BR112014013697A2

BR112014013697A2 - peptídeos mini-hepcidina modificados e métodos de uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112014013697A2
Application number: BR112014013697-1A
Authority: BR
Inventors: Tomas Ganz; Elizabeta Nemeth; Piotr Ruchala
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2020-11-03
Also published as: EP2788370A4; AU2012327226B2; IL232927A0; JP6571333B2; CA2855122A1; JP2018087215A; JP2015504859A; WO2013086143A1; AU2012327226A1; AU2012327226C1; ZA201404962B; US9896481B2; AU2012327226C9; US20160200765A1; EP2788370B1; EP2788370A1; HK1199892A1; US20140336110A1; US9328140B2; CN104011066A

Abstract

peptídeos mini-hepcidina modificados e métodos de uso dos mesmos. são revelados aqui peptídeos os quais exibem atividade hepcidina e métodos para preparar e usar os mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PEPTÍDEOS MINI-HEPCIDINA MODIFICADOS E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS”.

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[1] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente US N.º de série 61/568.724, depositado em 09 de dezembro de 2011, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[2] Este pedido está relacionado com o pedido de Patente US N.º de série 13/131.792, que é uma entrada em Fase Nacional 371 de PCT/US2009/066711, depositada em 4 de dezembro de 2009, e o pedido provisório US N.º de série 61/120.277, depositado em 5 de dezembro de 2008, todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

AVISO DE APOIO GOVERNAMENTAL

[3] Esta invenção foi feita com o apoio do Governo N.º de concessão NIH/NIDDK R01 DK090554, concedido pelo National Institutes of Health. O Governo tem certos direitos nesta invenção.

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ENVIADA VIA EFS-WEB

[4] O conteúdo do arquivo de texto ASCII da listagem de sequência nomeada “034044_097WO1_ST25”, que é de 2,53 kb de tamanho foi criada em 1 de Novembro de 2012 e eletronicamente submetida através de EFS-Web, em anexo ao pedido, é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[5] FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[6] 1. CAMPO DA INVENÇÃO.

[7] A presente invenção refere-se genericamente aos peptídeos que apresentam atividade hepcidina.

2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA.

[8] Hepcidina, um hormônio peptídico produzido pelo fígado, é um regulador da homeostase de ferro em seres humanos e outros mamíferos. Hepcidina atua através da ligação ao seu receptor, o canal ferroportina de exportação de ferro, e gerando sua internalização e degradação.

Hepcidina humana é um peptídeo de 25-aminoácidos (Hep25).

Ver Krause et al. (2000) FEBS Lett 480: 147-150, e Park et al. (2001) J Biol Chem 276:7806-7810. A estrutura da forma de 25-aminoácidos bioativos de hepcidina é um simples grampo de cabelo com 8 cisteínas que formam 4 ligações dissulfeto, conforme descrito por Jordan et al. (2009) J Biol Chem 284:24155-67. A região N-terminal é necessária para a função reguladora de ferro, e deleção de 5 resíduos de aminoácidos N-terminais resulta em uma perda da função reguladora de ferro. Ver Nemeth et al. (2006) Blood 107:328-33.

[9] Atividade de hepcidina anormal está associada a doenças de sobrecarga de ferro, que incluem a hemocromatose hereditária e anemias de carregamento de ferro e mielodisplasia. Hemocromatose hereditária (HH) é uma doença de sobrecarga de ferro genética que é causada principalmente pela deficiência de hepcidina, ou muito raramente por resistência a hepcidina. Isto permite que a absorção excessiva de ferro da dieta e desenvolvimento de sobrecarga de ferro. As manifestações clínicas de HH podem incluir doença hepática (cirrose hepática, carcinoma hepatocelular), diabetes, e insuficiência cardíaca.

Atualmente, o único tratamento para HH é flebotomia regular, que é eficaz, mas muito onerosa para os pacientes.

[10] Anemias de carregamento de ferro são anemias hereditárias com eritropoiese ineficaz, como β-talassemia, que são acompanhadas por sobrecarga de ferro grave. As complicações da sobrecarga de ferro são a principal causa de morbidade e mortalidade desses pacientes. Deficiência de hepcidina é a principal causa da sobrecarga de ferro em pacientes não transfundidos, e contribui para a sobrecarga de ferro em pacientes transfundidos. O tratamento atual para a sobrecarga de ferro nesses pacientes é quelante de ferro que é muito pesado, por vezes, ineficaz e acompanhado por efeitos colaterais frequentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[11] A presente invenção refere-se genericamente aos peptídeos que apresentam atividade hepcidina e métodos de utilização dos mesmos.

[12] A presente invenção fornece peptídeos, que podem ser isolados e/ou purificados, compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo na seguinte fórmula estrutural IA ou IB: em que A1 é Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, piroglutamato, D- piroglutamato, Gln, D-Gln, Asn, D-Asn, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como bhAsp, Ida, Ida(NHPal), e N-MeAsp, preferencialmente Ida e N-MeAsp; A2 é Thr, D-Thr, Ser, D-Ser, Val, D-Val, Ile, D-Ile, Ala, D-Ala ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como Tle, Inp, Chg, bhThr, e N-MeThr; A3 é His, D-His, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como L-His(π-Me), D-His(π-Me), L- His(τ-Me), ou D-His(τ-Me); A4 é Phe, D-Phe, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Trp, D-Trp, Tyr, D-Tyr, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como Phg, bhPhe,

Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal, bhDpa, Amc, PheF5, hPhe, Igl ou ciclohexilalanina, preferencialmente Dpa;

A5 é Pro, D-Pro, Ser, D-Ser, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos,

como Oic, bhPro, trans-4-PhPro, cis-4-PhPro, cis-5-PhPro,

Idc e, preferencialmente, bhPro;

A6 é Arg, D-Arg, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Thr, D-Thr,

Lys, D-Lys, Val, D-Val, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como D-

Νω,ω-dimetil-arginina, L-Nω,ω-dimetil-arginina, D-

homoarginina, L-homoarginina, D-norarginina, L-norarginina,

citrulina, um Arg modificado, em que o grupo guanidínio é modificado ou substituído, norleucina, norvalina, bheIle,

Ach, N-MeArg, e N-MeIle, preferencialmente, Arg;

A7 é Cys, D-Cys, Ser, D-Ser, Ala, D-Ala, ou um aminoácido não natural, como Cys(S-tBut), homocisteína,

Pen, (D)Pen, preferencialmente, S-terciário-butil-cisteína,

Cys(S-S-Pal), Cys(S-S-cisteamina-Pal), Cys(S-S-Cys-NHPal) e

Cys(S-S-Cys);

A8 é Arg, D-Arg, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Thr, D-Thr,

Νω,ω-dimetil-arginina, L-Nω,ω-dimetil-arginina, D-

homoarginina, L-homoarginina, D-norarginina, L-norarginina,

Ach, N-MeArg, e N-MeIle, preferencialmente, Arg;

A9 é Phe, D-Phe, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Tyr, D-Tyr,

Trp, D-Trp, Phe-Ra, D-Phe-Ra, Dpa-Da, D-Dpa-Ra, Trp-Ra,

bhPhe-Ra, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo como PheF5 , N-MePhe,

benzilamida, 2-aminoindano, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal,

bhDpa, e ciclohexilalanina que pode ser ou não ter Ra ligado ao mesmo, preferencialmente bhPhe e bhPhe-Ra, em que

Ra um é palmitoil-PEG, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3,

palmitoil-PEG-PEG, em que o PEG é PEG11 ou miniPEG3,

butanoil (C4)-PEG11, octanoil(C8, caprílico)-PEG11,

palmitoil (C16)-PEG11-, ou tetracosanoil (C24,

lignocérico)-PEG11; e

A10 é Cys, D-Cys, Ser, D-Ser, Ala, D-Ala, ou um aminoácido não natural, como Ida, Ida(NHPal)Ahx e

Ida(NBzl2)Ahx;

em que o aminoácido carboxi-terminal está na forma de amida ou carboxi; em que pelo menos um aminoácido sulfidril está presente como um dos aminoácidos na sequência; e em que A1, A1, a A2, A10, ou uma combinação dos mesmos são opcionalmente ausentes, com a condição de que o peptídeo não é um dos peptídeos conforme definidos na Tabela 1. Em algumas modalidades, os peptídeos da presente invenção contêm pelo menos uma das seguintes formas: a) A1 = N-

MeAsp, Ida ou Ida(NHPal); b) A5 = bhPro; c) A6 = D-Val, D-

Leu, Lys, D-Lys, Arg, D-Arg, Ach, bhArg, ou N-MeArg; d) A7

= Cys(S-S-Pal), Cys(S-S-cisteamina-Pal), Cys(S-S-Cys-

NHPal), ou Cys(S-S-Cys); e/ou e) A8 = D-Val, D-Leu, Lys, D-

Lys, Arg, D-Arg, Ach, bhArg, ou N-MeArg.

