BR112015025257B1 - Complexo imunogênico para uso em vacinação e método para a obtenção do mesmo - Google Patents
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COMPLEXO IMUNOGÊNICO PARA USO EM VACINAÇÃO E MÉTODO PARA OBTENÇÃO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um complexo imunogênico compreendendo um antígeno polimerizado, manana e um dialdeído, a composição compreendendo o mesmo e seu uso como um estimulador de resposta imune e vacina. Similarmente, a invenção se refere a um método para a obtenção do referido complexo imunogênico, com base no antígeno e na conjugação e polimerização simultânea de manana pela utilização de um dialdeído.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um complexo imunogênico compreendendo um antígeno polimerizado, manana e um dialdeído, a composição compreendendo o mesmo e seu uso como um estimulador de resposta imune e vacina. Similarmente, a invenção se refere a um método para a obtenção do referido complexo imunogênico, com base no antígeno e na conjugação e polimerização simultânea de manana pela utilização de um dialdeído. Portanto, a invenção se situa no campo da imunologia e produção de vacinas, bem como no campo de tratamento e prevenção de alergias.
[0002] Células dendríticas (CD) são células que apresentam antígenos e são especializadas em estimular eficientemente as células T; por isso são fundamentais para induzir uma resposta imune específica. As CDs imaturas são estrategicamente distribuídas em tecidos e órgãos onde atuam como sentinelas, continuamente carregando amostras de antígeno em seu microambiente. CDs iniciam um processo de maturação como resposta a diferentes estímulos, incluindo os próprios antígenos, produtos de micro-organismos e sinais de perigo aos tecidos, o que leva à migração em direção a áreas T de órgãos linfáticos secundários, carregando os antígenos portados por eles na periferia. Aqui, células CDs maduras, mostrando um aumento na expressão de HLA-II e moléculas co- estimulatórias, interagem com as células T apresentando os peptídeos antigênicos a elas depois que são processadas, estimulando-as a iniciar a resposta específica.
[0003] CDs imaturas capturam antígenos por fagocitose, micropinocitose e endocitose mediada por receptores. Há diferentes receptores envolvidos na captação endocítica, entre os quais receptores de manose (RM) são encontrados (CD206 e CD209).
[0004] Eles reconhecem resíduos de manose terminais, fucose e / ou N-acetil- glucosamina através de domínios de carboidratos de reconhecimento. Ligandos naturais incluem produtos de origem bacteriana (glicoproteínas e glicolípidos), bem como glicoproteínas de mamíferos que têm alto teor de manose. RMs são expressas em macrófagos e células dendríticas imaturas, estando envolvidos na endocitose de antígenos manosilados para processamento e apresentação de células T dos mesmos.
[0005] A imunoterapia em condições alérgicas mediadas por IgE baseia-se na administração de vacinas terapêuticas cujos antígenos são os mesmos alérgenos aos quais o doente alérgico é sensibilizado. Alérgenos são proteínas de pólens, ácaros, epitélio, etc, que são as superestruturas contidas no ar que o paciente respira (inalantes ambientais). É amplamente aceito que a eficácia clínica dessas vacinas está associada à dose do alérgeno administrado; assim, as orientações da OMS e de consenso das associações científicas recomendam que as vacinas devem ser preparadas com uma concentração suficiente de alérgeno. Essa exigência implica que a resposta alérgica ao paciente da dose da vacina envolve o risco de efeitos adversos, que se destinam a ser limitados. Uma maneira de evitar isso é a preparação de vacinas baseadas em alérgenos modificados (alergóides) mostrando menor capacidade de reação contra anticorpos IgE (menos alergenicidade).
[0006] As modificações químicas baseadas em tratar alérgenos com formaldeído e / ou glutaraldeído, são as mais amplamente utilizadas entre os fabricantes de vacinas. A reação de grupos aldeído (R-CHO) com os grupos amino (R-NH2), que estão presentes em aminoácidos alérgenos, por exemplo, lisinas, é a base de tal modificação. Contrariamente ao formaldeído, que é um mono-aldeído, o glutaraldeído é um dialdeído possuindo dois grupos R-CHO capazes de reagir com lisinas R-NH2 presentes em moléculas diferentes. Isto gera a polimerização de um alérgeno e perda de reatividade com os anticorpos IgE específicos (o alergóide que é formado por meio de formaldeído baseia-se na modificação estrutural da proteína, e não na polimerização da mesma). Essa polimerização é considerada para determinar alergenicidade mais baixa ao alergóide, uma vez que os anticorpos IgE perdem sua acessibilidade para reagir com seus epítopos (sítios de ligação de alérgenos), e reduzem o número de mastócitos sensibilizados com IgE que podem ser ativados por eles. A perda de alergenicidade de alérgenos polimerizados pode implicar uma perda de imunogenicidade, o que reduziria a eficácia clínica dessas preparações. Tem sido sugerido que a polimerização reduz o acesso de MR em DCs para os resíduos de manose do alérgeno, e que esta é decisiva para a perda de imunogenicidade de alérgenos polimerizados. Isto é apoiado no fato de que os resíduos de manose são um dos principais ligandos utilizados por DCs para captação de alérgenos, e que tais células desempenham um papel crítico na apresentação do alérgeno na resposta à células T.
[0007] Métodos para a conjugação de açucares em proteínas são principalmente baseadas na ativação de açúcar por um processo de oxidação, gerando grupos de aldeído reativos (R-CHO) por conversão dos grupos cis-glicol. O R-CHO gerado no açúcar oxidado, após tratamento com metaperiodato, por exemplo, pode reagir com os grupos ε-amino de lisinas, resultando na formação de bases de Schiff. Esta metodologia é altamente apropriada para conjugar glicoproteínas (ex. enzimas, anticorpos), uma vez que seu resíduo carboidrato é usado para conjugação e evita a porção de proteína associada à sua atividade biológica.
[0008] Embora a oxidação de açúcar com periodato tenha sido relatada como um caminho para proteínas manossilato (Masarova et al. 2002. Int. J. Polymer. Anal. Charact., 7: 106-116), incluindo alérgenos (Weinberger et al. 2013. J Control Release, 165: 101-109), seu uso para antígenos polimerizados manossilato tem duas desvantagens: 1 ) A oxidação de açucares produz a rupture de ligações entre carbonos adjacentes que contém grupos hidroxilo (OH) e que são a base para a geração de aldeídos reativos. Tal ruptura afeta a estrutura de manose (Shibuya, N., et al. 1988. J. Biol. Chem., 263: 728-734), alterando sua capacidade de ligação à lectinas que reconhecem manose (Masarova et al. 2001, Chem. Pap. 55: 130-135) e sua capacidade de ativação de DC (Sheng et al, 2006. Immunology, 118:372-383). Embora a perda de integridade estrutural de manose seja minimizada reduzindo-se o grau de oxidação (Masarova et al. 2001, Chem. Pap. 55: 130—135), sua eficiência para conjugação sob condições mais amenas é submetida à natureza da proteína a ser manosilada (Weinberger et al. 2013, J. Control Release, 165: 101-109). A fim de preservar a manose em sua forma nativa, houve tentativas de desempenhar manosilação de proteínas por meio de reações de glicolização em temperatura elevada, mas com resultado negative na ausência de oxidação (Kanska et al. 2008. Biotechnol. Appl. Biochem. 49: 57-64). 2 ) Manose ativada após sua oxidação gera aldeídos reativos que devem interagir com grupos amino da proteína a ser manosilada. No entanto, a polimerização de proteínas com glucataraldeído produz uma redução dramática desses grupos amino, uma vez que eles já foram usados em sua reação com o próprio glutaraldeído. Sob essas condições, a eficiência de manose ativada para manosilar proteínas previamente tratadas com glutaraldeído é provavelmente muito baixa, assim como a capacidade de glutaraldeído de polimerizar quando da ausência de grupos amina aos quais ele possa ligar (Silva et al. 2004. Food Technol. Biotechnol. 42: 5156). Este inconveniente não só afeta a manosilação de alérgenos polimerizados, como também a de proteína polimerizada com glutaraldeído que pod epode, por fim, ser destinado a ser manosilado.
[0010] Patterson et al. 1977 (J Allergy Clinical Immunology 59: 314-319) descrevem polimerização de alérgeno (pólen de gramíneas) com glutaraldeído os alérgenos polimerizados são hipoalergênicos pois apresentam capacidade reduzida de ativação de mastócitos sensibilizados com anticorpos IgE.
[0011] Subiza et al. 2008 (Clinical and Experimental Allergy, 39: 987-994) descrem o uso de alérgenos (pólen de gramíneas, Trisetum paniceum e Dactylis glomerata) modificados com glutaraldeído (também denominados alergóides) para imunoterapia em alergia. Pesquisadores relatam que é eficaz a vacinação com alergóides de gramínea obtidos por polimerização com glutaraldeído.
[0012] Heydenreich et al. 2012 (Immunology, 136: 208-217) descrevem um estudo comparativo de diferenças em imunogenicidade e alergenicidade entre extratos alérgenos de pólen intacto das espécies Phleum pratense e Betula verrucosae, e seus alergóides correspondentes modificados com glutaraldeído ou formaldeído. Relata-se que a modificação com glutaraldeído reduduz alergenicidade e imunogenicidade de alergóides mais que a modificação com formaldeído, e que DCs não capturam esse tipo de alérgenos modificados eficientemente.
[0013] Weinberger et al. 2013 (Journal of Control Release, 165: 101-109) descrevem conjugação de proteínas alérgenas (ovalbumina e papaina) à manose ativando o açúcar por oxidação suave com periodato. Um grau diferente de eficiência é obtido dependendo da proteína a ser manosilada. Relata-se que os conjugados manosilados são capturados por DCs in vivo produzem uma resposta imune em ratos, então, eles poderiam ser úteis para imunoterapia.
[0014] Assim sendo, no estado da arte, há necessidade de prover um método para obter vacinas com base em antígenos polimerizados e manosilados que seja alternativo aos atualmente utilizados na matéria, e que permita polimerização de antígeno bem como sua conjugação à manose de uma maneira altamente eficaz, sem que o açúcar perca sua integridade estrutural e sem que as propriedades do polímero sejam afetadas (baixa alergenicidade), para que a vacina, com base nas proteínas polimerizadas e monosiladas, aumente sua imunogenicidade por melhorar sua captação pelas DCs.
[0015] Os autores da presente invenção descobriram que a adição de dialdeído em uma mistura de um antígeno de uma proteína natural e manana permite polimerização de antígeno simultaneamente com a conjugação à manana, o que torna possível obter um complexo imunogênico ou vacina capaz de estimular ou induzir uma resposta imune no indivíduo sem desencadear uma resposta alérgica ao complexo e capaz de ser reconhecida e capturada pelas células dendríticas (CD).
[0016] Com base nessa descoberta, foi desenvolvida uma série de aspectos inventivos, os quais são descritos em detalhes abaixo.
[0017] Conforme anteriormente mencionado, a adição de um dialdeído, em particular glutaraldeído, a uma mistura de proteína (antígeno) e manana, permite polimerização do antígeno simultaneamente com conjugação do antígeno à manana, o que torna possível a obtenção de uma vacina ou complexo imunogênico.
[0018] Portanto, um aspecto da presente invenção refere-se a um complexo imunogênico, doravante denominado “complexo imunogênico da invenção”, compreendendo um antígeno polimerizado, manana e um dialdeído.
[0019] Na presente invenção, “complexo imunogênico” é entendido como a associação de uma ou duas unidades que permanecem conjugadas uma a outra por ligação química (conjugação química) ou por aprisionamento físico, as referidas unidades sendo um antígeno polimerizado, manana e um dialdeído.
[0020] Por “antígeno polimerizado” entende-se o polímero formado por monômeros de antígeno ligados uns aos outros, os quais podem ser diferentes ou os mesmos. Assim sendo, em uma configuração em particilar, o antígeno polimerizado compreende pelo menos dois antígenos que são os mesmos ou diferentes. Por “antígeno”, entende-se qualquer substância capaz de uma resposta imune, tanto humoral quanto celular, no organismo de um sujeito (humano ou animal), ou capaz de induzir uma resposta imune celular (expansão, ativação e/ou maturação de células imunes, produção de anticorpos ou citocina) quando entra em contato com células imunes. Em particular, um antígeno é uma proteína que pode ser um alérgeno, uma proteína derivada de um agente infeccioso, ou célula neoplástica, um um peptídeo ou fragmento de tais proteínas, uma proteína recombinante das referidas proteínas ou até mesmo um peptídeo sintético capaz de induzir as respostas indicadas. Em uma configuração em particular, o antígeno é um alérgeno.
