5, 181+161+1+2+43+55, 181+161+1+2+43 +79, 181+161+1+2+43+5, 181+161+1+2+55+79, 181+161+1+2+55+5, 181+161+1+2+79+5 , 181+161+1+43+55+79, 181+161+1+43+55+5, 181+161+1+43+79+5, 181+161+1+55+79+5, 181 +161+2+43+55+79, 181+161+2+43+55+5, 181+161+2+43+79+5, 181+161+2+55+79+5, 181+161 +43+55+79+5, 181+1+2+43+55+79, 181+1+2+43+55+5, 181+1+2+43+79+5, 181+1+2 +55+79+5, 181+1+43+55+79+5, 181+2+43+55+79+5, 182+115+161+1+2+43, 182+115+161+1 +2+55, 161+2+43+55+79+5, 1+2+43+55+79+5, such as those described above.

[076] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161+1+2+43, 181+182+115+161+1+2+55, 181+182+115+161+1+2+79, 181+182+115+161+1+2+5, 181+182+115+161+1+43+55, 181+182+115+161+1+43+79, 181+182+115+161+1+43+5, 181+182+115+161+1+55+79, 181+182+115+161+1+55+5, 181+182+115+161+1+79+5, 181+182+115+161+2+43+55, 181+182+115+161+2+43+79, 181+182+115+161+2+43+5, 181+182+115+161+2+55+79, 181+182+115+161+2+55+5, 181+182+115+161+2+79+5, 181+182+115+161+43+55+79, 181+182+115+161+43+55+5, 181+182+115+161+43+79+5, 181+182+115+161+55+79+5, 181+182+115+1+2+43+55, 181+182+115+1+2+43+79, 181+182+115+1+2+43+5, 181+182+115+1+2+55+79, 181+182+115+1+2+55+5, 181+182+115+1+2+79+5, 181+182+115+1+43+55+79, 181+182+115+1+43+55+5, 181+182+115+1+43+79+5, 181+182+115+1+55+79+5, 181+182+115+2+43+55+79, 181+182+115+2+43+55+5, 181+182+115+2+43+79+5, 181+182+115+2+55+79+5, 181+182+115+43+55+79+5, 181+182+161+1+2+43+55, 181+182+161+1+2+43+79, 181+182+161+1+2+43+5, 181+182+161+1+2+55+79, 181+182+161+1+2+55+5, 181+182+161+1+2+79+5, 181+182+161+1+43+55+79, 181+182+161+1+43+55+5, 181+182+161+1+43+79+5, 181+182+161+1+55+79+5, 181+182+161+2+43+55+79, 181+182+161+2+43+55+5, 181+182+161+2+43+79+5, 181+182+161+2+55+79+5, 181+182+161+43+55+79+5, 181+182+1+2+43+55+79, 181+182+1+2+43+55+5, 181+182+1+2+43+79+5, 181+182+1+2+55+79+5, 181+182+1+43+55+79+5, 181+182+2+43+55+79+5, 181+115+161+1+2+43+55, 181+115+161+1+2+43+79, 181+115+161+1+2+43+5, 181+115+161+1+2+55+79, 181+115+161+1+2+55+5, 181+115+161+1+2+79+5,181+115+161+1+43+55+79, 181+115+161+1+43+55+5, 181+115+161+1+43+79+5, 181+115+161+1+55+79+5, 181+115+161+2+43+55+79, 181+115+161+2+43+55+5, 181+115+161+2+43+79+5, 181+115+161+2+55+79+5, 181+115+161+43+55+79+5, 181+115+1+2+43+55+79, 181+115+1+2+43+55+5, 181+115+1+2+43+79+5, 181+115+1+2+55+79+5, 181+115+1+43+55+79+5, 181+115+2+43+55+79+5, 181+161+1+2+43+55+79, 181+161+1+2+43+55+5, 181+161+1+2+43+79+5, 181+161+1+2+55+79+5, 181+161+1+43+55+79+5, 181+161+2+43+55+79+5, 181+1+2+43+55+79+5, 182+115+161+1+2+43+55, 182+115+161+1+2+43+79, 182+115+161+1+2+43+5, 182+115+161+1+2+55+79, 182+115+161+1+2+55+5, 182+115+161+1+2+79+5, 182+115+161+1+43+55+79, 182+115+161+1+43+55+5, 182+115+161+1+43+79+5, 182+115+161+1+55+79+5, 182+115+161+2+43+55+79, 182+115+161+2+43+55+5, 182+115+161+2+43+79+5, 182+115+161+2+55+79+5, 182+115+161+43+55+79+5, 182+115+1+2+43+55+79, 182+115+1+2+43+55+5, 182+115+1+2+43+79+5, 182+115+1+2+55+79+5, 182+115+1+43+55+79+5, 182+115+2+43+55+79+5, 182+161+1+2+43+55+79, 182+161+1+2+43+55+5, 182+161+1+2+43+79+5, 182+161+1+2+55+79+5, 182+161+1+43+55+79+5, 182+161+2+43+55+79+5, 182+1+2+43+55+79+5, 115+161+1+2+43+55+79, 115+161+1+2+43+55+5, 115+161+1+2+43+79+5, 115+161+1+2+55+79+5, 115+161+1+43+55+79+5, 115+161+2+43+55+79+5, 115+1+2+43+55+79+5, 161+1+2+43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[076] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161+1+2+43, 181+182+115+161+1+2+55, 181+182 +115+161+1+2+79, 181+182+115+161+1+2+5, 181+182+115+161+1+43+55, 181+182+115+161+1+43 +79, 181+182+115+161+1+43+5, 181+182+115+161+1+55+79, 181+182+115+161+1+55+5, 181+182+115 +161+1+79+5, 181+182+115+161+2+43+55, 181+182+115+161+2+43+79, 181+182+115+161+2+43+5 , 181+182+115+161+2+55+79, 181+182+115+161+2+55+5, 181+182+115+161+2+79+5, 181+182+115+161 +43+55+79, 181+182+115+161+43+55+5, 181+182+115+161+43+79+5, 181+182+115+161+55+79+5, 181 +182+115+1+2+43+55, 181+182+115+1+2+43+79, 181+182+115+1+2+43+5, 181+182+115+1+2 +55+79, 181+182+115+1+2+55+5, 181+182+115+1+2+79+5, 181+182+115+1+43+55+79, 181+182 +115+1+43+55+5, 181+182+115+1+43+79+5, 181+182+115+1+55+79+5, 181+182+115+2+43+55 +79, 181+182+115+2+43+55+5, 181+182+115+2+43+79+5, 181+182+115+2+55+79+5, 181+182+115 +43+55+79+5, 181+182+161+1+2+43+55, 181+182+161+1+2+43+79, 181+182+161+1+2+43+5 , 181+182+161+1+2+55+79, 181+182+161+1+2+55+5, 181+182+161+1+2+79+5, 181+182+161+1 +43+55+79, 181+182+161+1+43+55+5, 181+182+161+1+43+79+5, 181+182+161+1+55+79+5, 181 +182+161+2+43+55+79, 181+182+161+2+43+55+5, 181+182+161+2+43+79+5, 181+182+161+2+55 +79+5, 181+182+161+43+55+79+5, 181+182+1+2+43+55+79, 181+182+1+2+43+55+5, 181+182 +1+2+43+79+5, 181+182+1+2+55+79+5, 181+182+1+43+55+79+5, 181+182+2+43+55+79 +5, 181+115+161+1+2+43+55, 181+115+161+1+2+43+79, 181+115+161+1+2+43+5, 181+115+161 +1+2+55+79, 181+115+161+1+2+55+5, 181+115+161+1+2+79+5,181+115+161+1+43+55+79, 181 +115+161+1+43+55+5, 181+115+161+1+43+79+5, 181+115+161+1+55+79+5, 181+115+161+2+43 +55+79, 181+115+161+2+43+55+5, 181+115+161+2+43+79+5, 181+115+161+2+55+79+5, 181+115 +161+43+55+79+5, 181+115+1+2+43+55+79, 181+115+1+2+43+55+5, 181+115+1+2+43+79 +5, 181+115+1+2+55+79+5, 181+115+1+43+55+79+5, 181+115+2+43+55+79+5, 181+161+1 +2+43+55+79, 181+161+1+2+43+55+5, 181+161+1+2+43+79+5, 181+161+1+2+55+79+5 , 181+161+1+43+55+79+5, 181+161+2+43+55+79+5, 181+1+2+43+55+79+5, 182+115+161+1 +2+43+55, 182+115+161+1+2+43+79, 182+115+161+1+2+43+5, 182+115+161+1+2+55+79, 182 +115+161+1+2+55+5, 182+115+161+1+2+79+5, 182+115+161+1+43+55+79, 182+115+161+1+43 +55+5, 182+115+161+1+43+79+5, 182+115+161+1+55+79+5, 182+115+161+2+43+55+79, 182+115 +161+2+43+55+5, 182+115+161+2+43+79+5, 182+115+161+2+55+79+5, 182+115+161+43+55+79 +5, 182+115+1+2+43+55+79, 182+115+1+2+43+55+5, 182+115+1+2+43+79+5, 182+115+1 +2+55+79+5, 182+115+1+43+55+79+5, 182+115+2+43+55+79+5, 182+161+1+2+43+55+79 , 182+161+1+2+43+55+5, 182+161+1+2+43+79+5, 182+161+1+2+55+79+5, 182+161+1+43 +55+79+5, 182+161+2+43+55+79+5, 182+1+2+43+55+79+5, 115+161+1+2+43+55+79, 115 +161+1+2+43+55+5, 115+161+1+2+43+79+5, 115+161+1+2+55+79+5, 115+161+1+43+55 +79+5, 115+161+2+43+55+79+5, 115+1+2+43+55+79+5, 161+1+2+43+55+79+5, such as those described above.

[077] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161+1+2+43+55, 181+182+115+161+1+2+43+79, 181+182+115+161+1+2+43+5, 181+182+115+161+1+2+55+79, 181+182+115+161+1+2+55+5, 181+182+115+161+1+2+79+5, 181+182+115+161+1+43+55+79, 181+182+115+161+1+43+55+5, 181+182+115+161+1+43+79+5, 181+182+115+161+1+55+79+5, 181+182+115+161+2+43+55+79, 181+182+115+161+2+43+55+5, 181+182+115+161+2+43+79+5, 181+182+115+161+2+55+79+5, 181+182+115+161+43+55+79+5, 181+182+115+1+2+43+55+79, 181+182+115+1+2+43+55+5, 181+182+115+1+2+43+79+5, 181+182+115+1+2+55+79+5, 181+182+115+1+43+55+79+5, 181+182+115+2+43+55+79+5, 181+182+161+1+2+43+55+79, 181+182+161+1+2+43+55+5, 181+182+161+1+2+43+79+5, 181+182+161+1+2+55+79+5, 181+182+161+1+43+55+79+5, 181+182+161+2+43+55+79+5, 181+182+1+2+43+55+79+5, 181+115+161+1+2+43+55+79, 181+115+161+1+2+43+55+5, 181+115+161+1+2+43+79+5, 181+115+161+1+2+55+79+5, 181+115+161+1+43+55+79+5, 181+115+161+2+43+55+79+5, 181+115+1+2+43+55+79+5, 181+161+1+2+43+55+79+5, 182+115+161+1+2+43+55+79, 182+115+161+1+2+43+55+5, 182+115+161+1+2+43+79+5, 182+115+161+1+2+55+79+5, 182+115+161+1+43+55+79+5, 182+115+161+2+43+55+79+5, 182+115+1+2+43+55+79+5, 182+161+1+2+43+55+79+5, 115+161+1+2+43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[077] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161+1+2+43+55, 181+182+115+161+1+2+43+79 , 181+182+115+161+1+2+43+5, 181+182+115+161+1+2+55+79, 181+182+115+161+1+2+55+5, 181 +182+115+161+1+2+79+5, 181+182+115+161+1+43+55+79, 181+182+115+161+1+43+55+5, 181+182 +115+161+1+43+79+5, 181+182+115+161+1+55+79+5, 181+182+115+161+2+43+55+79, 181+182+115 +161+2+43+55+5, 181+182+115+161+2+43+79+5, 181+182+115+161+2+55+79+5, 181+182+115+161 +43+55+79+5, 181+182+115+1+2+43+55+79, 181+182+115+1+2+43+55+5, 181+182+115+1+2 +43+79+5, 181+182+115+1+2+55+79+5, 181+182+115+1+43+55+79+5, 181+182+115+2+43+55 +79+5, 181+182+161+1+2+43+55+79, 181+182+161+1+2+43+55+5, 181+182+161+1+2+43+79 +5, 181+182+161+1+2+55+79+5, 181+182+161+1+43+55+79+5, 181+182+161+2+43+55+79+5 , 181+182+1+2+43+55+79+5, 181+115+161+1+2+43+55+79, 181+115+161+1+2+43+55+5, 181 +115+161+1+2+43+79+5, 181+115+161+1+2+55+79+5, 181+115+161+1+43+55+79+5, 181+115 +161+2+43+55+79+5, 181+115+1+2+43+55+79+5, 181+161+1+2+43+55+79+5, 182+115+161 +1+2+43+55+79, 182+115+161+1+2+43+55+5, 182+115+161+1+2+43+79+5, 182+115+161+1 +2+55+79+5, 182+115+161+1+43+55+79+5, 182+115+161+2+43+55+79+5, 182+115+1+2+43 +55+79+5, 182+161+1+2+43+55+79+5, 115+161+1+2+43+55+79+5, such as those described above.

[078] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161+1+2+43+55+79, 181+182+115+161+1+2+43+55+5, 181+182+115+161+1+2+43+79+5, 181+182+115+161+1+2+55+79+5, 181+182+115+161+1+43+55+79+5, 181+182+115+161+2+43+55+79+5, 181+182+115+1+2+43+55+79+5, 181+182+161+1+2+43+55+79+5181+115+161+1+2+43+55+79+5, 182+115+161+1+2+43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[078] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161+1+2+43+55+79, 181+182+115+161+1+2+43 +55+5, 181+182+115+161+1+2+43+79+5, 181+182+115+161+1+2+55+79+5, 181+182+115+161+1 +43+55+79+5, 181+182+115+161+2+43+55+79+5, 181+182+115+1+2+43+55+79+5, 181+182+161 +1+2+43+55+79+5181+115+161+1+2+43+55+79+5, 182+115+161+1+2+43+55+79+5, such as those described above.

[079] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em alterações nas posições correspondendo às posições 181+182+115+161+1+2+43+55+79+5, tais como aquelas descritas acima.[079] In another aspect, the variant comprises or consists of changes in positions corresponding to positions 181+182+115+161+1+2+43+55+79+5, such as those described above.

[080] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma ou mais (p.ex., várias) substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em R181P, G182*, V115I, A161L, Q1*, L2*, A43C, I55C, N79A, e I5V.[080] In another aspect, the variant comprises or consists of one or more (e.g., several) substitutions selected from the group consisting of R181P, G182*, V115I, A161L, Q1*, L2*, A43C, I55C, N79A, and I5V.