Em algumas modalidades, i) quando A1 é Ida e A9 é Phe, então A10 não é

Ahx-Ida(NHPal); ii) quando A1 é Ida, A9 não é bhPhe-Rb, em que Rb é S-(palmitil)tioglicólico-PEG-; iii) quando A4 é D-

Phe, A7 não é D-Cys(S-S-tBut) e A9 não é D-Trp-Rc, em que

Rc é butanoil-PEG11-, Octanoil-PEG11-, Palmitoil-PEG11-, ou

Tetracosanoil-PEG11-; ou iv) quando A1 é Ida e A9 é bhPhe-

Rd, em que Rd é palmitoil-PEG-miniPEG3-, A6 e A8 não são ambos D-Arg ou ambos bhArg.

Em algumas modalidades, A1 é D-

Asp, N-MeAsp, Ida, ou Ida(NHPal); A2 é Thr ou D-Thr; A3 é

His ou D-His; A4 é Dpa ou D-Dpa; A5 é Pro, D-Pro, bhPro, ou

Oic; A6 é Ile, D-Ile, Arg, D-Val, D-Leu, Ach, ou N-MeArg;

A7 é Cys, D-Cys, Cis(S-S-Pal), Cys(S-S-cisteamina-Pal),

Cys(S-S-Cys-NHPal), ou Cys(S-S-Cys); A8 é Ile, D-Ile, Arg,

D-Val, D-Leu, Ach, ou N-MeArg; A9 é Phe, D-Phe, Dpa, D-Dpa,

Trp, D-Trp, bhPhe, Phe-Ra, D-Phe-Ra, Dpa-Ra, D-Dpa-Ra, Trp-

Ra, bhPhe-Ra, em que Ra um é palmitoil-PEG-, em que PEG é

PEG11 ou miniPEG3, palmitoil-PEG-PEG, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3, butanoil (C4)-PEG11-, octanoil(C8, caprílico)-

PEG11-, palmitoil (C16)-PEG11-, ou tetracosanoil (C24,

lignocérico)-PEG11-; e A10, se presente, é Ida(NHPal) Ahx ou Ida(NBzl2)Ahx. Em algumas modalidades, A6 e/ou A8 é um derivado da lisina, como Ν-ε-dinitrofenil-lisina, Ν-ε- metil-lisina, Ν,Ν-ε-dimetil-lisina, e Ν,Ν,Ν-ε-trimetil- lisina. Em algumas modalidades, o peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: PR42’, PR47, PR48, PR49, PR50, PR51, PR52, PR53, PR56, PR57, PR58, PR59, PR60, PR61, PR63, PR65, PR66, PR67, PR68, PR69, PR70, PR71, PR72, PR73, PR74, e PR82.

[13] Em algumas modalidades, os peptídeos formam uma estrutura cíclica através de uma ponte dissulfeto. Em algumas modalidades, os peptídeos exibem atividade hepcidina. Em algumas modalidades, os peptídeos ligam ferroportina, preferencialmente ferroportina humana.

[14] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições e medicamentos que compreendem pelo menos um peptídeo, que podem ser isolados, sintetizados e/ou purificados, compreendendo, consistindo essencialmente ou que consiste na Fórmula Estrutural IA ou IB como aqui estabelecido. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de fabricação de medicamentos para tratar doenças do metabolismo do ferro, como as doenças de sobrecarga de ferro, os quais compreendem, pelo menos, um peptídeo, que pode ser isolado e/ou purificado, compreendendo, consistindo essencialmente ou que consiste em Fórmula Estrutural IA ou IB como aqui estabelecido.

Também são fornecidos métodos para tratar uma doença do metabolismo do ferro, em um sujeito, como um sujeito mamífero, preferencialmente um sujeito humano, que compreende administrar pelo menos um peptídeo, que pode ser isolado e/ou purificado, compreendendo, consistindo essencialmente ou que consiste na Fórmula Estrutural IA ou IB, como estabelecido aqui ou uma composição compreendendo o dito pelo menos um peptídeo ao sujeito. Em algumas modalidades, o peptídeo é administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma dose diária eficaz administrada como uma única dose diária ou em doses diárias divididas. Os peptídeos da presente invenção também podem ser administrados em uma variedade de doses.

[15] Em algumas modalidades, a dose é administrada como uma dose semanal, por exemplo, a partir de 1-10.000 µg/kg/dose. Em algumas modalidades, a dose diária é de cerca de 1-1.000, preferencialmente cerca de 10-500 µg/kg/dia. As dosagens podem variar de acordo com o tipo de formulação da droga peptidil administrada, bem como da via de administração. Um especialista no assunto poderá ajustar a dosagem, alterando a via de administração ou formulação, de modo a que a dosagem administrada deverá resultar em uma farmacocinética semelhante ou perfil biológico como poderia resultar de intervalos de dosagem preferenciais aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição a ser administrada é formulada para administração oral, pulmonar ou das mucosas.

[16] Algumas modalidades incluem qualquer dosagem com qualquer via de administração o que resulta em um perfil farmacocinético e farmacodinâmico eficaz, reduzindo os valores de ferro sérico em 10-80%. Algumas doses preferenciais incluem aquelas que resultam de uma redução desejada no ferro sérico. Administração das formulações peptidil ou proteína da presente invenção inclui tanto a administração direta, incluindo a autoadministração, e administração indireta, inclusive o ato de prescrever uma droga. Por exemplo, um médico que instrui um paciente a se autoadministrar uma droga e/ou fornece um paciente com uma prescrição de uma droga é considerada sendo administrada a droga ao paciente.

[17] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de ligação de uma ferroportina ou indução da internalização e degradação de ferroportina, que compreende o contato da ferroportina com pelo menos um peptídeo ou uma composição como aqui divulgado.

[18] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece kits que compreendem pelo menos um peptídeo ou uma composição como aqui divulgado embalados em conjunto com um reagente, um dispositivo, material de instrução, ou uma combinação dos mesmos.

[19] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece complexos que compreendem pelo menos um peptídeo como aqui divulgado ligado a uma ferroportina, preferencialmente uma ferroportina humana, ou um anticorpo, como um anticorpo que se liga especificamente a um peptídeo como aqui divulgado, Hep25, ou uma combinação dos mesmos.

[20] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece a utilização de pelo menos um peptídeo, que pode ser isolado e/ou purificado, compreendendo, consistindo essencialmente ou que consiste na Fórmula Estrutural IA ou IB, como definido aqui, ou uma composição compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste no referido pelo menos um peptídeo para fabricar um medicamento para tratar uma doença do metabolismo de ferro e/ou diminuir a quantidade de ferro, em um sujeito com necessidade dos mesmos, em que o medicamento está preparado para ser administrado em uma dose diária eficaz, como uma dose diária única, ou em doses diárias divididas. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 1-1.000, preferencialmente cerca de 10-500 µg/kg/dia. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para a injeção subcutânea ou a administração oral, pulmonar ou das mucosas.

[21] Tanto a descrição geral anterior como a descrição detalhada seguinte são apenas exemplificativas e explicativas e destinam-se a fornecer uma explicação adicional da invenção como reivindicado. Os desenhos anexos são incluídos para fornecer um entendimento adicional da invenção e estão incorporados e constituem parte desta especificação, ilustram diversas modalidades da invenção e, juntamente com a descrição servem para explicar os princípios da invenção.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[22] A presente invenção é mais bem compreendida com referência aos desenhos em que:

[23] A Figura 1 é um gráfico que mostra a atividade relativa de hepcidina de substituições de alanina em Hep25.