[0021] Por “alérgeno”, entende-se aquela substância que é capaz de causar alergia em um indivíduo, ou seja, a substância que é reconhecida como estranha pelo sistema imune de um indivíduo, causando uma reação imune, principalmente do tipo imunoglobulinas E (IgE). Exemplos de alérgenos incluem, mas não se limitam a, extratos alérgenicos de pólen, extrataos alergênicos de artrópodes, extratos alergênicos de alimentos ou produtos alimentícios, componentes presentes na saliva, garras ou picadas de insetos que induzem uma reação de sensibilidade a um sujeito, etc. Portanto, por exemplo, extratos de proteína de pólen, tais como pólen de gramíneas (Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa), outros pólen de grama (tais como Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica), ou pólen de árvore (tais como Olea europaea, Platanus spp, Cuppresus spp), etc. podem ser utilizados. Extratos de proteína de artrópodes, tais como ácaros (como Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acaro siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), etc. também podem ser utilizados. Outros extratos alergênicos podem ser obtidos a partir de esporos de fungos (Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Penicilium notatum) e epitélio de animais (mistura de penas, epitélio de cachorro, epitélio de gato, epitélio de cavalo), bem como componentes alimentícios. Conforme deverá ser entendido por especialistas na matéria, anexos cutâneos, tais como pelos, estão incluídos no termo “epitélio”. Praticamente qualquer alérgeno pode ser utilizado no complexo imunológico; no entanto, em uma configuração específica, o alérgeno é selecionado do grupo consistindo de pólens, ácaros, epitélios, esporos de fungos e combinações dos mesmos.
[0022] Em uma outra configuração específica, o pólen deriva das espécies Phleum pratense, Dactylis glomerata, Cynodon dactylon, Lolium perenne, Trisetum spp., Olea europaea, Cuppresus spp., Ambrosia spp., Betula spp., Platanus spp., Corylus avellana ou Alnus glutinosa.
[0023] Em uma outra configuração específica, o ácaro pertence à espécie Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae ou Blomia tropicalis.
[0024] Em uma outra configuração, o epitélio pertence à Felis domesticus ou Canis familiaris.
[0025] Em uma outra configuração, o esporo de fungo pertence à espécie Alternaria alternata ou Alternaria tenuis.
[0026] Na presente invenção, “manana” significa um polímero de carboidrato consistindo de manose e ligações glicosídicas dos seguintes tipos: alfa-1,6-glicosida, alfa-1,2-glicoside, alfa-1,3-glicosida ou beta-1,3-glicosida. Manose significa o açúcar simples ou monossacarídeo formado por 6 átomos de carbono e cujo grupo químico funcional é um aldeído no carbono 1 ou carbono anomérico. A manana pode conter um resíduo de peptídeo da manoproteína à qual ela se liga naturalmente. Qualquer manana pode ser usada no contexto da presente invenção. Exemplos de manana incluem, mas não se limitam a, polimanose, galactomanana, glucomanana, acemanana e aloerídeos.
[0027] Polimanose é entendida como sendo uma estrutura linear formada por manoses ligadas por ligações α-D-(1→6), possuindo ramificações frequentes curtas de diferentes unidades, principalmente por ligações α-D- (1→2), mas também α-D-(1→3).
[0028] “Galactomanana” é entendida como sendo o composto formado por uma ligação de cadeia de manose, ligados entre eles β(1→4), ligações em muitos casos possuindo ramificações formadas por unidades de galactose ligadas às manoses por uma α(1→6). Dependendo da planta da qual elas são extraídas, as galactomananas possuem diferentes graus de ramificações.
[0029] “Glucomanana” deve ser entendida como o composto cuja estrutura química inclui D-manose e D-glucose em uma proporção 8:5, respectivamente, unida por ligação β(1 →4) bond. É encontrada, por exemplo, em tubérculos da planta Amorphophallus konjac.
[0030] “Acemanana” deve ser entendida como a mistura de polissacarídeos de complexo O-acetilados do tipo beta(1-4)-manana. Acemanana é encontrada, por exemplo, na planta Aloe vera.
[0031] “Aloerídeo” é entendido como sendo aquele polissacarídeo com alto peso molecular constituído por glucose, galactose, manose e arabinose. The aloerídeo é encontrado, por exemplo, na planta Aloe vera.
[0032] Mananas (polimanoses, galactomananas, glucomananas, etc.) podem ser obtidas de fontes naturais, por exemplo, de fungos, leveduras e plantas, ou por sínteses químicas usando técnicas amplamente conhecidas por especialistas na matéria. Em uma configuração em particular, a manana que faz parte do complexo imunogênico da presente invenção vem de uma levedura, planta ou fungo. Em uma outra configuração, a levedura é selecionada do grupo constituído por Saccharomyces ssp., Pichia ssp., e Candida ssp.
[0033] Exemplos of leveduras Saccharomyces ssp. incluem, mas não se limitam a, S. bayanus, S. boulardii, S. bulderi, S. cariocanus, S. cariocus, S. cerevisiae, S. chevalieri, S. dairenensis, S. ellipsoideus, S. eubayanus, S. exiguus, S. florentinus, S. kluyveri, S. martiniae, S. monacensis, S. norbensis, S. paradoxus, S. pastorianus, S. spencerorum, S. turicensis, S. unisporus, S. uvarum and S. zonatus. Em uma configuração mais específica, a levedura é S. cerevisiae.
[0034] Exemplos de leveduras Pichia ssp. incluem, mas não se limitam a, P. pastoris, P. anomola, P. heedii, P. guilliermondii, P. kluyveri, P. membranifaciens, P. norvegensis, P. ohmeri, P. pastoris e P. subpelliculosa.
[0035] Exemplos de leveduras Candida ssp. incluem, mas não se limitam a, C. albicans, C. ascalaphidarum, C. amphixiae, C. Antarctica, C. argêntea, C. atlântica, C. atmosphaerica, C. blattae, C. carpophila, C. cerambycidarum, C. chauliodes, C. corydali,C. dosseyi, C. dubliniensis, C. ergatensis, C. fructus, C. glabrata, C. fermentati, C. guilliermondii, C. haemulonii, C. insectamens, C. insectorum, C. intermédia, C. jeffresii, C. kefyr, C. krusei, C. lusitaniae, C. lyxosophila, C. maltosa, C. marina, C. membranifaciens, C. milleri, C. oleophila, C. oregonensis, C. parapsilosis, C. quercitrusa, C. rugosa, C. sake, C. shehatea, C. temnochilae, C. tenuis, C. tropicalis, C. tsuchiyae, C. sinolaborantium, C. sojae, C. subhashii, C. viswanathii, C. utilis.
[0036] Exemplos de plantas das quais a manana pode ser extraída incluem, mas não se limitam a, leguminosas (por exemplo, Ceratonia siliqua, Cyanaposis tetragonolobus, etc.), tubérculos (por exemplo, Amorphophallus konjac, etc.), sementes de plantas da família Liliaceae, Iridaceae, na qual a manana é usada como amarzenamento de energia e paredes celulares de algas verdes, tais como Acetabularia, Codium, Halicoryne, etc., e algas vermelhas (Porphyra umbilicalis).
[0037] Exemplos de fungos dos quais pode ser extraída manana incluem, mas não se limitam a, Paecilomyces ssp. and Ganoderma Iucidum (Reishi).
[0038] Conforme compreendido por indivíduos habilitados na matéria, se a manana é obtida de um fungo ou levedura, ela será parte da parede celular do fungo ou levedura e, assim, pode conter resíduos da proteína usados para sintetizar a parede celular. Por isso, a manana pode compreender em sua estrutura grupos amino de resíduos de aminoácidos presentes. Portanto, em uma configuração mais específica, os referidos grupos amino originam-se do aminoácido lisina.
[0039] Na presente invenção, entende-se que “dialdeído” se refere ao compost que compreende dois grupos de aldeídos. Exemplos de dialdeídos incluem, mas não se limitam a, glutaraldeído, glioxal, malonaldeído, succinaldeído e adipaldeído. Em uma configuração preferida, o dialdeído é glutaraldeído.
[0040] Conforme mencionado acima, o complexo imunogênico da invenção compreende um antígeno polimerizado, manana e um dialdeído. Assim, a ligação dos components do complex imunológico da invenção podem ser gerados por conjugação química, conjugação física ou ambas ao mesmo tempo.
[0041] Na presente invenção, “conjugação química” deve ser entendida como a ligação dos componentes do complexo imunogênico da invenção por meio de uma ligação química. Conforme explicado acima, manana pode compreender grupos amino devido à presença de aminoácidos na sua estrutura, por exemplo lisinas. Sem desejar que se restrinja à teoria, é entendido que a ligação entre os componentes do complexo imunogênico pode ser gerada pela ligação entre os grupos amino que estão presentes na manana e o dialdeído presente na reação. Assim, em uma configuração em particular, o antígeno polimerizado é ligado à manana pelo dialdeído. O dialdeído em meio aquoso está presente em uma certa proporção em uma forma polimérica, havendo, portanto, diversas espécies com dois ou mais grupos funcionais aldeído cuja reação com os grupos amino presentes em manana e na proteína antigênica levam a uma ligação cruzada covalente entre os diversos componentes presentes na mistura da reação. A reação primária entre grupos amino e aldeído leva à formação das chamadas bases de Schiff que, dependendo das condições de pH, podem ser reversíveis. No entanto, no caso de os grupos aldeído pertencerem a compostos dialdeídicos ou polialdeídicos, como por exemplo glutaraldeído, e suas formas poliméricas apresentem na solução aquosa, acontecem outras reações de condensação do tipo aldol e desidratação, que geram sistemas carbonílicos alfa-beta insaturados de natureza polimérica multifuncional. Além disso, foi mostrado que as bases de Schiff também estão propensas a produzir condensações do tipo aldol com os aldeídos presentes no meio da reação, de modo a gerar iminas alfa-beta insaturadas mais estáveis que as bases de Schiff originais. Por outro lado, tanto os carbonilos quanto as iminas alfa-beta insaturadas derivadas de condensação de aldol estão propensas a passar por uma reação de adição conjugada a fim de formar novas ligações covalentes estáveis. A reatividade química descrita junto com a natureza multifuncional do dialdeído original e suas formas poliméricas presentes no meio de reação, são a base para a ligação química covalente cruzada estável entre manana e os antígenos para formar os conjugados químicos poliméricos finais.
[0042] Na presente invenção, “conjugação física” é entendida como sendo a ligação dos componentes do complexo imunogênico da invenção por aprisionamento físico. Sem que se deseje ficar restrito à teoria, considera-se que, quando o antígeno está sendo polimerizado, manana permanece presa na onda de polímero favorecida pela rigidez e alto nível de ramificação de estrutura. Portanto, em uma configuração em particular, o alérgeno é ligado à manana por aprisionamento físico pelo polímero.
[0043] Uma vez que o complex imunogênico está formado, a proporção dos componentes pode variar dependendo da concentração de manana no meio. Assim, em uma configuração em particular, a proporção antígeno:manana varia entre 1:10 e 1:0,1; preferivelmente entre 1:4 e 1:0,15, mais preferivelmente entre 1:3 and 1:0,3 e mais preferivelmente entre 1:4 e 1:0,5. Em uma configuração em particular, a proporção antígeno:manana é 1:0,3 ou 1:0,5.
[0044] Método da invenção
[0045] Os autores da presente invenção descobriram que a adição de um dialdeído em uma mistura de antígeno e manana permite polimerização simultaneamente a conjugação de antígeno à manana, o que torna possível obter um complexo imunogênico ou vacina capaz de estimular e/ou induzir uma resposta imune no indivíduo sem desencadear uma resposta alérgica ao referido complexo, e o qual pode ser reconhecido e capturado pelas células dendríticas (CD).
[0046] Portanto, em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para obtenção do complexo imunogênico da invenção, doravanete chamado “método da invenção”, o qual compreende (i) preparar uma dissolução compreendendo um antígeno e manana e (ii) adicionar um dialdeído à referida solução.
[0047] Na primeira etapa [etapa (i)], o método da invenção consiste de preparar uma dissolução compreendendo um antígeno e manana.
[0048] O termo antígeno foi definido anteriormente. Em uma configuração em particular, o antígeno é um alérgeno. Exemplos de alérgenos incluem, mas não se limitam a, extratos alergênicos de pólen, extratos alergênicos de artrópodes, extratos alergênicos de alimentos ou produtos alimentícios, componentes presentes na saliva, garras ou picadas de insetos induzindo à reação de sensibilidade em um sujeito, etc. Em uma configuração em particular, o alérgeno é selecionado do grupo constituído por pólens, preferivelmente Phleum pratense, Dactylis glomerata, Cynodon dactylon, Lolium perenne, Trisetum spp., Olea europaea, Cuppresus spp., Ambrosia spp., Betula spp., Platanus spp., Corylus avellana or Alnus glutinosa; ácaros, preferivelmente o ácaro pertencente às espécies Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae ou Blomia tropicalis; epitélios, preferivelmente o epitélio pertencente às espécies Felis domesticus ou Canis familiaris; esporos de fungos, preferivelmente os esporos de fungos pertencentes às espécies Alternaria alternata ou Alternaria tenuis; e as combinações dos mesmos.
[0049] Conforme fica entendido por aqueles com habilidade na matéria, a dissolução da etapa (i) pode conter mais de um antígeno que pode ser diferente ou igual aos outros. Assim sendo, em uma configuração em particular, a dissolução compreende pelo menos dois antígenos que são os iguais diferentes.