[081] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*, R181P+V115I, R181P+A161L, R181P+Q1*, R181P+L2*, R181P+A43C, R181P+I55C, R181P+N79A, R181P+I5V, G182*+V115I, G182*+A161L, G182*+Q1*, G182*+L2*, G182*+A43C, G182*+I55C, G182*+N79A, G182*+I5V, V115I+A161L, V115I+Q1*, V115I+L2*, V115I+A43C, V115I+I55C, V115I+N79A, V115I+I5V, A161L+Q1*, A161L+L2*, A161L+A43C, A161L+I55C, A161L+N79A, A161L+I5V, Q1*+L2*, Q1*+A43C, Q1*+I55C, Q1*+N79A, Q1*+I5V, L2*+A43C, L2*+I55C, L2*+N79A, L2*+I5V, A43C+I55C, A43C+N79A, A43C+I5V, I55C+N79A, I55C+I5V, N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[081] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*, R181P+V115I, R181P+A161L, R181P+Q1*, R181P+L2*, R181P+A43C, R181P+I55C, R181P+N79A, R181P +I5V, G182*+V115I, G182*+A161L, G182*+Q1*, G182*+L2*, G182*+A43C, G182*+I55C, G182*+N79A, G182*+I5V, V115I+A161L, V115I +Q1*, V115I+L2*, V115I+A43C, V115I+I55C, V115I+N79A, V115I+I5V, A161L+Q1*, A161L+L2*, A161L+A43C, A161L+I55C, A161L+N79A, A161L+I5V , Q1*+L2*, Q1*+A43C, Q1*+I55C, Q1*+N79A, Q1*+I5V, L2*+A43C, L2*+I55C, L2*+N79A, L2*+I5V, A43C+I55C , A43C+N79A, A43C+I5V, I55C+N79A, I55C+I5V, N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[082] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I, R181P+G182*+A161L, R181P+G182*+Q1*, R181P+G182*+L2*, R181P+G182*+A43C, R181P+G182*+I55C, R181P+G182*+N79A, R181P+G182*+I5V, R181P+V115I+A161L, R181P+V115I+Q1*, R181P+V115I+L2*, R181P+V115I+A43C, R181P+V115I+I55C, R181P+V115I+N79A, R181P+V115I+I5V, R181P+A161L+Q1*, R181P+A161L+L2*, R181P+A161L+A43C, R181P+A161L+I55C, R181P+A161L+N79A, R181P+A161L+I5V, R181P+Q1*+L2*, R181P+Q1*+A43C, R181P+Q1*+I55C, R181P+Q1*+N79A,R181P+Q1*+I5V, R181P+L2*+A43C, R181P+L2*+I55C, R181P+L2*+N79A, R181P+L2*+I5V, R181P+A43C+I55C, R181P+A43C+N79A, R181P+A43C+I5V, R181P+I55C+N79A, R181P+I55C+I5V, R181P+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L, G182*+V115I+Q1*, G182*+V115I+L2*, G182*+V115I+A43C, G182*+V115I+I55C, G182*+V115I+N79A, G182*+V115I+I5V, G182*+A161L+Q1*, G182*+A161L+L2*, G182*+A161L+A43C, G182*+A161L+I55C, G182*+A161L+N79A, G182*+A161L+I5V, G182*+Q1*+L2*, G182*+Q1*+A43C, G182*+Q1*+I55C, G182*+Q1*+N79A, G182*+Q1*+I5V, G182*+L2*+A43C, G182*+L2*+I55C, G182*+L2*+N79A, G182*+L2*+I5V, G182*+A43C+I55C, G182*+A43C+N79A, G182*+A43C+I5V, G182*+I55C+N79A, G182*+I55C+I5V, G182*+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*, V115I+A161L+L2*, V115I+A161L+A43C, V115I+A161L+I55C, V115I+A161L+N79A, V115I+A161L+I5V, V115I+Q1*+L2*, V115I+Q1*+A43C, V115I+Q1*+I55C, V115I+Q1*+N79A, V115I+Q1*+I5V, V115I+L2*+A43C, V115I+L2*+I55C, V115I+L2*+N79A, V115I+L2*+I5V, V115I+A43C+I55C, V115I+A43C+N79A, V115I+A43C+I5V, V115I+I55C+N79A, V115I+I55C+I5V, V115I+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*, A161L+Q1*+A43C, A161L+Q1*+I55C, A161L+Q1*+N79A, A161L+Q1*+I5V, A161L+L2*+A43C, A161L+L2*+I55C, A161L+L2*+N79A, A161L+L2*+I5V, A161L+A43C+I55C, A161L+A43C+N79A, A161L+A43C+I5V, A161L+I55C+N79A, A161L+I55C+I5V, A161L+N79A+I5V, Q1*+L2*+A43C, Q1*+L2*+I55C, Q1*+L2*+N79A, Q1*+L2*+I5V, Q1*+A43C+I55C, Q1*+A43C+N79A, Q1*+A43C+I5V, Q1*+I55C+N79A, Q1*+I55C+I5V, Q1*+N79A+I5V, L2*+A43C+I55C, L2*+A43C+N79A, L2*+A43C+I5V, L2*+I55C+N79A, L2*+I55C+I5V, L2*+N79A+I5V, A43C+I55C+N79A, A43C+I55C+I5V, A43C+N79A+I5V, I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[082] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I, R181P+G182*+A161L, R181P+G182*+Q1*, R181P+G182*+L2*, R181P+G182*+A43C , R181P+G182*+I55C, R181P+G182*+N79A, R181P+G182*+I5V, R181P+V115I+A161L, R181P+V115I+Q1*, R181P+V115I+L2*, R181P+V115I+A43C, R18 1P+ V115I+I55C, R181P+V115I+N79A, R181P+V115I+I5V, R181P+A161L+Q1*, R181P+A161L+L2*, R181P+A161L+A43C, R181P+A161L+I55C, R181P+A161L+ N79A, R181P+ A161L+I5V, R181P+Q1*+L2*, R181P+Q1*+A43C, R181P+Q1*+I55C, R181P+Q1*+N79A, R181P+Q1*+I5V, R181P+L2*+A43C, R181P+L2 *+I55C, R181P+L2*+N79A, R181P+L2*+I5V, R181P+A43C+I55C, R181P+A43C+N79A, R181P+A43C+I5V, R181P+I55C+N79A, R181P+I55C+I5V, R181P+ N79A+I5V, G182*+V115I+A161L, G182*+V115I+Q1*, G182*+V115I+L2*, G182*+V115I+A43C, G182*+V115I+I55C, G182*+V115I+N79A, G182* +V115I+I5V, G182*+A161L+Q1*, G182*+A161L+L2*, G182*+A161L+A43C, G182*+A161L+I55C, G182*+A161L+N79A, G182*+A161L+I5V, G182 *+Q1*+L2*, G182*+Q1*+A43C, G182*+Q1*+I55C, G182*+Q1*+N79A, G182*+Q1*+I5V, G182*+L2*+A43C, G182* +L2*+I55C, G182*+L2*+N79A, G182*+L2*+I5V, G182*+A43C+I55C, G182*+A43C+N79A, G182*+A43C+I5V, G182*+I55C+N79A, G182*+I55C+I5V, G182*+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*, V115I+A161L+L2*, V115I+A161L+A43C, V115I+A161L+I55C, V115I+A161L+N79A, V115I+A16 1L+ I5V, V115I+Q1*+L2*, V115I+Q1*+A43C, V115I+Q1*+I55C, V115I+Q1*+N79A, V115I+Q1*+I5V, V115I+L2*+A43C, V115I+L2*+ I55C, V115I+L2*+N79A, V115I+L2*+I5V, V115I+A43C+I55C, V115I+A43C+N79A, V115I+A43C+I5V, V115I+I55C+N79A, V115I+I55C+I5V, V115I+N79A + I5V, A161L+Q1*+L2*, A161L+Q1*+A43C, A161L+Q1*+I55C, A161L+Q1*+N79A, A161L+Q1*+I5V, A161L+L2*+A43C, A161L+L2*+ I55C, A161L+L2*+N79A, A161L+L2*+I5V, A161L+A43C+I55C, A161L+A43C+N79A, A161L+A43C+I5V, A161L+I55C+N79A, A161L+I55C+I5V, A161L+N79A + I5V, Q1*+L2*+A43C, Q1*+L2*+I55C, Q1*+L2*+N79A, Q1*+L2*+I5V, Q1*+A43C+I55C, Q1*+A43C+N79A, Q1* +A43C+I5V, Q1*+I55C+N79A, Q1*+I55C+I5V, Q1*+N79A+I5V, L2*+A43C+I55C, L2*+A43C+N79A, L2*+A43C+I5V, L2*+ I55C+N79A, L2*+I55C+I5V, L2*+N79A+I5V, A43C+I55C+N79A, A43C+I55C+I5V, A43C+N79A+I5V, I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 .