[24] A Figura 2A é um gráfico que mostra as atividades relativas de hepcidina de substituições F4 em Hep25.

[25] A Figura 2B é um gráfico que mostra as atividades relativas de hepcidina de substituições F9 em Hep25.

[26] A Figura 3A é um gráfico que mostra as atividades de hepcidina Hep1-9 e Hep1-10 C7A em relação ao Hep25 (A).

[27] A Figura 3B é um gráfico que mostra as atividades de hepcidina Hep1-7 e Hep1-8 em relação à Hep 1-9 ou Hep25.

[28] A Figura 3C é um gráfico que mostra as atividades de hepcidina Hep4-7, Hep3-7, Hep3-8 e Hep3-9 em relação a Hep25.

[29] A Figura 4 é um gráfico que mostra as atividades de hepcidina de peptídeos C7 modificados em relação aos Hep25 e Hep 1-9.

[30] A Figura 5 é um gráfico que mostra efeito in vivo (como medido pelos níveis de ferro no soro em camundongos) de mini-hepcidinas Hep 1-9, PR6 e PR12 em comparação com o Hep25 ou controle (PBS). Os peptídeos foram injetados por via intraperitoneal, 50 µg de peptídeo por camundongo.

[31] A Figura 6 é um gráfico que mostra efeito in vivo (como medido pelos níveis de ferro no soro em camundongos) de mini-hepcidina PR27 injetada intraperitonealmente (20 e 200 nmoles). A quantidade de Hep25 injetada foi de 20 nmoles.

[32] A Figura 7 é um gráfico que mostra efeito in vivo (como medido pelos níveis de ferro no soro em camundongos) de mini-hepcidina riHep7∆DT injetada intraperitonealmente (20 e 200 nmoles). A quantidade de Hep25 injetada foi de 20 nmoles.

[33] A Figura 8 é um gráfico que mostra efeito in vivo (como medido pelos níveis de ferro no soro em camundongos) de mini-hepcidinas PR27 e PR28 que foram primeiro misturadas com lipossomas e injetadas por via intraperitoneal (20 nmoles). A quantidade de Hep25 injetada foi de 20 nmoles.

[34] A Figura 9 é um gráfico que mostra efeito in vivo

(como medido pelos níveis de ferro no soro em camundongos) de mini-hepcidina PR27 após administração oral por gavagem (200 nmoles).

[35] As Figuras 10A-10C mostram mini-hepcidina PR65 e sua atividade em camundongos tipo selvagem. A Figura 10A mostra a fórmula estrutural de PR65. Ida = ácido iminodiacético, Dpa = difenilalanina, bhPro = beta-homo prolina, bhPhe = beta-homo fenilalanina. A Figura 10B mostra o ferro no soro em camundongos C57BL/6 tipo selvagem, 4 horas após injeção intraperitoneal de solvente, hepcidina nativa ou PR65 (n = 4-8 em cada grupo). ** p = 0,01, *p = 0,005. Figura 10C mostra o ferro no soro em camundongo C57BL/6 tipo selvagem 4 horas após injeção intraperitoneal ou subcutânea de 20 nmoles de PR65 (n = 4 em cada grupo). *p = 0,007, **p = 0,04. Nas Figuras 10B e 10C as barras representam os valores médios e desvios- padrão de barras de erro.

[36] As Figuras 11A e 11B mostram o efeito hipoferrêmico de PR65 em camundongos knockout de hepcidina carregada com ferro. A Figura 11A mostra que PR65 induziu uma redução dependente da dose de ferro no soro em 24 horas após uma injeção subcutânea. Os valores médios e desvios padrão são ilustrados, n = 3-5 camundongos por ponto. #p = 0,005, &p = 0,004, *p <0,001. Figura 11B mostra o curso de tempo de hipoferremia induzida por uma injeção subcutânea de 100 nmoles de PR65. Desvios médios e padrões são mostrados, n = 4-6 camundongos por ponto. #p = 0,008, * p <0,001.

[37] A Figura 12 mostra as mudanças na distribuição de ferro em camundongos knockout de hepcidina tratados com PR65. Ferro tecidual foi visualizado por uma maior de Perls aumentada em 0-48 horas após a injeção subcutânea de PR65 (100 nmoles). Imagens representativas são mostradas. As barras horizontais indicam 400 µm (10X) e 100 µm (40X).

Linha superior: ferro no baço era escasso e sua distribuição não se alterou significativamente durante as 48 horas. Linha do meio: Ferro no estroma das vilosidades foi evidente em camundongos tratados com solventes e tratados com PR65 1-4 horas, indicando efluxo de ferro mediado por ferroportina ativa a partir de membranas basolaterais dos enterócitos. A partir de 12-24 horas, o ferro foi mantido em enterócitos consistente com degradação de ferroportina induzida por (mini)hepcidina. 48 horas após a injeção de ferro deixou de ser retido por enterócitos.

Linha inferior: Como esperado, os fígados foram carregados com ferro no início do estudo e nenhuma alteração no padrão de coloração de ferro foi observada dentro de 48 horas de tratamento com PR65.

[38] As figuras 13A-13E mostram que PR65 preveniu o carregamento de ferro em camundongos knockout de hepcidina esgotados em ferro. Todos os camundongos foram colocados em uma dieta com deficiência de ferro (4 ppm de ferro) entre as idades de 5-6 semanas até 12 semanas. O grupo “linha de base” (n = 7) foi examinado em 12 semanas de idade (barras brancas). O resto dos camundongos foi alimentado com uma dieta de carregamento de ferro (300 ppm) por mais 2 semanas, enquanto recebendo injeções subcutâneas diárias de solvente (barras cinzentas, n = 6) ou PR65, a 20, 50 ou 100 nmoles por dia (barras pretas, n = 4 por dose). Os camundongos foram analisados 24 horas após a última injeção. Comparado ao solvente, as injeções de PR65 resultaram em: Figura 13A – retenção de ferro no baço; Figura 13B – uma diminuição dependente da dose no ferro sérico; Figura 13C – uma diminuição dependente da dose correspondente nos níveis de Hb; Figura 13D – uma diminuição de ferro no coração em doses mais elevadas; e Figura 13E – diminuição de ferro no fígado. Teor de ferro no fígado em camundongos injetados com PR65 não diferiram significativamente do grupo de base de camundongos, indicando que pouco ou nenhum ferro novo foi absorvido ou depositado no fígado durante tratamento de 2 semanas. Os gráficos mostram média e desvio padrão. Foi utilizado o teste t de Student para comparar a média de cada condição daquela do tratamento com solvente (valor p sobre barras).

Na Figura 13E, média de cada condição também foi comparada com a linha de base (valores de p em linhas sobre barras).

[39] A Figura 14 mostra a distribuição celular de ferro após 2 semanas de injeções de PR65 para a prevenção da sobrecarga de ferro. Imagens representativas são mostradas. As barras horizontais indicam 400 µm (10X) e 100 µm (40X). Acumulação de ferro foi observada na polpa vermelha do baço de camundongos tratados com PR65, mas não com camundongos tratados com solvente. Da mesma forma, o acúmulo de ferro em enterócitos duodenais foi observado apenas em camundongos tratados com PR65. Comparado à coloração de ferro no coração de camundongos injetados com solvente, houve menor acúmulo de ferro no coração dos animais injetados com 50 e 100 nmoles de PR65, de acordo com o método quantitativo na Figura 4. Carregamento de ferro no fígado em camundongos tratados com 20 e 50 nmoles de PR65 foi semelhante ao do grupo de linha de base e muito menos do que o carregamento de ferro no grupo tratado com solvente. Na dose mais alta de PR65, ferro hepático foi menor do que no início do estudo, indicando que os camundongos foram capazes de mobilizar ferro hepático apesar da atividade alta de mini-hepcidina.

[40] As Figuras 15A-15E mostram que o tratamento de duas semanas com PR65 de camundongos knockout em hepcidina carregados com ferro causou a redistribuição mais modesta de ferro. Camundongos knockout em hepcidina foram mantidos em uma dieta de ferro de 300 ppm para toda a sua vida útil.