[0050] As técnicas e metodologias usadas para obter extratos alergênicos e antígenos são amplamente conhecidas por especialistas na matéria, embora possam estar comercialmente disponíveis ou encontradas na forma de proteínas recombinantes. No caso de o antígeno ou extrato alergênico ser liofilizado, ele terá que ser reconstituído, por exemplo, com tampão de fosfato, para que possa ser usado no método da invenção.
[0051] Por outro lado, a etapa de dissolução da etapa (i) também possui manana. O terma manana já foi anteriormente definido e pode ser aplicado ao presente aspecto inventivo. Exemplos de manana incluem, mas não se limitam a, polimanose, galactomanana e glucomanana. Em uma determinada configuração da presente invenção, a manana usada no método da invenção vem de levedura, planta ou fungo. Em uma outra configuração em particular, a levedura é selecionada do grupo constituído por Saccharomyces ssp., particularly S. cerevisiae; Pichia ssp. e Candida ssp. Exemplos de leveduras, fungos e plantas dos quais a manana pode ser obtida já foram descritos no presente relatório. Além disso, como foi afirmado acima, a manana pode compreender em sua estrutura grupos amino de resíduos de aminoácidos presentes na manoproteína. Assim sendo, em ainda uma outra determinada configuração da invenção, a manana compreende grupos amino, os referidos grupos amino que, em ainda uma outra configuração, vêm do aminoácido lisina.
[0052] A quantidade de manana a ser adicionada à dissolução pode variar dependendo da proporção antígeno: manana que se deseja obter no complexo imunológico da invenção. Assim, em uma configuração em particular, a proporção antígeno:manana varia de 1:10 to 1:0,1; preferivelmente de 1:4 e 1:0,15, mais preferivelmente, entre 1:3 e 1:0,3, ainda mais preferivelmente entre 1:4 e 1:0,5. Em uma configuração, a proporção é de antígeno:manana é 1:0,3 ou 1:0,5.
[0053] Uma vez que a dissolução de antígeno e manana está preparada, o dialdeído é adicionado, atuando então como um agente de polimerização [etapa (ii) do método da invenção]. O dialdeído será gradualmente adicionado à dissolução até atingir uma concentração que seja suficiente para alcançar polimerização do antígeno, bem como a conjugação de manana ao antígeno. A técnica e a metodologia usadas para preparar polímeros usando dialdeídos é bem conhecida na matéria e é prática comum para especialistas na matéria (Silva et al. 2004. Modificações Químicas em Proteínas Usando Glutaraldeído. Food Technol. Biotechnol. 42: 51-56).
[0054] Após a adição de dialdeído à dissolução de antígeno e manana, a mistura é deixada sob condições apropriadas e durante o tempo adequado para que aconteça a reação de polimerização, por exemplo, por cerca de 15 horas em 4°C sob agitação.
[0055] Em uma configuração em particular, o dialdeído é selecionado do grupo constituído por glutaraldeido, glioxal, malondialdeído, succinaldeído e adipaldeído. Preferivelmente, o aldeído é o glutaraldeído.
[0056] Após a conclusão do tempo necessário para que ocorra a reação de polimerização, a reação é parada por adição à mistura de um agente que neutraliza (agente neutralizante) os grupos aldeídos livres, tais como agentes que contêm grupos amino (por exemplo, aminoácidos, ácido ε-amino-caproico, etc), ou outros agentes reativos com aldeídos (por exemplo, metabissulfito de sódio, amónio, etc.), excluindo agentes oxidantes (por exemplo, peróxido de hidrogénio, periodato de sódio, etc.) devido a seu efeito sobre a manose. Em uma configuração da invenção, o método tem uma etapa adicional (iii) compreendendo a adição de um agente de neutralização, por exemplo, um aminoácido, em particular glicina, para parar a reação de polimerização. A quantidade de glicina adicionada à mistura da reação para parar a polimerização pode variar dependendo das condições da reação, mas o cálculo da quantidade de glicina necessária a ser adicionada para parar a polimerização é prática comum para aqueles com habilidade na arte. Em geral, a glicina tem que exceder a quantidade adicionada de aldeído, por exemplo, em uma proporção de dialdeído:glicina de 1:50.
[0057] Depois de parar a reação de polimerização, o complexo imunogênico pode ser isolado, o que é prática comum para uma pessoa habilitada na matéria. Assim, numa configuração em particular, o método da invenção compreende uma etapa (iv) de se isolar o complexo imunogênico. Praticamente qualquer método de isolamento de complexos proteicos podem ser utilizados no contexto da presente invenção. Os exemplos dos referidos métodos incluem, mas não estão limitados a, coluna de baixa ou alta de cromatografia líquida de pressão, cromatografia de afinidade com base na lectina de ligação de manose (por exemplo, Concanavalina A), técnicas de precipitação (por exemplo, sulfato de amónio), separação por gradiente de densidade e centrifugação diferencial. A título de exemplo, a mistura contendo o complexo imunogênico da invenção já formado pode ser dialisada, a fim de eliminar os sais e os possíveis resíduos não polimerizados, após a qual a filtração da mistura polimerizada é realizada, por exemplo, por ultrafiltração tangencial com um membrana possuindo um tamanho de poro de 100 KDa.
[0058] O complexo imunogênico da presente invenção possui certas características técnicas que tornam possível estimular e/ou induzir uma resposta no indivíduo com baixa resposta alérgica ao referido complexo em caso de ser alérgeno. Essa propriedade torna possível usar o complexo imunogênico da presente invenção para elaborar uma composição farmacêutica que, quando administrada em um sujeito estimula e/ou induz a resposta imune de tal sujeito, e que torna apropriada sua utilização como vacina no tratamento, por exemplo, de alergias, doenças infecciosas ou neoplasias.
[0059] Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se ao uso do complexo imunogênico da invenção na elaboração de uma composição farmacêutica.
[0060] Assim, em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica, doravante chamada “composição farmacêutica da invenção”, compreendendo o complexo imunogênico da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos no estado da técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como óleo / água, diversos tipos de agentes umedecedores, dissoluções estéreis, etc. As composições que compreendem os referidos veículos podem ser formuladas por processos convencionais conhecidos no estado da arte. Todas as formas de realização particulares explicadas para o complexo imunogênico da invenção podem ser aplicadas ao presente aspecto do invento. Além disso, a composição farmacêutica da invenção também pode ter um excipiente farmaceuticamente aceitável, diluente, adjuvante (por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de cálcio, monofosforil lípidio A, quitosana e outros) e / ou estabilizador (por exemplo, glicerol). Como deve ser entendido por aqueles com habilidade na matéria, o complexo imunogênico da invenção estará presente na composição da invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, em uma quantidade tal que seja suficiente para exercer o efeito de estimular e / ou induzir a resposta imune em um sujeito.
[0061] O termo composição farmacêutica inclui composições para a sua utilização em saúde humana ou animal (composições veterinárias).
[0062] Em uma configuração em particular, a composição farmacêutica da invenção também compreende uma substância adicional. Praticamente qualquer substância potencialmente útil para o tratamento sintomático de uma doença ou alergia pode ser incorporada como uma substância ativa adicional. Os exemplos ilustrativos, não limitativos da referida substância ativa adicional incluem anti-histamínicos, hormônios esteróides, cromoglicato dissódico, fluticasona, rupatadina, ebastina, loratadina, desloratadina e outros antagonistas de receptores de histamina, leucotrienos, etc., e as suas misturas.
[0063] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrado por qualquer via adequada (por exemplo, via oral, sublingual, perioral, intranasal, parentérica, transdérmica, administração tópica, etc.), para a qual serão usados os excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis necessários para a formulação do modo de administração escolhido. As diferentes formas farmacêuticas de administração e a preparação de medicamentos são do conhecimento comum de especialistas na matéria. De uma forma ilustrativa, mas não limitativa, a composição farmacêutica do invento pode ser parte de uma formulação sob a forma de macropartículas, nanopartículas ou lipossomas, e podem ser administrados sob uma forma farmacêutica sólida de administração, de uma forma farmacêutica líquida de administração, ou em uma forma de administração farmacêutica que compreende um sistema disperso. Mais particularmente, a composição farmacêutica da invenção pode ser na forma de uma solução para injeção, formas farmacêuticas adequadas para administração sublingual, pó, pastilhas, grânulos, comprimidos, cápsulas, xaropes, emulsões, supositórios, colírio, nebulizações, aerossóis, cremes, géis, etc. O regime de dosagem da composição da invenção será determinado de acordo com o médico e fatores clínicos. Como é bem conhecido na medicina, a dosagem depende de muitos fatores, incluindo as características físicas do paciente (idade, altura, sexo), processo de administração usado, gravidade da doença, composto particular utilizado e propriedades farmacocinéticas do indivíduo.
[0064] Em uma configuração, a referida composição farmacêutica é útil para estimular e / ou induzir a resposta imune. Em uma outra forma de realização, a referida composição farmacêutica é útil como uma vacina. Em ainda outra configuração, a referida composição farmacêutica é útil para o tratamento de alergia, doenças infecciosas e neoplasias em um sujeito.
[0065] Na presente invenção, "alergia" é entendida como a hipersensibilidade a uma partícula ou substância (chamada "alérgeno") que, quando inalada, ingerida ou tocada, produz um quadro clínico característico e desencadeia uma resposta imune, principalmente uma resposta de IgE, no sujeito. O termo "alérgeno" já foi descrito acima no presente relatório
[0066] No presente invento, "doença infecciosa" refere-se à manifestação clínica consistente com uma infecção causada por um microorganismo - tais como bactérias, fungos, vírus, protozoários, etc. - ou por priões. Os exemplos de doenças infecciosas incluem, mas não estão limitados a, brucelose (Brucella spp.), antraz (Bacillus anthracis), cólera (Vibrio cholerae), difteria (Corynebacterium diphtheriae), erisipela (Streptococcus spp.), febre Q (Coxiella burneti), febre tifóide (Salmonella typhi, S. paratyphi), doença do legionário (Legionella pneumophila), pneumonia (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma spp., Chlamydia spp.), tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) e tétano (Clostridium tetani). Os exemplos de doenças infecciosas virais incluem, mas não estão limitados a, febre de dengue (Flavivirus), febre amarela (Flavivirus), febre hemorrágica de Ebola (Filovirus), gripe (Influenzavirus), hepatite A (Enterovirus (VHA)), hepatite B (Orthohepadnavirus (VHB)), hepatie C (Hepacivirus (VHC)), herpes (Herpesvirus), mononucleose (Epstein-Barr virus), parotite (Paramixovirus), febre suína (Pestivirus), poliomielite (Enterovirus), resfriado comum (Rinovirus, Coronavirus, Ecovirus, Coxsackievirus), raiva (Rhabdovirus), rubéola (Rubivirus), sarampo (Morbillivirus), varicela (Varicela-zoster) evaríola (Orthopoxvirus). Exemplos of infecções fúngicas incluem, mas não se limitam a, aspergillose, candidíase, cromomicose, criptococose, dermatofitose, esporotricose, histoplasmose, herpes circinado, otomicose, pitiríase versicolor, ceratomicose e zigomicose. Exemplos de doenças causadas por protozoários incluem, mas não estão limitados a, leishmaniose, malária, criptosporidiose, toxoplasmose, amebíase, giardíase e doença de Chagas. Os exemplos de doenças infecciosas provocadas por priões incluem, mas não estão limitados a, doença de Creutzfeldt-Jakob, encefalopatia espongiforme bovina ("doença da vaca loucas"), tremor epizoótico (ou “scrapie”), insônia familiar fatal (FFI) e kuru.
[0067] Na presente invenção, "neoplasia" é entendido como sendo a doença causada por uma alteração da proliferação celular e, muitas vezes, da diferenciação celular que consiste na formação de uma massa ou tumor que, em caso de ser maligno, é denominado câncer. Exemplos de neoplasias benignas incluem, mas não estão limitados a, fibroma (tecido conjuntivo fibroso), mixoma (tecido conjuntivo frouxo), lipoma (tecido adiposo), condroma (tecido de cartilagem), osteoma (tecido ósseo), hemangioma (vasos sanguíneos), linfangioma (vasos linfáticos), meningioma (meninges), tumor glômico (suporte do tecido neural), leiomioma (tecido muscular liso), rabdomioma (tecido muscular estriado), papiloma (epitelial tecido papilas formando), adenoma (tecido glandular) e teratoma (céulas totipotentes). Exemplos de tumores malignos incluem, mas não se limitam a, sarcomas (por exemplo: fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, angiossarcoma, linfangiossarcoma, sarcoma sinovial, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, etc), carcinomas (por exemplo: carcinoma epidermóide ou escamoso, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, cistadenocarcinoma, coriocarcinoma, carcinoma peniano, carcinoma do pulmão, carcinoma da mama, carcinoma do cólon, etc), gliomas, linfomas, leucemias, melanoma, hepatoma, seminoma, cordoma e mesotelioma. Por outro lado, exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer do cólon e reto, câncer do pâncreas, câncer do ovário, leucemia, câncer da próstata e fígado e câncer da bexiga.