[083] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I+A161L, R181P+G182*+V115I+Q1*, R181P+G182*+V115I+L2*, R181P+G182*+V115I+A43C, R181P+G182*+V115I+I55C, R181P+G182*+V115I+N79A, R181P+G182*+V115I+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*, R181P+G182*+A161L+L2*, R181P+G182*+A161L+A43C, R181P+G182*+A161L+I55C, R181P+G182*+A161L+N79A, R181P+G182*+A161L+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*, R181P+G182*+Q1*+A43C, R181P+G182*+Q1*+I55C, R181P+G182*+Q1*+N79A, R181P+G182*+Q1*+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C, R181P+G182*+L2*+I55C, R181P+G182*+L2*+N79A, R181P+G182*+L2*+I5V, R181P+G182*+A43C+I55C, R181P+G182*+A43C+N79A, R181P+G182*+A43C+I5V, R181P+G182*+I55C+N79A, R181P+G182*+I55C+I5V, R181P+G182*+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*, R181P+V115I+A161L+L2*, R181P+V115I+A161L+A43C, R181P+V115I+A161L+I55C, R181P+V115I+A161L+N79A, R181P+V115I+A161L+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*, R181P+V115I+Q1*+A43C, R181P+V115I+Q1*+I55C, R181P+V115I+Q1*+N79A, R181P+V115I+Q1*+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C, R181P+V115I+L2*+I55C, R181P+V115I+L2*+N79A, R181P+V115I+L2*+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C, R181P+V115I+A43C+N79A, R181P+V115I+A43C+I5V, R181P+V115I+I55C+N79A, R181P+V115I+I55C+I5V, R181P+V115I+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*, R181P+A161L+Q1*+A43C, R181P+A161L+Q1*+I55C, R181P+A161L+Q1*+N79A, R181P+A161L+Q1*+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C, R181P+A161L+L2*+I55C, R181P+A161L+L2*+N79A, R181P+A161L+L2*+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C,R181P+A161L+A43C+N79A, R181P+A161L+A43C+I5V, R181P+A161L+I55C+N79A, R181P+A161L+I55C+I5V, R181P+A161L+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C, R181P+Q1*+L2*+I55C, R181P+Q1*+L2*+N79A, R181P+Q1*+L2*+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C, R181P+Q1*+A43C+N79A, R181P+Q1*+A43C+I5V, R181P+Q1*+I55C+N79A, R181P+Q1*+I55C+I5V, R181P+Q1*+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C, R181P+L2*+A43C+N79A, R181P+L2*+A43C+I5V, R181P+L2*+I55C+N79A, R181P+L2*+I55C+I5V, R181P+L2*+N79A+I5V, R181P+A43C+I55C+N79A, R181P+A43C+I55C+I5V, R181P+A43C+N79A+I5V, R181P+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*, G182*+V115I+A161L+L2*, G182*+V115I+A161L+A43C, G182*+V115I+A161L+I55C, G182*+V115I+A161L+N79A, G182*+V115I+A161L+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*, G182*+V115I+Q1*+A43C, G182*+V115I+Q1*+I55C, G182*+V115I+Q1*+N79A, G182*+V115I+Q1*+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C, G182*+V115I+L2*+I55C, G182*+V115I+L2*+N79A, G182*+V115I+L2*+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C, G182*+V115I+A43C+N79A, G182*+V115I+A43C+I5V, G182*+V115I+I55C+N79A, G182*+V115I+I55C+I5V, G182*+V115I+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*, G182*+A161L+Q1*+A43C, G182*+A161L+Q1*+I55C, G182*+A161L+Q1*+N79A, G182*+A161L+Q1*+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C, G182*+A161L+L2*+I55C, G182*+A161L+L2*+N79A, G182*+A161L+L2*+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C, G182*+A161L+A43C+N79A, G182*+A161L+A43C+I5V, G182*+A161L+I55C+N79A, G182*+A161L+I55C+I5V, G182*+A161L+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C, G182*+Q1*+L2*+I55C, G182*+Q1*+L2*+N79A, G182*+Q1*+L2*+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C, G182*+Q1*+A43C+N79A, G182*+Q1*+A43C+I5V, G182*+Q1*+I55C+N79A, G182*+Q1*+I55C+I5V, G182*+Q1*+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C,G182*+L2*+A43C+N79A, G182*+L2*+A43C+I5V, G182*+L2*+I55C+N79A, G182*+L2*+I55C+I5V, G182*+L2*+N79A+I5V, G182*+A43C+I55C+N79A, G182*+A43C+I55C+I5V, G182*+A43C+N79A+I5V, G182*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*, V115I+A161L+Q1*+A43C, V115I+A161L+Q1*+I55C, V115I+A161L+Q1*+N79A, V115I+A161L+Q1*+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C, V115I+A161L+L2*+I55C, V115I+A161L+L2*+N79A, V115I+A161L+L2*+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C, V115I+A161L+A43C+N79A, V115I+A161L+A43C+I5V, V115I+A161L+I55C+N79A, V115I+A161L+I55C+I5V, V115I+A161L+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C, V115I+Q1*+L2*+I55C, V115I+Q1*+L2*+N79A, V115I+Q1*+L2*+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C, V115I+Q1*+A43C+N79A, V115I+Q1*+A43C+I5V, V115I+Q1*+I55C+N79A, V115I+Q1*+I55C+I5V, V115I+Q1*+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C, V115I+L2*+A43C+N79A, V115I+L2*+A43C+I5V, V115I+L2*+I55C+N79A, V115I+L2*+I55C+I5V, V115I+L2*+N79A+I5V, V115I+A43C+I55C+N79A, V115I+A43C+I55C+I5V, V115I+A43C+N79A+I5V, V115I+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C, A161L+Q1*+L2*+I55C, A161L+Q1*+L2*+N79A, A161L+Q1*+L2*+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C, A161L+Q1*+A43C+N79A, A161L+Q1*+A43C+I5V, A161L+Q1*+I55C+N79A, A161L+Q1*+I55C+I5V, A161L+Q1*+N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C, A161L+L2*+A43C+N79A, A161L+L2*+A43C+I5V, A161L+L2*+I55C+N79A, A161L+L2*+I55C+I5V, A161L+L2*+N79A+I5V, A161L+A43C+I55C+N79A, A161L+A43C+I55C+I5V, A161L+A43C+N79A+I5V, A161L+I55C+N79A+I5V, Q1*+L2*+A43C+I55C, Q1*+L2*+A43C+N79A, Q1*+L2*+A43C+I5V, Q1*+L2*+I55C+N79A, Q1*+L2*+I55C+I5V, Q1*+L2*+N79A+I5V, Q1*+A43C+I55C+N79A, Q1*+A43C+I55C+I5V, Q1*+A43C+N79A+I5V, Q1*+I55C+N79A+I5V, L2*+A43C+I55C+N79A, L2*+A43C+I55C+I5V, L2*+A43C+N79A+I5V, L2*+I55C+N79A+I5V, A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[083] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I+A161L, R181P+G182*+V115I+Q1*, R181P+G182*+V115I+L2*, R181P+G182*+V115I+ A43C, R181p+G182*+V115i+i55c, R181p+G182*+V115i+N79a, R181p+G182*+V115i+I5V, R181p+G182*+a161l+Q1*, R181p+G182*+A161L+L2*, r181p +G182*+A161L+A43C, R181P+G182*+A161L+I55C, R181P+G182*+A161L+N79A, R181P+G182*+A161L+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*, R181P+G182* +Q1*+A43C, R181P+G182*+Q1*+I55C, R181P+G182*+Q1*+N79A, R181P+G182*+Q1*+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C, R181P+G182* +L2*+I55C, R181P+G182*+L2*+N79A, R181P+G182*+L2*+I5V, R181P+G182*+A43C+I55C, R181P+G182*+A43C+N79A, R181P+G182*+A43C +I5V, R181P+G182*+I55C+N79A, R181P+G182*+I55C+I5V, R181P+G182*+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*, R181P+V115I+A161L+L2*, R181P+ V115I+A161L+A43C, R181P+V115I+A161L+I55C, R181P+V115I+A161L+N79A, R181P+V115I+A161L+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*, R181P+V115I+Q1*+A 43C, R181P +V115I+Q1*+I55C, R181P+V115I+Q1*+N79A, R181P+V115I+Q1*+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C, R181P+V115I+L2*+I55C, R181P+V115I+L2* +N79A, R181P+V115I+L2*+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C, R181P+V115I+A43C+N79A, R181P+V115I+A43C+I5V, R181P+V115I+I55C+N79A, R181P+V11 5I+I55C+ I5V, R181P+V115I+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*, R181P+A161L+Q1*+A43C, R181P+A161L+Q1*+I55C, R181P+A161L+Q1*+N79A, R181P+A161L +Q1*+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C, R181P+A161L+L2*+I55C, R181P+A161L+L2*+N79A, R181P+A161L+L2*+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C, R181P+A161L+A43C+N79A, R181P+A161L+A43C+I5V, R181P+A161L+I55C+N79A, R181P+A161L+I55C+I5V, R181P+A161L+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A 43C, R181P+Q1*+L2*+I55C, R181P+Q1*+L2*+N79A, R181P+Q1*+L2*+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C, R181P+Q1*+A43C+N79A, R181P+ Q1*+A43C+I5V, R181P+Q1*+I55C+N79A, R181P+Q1*+I55C+I5V, R181P+Q1*+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C, R181P+L2*+A43C+ N79A, R181P+L2*+A43C+I5V, R181P+L2*+I55C+N79A, R181P+L2*+I55C+I5V, R181P+L2*+N79A+I5V, R181P+A43C+I55C+N79A, R181P+A43C+ I55C+I5V, R181P+A43C+N79A+I5V, R181P+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*, G182*+V115I+A161L+L2*, G182*+V115I+A161L+A43C, G182 *+V115I+A161L+I55C, G182*+V115I+A161L+N79A, G182*+V115I+A161L+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*, G182*+V115I+Q1*+A43C, G182*+ V115I+Q1*+I55C, G182*+V115I+Q1*+N79A, G182*+V115I+Q1*+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C, G182*+V115I+L2*+I55C, G182*+ V115I+L2*+N79A, G182*+V115I+L2*+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C, G182*+V115I+A43C+N79A, G182*+V115I+A43C+I5V, G182*+V115I+I55C +N79A, G182*+V115I+I55C+I5V, G182*+V115I+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*, G182*+A161L+Q1*+A43C, G182*+A161L+Q1*+ I55C, G182*+A161L+Q1*+N79A, G182*+A161L+Q1*+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C, G182*+A161L+L2*+I55C, G182*+A161L+L2*+ N79A, G182*+A161L+L2*+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C, G182*+A161L+A43C+N79A, G182*+A161L+A43C+I5V, G182*+A161L+I55C+N79A, G182* +A161L+I55C+I5V, G182*+A161L+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C, G182*+Q1*+L2*+I55C, G182*+Q1*+L2*+N79A, G182 *+Q1*+L2*+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C, G182*+Q1*+A43C+N79A, G182*+Q1*+A43C+I5V, G182*+Q1*+I55C+N79A, G182*+Q1*+I55C+I5V, G182*+Q1*+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C,G182*+L2*+A43C+N79A, G182*+L2*+A43C+I5V, G182*+L2*+I55C+N79A, G182*+L2*+I55C+I5V, G182*+L2*+N79A+I5V, G182*+A43C+I55C+N79A, G182*+A43C+I55C+I5V, G182* +A43C+N79A+I5V, G182*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*, V115I+A161L+Q1*+A43C, V115I+A161L+Q1*+I55C, V115I+A161L+Q1* +N79A, V115I+A161L+Q1*+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C, V115I+A161L+L2*+I55C, V115I+A161L+L2*+N79A, V115I+A161L+L2*+I5V, V115I+ A161L+A43C+I55C, V115I+A161L+A43C+N79A, V115I+A161L+A43C+I5V, V115I+A161L+I55C+N79A, V115I+A161L+I55C+I5V, V115I+A161L+N79A+I5V , V115I+Q1* +L2*+A43C, V115I+Q1*+L2*+I55C, V115I+Q1*+L2*+N79A, V115I+Q1*+L2*+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C, V115I+Q1*+ A43C+N79A, V115I+Q1*+A43C+I5V, V115I+Q1*+I55C+N79A, V115I+Q1*+I55C+I5V, V115I+Q1*+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C, V115I +L2*+A43C+N79A, V115I+L2*+A43C+I5V, V115I+L2*+I55C+N79A, V115I+L2*+I55C+I5V, V115I+L2*+N79A+I5V, V115I+A43C+I55C+ N79A, V115I+A43C+I55C+I5V, V115I+A43C+N79A+I5V, V115I+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C, A161L+Q1*+L2*+I55C, A161L+Q1* +L2*+N79A, A161L+Q1*+L2*+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C, A161L+Q1*+A43C+N79A, A161L+Q1*+A43C+I5V, A161L+Q1*+I55C+ N79A, A161L+Q1*+I55C+I5V, A161L+Q1*+N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C, A161L+L2*+A43C+N79A, A161L+L2*+A43C+I5V, A161L+L2 *+I55C+N79A, A161L+L2*+I55C+I5V, A161L+L2*+N79A+I5V, A161L+A43C+I55C+N79A, A161L+A43C+I55C+I5V, A161L+A43C+N79A+I5V, A161L+ I55C+N79A+I5V, Q1*+L2*+A43C+I55C, Q1*+L2*+A43C+N79A, Q1*+L2*+A43C+I5V, Q1*+L2*+I55C+N79A, Q1*+L2 *+I55C+I5V, Q1*+L2*+N79A+I5V, Q1*+A43C+I55C+N79A, Q1*+A43C+I55C+I5V, Q1*+A43C+N79A+I5V, Q1*+I55C+N79A+ I5V, L2*+A43C+I55C+N79A, L2*+A43C+I55C+I5V, L2*+A43C+N79A+I5V, L2*+I55C+N79A+I5V, A43C+I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[084] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C, R181P+G182*+V115I+A161L+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C, R181P+G182*+V115I+Q1*+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C, R181P+G182*+V115I+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C, R181P+G182*+A161L+Q1*+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C, R181P+G182*+A161L+L2*+I55C, R181P+G182*+A161L+L2*+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+I5V, R181P+G182*+A161L+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+A43C+I5V, R181P+G182*+A161L+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C, R181P+G182*+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182*+Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C, R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C, R181P+V115I+A161L+L2*+N79A, R181P+V115I+A161L+A43C+I55C, R181P+V115I+A161L+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C, R181P+V115I+Q1*+L2*+N79A, R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C, R181P+V115I+Q1*+A43C+I5V, R181P+V115I+Q1*+I55C+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+A161L+Q1*+A43C+I5V, R181P+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+A161L+L2*+A43C+I5V, R181P+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C, R181P+V115I+A161L+L2*+I5V, R181P+V115I+A161L+A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C, R181P+V115I+Q1*+L2*+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+N79A, R181P+V115I+Q1*+I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+N79A, R181P+V115I+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+L2*+N79A+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181P+A161L+Q1*+A43C+N79A, R181P+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P+A161L+L2*+N79A+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C, G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C, G182*+V115I+A161L+L2*+N79A, G182*+V115I+A161L+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C, G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C, G182*+V115I+Q1*+A43C+I5V, G182*+V115I+Q1*+I55C+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+L2*+I55C+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C, G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C, G182*+A161L+Q1*+A43C+I5V, G182*+A161L+Q1*+I55C+I5V G182*+A161L+Q1*+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+N79A, G182*+A161L+L2*+I55C+N79A, G182*+A161L+L2*+N79A+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C+I5V, G182*+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C, G182*+V115I+A161L+L2*+I5V, G182*+V115I+A161L+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C, G182*+V115I+Q1*+L2*+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A, G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+L2*+N79A+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C, G182*+A161L+Q1*+L2*+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A, G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C, G182*+A161L+L2*+A43C+I5V, G182*+A161L+L2*+I55C+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+A43C+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C, V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C, V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+A43C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A, V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+N79A, V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, V115I+A161L+L2*+N79A+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A, V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, L2*+A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[084] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C, R181P +G182*+V115I+A161L+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*, R181P+G182*+ V115I+Q1*+A43C, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C, R181P+G182*+V115I+Q1*+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+I5V, R181P+G182*+V115I+ L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C, R181P+G182*+V115I+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+A43C+ I55C, R181P+G182*+V115I+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+I55C+I5V, R181P+G 182* +V115I+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C, R181P+G182*+A161L +Q1*+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C, R181P+G182*+A161L+L2*+I55C, R181P+G182*+A161L+L2 *+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+I5V, R181P+G182*+A161L+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+A43C+I5V, R181P +G182*+A161L+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+ Q1*+L2*+I55C, R181P+G182*+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182* +Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+Q1 *+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+L2*+ I55C+N79A, R181P+G182*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*, R181P+V115i+A161L+Q1*+A43C, R181P+V115I+A161 +Q1*+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C, R181P+V115I+A161L+L2*+N79A, R181P+V115I+A161L+A43C+I55C, R18 1P +V115I+A161L+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C, R181P+V115I+Q1*+L2*+N79A, R181P+V115I+Q1*+ A43C+I55C, R181P+V115I+Q1*+A43C+I5V, R181P+V115I+Q1*+I55C+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+L2*+A43C+I5V, R181P+ V115I+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+A161L+Q1*+L2* +N79A, R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+A161L+Q1*+A43C+I5V, R181P+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+A161L +L2*+A43C+I5V, R181P+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C , R181P+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I +A161L+Q1*+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C, R181P+V115I+A161L+L2*+I5V, R181P+V115I+A161L+A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+I55C+N79 A, R181P+V115I+A161L+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C, R181P+V115I+Q1*+L2*+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+N79A, R181P+V115I+Q1 *+I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+N79A, R181P+V115I+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+L2*+N79A+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181P+A161L+Q1* +A43C+N79A, R181P+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P +A161L+L2*+N79A+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+Q1*+L2*+ I55C+N79A, R181P+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P +L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C, G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A, G182*+V115I+A161L +L2*+A43C, G182*+V115I+A161L+L2*+N79A, G182*+V115I+A161L+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+I55C+I5V , G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C, G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C, G182*+V115I+Q1*+A43C+I5V , G182*+V115I+Q1*+I55C+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+L2*+I55C+I5V, G182 *+V115I+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C, G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A, G182*+ A161L+Q1*+A43C+I55C, G182*+A161L+Q1*+A43C+I5V, G182*+A161L+Q1*+I55C+I5V G182*+A161L+Q1*+N79A+I5V, G182*+A161L+L2 *+A43C+N79A, G182*+A161L+L2*+I55C+N79A, G182*+A161L+L2*+N79A+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C+I5V, G182*+A161L+I55C+N79A+ I5V, R181P+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C, G182 *+V115I+A161L+Q1*+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C, G182*+V115I+A161L+L2*+I5V, G182*+V115I+A161L+A43C+N79A, G182*+V115I +A161L+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C, G182*+V115I+Q1*+L2*+I5V, G182*+V115I+Q1 *+A43C+N79A, G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+L2*+ I55C+N79A, G182*+V115I+L2*+N79A+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C , G182*+A161L+Q1*+L2*+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A, G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C, G182*+A161L+L2*+A43C+I5V, G182*+A161L+L2*+I55C+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+A43C+N79A+I5V, G182*+Q1 *+L2*+A43C+I55C, G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182* +Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+ Q1*+L2*+A43C, V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C, V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, V115I+A161L+Q1*+I55C +I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+ A43C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C +N79A, V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1* +L2*+A43C+N79A, A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, A161L+Q1*+I55C+ N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C +N79A, G182*+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A, V115I+A161L+ Q1*+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+N79A, V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, V115I+A161L+L2*+N79A+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A, V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, V115I+Q1* +A43C+I55C+I5V, V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+ I55C, A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, A161L+ L2*+A43C+I55C+N79A, A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, Q1*+L2*+A43C+I55C +N79A, Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, L2*+A43C+I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[085] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*, 181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+N79A+I5V, 181P+G182*+V115I+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A43C+I55C+I5V, 181P+G182*+V115I+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I5V, 181P+G182*+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+N79A+I5V, 181P+G182*+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V, 181P+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V, 182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[085] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*, 181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C, R181P+G182*+V115I+ A161L+Q1*+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C, R181P +G182*+V115I+A161L+L2*+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+ A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+N79A, R181P+G182* +V115I+ A161L+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C, R181P +G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+ Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+I5V, R181P +G182*+V115I+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+L2* +A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+N79A+I5V, 181P+G182 *+V115I+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A43C+I55C+I5V, 181P+G182*+V115I+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+I55C+N79A+I5V, R18 1P +G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+A161L +Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I5V , R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+ L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I5V, 181P+G182*+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P +G182*+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+N79A+I5V, 181P+G182*+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+A43C+I55C +I5V, R181P+G182*+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+Q1 *+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+ I55C+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182 *+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C +I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+ Q1*+L2*+A43C, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181p+v115i+a161l+q1*+a43c+i55c, r181p+v115i+a161l+q1*+a43c+n79a, r181p+v115i+a161l+q1*+a43c+i5v, r181p+v115i+a161l+q1*+i5c+ N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+A161L+L2*+ A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+ L2 *+N79A+I5V, 181P+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A1 61L+I55C+ N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+ Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A , R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C +N79A, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A43C+I55C+ N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+A161L+ Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A , R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C +N79A, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+A43C+I55C+ N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+Q1* +L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C , G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, G182*+V115I +A161L+Q1*+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+ N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L +L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, G182*+V115i+A161L+L2*+N79A+I5V, 182*+V115i+A161L+A43C+I55C+N79A, G182*+V115i+A161L+I55C+I5V, G182*+V115i+A161L+A43C+N7C+N79A +I5V, G182*+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I +Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2 *+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182* +V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+ N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+A161L +Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+A161L+Q1*+L2 *+I55C+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182 *+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+L2*+A43C +I55C+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+Q1 *+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+ I55C+N79A+I5V, G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, V115I+ A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+L2*+ I55C+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+Q1* +A43C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+ L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+ Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A +I5V, V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, A161L+Q1*+L2 *+A43C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, Q1* +L2*+A43C+I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[086] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[086] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C, R181P+ G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C, R181P+ G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A, R181P+G182* +V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I +A161L+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L +L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+ I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C , R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+ N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+ N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+ G182*+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182* +A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182 *+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182 *+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+ A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+ L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+Q1*+L2 *+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+ A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2 *+A43C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+ I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A 161L +L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C +I55C+N79A, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A +I5V, R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P +A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L +Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+ Q1*+L2*+A43C+I55C, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, G182*+V115I+A161L +Q1*+L2*+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, G182*+V115I+ A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+ Q1*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+L2* +A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C +I55C+N79A, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+ I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C +I55C+N79A, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+ I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C +N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A +I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I +Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[087] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[087] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+ N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1 *+L2*+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182* +V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+ N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2 *+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182* +V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V , R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2 *+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+ A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+ N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+ I55C+N79A+I5V, R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, G182*+V115I+A161L+ Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C +N79A+I5V, G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V of mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 .

[088] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[088] In another aspect, the variant comprises or consists of R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C +I55C+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V, R181P+G182 *+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+ A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V, G182 *+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[089] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[089] In another aspect, the variant comprises or consists of the substitutions R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[090] As variantes podem compreender adicionalmente uma ou mais alterações adicionais em uma ou mais (por exemplo, várias) posições diferentes.[090] Variants may additionally comprise one or more additional changes in one or more (e.g., several) different positions.

[091] As alterações de aminoácidos podem ser de natureza secundária, isto é, substituições conservativas ou inserções de aminoácidos que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligador possuindo até 2025 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por meio de alteração da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epitopo antigênico ou um domínio de ligação.[091] Amino acid changes may be secondary in nature, that is, conservative substitutions or insertions of amino acids that do not significantly affect the folding and/or activity of the protein; small deletions, typically 1-30 amino acids; short amino- or carboxyl-terminal extensions, such as an amino-terminal methionine residue; a small linker peptide having up to 2025 residues; or a small extension that facilitates purification by altering the total charge or other function, such as a polyhistidine tract, an antigenic epitope, or a binding domain.

[092] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.[092] Examples of conservative substitutions are within the groups of basic amino acids (arginine, lysine and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine and valine), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine), and small amino acids (glycine, alanine, serine, threonine and methionine). Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art and are described, for example, by H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Common substitutions are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg , Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.

[093] Alternativamente, as alterações de aminoácidos são de natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.[093] Alternatively, the amino acid changes are of such a nature that the physicochemical properties of the polypeptides are altered. For example, amino acid changes can improve the thermal stability of the polypeptide, change substrate specificity, change the optimum pH, and the like.

[094] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de cutinase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física da estrutura, como determinado por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.[094] Essential amino acids in a polypeptide can be identified according to procedures known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). In the latter technique, single alanine mutations are introduced at each residue of the molecule, and the resulting mutant molecules are tested for cutinase activity to identify amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. See also, Hilton et al., 1996, J. Biol. chem. 271:4699-4708. The active site of the enzyme or other biological interaction can also be determined by physical analysis of the structure, as determined by techniques such as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labeling, in conjunction with contact site amino acid mutation. putative. See, for example, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. The identity of essential amino acids can also be inferred from an alignment with a related polypeptide.

[095] Em um aspecto, uma variante pode consistir em ou compreender pelo menos 172 resíduos de aminoácidos (p.ex., os aminoácidos 17 a 188 de SEQ ID NO: 2). Em um aspecto, a variante compreende pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, a variante compreende pelo menos 172 resíduos de aminoácidos (p.ex., os aminoácidos 17 a 188 de SEQ ID NO: 2) e pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.[095] In one aspect, a variant may consist of or comprise at least 172 amino acid residues (e.g., amino acids 17 to 188 of SEQ ID NO: 2). In one aspect, the variant comprises at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96 %, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of amino acids of SEQ ID NO: 2. In one aspect, the variant comprises at least 172 amino acid residues ( e.g., amino acids 17 to 188 of SEQ ID NO: 2) and at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of amino acids of SEQ ID NO: 2.