A partir de 12 semanas de idade, um grupo de camundongos foi injetado por via subcutânea com o solvente (n = 4) e o outro com 50 nmoles de PR65 (n = 4) por dia, durante 2 semanas. Foram medidos os parâmetros de ferro e hematológicos 24 horas após a última injeção. Em camundongos tratados com PR65 em comparação aos camundongos tratados com solvente: Figura 15A – ferro no baço aumentou mais de 15 vezes confirmando atividade de PR65; Figura 15B – as concentrações séricas de ferro foram semelhantes 24 horas após a última injeção; Figura 15C – hemoglobina reduzida em 2 g/dL, indicando restrição de ferro para eritropoiese; Figura 15D – ferro no coração tende a diminuir, embora a diferença não foi estatisticamente significativa no número de camundongos testados; Figura 15E – ferro hepático diminuiu cerca de 20%.

[41] A Figura 16 mostra a distribuição celular de ferro após 2 semanas de injeções de PR65 para tratar sobrecarga de ferro estabelecida. As secções de tecido correspondem aos animais analisados nas Figuras 15A-15E, com imagens representativas mostradas. As barras horizontais indicam 400 µm (10X) e 100 µm (40X). Coloração de Perls melhorada confirmou que os macrófagos do baço e enterócitos duodenais retiveram ferro em camundongos tratados com PR65, mas não nos tratados com solventes. Em comparação com os controles tratados com solvente, a coloração de ferro menos intensa foi observada no fígado de camundongos tratados com PR65. Nenhuma diferença consistente entre os camundongos tratados com solvente e com PR65 foi observada nas secções do coração (não ilustrado).

[42] A Figura 17 mostra algumas das estruturas das moléculas citadas nas Tabelas 1, 3 e 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[43] A presente invenção fornece peptídeos que são úteis no estudo e tratamento de doenças do metabolismo do ferro.

[44] Como aqui utilizado, uma “doença do metabolismo do ferro” inclui doenças onde metabolismo de ferro anormal provoca diretamente a doença, ou em que os níveis sanguíneos de ferro estão desregulados causando a doença, ou quando a desregulação de ferro é uma consequência de outra doença, ou em que as doenças podem ser tratadas por modulação dos níveis de ferro, e semelhantes. Mais especificamente, uma doença do metabolismo de ferro de acordo com essa divulgação inclui doenças de sobrecarga de ferro, distúrbios por deficiência de ferro, distúrbios de biodistribuição de ferro, outros distúrbios do metabolismo de ferro e outras doenças potencialmente relacionadas com o metabolismo do ferro, etc. Doenças do metabolismo de ferro incluem hemocromatose, hemocromatose por mutação de HFE,

hemocromatose por mutação de ferroportina, hemocromatose por mutação do receptor de transferrina 2, hemocromatose por mutação de hemojuvelina, hemocromatose por mutação de hepcidina, hemocromatose juvenil, hemocromatose neonatal,

deficiência de hepcidina, sobrecarga de ferro transfusional, talassemia, talassemia intermedia,

talassemia alfa, anemia sideroblástica, porfiria, porfiria cutânea tardia, sobrecarga de ferro Africano,

hiperferritinemia, deficiência de ceruloplasmina,

atransferrinemia, anemia diseritropoiética congênita,

anemia de doença crônica, anemia de inflamação, anemia de infecção, anemia microcítica hipocrômica, anemia por deficiência de ferro, anemia por deficiência de ferro refratária ao ferro, anemia da doença renal crônica,

resistência a eritropoetina, deficiência de ferro da obesidade, outras anemias, tumores benignos ou malignos de superprodução de hepcidina ou induzem sua superprodução,

condições com excesso de hepcidina, Ataxia de Friedreich,

síndrome gracile, doença de Hallervorden-Spatz, doença de

Wilson, hemosiderose pulmonar, carcinoma hepatocelular,

câncer, hepatite, cirrose hepática, pica, insuficiência renal crônica, resistência à insulina, diabetes,

aterosclerose, doenças neurodegenerativas, esclerose múltipla, doença de Parkinson, doença de Huntington e doença de Alzheimer. Como aqui utilizado, “doenças de sobrecarga de ferro” e “doenças de sobrecarga de ferro” referem-se às doenças e distúrbios que resultam em ou podem causar níveis anormalmente elevados de ferro em indivíduos aflitos se não for tratada.

[45] Em alguns casos, as doenças e distúrbios incluídos na definição de “doença do metabolismo do ferro” não são tipicamente identificadas como sendo relacionadas com ferro. Por exemplo, hepcidina é altamente expressa no pâncreas murino sugerindo que a diabetes (Tipo I ou Tipo II), resistência à insulina, intolerância à glicose e outros distúrbios podem ser melhorados por tratamento de perturbações do metabolismo de ferro subjacentes. Ver Ilyin, G. et al. (2003) FEBS Lett. 542 22-26, que é aqui incorporada por referência. Como tal, estas doenças são englobadas no escopo da definição ampla. Os especialistas na técnica são prontamente capazes de determinar se uma determinada doença é uma “doença ou metabolismo ferro” de acordo com a presente invenção, usando métodos conhecidos na técnica, incluindo os ensaios de WO 2004092405, que é aqui incorporado por referência, e de ensaios que monitoram a hepcidina, hemojuvelina, ou os níveis de ferro e de expressão, que são conhecidos na técnica, como os descritos na Patente US N.º 7.534.764, que é aqui incorporada por referência.

[46] Em modalidades preferenciais da presente invenção, as doenças de metabolismo de ferro são doenças de sobrecarga de ferro, que incluem a hemocromatose hereditária, anemias de carregamento de ferro, doenças hepáticas alcoólicas e hepatite C crônica

[47] Como aqui utilizado, os termos “proteína”, “polipeptídeo” e “peptídeo” são utilizados indiferentemente para se referir a dois ou mais aminoácidos ligados em conjunto. Exceto para as abreviaturas dos aminoácidos incomuns ou não naturais indicados na Tabela 2, abaixo, as abreviaturas de três letras e de uma letra, como utilizado na técnica, são aqui utilizados para representar os resíduos de aminoácidos. Exceto quando precedido por “D-”, o aminoácido é um L-aminoácido. Grupos ou cadeias de abreviaturas de aminoácidos são utilizados para representar os peptídeos. Exceto quando indicado em contrário, os peptídeos são indicados com o N-terminal à esquerda e a sequência é escrita a partir do N-terminal para o C- terminal.

[48] Os peptídeos da presente invenção podem ser feitos usando métodos conhecidos na técnica, incluindo a síntese química (em fase sólida, em fase de solução, ou uma combinação de ambos), biossíntese ou síntese in vitro utilizando métodos de DNA recombinante, ver, por exemplo, Kelly & Winkler (1990) Genetic Engineering Principles and

Methods, vol. 12, J.K. Setlow ed, Plenum Press, N.Y., pp 1- 19; Merrifield (1964) J. Amer Chem Soc 85:2149; Houghten (1985), PNAS USA 82:5131-5135; e Stewart & Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2ed. Pierce, Rockford, IL, que são aqui incorporados por referência. Os peptídeos da presente invenção podem ser purificados utilizando técnicas de purificação de proteínas conhecidas na técnica, como cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (HPLC), cromatografia de troca iônica ou de imunoafinidade, precipitação, filtração, exclusão de tamanho, ou eletroforese. Ver Olsnes, S. e A. Pihl (1973) Biochem. 12 (16):3121-3126; e Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, NY, as quais são aqui incorporados por referência. Alternativamente, os peptídeos da presente invenção podem ser feitos por meio de técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. Assim, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos do presente invenção são contemplados aqui. Em modalidades preferenciais, os polinucleotídeos são isolados. Como aqui utilizado, “polinucleotídeos isolados” referem-se aos polinucleotídeos que estão em um ambiente diferente daquele em que o polinucleotídeo ocorre naturalmente.

[49] Em algumas modalidades, os peptídeos da presente invenção são substancialmente purificados. Como aqui utilizado, um composto “substancialmente purificado”

refere-se a um composto que é removido do seu ambiente natural e, pelo menos, cerca de 60% livre, preferencialmente cerca de 75% livre, e mais preferencialmente cerca de 90% livre de outros componentes macromoleculares com que o composto está naturalmente associado, ou um composto que é pelo menos cerca de 60% livre, preferencialmente cerca de 75% livre, e mais preferencialmente cerca de 90% livre de outros componentes peptídicos como medido por HPLC com detecção a 214 nm.