[0068] Na presente invenção, indivíduo ou sujeito refere-se a um membro de uma espécie animal, preferivelmente um mamífero, e incluindo, mas não estando limitado a, animais, seres humanos e primatas. No contexto da presente invenção, o indivíduo é preferivelmente um ser humano do sexo masculino ou do sexo feminino de qualquer idade ou raça.
[0069] Por "vacina" se entende a preparação de antígeno que, uma vez dentro do organismo, provoca ativação dos linfócitos específicos e produção de antígeno, e, assim, uma resposta de defesa contra substâncias estranhas ou de microrganismos patogénicos. Esta resposta pode gerar memória imunológica, produzindo imunidade temporária ou a longo prazo contra o ataque de patógeno correspondente.
[0070] Assim, a presente invenção permite a personalização das vacinas para um sujeito, isto é, o antígeno pode ser escolhido de acordo com os requisitos do sujeito, a fim de produzir o complexo imunogênico da invenção, que pode ser utilizado como uma vacina. A doença a ser tratada / impedida dependerá do antígeno selecionado para a produção do complexo imunogênico da invenção. Assim, qualquer alergia, doença infecciosa ou antineoplásico pode ser tratado com o complexo imunogênico da invenção. Por exemplo, sabendo que alérgeno ao qual o sujeito é alérgico, um complexo imunogênico que compreende o alérgeno selecionado pode ser preparado de acordo com a presente invenção, e pode ser administrado ao sujeito para gerar uma resposta imune e tratar, assim, a alergia.
[0071] Assim sendo, em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma vacina compreendendo um complexo imunogênico da invenção.
[0072] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a prevenção e / ou tratamento de uma doença infecciosa, um neoplasma ou reação alérgica causada por um alérgeno em um indivíduo, em que o referido método compreende a administração do complexo imunogênico da invenção ou da composição farmacêutica da invenção ao sujeito.
[0073] Ao longo da descrição e das reivindicações, o termo "compreender" e suas variantes não exclui outras características, aditivos, componentes técnicos ou etapas. Para especialistas na área, outros objetivos, vantagens e características do invento em parte decorrem da descrição e em parte a partir da prática da invenção. Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos para fins de ilustração, e não se pretende que sejam limitações da presente invenção.
[0074] Fig. 1. É uma representação gráfica da reacção de oxidação da manana com periodato. O esquema mostra dois tipos de ligações glicosídicas, alfa (1-2) e alfa (1-6) na manana derivada de levedura. A oxidação com periodato deteriora os anéis de piranose em ambos os casos.
[0075] Fig. 2. É uma representação gráfica do espectro unidimensional da manana pré-tratada com periodato e sem ser tratada. Não aparecem grupos aldeído na manana pré-tratada.
[0076] Fig. 3. Mostra quatro gráficos que representam percentagens dos grupos amino livres em vários alérgenos polimerizados (barras pretas) para fora do valor alergénico na sua forma nativa não polimerizado (barras brancas). Os dados apresentados são a média de pelo menos 4 lotes diferentes.
[0077] Fig. 4. É uma imagem que mostra o resultado de uma eletroforese (PAGE) sob condições de desnaturalização, após o tratamento de albumina de soro bovino (BSA) com manana previamente oxidada. As pistas correspondem a mistura em bruto após a conjugação (conjugado de BSA) e as duas amostras que são da filtração em AMICON YM100 (BSA inferior a 100 kDa e 100 kDa BSA superior).
[0078] Fig. 5. É m gráfico mostrando a análise dos aminoácidos a partir do extrato nativo de Phleum pratense e do polímero de Phleum pratense por cromatografia em fase gasosa. Uma redução significativa de lisinas livres é observada na amostra polimerizada.
[0079] Fig. 6. É um gráfico mostrando a análise dos aminoácidos de uma amostra da manana S. cerevisiae.
[0080] Fig. 7. É um gráfico que mostra o espectro unidimensional de amostras polimerizadas com manana em diferentes proporções (proteína: hidratos de carbono). Uma amostra polimerizada sem manana foi utilizada como controle.
[0081] Fig. 8. É um gráfico que mostra um espectro bidimensional (DOSY) "Espectroscopia ordenada por difusão” de amostras polimerizadas com manana em diferentes proporções (proteína: hidratos de carbono). Uma amostra polimerizada sem manana foi utilizada como controle.
[0082] Fig. 9. Apresenta uma representação gráfica da percentagem de monossacáridos das diferentes amostras analisadas por cromatografia gasosa de Phleum pratense
[0083] Fig. 10. É um quadro que mostra o espectro unidimensional comparando amostras de Phleum pratense: extrato nativo (não polimerizada), polimerizada (sem manana) e com polimerização ligada em uma proporção (1:0,5).
[0084] Fig. 11. É um gráfico que mostra o espectro bidimensional (DOSY) "Espectroscopia ordenada por difusão” de amostras de Phleum pratense não polimerizado, e polimerizado com e sem manana.
[0085] Fig. 12. É um gráfico que mostra o espectro bidimensional de HSQC (HC) em que diferentes amostras de Phleum pratense são comparados. Região ampliada da área não-monomérica.
[0086] Fig. 13. É um gráfico que mostra o espectro bidimensional (DOSY) "Espectroscopia ordenada por difusão", da amostras de extratos de ácaros (D. farinae) olimerizados com manana em diferentes proporções (proteína: hidratos de carbono). Uma amostra polimerizada sem manana foi utilizada como controle.
[0087] Fig. 14. É um quadro que mostra a sobreposição espectros unidimensionais de amostras de D. farinae: extrato nativo, polimerizado (sem manana) e com a polimerização conjunta na proporção (1: 0,3).
[0088] Fig. 15. Apresenta uma representação gráfica da percentagem de monossacáridos das diferentes amostras analisadas por cromatografia gasosa de D. farinae.
[0089] Fig. 16. É um gráfico que mostra o espectro bidimensional (DOSY) "Espectroscopia ordenada por difusão", a partir de amostras de D. farinae, não polimerizado, e polimerizada com ou sem manana.
[0090] Fig. 17. É uma imagem de microscopia electrónica das amostras de D. farinae de: a) extrato nativo, b) polimerizado e c) polimerizado com manana (1: 0,3).
[0091] Fig. 18. É é um grupo de gráficos que mostram o espectro de protons unidimensional de Phleum pratense em momentos diferentes.
[0092] Fig. 19. A Figura 19A é um gráfico que mostra os resultados de análises ELISA para a inibição de ligação de IgE a um extrato nativo de Phleum pratense com o alérgeno nativo (não polimerizado), alérgeno polimerizado não manosilado e alérgeno manosilado com glutaraldeído. A Figura 19B é uma imagem correspondendo a uma eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) e imunodetecção (immunoblotting) com soros de pacientes com alergia, de um extrato de Phleum pratense: reatividade de IgE com proteínas separadas por PAGE. Pm = pesos moleculares padrão; 1 = alérgeno nativo; 2 = alérgeno polimerizado não manossilado; 3 = alérgeno manosilado com glutaraldeído.
[0093] Fig. 20. Figure 20A é um gráfico que mostra os resultados de análises ELISA para a inibição de ligaçãodea IgE a um extrato natural de D. pteronyssinus e D. farinae, respectivamente com o alérgeno nativo (não polimerizado), alérgeno polimerizado não manosilado e alérgeno manosilado com glutaraldeído. A Figura 20B é uma imagem correspondendo a uma eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) e imunodetecção (immunoblotting) com soros de pacientes com alergia, de um extrato de D. pteronyssinus e D. farinae: reatividade de IgE com as proteínas separadas por PÁGINA. Pm = pesos moleculares padrão; 1 = alérgeno nativo; 2 = alérgeno polimerizado não manoslado; 3 = alérgeno manosilado com glutaraldeído.
[0094] Fig. 21. É um grupo de gráficos que mostram os resultados de ensaios ex vivo de ativação de basófilos em pacientes alérgicos a Phleum pratense ou D. farinae com a mesma concentração de proteínas de extratos não polimerizados (nativos), polimerizado (Pol) ou polimerizados com manana (Pol Manana). A análise da ativação de basófilos foi realizada por citometria de fluxo utilizando o kit BASOTEST.
[0095] Fig. 22. É um quadro que mostra resultados dos ensaios sobre a resposta in vivo (teste de puntura) em pacientes alérgicos a Phleum pratense com a mesma concentração de proteínas de extratos não polimerizados (nativos), polimerizados (Pol) ou polimerizados com manana (Pol Manana).
[0096] Fig. 23. É um diagrama de caixa mostrando os resultados dos ensaios sobre a resposta in vivo (teste de puntura) em pacientes alérgicos a D. farinae com a mesma concentração de proteínas de extratos não polimerizados (nativos), polimerizadso (Pol) ou polimerizados com manana (Pol Manana).
[0097] Fig. 24. A Figure 24A é uma representação gráfica que mostra os resultados obtidos nas análises da captação de células dendríticas (CD) derivadas de monócitos humanos com alérgenos Phleum pratense polimerizados (Pol) ou Phleum pratense polymerizados e manosilados (Pol Manana). As analises foram efetuadas por citometria de fluxo da autofluorescência dos pigmentos associados a esse extrato de gramíneas. A Figura 24B é uma representação gráfica que mostra os resultados obtidos nas análises da captação de células dendríticas (CD) derivadas de monócitos humanos com alérgenos Phleum pratense polimerizados (Pol) ou Phleum pratense polymerizados e manosilados (Pol Manana), sendo rotuladas em cisteínas com Alexa 488. As análises foram efetuadas em dois momentos de incubação (1 e 5 min) e analisadas por citometria de fluxo. A seção superior mostra as células duplo positivas (quadrante superior direito) em que o as CDs (HLADR +), que captura Alexa 488 estão concentradas. O lado inferior mostra a intensidade de fluorescência média das CDs de acordo com a preparação com a qual foram incubadas. A Figura 24C é uma amostra representativa de microscopia confocal de uma zona microscópica, da diferente captação entre as diferentes preparações fluoresceinadas (Alexa 488) pelas CDs após 30 minutos de incubação. A fluorescência associada aos diferentes complexos pode ser vist na figura sob a forma de pequenas manchas brancas no interior das células (painel superior em positivo e o mesmo no painel inferior, em negativo para uma melhor identificação do fluorocromo capturado, em pontos pretos).
[0098] Fig. 25. É um grupo de quadros que mostra a produção de citocina em sobrenadante de células dendríticas (CDs) estimulada em 24 horas com extrato de Phleum pratense nativo (N) Phleum pratense polimerizado e Phleum pratense polimerizado com manana (PM).
[0099] Fig. 26. É um quadro que mostra a expressão dos marcadores de maturação em células dendríticas estimuladas com alérgenos não polimerizados (Nativos) de Phleum pratense, Phleum pratense polimerizados e não-manosilados (Pol) ou Phleum pratense polimerizados manosilados (Pol- Man).
[00100] Fig. 27. É um quadro que mostra a expressão dos marcadores de maturação em células dendríticas estimuladas com alérgenos (Nativos) de D. farinae não polimerizados, polimerizados e não-manosilados (Pol) ou polimerizados e manosilados (Pol-Man).
[00101] Fig. 28. É um quadro que mostra a indução de células de produção de IFNY, IL-10 and IL-4 específicas após análises de imunização ex vivo com alérgenos de Phleum pratense polimerizado (Pol) ou polimerizado e manosilado (Pol Man). A quantidade de células de produção foi determinada por ELISPOT.
[00102] Fig. 29. É um quadro que mostra a indução de células de produção de IFNY, IL-10 and IL-4 específicas após análises de imunização ex vivo com alérgenos de D. farinae polimerizado (Pol) ou polimerizado e manosilado (Pol Man). A quantidade de células de produção foi determinada por ELISPOT.
[00103] Fig. 30. É o esquema de protocolo de imunização de camundongos Balb / c.
[00104] Fig. 31. É o esquema do protocolo utilizado na análise de proliferação de linfócitos.
[00105] Fig. 32. É um quardo que mostra a resposta de proliferação em camundongos imunizados com 5 μg de alérgeno de Phleum pratense , sendo polimerizados e não manosilados (Polímero) ou polimerizado e manosilado (Polímera manana). Ensaio de proliferação com CSFE.
[00106] Fig. 33. È um quadro que mostra a resposta de proliferação em camundongos imunizados com 20 μg de alérgeno de D. farinae, sendo polimerizados e não manosilados (Polímero) ou polimerizado e manosilado (Polímera manana). Ensaio de proliferação com CSFE.