[096] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a variantes compreendendo uma extensão N-terminal. A extensão pode constituir-se das posições correspondendo aos aminoácidos -17 a -1 de SEQ ID NO: 2, ou truncamentos desta. Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma variantes na qual a extensão N-terminal é selecionada de: (a) AAVDSNHTPAVPELVAR; (b) AVDSNHTPAVPELVAR; (c) VDSNHTPAVPELVAR; (d) DSNHTPAVPELVAR; (e) SNHTPAVPELVAR; (f) NHTPAVPELVAR; (g) HTPAVPELVAR; (h) TPAVPELVAR; (i) PAVPELVAR; (j) AVPELVAR; (k); (l) PELVAR; (m) PELVAR, (n) ELVAR; (o) LVAR; (p) VAR; (q) AR; ou (r) R. As variantes compreendendo uma deleção em uma ou mais (p.ex., várias) das posições correspondendo ao aminoácido 1 e/ou 2 de SEQ ID NO: 2 (p.ex., Q1*, L2*, ou Q1*+L2*) podem ter um processamento diferente da pró-região. Isso pode, em alguns aspectos da invenção, resultar em variantes que possuem tanto uma deleção em uma ou mais (p.ex., várias) das posições correspondendo ao aminoácido 1 e/ou 2 de SEQ ID NO: 2 (p.ex., Q1*, L2*, ou Q1*+L2*) como uma extensão N-terminal selecionada de: (a) AAVDSNHTPAVPELVAR; (b) AVDSNHTPAVPELVAR; (c) VDSNHTPAVPELVAR; (d) DSNHTPAVPELVAR; (e) SNHTPAVPELVAR; (f) NHTPAVPELVAR; (g) HTPAVPELVAR; (h) TPAVPELVAR; (i) PAVPELVAR; (j) AVPELVAR; (k); (l) PELVAR; (m) PELVAR, (n) ELVAR; (o) LVAR; (p) VAR; (q) AR; ou (r) R.[096] In some aspects, the invention relates to variants comprising an N-terminal extension. The extension may consist of positions corresponding to amino acids -17 to -1 of SEQ ID NO: 2, or truncations thereof. In some aspects, the invention relates to a variant in which the N-terminal extension is selected from: (a) AAVDSNHTPAVPELVAR; (b) AVDSNHTPAVPELVAR; (c) VDSNHTPAVPELVAR; (d) DSNHTPAVPELVAR; (e) SNHTPAVPELVAR; (f) NHTPAVPELVAR; (g) HTPAVPELVAR; (h) TPAVPELVAR; (i) PAVPELVAR; (j) AVPELVAR; (k); (l) PELVAR; (m) PELVAR, (n) ELVAR; (o) LVAR; (p) VAR; (q) AR; or (r) R. Variants comprising a deletion at one or more (e.g., several) of the positions corresponding to amino acid 1 and/or 2 of SEQ ID NO: 2 (e.g., Q1*, L2* , or Q1*+L2*) may have a different processing than the pro-region. This may, in some aspects of the invention, result in variants that have either a deletion at one or more (e.g., several) of the positions corresponding to amino acid 1 and/or 2 of SEQ ID NO: 2 (e.g., , Q1*, L2*, or Q1*+L2*) as an N-terminal extension selected from: (a) AAVDSNHTPAVPELVAR; (b) AVDSNHTPAVPELVAR; (c) VDSNHTPAVPELVAR; (d) DSNHTPAVPELVAR; (e) SNHTPAVPELVAR; (f) NHTPAVPELVAR; (g) HTPAVPELVAR; (h) TPAVPELVAR; (i) PAVPELVAR; (j) AVPELVAR; (k); (l) PELVAR; (m) PELVAR, (n) ELVAR; (o) LVAR; (p) VAR; (q) AR; or (r) R.

[097] Em um aspecto, a variante tem atividade específica melhorada em comparação com a enzima genitora. A atividade específica pode ser determinada por hidrólise de BETEB como descrito no Exemplo 3, e/ou determinada por um aumento da mudança de pH e/ou mudança da DO por hidrólise de PET como descrito no Exemplo 4.[097] In one aspect, the variant has improved specific activity compared to the parent enzyme. Specific activity can be determined by hydrolysis of BETEB as described in Example 3, and/or determined by an increase in pH change and/or change in OD by hydrolysis of PET as described in Example 4.

[098] Em um aspecto, a variante tem ligação ao substrato melhorada em comparação com a enzima genitora.[098] In one aspect, the variant has improved substrate binding compared to the parent enzyme.

[099] Em um aspecto, a variante tem clivagem do substrato melhorada em comparação com a enzima genitora. A clivagem do substrato pode ser determinada por hidrólise de BETEB como descrito no Exemplo 3, e/ou determinada por um aumento da mudança de pH e/ou mudança da DO por hidrólise de PET como descrito no Exemplo 4.[099] In one aspect, the variant has improved substrate cleavage compared to the parent enzyme. Substrate cleavage can be determined by hydrolysis of BETEB as described in Example 3, and/or determined by an increase in pH change and/or change in OD by hydrolysis of PET as described in Example 4.

[0100] Em um aspecto, a variante tem especificidade de substrato melhorada em comparação com a enzima genitora. A especificidade de substrato pode ser determinada por hidrólise de BETEB como descrito no Exemplo 3, e/ou determinada por um aumento da mudança de pH e/ou mudança da DO por hidrólise de PET como descrito no Exemplo 4.[0100] In one aspect, the variant has improved substrate specificity compared to the parent enzyme. Substrate specificity can be determined by hydrolysis of BETEB as described in Example 3, and/or determined by an increase in pH change and/or change in OD by hydrolysis of PET as described in Example 4.

[0101] Em um aspecto, a variante tem termoestabilidade melhorada em comparação com a enzima genitora. A termoestabilidade pode ser determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC, do inglês "Differential Scanning Calorimetry") ou por determinação da atividade residual após incubação a uma temperatura específica medida por hidrólise de BETEB como descrito no Exemplo 3, e/ou determinada por um aumento da mudança de pH e/ou mudança da DO por hidrólise de PET como descrito no Exemplo 4.[0101] In one aspect, the variant has improved thermostability compared to the parent enzyme. Thermostability can be determined by differential scanning calorimetry (DSC) or by determining the residual activity after incubation at a specific temperature measured by hydrolysis of BETEB as described in Example 3, and/or determined by a increasing pH change and/or changing DO by hydrolysis of PET as described in Example 4.

[0102] A termoestabilidade determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) é realizada usando um calorímetro VP-Capillary DSC (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EUA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi obtida como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento das soluções de enzima (aprox. 0,5 mg/mL) em tampão (Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 9) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hora. Soluções de amostra e de referência (aprox. 0,2 mL) são carregadas no calorímetro (referência: tampão sem enzima) das condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas por 20 minutos a 20 °C antes da varredura DSC de 20 °C a 100 °C. A temperatura de desnaturação é determinada a uma precisão de +/- 1 °C.[0102] Thermostability determined by differential scanning calorimetry (DSC) is performed using a VP-Capillary DSC calorimeter (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, USA). The thermal denaturation temperature, Td (°C), was obtained as the top of the denaturation peak (main endothermic peak) in thermograms (Cp vs. T) obtained after heating the enzyme solutions (approx. 0.5 mg/mL ) in buffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 9) at a constant programmed heating rate of 200 K/hour. Sample and reference solutions (approx. 0.2 mL) are loaded into the calorimeter (reference: enzyme-free buffer) from storage conditions at 10 °C and thermally pre-equilibrated for 20 minutes at 20 °C prior to DSC scanning. 20°C to 100°C. The denaturation temperature is determined to an accuracy of +/- 1°C.

[0103] Em um aspecto, a variante tem menor propensão à formação de borbotos em comparação com a enzima genitora. A propensão à formação de borbotos pode ser determinada realizando o teste de notas de formação de borbotos como descrito no Exemplo 4.[0103] In one aspect, the variant has a lower propensity to form pills compared to the parent enzyme. The propensity for pilling can be determined by performing the pilling score test as described in Example 4.

Parent cutinases

[0104] A cutinase genitora pode ser (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza, sob condições de baixa estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento de comprimento total; ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.[0104] The parent cutinase can be (a) a polypeptide that has at least 60% sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes, under low stringency conditions, to the coding sequence of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1, or its full-length complement; or (c) a polypeptide encoded by a polynucleotide that has at least 60% sequence identity with the coding sequence of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1.

[0105] Em um aspecto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de cutinase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 20 aminoácidos, por exemplo, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[0105] In one aspect, the parent has a sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 of at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%, which have cutinase activity. In one aspect, the amino acid sequence of the parent differs by up to 20 amino acids, e.g., 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[0106] Em outro aspecto, o genitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o genitor compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 194 de SEQ ID NO: 2.[0106] In another aspect, the parent comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In another aspect, the parent comprises or consists of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2. In another aspect, the parent comprises or consists of amino acids 1 to 194 of SEQ ID NO: 2.

[0107] Em outro aspecto, o genitor é um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 que consiste em ou compreende pelo menos 172 resíduos de aminoácidos (p.ex., correspondendo aos aminoácidos 17 a 188 de SEQ ID NO: 2). Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 172 resíduos de aminoácidos (p.ex., os aminoácidos 17 a 188 de SEQ ID NO: 2) e pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, do número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.[0107] In another aspect, the parent is a fragment of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 that consists of or comprises at least 172 amino acid residues (e.g., corresponding to amino acids 17 to 188 of SEQ ID NO: 2 ). In one aspect, a fragment comprises at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96 %, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of amino acids of SEQ ID NO: 2. In one aspect, a fragment comprises at least 172 amino acid residues ( e.g., amino acids 17 to 188 of SEQ ID NO: 2) and at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, of the number of amino acids of SEQ ID NO: 2.

[0108] Em outro aspecto, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.[0108] In another aspect, the parent is an allelic variant of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

[0109] Em outro aspecto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento de comprimento total (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).[0109] In another aspect, the parent is encoded by a polynucleotide that hybridizes under conditions of very low stringency, conditions of low stringency, conditions of medium stringency, conditions of medium-high stringency, conditions of high stringency, or conditions of very high stringency. stringency with (i) the coding sequence of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1, or its full-length complement (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York) .

[0110] O polinucleotídeo de SEQ ID N°: 1, ou uma subsequência desta, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento desta, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica um genitor de estirpes de gêneros ou espécies diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de Southern blot padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí presente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.[0110] The polynucleotide of SEQ ID NO: 1, or a subsequence thereof, as well as the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof, can be used to design nucleic acid probes to identify and clone DNA encoding a parent of strains of different genera or species according to methods well known in the art. In particular, such probes can be used for hybridization with the genomic DNA or cDNA of a cell of interest, following standard Southern blot procedures, in order to identify and isolate the corresponding gene present there. Such probes may be considerably shorter than the entire sequence, but must be at least 15, for example, at least 25, at least 35, or at least 70 nucleotides in length. Preferably, the nucleic acid probe is at least 100 nucleotides in length, for example, at least 200 nucleotides, at least 300 nucleotides, at least 400 nucleotides, at least 500 nucleotides, at least 600 nucleotides, at least 700 nucleotides, at least 800 nucleotides, or at least 900 nucleotides in length. Both DNA and RNA probes can be used. Probes are typically labeled to detect the corresponding gene (e.g., with 32P, 3H, 35S, biotin, or avidin). Such probes are encompassed by the present invention.

[0111] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibridiza com SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta, o material transportador é usado em um Southern blot.[0111] A library of genomic DNA or cDNA prepared from such other strains can be screened for DNA that hybridizes to the probes described above and encodes a parent. Genomic or other DNA from such other strains can be separated by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or other separation techniques. DNA from libraries or separated DNA can be transferred and immobilized on nitrocellulose or other suitable carrier material. In order to identify a clone or DNA that hybridizes to SEQ ID NO: 1 or a subsequence thereof, the carrier material is used in a Southern blot.

[0112] Para propósitos da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) o seu complemento de comprimento total; ou (iv) uma subsequência da mesma; sob condições de muito baixa até muito alta estringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nessas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.[0112] For purposes of the present invention, hybridization indicates that the polynucleotide hybridizes with a labeled nucleic acid probe corresponding to (i) SEQ ID NO: 1; (ii) the coding sequence of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1; (iii) its full-length complement; or (iv) a subsequence thereof; under conditions of very low to very high stringency. Molecules to which the nucleic acid probe hybridizes under these conditions can be detected using, for example, X-ray film or any other detection means known in the art.

[0113] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 106 a 687 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; o seu polipeptídeo maduro; ou um fragmento do mesmo. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1.[0113] In one aspect, the nucleic acid probe is the coding sequence of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1. In another aspect, the nucleic acid probe corresponds to nucleotides 106 to 687 of SEQ ID NO: 1. In another aspect, the nucleic acid probe is a polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2; its mature polypeptide; or a fragment thereof. In another aspect, the nucleic acid probe is SEQ ID NO: 1.

[0114] Em um aspecto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.[0114] In one aspect, the parent is encoded by a polynucleotide that has a sequence identity to the coding sequence of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1 of at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%.

[0115] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.[0115] The polypeptide may be a hybrid polypeptide in which a region of one polypeptide is fused to the N-terminus or C-terminus of a region of another polypeptide.

[0116] O genitor pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem a ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos de modo que fiquem na mesma fase de leitura e a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão após a tradução (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).[0116] The parent may be a fusion polypeptide or cleavable fusion polypeptide to which another polypeptide is fused at the N-terminus or C-terminus of the polypeptide of the present invention. A fusion polypeptide is produced by fusing a polynucleotide encoding another polypeptide to a polynucleotide of the present invention. Techniques for producing fusion polypeptides are known in the art, and include ligation of the coding sequences encoding the polypeptides so that they are in the same reading frame and expression of the fusion polypeptide is under the control of the same(s). ) promoter(s) and terminator. Fusion polypeptides can also be constructed using intein technology in which fusion polypeptides are created post-translationally (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776- 779).

[0117] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, sítios divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.[0117] A fusion polypeptide may additionally comprise a cleavage site between the two polypeptides. After secretion of the fusion protein, the site is cleaved releasing the two polypeptides. Examples of cleavage sites include, but are not limited to, the sites disclosed in Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0118] O genitor pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o genitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o genitor é secretado extracelularmente.[0118] The parent can be obtained from microorganisms of any gender. For purposes of the present invention, the term "obtained from" as used herein in connection with a given source shall mean that the parent encoded by a polynucleotide is produced by the source or by a strain into which the source polynucleotide was inserted. In one aspect, the parent is secreted extracellularly.

[0119] O genitor pode ser uma cutinase bacteriana. Por exemplo, o genitor pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram- positiva, tal como uma cutinase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces, ou um polipeptídeo de bactéria Gram-negativa, tal como uma cutinase de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.[0119] The parent may be a bacterial cutinase. For example, the parent may be a polypeptide from Gram-positive bacteria, such as a cutinase from Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, or Streptomyces, or a polypeptide from Gram-negative bacteria, such as a cutinase from Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, or Ureaplasma.

[0120] Em um aspecto, o genitor é uma cutinase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.[0120] In one aspect, the parent is a cutinase from Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, or Bacillus thuringiensis.

[0121] Em outro aspecto, o genitor é uma cutinase de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.[0121] In another aspect, the parent is a cutinase from Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, or Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0122] Em outro aspecto, o genitor é uma cutinase de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.[0122] In another aspect, the parent is a cutinase from Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, or Streptomyces lividans.

[0123] O genitor pode ser uma cutinase fúngica. Por exemplo, o genitor pode ser uma cutinase de levedura, tal como uma cutinase de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou uma cutinase de fungo filamentoso, tal como uma cutinase de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.[0123] The parent may be a fungal cutinase. For example, the parent may be a yeast cutinase, such as a cutinase from Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, or Yarrowia; or a filamentous fungal cutinase, such as a cutinase from Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, S cytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, or Xylaria.

[0124] Em outro aspecto, o genitor é uma cutinase de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.[0124] In another aspect, the parent is a cutinase from Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, or Saccharomyces oviformis.

[0125] Em outro aspecto, o genitor é uma cutinase de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.[0125] In another aspect, the parent is a cutinase from Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysospor ium lucknowense, Chrysosporium shitarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusa rium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phan erochaete chrysosporium, Thielavia achromatica , Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei , or Trichoderma viride.

[0126] Em outro aspecto, o genitor é uma cutinase de Humicola insolens, ou a cutinase de SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o genitor pode ser uma estirpe de Rhizoctonia, por exemplo, R. solani, ou uma estirpe de Alternaria, por exemplo, A. brassicicola (WO94/03578). A enzima cutinase pode ser também uma variante de uma cutinase genitora tal como aquelas descritas em WO00/34450, ou WO01/92502.[0126] In another aspect, the parent is a cutinase from Humicola insolens, or the cutinase of SEQ ID NO: 2 or its mature polypeptide. In another aspect, the parent may be a strain of Rhizoctonia, for example R. solani, or a strain of Alternaria, for example A. brassicicola (WO94/03578). The cutinase enzyme may also be a variant of a parent cutinase such as those described in WO00/34450, or WO01/92502.

[0127] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.[0127] It will be understood that, for the above-mentioned species, the invention encompasses both perfect and imperfect states, and other taxonomic equivalents, for example, anamorphs, regardless of the name of the species by which they are known. Those skilled in the art will readily recognize the identity of suitable equivalents.

[0128] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).[0128] Strains of these species are readily accessible to the public in a number of culture collections, such as the American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), and Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0129] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica um genitor pode então ser obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo que codifica um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Preparação de Variantes[0129] The parent can be identified and obtained from other sources, including microorganisms isolated from nature (e.g., soil, fertilizers, water, etc.) or DNA samples obtained directly from natural materials (e.g., soil , fertilizers, water, etc.) using the probes mentioned above. Techniques for isolating microorganisms and DNA directly from natural habitats are well known in the art. A polynucleotide encoding a parent can then be obtained by similar screening of a library of genomic DNA or cDNA from another microorganism or mixed DNA sample. Once a polynucleotide encoding a parent with the probe(s) has been detected, the polynucleotide can be isolated or cloned using techniques that are known to those skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., 1989, supra). . Variant Preparation

[0130] A presente invenção se refere também a métodos para obter uma variante que tem atividade de cutinase, compreendendo: (a) introduzir em uma cutinase genitora uma alteração em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 181, 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79, ou 5 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a alteração é uma substituição para as posições 181, 115, 161, 43, 55, 79, e 5, e uma deleção para as posições 1, 2 e 182, em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem atividade de cutinase; e (b) recuperar a variante.[0130] The present invention also relates to methods for obtaining a variant that has cutinase activity, comprising: (a) introducing into a parent cutinase a change in one or more (e.g., several) positions corresponding to positions 181 , 182, 115, 161, 1, 2, 43, 55, 79, or 5 of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, wherein the change is a substitution for positions 181, 115, 161, 43, 55, 79 , and 5, and a deletion for positions 1, 2 and 182, of which the variant is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96% , at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100%, sequence identity with the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, and wherein the variant has cutinase activity; and (b) retrieve the variant.

