BR112016012097A2

BR112016012097A2 - vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniasis, immunogenic peptides and obtaining process

Info

Publication number: BR112016012097A2
Application number: BR112016012097-3A
Authority: BR
Inventors: Jean-Loup Lemesre; Gérard-Marie Papierok; Rachel Elise Bras Gonçalves; Elodie Petitdidier-Lesin
Original assignee: Institut De La Recherche Pour Le Developpement (Ird); Virbac
Priority date: 2013-11-29
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2020-11-10
Also published as: WO2015079420A3; FR3014103B1; WO2015079420A2; FR3014103A1; EP3074418A2

Abstract

COMPOSIÇÃO VACINAL PARA A PREVENÇÃO E/OU O TRATAMENTO DE LEISHMANIOSES, PEPTÍDEOS IMUNOGÊNICOS E PROCESSO DE OBTENÇÃO. A invenção visa a utilização, como molécula vacinal em um mamífero, de uma PSA, como proveniente de leishmania, ou uma parte desta PSA possuindo propriedades imunogênicas, a referida PSA, designada a seguir por ES PSAr, apresentando-se sob forma solúvel, nativa, recombinante. Ela visa igualmente uma composição vacinal para a prevenção e/ou o tratamento das leishmanioses compreendendo uma proteína ES PSAr.VACINAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF LEISHMANIOSIS, IMMUNOGENIC PEPTIDES AND PROCESS OF OBTAINING. The invention aims to use, as a vaccine molecule in a mammal, a PSA, as derived from leishmania, or a part of this PSA having immunogenic properties, said PSA, hereinafter referred to as ES PSAr, in soluble, native form , recombinant. It also targets a vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniasis comprising an ES PSAr protein.

Description

“VACINAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF LEISHMANIOSIS, IMMUNOGENIC PEPTIDES AND PROCESS OF OBTAINING”

[0001] A invenção tem por objeto uma composição vacinal para a prevenção e/ou o tratamento de leishmanioses nos mamíferos. Ela se refere, igualmente, aos peptídeos imunogênicos e seu processo de produção.[0001] The invention relates to a vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniasis in mammals. It also refers to immunogenic peptides and their production process.

[0002] As grandes endemias parasitárias são, há muito tempo, as causas primordiais de morbidade e mortalidade, não somente para a espécie humana, mas para todas as outras espécies animais, tanto domésticas como selvagens.[0002] Major parasitic endemics have long been the primary causes of morbidity and mortality, not only for the human species, but for all other animal species, both domestic and wild.

[0003] As leishmanioses estão entre as mais graves infecções parasitárias que afetam o homem no mundo. Trezentos e cinquenta milhões de indivíduos são expostos nos oitenta e oito países espalhados em quatro dos cinco continentes e dezesseis milhões entre eles são portadores do parasita. Eles são responsáveis por um amplo espectro de manifestações clínicas: cutâneas, mucocutâneas e viscerais.[0003] Leishmaniasis are among the most serious parasitic infections affecting man in the world. Three hundred and fifty million individuals are exposed in the eighty-eight countries spread across four of the five continents and sixteen million among them are carriers of the parasite. They are responsible for a wide spectrum of clinical manifestations: cutaneous, mucocutaneous and visceral.

[0004] A leishmaniose visceral (LV) é causada pelos parasitas do complexo Leishmania donovani (L. infantum, L. chagasi e L. donovani) que são os parasitas intracelulares do macrófago. Contrariamente às outras espécies de Leishmania causando as formas tegumentares da doença (L. major, L. brasiliensis,…) quem afetam a derme ou as mucosas, as leishmanias do complexo donovani apresentam uma capacidade de disseminação ao conjunto dos órgãos profundos (fígado, baço, gânglios e medula óssea) onde se multiplicam. Os pacientes atingidos por LV apresentam, então, um quadro clínico associando uma febre moderada mais persistente, uma hepatosplenomegalia e uma pancitopenia conduzindo geralmente ao falecimento se nenhum tratamento específico for iniciado de modo suficientemente rápido ou no caso de insucesso no tratamento.[0004] Visceral leishmaniasis (LV) is caused by the Leishmania donovani complex parasites (L. infantum, L. chagasi and L. donovani) which are the intracellular parasites of the macrophage. Contrary to the other species of Leishmania causing the tegumentary forms of the disease (L. major, L. brasiliensis,…) which affect the dermis or mucous membranes, leishmanias of the donovani complex have a capacity to spread to the set of deep organs (liver, spleen , ganglia and bone marrow) where they multiply. The patients affected by VL then present a clinical picture associating a more persistent moderate fever, hepatosplenomegaly and pancytopenia, generally leading to death if no specific treatment is started quickly enough or in case of treatment failure.

[0005] Ainda que a LV em L. infantum/chagasi seja um problema significativo no sul da Europa com a extensão da pandemia da AIDS e o aparecimento de um número crescente de co-infecções Leishmania/HIV, ela está longe de ser controlada e se torna muito preocupante em termos de problema de saúde pública nos países da América do Sul. Em outras partes do mundo, particularmente nas zonas de endemia por L. donovani, as epidemias mortíferas alcançaram centenas de milhares de vítimas nestas últimas décadas, particularmente no Sudão e na Índia. Além disso, a situação torna-se crítica na Índia com a emergência de cepas resistentes aos derivados pentavalentes do antimônio (medicamentos de primeira escolha).[0005] Although LV in L. infantum / chagasi is a significant problem in southern Europe with the extension of the AIDS pandemic and the emergence of an increasing number of Leishmania / HIV co-infections, it is far from being controlled and becomes very worrying in terms of the public health problem in South American countries. In other parts of the world, particularly in L. donovani endemic areas, deadly epidemics have reached hundreds of thousands of victims in recent decades, particularly in Sudan and in India. In addition, the situation becomes critical in India with the emergence of strains resistant to pentavalent antimony derivatives (drugs of first choice).

[0006] A incidência anual das leishmanioses humanas é estimada entre 2 e 2,5 milhões de novos casos, entre os quais mais de 500.000 são atingidos pela leishmaniose visceral e 1,5 a 2 milhões de leishmanioses tegumentares das quais algumas são muito desfigurantes e mutilantes, como as leishmanioses mucocutâneas (LMC). Isto tem por consequência uma morbidade global superior a dois milhões de DALYs (sigla para Disability Adjusted Life Years) e o falecimento de quase sessenta mil pessoas a cada ano. Estas doenças constituem ainda hoje um verdadeiro problema de saúde pública na América Latina, na Ásia, na África, no Oriente Próximo e Oriente Médio e no sul da Europa.[0006] The annual incidence of human leishmaniasis is estimated between 2 and 2.5 million new cases, among which more than 500,000 are affected by visceral leishmaniasis and 1.5 to 2 million cutaneous leishmaniasis, some of which are very disfiguring and mutilating, such as mucocutaneous leishmaniasis (CML). This has the consequence of a global morbidity of more than two million DALYs (acronym for Disability Adjusted Life Years) and the death of almost sixty thousand people each year. These diseases are still a real public health problem in Latin America, Asia, Africa, the Middle East and the Middle East and southern Europe.

[0007] A leishmaniose visceral afeta igualmente a população canina, que constitui um reservatório de parasitas alimentando, de modo contínuo, o ciclo de transmissão. Ela é devido à L. infantum/chagasi, espécie responsável por uma zoonose dos canídeos domésticos e selvagens largamente disseminada no mundo. Ela afeta milhões de cães na Europa, Ásia, África do Norte e América do Sul. Os cães sintomáticos, mas também os assintomáticos, constituem uma fonte de parasitas para a transmissão da LV no Homem.[0007] Visceral leishmaniasis also affects the canine population, which constitutes a reservoir of parasites that continuously feeds the transmission cycle. It is due to L. infantum / chagasi, a species responsible for a zoonosis of domestic and wild canids widespread in the world. It affects millions of dogs in Europe, Asia, North Africa and South America. Symptomatic, but also asymptomatic, dogs are a source of parasites for the transmission of VL in humans.

[0008] As medidas de prevenção contra a leishmanioses são numerosas. Por muito tempo, elas se encontram baseadas na luta contra o inseto vetor e o objetivo principal visava controlar sua multiplicação pela utilização de inseticidas e em evitar o contato entre o vetor (flebótomo) e seus hospedeiros (cão, homem,…). O controle das leishmanioses, uma vez diagnosticadas, passa também pelos tratamentos quimioterapêuticos. Estes são infelizmente colocados em perigo por um arsenal terapêutico antigo e muito limitado, tratamentos longos, tóxicos e caros, acompanhados por numerosos casos de recaída e pela emergência dos fenômenos de quimiorresistência. Na ausência de tratamentos eficazes e diante da amplitude do problema, torna-se, portanto, necessário colocar à disposição das populações, as mais gravemente afetadas, meios de prevenção aplicáveis em grande escala, dos quais o mais adaptado seria a vacinação.[0008] Prevention measures against leishmaniasis are numerous. For a long time, they are based on the fight against the vector insect and the main objective was to control its multiplication through the use of insecticides and to avoid contact between the vector (phlebotome) and its hosts (dog, man, ...). The control of leishmaniasis, once diagnosed, also involves chemotherapeutic treatments. These are unfortunately endangered by an ancient and very limited therapeutic arsenal, long, toxic and expensive treatments, accompanied by numerous cases of relapse and the emergence of chemoresistance phenomena. In the absence of effective treatments and given the magnitude of the problem, it is therefore necessary to make available to the populations, the most severely affected, prevention means applicable on a large scale, of which the most suitable would be vaccination.

[0009] Vários argumentos visam a viabilidade de uma vacina para o homem.[0009] Several arguments aim at the viability of a vaccine for man.

[0010] Contudo, para o homem, nenhuma vacina se encontra atualmente disponível contra as leishmanioses.[0010] However, for man, no vaccine is currently available against leishmaniasis.

[0011] Com efeito, apenas uma abordagem pragmática utilizando parasitas completos mortos se tornou possível até agora.[0011] Indeed, only a pragmatic approach using dead complete parasites has been possible until now.

[0012] Historicamente, as vacinas de primeira geração, baseadas na utilização de parasitas completos atenuados ou mortos (particularmente autoclavados), combinados ou não com adjuvantes, tinham por objetivo proteger principalmente contra as leishmanioses cutâneas, ao tentarem reproduzir os níveis de proteção obtidos com os parasitas vivos.[0012] Historically, first generation vaccines, based on the use of complete attenuated or dead parasites (particularly autoclaved), combined or not with adjuvants, were intended to protect mainly against cutaneous leishmaniasis, when trying to reproduce the levels of protection obtained with live parasites.

[0013] No entanto, numerosos testes clínicos efetuados com milhares de indivíduos na América do Sul, mas também no Irã, produziram resultados mais do que incertos, ou mesmo decepcionantes.[0013] However, numerous clinical tests carried out on thousands of individuals in South America, but also in Iran, have produced results that are more than uncertain, or even disappointing.

[0014] Numerosas vacinas em sub-unidades, constituídas por proteínas nativas purificadas (vacina de primeira geração) ou recombinantes (vacina de segunda geração) assim foram testadas. Determinadas vacinas candidatas conferiram um bom nível de proteção contra uma infecção experimental no camundongo.[0014] Numerous vaccines in sub-units, consisting of purified native proteins (first generation vaccine) or recombinants (second generation vaccine) were tested in this way. Certain candidate vaccines conferred a good level of protection against experimental infection in the mouse.

[0015] Mais recentemente, as vacinas DNA, ditas de terceira geração, foram desenvolvidas com as sequências nucleotídicas codificando as proteínas utilizadas nas vacinas de segunda geração (Referências 1, 2 e 3).[0015] More recently, DNA vaccines, said to be third generation, were developed with nucleotide sequences encoding proteins used in second generation vaccines (References 1, 2 and 3).

[0016] Por último, outras pistas vacinais foram exploradas com sucesso para camundongos, como as vacinas à base de antígenos presentes na saliva do flebótomo (Referências 4 e 5), que permitiram obter uma relativa resistência à infecção experimental por Leishmania major.[0016] Finally, other vaccine clues have been successfully explored for mice, such as antigens-based vaccines present in the phlebotome's saliva (References 4 and 5), which made it possible to obtain a relative resistance to experimental infection by Leishmania major.