[00107] Fig. 34. É um grupo de quadros (Fig. 34A e 34B) que mostra a produção de citocinas por esplenócitos de camundongos imunizados com polímeros de Phleum pratense como resposta ao alérgeno nativo (não polimerizado) de Phleum pratense. As barras representam a média dos ratos pertencentes ao mesmo grupo. Barras Cinzas: polímeros não manosilados. Barras pretas: polímeros manosilados
[00108] Fig. 35. É um grupo de quadros (Fig. 35A e 35B) que mostra a produção de citocinas por esplenócitos de camundongos imunizados com polímeros de D. farinae como resposta ao alérgeno nativo (não polimerizado) de D. farinae. As barras representam a média dos ratos pertencentes ao mesmo grupo. Barras Cinzas: polímeros não manosilados. Barras pretas: polímeros manosilados
[00109] Fig. 36. É um grupo de quadros (Fig. 36A e 36B) que mostra os níveis de anticorpos específicos contra alérgenos de Phleum pratense na sua forma nativa (não polimerizada), detectados em soro de camundongos imunizados com alérgenos sendo polimerizados e não manosilados (Polímero) ou polimerizados e manosilados (Polímera manana). O quadro inferior representa a relação entre os níveis de anticorpos específicos induzidos com cada imunogênio da classe IgG2a e IgE.
[00110] Fig. 37. É um grupo de quadros (Fig. 37A e 37B) que mostra os níveis de anticorpos específicos contra alérgenos de D. farinaena sua forma nativa (não polimerizada), detectados em soro de camundongos imunizados com alérgenos sendo polimerizados e não manosilados (Polímero) ou polimerizados e manosilados (Polímera manana). O quadro inferior representa a relação entre os níveis de anticorpos específicos induzidos com cada imunogênio da classe IgG2a e IgE.
[00111] A manana da Saccharomyces cerevisiae foi previamente fraccionada por ultrafiltração usando uma membrana de corte de 100 kDa. A fração filtrada de peso molecular baixo foi recolhida e submetida à oxidação com periodato. A Figura 1 mostra a ação teórica do periodato sobre a integridade da manose e a geração de grupos aldeído. Na Figura 2, a geração desses grupos, após a oxidação da manana é demonstrada experimentalmente.
[00112] Alérgenos de diferentes origens (Phleum pratense, Olea europea, Dermatophagoides pteronyssinus nd Alnus glutinosa) foram polimerizados usando-glutaraldeído. A Figura 3 mostra a redução de grupos amino nos alérgenos polimerizados sobre o valor do alérgeno em sua forma nativa não polimerizada.. A presença de grupos amino foi determinada por reação com ninidrina de acordo com European Pharmacopoeia (seção 2.2.56, análise de aminoácidos).
[00113] Os resultados obtidos mostraram que houve uma conjugação entre BSA e a manana oxidada, como demonstrado pela eletroforese de poliacrilamida [Figura 4, (BSA conjugada)]. A mesma figura mostra como a fração do conjugado de BSA, retida na maior fracção de 100 kDa por ultrafiltração, apareceu como BSA monomérico BSA. Isto implica que uma grande percentagem dos possíveis conjugados formados voltou para a condição inicial em circunstâncias de desnaturalização, o que indicou que a reação de conjugação com manana pré-oxidada não gerou produtos com estabilidade suficiente. A estabilização destes conjugados pode ser realizada pelo processo químico denominado aminação redutora, que envolve a redução química com cianoborohidreto de sódio, das bases de Schiff formadas na reação de conjugação, a fim de se obter correspondentes aminas secundárias, mais estáveis. No entanto, esta reação implica uma nova transformação química nos substratos iniciais, que gera grupos funcionais e entidades químicas (aminas secundárias) as quais não existem em qualquer um dos reagentes de partida (manana e proteína) e que, portanto, seriam necessárias para definir e caracterizar.
[00114] Embora não tenha sido uma questão óbvia que se poderia alcançar uma conjugação bem sucedida, devido à diminuição significativa dos grupos amino livres na polímeros (Figura 3), a conjugação da manana pré-oxidada com alérgenos polimerizados de Phleum pratense foi testada seguindo o protocolo descrito para a albumina (Masárová, J. e Mislovicová, D. 2002. Int. J. Polymer. Anal. Charact., 7: 106-116). Como era de se esperar, após a polimerização com glutaraldeído, a quantidade de lisinas livres é 4,5 vezes menos na % de aminoácidos totais com relação ao extrato nativo não polimerizado (Figure 5).
[00115] A manana oxidada foi conjugada com extrato de Phleum pratense polimerzado (material com um tamanho molecular superior a 100KDa). Depois disso, o produto da reação foi novamente fracionado através de uma membrana de 100KDa. Nessa etapa, a fração retida maior que 100KDa, onde são encontrados o extrato original polimerizado e a manana, foi coletada.
[00116] O conteúdo de carboidrato inteiro da amostra retida foi analisado por análise colorimétrica com antrona e não houve aumento significativo observado no valor de carboidratos na amostra, em comparação com o conteúdo inicial do extrato polimerizada não tratado com manana. Por outro lado, estudos de ressonância magnética nuclear (estudos uni e bidimensionais) não mostram uma ligação covalente entre ambos os compostos, nem diferenças estruturais a nível molecular, indicando que com este protocolo conjugação não houve interação molecular obtida entre ambos componentes e, por conseguinte, uma ligação ou conjugação entre ambos os produtos não foi obtida. Sem a pretensão de se limitar pela teoria, isto poderia ser devido a uma diminuição dos grupos amino livres (fornecidos principalmente por lisinas), em conjunto com baixa acessibilidade de lisinas residuais livres devido ao material proteico ser um polímero, deste modo uma estrutura rígida com pouca flexibilidade. Esta possibilidade é corroborada pelo fato de que os mesmos resultados negativos foram obtidas com outros alérgenos previamente polimerizados com glutaraldeído, e, portanto, com uma redução nos grupos amino livres, como é mostrado na Figura 3.
[00117] Estes resultados evidenciam a falta de conjugação entre as amostras polimerizadas de Phleum pratense (e outros alérgenos polimerizados) com manana oxidada. Este fato, em conjunto com desvantagens referentes à transformação da manose após oxidação (Figura 1) (Shibuya, N., et al 1988. Journal of Biological Chemistry, 263:. 728-734), e à falta de estabilidade dos conjugados formados, mesmo com uma proteína rica em lisina tal como BSA (Figura 4), faz com que seja possível dispensar esta metodologia para a sua utilização na produção de vacinas com alérgeno polimerizado
[00118] O método para polimerização e conjugação de extratos de proteína consiste das seguintes etapas: 1. procedimento começa a partir de um extrato liofilizado de Phleum pratense, que é reconstituído no volume necessário de salina tamponada com fosfato (PBS) de modo a atingir a concentração de proteína final de 2 mg/mL. Depois disso, o pH é ajustado para 7,2 utilizando tampões de fosfato de potássio ou fosfato de sódio, conforme necessário para baixar ou aumentar o pH do extrato, e a concentração de proteína é calculada levando-se em consideração o volume do tampão para ajustar o pH. Ex.: Quantidade de proteína de partida: 300 mg of proteína de P. pratense. Volume necessário para PBS: 150 mL Volume necessário para ajustar pH em 7,2: tampão de 1 mL. Concentração final da amostra: 1,986 mg/mL 2. Reação de polimerização e conjugação do extrato: O agente de polimerização, neste caso glutaraldeído, é adicionado com gotejamento sobre o extrato sob agitação até atingir uma concentração final de 0,025 M. A manana, para a conjugação de amostra, também será adicionada nesse ponto emu ma proporção de 1:0,5 (massa de proteína: massa de manana). A reação é mantida durante 15 horas em 4°C sob agitação. Ex.: Concentração inicial de glutaraldeído: 2.5 M. Volume a ser adicionado ao extrato: 1.5 mL Manana (proporção de proteína:carboidrato 1:0,5): 90 mg. 3. Parar a reação: O extrato é aquecido em temperatura do ambiente (25°C) e é adicionada glicina em pó para parar a reação de polimerização. A glicina deve exceder, por exemplo, em uma proporção de 1:50 com glutaraldeído. A glicina é dissolvida na amostra e deixada em 4°C sob agitação, por 2 horas. Ex.: Concentração de glicina inicial (peso molecular: 75,07): 1,25 M Concentração de glutaraldeído: 0,025 M Volume do extrato: 152,5 mL (inicial 151 mL + 1.5 mL glutaraldeído) Quantidade de glicina a ser adicionada: 14,31 g 4. O extrato é subsequentemente dializado contra 7 volumes de água destilada, a fim de remover os sais e possíveis resíduos não polimerizados. Um sistema de filtração de fluxo cruzado é usado (Pellicon, Millipore Merck) com uma membrana de poro de 100 kDa. Ex.: volume do extrato: 152,5 mL Volume de água: 1,525 mL 5. Finalmente, o extrato que é polimerizado e conjugado com manana, é filtrado por 0.22 μm, dividido em porções, congelado em -60°C e liofilizado para sua preservação.
[00122] Como resultado da aplicação do referido método, foi obtido um polímero manosilado imunologicamente melhorado com relação ao alérgeno original. Tratamento com glutaraldeído permite a ligação de ambas as estruturas (alérgeno e manana), fazendo com que a polimerização e a conjugação ocorram ao mesmo tempo, como é demonstrado pelos resultados mostrados no exemplo a seguir (exemplo 3).
[00123] O referido polímero manosilado possui propriedades estruturais e imunológicas que são superiores as do alérgeno nativo ou polimerizado e não manosilado, como é mostrado no exemplo 4 e nos exemplos 5-10, respectivamente.
[00124] Portanto, é estabelecido um método para a conjugação de antígenos polimerizados com manana usando glutaraldeído em uma única etapa, onde a integridade da estrutura de manose é mantida. A fim de fazê-lo, por um lado é feito bom uso do fato de que manana de origem natural, por ex. de Saccharomyces cerevisiae, possui um resíduo de peptídeo da manoproteína original em que a manana é sintetizada em leveduras contendo lisinas (Figura 6), resultando em uma conjugação química. Por outro lado, é bem usada a estrutura polimérica, ramificada e rígida de manana em solução com um polímero de uma proteína, na qual ela é aprisionada pela proteína que está sendo polimerizada por glurtaraldeído, resultando em uma conjugação física. Em qualquer um dos casos, sem ser exclusivo mutualmente, o tratamento com glutaraldeído da mistura da proteína em sua forma nativa (não polimerizada) com manana permite ligar ambas as estruturas, o que produz conjugação e polimerização ao mesmo tempo.
[00125] Porções de 2 mg de amostras liofilizadas obtidas no exemplo 2 foram dissolvidas em 0,5 mL de água pesada e analisadas por ressonância magnética nuclear (NRM) em um espectrômetro de avanço Bruker de 500 MHz ou em um espectrômetro de avanço Bruker de 600MHz equipado com crio-sonda. Espectros de ressonância de próton unidimensional, espectros de correlação heteronuclear de próton-carbono 13 bidimensional (HSQC; Zwahlen et al., 1997. J. Am. Chem. Soc. 119: 6711-6721) e espectros bidimensionais ordenados por difusão translacional (DOSY, Wu et al. 1995. J. Magn. Reson. A. 115: 260-264) foram adquiridos das amostras diferentes, seguindo os protocolos padronizados e implementados pelo fabricante, Bruker Biospin Corporation, (Billerica, Massachusetts, USA), no software TOPSPIN de aquisição de espectros software de processamento.
[00126] O conteúdo de carboidrato e proteína das amostras foi analisado por técnicas colorimétricas, usando o método antrone (Shields, R. and W. Burnett.1960. Analytical Chemistry 32: 885-886) para a análise carboidratos totais, e o método de Bradford para análise de proteínas (Bradford, M. M. 1976. Analytical Biochemistry 72: 248-254).
[00127] Foi efetuada uma análise da taxa de monossacarídeos diferentes da parte glicídica das amostras, por meio de hidrólise de ácido total e análise de cromatrografia gasosa dos monossacarídeos liberados na forma dos seus acetatos de alditol. (M. F. Chaplin & J. F. Kennedy editors, Carbohydrate Analysis: a practical approach. (1986) Oxford IRL PRESS).
[00128] Foi efetuada uma análise dos diferentes aminoácidos na parte da proteína das amostras por hidrólise de ácido total das amostras e por cromatografia líquida dos aminoácidos liberados em um aparelho analisador de aminoácidos Biochrom.
[00129] 3.1.- Estudos de polimerização conjunta de Phleum pratense com proporções diferentes de manana a fim de estabelecer uma proporção mais apropriada, permitindo uma conjugação adequada do extrato polimerizado com manana.
[00130] A estrutura das amostras obtidas nesse processo com proporções diferentes de proteína:manana foi analisada por ressonância magnética nuclear (NMR), usando uma amostra de polimerizado sem manana. O extrato de proteína por si só possuía resíduos de oligossacarídeos pertencentes à própria amostra (12-20%), o que foi confirmado por cromatografia gasosa (análise de monossacarídeos). Aumentando-se a quantidade de açúcar no meio, o sinal de polissacarídeo no espectro também foi aumentado, como era esperado acontecer (Figura 7). Um estudo de difusão translacional foi efetuado, estudo esse que ordena os compostos de acordo com seu coeficiente de difusão, e o qual, por sua vez, depende do tamanho molecular (espectro bidimensional por NMR; espectro bidimensional (DOSY) “Espectroscopia ordenada por difusão”). Nesse estudo, pode ser observado que nas amostras polimerizadas com manana havia partículas maiores que nas amostras não polimerizadas, o que indicaria uma associação entre o extrato de proteína e a manana em todos os casos (Figura 8). Particularmente, no caso da proporção de 1:4, uma quantidade elevada de oligossacarídeo foi observada, possivelmente devido ao excesso de carboidrato no meio da reação.