[0131] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção genética sintética, construção genética semissintética, mutagênese aleatória, rearranjo, etc.[0131] Variants can be prepared using any mutagenesis procedure known in the art, such as site-directed mutagenesis, synthetic genetic construction, semi-synthetic genetic construction, random mutagenesis, rearrangement, etc.

[0132] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (p.ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo que codifica o genitor.[0132] Site-directed mutagenesis is a technique in which one or more (e.g., several) mutations are introduced into one or more defined sites in a polynucleotide encoding the parent.

[0133] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores oligonucleotídicos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo que codifica o genitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Normalmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e do inserto se liguem entre si. Ver, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.[0133] Site-directed mutagenesis can be achieved in vitro by PCR involving the use of oligonucleotide primers containing the desired mutation. Site-directed mutagenesis can also be carried out in vitro by cassette mutagenesis involving cleavage by a restriction enzyme at a site on the plasmid comprising a polynucleotide encoding the parent and subsequent ligation of an oligonucleotide containing the mutation in the polynucleotide. Typically, the restriction enzyme that digests the plasmid and oligonucleotide is the same, allowing the sticky ends of the plasmid and insert to ligate together. See, for example, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. academic Sci. USA 76: 4949-4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0134] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, US2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.[0134] Site-directed mutagenesis can also be achieved in vivo by methods known in the art. See, for example, US2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; and Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[0135] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio-dirigida na presente invenção. Existem muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.[0135] Any site-directed mutagenesis procedure can be used in the present invention. There are many commercial kits available that can be used to prepare variants.

[0136] A construção de genes sintéticos implica síntese in vitro de uma molécula polinucleotídica desenhada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese genética pode ser realizada usando várias técnicas, como a tecnologia baseada em microchip multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.[0136] The construction of synthetic genes involves in vitro synthesis of a polynucleotide molecule designed to encode a polypeptide of interest. Gene synthesis can be performed using various techniques, such as the multiplex microchip-based technology described by Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) and similar technologies in which oligonucleotides are synthesized and assembled into photoprogrammable microfluidic chips.

[0137] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou rearranjo, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413; ou WO95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US5223409; WO92/06204) e mutagênese região-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).[0137] Single or multiple amino acid substitutions, deletions, and/or insertions can be made and tested using known methods of mutagenesis, recombination, and/or rearrangement, followed by a relevant screening procedure, such as those disclosed by Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. academic Sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413; or WO95/22625. Other methods that can be used include error-prone PCR, phage display (e.g., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US5223409; WO92/06204), and region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0138] Os métodos de mutagênese/rearranjo podem ser combinados com métodos de rastreamento automatizados, de elevado rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos clonados, que sofreram mutagênese, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA que sofreram mutagênese que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos comuns na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.[0138] Mutagenesis/rearrangement methods can be combined with automated, high-throughput screening methods to detect the activity of cloned, mutagenic polypeptides expressed by host cells (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Mutagenesis-encoding DNA molecules encoding active polypeptides can be recovered from host cells and rapidly sequenced using methods common in the art. These methods allow rapid determination of the importance of individual amino acid residues in a polypeptide.

[0139] A construção genética semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção de genes sintéticos, e/ou mutagênese sítio-dirigida, e/ou mutagênese aleatória, e/ou rearranjo. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio-específicos, enquanto outras regiões ainda podem estar sujeitas a amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. Subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas.[0139] Semi-synthetic genetic construction is achieved by combining aspects of synthetic gene construction, and/or site-directed mutagenesis, and/or random mutagenesis, and/or rearrangement. The semisynthetic construction is typified by a process using polynucleotide fragments that are synthesized, in combination with PCR techniques. Defined regions of genes can thus be synthesized de novo, while other regions can be amplified using site-specific mutagenic primers, while other regions can still be subject to amplification by error-prone PCR or non-error-prone PCR. Polynucleotide subsequences can then be scrambled.

Polynucleotides

[0140] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam uma variante da presente invenção.[0140] The present invention also relates to polynucleotides that encode a variant of the present invention.

Nucleic Acid Constructs

[0141] A presente invenção se refere também a construções de ácidos nucleicos compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada em condições compatíveis com as sequências de controle.[0141] The present invention also relates to nucleic acid constructs comprising a polynucleotide encoding a variant of the present invention operably linked to one or more control sequences that direct the expression of the coding sequence in a suitable host cell under conditions compatible with the control sequences.

[0142] O polinucleotídeo pode ser manipulado de várias formas para proporcionar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão. As técnicas de modificação de polinucleotídeos usando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.[0142] The polynucleotide can be manipulated in various ways to provide expression of a variant. Manipulation of the polynucleotide prior to its insertion into a vector may be desirable or necessary, depending on the expression vector. Techniques for modifying polynucleotides using recombinant DNA methods are well known in the art.

[0143] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.[0143] The control sequence can be a promoter, a polynucleotide that is recognized by a host cell for expression of the polynucleotide. The promoter contains transcriptional control sequences that mediate expression of the variant. The promoter can be any polynucleotide that shows transcriptional activity in the host cell including mutant, truncated, and hybrid promoters, and can be obtained from genes that encode extracellular or intracellular polypeptides homologous or heterologous to the host cell.

[0144] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansacarase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores em tandem são divulgados em WO99/43835.[0144] Examples of promoters suitable for directing the transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a bacterial host cell are the promoters obtained from the alpha-amylase gene (amyQ) of Bacillus amyloliquefaciens, alpha-amylase gene (amyL) of Bacillus licheniformis, penicillinase gene (penP) from Bacillus licheniformis, maltogenic amylase gene (amyM) from Bacillus stearothermophilus, levansucrase gene (sacB) from Bacillus subtilis, xylA and xylB genes from Bacillus subtilis, cryIIIA gene from Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), lac operon from E. coli, trc promoter from E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), agarase gene (dagA) from Streptomyces coelicolor, and prokaryotic beta-lactamase gene (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), as well as the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Additional promoters are described in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra. Examples of tandem promoters are disclosed in WO99/43835.

[0145] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO00/56900), cutinase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa- amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.[0145] Examples of promoters suitable for directing transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a filamentous fungal host cell are the promoters obtained from the acetamidase genes of Aspergillus nidulans, neutral alpha-amylase of Aspergillus niger, stable acid alpha-amylase from Aspergillus niger, glucoamylase (glaA) from Aspergillus niger or Aspergillus awamori, TAKA amylase from Aspergillus oryzae, alkaline protease from Aspergillus oryzae, triose phosphate isomerase from Aspergillus oryzae, trypsin-like protease from Fusarium oxysporum (WO96/00787), Fusarium amyloglucosidase venenatum (WO00/56900), Daria from Fusarium venenatum (WO00/56900), Quinn from Fusarium venenatum (WO00/56900), cutinase from Rhizomucor miehei, aspartic proteinase from Rhizomucor miehei, beta-glucosidase from Trichoderma reesei, cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei , Celobiohydrolase II of Trichoderma Reesii, Endoglucanase I of Trichoderm Reesii, Endoglucanase II of Trichoderm Reesei, Endoglucanase III of Trichoderma Reesei, Endoglucanase IV of Trichoderma Reesei, Endoglucanase V of Trichoderma Reesii, Xilanase I of Trichoderma Reesei, xilana SE II DE TRICHODERMA RESEI, BETA -xylosidase from Trichoderma reesei, as well as the NA2-tpi promoter (a modified promoter from an Aspergillus neutral alpha-amylase gene in which the untranslated leader has been replaced by an untranslated leader from an Aspergillus triose phosphate isomerase gene; non-limiting examples include modified promoters of a neutral alpha-amylase gene from Aspergillus niger in which the untranslated leader has been replaced by an untranslated leader from a triose phosphate isomerase gene from Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae); and their mutant, truncated, and hybrid promoters.

[0146] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.[0146] In a yeast host, useful promoters are obtained from the genes for enolase (ENO-1) of Saccharomyces cerevisiae, galactokinase (GAL1) of Saccharomyces cerevisiae, alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH1, ADH2/GAP) from Saccharomyces cerevisiae, triose phosphate isomerase (TPI) from Saccharomyces cerevisiae, metallothionein (CUP1) from Saccharomyces cerevisiae, and 3-phosphoglycerate kinase from Saccharomyces cerevisiae. Other useful promoters for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0147] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.[0147] The control sequence can also be a transcription terminator, which is recognized by a host cell to terminate transcription. The terminator sequence is operably linked to the 3' terminus of the polynucleotide encoding the variant. Any terminator that is functional in the host cell can be used.

[0148] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.[0148] Preferred terminators for bacterial host cells are obtained from the alkaline protease (aprH) genes of Bacillus clausii, alpha-amylase (amyL) of Bacillus licheniformis, and ribosomal RNA (rrnB) of Escherichia coli.

[0149] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.[0149] Preferred terminators for filamentous fungal host cells are obtained from the genes of anthranilate synthase from Aspergillus nidulans, glucoamylase from Aspergillus niger, alpha-glucosidase from Aspergillus niger, TAKA amylase from Aspergillus oryzae, and trypsin-type protease from Fusarium oxysporum.

[0150] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.[0150] Preferred terminators for yeast host cells are obtained from the enolase genes of Saccharomyces cerevisiae, cytochrome C (CYC1) of Saccharomyces cerevisiae, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae. Other useful terminators for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, supra.

[0151] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.[0151] The control sequence can also be an mRNA stabilizing region downstream of a promoter and upstream of the coding sequence of a gene that increases expression of the gene.

[0152] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).[0152] Examples of suitable mRNA stabilizing regions are obtained from a cryIIIA gene from Bacillus thuringiensis (WO94/25612) and a SP82 gene from Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0153] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.[0153] The control sequence can also be a leader, an untranslated region of an mRNA that is important for translation by the host cell. The leader sequence is operably linked to the 5' terminus of the polynucleotide encoding the variant. Any leader that is functional in the host cell can be used.

[0154] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.[0154] Preferred leaders for filamentous fungal host cells are obtained from the TAKA amylase genes of Aspergillus oryzae and triose phosphate isomerase of Aspergillus nidulans.

[0155] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.[0155] Leaders suitable for yeast host cells are obtained from the enolase genes (ENO-1) of Saccharomyces cerevisiae, 3-phosphoglycerate kinase of Saccharomyces cerevisiae, alpha factor of Saccharomyces cerevisiae, and alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( ADH2/GAP) from Saccharomyces cerevisiae.

[0156] A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência de codificação da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.[0156] The control sequence may also be a polyadenylation sequence, a sequence operably linked to the 3' terminus of the variant's coding sequence and, when transcribed, is recognized by the host cell as a signal to add polyadenosine residues to the transcribed mRNA . Any polyadenylation sequence that is functional in the host cell can be used.

[0157] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.[0157] Preferred polyadenylation sequences for filamentous fungal host cells are obtained from the genes for anthranilate synthase from Aspergillus nidulans, glucoamylase from Aspergillus niger, alpha-glucosidase from Aspergillus niger, TAKA amylase from Aspergillus oryzae, and trypsin-like protease from Fusarium oxysporum.

[0158] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.[0158] Useful polyadenylation sequences for yeast host cells are described by Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15:5983-5990.

[0159] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada na mesma fase de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante de peptídeo sinal estranha pode ser necessária quando a sequência codificante não contiver naturalmente uma sequência codificante de peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.[0159] The control sequence can also be a signal peptide coding region that encodes a signal peptide linked to the N-terminus of a variant and directs the variant to the cell's secretory pathway. The 5' end of the polynucleotide coding sequence may inherently contain a signal peptide coding sequence naturally linked in the same translation reading frame to the segment of the coding sequence encoding the variant. Alternatively, the 5' end of the coding sequence may contain a sequence coding for a signal peptide that is foreign to the coding sequence. A foreign signal peptide coding sequence may be required when the coding sequence does not naturally contain a signal peptide coding sequence. Alternatively, a foreign signal peptide coding sequence may simply replace the natural signal peptide coding sequence in order to enhance secretion of the variant. However, any signal peptide coding sequence that directs the expressed variant to the secretory pathway of a host cell can be used.

[0160] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.[0160] Effective signal peptide coding sequences for bacterial host cells are the signal peptide coding sequences obtained from the genes of maltogenic amylase from Bacillus NCIB 11837, subtilisin from Bacillus licheniformis, beta-lactamase from Bacillus licheniformis, alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus, neutral proteases (nprT, nprS, nprM) from Bacillus stearothermophilus, and prsA from Bacillus subtilis. Additional signal peptides are described by Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0161] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, cutinase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.[0161] Effective signal peptide coding sequences for filamentous fungal host cells are the signal peptide coding sequences obtained from the genes of neutral amylase of Aspergillus niger, glucoamylase of Aspergillus niger, TAKA amylase of Aspergillus oryzae, cellulase of Humicola insolens, endoglucanase V of Humicola insolens, cutinase from Humicola lanuginosa, and aspartic proteinase from Rhizomucor miehei.

[0162] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.[0162] Signal peptides useful for yeast host cells are obtained from the Saccharomyces cerevisiae alpha factor and Saccharomyces cerevisiae invertase genes. Other useful signal peptide coding sequences are described by Romanos et al., 1992, supra.

[0163] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeo que codifica um pró- peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.[0163] The control sequence can also be a pro-peptide coding sequence that encodes a pro-peptide positioned at the N-terminus of a variant. The resulting polypeptide is known as a proenzyme or propolypeptide (or a zymogen in some cases). A propolypeptide is generally inactive and can be converted to an active polypeptide by catalytic or autocatalytic cleavage of the propeptide from the propolypeptide. The propeptide coding sequence can be obtained from the genes for alkaline protease (aprE) from Bacillus subtilis, neutral protease (nprT) from Bacillus subtilis, laccase from Myceliophthora thermophila (WO95/33836), aspartic proteinase from Rhizomucor miehei, and alpha factor of Saccharomyces cerevisiae.

[0164] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró-peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N da variante e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró- peptídeo.[0164] Where signal peptide and pro-peptide sequences are present, the pro-peptide region is positioned adjacent to the N-terminus of the variant and the signal peptide sequence is positioned adjacent to the N-terminus of the pro-peptide sequence.

[0165] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.[0165] It may also be desirable to add regulatory sequences that regulate expression of the variant in relation to host cell growth. Examples of regulatory systems are those that cause gene expression to be turned on or off in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Regulatory systems in prokaryotic systems include the lac, tac, and trp operator systems. In yeast, the ADH2 system or GAL1 system can be used. In filamentous fungi, the glucoamylase promoter from Aspergillus niger, the TAKA alpha-amylase promoter from Aspergillus oryzae, and the glucoamylase promoter from Aspergillus oryzae can be used. Other examples of regulatory sequences are those that allow gene amplification. In eukaryotic systems, these regulatory sequences include the dihydrofolate reductase gene that is amplified in the presence of methotrexate, and the metallothionein genes that are amplified with heavy metals. In these cases, the polynucleotide encoding the variant would be operably linked to the regulatory sequence.

Expression Vectors

[0166] A presente invenção se refere também a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica a variante em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de modo que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.[0166] The present invention also relates to recombinant expression vectors comprising a polynucleotide encoding a variant of the present invention, a promoter, and transcription and translation termination signals. The various nucleotide and control sequences can be joined together to produce a recombinant expression vector that can include one or more convenient restriction sites to allow insertion or substitution of the polynucleotide encoding the variant at such sites. Alternatively, the polynucleotide can be expressed by inserting the polynucleotide or a nucleic acid construct comprising the polynucleotide into an appropriate vector for expression. When creating the expression vector, the coding sequence is located in the vector so that the coding sequence is operatively linked to the appropriate control sequences for expression.

[0167] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.[0167] The recombinant expression vector can be any vector (for example, a plasmid or virus) that can be conveniently subjected to recombinant DNA procedures and can cause expression of the polynucleotide. The choice of vector will typically depend on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector is to be introduced. The vector can be a closed linear or circular plasmid.

[0168] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.[0168] The vector may be an autonomously replicating vector, that is, a vector that exists as an extrachromosomal entity, whose replication is independent of chromosomal replication, for example, a plasmid, an extrachromosomal element, a minichromosome, or an artificial chromosome . The vector may contain any means to ensure self-replication. Alternatively, the vector may be one that, when introduced into the host cell, is integrated into the genome and replicated together with the chromosome(s) into which it has been integrated. Additionally, a single vector or plasmid or two or more vectors or plasmids may be used that together contain the total DNA to be introduced into the host cell genome, or a transposon.

[0169] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.[0169] The vector preferably contains one or more selectable markers that allow easy selection of transformed, transfected, transduced, or similar cells. A selectable marker is a gene whose product provides biocidal or viral resistance, resistance to heavy metals, prototrophy to auxotrophs, and the like.