[0017] No entanto, até agora, poucos candidatos a vacinas excederam a fase experimental (camundongos, hamsters) devido à dificuldade para desenvolver um modelo animal apropriado reproduzindo as características da doença humana e aplicar os testes clínicos em hospedeiros naturais da infecção que necessitam de coortes significantes, infraestruturas pesadas e que pode levar anos antes de dar um resultado definitivo. Além disso, é difícil extrapolar diretamente resultados obtidos com os camundongos para hospedeiros naturais da infecção, como o cão ou o homem. Por último, as respostas imunes protetoras controlando uma infecção de prova podem não refletir as requeridas para evitar leishmanioses em zonas endêmicas.[0017] However, until now, few vaccine candidates have exceeded the experimental phase (mice, hamsters) due to the difficulty in developing an appropriate animal model reproducing the characteristics of human disease and applying clinical tests in natural hosts of the infection that require significant cohorts, heavy infrastructure and it may take years before giving a definitive result. In addition, it is difficult to directly extrapolate results obtained with mice to natural hosts of the infection, such as the dog or man. Finally, protective immune responses controlling a trial infection may not reflect those required to prevent leishmaniasis in endemic areas.

[0018] Dois candidatos vacinais estão em curso de desenvolvimento clínico: • Leish 111 f MPL SE do Infections Disease Research Institute (IRDI) em Seattle é uma vacina quimérica chamada LEISH-F1 constituída de 3 proteínas recombinantes em fusão (TSA-LmSTI1-LeIF) formuladas com um lipídeo monofosforilado e esqualeno em uma emulsão estável (MPL-SE). No entanto, se a proteção contra a leishmaniose cutânea parece em boa via, estudos mostraram que Leish-111 f MPL-SE não protege cães expostos s uma infecção natural por L. infantum. • HASPB + KMP-11 da Universidade de York (Grã-Bretanha) cujos resultados de testes clínicos não são conhecidos até agora.[0018] Two vaccine candidates are undergoing clinical development: • Leish 111 f MPL SE from the Infections Disease Research Institute (IRDI) in Seattle is a chimeric vaccine called LEISH-F1 consisting of 3 recombinant fusion proteins (TSA-LmSTI1-LeIF ) formulated with a monophosphorylated and squalene lipid in a stable emulsion (MPL-SE). However, if protection against cutaneous leishmaniasis seems to be going well, studies have shown that Leish-111 f MPL-SE does not protect dogs exposed to a natural infection by L. infantum. • HASPB + KMP-11 from York University (Great Britain) whose results of clinical tests are not known so far.

[0019] Para o cão, existe uma solução eficaz como CaniLeish®, que é um produto composto de antígenos de excreção secreção (AES) de promastigotas de L. infantum (com base em WO 9426899 e suas extensões, em nome de IRD). A leishmaniose canina recebe, assim, suas medidas preventivas profundamente modificadas e completadas.[0019] For the dog, there is an effective solution like CaniLeish®, which is a product composed of secretion excretion antigens (AES) from L. infantum promastigotes (based on WO 9426899 and its extensions, on behalf of IRD). Canine leishmaniasis thus receives its preventive measures that have been deeply modified and completed.

[0020] A vacinação controla não somente o desenvolvimento da doença, mas diminui também significativamente a carga parasitária no cão e contribui, assim, para a interrupção do ciclo de transmissão da LV no flebótomo, no cão e no homem.[0020] Vaccination controls not only the development of the disease, but also significantly decreases the parasitic burden in the dog and thus contributes to the interruption of the LV transmission cycle in the phlebotome, in the dog and in man.

[0021] Todavia, os rendimentos de produção de AES não permitem uma produção em escala industrial de uma vacina humana.[0021] However, AES production yields do not allow for industrial scale production of a human vaccine.

[0022] Neste contexto, existe até agora uma necessidade urgente em investimentos em novas pistas propondo uma alternativa mais eficaz às vacinas existentes, a fim de permitir a vacinação profilática e/ou terapêutica dos pacientes contra as leishmanias, particularmente os pacientes resistentes às terapias existentes e fornecer uma molécula vacinal reprodutível, termoestável e fácil de se produzir em baixos preços nas zonas de endemia.[0022] In this context, there is still an urgent need for investments in new avenues proposing a more effective alternative to existing vaccines, in order to allow prophylactic and / or therapeutic vaccination of patients against leishmanias, particularly patients resistant to existing therapies and to provide a reproducible, thermostable and easy to produce vaccine molecule at low prices in endemic areas.

[0023] A solução prevista pela invenção se apoia sobre os trabalhos realizados por alguns dos co-inventores sobre o imunogene principal dos antígenos naturalmente excretados secretados (AES).[0023] The solution provided by the invention is based on the work carried out by some of the co-inventors on the main immunogen of naturally secreted secreted antigens (AES).

[0024] Estes trabalhos, relacionados com a caracterização bioquímica, imunológica e, mais recentemente, molecular de AES de L. amazonensis ou L. infantum, demonstrou claramente que contêm imunogenes principais constituídos por proteínas chamadas PSA (para “Promastigote Surface Antigen”).[0024] These works, related to the biochemical, immunological and, more recently, molecular characterization of AES of L. amazonensis or L. infantum, clearly demonstrated that they contain major immunogens consisting of proteins called PSA (for "Promastigote Surface Antigen").

[0025] No âmbito do estudo destas proteínas como candidatos vacinais, uma nova estratégia de produção foi desenvolvida pelos inventores, permitindo dispor de produtos excretados/secretados fortemente imunogenes e obter os mesmos sob forma nativa, recombinante, com rendimentos elevados, tornando assim possível sua exploração em escala industrial.[0025] As part of the study of these proteins as vaccine candidates, a new production strategy was developed by the inventors, making it possible to have products excreted / secreted strongly immunogenes and to obtain them in native, recombinant form, with high yields, thus making possible their industrial scale exploration.

[0026] Além disso, revelou-se que partes de tais moléculas apresentavam, de modo inesperado, igualmente um grande interesse para as aplicações profiláticas e terapêuticas visadas.[0026] In addition, it was revealed that parts of such molecules were, unexpectedly, also of great interest for the targeted prophylactic and therapeutic applications.

[0027] A invenção apresenta, portanto, por objetivo o uso, como molécula vacinal, de uma PSA, como a obtida implementando a estratégia e/ou o uso de uma parte desta molécula, e suas aplicações profiláticas e/ou imunoterapêuticas nos mamíferos.[0027] The invention therefore has as its objective the use, as a vaccine molecule, of a PSA, as obtained by implementing the strategy and / or the use of a part of this molecule, and its prophylactic and / or immunotherapeutic applications in mammals.

[0028] Ela visa igualmente um processo de produção em meio completamente definido de uma PSA, assegurando sua obtenção de modo reprodutível desprovida de todas proteínas estranhas e a um custo permitindo uma exploração em escala industrial, bem como a produção de uma parte desta PSA.[0028] It also aims at a process of production in a completely defined medium of a PSA, ensuring its obtainability in a reproducible way without all foreign proteins and at a cost allowing an industrial scale exploration, as well as the production of a part of this PSA.

[0029] A invenção visa, igualmente, como novas moléculas, imunogenes principais de AES, e uma parte destes imunogenes, como os produzidos de acordo com o processo da invenção.[0029] The invention also aims, as new molecules, main immunogens of AES, and a part of these immunogens, such as those produced according to the process of the invention.

[0030] De acordo com ainda outro aspecto, a invenção visa ainda uma composição vacinal com finalidade preventiva e/ou terapêutica, contendo tal molécula imunogênica e/ou uma parte desta molécula e os anticorpos dirigidos contra esta molécula.[0030] According to yet another aspect, the invention also aims at a vaccine composition with preventive and / or therapeutic purpose, containing such immunogenic molecule and / or a part of this molecule and the antibodies directed against this molecule.

[0031] A invenção visa assim o uso, como molécula vacinal para um mamífero, de uma PSA como a proveniente de leishmania, ou uma parte desta PSA, designada a seguir por ES PSAr, possuindo propriedades imunogênicas, a PSA se apresentando sob forma solúvel, nativa, recombinante.[0031] The invention thus aims at the use, as a vaccine molecule for a mammal, of a PSA such as that derived from leishmania, or a part of this PSA, hereinafter referred to as ES PSAr, having immunogenic properties, PSA presenting itself in soluble form , native, recombinant.

[0032] Na descrição e nas reivindicações, - “PSA solúvel” designa uma PSA solúvel excretada/secretada em sobrenadante de cultura de leishmanias. - “PSA nativo” designa uma PSA tal como foi produzida em um sobrenadante de cultura por uma leishmania, comportando as modificações co- e pós- traducionais de uma PSA como proveniente de leishmania, ou uma parte desta PSA possuindo propriedades imunogênicas, a PSA designada a seguir por ES PSAr se apresentando sob forma solúvel, nativa pela sua conformação, recombinante ou uma parte de uma tal PSA. - “PSA recombinante” designa uma PSA tal como expressada por recombinação genética, integrada ao genoma das células hospedeiras do sistema de expressão. - “ES PSAr” designa de modo geral uma PSA de leishmania, sob forma solúvel, nativa, recombinante ou uma parte de tal PSA.[0032] In the description and in the claims, - "Soluble PSA" means a soluble PSA excreted / secreted in leishmania culture supernatant. - "Native PSA" means a PSA as produced in a culture supernatant by a leishmania, comprising the co- and post-translational modifications of a PSA as coming from leishmania, or a part of this PSA having immunogenic properties, the designated PSA then by ES PSAr in soluble form, native for its conformation, recombinant or a part of such PSA. - "Recombinant PSA" means a PSA as expressed by genetic recombination, integrated into the genome of the host cells of the expression system. - "ES PSAr" generally means a leishmania PSA, in soluble, native, recombinant form or a part of such PSA.

[0033] Lembra-se que a sequência de uma PSA comporta um peptídeo sinal implicado nas vias de secreção situada na extremidade da parte aminoterminal da molécula, um número variável de domínios repetidos ricos em leucina (motivos LRR, para “Leucine Rich Repeats”) e uma parte carbóxi-terminal da molécula rica em prolina, treonina e cisteína (ver Figura 1). A extremidade da parte carbóxi-terminal comporta um sinal hidrofóbico de ancoragem GPI ou de âncora GPI (Glicosil Fosfatidil Inositol).[0033] Remember that the sequence of a PSA comprises a signal peptide involved in the secretion pathways located at the end of the amino-terminal part of the molecule, a variable number of repeated domains rich in leucine (LRR motifs, for "Leucine Rich Repeats") and a carboxy-terminal part of the proline, threonine and cysteine-rich molecule (see Figure 1). The end of the carboxy-terminal part contains a hydrophobic GPI anchor or GPI anchor signal (Glycosyl Phosphatidyl Inositol).

[0034] A PSA apresenta também a particularidade de estar presente em todas as espécies de leishmanias (tegumentares e viscerais), o que representa uma real vantagem em termos de vacinação cruzada frente às diferentes expressões clínicas da leishmaniose.[0034] The PSA also has the particularity of being present in all species of leishmanias (cutaneous and visceral), which represents a real advantage in terms of cross-vaccination compared to the different clinical expressions of leishmaniasis.

[0035] De acordo com uma modalidade, a invenção visa o uso da molécula de ES PSAr inteira. A expressão “ES PSAr inteira” significa que a proteína possui as modificações co- e pós-traducionais da molécula nativa, tal como produzida pelo parasita e não é truncada.[0035] According to one embodiment, the invention aims to use the entire ES PSAr molecule. The expression "ES PSAr entire" means that the protein has the co- and post-translational modifications of the native molecule, as produced by the parasite and is not truncated.

[0036] Em variante, a invenção visa o uso de uma ES PSAr não comportando a totalidade das modificações co- e pós-traducionais. Em particular, a invenção visa o uso de uma ES PSAr desglicosilada.[0036] In a variant, the invention aims to use an ES PSAr not including all co- and post-translational modifications. In particular, the invention is directed to the use of a deglycosylated PSAr ES.

[0037] De acordo com outra variante, o uso de acordo com a invenção compreende uma ES PSAr glicosilada.[0037] According to another variant, the use according to the invention comprises a glycosylated PSAr ES.