[00131] Por outro lado, a quantidade de proteína e açúcar foi quantificada de modo a tentar estabelecer, grosso modo, a proporção de proteína:açúcar das amostras que tinham passado pelo processo de polimerização e compará-lo às proporções iniciais (Tabela 1).
[00132] Tabela 1: Comparação da proporção proteína:manana antes e depois da polimerização
[00133] No caso da amostra polimerizada na proporção de 1:4, foi normal obter uma proporção mais baixa na quantidade de açúcares após o processo, devido ao grande excesso inicial no qual é encontrado no meio de reação, removendo a parte não reagida na etapa de lavagem. Nas amostras remanescentes, foi observado um aumento da proporção de polissacarídeos em comparação à proporção inicial, a qual se deve ao fato de o próprio extrato possuir resíduos de polissacarídeos ligados covalentemente.
[00134] Em posse dos dados, a proporção (1:0,5) foi escolhida, uma vez que confirma incorporação de carboidrato à amostra e minimiza o uso de manana.
[00135] Iniciando da dissolução de material liofilizado, a percentage de carboidrato em peso seco com relação à toda amostra foi quantificada usando cromatografia gasosa, por hidrólise ácida (análise de alditol). (Fukuda, M. & Kobata, A. 1993. Glycobiology. A Practical Approach. The practical Approach Series. Oxford University Press Inc., New York.).
[00136] Três amostras foram analisadas (Figura 9): - Extrato nativo de Phleum pratense - Phleum pratense Polimerizado - Phleum pratense Polimerizado com manana (1:0,5)
[00137] Os resultados mostraram um aumento significativo de manose nas amostras submetidas a polimerização conjunta com relação à amostra polimerizada (sem manana) e ao extrato nativo.
[00138] Os estudos estruturais por NMR mostram uma ampliação dos sinais nas amostras polimerizadas, indicando um aumento de tamanho, o que é corroborado no espectro bidimensional da DOSY (Espectroscopia Ordenada por Difusão) de difusão translacional (Figuras 10 e 11). Nesse experimento bidimensional, pode ser observado que, no caso do extrato de proteína não polimerizado, há um material de tamanho diferente e, portanto, é uma amostra bem heterogênea que aumenta seu tamanho molecular quando polimeriza. Por outro lado, quando o extrato é polimerizado na presença de manana, também é obtido um material que possui coeficiente de difusão ainda mais baixo (dado indicativo de tamanho maior), que o polimerizado (devido ao fato de o polissacarídeo ser de peso molecular alto), indicando ligação ou interação entre o polissacarídeo e o extrato de proteína, uma vez que ambas as partes do espectro, a área de carboidratos e a de proteína, possuem o mesmo coeficiente de difusão, indicando interação entre ambos os componentes. Esses experimentos com ressonância magnética nuclear corroboram a conjugação de proteína: manana após polimerização do extrato de proteína na presença de manana.
[00139] Por outro lado, outro estudo bidimensional por NMR foi conduzido com base na correlação heteronuclear entre carbono 13 e próton (13C-1H) (HSQC, “Heteronuclear Single Quantum Coeherence”). Esses estudos mostram, no nível atômico, as ligações entre um hidrogênio e um carbono, cada ligação correspondendo a um sinal de correlação concreto (pico) do espectro e uma posição (coordenadas: abscissas, desvio químico de 1H; ordenadas: desvio químico de 13C) que é diferente dependendo do tipo de composto. O grupo de sinais (ligações H-C) geram um padrão bidimensional que é específico e exclusivo para cada composto, de modo similar a uma impressão digital” (Claridge, T. D. W. 1999. High-resolution NMR techniques in Organic Chemistry. Tetrahedron Organic Chemistry Series. Elsevier).
[00140] Três experiências HSQC foram realizadas para distinguir o padrão característico de cada tipo de amostra: -Sem manana -Polimerizado de Phleum pratense -Polimerizado de Phleum pratense na presença de manana (1:0,5)
[00141] A amostra polimerizada na presença de manana apresenta os sinais característicos de manana e os de carboidratos intrínsecos da própria amostra, indicando a interação entre o extrato de proteína e o polissacarídeo (Figura 12).
[00142] 3.3.- Estudos de processo de polimerização conjunta de D. farinae com diferentes proporções de manana
[00143] Iniciando por resultados obtidos Phleum pratense, foram relaizados experimentos preliminares com a proporção de proteína:carboidrato de (1:0,5); no entanto, os resultados obtidos não foram tão satisfatórios quanto para cada caso do extrato de Phleum pratense extract, uma vez que um excesso de resíduos de manana foi observado, o qual não era associado ao material de proteína (Figura 13, sinal delimitado pelo círculo preto). Novas polimerizações foram efetuadas com uma proporção de carboidrato mais baixa no meio (1:0,3 e 1:0,15). A proporção escolhida foi (1:0,3), já que foi observada uma incorporação de manana na amostra principalmente na forma associada à proteína (Figura 13, b) e não na forma livre (Figura 13, c, círculo preto), e esta incorporação de manana foi mais elevada que aquela com a proporção de (1:0,15) e na maior perturbação observada também para a proporção de 1:0,3, na área de espectro correspondente à parte de proteína (Figura 13).
[00144] A Figura 14 mostra a comparação qualitativa do dos espectros de próton unidimensionais de uma amostra de um extrato de D. farinae polimerizado na presença de manana em uma proporção de 1:0,3 Com relação a uma amostra polimerizada sem manana e a uma amostra de extrato não polimerizado. O espectro indica os sinais específicos para manana na amostra polimerizada com manana, bem como mudança de padrão espectroscópico, causada por polimerização, na área de espectro específica para a proteína.
[00145] Iniciando por uma dissolução de material liofilizado, foi quantificada a percentagem de carboidrato em peso seco com relação à amostra inteira, por cromatografia gasosa (Fukuda, M. & Kobata, A. 1993. Glycobiology. Oxford University Press Inc., New York).
[00146] Três amostras foram analisadas (Figura 15): - Extrato native de D.farinae - D.farinae Polimeriazada - D.farinae Polimerizada com manana (1:0,3)
[00147] Extratos e polimerizados de D. farinae contêm resíduos de oligossacarídeos na própria amostra (aproximadamente 17-20% determinado por cromatografia gasosa com uma presença mais elevada de glicose, manose e galactose). Os resultados para o produto de polimerização conjunta com manana mostraram um aumento significativo de manose, tanto com relação à amostra polimerizada sem manana quanto ao extrato nativo.
[00148] As amostras obtidas na polimerização e conjugação simultâneas, na proporção de (1:0,3) (proteína:manana), foram analisadas por NMR. Os resultados mostraram uma ampliação do sinal nas amostras polimerizadas, indicando um aumento no tamanho molecular que é corroborado no DOSY bidimensional (Figura 16). Similarmente ao caso de Phleum pratense, a amostra polimerizada com manana era homogênea e de maior tamanho que àquela polimerizada sem manana, indicando uma associação entre o polissacarídeo e o extrato de proteína de D. farinae e, desse modo, confirmando a conjugação de ambos os componentes.
[00149] Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das diferentes amostras de D. farinae nos permitiram observar diferenças de nível estrutural entre os extratos nativos e polimerizados. A polimerização oferece uma densidade mais elevada nas partículas e a conjugação com manana também produz mudanças no nível morfológico e estrutural que são claramente vistas no polímero, sendo evidência adicional da associação entre o polissacarídeo e o extrato de proteína (Figura 17).
[00150] A estabilidade de três amostras de Phleum pratense foi comparada: uma delas polimerizada na presença de manana (proporção de proteína/manana de 1:0,5), uma outra polimerizada sem manana e o próprio alérgeno não polimerizado, em armazenamento de longo prazo em um meio aquoso. Porções de amostras equivalentes às analisadas no exemplo 3 foram dissolvidas em água pesada e analisadas por experimentos com NMR e então armazenamento 4°C. As amostras não foram retiradas dos tubos de NMR nem manipuladas de qualquer outra maneira. 4 meses após o armazenamento, os experimentos com NMR foram repetidos, seguindo os mesmos parâmetros de aquisição, de modo a verificar a estabilidade das amostras sob essas condições de dissolução (água pesada em 4°C). Os resultados, apresentados como a diferença dos espectros no momento inicial e após 4 meses (subtração de espectros desempenhados pelo próprio programa do espectrômetro TOPSPIN), mostraram que as amostras polimerizadas estavam mais estáveis que os extratos nativos (40% de perda de sinal), e que a conjugação com manana aumentou ainda mais a estabilidade, uma vez que apenas 4% de sinal da amostra foi perdido, indicando um baixo índice de degradação/precipitação da amostra (Figura 18).
[00151] Análises de reatividade a IgE foram conduzidas por técnicas ELISA de inibição.
[00152] Placas de 96 cavidades (Microlon, elevada capacidade de ligação, Greiner Bio-One, Alemanha) foram colocadas com 1 ug de extrato nativo por cavidade diluídas em um tampão de 0,05 M carbono/bicarbonato, pH = 9,6. As placas foram deixadas a 4°C durante a noite. No dia seguinte as placas foram lavadas com tampão PBS-T (tampão de fosfato com 0,25% de Tween-20), e elas foram colocadas em uma piscina de soro correspondente em cada caso de pacientes alérgicos (alergia a gramíneas ou ácaros) e os inibidores (extrato nativo , extrato polimerizado e extrato polimerizado manosilado), por diluições em série de 1/2 de 100μg/mL a 0.01μg/m. ml. As placas foram incubadas com a mistura durante a noite, e no dia seguinte, após lavagem com PBS-T, foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-IgE humano conjugado com peroxidase (Southern Biotech, EUA) em uma diluição de 1:2000. As placas foram desenvolvidas com o sistema OPD (Sigma Aldrich, EUA) durante 30 minutos. A reação foi parada com ácido clorídrico diluído de 1/10 em água e as placas foram lidas a 492 nm.
[00153] A reatividade a IgE de extratos nativos, polimerizados e polimerizados e manosilados foi também analisada por eletroforese e imunodetecção. A separação de proteína dos extratos foi efetuada em géis de poliacrilamida sob condições de desnaturalização (SDS-PAGE). Foram realizadas imunodetecções transferindo as proteínas separadas por eletroforese para membranas de nitrato de celulose (Bio Rad, Alemanha). O membranas foram bloqueadas com PBS-T, com 5% de BSA (albumina de soro bovino) e incubou-se com soros de pacientes alérgicos. Em seguida, elas foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-IgE humano conjugado com peroxidase (Southern Biotech, EUA) a uma diluição de 1:2,000. Sistema de quimioluminescência ECL foi utilizada para o desenvolvimento (GE- Healthcare, EUA).
[00154] A Figura 19A mostra uma ELISA de inibição, onde pode ser observado que os alérgenos polimerizados de P. pratense manosilados ou não, apresentam menor reatividade a IgE do que alérgenos nativos. A Figura 19B mostra as faixas correspondentes às proteínas alergênicas de P. pratense tanto na eletroforese em gel quanto na imunodetecção realizada com soro de pacientes alérgicos, ao passo que nas pistas correspondentes ao alérgeno polimerizado e ao alérgeno polimerizado e manosilado não são observadas faixas (PAGE-SDS) ou de ligação de IgE.
[00155] A Figura 20A mostra uma ELISA de inibição, onde pode ser observado que os alérgenos polimerizados de D. pteronyssinus e D. farinae conjugados com manana ou não, apresentam similar reatividade a IgE, a qual é menor do que o observado com alérgenos nativos. A Figura 20B mostra as faixas correspondentes às proteínas alergênicas de ambas as espécies de ácaros, tanto na eletroforese em gel quanto na imunodetecção realizada com soro de pacientes alérgicos, ao passo que nas pistas correspondentes ao alérgeno polimerizado e ao alérgeno polimerizado e manosilado não são observadas faixas (PAGE-SDS) ou de ligação de IgE. 5.2. - Testes de ativação ex vivo em basófilos humanos Foi efetuada avaliação sobre a capacidade das diferentes preparações de Phleum pratense e D. farinae em ativar basófilos de pacientes alérgicos a tais alérgenos.
[00156] A avaliação na ativação de basófilos foi conduzida utilizando-se o kit comercial BASOTEST ® (ORPEGEN Pharma, Heidelberg, Alemanha), que permitiu medir a percentagem de ativação de basófilos no sangue periférico pot citometria de fluxo. Procedimento: 1- Extração de sangue venoso periférico em um tubo com heparina de sódio 2- Incubação do sangue com o tampão de estimulação (contendo IL- 3) 3- Estimulação com alérgenos de P. pratense e D. farinae (nativo, polímero e polímero-manana). Um controle negativo (apenas com o tampão de lavagem) e um controle positivo (péptido quimiotáctico de N-formil- metionina-leucina-fenilalanina (fMLP)) também estão incluídos. 4- Rotulagem de células com anticorpos monoclonais fluorocromo conjugado (anti-CD203c e anti-CD63.FITC). Células duplo positivas (CD203c / CD63) refletem os basófilos ativados. 5- Lise de eritrócitos com tampão hipotônico. 6- A análise foi efetuada em um citômetro FC500 (Beckman Coulter). A rotulagem específica para a determinação basófilos ativados foi: CD203c + e CD63 +.