[0170] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.[0170] Examples of bacterial selectable markers are dal genes from Bacillus licheniformis or Bacillus subtilis, or markers that confer resistance to antibiotics such as resistance to ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, neomycin, spectinomycin, or tetracycline. Suitable markers for yeast host cells include, but are not limited to, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, and URA3. Selectable markers for use in a filamentous fungal host cell include, but are not limited to, amdS (acetamidase), argB (ornithine carbamoyltransferase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hph (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase), pyrG (orotidine -5'-phosphate decarboxylase), sC (sulfate adenyltransferase), and trpC (anthranilate synthase), as well as their equivalents. Preferred for use in an Aspergillus cell are amdS and pyrG genes from Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae and a bar gene from Streptomyces hygroscopicus.

[0171] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.[0171] The vector preferably contains an element(s) that allows integration of the vector into the host cell genome or autonomous replication of the vector in the cell independently of the genome.

[0172] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo que codifica a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) específico(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local específico, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.[0172] For integration into the host cell genome, the vector may be based on the polynucleotide sequence encoding the variant or any other element of the vector for integration into the genome by homologous or non-homologous recombination. Alternatively, the vector may contain additional polynucleotides for directing integration by homologous recombination into the host cell genome at a specific location(s) on the chromosome(s). To increase the probability of integration at a specific site, the integration elements must contain a sufficient number of nucleic acids, such as 100 to 10,000 base pairs, 400 to 10,000 base pairs, and 800 to 10,000 base pairs, which have a high degree of sequence identity with the corresponding target sequence to enhance the likelihood of homologous recombination. The integration elements can be any sequence that is homologous to the target sequence in the host cell genome. Furthermore, the integration elements can be non-coding or coding polynucleotides. On the other hand, the vector can be integrated into the host cell genome by non-homologous recombination.

[0173] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.[0173] For autonomous replication, the vector may additionally comprise an origin of replication allowing the vector to replicate autonomously in the host cell in question. The origin of replication can be any plasmid replicator mediating autonomous replication that functions in a cell. The term "origin of replication" or "plasmid replicator" means a polynucleotide that allows a plasmid or vector to replicate in vivo.

[0174] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.[0174] Examples of bacterial replication origins are the replication origins of plasmids pBR322, pUC19, pACYC177 and pACYC184 allowing replication in E. coli, and pUB110, pE194, pTA1060 and pAMβl allowing replication in Bacillus.

[0175] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.[0175] Examples of origins of replication for use in a yeast host cell are the 2 micron origin of replication, ARS1, ARS4, the combination of ARS1 and CEN3, and the combination of ARS4 and CEN6.

[0176] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.[0176] Examples of useful replication origins in a filamentous fungal cell are AMA1 and ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO00/24883). Isolation of the AMA1 gene and construction of plasmids or vectors comprising the gene can be achieved in accordance with the methods disclosed in WO 00/24883.

[0177] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.[0177] More than one copy of a polynucleotide of the present invention can be inserted into a host cell to increase the production of a variant. An increase in the number of copies of the polynucleotide can be obtained by integrating at least one additional copy of the sequence into the host cell genome or by including an amplifiable selectable marker gene with the polynucleotide where cells containing amplified copies of the selectable marker gene, and thereof additional copies of the polynucleotide can be selected by culturing the cells in the presence of the appropriate selectable agent.

[0178] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos do perito na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).[0178] The procedures used to link the elements described above to construct the recombinant expression vectors of the present invention are well known to those skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., 1989, supra).

Host Cells

[0179] A presente invenção se refere também a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Uma construção ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de forma que a construção ou vetor seja mantido como integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica a variante e sua fonte.[0179] The present invention also relates to recombinant host cells, comprising a polynucleotide encoding a variant of the present invention operably linked to one or more control sequences that direct the production of a variant of the present invention. A construct or vector comprising a polynucleotide is introduced into a host cell so that the construct or vector is maintained as a chromosomal integrant or as a self-replicating extrachromosomal vector as previously described. The term "host cell" encompasses any offspring of a parent cell that is not identical to the parent cell due to mutations that occur during replication. The choice of a host cell will largely depend on the gene encoding the variant and its source.

[0180] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.[0180] The host cell can be any cell useful in the recombinant production of a variant, for example, a prokaryote or a eukaryote.

[0181] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.[0181] The prokaryotic host cell can be any Gram-positive or Gram-negative bacteria. Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, and Streptomyces. Gram-negative bacteria include, but are not limited to, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, and Ureaplasma.

[0182] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.[0182] The bacterial host cell can be any Bacillus cell including, but not limited to, cells of Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringiensis.

[0183] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.[0183] The bacterial host cell can also be any Streptococcus cell including, but not limited to, cells of Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, and Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0184] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces, incluindo mas não se limitando a células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.[0184] The bacterial host cell can also be any Streptomyces cell, including but not limited to cells of Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, and Streptomyces lividans.

[0185] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p. ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira.[0185] The introduction of DNA into a Bacillus cell can be carried out by transformation of protoplasts (see, e.g., Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformation of competent cells (see, e.g., Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporation (see, e.g., Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), or conjugation (see, e.g., Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). The introduction of DNA into an E. coli cell can be effected by protoplast transformation (see, e.g., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) or electroporation (see, e.g. ., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). The introduction of DNA into a Streptomyces cell can be effected by protoplast transformation, electroporation (see, for example, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugation (see, e.g. e.g., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), or transduction (see, e.g., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289 -6294). The introduction of DNA into a Pseudomonas cell can be effected by electroporation (see, e.g., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), or conjugation (see, e.g., Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). The introduction of DNA into a Streptococcus cell can be effected by natural competence (see, e.g., Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), protoplast transformation (see, e.g., , Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporation (see, e.g., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), or conjugation (see, p. e.g., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). However, any method known in the art to introduce DNA into a host cell can be used.

[0186] A célula hospedeira pode ser também um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.[0186] The host cell can also be a eukaryote, such as a mammalian, insect, plant, or fungal cell.

[0187] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).[0187] The host cell may be a fungal cell. "Fungi" as used herein include the phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, and Zygomycota as well as the Oomycota and all mitosporic fungi (as defined by Hawksworth et al., in, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

[0188] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N.° 9, 1980).[0188] The fungal host cell can be a yeast cell. "Yeast" as used herein includes ascosporogenic yeast (Endomycetales), basidiosporogenic yeast, and yeast belonging to the Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Since the classification of yeast may change in the future, for the purposes of this invention, yeast should be defined as described in Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N .° 9, 1980).

[0189] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.[0189] The yeast host cell may be a cell of Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, or Yarrowia, such as a cell of Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluy see, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, or Yarrowia lipolytica.

[0190] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucano, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.[0190] The fungal host cell may be a filamentous fungal cell. "Filamentous fungi" include all filamentous forms of the subdivision Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth et al., 1995, supra). Filamentous fungi are generally characterized by a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan, and other complex polysaccharides. Vegetative growth is by elongation of hyphae and carbon catabolism is necessarily aerobic. In contrast, vegetative growth by yeasts such as Saccharomyces cerevisiae is by flowering of a unicellular thallus and carbon catabolism can be fermentative.

[0191] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.[0191] The filamentous fungal host cell may be a cell of Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium , Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, or Trichoderma.

[0192] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.[0192] For example, the filamentous fungal host cell may be a cell of Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescen s, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium medorium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus cinereus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, or Trichoderma viride .

[0193] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920. Métodos de Produção[0193] Fungal cells can be transformed by a process involving protoplast formation, protoplast transformation, and cell wall regeneration in a manner known per se. Suitable procedures for the transformation of Aspergillus and Trichoderma host cells are described in EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. academic Sci. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Suitable methods for transforming Fusarium species are described by Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, and WO96/00787. Yeast can be transformed using the procedures described by Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. academic Sci. USA 75: 1920. Production Methods

[0194] A presente invenção se refere também a métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperar a variante.[0194] The present invention also relates to methods of producing a variant, comprising: (a) cultivating a host cell of the present invention under conditions suitable for expression of the variant; and (b) retrieve the variant.

[0195] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido), em fermentadores de laboratório ou industriais, realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo é realizado com um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada de lisados celulares.[0195] The host cells are cultivated in a nutrient medium suitable for producing the variant using methods known in the art. For example, the cell may be grown by shake flask cultivation, or small-scale or large-scale fermentation (including continuous, batch, fed-batch, or solid-state fermentations), in laboratory or industrial fermentors, carried out in a suitable medium. and under conditions allowing the variant to be expressed and/or isolated. Cultivation is carried out with a suitable nutrient medium comprising carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using procedures known in the art. Suitable media are available from commercial suppliers or can be prepared according to published compositions (e.g., in American Type Culture Collection catalogs). If the variant is secreted into the nutrient medium, the variant can be recovered directly from the medium. If the variant is not secreted it can be recovered from cell lysates.

[0196] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto enzimático, ou desaparecimento de um substrato enzimático. Por exemplo, pode ser usado um ensaio enzimático para determinar a atividade da variante. A atividade de cutinase pode ser determinada como a atividade hidrolítica contra o substrato BETEB como descrito no exemplo 3.[0196] The variant can be detected using methods known in the art that are specific to the variants. These detection methods include, but are not limited to, use of specific antibodies, formation of an enzyme product, or disappearance of an enzyme substrate. For example, an enzyme assay may be used to determine the activity of the variant. The cutinase activity can be determined as the hydrolytic activity against the BETEB substrate as described in example 3.

[0197] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.[0197] The variant can be recovered using methods known in the art. For example, the variant can be recovered from the nutrient medium by conventional procedures including, but not limited to, collection, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or precipitation.

[0198] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.[0198] The variant can be purified by a variety of procedures known in the art, including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromatofocusing, and size exclusion), electrophoretic procedures ( e.g., preparative isoelectric focusing), differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation), SDS-PAGE, or extraction (see, e.g., Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers , New York, 1989) to obtain substantially pure variants.

[0199] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante.[0199] In an alternative aspect, the variant is not recovered, but instead a host cell of the present invention expressing the variant is used as a source of the variant.

Compositions

[0200] Em alguns aspectos, a invenção se refere também a composições compreendendo uma ou mais (p.ex., várias) das variantes.[0200] In some aspects, the invention also relates to compositions comprising one or more (e.g., several) of the variants.

Uses

[0201] A variante de cutinase da invenção pode ser usada, por exemplo, para a hidrólise enzimática de oligômeros cíclicos de poli(tereftalato de etileno), tais como o tri(tereftalato de etileno) cíclico, abreviado como c3ET. Podem ser usadas para remover tais oligômeros cíclicos de tecido ou fio contendo poliéster por tratamento do tecido ou fio com a variante de cutinase, opcionalmente seguido por lavagem do tecido ou fio com uma solução aquosa com um pH na faixa de pH 7 a pH 11. O tratamento do poliéster é convenientemente realizado acima da temperatura de transição vítrea do c3ET (cerca de 55 °C) e abaixo da temperatura de transição vítrea do poliéster (cerca de 70 °C). Assim, o tratamento pode ser apropriadamente realizado a uma temperatura de 50 a 100 °C, 50 a 95, 50 a 90 °C, 50 a 85 °C, 50 a 80 °C, ou 60 a 75 °C. O processo pode ser realizado analogamente a WO97/27237.[0201] The cutinase variant of the invention can be used, for example, for the enzymatic hydrolysis of cyclic poly(ethylene terephthalate) oligomers, such as cyclic tri(ethylene terephthalate), abbreviated as c3ET. They can be used to remove such cyclic oligomers from polyester-containing fabric or yarn by treating the fabric or yarn with the cutinase variant, optionally followed by washing the fabric or yarn with an aqueous solution having a pH in the range of pH 7 to pH 11. The treatment of polyester is conveniently carried out above the glass transition temperature of c3ET (about 55 °C) and below the glass transition temperature of polyester (about 70 °C). Thus, the treatment may suitably be carried out at a temperature of 50 to 100 °C, 50 to 95, 50 to 90 °C, 50 to 85 °C, 50 to 80 °C, or 60 to 75 °C. The process can be carried out analogously to WO97/27237.

[0202] A variante de cutinase pode ser usada para tratar têxtil/tecido que consiste de ou compreende poliéster, como, por exemplo, PET (polímero de etilenoglicol e ácido tereftálico), P3GT (polímero de 1,3-propanodiol e ácido tereftálico) ou quaisquer de suas misturas. Tais misturas de poliéster podem compreender, por exemplo, algodão (misturas de poliéster e algodão) e/ou outras fibras adequadas. O tratamento pode proporcionar benefícios ao têxtil/tecido que consiste de ou compreende poliéster, tais como redução da propensão à formação de borbotos.[0202] The cutinase variant can be used to treat textile/fabric consisting of or comprising polyester, such as, for example, PET (polymer of ethylene glycol and terephthalic acid), P3GT (polymer of 1,3-propanediol and terephthalic acid) or any of their mixtures. Such polyester blends may comprise, for example, cotton (blends of polyester and cotton) and/or other suitable fibers. The treatment may provide benefits to the textile/fabric consisting of or comprising polyester, such as reducing the propensity for pilling.

[0203] A variante de cutinase pode ser usada para melhorar o acabamento funcional de um fio ou tecido contendo PET por tratamento com a variante de cutinase, seguido por tratamento com um agente de acabamento tal como um amaciante, uma resina anti-rugas, um agente antiestático, um agente anti- sujeira ou agentes para proporcionar efeitos de ausência de rugas, prensagem permanente ou resistência à chama. O tratamento com a variante de cutinase pode aumentar o número de grupos funcionais na superfície, e isso pode ser usado para fixar o acabamento funcional. Exemplos de agentes de acabamento são descritos em "SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN" publicado em 15/10/1998 por Nihon Seni Sentaa KK.[0203] The cutinase variant can be used to improve the functional finish of a PET-containing yarn or fabric by treatment with the cutinase variant, followed by treatment with a finishing agent such as a softener, an anti-crease resin, a antistatic agent, an anti-soil agent or agents to provide wrinkle-free, permanent pressing or flame resistance effects. Treatment with the cutinase variant can increase the number of functional groups on the surface, and this can be used to fix the functional finish. Examples of finishing agents are described in "SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN" published on 15/10/1998 by Nihon Seni Sentaa KK.

[0204] A variante de cutinase pode ser também usada para a degradação e reciclagem de poliéster, como policaprolactona (PCL), poli-etilenoglicol-tereftalato (PET), ácido polilático, poli(succinato de butileno) e poli(ácido hidroxibutírico)-co-(ácido hidroxivalérico), por exemplo, filmes e garrafas, por exemplo, como descrito em JP-A 5-344897.[0204] The cutinase variant can also be used for the degradation and recycling of polyester, such as polycaprolactone (PCL), polyethylene glycol terephthalate (PET), polylactic acid, poly(butylene succinate) and poly(hydroxybutyric acid)- co-(hydroxyvaleric acid), for example, films and bottles, for example, as described in JP-A 5-344897.

[0205] Em alguns aspectos, a invenção se refere a um método de modificação de poliéster compreendendo o uso de uma ou mais (p.ex., várias) das variantes.[0205] In some aspects, the invention relates to a polyester modification method comprising the use of one or more (e.g., several) of the variants.

[0206] Em alguns aspectos, a invenção se refere a um método de hidrólise de oligômeros cíclicos de poli(tereftalato de etileno) compreendendo o uso de uma ou mais (p.ex., várias) das variantes.[0206] In some aspects, the invention relates to a method of hydrolysis of cyclic oligomers of poly(ethylene terephthalate) comprising the use of one or more (e.g., several) of the variants.

[0207] Em alguns aspectos, a invenção se refere a um método de modificação de tecido misto de poliéster e algodão compreendendo o uso de uma ou mais da cutinase e celulase.[0207] In some aspects, the invention relates to a method of modifying polyester and cotton mixed fabric comprising the use of one or more of cutinase and cellulase.

[0208] Em alguns aspectos, a invenção se refere a um método de redução da propensão à formação de borbotos de tecidos que compreendem ou consistem de poliéster compreendendo o uso de uma ou mais (p.ex., várias) das variantes. A melhoria da resistência à formação de borbotos pode ser determinada usando o testador de formação de borbotos Martindale (norma suíça SN 198525) como descrito no parágrafo "Materiais e Métodos" abaixo.[0208] In some aspects, the invention relates to a method of reducing the propensity for pilling of fabrics comprising or consisting of polyester comprising the use of one or more (e.g., several) of the variants. Improvement of pilling resistance can be determined using the Martindale pilling tester (Swiss standard SN 198525) as described in the "Materials and Methods" paragraph below.