[50] Como aqui utilizado, um composto “isolado” refere-se a um composto que é isolado do seu ambiente nativo. Por exemplo, um peptídeo isolado é um que não têm os seus aminoácidos nativos, que correspondem ao polipeptídeo de comprimento total, flanqueando a extremidade N-terminal, C-terminal, ou ambas. Por exemplo, Hep1-9 isolado refere-se a um peptídeo isolado compreendendo os resíduos de aminoácidos 1-9 de Hep25, que podem ter os aminoácidos não nativos na sua extremidade N- terminal, C-terminal, ou em ambas, mas não tem um resíduo aminoácido cisteína após seu 9º resíduo de aminoácido no C- terminal. Como estabelecido aqui, referências às posições de aminoácidos correspondem aos resíduos de aminoácidos de Hep25. Por exemplo, a referência à posição de aminoácido 9, corresponde ao 9º resíduo de aminoácido de Hep25.

[51] Os peptídeos da presente invenção ligam ferroportina, preferencialmente ferroportina humana. Os peptídeos preferenciais da presente invenção se ligam especificamente à ferroportina humana. Como aqui utilizado, “se liga especificamente” refere-se à interação preferencial de um agente de ligação específica com um dado ligante em relação aos outros agentes em uma amostra. Por exemplo, um agente de ligação específica que se liga especificamente a um dado ligante, se liga ao ligante determinado, sob condições adequadas, de uma quantidade, ou um nível que é observável sobre a de qualquer interação não específica com outros componentes presentes na amostra. As condições adequadas são as que permitem a interação entre um dado agente de ligação específica e de um dado ligante.

Estas condições incluem o pH, temperatura, concentração, solvente, tempo de incubação, e semelhantes, e podem variar entre determinados pares de agente e o ligante de ligação específica, mas pode ser facilmente determinado por aqueles especialistas na técnica.

[52] Os peptídeos da presente invenção, que simulam a atividade de hepcidina Hep25, a forma humana bioativa de 25-aminoácidos, são aqui referidos como “mini-hepcidinas”.

Como aqui utilizado, um composto que tem “atividade hepcidina” significa que o composto tem a capacidade de reduzir as concentrações de ferro no plasma em indivíduos (por exemplo, camundongos ou seres humanos), quando administrado ao mesmo (por exemplo, injetado por via parenteral ou administrado oralmente), de uma forma dependente da dose e dependente do tempo. Ver, por exemplo, como demonstrado em Rivera et al. (2005), Blood 106:2196-9.

[53] Em algumas modalidades, os peptídeos da presente invenção possuem atividade in vitro como ensaiado pela sua capacidade para provocar a internalização e degradação de ferroportina em uma linhagem de células que expressam ferroportina como ensinado em Nemeth et al. (2006) Blood 107:328-33. A atividade in vitro pode ser medida pela perda de fluorescência dependente da dose de células modificadas para exibir ferroportina fundida à proteína fluorescente verde, como em Nemeth et al. (2006) Blood 107:328-33.

Alíquotas de células são incubadas durante 24 horas com concentrações graduais de uma preparação de referência de Hep25 ou um mini-hepcidina. Como aqui fornecida, os valores de EC50 são fornecidos como a concentração de um determinado composto (por exemplo, peptídeo) que provoca 50% da perda máxima de fluorescência gerada pela preparação de Hep25 de referência. EC50 de preparações Hep25 neste intervalo do ensaio variam de 5 a 15 nM e mini-hepcidinas preferenciais possuem valores EC50 em ensaios de atividade in vitro de cerca de 1.000 nM ou menos.

[54] Podem ser utilizados outros métodos conhecidos na técnica para calcular a atividade de hepcidina e atividade in vitro de peptídeos de acordo com a presente invenção.

Por exemplo, a atividade in vitro dos compostos pode ser medida pela sua capacidade de internalizar ferroportina celular, o que é determinado por imunohistoquímica ou citometria de fluxo, utilizando anticorpos que reconhecem epítopos extracelulares de ferroportina. Alternativamente, a atividade in vitro dos compostos pode ser medida pela sua capacidade dependente da dose para inibir o efluxo de ferro a partir de células que expressam ferroportina que são pré- carregadas com radioisótopos ou isótopos estáveis de ferro, como em Nemeth et al. (2006) Blood 107:328-33.

PROJETO DE MINI-HEPCIDINAS

[55] Estudos anteriores indicam que o segmento N- terminal de Hep25 é importante para a sua atividade hepcidina e é provável que forme a interface de contato com ferroportina. No entanto, a importância de cada um dos aminoácidos N-terminal para a atividade hepcidina era desconhecida. Portanto, mutagênese de varredura de alanina foi feita nos resíduos 1-6 de Hep25 para determinar a contribuição de cada aminoácido N-terminal à atividade hepcidina. Como mostrado na Figura 1, a substituição T2A não impactou substancialmente na atividade hepcidina.

Substituições de fenilalanina (F4A ou F9A) causaram a maior redução, mais do que cerca de 70%, na atividade hepcidina.

As restantes substituições de alanina apresentaram reduções detectáveis na atividade hepcidina que não eram tão significativas quanto as substituições F4A ou F9A.

[56] Para se determinar se fenilalanina F4 altamente conservada e aparentemente estruturalmente importante é importante para a atividade hepcidina, o aminoácido F4 de Hep25 foi sistematicamente substituído com outros aminoácidos. Como mostrado na Figura 2A, tornar a cadeia lateral mais polar (F4Y) levou a uma perda substancial da atividade hepcidina como fez a substituição com D- fenilalanina (f), ou aminoácidos carregados (D, K e Y). No entanto, a atividade hepcidina foi mantida quando o resíduo F4 foi substituído com ciclohexilalanina não aromático, indicando, assim, que um resíduo hidrofóbico volumoso é suficiente para a atividade.

[57] Para determinar se a altamente conservada e aparentemente estruturalmente importante fenilalanina F9 é importante para a atividade hepcidina, o aminoácido F9 de Hep25 foi substituído por outros aminoácidos. Como mostrado na Figura 2B, a atividade hepcidina não só diminuiu quando F9 foi substituído com alanina, mas também quando foi substituído com ciclohexilalanina não aromático, indicando, assim, que um resíduo aromático pode ser importante para a atividade.

[58] Estudos mutacionais indicam que C326, o resíduo cisteína na posição 326 de ferroportina humana, é o resíduo crítico envolvido em ligação à hepcidina. Assim, vários fragmentos N-terminais de Hep25 contendo um tiol, por exemplo, Hep4-7, Hep3-7, Hep3-8, Hep3-9, Hep1-7, Hep1-8, Hep1-9, e Hep1-10 C7A, foram sintetizados quimicamente, reenovelados e suas atividades em relação ao Hep25 foram analisadas usando a quantificação por citometria de fluxo da degradação de ferroportina-GFP, estimativa de efluxo de ferro com base em medições de ferritina celular, e os estudos de efluxo de ferro radioisótopos. As sequências e EC50 destes fragmentos N-terminais são apresentadas na Tabela 1.

[59] Surpreendentemente e de forma inesperada, como se mostra na Figura 3, Hep1-9 e Hep1-10 C7A foram consideradas muito ativas no ensaio de citometria de fluxo de internalização de ferroportina-GFP. Em uma base de massa, Hep1-9 e Hep1-10 C7A foram apenas cerca de quatro vezes menos potentes e em uma base molar, cerca de 10 vezes menos potente do que a Hep25. Assim, Hep1-9 e Hep1-10 C7A foram utilizados como base para a construção de outros peptídeos que têm atividade hepcidina.

[60] Para determinar a importância do tiol cisteína na atividade de hepcidina Hep 1-9, o resíduo C7 de Hep 1-9 foi substituído com os aminoácidos que têm uma forma semelhante, mas não se podem formar ligações dissulfeto para gerar Hep9-C7S (substituição de serina) e Hep9C7-tBut

(cisteína t-butil-bloqueado) ou com uma cisteína modificada por dissulfeto acoplado a butil terciário, que pode participar na transferência de dissulfetos com HS-t-butil como o grupo de saída, para gerar Hep9C7-SStBut. Como mostrado na Figura 4, as substituições de aminoácidos que extraíram o potencial para a formação de dissulfeto ou a troca resultou em uma perda completa de atividade hepcidina, indicando, assim, que a formação de dissulfeto é necessária para a atividade. Outras substituições de aminoácidos C7 e suas atividades hepcidina resultantes são mostradas na Tabela 1.