[00157] A percentagem de basófilos ativados (CD203c + CD63 +), após incubação com cada um dos alérgenos não polimerizados (nativos) foi, como era de se esperar, alta e similar à obtida com as de controle positivo do ensaio. Por outro lado, o grau de ativação reduzida quando a incubação foi realizada com alérgenos polimerizados de Phleum pratense e tanto de D. farinae. Esta perda da capacidade dos polímeros de ativar basófilos reflete a sua perda de alergenicidade, e, como é mostrado na Figura 21, foi comparável para ambos os polímeros não-manosilados e manosilados. Tudo isto indica que os polímeros manosilados mantêm sua alergenicidade reduzida para ambos os alérgenos, na mesma medida que a mostrada por alérgenos polimerizados convencionais (não manosilados). 5.3. - Testes de pele em pacientes alérgicos (teste de puntura)
[00158] Foi conduzida avaliação sobre a capacidade das diferentes preparações de Phleum pratense e D. farinae em produzir testes de pele positivos em pacientes alérgicos a esses alérgenos.
[00159] O teste de puntura consistiu na colocação de uma gota, em duplicado, de cada alérgeno (nativo, polímero ou polímero-manana) de P. pratense e D. farinae na pele do antebraço de pacientes alérgicos a P. pratense and D. farinae, respectivamente. Estes alérgenos, preparados tal como foi anteriormente descrito, foram ajustados para a mesma concentração de proteína em uma solução de 50% de solução salina tamponada com glicerol. O alérgeno foi introduzido na derme através da punção da pele com uma lanceta de 1 mm através da gotícula. O alérgeno reage com os mastócitos sensibilizados dos pacientes, através da IgE específica dos mesmos, que liberam histamina após sua ativação. O histamina libertada aumenta a permeabilidade capilar, produzindo um extravasamento de líquido que resulta em uma pápula cutânea que aparece 20 minutos após a puntura.
[00160] O tamanho da pápula (mm2) é considerado um índice de alergenicidade para a preparação, sendo este índice maior quanto maior for a superfície da pápula resultante.
[00161] Para estatísticas descritivas, foi utilizada a média com os seus respectivos limites de confiança (CI) de 95%, desvio padrão, mediana com o primeiro e terceiro quartil correspondente, coeficiente de variação e a gama de valores (valor máximo e mínimo).
[00162] Para dados estatísticos comparativos, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) com correção de Bonferroni (para comparação entre os pares de valores) na dados dos testes de pele com os ácaros (D. farinae), uma vez que estes seguem uma distribuição normal. No caso dos dados de testes cutâneos com Phleum pratense, foram utilizados os testes não paramétricos, uma vez que esses dados não seguem uma distribuição normal. Foi utilizado o teste de Friedman para comparar as três preparações e o teste de Wilcoxon para comparação entre os pares.
[00163] Para a representação gráfica, foi utilizado o diagrama de caixa, que representa a mediana com os seus respectivos quartis de 25 e 75%.
[00164] 12 pacientes foram estudados, 5 homens e 7 mulheres, sendo eles clinicamente alérgicos a pólen de gramíneas. A média de idade era de 41 anos, em uma gama de 11 a 78 anos. A mediana do tamanho de área da pápula induzida pelo extrato nativo (não modificado) de Phleum pratense foi 28,4 mm2, sendo os valores dos quartis de 25 e 75% de 23,0 e 43,1 mm2, respectivamente. Os valores correspondents aos extratos polimerizados foram 8,0 mm2 para a mediana e 8,0 e 19,7 para os quartis, respectivamente. Para o extrato polimerizado e manosilado, os valores foram 0,0 para a mediana e 0,0 e 5,4 para os quartis, respectivamente (Tabela 3).
[00165] As diferenças entre os tamanhos das pápulas, obtidas com os três tipos de preparações, foram bem significativas (teste de Friedman, P<0,0001), sendo também bastante significativas (teste de Wilcoxon test, P<0,0001) entre os pares de preparação: nativo-polimerizado, nativo-manosilado polimerizado, polimerizado-manosilado. The preparação que apresenta menor alergenicidade in vivo é o polimerizado manosilado.
[00166] As Tabelas 2 e 3 mostram os valores individuais da área de cada uma das pápulas obtidos em cada preparação, bem como as estatísticas descritivas desses valores e os dados epidemiológicos dos pacientes (idade e sexo).
[00167] Tabela 2: Dados epidemiológicos (idade e sexo) dos pacientes e valores da área de cada uma das pápulas induzidas por cada preparação.
[00168] Tabela 3: Estatísticas descritivas dos dados mostrados na Tabela 2.
[00169] Figura 22 mostra, através de um diagrama de caixa, os valores para as áreas das pápulas obtidas com cada uma das preparações de Phleum pratense. Como pode ser observado, os testes cutâneos realizados com o polímero manosilados são praticamente negativos, o que envolve uma redução no que diz respeito aos polímeros não-manosilados, que por sua vez é muito mais baixa do que a dos antígeno nativos (não polimerizados). Tudo isso indica uma perda de alergenicidade do polímero Phleum pratense manosilado de, em mesmo ou maior grau que o polímero convencional (não-manosilado).
[00170] Foram estudados 22 pacientes, 14 homens e 8 mulheres, sendo clinicamente alérgicos a Dermatophagoides farinae. A média de idade foi de 32 anos, em uma gama de 12 a 82 anos de idade. A mediana do tamanho da pápula induzida pelo extrato nativo (não modificado) de Dermatophagoides farinae foi de 64,2 mm2, sendo os valores dos quartis 25 e 75% de 54,2 mm2 e 72,3, respectivamente. O valores correspondentes aos extratos polimerizados foram 32,5 mm2 para a mediana e 1,0 e 45,7 para os quartis, respectivamente. Para o extrato polimerizado e manosilado, os valores foram de 24,1 para a mediana e de 16,3 e 33,8 para os quartis, respectivamente.
[00171] As diferenças entre os tamanhos de pápula, obtidas com os três tipos de preparações, são muito significativas (teste ANOVA, P <0,0001), sendo também muito significativa (correção de Bonferroni, P <0,0001) entre pares de preparação: polimerizado nativo e polimerizado nativo-manosilado. As duas preparações mostram uma diminuição muito importante de alergenicidade in vivo em comparação com o alérgeno não polimerizado
[00172] As Tabelas 4 e 5 mostram os valores individuais da área de cada uma das pápulas obtidos em cada preparação, bem como as estatísticas descritivas desses valores e os dados epidemiológicos dos pacientes (idade e sexo).
[00173] Tabela 4: Dados epidemiológicos (idade e sexo) dos pacientes e valores da área de cada uma das pápulas induzidas por cada preparação.
[00174] Table 5: Estatísticas descritas dos dados mostrados na Tabela 4
[00175] Figura 23 mostra, através de um diagrama de caixa, os valores para os áreas das pápulas obtidas com cada uma das preparações de D. farinae. Como pode ser observado, os testes cutâneos realizados com o polímero manosilado são semelhantes àqueles com o polímero não-manosilado, e ao mesmo tempo é muito menor do que os do antígeno nativos (não polimerizados). Tudo isso indica uma perda de alergenicidade do polímero manosilado de D. farinae, na mesma medida que o polímero convencional (não-manosilado)
[00176] Células dendríticas (CD) foram induzidas a partir de monócitos de sangue periférico de dadores saudáveis, cultivadas durante 5 dias com GM-CSF e IL-4. As CD assim obtidas (imaturas) foram expostas a polímeros de Phleum pratense (com ou sem manana conjugada) preparados tal como foi descrito anteriormente, para avaliar a aceitação por estas células. Os ensaios de captação foram realizados após 2 horas de contato entre CD e a preparação por meio de citometria de fluxo, utilizando a autofluorescência do extrato de Phleum pratense devido aos pigmentos destes. Dois parâmetros foram avaliados: a) quantidade de alérgeno capturado pelas CDs (taxa de absorção); b) percentagem de células que apresentam capacidade de internalização. Além disso, os ensaios de captação foram conduzidos com alérgenos Phleum pratense previamente marcados com um fluorocromo (M Alexa 488) através de cisteínas. Os resultados foram analisados por citometria de fluxo e microscopia confocal. Resultados Como pode ser observado na Figura 24A, a quantidade de polímero manosilado de Phleum pratense autofluorescente capturado pelas CDs é mais do que 7 vezes mais elevada do que a capturada pelo polímero convencional (não-manosilado), de acordo com o MFI (índice médio de fluorescência), o que reflete a taxa de absorção. Na parte superior esquerda da mesma figura, representou-se a quantidade de células com capacidade de captura de ambas as preparações de polímero (Phleum pratense, manosilado e não manosilado). Como pode ser observado, a percentagem de células positivas que mostram maior fluorescência corresponde às incubadas com o polímero manosilado. Estes resultados foram confirmados por rotulagem com um fluorocromo (Alexa M488) através de cisteínas. Como pode ser observado na Figura 24B, o número de células duplamente positivas (identificadas como HLA-DR e Alexa 488) foi muito superior quando as células foram incubadas com o polímero com manana, o que implicava uma maior absorção desta preparação. No lado inferior da mesma Figura, o valor médio de fluorescência é representado. Como pode ser observado, a intensidade da fluorescência foi também mais elevada nas CDs incubadas com o polímero manosilados. A Figura 24C mostra imagens de microscopia de fluorescência confocal, onde pode ser vista maior captação das CDs incubadas (30min) com o polímero com manana, em comparação com as CDs incubadas com o polímero não-manosilado ou o alérgeno nativo. A conclusão destes ensaios é que o polímero manosilado é capturado por um maior número de CDs e que estes as capturam, também, em uma quantidade maior.
[00177] Monócitos isolados de sangue periférico de dadores saudáveis foram diferenciados das células dendríticas (CD) com IL-4 e GM-CSF. Estas Ds (imaturas) foram incubadas com alérgenos polimerizado manosilado (PM) e polimerizado não-manosilado (P) alérgenos (Phleum pratense) a 50 ug / mL. A concentração de citocina foi determinada nos sobrenadantes das culturas destas células 24 horas após a sua estimulação com os diferentes preparações. A tecnologia utilizada para quantificar as citocinas foi citometria de fluxo Multiplex.
[00178] A Figura 25 mostra a media dos 3 experimentos independentes.
[00179] Como pode ser observado, as células dendríticas (CD) foram incubadas com o polímero de Phleum pratense manosilado produzem uma maior quantidade de IL-6 e IL-10 do que o alérgeno não manosilado polimerizado ou do que o alérgeno nativo (não polimerizado). Pelo contrário, as três preparações induzem uma produção semelhante de IL-8. Estes resultados indicam que as CDs mielóides humanas respondem diferencialmente aos polímeros manosilados. O fato de um aumento de IL-10 ser observado com o polímero manosilado é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são pretendidas para esse tipo de preparações.
[00180] Forma induzidas células dendríticas (CDs) de monócitos de sangue periférico (“buffy coat”) de dadores saudáveis, cultivadas durante 5 dias com GM- CSF e IL-4. As CDs assim obtidas (imaturas) foram expostos a diferentes preparações alergênicas (nativo, polímero e polímero-manana) para avaliar a maturação de CD em resposta aos mesmos. O ensaio de maturação foi analisado por citometria de fluxo após 48 horas de cultura, avaliando a expressão da molécula associada à maturação de DC (HLA-II (DR), CD80, CD83 e CD86).
[00181] Procedimento de marcação celular: células de 5 x 105 foram usadas por rotulagem. As células foram novamente suspensas em PBS e adicionou-se 1 μg de anticorpo direto (1:100) (conjugado com fluorocromo) ou indireto (não conjugado). Elas foram incubadas durante 20 minutos a 4 °C no escuro e posteriormente lavadas com PBS. No caso do anticorpo indireto, 1 μg (diluição 1:100) de anticorpo secundário de anti-IgG de camundongo, conjugado com o fluorocromo de interesse, foi adicionado. Depois de lavar duas vezes com PBS, as células foram novamente suspensas em um volume de 300-400 uL de PBS e foram finalmente analisadas por citometria de fluxo (FC 500 Coultek Beckman).