[0209] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados limitativos do escopo da invenção. Materiais e Métodos[0209] The present invention is further described by the following examples which should not be considered limiting the scope of the invention. Materials and methods

[0210] Salvo indicação em contrário, os materiais são de grau reagente. Tabela 1: Alterações em variantes correspondendo à posição de aminoácido na SEQ ID NO: 2. Exemplo 1: Clonagem e expressão[0210] Unless otherwise indicated, materials are reagent grade. Table 1: Changes in variants corresponding to the amino acid position in SEQ ID NO: 2. Example 1: Cloning and expression

[0211] Variantes foram geradas por mutagênese sítio- dirigida usando um iniciador direto contendo a mutação. A mistura da reação de PCR continha 50 ng do DNA molde; 10 pmol do iniciador mutagênico; 300 umol de dNTPs; 1X de um tampão HF Phusion 5X; MgCl2 0,5 mM; 1 unidade da polimerase Phusion; e até 25 uL de água MilliQ. O ciclo de PCR foi realizado aos 98 °C/2:00min; 18 x (98 °C/1:00min, 62 °C/1:00min, 72 °C/(2*comprimento do plasmídeo em kb) min); 72 °C/20:00min; manter a 4 °C. A temperatura de anelamento foi mudada de acordo com a Tm do iniciador mutagênico usado. A digestão com DpnI foi realizada com 0,5 uL da enzima DpnI adicionada diretamente à mistura da reação de PCR a 37 °C por 6 horas na máquina de PCR.[0211] Variants were generated by site-directed mutagenesis using a forward primer containing the mutation. The PCR reaction mixture contained 50 ng of template DNA; 10 pmol of the mutagenic primer; 300 umol of dNTPs; 1X of a Phusion 5X HF buffer; MgCl2 0.5 mM; 1 unit of Phusion polymerase; and up to 25 uL of MilliQ water. The PCR cycle was performed at 98 °C/2:00 min; 18 x (98 °C/1:00min, 62 °C/1:00min, 72 °C/(2*plasmid length in kb) min); 72°C/20:00min; keep at 4°C. The annealing temperature was changed according to the Tm of the mutagenic primer used. DpnI digestion was performed with 0.5 uL of DpnI enzyme added directly to the PCR reaction mixture at 37 °C for 6 hours in the PCR machine.

[0212] Células DH5α de E.coli quimicamente competentes foram diretamente transformadas com 5,0 uL da mistura reacional. 2 a 6 colônias foram inoculadas para o isolamento de plasmídeo e a sequência de DNA plasmidial foi confirmada quanto à incorporação da mutação desejada.[0212] Chemically competent E.coli DH5α cells were directly transformed with 5.0 uL of the reaction mixture. 2 to 6 colonies were inoculated for plasmid isolation and the plasmid DNA sequence was confirmed for incorporation of the desired mutation.

[0213] O DNA plasmidial confirmado como tendo a mutação desejada foi então transformado em Aspergillus oryzae e as colônias obtidas foram rastreadas para a expressão proteica em pequena escala (2 mL em placas de 24 poços).[0213] Plasmid DNA confirmed to have the desired mutation was then transformed into Aspergillus oryzae and the colonies obtained were screened for protein expression on a small scale (2 mL in 24-well plates).

Small scale expression:

[0214] Suspensão para esporos (0,2 g de ágar (RM026, HiMedia); 0,05 g de Tween20 (P9416, Sigma); e água até 100 mL foram autoclavados e dispensados em tubos Nunc de 1 mL).[0214] Spore suspension (0.2 g agar (RM026, HiMedia); 0.05 g Tween20 (P9416, Sigma); and water up to 100 mL were autoclaved and dispensed into 1 mL Nunc tubes).

[0215] Meio YPM (10 g de extrato de levedura (RM027, HiMedia); 20 g de peptona - (RM001, HiMedia); e água até 1000 mL; Maltose (RM3050, HiMedia) de uma solução estoque a 20% foi adicionada após autoclavagem até uma concentração final de 2%).[0215] YPM Medium (10 g yeast extract (RM027, HiMedia); 20 g peptone - (RM001, HiMedia); and water up to 1000 mL; Maltose (RM3050, HiMedia) from a 20% stock solution was added after autoclaving to a final concentration of 2%).

[0216] Esporos de colônias transformadas foram transferidos da placa de ágar usando uma alça de inoculação e a suspensão para esporos e inoculados em 2 mL de meio YPM em placas de cultura de 12 poços ou 24 poços. As placas foram incubadas a 34 °C sem agitação sob condições úmidas durante 3 dias. A camada de micélios que se formou na superfície do meio foi removida e o meio de cultura foi analisado por SDS-PAGE e um ensaio de atividade.[0216] Spores from transformed colonies were transferred from the agar plate using an inoculation loop and the spore suspension and inoculated into 2 mL of YPM medium in 12-well or 24-well culture plates. The plates were incubated at 34°C without shaking under humid conditions for 3 days. The layer of mycelia that formed on the surface of the medium was removed and the culture medium was analyzed by SDS-PAGE and an activity assay.

[0217] Alíquotas de 40 uL foram misturadas com 10 uL de tampão de amostra para SDS ("SDS loading dye"), aquecidas a 100 °C durante 10 minutos e aplicadas em um gel de agarose a 12% e subsequentemente coradas com azul de Coomassie. As colônias com a melhor expressão foram semeadas por esgotamento em ágar COVE-N inclinado para fermentação em frascos de agitação.[0217] Aliquots of 40 uL were mixed with 10 uL of SDS sample buffer ("SDS loading dye"), heated at 100 ° C for 10 minutes and applied to a 12% agarose gel and subsequently stained with blue. Coomassie. Colonies with the best expression were plated by depletion on COVE-N agar slanted for fermentation in shake flasks.

Fermentation in shake flasks:

[0218] Meio G2-Gly (18 g de extrato de levedura (RM027, HiMedia); 24,0 g de glicerol (87%, 10409405001730, Merck); 1,0 mL de Dowfax 63N10 (Novozymes); e volume para 1000 mL de água submetida a troca iônica).[0218] G2-Gly Medium (18 g yeast extract (RM027, HiMedia); 24.0 g glycerol (87%, 10409405001730, Merck); 1.0 mL Dowfax 63N10 (Novozymes); and volume to 1000 mL of water subjected to ion exchange).

[0219] Meio MDU-2BP (45,0 g de maltose (RM3050, HiMedia); 1,0 g de sulfato de magnésio (61777005001730, Merck); 1,0 g de cloreto de sódio (1.93206.0521, Merck); 2,0 g de sulfato de potássio (61777405001730, Merck); 12,0 g de dihidrogenofosfato de potássio (1.93205.0521, Merck); 7,0 g de extrato de levedura (RM027, HiMedia); 0,1 mL de Dowfax 63N10 (Novozymes); 0,5 mL de AMG Spormetal (KU6) (ver abaixo); e volume para 1000 mL de água submetida a troca iônica).[0219] MDU-2BP Medium (45.0 g of maltose (RM3050, HiMedia); 1.0 g of magnesium sulfate (61777005001730, Merck); 1.0 g of sodium chloride (1.93206.0521, Merck); 2.0 g potassium sulfate (61777405001730, Merck); 12.0 g potassium dihydrogen phosphate (1.93205.0521, Merck); 7.0 g yeast extract (RM027, HiMedia); 0.1 mL Dowfax 63N10 (Novozymes); 0.5 mL of AMG Spormetal (KU6) (see below); and volume to 1000 mL of water subjected to ion exchange).

[0220] AMG Spormetal (KU6) (6,8 g de cloreto de zinco (61752905001046, Merck); 2,5 g de sulfato de cobre (61775905001730, Merck); 0,13 g de cloreto de níquel anidro (8067220100, Merck); 13,9 g de sulfato de ferro (61751005001730, Merck); 8,45 g de sulfato de manganês (61754805001730, Merck); 3 g de ácido cítrico (60024205001730, Merck); e volume para 1000 mL de água submetida a troca iônica)[0220] AMG Spormetal (KU6) (6.8 g zinc chloride (61752905001046, Merck); 2.5 g copper sulfate (61775905001730, Merck); 0.13 g anhydrous nickel chloride (8067220100, Merck ); 13.9 g of iron sulfate (61751005001730, Merck); 8.45 g of manganese sulfate (61754805001730, Merck); 3 g of citric acid (60024205001730, Merck); and volume for 1000 mL of water subjected to ion exchange)

[0221] Aproximadamente 5 mL de meio G2-Gly em frascos com defletores (200 mL de meio em frascos de 500 mL) foram despejados em tubos com meio sólido inclinado com esporos da dada variante. Os esporos foram raspados do meio sólido inclinado usando uma alça de inoculação e ressuspendidos no meio, o qual foi retornado aos frascos com o resto do meio. Os frascos foram cobertos com uma camada espessa de tecido do tipo Mira e papel e incubados a 34 °C durante 24 horas a 180 rpm. Após crescimento ao longo da noite, 2 a 5 mL da cultura G2-Gly foram inoculados em 300 mL de meio MDU-2BP em frascos com defletores de 1 L. Adicionou-se ureia a 50% ao meio MDU- 2BP autoclavado até uma concentração final de 0,5% antes da inoculação. Os frascos foram incubados a 34 °C a 180 rpm durante 72 horas. Após 72 horas de crescimento, os sobrenadantes foram analisados em SDS-PAGE a 12% para expressão. Assim que o SDS-PAGE mostrou expressão da proteína desejada, o caldo de fermentação foi encaminhado para purificação. Exemplo 2: Purificação[0221] Approximately 5 mL of G2-Gly medium in baffled flasks (200 mL of medium in 500 mL flasks) was poured into tubes with solid medium slanted with spores of the given variant. Spores were scraped from the slanted solid medium using an inoculating loop and resuspended in the medium, which was returned to the vials with the rest of the medium. The flasks were covered with a thick layer of Mira fabric and paper and incubated at 34°C for 24 hours at 180 rpm. After overnight growth, 2 to 5 mL of the G2-Gly culture were inoculated into 300 mL of MDU-2BP medium in 1 L baffled flasks. 50% urea was added to the autoclaved MDU-2BP medium to a concentration final 0.5% before inoculation. The flasks were incubated at 34°C at 180 rpm for 72 hours. After 72 hours of growth, supernatants were analyzed on 12% SDS-PAGE for expression. As soon as SDS-PAGE showed expression of the desired protein, the fermentation broth was sent for purification. Example 2: Purification

[0222] O caldo de fermentação foi filtrado em um funil de Büchner (145 mm) equipado com um filtro sanduíche de fibra de vidro. O filtro sanduíche consiste de um filtro GF D/ A/ C/ B e F, com o filtro D localizado em cima e o filtro F na base do funil de Büchner. O caldo foi subsequentemente passado por um filtro de fibra oca de 0,2 um fixado em uma máquina QuixStand® da GE com uma pressão transmembrânica mantida a 5 psi.[0222] The fermentation broth was filtered in a Büchner funnel (145 mm) equipped with a fiberglass sandwich filter. The sandwich filter consists of a GF filter D/ A/ C/ B and F, with filter D located on top and filter F at the base of the Büchner funnel. The broth was subsequently passed through a 0.2 µm hollow fiber filter attached to a GE QuixStand® machine with a transmembrane pressure maintained at 5 psi.

[0223] O caldo filtrado estéril foi carregado em uma primeira coluna com uma resina de modo misto HEA-HyperCel® (HEA é hexilamina). A resina foi empacotada em uma coluna de vidro (Kron lab) com um diâmetro de coluna de 15 mm e um leito com altura de 200 mm. O processo de purificação foi automatizado usando o BioRad Duoflow pathfinder20® realizado em etapas sequenciais como delineado abaixo. Todos os volumes, com exceção do volume da amostra, foram 8 a 10x o volume da coluna. [0223] The sterile filtered broth was loaded into a first column with a HEA-HyperCel® mixed mode resin (HEA is hexylamine). The resin was packed in a glass column (Kron lab) with a column diameter of 15 mm and a bed height of 200 mm. The purification process was automated using the BioRad Duoflow pathfinder20® carried out in sequential steps as outlined below. All volumes, with the exception of the sample volume, were 8 to 10x the column volume.

[0224] As frações eluidas da primeira coluna foram combinadas e a condutividade ajustada para 4 mS/cm por diluição desta combinação com tampão acetato de sódio, 50 mM, pH 4,5, antes de ser carregada em uma segunda coluna com uma resina de troca catiônica UnoS® empacotada em uma coluna de vidro (Kron lab) com um diâmetro de coluna de 15 mm e uma altura do leito de 200 mm. O processo de purificação foi automatizado usando o BioRad Duoflow pathfinder20® realizado em etapas sequenciais como delineado abaixo. Todos os volumes, com exceção do volume da amostra, são 8 a 10x o volume da coluna. Cromatografia/Resi na UNO S (resina de troca catiônica) [0224] The fractions eluted from the first column were combined and the conductivity adjusted to 4 mS/cm by diluting this combination with sodium acetate buffer, 50 mM, pH 4.5, before being loaded onto a second column with a sodium acetate resin. UnoS® cation exchange packed in a glass column (Kron lab) with a column diameter of 15 mm and a bed height of 200 mm. The purification process was automated using the BioRad Duoflow pathfinder20® carried out in sequential steps as outlined below. All volumes, with the exception of the sample volume, are 8 to 10x the column volume. Chromatography/Resi at UNO S (cation exchange resin)

[0225] As frações eluidas foram combinadas, analisadas por SDS-PAGE para documentação, medidas a A280, empacotadas e entregues.[0225] The eluted fractions were combined, analyzed by SDS-PAGE for documentation, measured at A280, packaged and delivered.

Large-scale purification

[0226] O caldo de cultura foi centrifugado (20000xg, 20 min) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado do precipitado e filtrado por uma unidade de filtração Nalgene de 0,2 um.[0226] The culture broth was centrifuged (20000xg, 20 min) and the supernatant was carefully decanted from the precipitate and filtered through a 0.2 um Nalgene filtration unit.

[0227] Uma solução de NaCl 5 M foi adicionada ao filtrado de 0,2 um até uma concentração final 1 M de NaCl. A mistura foi aplicada em uma coluna de decilamina-agarose (da Upfront Chromatography) equilibrada em H3BO3/NaOH 40 mM, NaCl 1 M, pH 9,0 e subsequentemente lavada com um volume de 5x o volume da coluna de tampão de equilíbrio e foi eluída de forma escalonada com uma mistura de 70% ( H3BO3/NaOH 50 mM, pH 9,0) e 30% de isopropanol.[0227] A 5 M NaCl solution was added to the 0.2 µm filtrate to a final concentration of 1 M NaCl. The mixture was applied to a decylamine-agarose column (from Upfront Chromatography) equilibrated in 40 mM H3BO3/NaOH, 1 M NaCl, pH 9.0 and subsequently washed with a volume of 5x the column volume of equilibration buffer and was eluted in a stepwise manner with a mixture of 70% (50 mM H3BO3/NaOH, pH 9.0) and 30% isopropanol.

[0228] O pico eluído da etapa de decilamina-agarose foi aplicado a uma coluna de SP-sepharose FF (da GE Healthcare) equilibrada em ácido acético/NaOH 20 mM, pH 5,0. Após lavagem extensa da coluna com o tampão de equilíbrio, a cutinase foi eluída com um gradiente linear entre o tampão de equilíbrio e ácido acético/NaOH 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 5,0 ao longo de 3x o volume da coluna. O pico principal da coluna de SP-sepharose FF contendo a cutinase foi analisado por SDS-PAGE e as frações, quando apenas uma banda era vista no gel SDS-PAGE corado com coomassie, foram combinadas como o produto purificado. Exemplo 3: Atividade de cutinase[0228] The peak eluted from the decylamine-agarose step was applied to a SP-sepharose FF column (from GE Healthcare) equilibrated in acetic acid/20 mM NaOH, pH 5.0. After extensive washing of the column with equilibration buffer, cutinase was eluted with a linear gradient between equilibration buffer and 20 mM acetic acid/NaOH, 1.0 M NaCl, pH 5.0 over 3x column volume. . The main peak of the SP-sepharose FF column containing the cutinase was analyzed by SDS-PAGE and the fractions, when only one band was seen on the coomassie-stained SDS-PAGE gel, were combined as the purified product. Example 3: Cutinase activity

[0229] Para calcular a atividade residual das enzimas genitora e variantes, determinou-se a atividade hidrolítica contra o substrato BETEB (12,5 mg/mL de BETEB; 0,1% de Triton X-100, H2O) em duas temperaturas: a temperatura de 85 °C foi considerada 100% de atividade e de 90 °C foi considerada para mostrar atividade reduzida.[0229] To calculate the residual activity of the parent and variant enzymes, the hydrolytic activity against the substrate BETEB (12.5 mg/mL BETEB; 0.1% Triton X-100, H2O) was determined at two temperatures: temperature of 85°C was considered to show 100% activity and 90°C was considered to show reduced activity.