[61] Outros peptídeos baseados em Hep1-9 e Hep1-10 C7A foram construídos para serem resíduos F4 e F9 dissulfeto ciclizados, têm substituições de aminoácidos não naturais, são retroinvertidos, modificados, ou têm uma carga positiva. O aminoácido C-terminal foi na forma amidada. As modificações e as atividades hepcidina resultantes são mostradas na Tabela 1.

[62] Como mostrado na Tabela 1, com a exceção de PR40 e PR41, mini-hepcidinas que exibem EC50 de cerca de 1000 nM ou menos, contêm pelo menos 6 resíduos de aminoácidos contíguos, que correspondem aos resíduos 3-8 de Hep25 (ver Hep3-8). Assim, em algumas modalidades, as mini-hepcidinas preferenciais têm pelo menos 6 resíduos de aminoácidos contíguos, que correspondem a 6 resíduos de aminoácidos contíguos de Hep1-9, preferencialmente resíduos de 3-8. Os resíduos de aminoácidos podem ser aminoácidos não naturais ou pouco comuns, resíduos de L- ou D-aminoácidos, os resíduos modificados, ou uma combinação dos mesmos.

[63] Em algumas modalidades, as mini-hepcidinas da presente invenção têm pelo menos uma substituição de aminoácido, uma modificação, ou uma adição. Exemplos de substituições de aminoácidos incluem substituição de um resíduo de L-aminoácido para seu correspondente resíduo de D-aminoácido, substituição por Cys para homocisteína, Pen, (D)Pen, Inp, ou semelhante, substituindo Phe por bhPhe, Dpa, bhDpa, Bip, 1Nal e semelhantes. Os nomes e as estruturas dos resíduos de substituição são exemplificados na Tabela 2. Outras substituições adequadas são exemplificadas na Tabela 1. Exemplos de modificação incluem a modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos de tal modo que o peptídeo forma uma estrutura cíclica, retroinversão, e modificação de um resíduo sendo capaz de formar uma ligação dissulfeto. Os exemplos de uma adição incluem a adição de pelo menos um resíduo de aminoácido ou, pelo menos, um composto, em N-terminal, C-terminal, ou em ambos, como os exemplificados na Tabela 1.

[64] Como se mostra na Tabela 1, a maioria das mini- hepcidinas que exibem EC50 de cerca de 100 nm ou menos, contêm pelo menos uma substituição de aminoácidos Dpa ou bhDpa. Assim, em algumas modalidades, as mini-hepcidinas da presente invenção têm pelo menos uma substituição de aminoácidos Dpa ou bhDpa.

[65] Tendo em conta os dados de substituição de alanina da Figura 1, em algumas modalidades, as mini- hepcidinas da presente invenção podem ter uma Ala nas posições de aminoácidos além das posições de aminoácidos 4 e 9, desde que haja um tiol disponível para formar uma ligação dissulfeto na posição de aminoácido 7. Ver Hep9F4A e Hep9C-SStBut na Tabela 1.

[66] Tendo em conta os dados da de substituição de aminoácidos da posição 4 da Figura 2 e na Tabela 1, as mini-hepcidinas da presente invenção podem ter uma substituição de aminoácido na posição 4, que não resultam em uma alteração substancial da sua carga ou polaridade quando comparada com a de Hep25, Hep1-9 ou Hep1-10 C7A.

Substituições preferenciais de aminoácidos nas posições 4 de Hep1-9 ou Hep1-10 C7A incluem Phe, D-Phe, bhPhe, Dpa, bhDpa, Bip, 1Nal, ou semelhantes.

[67] As mini-hepcidinas originais como aqui mencionadas têm a seguinte Fórmula Estrutural I em que A1 é Asp, Glu, piroglutamato, Gln, Asn, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo;

A2 é Thr, Ser, Val, Ala, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos;

A3 é His, Asn, Arg, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos;

A4 é Phe, Leu, Ile, Trp, Tyr, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo que inclui ciclohexilalanina;

A5 é Pro, Ser, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos;

A6 é Ile, Leu, Val, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos;

A7 é Cys, Ser, Ala, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos que inclui S-terciário-butil-cisteína;

A8 é Ile, Leu, Thr, Vai, Arg, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos;

A9 é Phe, Leu, Ile, Tyr, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos que inclui ciclohexilalanina; e

A10 é Cys, Ser, Ala, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos;

em que o aminoácido carboxi-terminal está na forma amida ou carboxi;

em que uma Cys ou outro aminoácido sulfidril está presente como um dos aminoácidos na sequência; e em que A1, A2, A3, A1 a A2, A1 a A3, A10, A9 a A10, A8 a A10, ou uma combinação dos mesmos são opcionalmente ausentes.

[68] Em algumas modalidades, o A1 é Asp; A2 é Thr; A3 é His; A4 é Phe; A5 é Pro; A6 é Ile; A7 é Ala; A8 é Ile; A9 é Phe; e A10 é Cys na forma de uma amida; onde A1 ou A1 a A2 são opcionalmente ausentes.

[69] Em algumas modalidades, A1 é Asp, A2 é Thr, A3 é His, A4 é Phe, A5 é Pro, A6 é Ile, A7 é Cys ou um amino ácido não natural tiol, A8 é Ile, A9 é Phe em forma de amida, e A10 está ausente.

[70] Em algumas modalidades, A1 e A2 são ausentes, A3 é His, A4 é Phe, A5 é Pro, A6 é Ile, A7 é Cys ou um aminoácido não natural tiol, A8 é Ile na forma de amida, e A9 e A10 estão ausentes.

[71] Em algumas modalidades, A1 e A2 são ausentes, A3 é His, A4 é Phe, A5 é Pro, A6 é Ile, A7 é Cys ou um aminoácido não natural tiol em forma de amida, e A8 a A10 estão ausentes.

[72] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, ou uma combinação dos mesmos é o D-aminoácido correspondente. Por exemplo, para o A1, o aminoácido não natural pode ser D-

Asp, D-Glu, D-Gln, D-Asn, ou semelhantes.

[73] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural de: A1 é D-Asp, D-Glu, D-piroglutamato, D-Gln, D-Asn, bhAsp, Ida, ou N-MeAsp; A2 é D-Thr, D-Ser, D-Val, Tle, Inp, Chg, bhThr, ou N- MeThr; A3 é D-His, D-Asn, D-Arg, Dpa, (D)Dpa, ou 2- aminoindano; A4 é D-Phe, D-Leu, D-Ile, D-Trp, Phg, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, bhDpa, Amc, PheF5, hPhe, Igl, ou ciclohexilalanina; A5 é D-Pro, D-Ser, Oic, bhPro, trans-4-PhPro, cis-4- PhPro, cis-5-PhPro, Idc; A6, D-Ile, D-Leu, Phg, Chg, Amc, bheIle, Ach, e N-MeIle; A7 é D-Cys, D-Ser, D-Ala, Cys(S-tBut), homoCys, Pen, (D) Pen, Dap (AcBr), e Inp; A8 é D-Ile, D-Leu, D-Thr, D-Val, D-Arg, Chg, Dpa, bhIle, Ach, ou N-MeIle; A9 é D-Phe, D-Leu, D-Ile, PheF5, N-MePhe, benzalimida, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, bhDpa, ciclohexilalanina; e A10 é D-Cys, D-Ser, D-Ala.