[0038] Em outra modalidade, a invenção visa o uso de uma ES PSAr desprovida da âncora GPI da parte hidrofóbica na extremidade C-terminal.[0038] In another embodiment, the invention aims to use an ES PSAr devoid of the GPI anchor of the hydrophobic part at the C-terminal end.

[0039] Em outra variante de realização, a invenção visa o uso de uma ES PSAr desprovida da parte carbóxi-terminal.[0039] In another embodiment, the invention aims to use an ES PSAr devoid of the carboxy-terminal part.

[0040] De acordo com ainda outra modalidade, a invenção visa o uso da parte C- terminal de uma molécula de PSA ou de ES PSAr (designada, a seguir, por C-ter PSA ou C-ter ES PSAr) como isolada de um sobrenadante de excreção/secreção de cultura de leishmaniose. Trata-se de uma molécula não nativa, como codificada por uma sequência de DNA truncada de PSA ou de ES PSAr[0040] According to yet another embodiment, the invention aims to use the C-terminal part of a PSA or ES PSAr molecule (hereinafter referred to as C-ter PSA or C-ter ES PSAr) as isolated from a leishmaniasis culture excretion / secretion supernatant. It is a non-native molecule, as encoded by a truncated DNA sequence of PSA or ES PSAr

[0041] De modo vantajoso, a invenção visa o uso como molécula vacinal de uma ES PSAr, como obtida a partir da PSA de L. amazonensis ou de uma leishmania do complexo donovani, particularmente de L. infantum ou de L. donovani, ou do complexo braziliensis e tropica.[0041] Advantageously, the invention aims to use as a vaccine molecule an ES PSAr, as obtained from the PSA of L. amazonensis or from a leishmania of the donovani complex, particularly L. infantum or L. donovani, or of the braziliensis and tropica complex.

[0042] A invenção visa, assim, particularmente, o uso de uma ES PSAr de sequência SEQ ID N° 1. Esta ES PSAr é obtida mais particularmente a partir da PSA produzida por L. amazonensis deletada de seu peptídeo hidrofóbico de ancoragem membranar.The invention therefore aims, in particular, at the use of an ES PSAr of sequence SEQ ID N ° 1. This ES PSAr is obtained more particularly from the PSA produced by L. amazonensis deleted from its hydrophobic membrane anchoring peptide.

[0043] Em variante, a ES PSAr é mais particularmente obtida a partir da PSA de L. infantum de sequência SEQ ID N°2 ou L. donovani de sequência SEQ ID N°3, estas sequências sendo também deletadas na extremidade carbóxi-terminal de seu peptídeo hidrofóbico com ancoragem à membrana.[0043] In variant, ES PSAr is more particularly obtained from the PSA of L. infantum of sequence SEQ ID No. 2 or L. donovani of sequence SEQ ID No. 3, these sequences being also deleted at the carboxy-terminal end of its hydrophobic peptide with membrane anchoring.

[0044] A molécula vacinal utilizada pode corresponder a uma parte da ES PSAr, em particular à extremidade C-Terminal. Tal molécula apresenta particularmente a sequência SEQ ID N°4.[0044] The vaccine molecule used may correspond to a part of the ES PSAr, in particular the C-Terminal end. Such a molecule particularly has the sequence SEQ ID No. 4.

[0045] Mais especificamente, a invenção visa o uso, como molécula vacinal, de uma ES PSAr sob forma solúvel, como produzida por inserção de um vetor compreendendo o gene codificando a ES PSAr em um sistema de expressão recombinante eucariótico de leishmania.[0045] More specifically, the invention aims to use, as a vaccine molecule, an ES PSAr in soluble form, as produced by inserting a vector comprising the gene encoding the ES PSAr in a eukaryotic leishmania recombinant expression system.

[0046] Preferivelmente, o sistema de expressão recombinante utilizado é o de uma leishmania não patogênica nos mamíferos.[0046] Preferably, the recombinant expression system used is that of non-pathogenic leishmania in mammals.

[0047] A invenção visa mais especialmente o uso, como molécula vacinal, da ES PSAr sob forma solúvel, como produzida por inserção do gene codificando a ES PSAr, em um sistema de expressão recombinante eucariótico constituído por Leishmania tarentolae ou, em variante, do gene codificando uma parte de ES PSAr, em particular uma parte desprovida de sua parte hidrofóbica como já indicado.[0047] The invention aims more particularly at the use, as a vaccine molecule, of ES PSAr in soluble form, as produced by insertion of the gene encoding ES PSAr, in a eukaryotic recombinant expression system consisting of Leishmania tarentolae or, in a variant, of gene encoding a part of ES PSAr, in particular a part lacking its hydrophobic part as already indicated.

[0048] Vantajosamente, este sistema permite a integração do vetor de expressão contendo o gene codificando ES PSAr no locus 18S rRNA do cromossoma de Leishmania tarentolae que possui uma taxa de transcrição muito elevada e, assim, a obtenção de uma quantidade abundante da PSA recombinante.[0048] Advantageously, this system allows the integration of the expression vector containing the gene encoding ES PSAr into the 18S rRNA locus of the Leishmania tarentolae chromosome that has a very high transcription rate and, thus, obtaining an abundant amount of recombinant PSA .

[0049] A proteína pode ser produzida com a totalidade ou parte das modificações co- e pós-traducionais das proteínas das leishmanias.[0049] The protein can be produced with all or part of the co- and post-translational modifications of the leishmania proteins.

[0050] A invenção visa igualmente um processo de produção de ES PSAr sob forma solúvel, comportando as características definidas acima.[0050] The invention also aims at a process for the production of ES PSAr in soluble form, comprising the characteristics defined above.

[0051] Assim, este processo compreende a integração de um vetor de expressão comportando o gene codificando a ES PSAr em um sistema recombinante eucariótico não patogênico para o homem ou o animal.[0051] Thus, this process comprises the integration of an expression vector carrying the gene encoding the ES PSAr in a eukaryotic recombinant system not pathogenic to man or animal.

[0052] De modo vantajoso, a transfecção pelo vetor é realizada no locus de um cromossoma de uma leishmania não patogênica possuindo uma taxa de transcrição elevada.[0052] Advantageously, transfection by the vector is performed at the chromosome locus of a non-pathogenic leishmania having a high transcription rate.

[0053] Uma leishmania particularmente apropriada é constituída por L. tarentolae, no estágio promastigótico.[0053] A particularly appropriate leishmania consists of L. tarentolae, in the promastigotic stage.

[0054] A inserção no locus 18 s rRNA do cromossoma, cuja taxa de transcrição é elevada, permite obter rendimentos de produção elevados.[0054] The insertion in locus 18 s rRNA of the chromosome, whose transcription rate is high, allows to obtain high production yields.

[0055] O vetor de expressão utilizado é vantajosamente um plasmídeo. Como ilustrado nos exemplos, pF4X1.4 é particularmente apropriado para a implementação da invenção. As sequências necessárias às modificações pós- traducionais em L. tarentolae são introduzidas de um lado e outro do cassete de clonagem.[0055] The expression vector used is advantageously a plasmid. As illustrated in the examples, pF4X1.4 is particularly suitable for implementing the invention. The sequences necessary for post-translational modifications in L. tarentolae are introduced on both sides of the cloning cassette.

[0056] A proteína de ES PSAr assim produzida é uma proteína solúvel nos sobrenadantes de cultura das leishmanias, possuindo as propriedades da proteína nativa, em particular uma ou várias das modificações co- e pós-traducionais das proteínas das leishmanias, como a acetilação, a hidroxilação, as pontes dissulfeto, a glicilação, a glicosilação, a fosforilação, a ancoragem lipídica e similares.[0056] The ES PSAr protein thus produced is a protein soluble in leishmania culture supernatants, having the properties of the native protein, in particular one or more of the co- and post-translational modifications of the leishmania proteins, such as acetylation, hydroxylation, disulfide bonds, glycylation, glycosylation, phosphorylation, lipid anchorage and the like.

[0057] Assim, a ES PSAr desglicosilada, em uma variante da invenção, é produzida a partir da cultura das formas promastigóticas de L. tarentolae em presença de tunicamicina. A tunicamicina é um antibiótico que inibe a enzima GlcNAc fosfotransferase (GPT). Ela inibe assim a N-glicosilação necessária para a fixação dos precursores dos N-heterosídeos sobre o dolicol difosfato (ver Figura 3).Thus, deglycosylated ES PSAr, in a variant of the invention, is produced from the culture of the promastigotic forms of L. tarentolae in the presence of tunicamycin. Tunicamycin is an antibiotic that inhibits the GlcNAc phosphotransferase (GPT) enzyme. It thus inhibits the N-glycosylation necessary for the fixation of N-heteroside precursors on dolichol diphosphate (see Figure 3).

[0058] A cultura dos transgenes de promastigotas de L. tarentolae é obtida vantajosamente no meio de cultura totalmente definido como descrito no pedido internacional acima citado em nome de IRD e suas extensões, o que permite recuperar a PSA produzida sem contaminantes séricos e celulares relacionados com os meios de cultura classicamente utilizados.[0058] The culture of L. tarentolae promastigote transgenes is advantageously obtained in the culture medium fully defined as described in the international application mentioned above in the name of IRD and its extensions, which allows to recover the PSA produced without related serum and cellular contaminants with the traditionally used culture media.

[0059] Uma etapa de purificação pode ser realizada, por exemplo, por cromatografia de afinidade sobre gel.[0059] A purification step can be performed, for example, by gel affinity chromatography.

[0060] A produção da parte C-ter da PSA é realizada vantajosamente em um sistema bacteriano recombinante, seguido, preferivelmente, por uma etapa de purificação.[0060] The production of the C-ter part of PSA is advantageously carried out in a recombinant bacterial system, preferably followed by a purification step.

[0061] O vetor de expressão utilizado, que compreende o cDNA do gene codificando para a parte carbóxi-terminal da PSA é em particular um plasmídeo.[0061] The expression vector used, which comprises the cDNA of the gene encoding the carboxy-terminal part of PSA, is in particular a plasmid.

[0062] Uma construção de plasmídeo conveniente para implementação da invenção compreende os elementos para produzir uma proteína recombinante com um marcador 6-Histidina em posição NH2-terminal e um sítio de clivagem do marcador.A convenient plasmid construction for implementing the invention comprises the elements for producing a recombinant protein with a NH2-terminal 6-Histidine marker and a marker cleavage site.

[0063] As colônias produzindo as proteínas recombinantes buscadas são selecionadas e, após amplificação em cultura, são vantajosamente purificadas.[0063] The colonies producing the sought recombinant proteins are selected and, after amplification in culture, are advantageously purified.

[0064] A proteína recombinante, sob forma nativa, vantajosamente com uma ou várias modificações co- e pós-traducionais descritas acima, constitui um produto novo e, a este título, entra no campo da invenção.[0064] The recombinant protein, in native form, advantageously with one or more co- and post-translational modifications described above, constitutes a new product and, in this sense, enters the field of the invention.

[0065] A invenção visa em particular uma ES PSAr glicosilada ou em variante uma ES PSAr desglicosilada.[0065] The invention aims in particular at a glycosylated PSAr ES or in variant at a deglycosylated PSAr ES.

[0066] Ela visa, igualmente, uma ES PSAr deletada, em particular desprovida da âncora GPI e, portanto, do peptídeo hidrofóbico em posição C-terminal, permitindo evitar os fenômenos de agregação e a formação de corpos de inclusão quando da produção da ES PSAr.[0066] It also aims at a deleted PSAr ES, in particular without the GPI anchor and, therefore, the hydrophobic peptide in the C-terminal position, allowing the avoidance of aggregation phenomena and the formation of inclusion bodies when producing ES PSAr.

[0067] Do mesmo modo, a invenção visa, como produto novo, a molécula constituída pela parte C-ter PSA da proteína, como foi definida acima.[0067] Likewise, the invention aims, as a new product, the molecule constituted by the C-ter PSA part of the protein, as defined above.

[0068] Os processo de produção descritos acima são ilustrados nos exemplos partindo da ES PSAr de L. amazonensis e com C-ter PSA de L. amazonensis.[0068] The production processes described above are illustrated in the examples starting from the ES PSAr of L. amazonensis and with C-ter PSA from L. amazonensis.