[0230] Para cada temperatura de teste dois controles (um "branco do substrato" e um "branco da enzima") foram incluídos e testados em condições similares às da amostra de enzima. A amostra de enzima foi preparada misturando 25 uL do sobrenadante de cultura do exemplo 1 (sob) ou enzima purificada do exemplo 2 (pur), 100 uL do substrato e volume para 1 mL de um tampão Britton-Robinson 40 mM pH 7,0 (o tampão Britton- Robinson é uma mistura equimolar de ácido bórico, ácido orto- fosfórico e ácido acético. O pH foi ajustado usando uma solução 5x molar de NaOH). O "branco do substrato" continha 100 uL do substrato e volume para 1 mL de um tampão Britton-Robinson 40 mM pH 7,0. O "branco da enzima" continha 25 uL de sobrenadante de cultura, 100 uL de Triton X-100 a 0,1% e volume para 1 mL de um tampão Britton-Robinson 40 mM pH 7,0. Após incubação a 85 °C ou 90 °C durante 20 minutos a 1000 rpm, as reações foram interrompidas imediatamento colocando as amostras em gelo durante 1 a 5 minutos. Foram subsequentemente centrifugadas a 13000 rpm durante 1 minuto e a absorbância a 254 nm do sobrenadante foi medida.[0230] For each test temperature two controls (a "substrate blank" and an "enzyme blank") were included and tested under conditions similar to those of the enzyme sample. The enzyme sample was prepared by mixing 25 uL of the culture supernatant from example 1 (sob) or purified enzyme from example 2 (pur), 100 uL of the substrate and volume to 1 mL of a 40 mM Britton-Robinson buffer pH 7.0 (Britton-Robinson buffer is an equimolar mixture of boric acid, orthophosphoric acid and acetic acid. The pH was adjusted using a 5x molar NaOH solution). The "substrate blank" contained 100 uL of substrate and volume to 1 mL of a 40 mM Britton-Robinson buffer pH 7.0. The "enzyme blank" contained 25 uL of culture supernatant, 100 uL of 0.1% Triton X-100 and volume to 1 mL of a 40 mM Britton-Robinson buffer pH 7.0. After incubation at 85 °C or 90 °C for 20 minutes at 1000 rpm, the reactions were stopped immediately by placing the samples on ice for 1 to 5 minutes. They were subsequently centrifuged at 13000 rpm for 1 minute and the absorbance at 254 nm of the supernatant was measured.

[0231] A atividade residual melhorada de uma variante em comparação à enzima genitora é expressa como uma %AR relativa maior do que 100. O cálculo da %AR relativa foi realizada de acordo com o seguinte: %AR relativa = (%AR da variante) / (%AR de SEQ ID NO: 2) * 100 Tabela 2: Atividade residual (AR) de variantes de cutinase relativamente a SEQ ID NO: 2 Exemplo 4: Biopolimento com cutinase em Launder-Ometer[0231] The improved residual activity of a variant compared to the parent enzyme is expressed as a relative %AR greater than 100. The calculation of the relative %AR was performed according to the following: relative %AR = (%AR of the variant ) / (%AR of SEQ ID NO: 2) * 100 Table 2: Residual activity (AR) of cutinase variants relative to SEQ ID NO: 2 Example 4: Biopolishing with cutinase in Launder-Ometer

[0232] O biopolimento com cutinase foi realizado em um Launder-OMeter (LOM) LP2 da SDL-Atlas tanto em pequena escala (SSLOM) como em escala completa (FSLOM).[0232] Biopolishing with cutinase was carried out on a Launder-OMeter (LOM) LP2 from SDL-Atlas on both a small scale (SSLOM) and a full scale (FSLOM).

[0233] O tecido foi cortado em pedaços/amostras retangulares de 5x10 cm de cerca de 1 g para SSLOM e 14x14 cm de cerca de 4 a 5 g para FSLOM. O tecido foi fechado lateralmente por costura. Os pedaços foram condicionados em umidade relativa de 65% +/- 5% e 20 oC +/-1 oC durante 24 horas antes de serem numeradas, pesadas por uma balança analítica (para amostras abaixo de 100 g) ou uma balança de precisão (para amostras acima de 100 g) e registradas.[0233] The tissue was cut into rectangular pieces/samples of 5x10 cm of about 1 g for SSLOM and 14x14 cm of about 4 to 5 g for FSLOM. The fabric was closed on the side by sewing. The pieces were conditioned in relative humidity of 65% +/- 5% and 20 oC +/-1 oC for 24 hours before being numbered, weighed by an analytical balance (for samples below 100 g) or a precision balance ( for samples above 100 g) and recorded.

[0234] Um pedaço condicionado foi colocado em cada béquer junto com 10 bolas pequenas de aço resistente a ácido (M6M-SR-A4-80) proporcionando auxílio mecânico. O tampão (tampão Britton-Robinson, pH=8) e as soluções de enzima foram adicionados como indicado nas tabelas com base no cálculo dos pesos dos tecidos reais, com um razão de líquido para tecido v/p de 10:1. No tempo 0 horas, mediram-se a absorbância da DO a 254 nm e o pH inicial da solução.[0234] A conditioned piece was placed in each beaker along with 10 small acid-resistant steel balls (M6M-SR-A4-80) providing mechanical assistance. Buffer (Britton-Robinson buffer, pH=8) and enzyme solutions were added as indicated in the tables based on calculation of actual tissue weights, with a liquid to tissue v/w ratio of 10:1. At time 0 hours, the absorbance of the OD at 254 nm and the initial pH of the solution were measured.

[0235] Cada béquer foi equipado com uma tampa revestida com 2 anéis de vedação de neopreno e fechada firmemente com o dispositivo de grampo de metal. Os béqueres foram carregados no LOM pré-aquecido a 70 oC. Foram usadas prateleiras de metal para acomodar e fixar 5 béqueres, na posição vertical, em cada uma das 4 posições do tambor. A tampa do LOM foi fechada e a lavagem foi conduzida.[0235] Each beaker was equipped with a lid lined with 2 neoprene sealing rings and closed tightly with the metal clamp device. The beakers were loaded into the LOM preheated to 70 oC. Metal shelves were used to accommodate and fix 5 beakers, in a vertical position, in each of the 4 drum positions. The LOM lid was closed and washing was conducted.

[0236] Após 2 horas, os tecidos foram transferidos para uma solução de inativação (carbonato de sódio a 2 g/L) a 95 oC durante 10 minutos e subsequentemente lavados duas vezes em 1 L de água quente seguida por duas vezes em 1 L de água fria. Os tecidos foram secos em um secador (AEG, LAVATHERM 37700, Alemanha) durante 1 hora, após o que foram condicionados como descrito acima antes da avaliação.[0236] After 2 hours, the tissues were transferred to an inactivation solution (2 g/L sodium carbonate) at 95 oC for 10 minutes and subsequently washed twice in 1 L of hot water followed by twice in 1 L of cold water. Tissues were dried in a dryer (AEG, LAVATHERM 37700, Germany) for 1 hour, after which they were conditioned as described above before evaluation.

[0237] O banho de tratamento de cada béquer foi centrifugado a 13000 rpm durante 1 minuto e o pH e a absorbância da DO a 254 nm determinados. A nota de formação de borbotos e perda de peso do tecido foram avaliados.[0237] The treatment bath in each beaker was centrifuged at 13000 rpm for 1 minute and the pH and OD absorbance at 254 nm determined. The pilling score and tissue weight loss were evaluated.

[0238] A proteína enzimática foi medida com o kit de ensaio proteico BCATM (número de produto 23225, comercializado pela Thermo Fisher Scientific Inc.) de acordo com o manual do produto.[0238] Enzyme protein was measured with the BCATM protein assay kit (product number 23225, marketed by Thermo Fisher Scientific Inc.) according to the product manual.

OD absorbance and pH measurement

[0239] A atividade de cutinase foi investigada por hidrólise de PET ou BETEB em tubos de Eppendorf. Os produtos da hidrólise são tereftalato e seus ésteres que possuem picos de absorbância característicos em torno de 254 nm (UV). Portanto, a absorbância da DO a 254 nm (DO254) reflete a atividade hidrolítica das enzimas contra os poliésteres. O aumento da atividade enzimática contra o PET ou BETEB resulta em um aumento da DO254. A DO254 é lida em um leitor de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices, LLC.). Se a absorbância ultrapassar o limite efetivo do leitor de 1,5, a solução será diluída. Uma diluição x15 significa que a solução foi diluída 15 vezes.[0239] Cutinase activity was investigated by hydrolysis of PET or BETEB in Eppendorf tubes. The hydrolysis products are terephthalate and its esters, which have characteristic absorbance peaks around 254 nm (UV). Therefore, the absorbance of OD at 254 nm (OD254) reflects the hydrolytic activity of enzymes against polyesters. Increased enzymatic activity against PET or BETEB results in an increase in OD254. DO254 is read on a SpectraMax M2 microplate reader (Molecular Devices, LLC.). If the absorbance exceeds the reader's effective limit of 1.5, the solution will be diluted. A x15 dilution means the solution has been diluted 15 times.

[0240] O produto tereftalato da hidrólise é ácido e diminuirá o pH da solução. Portanto, a atividade enzimática pode ser observada medindo-se a mudança do pH antes e após a reação.[0240] The terephthalate hydrolysis product is acidic and will lower the pH of the solution. Therefore, enzyme activity can be observed by measuring the change in pH before and after the reaction.

Pilling Note Test

[0241] As amostras incluindo as tratadas e não tratadas que haviam sido pré-condicionados em clima normal (65% de umidade, 20 °C) durante pelo menos 24 horas foram testadas quanto às notas de formação de borbotos com um testador Nu-Martindale (James H. Heal Co. Ltd, Inglaterra) com tecidos não tratados do mesmo tipo como os tecidos desgastados. Um teste de formação de borbotos padrão (norma suíça (SN) 198525) foi realizado após 2000 rotações marcando de 1 a 5, com o significado definido abaixo, onde 1 mostra uma antiformação de borbotos fraca e 5 mostra excelente propriedade antiformação de borbotos. Assim, quanto mais elevadas as notas de formação de borbotos de Martindale pontuam, mais eficaz o tratamento de biopolimento. Nota 5: Nenhuma formação de borbotos Nota 4: Ligeira formação de borbotos Nota 3: Formação moderada de borbotos Nota 2: Formação marcante de borbotos Nota 1: Formação densa de borbotos são permitidas notas 1/2, 1/4.[0241] Samples including treated and untreated samples that had been pre-conditioned in normal climate (65% humidity, 20°C) for at least 24 hours were tested for pilling scores with a Nu-Martindale tester (James H. Heal Co. Ltd, England) with untreated fabrics of the same type as the worn fabrics. A standard pilling test (Swiss standard (SN) 198525) was performed after 2000 rotations scoring from 1 to 5, with the meaning defined below, where 1 shows poor anti-pilling property and 5 shows excellent anti-pilling property. Therefore, the higher the Martindale lint formation scores, the more effective the biopolishing treatment. Note 5: No pilling Note 4: Slight pilling Note 3: Moderate pilling Note 2: Marked pilling Note 1: Dense pilling Notes 1/2, 1/4 are permitted.

[0242] Três leituras separadas foram realizadas por pessoas diferentes para cada amostra, e a média das três leituras foi adotada como o resultado final de notas de formação de borbotos. Tabela 3: Biopolimento de tecido 100% PET estável em SSLOM1 1 SSLOM foi realizado com tecido 100% PET estável (receptivo a corantes catiônicos, CHN-2011-00461) a 70 °C, pH 8,0. 2 A concentração é indicada como mg de proteína enzimática por g de tecido. 3 A variação da nota de formação de borbotos é de cerca de 0,2. Tabela 4: Biopolimento de tecido 100% PET estável em SSLOM1 1 SSLOM foi realizado com tecido 100% PET estável (receptivo a corantes catiônicos, CHN-2011-00461) a 70 °C, pH 8,0. 2 A concentração é indicada como mg de proteína enzimática por g de tecido. 3 A variação da nota de formação de borbotos é de cerca de 0,2. Tabela 5: Biopolimento de tecido 100% PET estável em FSLOM1 Tabela 6: Biopolimento de tecido 100% PET estável em FSLOM1 1 FSLOM foi realizado com tecido 100% PET estável (receptivo a corantes catiônicos, CHN-2011-00461) a 70 °C, pH 8,0. 2 A concentração é indicada como mg de proteína enzimática por g de tecido. 3 A variação da nota de formação de borbotos é de cerca de 0,2. Tabela 7: Biopolimento de vários tecidos mistos de PET e algodão em FSLOM1 1 FSLOM foi realizado com vários tecidos mistos de PET e algodão a 70 °C, pH 8,0. 2 A concentração é indicada como mg de proteína enzimática por g de tecido.[0242] Three separate readings were taken by different people for each sample, and the average of the three readings was adopted as the final result of pilling scores. Table 3: Biopolishing of 100% PET fabric stable in SSLOM1 1 SSLOM was performed with stable 100% PET fabric (receptive to cationic dyes, CHN-2011-00461) at 70 °C, pH 8.0. 2 Concentration is indicated as mg of enzyme protein per g of tissue. 3 The variation of the pilling score is about 0.2. Table 4: Biopolishing of 100% PET fabric stable in SSLOM1 1 SSLOM was performed with stable 100% PET fabric (receptive to cationic dyes, CHN-2011-00461) at 70 °C, pH 8.0. 2 Concentration is indicated as mg of enzyme protein per g of tissue. 3 The variation of the pilling score is about 0.2. Table 5: Biopolishing of 100% PET fabric stable in FSLOM1 Table 6: Biopolishing of 100% PET fabric stable in FSLOM1 1 FSLOM was performed with stable 100% PET fabric (receptive to cationic dyes, CHN-2011-00461) at 70 °C, pH 8.0. 2 Concentration is indicated as mg of enzyme protein per g of tissue. 3 The variation of the pilling score is about 0.2. Table 7: Biopolishing of various PET and cotton blended fabrics in FSLOM1 1 FSLOM was performed with various PET and cotton blended fabrics at 70 °C, pH 8.0. 2 Concentration is indicated as mg of enzyme protein per g of tissue.

[0243] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos se pretendem como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.[0243] The invention described and claimed here is not to be limited in scope by the specific aspects disclosed herein, as these aspects are intended as illustrations of various aspects of the invention. Any equivalent aspects are intended to be within the scope of this invention. In fact, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the above-mentioned description. Such modifications are also intended to be within the scope of the appended claims. In the event of a conflict, this disclosure, including definitions, will control.

Claims

1. Variant with cutinase activity of a parent cutinase, characterized by comprising a change in one or more positions corresponding to positions: 1, 2, 5, 3, 55, 79, 115, 161, 181 or 182 of SEQ ID NO: 2, wherein the change is a substitution for positions 5, 43, 55, 79, 115, 161 and 181, and a deletion for positions 1, 2 and 182, comprising or consisting of changes selected from the group consisting of: a . I5V b. N79A c. V115I d. A161L e. Q1* + L2* f. A43C + I55C g. R181P + G182* h. A43C + I55C + N79A i. V115I + R181P + G182* j. A161L + R181P + G182*k. I5V + A43C + I55C + N79A + V115I l. I5V + A43C + I55C + N79A + V115I + R181P + G182* m. Q1* + L2* + A43C + I55C + N79A + V115I + R181P + G182* n. Q1* + L2* + I5V + A43C + I55C + N79A + V115I + R181P + G182*

2. Variant according to claim 1, characterized in that the variant additionally comprises an N-terminal extension to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2.

3. Variant according to claim 2, characterized in that the N-terminal extension is selected from: a. The. AAVDSNHTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 3) b. AVDSNHTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 4) c. VDSNHTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 5) d. DSNHTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 6) e. SNHTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 7) f. NHTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 8) g. HTPAVPELVAR (SEQ ID NO: 9) h. TPAVPELVAR (SEQ ID NO: 10) i. PAVPELVAR (SEQ ID NO: 11) j. AVPELVAR (SEQ ID NO: 12) k. VPELVAR (SEQ ID NO: 13) l. PELVAR (SEQ ID NO: 14) m. ELVAR (SEQ ID NO: 15) n. LVAR (SEQ ID NO: 16) o. VAR p. AR q. R

4. Variant according to claim 1, characterized in that the variant has an improved property relative to the parent, wherein the improved property is selected from the group consisting of specific activity, substrate binding, substrate cleavage, substrate specificity, thermostability, and less propensity to pill formation.

5. Composition characterized by comprising the variant as defined in claim 1.

6. Polynucleotide characterized by encoding the variant as defined in claim 1, wherein the coding sequence of the parent cutinase is nucleotides 106 to 687 of SEQ ID NO: 1.

7. Nucleic acid construction characterized by comprising the polynucleotide as defined in claim 6.

8. Expression vector characterized by comprising the polynucleotide as defined in claim 6.

9. Host cell characterized by comprising the polynucleotide as defined in claim 6.

10. Method of producing a cutinase variant, characterized in that the method comprises: a. cultivating the host cell as defined in claim 9 under conditions suitable for expression of the variant; and b. retrieve the variant.

11. Method of obtaining a variant with cutinase activity, as defined in claim 1, characterized in that it comprises introducing into a parent cutinase a change in one or more positions corresponding to positions 1, 2, 5, 43, 55, 79, 115 , 161, 181, or 182 of SEQ ID NO: 2, wherein the change is a substitution for positions 5, 43, 55, 79, 115, 161 and 181, and a deletion for positions 1, 2 and 182, and the variant has cutinase activity; and retrieve the variant.

12. Polyester modification method characterized in that the method comprises treating the polyester with the variant as defined in claim 1.

13. Method of hydrolysis of cyclic oligomers of poly(ethylene terephthalate) characterized in that the method comprises treating the oligomers with the variant as defined in claim 1.

14. Method of reducing the propensity for pilling of fabrics characterized in that the fabric comprises or consists of polyester, and the method comprises treating the fabric with the variant as defined in claim 1.