[00182] Como pode ser observado na Figura 26, alérgenos polimerizados induzem a maturação de CDs imaturas de mielóide após elas serem incubadas com os referidos alérgenos. O grau de maturação é avaliado de acordo com a expressão de superfície de CD dos marcadores refletida na figura. Todos os marcadores associados à maturação são incrementados nas CDs incubadas com os alérgenos polimerizados com respeito aos alérgenos não polimerizados, não havendo diferenças significativas dependendo do polímero sendo manosilado ou não. Estes resultados indicam que, do ponto de vista de maturação de DC, o polímero de Phleum pratense manosilado se comporta de forma semelhante aos polímeros convencionais (não polimerizados) e, portanto, apresenta um índice de maturação mais elevado do que os alérgeno convencionais (não polimerizados).
[00183] Como pode ser observado na Figura 27, alérgenos polimerizados induzem a maturação de CD imaturas mielóide após essas serem incubadas com os referidos alérgenos. O grau de maturação é avaliado de acordo com a expressão de superfície da CD dos marcadores refletida na figura. Todos os marcadores associados à maturação são incrementados em CDs incubadas com os alérgenos polimerizados com respeito aos alérgenos não polimerizados, não havendo diferenças significativas dependendo do polímero sendo manosilado ou não. Estes resultados indicam que, do ponto de vista de maturação de DC, o polímero manosilado de D. farinae se comporta de forma semelhante aos polímeros convencionais (não polimerizados) e, portanto, apresenta um índice de maturação mais elevado do que o alérgeno convencional (não polimerizado).
[00184] Células T de ação a alérgeno específico foram obtidas a partir de PBMC de indivíduos saudáveis, após três ciclos de estimulação com CDs maduras autólogas carregadas com os correspondentes extratos alergênicos. Resumidamente, as iCDs (106 / ml) foram incubadas durante 8 horas em meio DMEM completo com os extratos correspondentes (100 μg/mL) e, em seguida, foram maturadas por incubação com peptidoglicano (1 μg/mL). Células maduras dendríticas (mCD), previamente lavadas, foram incubadas novamente durante 6 horas (106 células em 1 ml), com os correspondentes extratos em meio DMEM completo e imediatamente a seguir foram irradiadas (3000 rad). As mCDs irradiadas e carregadas com os alérgenos foram então distribuídas em placas de 48 cavidades (106 / mL) e foram co-cultivadas com PBMCs em conjunto (107 células / ml) na presença de IL-7 (1 μg/mL). As culturas foram suplementadas com IL-2 (10 U / mL) 5 dias após o primeiro estímulo. O mesmo processo de estimulação e a expansão das PBMC com CDs carregadas com os extratos de alérgeno foi repetido três vezes. A produção de células-IFNy alergênicas específicas, IL- 10 e IL-4 foi medida por ensaio ELISPOT.
[00185] Como se observa na Figura 28, o número de células produtoras de IFN-y e IL-10 está aumentado nas culturas imunizados com o alérgeno polimerizado e manosilado na resposta específica, em comparação com as culturas imunizados no polímero convencional (não-manosilado). Este aumento não aparece com um número maior de células produtoras IL-4, que indica que não houve uma polarização para um fenótipo Th2. O fato do aumento de IFN-Y e IL-10, sem um aumento de IL-4, ser observado com o polímero manosilado é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são pretendidas para com esse tipo de preparação.
[00186] 9.1.2 Polímeros de D. farinae manosilados com glutaraldeído melhoram a resposta de y-IFN e IL-10 sos polímeros não-manosilados sem aumentar a resposta a IL-4. Como se observa na Figura 29, o número de células produtoras de IFN-y e IL-10 está aumentado nas culturas imunizados com o alérgeno polimerizado e manosilado na resposta específica, em comparação com as culturas imunizados no polímero convencional (não-manosilado). Este aumento não aparece com um número maior de células produtoras IL-4, que indica que não houve uma polarização para um fenótipo Th2. O fato do aumento de IFN-y e IL-10, sem um aumento de IL-4, ser observado com o polímero manosilado é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são pretendidas para com esse tipo de preparação.
[00187] Foram realizadas imunizações com alérgenos Phleum pratense e D. farinae com polímeros manosilados e não manosilados, de modo a avaliar a sua capacidade imunogênica in vivo. As imunizações foram realizadas em camundongos Balb / c com o protocolo mostrado na Figura 30. A resposta à imunização foi avaliada no baço, realizando ensaios de linfoproliferação específicos por marcação com CFSE em resposta ao alérgeno na sua forma nativos. Fito-hemaglutinina (PHA) foi usada como controle positivo. A proliferação foi determinada no dia 6 de cultura e no dia 7. A quantificação de citocinas também foi feita no sobrenadante da cultura de 48 horas após a estimulação com os fluxo de citometria tecnologia multiplex (Figura 31). Fito- hemaglutinina (PHA) foi usada como controle positivo. Os níveis específicos a IgE (P. D. farinae ou pratense) e IgG1 (como marcadores da resposta TH2) e IgG2a (marcador de resposta Th1), também foram avaliadas por ELISA. Resultados 10.1 Imunização com polímeros manosilados de Phleum pratense produz uma resposta proliferativa superior aos estímulos antigénicos do que com polímeros não-manosilado. Como pode ser observado na Figura 32, a percentagem de proliferação, que reflete o número de células T que respondem ao antígeno, é significativamente mais elevada quando os células que respondem são retiradas do baço de camundongos imunizados com os alérgenos polimerizados e manosilados, em comparação com os células pegas do baço de camundongos imunizados com o alérgeno polimerizado convencional (não polimerizados). Isto indica que as propriedades imunogénicas do alérgeno Phleum pratense alérgeno polimerizado e manosilado são significativamente mais elevadas do que as do polímero não- manosilado.
[00188] 10.2 Imunização com polímeros manosilados de D. farinae produz uma resposta proliferativa superior aos estímulos antigénicos do que com polímeros não-manosilado.
[00189] Como pode ser observado na Figura 33, a percentagem de proliferação, que reflete o número de células T que respondem ao antígeno, é significativamente mais elevada quando os células que respondem são retiradas do baço de camundongos imunizados com os alérgenos polimerizados e manosilados, em comparação com os células tiradas do baço de camundongos imunizados com o alérgeno polimerizado convencional (não polimerizados). Isto indica que as propriedades imunogénicas do alérgeno D. farinae Phleum pratense alérgeno polimerizado e manosilado são significativamente mais elevadas do que as do polímero não-manosilado.
[00190] 10.3 Esplenócitos de camundongos imunizados com polímeros Phleum pratense manosilados modificam o padrão de citocina, com relação a polímeros não-manosilados.
[00191] A Figura 34 (Fig. 34A e 34B) representa a produção das diferentes citocinas obtidas em sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimuladas com alérgeno P. pratense, de camundongos imunizados com alérgeno polimerizado manosilado e não-manosilado. Como pode ser observado, o padrão de citocinas produzidas difere para muitos deles dependendo do local onde estão os esplenócitos. Suas variações produzidas por células linfóides são mostrados de uma forma quantitativa na Tabela 6.
[00192] 10.4 Linfócitos de camundongos imunizados com polímeros Phleum pratense manosilados aumentam a produção de IL-10, em comparação a polímeros não-manosilados.
[00193] Tabela 6. Produção in vitro relativa de citocinas por linfócitos de camundongos imunizados com polímeros de Phleum pratense
[00194] **Aumento relativo 100 vezes mais alto que os valores obtidos em camundongos imunizados em polímeros não manosilados Como pode ser observado na Tabela 6, as maiores variações que podem ser obtidas no que diz respeito à produção de citocinas de origem linfóide mostradas na Figura 34 (FIG. 34A e 34B) correspondem à IL-2, IL-10 e IFN-Y, o que aumenta mais do que 300, 145 e 125 vezes em ratinhos imunizados com o alérgeno polimerizado e manosilado, no que diz respeito à produção obtido no aqueles imunizados com os polímero não-manosilado. Este aumento, especialmente na produção de IL-10 e IFN-Y, é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são pretendidas para com este tipo de preparações.
[00195] A Figura 35 (Fig. 35A e 35B) representa a produção das diferentes citocinas obtidas em sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimuladas com alérgeno D. farinae, de camundongos imunizados com alérgeno polimerizado manosilado e não-manosilado. Como pode ser observado, o padrão de citocinas produzidas difere para muitos deles dependendo do local onde estão os esplenócitos. Suas variações produzidas por células linfóides são mostrados de uma forma quantitativa na Tabela 7.
[00196] Tabela 7. Produção in vitro relativa de citocinas por linfócitos de camundongos imunizados com polímeros de D. farinae Citocina Variação (no. de vezes) de D. farinae-Manana X D. farina ** Aumento relativo 100 vezes maior que os valores obtidos em camundongos imunizados com polímeros sem Manana
[00197] Como pode ser observado na Tabela 7, as maiores variações que podem ser obtidas no que diz respeito à produção de citocinas de origem linfóide mostradas na Figura 35 (FIG. 35A e 35B) correspondem à IL-2, IL-10 e IFN-γ, o que aumenta mais do que 300, 145 e 125 vezes em camundongos imunizados com o alérgeno polimerizado e manosilado, no que diz respeito à produção obtida naqueles imunizados com os polímeros não-manosilados. Este aumento, especialmente na produção de IL-10 e IFN-γ, é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são pretendidas para com esse tipo de preparação. 10.7 A resposta de anticorpo específico em camundongos imunizados com altas doses de polímeros manosilados e polimerizados de Phleum pratense favorece a proporção de IgG/IgE com relação aos polímeros não manosilados. Como se observa na Figura 36 (Fig. 36A e 36B), os IgG de anticorpos específicos para cada resposta ao alérgeno de Phleum pratense é mais elevado nos soros de camundongos imunizados com os alérgenos polimerizados e manosilados que o polimerizado com o alérgeno convencional (não-manosilado). Pelo contrário, a resposta de anticorpos do tipo IgE específica é menor do que a dos polímeros convencionais. Como pode ser visto na figura, a proporção de IgG2a / IgE é maior quando são efetuadas imunizações com os alérgenos polimerizadose manosilados de D. farinae. O aumento desta proporção é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são requeridos para esse tipo de preparação, uma vez que indica uma polarização antialérgica d a resposta obtida. [00198] 10.8 A resposta de anticorpo específico em camundongos imunizados com altas doses de polímeros manosilados de D. farinae favorece a proporção de IgG/IgE ratio com relação aos polímeros não manosilados. Como se observa na Figura 37 (Fig. 37A e 37B), os IgG de anticorpos específicos para cada resposta ao alérgeno de D. farinae é mais elevado nos soros de camundongos imunizados com os alérgenos polimerizados e manosilados que o polimerizado com o alérgeno convencional (não-manosilado). Pelo contrário, a resposta de anticorpos do tipo IgE específica é menor do que a dos polímeros convencionais. Como pode ser visto na figura, a proporção de IgG2a / IgE é maior quando são efetuadas imunizações com os alérgenos polimerizadose manosilados de D. farinae. O aumento desta proporção é muito positivo para os propriedades imunomoduladoras que são requeridos para esse tipo de preparação, uma vez que indica uma polarização antialérgica da resposta obtida.
Claims (15)
1 .- “COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, caracterizado por compreender (i) um antígeno polimerizado de natureza proteica e (ii) manana compreendendo um resíduo peptídico com grupos amino; em que o antígeno e a manana estão covalentemente ligados entre si por meio de um grupamento diimino entre os grupos amino presentes no antígeno e no resíduo peptídico da manana, sendo o grupamento diimino resultante da reação de um dialdeído com os grupos amino presentes no antígeno e no resíduo peptídico da manana.
2 .- “COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a manana vir de uma planta, um fungo ou de uma levedura.
3 .- “COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o antígeno polimerizado compreender ao menos dois antígenos que são os mesmos ou diferentes entre si.
4 - “COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por o antígeno ser um alérgeno.
5 .- “COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por a razão manana:antígeno estar entre 1:10 e 1:0,1
6 .- “MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por compreender (i) a preparação de uma dissolução compreendendo um antígeno de natureza proteica e manana compreende resíduo peptídico compreendendo grupos amino, e (ii) adicionando um dialdeído à referida dissolução.
7 .- “MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o método compreender ainda a etapa (iii) compreendendo a adição de um agente neutralizante na etapa de reação e/ou etapa (iv) compreendendo o isolamento do complexo imunogênico.
8 .- “MÉTODO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o antígeno ser um alérgeno.
9 .- “MÉTODO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, caracterizado por a razão antígeno:manana estar entre 1:10 e 1:0.5.
10 . “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA” caracterizada por compreender um complexo imunogênico tal como definido por qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
11 .- “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ainda compreender uma substância ativa adicional.
12 .- “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizado por a composição se encontrar em uma forma farmacêutica sólida de administração, em uma forma farmacêutica líquida de administração, ou uma forma de expedição farmacêutica compreendendo um sistema disperso.
13 .- “USO DE UM COMPLEXO IMUNOGÊNICO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por ser para fabricação de uma composição farmacêutica.
14 .- “USO”, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a composição farmacêutica ser empregada para estimular e/ou induzir a resposta imune em um indivíduo.
15 .- “USO”, de acordo com as qualquer uma das reivindicações 13, caracterizado pela composição farmacêutica ser empregada para o tratamento de uma doença infecciosa, um neoplasma ou alergia em um indivíduo.
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