[0069] Como mostram igualmente os exemplos, a proteína ES PSAr, bem como sua parte carbóxi-terminal (C-ter PSA), em combinação com um adjuvante, conferem, ao cão, um nível de proteção muito forte contra uma infecção experimental por L. infantum.[0069] As the examples also show, the ES PSAr protein, as well as its carboxy-terminal part (C-ter PSA), in combination with an adjuvant, give the dog a very strong level of protection against an experimental infection by L. infantum.

[0070] Esta proteção é acompanhada por: - produção de anticorpos específicos principalmente de isotipo IgG2 que parecem desempenhar um papel não negligenciável na proteção (efeitos leishmanicida e neutralizante); - polarização da resposta à mediação celular para uma via de tipo Th1 revelada por um aumento da produção pelos linfócitos T de IFN-γ, conduzindo à ativação pela via clássica dos macrófagos, caracterizada pela síntese aumentada de[0070] This protection is accompanied by: - production of specific antibodies mainly of the IgG2 isotype that seem to play a not negligible role in the protection (leishmanicidal and neutralizing effects); - polarization of the response to cell mediation to a Th1-type pathway revealed by an increase in production by IFN-γ T lymphocytes, leading to activation by the classic macrophage pathway, characterized by increased synthesis of

NO e, portanto, a eliminação das leishmanias intracelulares (atividade leishmanicida dos macrófagos caninos).NO and, therefore, the elimination of intracellular leishmanias (leishmanicidal activity of canine macrophages).

[0071] As propriedades notáveis da ES PSAr, bem como de sua parte C-ter. também são reveladas por: - efeito inibidor de um hiperimunosoro de coelho policlonal monoespecífico dirigido contra C-ter PSA sobre o crescimento das formas promastigóticas de L. infantum; - efeito neutralizante de soros de coelho policlonal monoespecífico anti- ES PSAr e anti-C-ter PSA (não nativo) sobre a capacidade das promastigotas de infectar ex vivo os macrófagos, - efeito “fator de crescimento” da ES PSAr sobre a proliferação das formas promastigóticas.[0071] The notable properties of ES PSAr, as well as its C-ter part. they are also revealed by: - an inhibitory effect of a monospecific polyclonal rabbit hyperimmunosorum directed against C-ter PSA on the growth of promastigotic forms of L. infantum; - neutralizing effect of monospecific anti-ES PSAr and anti-C-ter PSA (non-native) polyclonal rabbit sera on the ability of promastigotes to infect macrophages ex vivo, - ES PSAr “growth factor” effect on the proliferation of promastigotic forms.

[0072] Os exemplos mostram igualmente uma imunorreação protetora e induzida sobre as células humanas, o que confirma os resultados obtidos no cão e permite visar o desenvolvimento de uma vacina com finalidade humana. Esta imuno- reatividade é acompanhada pela produção de citocinas de tipo TH1 e de uma resposta T-citotóxica destacada pela produção da granzima B.[0072] The examples also show a protective and induced immunoreaction on human cells, which confirms the results obtained in the dog and allows to target the development of a vaccine for human purposes. This immunoreactivity is accompanied by the production of TH1-type cytokines and a T-cytotoxic response highlighted by the production of granzyme B.

[0073] A invenção visa, portanto, igualmente uma composição vacinal para a prevenção e/ou o tratamento das leishmanioses no homem ou animal, caracterizada pelo fato de compreender: - uma proteína ES PSAr, sob forma solúvel, de leishmania e/ou uma ES PSAr truncada, em particular desprovida da âncora GPI, e/ou da parte peptídica C- ter da PSA, como proveniente de leishmania, ou da ES PSAr; e - um ou vários adjuvantes e/ou um ou vários imunomoduladores.[0073] The invention therefore also aims at a vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniasis in man or animal, characterized by the fact that it comprises: - an ES PSAr protein, in soluble form, of leishmania and / or a Truncated ES PSAr, in particular lacking the GPI anchor, and / or the PSA C-ter peptide part, as from leishmania, or ES PSAr; and - one or more adjuvants and / or one or more immunomodulators.

[0074] O adjuvante é escolhido vantajosamente entre os capazes de induzir uma resposta à mediação celular conduzindo à eliminação do parasita.[0074] The adjuvant is advantageously chosen from those capable of inducing a response to cell mediation leading to the elimination of the parasite.

[0075] Adjuvantes apropriados compreendem os das classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, as saponinas e seus derivados, as emulsões óleo em água ou água em óleo, os polissacarídeos, os lipossomas catiônicos, as virossomas ou os polieletrólitos.[0075] Appropriate adjuvants comprise those of classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, saponins and their derivatives, oil in water or water in oil emulsions, polysaccharides, cationic liposomes, virosomes or polyelectrolytes.

[0076] Imunomoduladores apropriados compreendem as proteínas de saliva de flebótomos, as citocinas e as proteínas de choque térmico ou HSP (para Heat Shock Protein).[0076] Appropriate immunomodulators include phlebotome saliva proteins, cytokines and heat shock proteins or HSP (for Heat Shock Protein).

[0077] A composição vacinal da invenção se apresenta, em particular, sob uma forma permitindo a administração por diferentes vias, como a via subcutânea, intradérmica, intramuscular, parenteral, oral, endonasal ou mucosal.[0077] The vaccine composition of the invention comes, in particular, in a form allowing administration by different routes, such as subcutaneous, intradermal, intramuscular, parenteral, oral, endonasal or mucosal.

[0078] A composição vacinal definida acima é mais especialmente apropriada para a fabricação de um medicamento ou de uma vacina, de um reagente de diagnóstico in vivo ou in vitro para a indução ou o diagnóstico, no mamífero, de uma ativação da imunidade à mediação celular dependente de linfócitos de tipo Th1 e/ou imunidade humoral efetora.[0078] The vaccine composition defined above is most especially suitable for the manufacture of a drug or a vaccine, an in vivo or in vitro diagnostic reagent for the induction or diagnosis, in the mammal, of an activation of immunity to mediation cell dependent on Th1 type lymphocytes and / or effector humoral immunity.

[0079] Esta composição convém para a indução ou o diagnóstico no mamífero da passagem de um estado imune de tipo Th2 para um estado imune de tipo Th1, ou ainda para a indução ou o diagnóstico, no mamífero, de anticorpos específicos de isotipo IgG2 neutralizantes e/ou líticos que reconhecem os determinantes antigênicos dos parasitas.[0079] This composition is suitable for the induction or diagnosis in the mammal of the transition from a Th2-type immune state to a Th1-type immune state, or even for the induction or diagnosis, in the mammal, of neutralizing IgG2-specific antibodies and / or lytic species that recognize the parasite's antigenic determinants.

[0080] Tais anticorpos e os imunosoros contendo os mesmos fazem parte igualmente da invenção.[0080] Such antibodies and the immunosorbents containing them are also part of the invention.

[0081] Outras características e vantagens da invenção são dadas nos exemplos seguintes, com referência às Figuras 1 a 18, que representam, respectivamente, - Figura 1: uma representação esquemática da proteína PSA de Leishmania, - Figura 2: a análise polipeptídica da ES PSAr purificada em gel SDS- PAGE (condições redutoras e não redutoras), - Figura 3: perfis eletroforéticos obtidos após coloração das proteínas (A) e dos açúcares (B) de ES PSAr (SEQ ID NO: 1) produzidos em presença (pista 3) ou ausência (pista 2) de tunicamicina, - Figura 4: a análise polipeptídica da C-ter PSA (SEQ ID NO: 4) purificada em gel SDS-PAGE (condições redutoras e não redutoras),[0081] Other characteristics and advantages of the invention are given in the following examples, with reference to Figures 1 to 18, which represent, respectively, - Figure 1: a schematic representation of the Leishmania PSA protein, - Figure 2: the polypeptide analysis of SS PSAr purified on SDS-PAGE gel (reducing and non-reducing conditions), - Figure 3: electrophoretic profiles obtained after staining the proteins (A) and sugars (B) of ES PSAr (SEQ ID NO: 1) produced in presence (lane 3) or absence (lane 2) of tunicamycin, - Figure 4: polypeptide analysis of C-ter PSA (SEQ ID NO: 4) purified on SDS-PAGE gel (reducing and non-reducing conditions),

- Figura 5: Análise eletroforética das glicoproteínas solúveis ES PSAr (SEQ ID NO: 1 desglicosiladas (1 e 3); ES PSAr nativa (2 e 4)), - Figura 6: ELISA IgG2 versus AES expressado em densidade óptica (DO), - Figura 7: ELISA IgG2 versus ES PSAr expressado em densidade óptica (DO), - Figura 8: ELISA IgG2 versus C-ter PSA expressado em densidade óptica (DO), - Figura 9: Efeito dos soros de cães vacinados (CaniLeish®, ES PSAr e C-ter PSA) sobre a viabilidade e a proliferação das promastigotas de L. infantum, em comparação com as dos soros de cães placebos.- Figure 5: Electrophoretic analysis of soluble ES PSAr glycoproteins (SEQ ID NO: 1 deglycosylated (1 and 3); Native PSAr ES (2 and 4)), - Figure 6: ELISA IgG2 versus AES expressed in optical density (DO), - Figure 7: ELISA IgG2 versus ES PSAr expressed in optical density (DO), - Figure 8: ELISA IgG2 versus C-ter PSA expressed in optical density (DO), - Figure 9: Effect of vaccinated dog sera (CaniLeish®, ES PSAr and C-ter PSA) on the viability and proliferation of L. infantum promastigotes, compared with those of placebo dog sera.

T0: soros pré-imunes; T5: soros tomados dois meses após a administração de três doses da vacina, - Figura 10: Efeito neutralizante de soros de coelho policlonal monoespecífico anti-ES PSAr e anti-C-ter PSA (utilizados em diferentes diluições (1/10, 1/50 e 1/100)), - Figura 11: Efeito de um soro de coelho policlonal monoespecífico dirigido contra a parte C-ter PSA (parte carbóxi - terminal da PSA) utilizado em diferentes diluições (1/25 e 1/50) sobre o crescimento das formas promastigóticas de L. infantum, - Figura 12: Avaliação, comparada com um testemunho, do número de promastigotas/mL com concentrações de ES PSAr de 17,8 µΜ e 0,22 µΜ, em diferentes tempos de adição, - Figura 13: Atividades leishmanicidas dos macrófagos caninos do grupo placebo versus o grupo vacinado antes (T0), um mês após a administração de 2 doses de vacina (T3) e dois meses após a injeção de 3 doses (T5), - Figura 14: Determinação das taxas de interferon (IFN)- γ presentes nos sobrenadantes de co-cultura das células provenientes de cães placebos e cães vacinados (ES PSAr ou C-ter PSA). T0: soros pré-imunes; T5: soros obtidos dois meses após a administração de três doses da vacina,T0: pre-immune sera; T5: sera taken two months after administration of three doses of the vaccine, - Figure 10: Neutralizing effect of monospecific polyclonal rabbit sera anti-ES PSAr and anti-C-ter PSA (used in different dilutions (1/10, 1 / 50 and 1/100)), - Figure 11: Effect of a monospecific polyclonal rabbit serum directed against the PSA C-ter part (PSA carboxy terminal) used in different dilutions (1/25 and 1/50) on the growth of promastigotic forms of L. infantum, - Figure 12: Evaluation, compared with a testimony, of the number of promastigotes / mL with ES PSAr concentrations of 17.8 µ 0,2 and 0.22 µΜ, at different times of addition, - Figure 13: Leishmanicidal activities of canine macrophages in the placebo group versus the vaccinated group before (T0), one month after the administration of 2 doses of vaccine (T3) and two months after the injection of 3 doses (T5), - Figure 14: Determination of interferon (IFN) - γ rates present in cell culture supernatants from dogs s placebos and vaccinated dogs (ES PSAr or C-ter PSA). T0: pre-immune sera; T5: sera obtained two months after administration of three doses of the vaccine,