[74] Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos (e adição, se indicado) para: A1 é Ala, D-Ala, Cys, D-Cys, Phe, D-Phe, Asp ou D-Asp ligada a Cys ou D-Cys, Phe ou D-Phe ligado a uma molécula de PEG ligado ao quenodesoxicolato, ursodesoxicolato, ou palmitoil, ou Dpa ou (D)Dpa ligada a palmitoil; A2 é Ala, D-Ala, Cys, D-Cys, Pro, D-Pro, Gly, D-Gly; A3 é Ala, D-Ala, Cys, D-Cys, Dpa, Asp ou D-Asp ligada a Dpa ou (D)Dpa; A4 is Ala, D-Ala, Pro, ou D-Pro; A5 é Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Arg, D-Arg; A6 é Ala, D-Ala, Phe, D-Phe, Arg, D-Arg, Cys, D-Cys; A7 é His, ou D-His; A8 é Cys ou D-Cys; e A9 é Phe ou D-Phe ligado a RA, Asp, D-Asp, Asp ou D- Asp ligada a RB, bhPhe ligada a RC, ou cisteamida, em que RA é -CONH2-CH2-CH2-S, -D-Pro ligada a Pro-Lys ou Pro-Arg, - bhPro ligada a Pro ligada a Pro-Lys ou Pro-Arg-, D-Pro ligado a bhPro-Lys ou bhPro-Arg, em que RB é -PEG11- GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL, -(PEG11)-(GPHyp)10, e em que RC é-D-Pro ligada a Pro-Lys ou Pro-Arg, -D-Pro ligado a bhPro-Lys ou bhPro-Arg.

[75] Em algumas modalidades, a mini-hepcidina é uma sequência de 10-mer em que A7 é Ala e A10 é Cys.

[76] Em algumas modalidades, as mini-hepcidina formam uma estrutura cíclica por uma ligação dissulfeto.

[77] Em algumas modalidades, a mini-hepcidina é um peptídeo retroinvertido de tal modo que A1 é o C-terminal e A10 é o N-terminal e os resíduos de aminoácidos são D-

aminoácidos. Em algumas modalidades, o peptídeo retroinvertido tem pelo menos uma adição no N-terminal, C- terminal, ou ambos. Em algumas modalidades, o peptídeo retroinvertido contém, pelo menos, um L-aminoácido.

[78] Em algumas modalidades, a mini-hepcidina tem uma substituição de aminoácido na posição 4, posição 9, ou ambos. Em algumas modalidades, o substituinte de aminoácido é Phg, Phe, D-Phe, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, Dpa, bhDpa, Amc, ou Cisteamida.

[79] Em algumas modalidades, a mini-hepcidina tem uma substituição de aminoácido na posição 7. Em algumas modalidades, o substituinte de aminoácido é Cys (S-tBut), Ala, D-Ala, Ser, D-Ser, homoCys, Pen, (D) Pen, His, D-His, ou Inp.

[80] Os exemplos de algumas mini-hepcidinas originais são fornecidos na Tabela 1.

Benzilamida

2-Aminoindano

SÍNTESE DE PEPTÍDEO

[81] Hep25 foi sintetizado no UCLA Peptide Synthesis Core Facility usando química de fase sólida 9 fluorenilmetiloxicarbonil (fmoc). Especificamente, os peptídeos foram sintetizados em um sintetizador de peptídeo

ABI 431A (PE Biosystems, Applied Biosystems, Foster City,

CA) com aminoácidos fmoc, resina Wang (AnaSpec, San Jose,

CA), e acoplamento duplo para todos os resíduos.

Após a clivagem, 30 mg de peptídeo bruto foi reduzido com um excesso molar de 1000 vezes de ditiotreitol (DTT) em tampão

Tris 0,5 M (pH 8,2), 6 M de cloridrato de guanidina, e EDTA

20 mM a 52°C durante 2 horas.

DTT fresco (excesso molar de

500) foi adicionado e incubado durante mais uma hora a

52°C.

Os peptídeos reduzidos foram purificados em cartuchos g C18 SEP-PAK (Waters, Milford, MA) equilibrados em 0,1%

TFA e eluída com 50% de acetonitrila.

Os eluatos foram liofilizados e ressuspensos em ácido acético a 0,1%. Os peptídeos reduzidos foram ainda purificados por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa

(HPLC) em coluna C18 VYDAC (218TP510; Waters) equilibrada com ácido trifluoroacético a 0,1% e eluída em gradiente de acetonitrila.

Os eluatos foram liofilizados, dissolvidos em

0,1% de ácido acético, 20% de DMSO, para a concentração aproximada de 0,1 mg/ml (pH 8), e oxidado ao ar por agitação durante 18 horas em temperatura ambiente.

Os peptídeos reenovelados foram também purificados sequencialmente em cartuchos 10 g C18 SEP-PAK e na coluna

C18 RP-HPLC VYDAC utilizando gradiente de acetonitrila.

Os eluatos foram liofilizados e ressuspensos em 0,016% HC1. A conformação de derivados sintéticos de hepcidina reenovelados foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida ácido-ureia 12,5% (PAGE), e as massas de peptídeos foram determinadas por dessorção a laser matriz- assistida/espectrometria de massa de ionização por tempo de voo (MALDI-TOF-MS, UCLA Mass Spectrometry Facility, em Los Angeles, CA).

[82] Os outros peptídeos estabelecidos na Tabela 1 foram sintetizados pelo método da fase sólida usando o sintetizador de peptídeos Symphony® automatizado (Protein Technologies Inc., Tucson, AZ) ou sintetizador de peptídeo de microondas automático CEM Liberty (CEM Corporation Inc., Matthews, NC), aplicando-se química de 9- fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) (Fields & Noble (1990) Int J Pept Protein Res. 35: 161-214) e derivados de aminoácidos e reagentes comercialmente disponíveis (EMD Biosciences, San Diego, CA e Chem-Impex International, Inc., Wood Dale, IL). Os peptídeos foram clivados da resina utilizando o reagente de modificação K (TFA a 94% (v/v); fenol, 2% (p/v), água, 2% (v/v); TIS, 2% (v/v), 2 horas) e precipitado por adição de éter dietílico resfriado com gelo. Subsequentemente, os peptídeos foram purificados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa preparativa (RP-HPLC) a > 95% de homogeneidade e a sua pureza avaliada por espectrometria de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS, UCLA Mass Spectrometry Facility, Los Angeles, CA), bem como RP-HPLC analítica utilizando sistema de HPLC Varian ProStar 210 equipado com detector de comprimento UV-Vis de comprimento de onda dual ProStar 325 com os comprimentos de onda previstos em 220 nm e 280 nm (Varian Inc., Palo Alto, CA).

As fases móveis consistiam em solvente A, TFA 0,1% em água e solvente B, 0,1% TFA em acetonitrila. Análises de peptídeos foram realizados com uma coluna C18 de fase reversa (Vydac 218TP54, 4,6 x 250 mm, Grace, Deerfield, IL), aplicando um gradiente linear de solvente B a partir de 0 a 100% ao longo de 100 min (taxa de fluxo: 1 ml/min).

[83] Outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para sintetizar ou obter os peptídeos de acordo com a presente invenção. Todos os peptídeos foram sintetizados como carboxilamidas (-CONH2) que cria uma extremidade de carga neutra mais semelhante à de uma ligação peptídica do que a extremidade –COOH carregada negativamente. No entanto, os peptídeos tendo a extremidade -COOH carregada negativamente são aqui contemplados.

ENSAIOS DE ATIVIDADES

[84] CITOMETRIA DE FLUXO. A atividade dos peptídeos da presente invenção foi medida por citometria de fluxo como descrito anteriormente. Ver Nemeth et al. (2006) Blood 107:328-333, que é aqui incorporada por referência.

ECR293/Fpn-GFP, uma linhagem celular estavelmente transfectada com uma construção de ferroportina induzível por ponasterona marcadas no C-terminal com a proteína verde fluorescente foi usada. Ver Nemeth et al. (2004) Science 306:2090-2093, que aqui se considera incorporada por referência. Resumidamente, as células foram semeadas em placas revestidas com poli-D-lisina na presença de 20 µΜ FAC, com ou sem 10 µΜ de ponasterona. Após 24 horas, ponasterona foi eliminada, e as células foram tratadas com os peptídeos durante 24 horas. As células foram então tratadas com tripsina e ressuspensas a 1 x 106 células/ml, e a intensidade da fluorescência verde foi analisada por citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi realizada no FACSCAN (scanner de células ativadas por fluorescência) Analytic Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA), com a versão 3.3 do software CELLQUEST (Becton Dickinson).