- Figura 15: Avaliação das taxas de óxido nítrico (NO) produzidas em sobrenadantes de co-cultura das células provenientes de cães placebos e cães vacinados (ES PSAr ou C-ter PSA). T0: soros pré-imunes; T5: soros obtidos dois meses após a administração de três doses da vacina, - Figura 16: Determinação das percentagens de cães parasitologicamente positivos nos grupos de cães placebos e nos grupos de cães vacinados com ES PSAr, - Figura 17: Determinação das percentagens de cães parasitologicamente positivos nos grupos de cães placebos e nos grupos de cães vacinados com C-ter PSA, - Figura 18: Determinação das cargas parasitárias por RT-PCR nos cães dos grupos placebos e vacinados. Exemplo 1: Obtenção, produção e purificação das proteínas recombinantes- Figure 15: Evaluation of nitric oxide (NO) rates produced in cell culture supernatants from placebo dogs and vaccinated dogs (ES PSAr or C-ter PSA). T0: pre-immune sera; T5: sera obtained two months after the administration of three doses of the vaccine, - Figure 16: Determination of the percentages of parasitologically positive dogs in the groups of placebo dogs and in the groups of dogs vaccinated with ES PSAr, - Figure 17: Determination of the percentages of dogs parasitologically positive in groups of placebo dogs and in groups of dogs vaccinated with C-ter PSA, - Figure 18: Determination of parasitic loads by RT-PCR in dogs in the placebo and vaccinated groups. Example 1: Obtaining, producing and purifying recombinant proteins

1. Clonagem e sequenciamento dos genes de PSA1. Cloning and sequencing of PSA genes

[0082] Um hiperimunosoro gerado no coelho e dirigido conta os antígenos de excreção secreção (AES) de promastigota de L. amazonensis, bem como um anticorpo monoclonal (E2) dirigido especificamente contra o imunogene principal de AES parasitários foram utilizados para triar um banco de cDNA de formas promastigóticas e amastigóticas (produzidas em 1ZAPII) de L. amazonensis.[0082] A hyperimmunosor generated in the rabbit and directed against L. amazonensis promastigote secretion (AES) antigens, as well as a monoclonal antibody (E2) directed specifically against the main parasitic AES immunogen were used to screen a bank of parasites. cDNA of promastigotic and amastigotic forms (produced in 1ZAPII) of L. amazonensis.

[0083] A análise das sequências dos insertos contidos nos plasmídeos recombinantes permitiu identificar principalmente clones de cDNA, situados seletivamente sobre o cromossoma 12 e codificando proteínas pertencendo à família das PSA.[0083] The sequence analysis of the inserts contained in the recombinant plasmids allowed to identify mainly cDNA clones, selectively located on chromosome 12 and encoding proteins belonging to the PSA family.

[0084] A sequência SEQ ID N° 1 é proveniente do gene LaPSA38 codificando a proteína completa de 45 kDa (372 aa) que corresponde a WO 2005051989, em nome de IRD, e a sequência SEQ ID N°4 é proveniente do gene truncado LaPSA19 codificando a parte carbóxi- terminal de LaPSA38. Trata-se da parte C-ter PSA, de 19kDa (119 aa).[0084] The sequence SEQ ID No. 1 comes from the LaPSA38 gene encoding the complete 45 kDa protein (372 aa) corresponding to WO 2005051989, in the name of IRD, and the sequence SEQ ID No. 4 comes from the truncated gene LaPSA19 encoding the carboxy-terminal part of LaPSA38. This is part C-ter PSA, 19kDa (119 aa).

[0085] A sequência SEQ ID N°2 é proveniente do gene LiJ11.[0085] The sequence SEQ ID No. 2 comes from the LiJ11 gene.

[0086] O gene LiJ11 foi obtido utilizando a sequência C-ter PSA (sonda radiomarcada) para triar um banco cosmídico de DNA genômico de promastigotas de L. infantum, o que permitiu caracterizar uma PSA homóloga em Leishmania infantum (PSA IJ11) de 463 aa (50 kDa). A sequência protéica da PSAIJ11 de L. infantum apresenta uma forte homologia de sequência com a de LaPSA38s de L. amazonensis em suas partes amino- (73,8%) e carbóxi- (77,5%) terminais com um número de motivos repetidos ricos em leucina mais elevado (9 contra 6) (no pedido internacional WO 2005/051989 acima citado, o gene codificando para a proteína não recombinante corresponde à SEQ ID N° 11 e a proteína codificada à SEQ ID N°12).[0086] The LiJ11 gene was obtained using the sequence C-ter PSA (radiolabeled probe) to screen a cosmid bank of genomic DNA from L. infantum promastigotes, which allowed to characterize a PSA homologous in Leishmania infantum (PSA IJ11) of 463 aa (50 kDa). The protein sequence of L. infantum PSAIJ11 has a strong sequence homology with that of L. amazonensis LaPSA38s in its terminal amino- (73.8%) and carboxi- (77.5%) parts with a number of repeated motifs higher in leucine (9 versus 6) (in the international application WO 2005/051989 above, the gene encoding the non-recombinant protein corresponds to SEQ ID No. 11 and the protein encoded to SEQ ID No. 12).

2. Produção de LaES PSAr deletada da âncora GPI em um sistema recombinante eucariótico e purificação2. Production of LaES PSAr deleted from the GPI anchor in a eukaryotic recombinant system and purification

[0087] Esta etapa é realizada com um sistema de expressão de gene em L. tarentolae comercializado por Jena Bioscience: “Leishmania tarentolae Gene Expression Starter Kit”.[0087] This step is performed with a gene expression system in L. tarentolae marketed by Jena Bioscience: "Leishmania tarentolae Gene Expression Starter Kit".

[0088] Este sistema de expressão utiliza o próprio parasita para produzir a sua própria proteína. Este último apresenta em numerosas vantagens para a produção de proteínas com finalidade terapêutica: - Leishmania tarentolae é um parasita do lagarto não patogénico para o Homem. Sua manipulação não necessita medidas de segurança limitadoras; - L. tarentolae é cultivado facilmente em suspensão celular em meios de cultura completamente definidos (sem contaminação com outras proteínas estranhas), a 26°C, com um bom rendimento (da ordem de 108 células por ml, tempos de duplicação de população de 4 h); - Este sistema de expressão permite produzir proteínas nativas de leishmania. O parasita contém, com efeito, o maquinário necessário para expressão de proteínas eucarióticas nativas; - Assim, a proteína produzida possui todas as modificações pós- traducionais das proteínas de leishmanias como a glicosilação e a formação de pontes dissulfetos;[0088] This expression system uses the parasite itself to produce its own protein. The latter has numerous advantages for the production of proteins for therapeutic purposes: - Leishmania tarentolae is a parasite of the lizard not pathogenic for humans. Its manipulation does not require limiting security measures; - L. tarentolae is easily grown in cell suspension in completely defined culture media (without contamination with other foreign proteins), at 26 ° C, with a good yield (in the order of 108 cells per ml, population doubling times of 4 H); - This expression system allows the production of proteins native to leishmania. The parasite contains, in effect, the machinery necessary for the expression of native eukaryotic proteins; - Thus, the protein produced has all post-translational modifications of leishmania proteins such as glycosylation and the formation of disulfide bonds;

- O vetor utilizado neste sistema permite realizar a clonagem do gene de interesse em sistema bacteriano, depois obter a expressão da proteína em Leishmania tarentolae; - Ele permite a integração do cassete de expressão no locus 18S rRNA do cromossoma que possui uma taxa de transcrição muito elevada e assim a obtenção estável de uma quantidade abundante de proteína recombinante.- The vector used in this system allows cloning the gene of interest in a bacterial system, then obtaining the expression of the protein in Leishmania tarentolae; - It allows the integration of the expression cassette in the 18S rRNA locus of the chromosome that has a very high transcription rate and thus the stable obtaining of an abundant amount of recombinant protein.

[0089] O gene LaPSA 38 s foi amplificado, depois modificado por mutagenese dirigida para permitir a produção de uma proteína com um marcador polihistidina (5 histidinas) em parte carbóxi-terminal, e suprimir o sítio de ancoragem à membrana.The LaPSA 38 s gene was amplified, then modified by targeted mutagenesis to allow the production of a protein with a polyhistidine marker (5 histidines) in a carboxy-terminal part, and to suppress the membrane anchoring site.

[0090] A clonagem direcional do gene da ES PSAr foi realizada no vetor de expressão pF4X1.4sat. Os plasmídeos foram especificamente construídos para permitir a produção da proteína recombinante no sobrenadante de meio de cultura a partir do qual ela pode ser facilmente isolada. Esta construção foi transfectada em Leishmania tarentolae onde foi integrada ao genoma do parasita, no estágio promastigótico, por recombinação homóloga, conferindo ao mesmo, para a mesma ocasião, uma resistência à nourseotricina (NTC), permitindo selecionar os indivíduos recombinantes. A super-expressão é efetuada graças à integração do gene no locus do rRNA 18S, alcançando vantagem devido ao alto nível de transcrição de RNA polimerase I do hospedeiro. Este plasmídeo contém igualmente em torno do cassete de clonagem as sequências necessárias às modificações co- e pós-traducionais em Leishmania tarentolae, permitindo obter uma proteína sob sua forma nativa.[0090] Directional cloning of the ES PSAr gene was performed on the pF4X1.4sat expression vector. The plasmids were specifically constructed to allow the production of the recombinant protein in the culture medium supernatant from which it can be easily isolated. This construct was transfected into Leishmania tarentolae where it was integrated into the parasite's genome, in the promastigotic stage, by homologous recombination, giving it, for the same occasion, a resistance to nourseotrichin (NTC), allowing to select the recombinant individuals. Overexpression is effected thanks to the integration of the gene in the 18S rRNA locus, achieving advantage due to the high level of transcription of RNA polymerase I of the host. This plasmid also contains around the cloning cassette the sequences necessary for co- and post-translational modifications in Leishmania tarentolae, allowing to obtain a protein in its native form.

[0091] Os transgenes promastigóticos de L. tarentolae foram adaptados ao meio completamente definido, desenvolvido por IRD (pedido WO acima citado e suas extensões) de forma a purificar facilmente a proteína parasitária a partir dos sobrenadantes de cultura e produzir a mesma em ausência de qualquer proteína estranha (moléculas de origem sérica e celular).[0091] The L. tarentolae promastigotic transgenes were adapted to the completely defined medium, developed by IRD (WO application mentioned above and its extensions) in order to easily purify the parasitic protein from the culture supernatants and produce the same in the absence of any foreign protein (molecules of serum and cellular origin).

[0092] A purificação a partir dos sobrenadantes de meio de cultura da ES PSAr assim produzida foi realizada por cromatografia de afinidade sobre gel Agarose- Níquel.[0092] Purification from the supernatants of ES PSAr culture medium thus produced was performed by affinity chromatography on Agarose-Nickel gel.

[0093] Nestas condições experimentais, apenas a LaPSA38snr de L. amazonensis foi produzida com um rendimento de produção de 0,2 a 0,3 mg de proteína purificada por litro de cultura, suficiente para permitir suo uso no desenvolvimento de novos métodos analíticos e sua avaliação como candidato de vacina. Ela corresponde a um peso molecular aparente de 45 kDa e um peso molecular teórico de 37kDa. Ela apresenta a sequência SEQ ID N° 1 visada acima. Esta proteína comporta 349 aminoácidos; seu pI é de 5,07.[0093] In these experimental conditions, only L. amazonensis LaPSA38snr was produced with a production yield of 0.2 to 0.3 mg of purified protein per liter of culture, sufficient to allow its use in the development of new analytical methods and your evaluation as a vaccine candidate. It corresponds to an apparent molecular weight of 45 kDa and a theoretical molecular weight of 37kDa. It has the SEQ ID No. 1 sequence referred to above. This protein has 349 amino acids; your pI is 5.07.

[0094] A análise polipeptídica da ES PSAr purificada em gel SDS-PAGE (condições redutoras e não redutoras) é dada na Figura 2.[0094] Polypeptide analysis of ES PSAr purified on SDS-PAGE gel (reducing and non-reducing conditions) is given in Figure 2.

[0095] Os perfis eletroforéticos obtidos após coloração das proteínas (A) e açúcares (B) das ES PSAr produzidas em presença (pista 3) ou em ausência (pista 2) de tunicamicina, são dados na figura 3.[0095] The electrophoretic profiles obtained after staining the proteins (A) and sugars (B) of the ES PSAr produced in the presence (lane 3) or in the absence (lane 2) of tunicamycin, are given in figure 3.

3. Produção em sistema bacteriano recombinante e purificação de C-terPSA3. Production in recombinant bacterial system and purification of C-terPSA

[0096] Os cDNAs do gene LaPSA19s (C-ter PSA) foram inseridos no plasmídeo pQE-31. Os plasmídeos foram especificamente construídos para permitir a produção de uma proteína recombinante possuindo uma 6-His-etiqueta em posição amino- terminal e um sítio de clivagem do marcador. A transformação com o plasmídeo pQE-31-6 (His)-COOH LaPSA19s foi efetuada em células bacterianas E. coli M15 tornadas quimiocompetentes. As colônias recombinantes foram selecionadas para produzir as proteínas recombinantes. O clone o maior produtor foi amplificado em cultura. A proteína correspondente C-ter PSA foi purificada sobre gel Agarose- Níquel. Um rendimento de cerca de 1 mg de proteína recombinante por litro de cultura foi obtido. Ela comporta 119 aminoácidos e apresenta um peso molecular de 18 kDa em condições redutoras e sob forma dímera, em condições não redutoras, um peso molecular de 36 kDa (ver Figura 4).[0096] LaPSA19s gene cDNAs (C-ter PSA) were inserted into plasmid pQE-31. The plasmids were specifically constructed to allow the production of a recombinant protein having an amino terminal 6-His-tag and a marker cleavage site. Transformation with plasmid pQE-31-6 (His) -COOH LaPSA19s was carried out on E. coli M15 bacterial cells made chemocompetent. The recombinant colonies were selected to produce the recombinant proteins. The largest producer clone was amplified in culture. The corresponding C-ter PSA protein was purified on Agarose-Nickel gel. A yield of about 1 mg of recombinant protein per liter of culture was obtained. It holds 119 amino acids and has a molecular weight of 18 kDa in reducing conditions and in a dimer form, in non-reducing conditions, a molecular weight of 36 kDa (see Figure 4).

[0097] Os resultados da análise eletroforética das glicoproteínas solúveis são apresentados na Figura 5: ES PSAr desglicosiladas (1 e 3) e ES PSAr nativa (2 e 4) Exemplo 2: Respostas immunoprotetoras induzidas pela ES PSAr e a C-ter PSA no cão[0097] The results of the electrophoretic analysis of soluble glycoproteins are shown in Figure 5: Deglycosylated ES PSAr (1 and 3) and native PS PSAr (2 and 4) Example 2: Immunoprotective responses induced by ES PSAr and C-ter PSA in dog

[0098] Este teste clínico relatado a seguir visa comparar, em um mesmo teste de vacinação com cães “Beagle”, os efeitos protetores das duas proteínas recombinantes ES PSAr e C-ter PSA sobre grupos de 9 cães e de 5 cães respectivamente. Um grupo placebo de 5 cães constitui o grupo de controle não vacinado. Uma infecção de prova experimental é realizada 2 meses após o protocolo de imunização. Acompanhamentos clínicos e parasitológicos são efetuados a cada 2 meses até 8 meses após a infecção experimental.[0098] This clinical test reported below aims to compare, in the same vaccination test with "Beagle" dogs, the protective effects of the two recombinant proteins ES PSAr and C-ter PSA on groups of 9 dogs and 5 dogs respectively. A placebo group of 5 dogs constitutes the unvaccinated control group. An experimental test infection is performed 2 months after the immunization protocol. Clinical and parasitological follow-ups are carried out every 2 months up to 8 months after the experimental infection.

[0099] O QA21 é utilizado a 60 µm por dose de vacina, quantidade de adjuvante equivalente à contida na vacina CaniLeish. Utilizado sozinho e nesta concentração, não tem nenhum efeito significativo para o sistema imune do cão e do camundongo. 1 - PROTOCOLO DE IMUNIZAÇÃO[0099] QA21 is used at 60 µm per dose of vaccine, an amount of adjuvant equivalent to that contained in the CaniLeish vaccine. Used alone and in this concentration, it has no significant effect on the immune system of the dog and mouse. 1 - IMMUNIZATION PROTOCOL

[0100] O estudo foi efetuado em duplo cego, aleatorizado e controlado. Ele foi aprovado pelo Comité de Ética da Escola Nacional Veterinária de Lyon.[0100] The study was carried out in double blind, randomized and controlled. He was approved by the Ethics Committee of the National Veterinary School of Lyon.

[0101] O protocolo de imunização compreende 3 injeções por via subcutânea realizada com um mês de intervalo. Três grupos de cães foram selecionados do seguinte modo: * Grupo 1: Placebo (Injeção de água fisiológica para preparações injetáveis); * Grupo 2: Injeção de 25µg da LaES PSAr com adjuvantes com 60 µg de QA-21; * Grupo 3: Injeção de 25 µg de C-ter PSA (proteína de sequência SEQ ID N°4) com adjuvantes com 60 µg de QA-21.[0101] The immunization protocol comprises 3 subcutaneous injections performed one month apart. Three groups of dogs were selected as follows: * Group 1: Placebo (Injection of physiological water for injections); * Group 2: Injection of 25 µg of LaES PSAr with adjuvants with 60 µg of QA-21; * Group 3: Injection of 25 µg of C-ter PSA (sequence protein SEQ ID No. 4) with adjuvants with 60 µg of QA-21.

RANDOMIZAÇÃO Vacinados ES PSAr Vacinados C-ter PSA Controles Total Número de cães 9 5 5 19 Número de fêmeas 5 2 3 10 Número de machos 4 3 2 9 Média de idade (ano 2, 69 2, 93 2, 87 2, 89 Desvio tipo idade (ano) 1, 12 1, 10 1, 14 1, 08 Média de peso (kg) 15,2 15,4 14,8 14,9 Desvio tipo de peso (kg) 2,5 2,2 2,4 2,3RANDOMIZATION Vaccinated ES PSAr Vaccinated C-ter PSA Controls Total Number of dogs 9 5 5 19 Number of females 5 2 3 10 Number of males 4 3 2 9 Average age (year 2, 69 2, 93 2, 87 2, 89 Deviation age type (year) 1, 12 1, 10 1, 14 1, 08 Average weight (kg) 15.2 15.4 14.8 14.9 Deviation type of weight (kg) 2.5 2.2 2, 4 2.3

2 - PROTOCOLO DAS AMOSTRAS2 - SAMPLE PROTOCOL

[0102] Diferentes amostras antes do desafio infeccioso foram realizadas: T0: antes de qualquer imunização T3: um mês após a administração de duas doses de vacina T5: dois meses após a administração de três doses da vacina. 3 - ACOMPANHAMENTOS CLÍNICOS:[0102] Different samples were taken before the infectious challenge: T0: before any T3 immunization: one month after the administration of two doses of T5 vaccine: two months after the administration of three doses of the vaccine. 3 - CLINICAL FOLLOW-UP:

[0103] Estes acompanhamentos são efetuados - na recepção dos animais - 1 vez/mês durante todo o estudo - diariamente durante 5 dias após o desafio experimental 4 - ACOMPANHAMENTOS IMUNOLÓGICOS E PARASITOLÓGICOS:[0103] These follow-ups are carried out - at the reception of the animals - 1 time / month throughout the study - daily for 5 days after the experimental challenge 4 - IMMUNOLOGICAL AND PARASITOLOGICAL FOLLOW-UP:

[0104] Imunológicos: - sorologia específica a T0, T3 e T5 - efeito leishmanicida a T0 e T5 - dosagem de óxido nítrico (NO) e determinação da produção de IFN-γ em sobrenadantes de co-cultura a T0 e T5. Parasitológicos:[0104] Immunological: - specific serology at T0, T3 and T5 - leishmanicidal effect at T0 and T5 - dosage of nitric oxide (NO) and determination of IFN-γ production in supernatants of co-culture at T0 and T5. Parasitological:

[0105] Uma infecção de prova experimental (injeção de 109 promastigotas metacíclicas de L. infantum pela via intravenosa) foi realizada 2 meses após o protocolo de imunização. Acompanhamentos clínicos e parasitológicos foram efetuados a cada 2 meses durante 8 meses após a infecção experimental.[0105] An experimental test infection (injection of 109 metacyclic promastigotes of L. infantum intravenously) was performed 2 months after the immunization protocol. Clinical and parasitological follow-ups were performed every 2 months for 8 months after the experimental infection.

[0106] PCR e uma colocação em cultura de amostras de medulas ósseas a T0, 2 meses após desafio (T6), 4 meses após desafio (T7), e 6 meses após desafio (T8) foram realizados para evidenciar a presença do parasita ou de seu DNA. 5 - RESULTADOS[0106] PCR and culture of bone marrow samples at T0, 2 months after challenge (T6), 4 months after challenge (T7), and 6 months after challenge (T8) were performed to evidence the presence of the parasite or of your DNA. 5 - RESULTS

5.1 - Respostas com mediação humoral a - Análise da resposta anticorpo específico de isotipo IgG25.1 - Responses with humoral mediation a - Analysis of the IgG2 isotype specific antibody response

[0107] Técnicas ELISA foram realizadas para analisar as respostas anticorpo nos cães do estudo. Os títulos médios anticorpos IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr e anti-Cter PSA foram comparados pela técnica ELISA entre cães placebos e cães vacinados antes imunização (T0) e em diferentes tempos de pós-imunização: - um mês após a administração de duas doses de vacina (T3) e/ou - dois meses após três injeções (T5).[0107] ELISA techniques were performed to analyze the antibody responses in the study dogs. The mean titers of IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr and anti-Cter PSA antibodies were compared by the ELISA technique between placebo dogs and vaccinated dogs before immunization (T0) and at different post-immunization times: - one month after the administration of two doses of vaccine (T3) and / or - two months after three injections (T5).

[0108] Todos os cães sob estudo revelaram-se sorologicamente negativos em T0 (figuras 5, 6 e 7). Todos os cães pertencendo ao grupo placebo apresentam títulos de anticorpo de isotipo IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr e anti-C-ter PSA inferiores ao corte correspondente e isto qualquer que seja o período de retirada da amostra (T3 e T5) (Figuras 6,7 e 8).[0108] All dogs under study were serologically negative at T0 (Figures 5, 6 and 7). All dogs belonging to the placebo group have anti-AES, anti-ES PSAr and anti-C-ter PSA isotype antibody titers lower than the corresponding cut and this regardless of the sample withdrawal period (T3 and T5) ( Figures 6,7 and 8).

[0109] As respostas anticorpos IgG anti-Leishmania determinadas são negativas em todos os cães do estudo antes da imunização, bem como com todos os cães do grupo placebo em T5.[0109] The determined anti-Leishmania IgG antibody responses are negative in all dogs in the study prior to immunization, as well as with all dogs in the T5 placebo group.

[0110] Apenas uma produção significativamente elevada de anticorpos de isotipo IgG2 especificamente dirigidos contra AES (figura 6), ES PSAr (figura 7) e C-ter PSA (figura 8) é evidenciada em todos os cães vacinados a partir do primeiro mês após a administração de duas doses de vacina (T3) e dois meses após a administração de três doses da vacina (T5).[0110] Only a significantly high production of IgG2 isotype antibodies specifically directed against AES (figure 6), ES PSAr (figure 7) and C-ter PSA (figure 8) is evident in all dogs vaccinated from the first month after administration of two doses of vaccine (T3) and two months after administration of three doses of vaccine (T5).

[0111] As médias dos títulos anticorpos IgG2 são significativamente mais elevadas nos cães vacinados que nos cães placebos (P <0/05) aos tempos T3 e T5 após-imunização (Figuras 6, 7 e 8).[0111] The mean IgG2 antibody titers are significantly higher in vaccinated dogs than in placebo dogs (P <0/05) at times T3 and T5 after immunization (Figures 6, 7 and 8).

[0112] Os candidatos vacinas não induzem no cão anticorpos IgG anti- Leishmania (antígeno figurado) pela técnica de imunofluorescência indireta (IFI, técnica de referência para o diagnóstico sorológico) em todos os cães vacinados (título IFI negativos em T3 e T5).[0112] Vaccine candidates do not induce anti-Leishmania IgG antibodies (figured antigen) in the dog by the indirect immunofluorescence technique (IFI, reference technique for serological diagnosis) in all vaccinated dogs (IFI titer negative in T3 and T5).

[0113] A evidência de anticorpos de isotipo IgG2 mostra, com certeza, a indução de uma imunidade celular de tipo Th1 (imunidade protetora). b - Papel biológico funcional dos anticorpos produzidos b1 - Efeito dos soros de cães vacinados (CaniLeish®, ES PSAr e C-ter PSA) sobre a viabilidade e a proliferação das leishmanias[0113] Evidence of IgG2 isotype antibodies certainly shows the induction of Th1-type cellular immunity (protective immunity). b - Functional biological role of antibodies produced b1 - Effect of vaccinated dog sera (CaniLeish®, ES PSAr and C-ter PSA) on the viability and proliferation of leishmanias

[0114] As promastigotas transgenes de L. infantum (MON1, c12, NEO/Luc) transfectadas com o gene da luciferase são incubadas durante 5 dias na ausência ou na presença de soro (descomplementadas) de cães placebos e vacinados. O número de parasitas é determinado por luminometria (RLU). Os resultados são expressos em percentagem de inibição da multiplicação das promastigotas.[0114] L. infantum transgenic promastigotes (MON1, c12, NEO / Luc) transfected with the luciferase gene are incubated for 5 days in the absence or in the presence of (uncomplicated) serum from placebo and vaccinated dogs. The number of parasites is determined by luminometry (RLU). The results are expressed as a percentage of inhibition of the multiplication of promastigotes.

[0115] Como mostrado na Figura 9, um efeito leishmanicida significativo (p <0,01) é observado sobre as formas promastigóticas de L. infantum quando os parasitas são incubados durante 30 min com soro não diluído de cães vacinados (ES PSAr e C-ter PSA), enquanto que as percentagens de viabilidade permanecem elevadas com os soros de cães placebos (menos de 10% de redução do crescimento parasitário). Inibições de 60%, 70% e 85% da proliferação parasitária são observadas respectivamente com os soros de cães vacinados com CaniLeish®, a ES PSAr e C-ter PSA (p <0,01). Este efeito leishmanicida é menos pronunciado com diluição de ½ e se apaga com a diluição de 1/8.[0115] As shown in Figure 9, a significant leishmanicidal effect (p <0.01) is observed on the promastigotic forms of L. infantum when the parasites are incubated for 30 min with undiluted serum from vaccinated dogs (ES PSAr and C -ter PSA), while the viability percentages remain high with the sera of placebo dogs (less than 10% reduction in parasitic growth). Inhibitions of 60%, 70% and 85% of parasitic proliferation are observed with the sera of dogs vaccinated with CaniLeish®, ES PSAr and C-ter PSA respectively (p <0.01). This leishmanicidal effect is less pronounced at ½ dilution and is extinguished at 1/8 dilution.

[0116] A proliferação dos parasitas não tratados era muito semelhante à dos parasitas tratados com soros de cães do grupo placebo, qualquer que seja a diluição do soro utilizada. Menos de 10% de redução do crescimento era observado.[0116] The proliferation of untreated parasites was very similar to that of parasites treated with sera from dogs of the placebo group, whatever the dilution of the serum used. Less than 10% reduction in growth was observed.

[0117] Em contrapartida, os soros de cães vacinados não têm nenhum efeito sobre a diferenciação das promastigotas em amastigotas). b2- Efeito neutralizando de soros de coelho policlonais monoespecíficos anti-ES PSAr e anti-C ter PSA[0117] In contrast, sera from vaccinated dogs have no effect on the differentiation of promastigotes into amastigotes). b2- Neutralizing effect of polyclonal rabbit sera monospecific anti-ES PSAr and anti-C ter PSA

[0118] Formas promatigóticas foram incubadas na presença de diferentes diluições (1/10, 1/50 e 1/100) de soros de coelhos saudáveis ou previamente imunizados com a ES PSAr (ou C-ter PSA) depois lavadas três vezes por centrifugação para eliminar o excedente de soro. As suas capacidades de infectar os macrófagos derivados de monócitos caninos foram estudadas determinando a percentagem de redução do Índice Parasitário (IP) após 72 h de interação.[0118] Promatigotic forms were incubated in the presence of different dilutions (1/10, 1/50 and 1/100) of sera from healthy rabbits or previously immunized with ES PSAr (or C-ter PSA) then washed three times by centrifugation to eliminate excess serum. Its ability to infect canine monocyte-derived macrophages was studied by determining the percentage of reduction in the Parasitic Index (PI) after 72 h of interaction.

[0119] Como mostrado na Figura 10, as promastigotas tratadas com soro de coelho revelaram-se ser mais infeciosas com relação aos macrófagos que as não tratadas. Em contrapartida, a exposição dos parasitas aos soros de coelhos policlonais monoespecíficos antiES PSAr ou anti-C-ter PSA inibe a sua capacidade de infectar ex vivo os macrófagos derivados de monócitos caninos. O efeito do soro anti-C-ter PSA na diluição 1/100 é mais pronunciado que o do soro antiES PSAr na mesma diluição (Figura 10).[0119] As shown in Figure 10, promastigotes treated with rabbit serum were found to be more infectious with respect to macrophages than untreated ones. In contrast, the parasites' exposure to monospecific antiES PSAr or anti-C-ter PSA polyclonal rabbit sera inhibits their ability to infect canine monocyte-derived macrophages ex vivo. The effect of anti-C-ter PSA serum at 1/100 dilution is more pronounced than that of antiES PSAr serum at the same dilution (Figure 10).

[0120] O efeito do soro de coelho policlonal monoespecífico dirigido contra a parte C-ter PSA também foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigóticas de L. infantum. Como mostrado na Figura 11, uma inibição quase total da multiplicação das promastigotas é observada quando o soro é adicionado na diluição de 1/25 a cada dois dias da cultura de parasitas. Utilizada em diluição 1/50, esta inibição é parcial.[0120] The effect of monospecific polyclonal rabbit serum directed against the C-ter PSA part was also evaluated on the in vitro growth of L. infantum promastigotic forms. As shown in Figure 11, an almost total inhibition of the multiplication of promastigotes is observed when the serum is added at 1/25 dilution every two days of the parasite culture. Used in 1/50 dilution, this inhibition is partial.

[0121] Em contrapartida, a adição a cada dois dias de diferentes concentrações de ES PSAr (0,22 µΜ et 17,8 µΜ) à cultura dos promastigotas de L. infantum ativa significativamente a proliferação dos parasitas (Figura 12).[0121] In contrast, the addition every two days of different concentrations of ES PSAr (0.22 µΜ and 17.8 µΜ) to the culture of L. infantum promastigotes significantly activates the proliferation of parasites (Figure 12).

5.2 Respostas à mediação celular A - Atividades leishmanicidas dos macrófagos caninos5.2 Responses to cell mediation A - Leishmanicidal activities of canine macrophages

[0122] As atividades leishmanicidas reveladas pelas células dos cães do grupo Placebo versus os do grupo Vacinados foram avaliadas antes (T0) e um mês após a administração de 2 doses de vacina (T3) e dois meses após a injeção de 3 doses (T5).[0122] Leishmanicidal activities revealed by cells of dogs in the Placebo group versus those in the Vaccinated group were evaluated before (T0) and one month after the administration of 2 doses of vaccine (T3) and two months after the injection of 3 doses (T5 ).

[0123] A incubação dos linfócitos autólogos com os macrófagos infectados provenientes dos cães pré-imunes (T0), mas também dos cães placebo em diferentes tempos de pós-imunização (T3 et T5) induz atividades leishmanicidas inferiores à 20% de redução do índice parasitário (Figura 13).[0123] Incubation of autologous lymphocytes with infected macrophages from pre-immune dogs (T0), but also from placebo dogs at different times of post-immunization (T3 and T5) induces leishmanicidal activities below 20% reduction in the index parasitic (Figure 13).

[0124] De modo notável, os efeitos leishmanicidas revelados pela co-cultura das células isoladas dos cães vacinados com a ES PSAr ou C-ter PSA aumentam significativamente em T3 (60% e 40% de redução do índice parasitário, respectivamente, P<0,05) e sobrem ainda a T5 (90% e 60% de redução respectivamente, P<0,01) (Figura 13).[0124] Notably, the leishmanicidal effects revealed by the co-culture of cells isolated from dogs vaccinated with ES PSAr or C-ter PSA increase significantly by T3 (60% and 40% reduction in the parasitic index, respectively, P < 0.05) and still remain at T5 (90% and 60% reduction respectively, P <0.01) (Figure 13).

[0125] Estes efeitos leishmanicidas são acompanhados a T5 de uma produção seletiva e significativas de óxido nítrico (NO) (Figura 15) e de interferon (IFN) - γ (Figura 14) nos cães vacinados com ES PSAr ou C-ter PSA.[0125] These leishmanicidal effects are accompanied at T5 by a selective and significant production of nitric oxide (NO) (Figure 15) and interferon (IFN) - γ (Figure 14) in dogs vaccinated with ES PSAr or C-ter PSA.

5.3 Acompanhamentos parasitológicos dos cães após prova infecciosa5.3 Parasitological monitoring of dogs after an infectious test

[0126] Os acompanhamentos parasitológicos foram realizados nos cães utilizando dois métodos de amplificação: - o visando detectar a presença dos parasitas na medula óssea após colocação em cultura de amostras de medula óssea em meio NNN; - o visando detectar o DNA parasitário por uma técnica de amplificação de genes (PCR) que, acoplada a PCR-quantitativo, apresenta a vantagem de avaliar quantitativamente a carga parasitária.[0126] Parasitological follow-ups were performed on dogs using two amplification methods: - o aiming to detect the presence of parasites in the bone marrow after placing bone marrow samples in NNN culture; - the aim of detecting parasitic DNA by a gene amplification technique (PCR) that, coupled with quantitative PCR, has the advantage of quantitatively evaluating the parasitic burden.

[0127] Os acompanhamentos parasitológicos efetuados em T0 permitem mostrar que o conjunto dos cães do estudo era ileso para leishmanias antes da prova infecciosa experimental (Figuras 16 e 17)[0127] The parasitological follow-ups carried out at T0 show that the group of dogs in the study was unharmed for leishmanias before the experimental infectious test (Figures 16 and 17)

[0128] De acordo com as Figuras 16, 17 e 18 e o estudo estatístico, os resultados do acompanhamento parasitológico são os seguintes: - 2 meses após a prova infeciosa[0128] According to Figures 16, 17 and 18 and the statistical study, the results of parasitological monitoring are as follows: - 2 months after the infectious test

[0129] Nenhuma diferença significativa em grupos placebo e vacinados foi destacada. Todos os cães eram parasitologicamente negativos. - 4 meses após a prova infecciosa[0129] No significant differences in placebo and vaccinated groups were highlighted. All dogs were parasitologically negative. - 4 months after the infectious test

[0130] Os resultados são pouco significativos entre o grupo de cães placebo e o grupo de cães vacinados com Cter PSA (p = 0,04852). Em contrapartida, os placebos têm significativamente mais cães infectados que os vacinados com a ES PSAr (p = 0,0256) - 6 meses após a prova infecciosa[0130] The results are insignificant between the group of placebo dogs and the group of dogs vaccinated with Cter PSA (p = 0.04852). In contrast, placebos have significantly more infected dogs than those vaccinated with ES PSAr (p = 0.0256) - 6 months after infectious testing

[0131] Todos os cães do grupo placebo são infectados enquanto que apenas 22% e 20% dos cães vacinados respectivamente com ES PSAr e C-ter PSA o são. As diferenças entre grupos placebo e vacinados são, portanto, muito significativas (p <0,01).[0131] All dogs in the placebo group are infected whereas only 22% and 20% of dogs vaccinated with ES PSAr and C-ter PSA respectively are infected. The differences between placebo and vaccinated groups are therefore very significant (p <0.01).

5.4 Conclusões:5.4 Conclusions:

[0132] A proteína PSA recombinante (ES PSAr) bem como sua parte carbóxi- terminal (C-ter PSA) combinada com QA-21 conferem ao cão um excelente nível de proteção contra uma infecção experimental por L. infantum. Esta proteção é acompanhada por: - a produção de anticorpos específica principalmente de isotipo IgG2 que parece desempenhar um papel não negligenciável na proteção (efeitos leishmanicida e neutralizante); - a polarização da resposta à mediação celular para uma via de tipo Th1 revelada por um aumento da produção pelos linfócitos T de IFN-γ conduzindo à ativação pela via clássica dos macrófagos caracterizada pela síntese aumentada de NO e, portanto, pela eliminação das leishmanias intracelulares (atividade leishmanicida dos macrófagos caninos).[0132] The recombinant PSA protein (ES PSAr) as well as its carboxy terminal part (C-ter PSA) combined with QA-21 give the dog an excellent level of protection against an experimental infection by L. infantum. This protection is accompanied by: - the production of specific antibodies, mainly of the IgG2 isotype, which seems to play a not negligible role in the protection (leishmanicidal and neutralizing effects); - the polarization of the response to cell mediation to a Th1-type pathway revealed by an increase in production by T lymphocytes of IFN-γ leading to activation by the classic pathway of macrophages characterized by increased NO synthesis and, therefore, by the elimination of intracellular leishmanias (leishmanicidal activity of canine macrophages).

[0133] As propriedades notáveis da ES PSAr bem como de sua parte C-ter também são reveladas por: - o efeito inibidor de um soro de coelho policlonal monoespecífico dirigido contra C-ter PSA sobre o crescimento das formas promastigóticas de L. infantum; - o efeito neutralizante de soros de coelho policlonal monoespecífico anti- rPSA e anti-C-ter PSA sobre a capacidade das promastigotas de infectar ex vivo os macrófagos; - o efeito “fator de crescimento” da ES PSAr sobre a proliferação das formas promastigóticas. Exemplo 3 -: Testes sobre células humanas[0133] The remarkable properties of ES PSAr as well as its C-ter part are also revealed by: - the inhibitory effect of a monospecific polyclonal rabbit serum directed against C-ter PSA on the growth of the promastigotic forms of L. infantum; - the neutralizing effect of polyclonal monospecific rabbit sera anti-rPSA and anti-C-ter PSA on the ability of promastigotes to infect macrophages ex vivo; - the "growth factor" effect of ES PSAr on the proliferation of promastigotic forms. Example 3 -: Tests on human cells

[0134] A imunogenicidade da PSA recombinante nativa (ES PSAr) foi avaliada sobre células humanas pela análise do perfil da resposta imune celular gerada ex vivo no homem.[0134] The immunogenicity of native recombinant PSA (ES PSAr) was evaluated on human cells by analyzing the profile of the cellular immune response generated ex vivo in man.

[0135] A capacidade da ES PSAr de induzir, ex vivo, sobre células humanas, uma resposta imune à mediação celular específica ativando os linfócitos T produtores de citocinas de tipo Th1 e/ou Granzima B proveniente de doadores saudáveis em comparação com indivíduos imunes ou curados expostos à leishmaniose visceral ao L. infantum no sul da França, foi avaliada.[0135] ES PSAr's ability to induce, ex vivo, in human cells, an immune response to specific cell mediation by activating Th1 and / or Granzyme B-producing T lymphocytes from healthy donors compared to immune individuals or cured animals exposed to visceral leishmaniasis to L. infantum in southern France, was evaluated.

[0136] Com efeito, um conjunto de métodos imunológico e parasitológico, associados ao acompanhamento clínico, foi empregado.[0136] Indeed, a set of immunological and parasitological methods, associated with clinical monitoring, was employed.

[0137] Os resultados são dados nas Tabelas 1 e 2 seguintes:[0137] The results are given in Tables 1 and 2 below:

Tabela 1 Taxas de IFN-γ (pg/ml) nos sobrenadantes de co-cultura de células humanas provenientes de indivíduos saudáveis (B, IND 8 a 15) e indivíduos imunes assintomáticos ou curados (A, IND 1 a 7) expostos no sul da França à leishmaniose visceral por L. infantum.Table 1 Rates of IFN-γ (pg / ml) in human cell co-culture supernatants from healthy individuals (B, IND 8 to 15) and asymptomatic or cured immune individuals (A, IND 1 to 7) exposed in the south from France to visceral leishmaniasis by L. infantum.

Só meio Só meio TSLA Ldd8: extrato parasitário total de promastigotas de L. donovani TSLA Ldi: extrato parasitário total de promastigotas de L. infantum.Only half Just half TSLA Ldd8: total parasitic extract of L. donovani promastigotes TSLA Ldi: total parasitic extract of L. infantum promastigotes.

Tabela 2 Produção de Granzima B (pg/ml) em sobrenadante de co-cultura de células humanas provenientes de indivíduos saudáveis (B, IND 8 a 15) e indivíduos imunes assintomáticos ou curados (A, IND 1, 3, 5 e 6) expostos no sul da França à leishmaniose visceral por L. infantum.Table 2 Production of Granzyme B (pg / ml) in supernatant from human cell co-culture from healthy individuals (B, IND 8 to 15) and asymptomatic or cured immune individuals (A, IND 1, 3, 5 and 6) exposed in the south of France to visceral leishmaniasis by L. infantum.

Só meio Só meio TSLA Ldd8: extrato parasitário total de promastigotas de L. donovani TSLA Ldi: extrato parasitário total de promastigotas de L. infantumJust half Just half TSLA Ldd8: total parasitic extract of L. donovani promastigotes TSLA Ldi: total parasitic extract of L. infantum promastigotes

[0138] A análise dos resultados dos testes celulares mostra que a ES PSAr constituindo o candidato vacinal é capaz de induzir uma resposta imune específica de tipo Th1, gerando taxas significativas de IFN-gama (Tabela 1), e/ou uma resposta T-citotóxica determinada por uma produção significativa de Granzima B (Tabela 2) em indivíduos imunes assintomáticos ou curados em relação aos indivíduos saudáveis. Os resultados dos testes de imunogenicidade do candidato vacinal ES[0138] Analysis of cell test results shows that ES PSAr constituting the vaccine candidate is able to induce a specific Th1-type immune response, generating significant IFN-gamma rates (Table 1), and / or a T- cytotoxicity determined by a significant production of Granzima B (Table 2) in asymptomatic or cured immune individuals in relation to healthy individuals. The results of the immunogenicity tests of the ES vaccine candidate

PSAr confirmam o interesse desta proteína recombinante de ser selecionada para entrar na composição de uma vacina contra as leishmanioses humanas.PSAr confirm the interest of this recombinant protein to be selected to enter the composition of a vaccine against human leishmaniasis.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 - Dumonteil E. et al., Vaccine, 2003 May 16; 21 (17-18 ): 2161-8. ; 2 - Rafati S. et al, Vaccine, 2005, May 25; 23(28):3716-25; 3 - Rodriguez-Cortes A. et al, Vaccine, 2007, Nov 14;25 (46) -.7962-71; 4 - Morris R.V. et al, J. Immunol. , 2001, Nov 1, 167 (9) :5226-30; 5 - Valenzuela J.G. et al, J. Exp. Biol., 2004, Oct 207(Pt21):3717-29.BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES 1 - Dumonteil E. et al., Vaccine, 2003 May 16; 21 (17-18): 2161-8. ; 2 - Rafati S. et al, Vaccine, 2005, May 25; 23 (28): 3716-25; 3 - Rodriguez-Cortes A. et al, Vaccine, 2007, Nov 14; 25 (46) -.7962-71; 4 - Morris R.V. et al, J. Immunol. , 2001, Nov 1, 167 (9): 5226-30; 5 - Valenzuela J.G. et al, J. Exp. Biol., 2004, Oct 207 (Pt21): 3717-29.

Claims

1. Use, as a vaccine molecule in a mammal, characterized by the fact that it is a PSA protein (Promastigote Surface Antigen), originating from leishmania, or a part of this PSA having immunogenic properties, the PSA designated below as ES PSAr, presenting if in soluble, native, recombinant form.

2. Use according to claim 1, characterized by the fact that the ES PSAr molecule is complete.

3. Use of an ES PSAr, characterized by the fact that it does not include all co- and post-translational modifications.

4. Use according to any one of claims 1, 2 or 3, characterized in that it is a glycosylated PSAr ES or deglycosylated PSAr ES.

5. Use according to either of claims 3 or 4, characterized by the fact that the ES PSAr is devoid of GPI anchor.

6. Use according to any of claims 1, 3 or 4, characterized by the fact that the ES PSAr is devoid of the carboxy-terminal part.

7. Use according to claim 1, characterized by the fact that the ES PSAr part is the C-terminal part, hereinafter referred to as C-ter PSA, or the C-terminal part of the PSA as isolated from a supernatant of leishmania culture excretion / secretion.

8. Use according to any one of claims 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, characterized by the fact that the ES PSAr or part of this PSA is as obtained from the PSA of L. amazonensis or a leishmania from the donovani complex, particularly from L. infantum or L. donovani, or from the braziliensis and tropica complex.

9. Use according to claim 8, characterized by the fact that the ES PSAr has the sequence SEQ ID N ° 1, SEQ ID N ° 2 or SEQ ID N ° 3.

10. Use according to either of claims 7 or 8, characterized in that the C-terminal part of the PSA has the sequence SEQ ID N ° 4.

11. Use according to any one of claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 or 9, characterized by the fact that ES PSAr is produced by inserting a vector comprising the gene encoding ES PSAr or a portion of ES PSAr, in particular a deleted portion of the GPI anchor, in a leishmania eukaryotic recombinant expression system.

12. Use, according to claim 11, characterized by the fact that the recombinant expression system used is that of a non-pathogenic leishmania in mammals.

13. Use according to either of claims 11 or 12, characterized by the fact that the eukaryotic recombinant expression system consists of that of Leishmania tarentolae promastigotes.

14. Use according to claim 13, characterized by the fact that the expression vector containing the gene encoding ES PSAr PSA is integrated into the 18S rRNA locus of the Leishmania tarentolae chromosome.

15. Process for the production of ES PSAr in soluble form, characterized by the fact that it comprises the steps defined in any one of claims 11 to 14.

16. Production process of part C-ter PSA according to any one of claims 1, 7, 8 or 10, characterized in that it is carried out in a recombinant bacterial system.

17. Recombinant protein characterized by the fact that it is a PS PS ES in soluble, native, recombinant form, comprising, as the case may be, one or more co- and post-translational modifications, such as acetification, hydroxylation, disulfide bridges , glycylation, glycosylation, phosphorylation, lipid anchoring and / or lacking the GPI anchor.

18. Recombinant protein according to claim 17, characterized by the fact that it is a glycosylated PSAr ES or a deglycosylated PSAr ES.

19. Recombinant protein according to either of claims 17 or 18, characterized in that it is deleted from the GPI anchor.

20. Peptide characterized by the fact that it is part C-ter of the ES PSAr according to any of claims 7, 8 or 10.

21. Vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniasis characterized by the fact of understanding:. a leishmania ES PSAr protein and / or the C-ter part of the leishmania PSA, as used in accordance with any one of claims 1 to 14, or as defined in any one of claims 17 to 20; and . one or more adjuvants and / or one or more immunomodulators.

22. Vaccine composition according to claim 21, characterized by the fact that the adjuvant is advantageously chosen from those capable of inducing a response to cell mediation leading to the elimination of the parasite.

23. Vaccine composition according to claim 22, characterized by the fact that adjuvants are chosen from those in classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, saponins and their derivatives, oil in water or water emulsions in oil, polysaccharides, cationic liposomes, virosomes or polyelectrolytes and immunomodulators are chosen from the phlebotome saliva proteins, cytokines and HSP20 heat shock proteins.

24. Vaccine composition according to any one of claims 21, 22 or 23, characterized in that it is presented in a form allowing administration by different routes, such as subcutaneous, intradermal, intramuscular, parenteral, endonasal, mucosal or oral route .

25. Vaccine composition according to any one of claims 21, 22, 23 or 24, characterized in that for the manufacture of a medicine or a vaccine, an in vivo or in vitro diagnostic reagent for induction or diagnosis in the mammal of an activation of immunity with cellular mediation dependent on lymphocytes of type Th1 and / or the effector humoral immunity.

26. Composition according to claim 24, characterized by the fact that it is for the induction or diagnosis in the mammal of the transition from a Th2-type immune state to a Th1-type immune state, or for induction or diagnosis in the neutralizing and / or lytic IgG2 isotype specific antibodies that recognize the antigenic determinants of the parasites.

27. IgG2-specific antibodies and immunosomes containing them, characterized in that they are directed against an ES PSAr or a part of ES PSAr according to any one of claims 17 to 20.