As células não induzidas com ponasterona para expressar FPN-GFP foram utilizadas para estabelecer um canal para excluir fluorescência de fundo. As células induzidas com ponasterona, mas que não foram tratadas com quaisquer peptídeos foram usadas como controle positivo. Cada peptídeo foi testado ao longo da faixa de concentração (0, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 e 10 µΜ). Cada tratamento de peptídeo foi repetido independentemente 3 a 6 vezes. Para cada concentração de peptídeo, os resultados foram expressos como uma fração da atividade máxima (FHep25) de Hep25 (na faixa de dose de 0,01-10 µΜ), de acordo com a fórmula 1 -((Fx - FHep25)/(F não tratado-FHep25)), em que F foi a média da fluorescência verde canalizada e x foi o peptídeo.

As concentrações de IEC50 são apresentadas na Tabela 1.

[85] ENSAIO DE FERRITINA. As células tratadas com os peptídeos tendo atividade de hepcidina reterão ferro e contêm quantidades mais elevadas de ferritina. Assim, o ensaio de ferritina a seguir pode ser usado para identificar as mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção. Resumidamente, as células HEK293-Fpn são incubadas com 20 µΜ FAC com ou sem 10 µΜ de ponasterona.

Após 24 horas, ponasterona é eliminada, e derivados de hepcidina são adicionados durante 24 horas na presença de 20 µΜ FAC. Proteína celular é extraída com 150 mM de NaCl, mM de EDTA, 10 mM Tris (pH 7,4), 1% de Triton X-100, e um coquetel inibidor de protease (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Os níveis de ferritina são determinados por um ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) (Ramco Laboratories, Stafford, TX ou Biotech Diagnostic, Laguna Niguel, CA) de acordo com as instruções do fabricante e são normalizados para a concentração de proteína total em cada amostra, como determinada pelo ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL).

[86] ENSAIOS IN VIVO. Ensaio de ferro no soro. A diminuição de ferro sérico após a administração de peptídeo é a principal medida de atividade hepcidina. Assim, como aqui fornecida, a atividade hepcidina de peptídeos selecionados da presente invenção foi avaliada in vivo, por medição de ferro no soro de sujeitos de teste.

Resumidamente, os camundongos C57/B16J foram mantidos em dieta de roedor NIH 31 (333 partes por milhão (ppm) de ferro; Harlan Teklad, Indianapolis, IN). Duas semanas antes da experiência, os camundongos foram transferidos para uma dieta que continha cerca de 2-4 ppm de ferro (Harlan Teklad, Indianapolis, IN), a fim de suprimir hepcidina endógena. Peptídeos estoques foram diluídos para as concentrações desejadas em tampão fosfato salina estéril (PBS) ou com outros diluentes como descritos a seguir. Os camundongos foram submetidos aos seguintes tratamentos: (a) injetados por via intraperitoneal com 100 µl PBS (controle) ou com 50 µg de peptídeos em 100 µl PBS; (b) injetados com 100 µl de peptídeo (ou PBS) misturado com 500 µg de lipossomas vazios série COATSOME EL (NOF, Tóquio, Japão) (preparado de acordo com as recomendações do fabricante); (c) injetados com 100 µl de peptídeos (ou PBS) solubilizados com agente de solubilização SL220 (NOF, Tóquio, Japão); (d) gavados com 250 µl de peptídeo (ou PBS) em 1x solvente (Cremophor EL (Sigma)/etanol/PBS; (12.5:12.5:75)). Os camundongos foram sacrificados 4 horas mais tarde, o sangue foi colhido por punção cardíaca, e o soro foi separado usando tubos MICROTAINER (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Ferro no soro foi determinado utilizando um ensaio colorimétrico (Diagnostic Chemicals, Oxford, CT), que foi modificado para o formato de microplacas de modo a que 10 µl de soro foi utilizado por medição. Os resultados foram expressos como o percentual de redução de ferro sérico quando comparado com o valor médio dos níveis de ferro no soro em camundongos tratados com PBS.

[87] Como ilustrado na Figura 5, por administração via intraperitoneal (i.p.) de 50 µg de PR12 por camundongo em PBS causou uma diminuição significativa de ferro no soro após 4 horas, quando comparada com a administração i.p. de PBS. A diminuição de ferro no soro foi semelhante ao causado por injeção i.p. de 50 mg de Hep25. Injeção (i.p.) de Hep9 não resultou em uma diminuição de ferro no soro.

PR12 é uma forma retroinvertida de Hep9, e é resistente à proteólise por causa da estrutura retroinvertida. A experiência indica que o aumento da resistência proteolítica melhora a atividade de mini-hepcidinas.

[88] Como ilustrado na Figura 6, a administração i.p.

de 200 nmoles de riHep7∆DT em PBS resultou em concentrações de ferro sérico significativamente mais baixas do que as obtidas após a injeção de PBS, e também menor do que a injeção i.p. de 20 nmoles de Hep25. A administração de 20 nmoles de riHep7∆DT reduziu ligeiramente mas não significativamente as concentrações de ferro no soro. A experiência indica que, após injeção i.p. de peptídeos tão pequenos como 7 aminoácidos são capazes de exibir uma atividade comparável a Hep25.

[89] Como ilustrado na Figura 7, a administração i.p.

de 20 nmoles de PR27 em PBS causou uma diminuição de ferro no soro comparável ao provocado pela administração i.p. de nmoles de Hep25. Isto indicou que a mini-hepcidina pode atingir uma potência semelhante à Hep25 in vivo. Maior concentração de PR27 (200 nmoles) causou ainda maior diminuição das concentrações séricas de ferro.

[90] Como mostrado na Figura 8, a administração i.p.

de 20 nmoles de PR27 em solução lipossomal também causou uma diminuição de ferro de soro, semelhante à causada por administração i.p. de 20 nmoles de Hep25. A administração de solução lipossomal por si só não afetou os níveis de ferro no sangue. A solução de lipossomas foi preparada pela mistura de 100 µl de PBS com 500 µg de lipossomas vazios série COATSOME EL (NOF, Tóquio, Japão) (preparado de acordo com as recomendações do fabricante). Mini-hepcidina PR28 dissolvida em solução lipossomal, no entanto, apresentou uma menor capacidade de diminuir ferro sérico de PR27. A experiência indica que a suspensão de peptídeos em lipossomas não afeta suas atividades. Assim, os lipossomas podem ser úteis para administração oral de peptídeos de acordo com a presente invenção.

[91] Como mostrado na Figura 9, a administração oral de PR27 200 nmoles por gavagem em uma solução de Cremophor EL causou uma diminuição no ferro sérico em camundongos, em comparação com a administração oral de PBS na mesma formulação. Cremophor EL aumenta a solubilidade de substâncias químicas, e é frequentemente usado como excipiente ou aditivo em drogas. Solução de Cremophor EL foi preparada por mistura de Cremophor EL (Sigma), etanol e PBS em uma proporção 12.5:12.5:75. 250 µl da solução foi administrada por gavagem aos camundongos.

[92] Assim, a presente invenção pode ser utilizada para diminuir o ferro no soro em sujeitos. Uma mini- hepcidina preferencial de acordo com a presente invenção é um peptídeo retroinvertido que compreende uma molécula de PEG, como PEG11, ligada ao seu aminoácido N-terminal. Em algumas modalidades, a molécula de PEG está ligada a um grupo palmitoil ou ácido diaminopropiônico ligado a um ou mais grupos palmitoil.

[93] Além de analisar o efeito sobre o conteúdo de ferro no soro, outros ensaios in vivo conhecidos na técnica podem ser conduzidos para identificar mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção e/ou determinar a quantidade terapeuticamente eficaz de um determinado peptídeo ou mini- hepcidina de acordo com a presente invenção. Exemplos de tais ensaios incluem o seguinte:

[94] Ensaio de ferro tecidual. Adicionalmente a, ou em vez de ensaio de ferro no soro acima, a distribuição de ferro no tecido pode ser determinada por coloração melhorada de Perl de secções de fígado e baço obtidas a partir de camundongos tratados. Resumidamente, os cortes de tecidos são fixados em paraformaldeído a 4%/PBS, incubados em solução de Perl (1:1,2% de HC1 e 2% de ferrocianeto de potássio) e diaminobenzidina em 0,015% de peróxido de hidrogênio. Ferro não-heme tecidual pode ser quantificado utilizando o micrométodo de Rebouche et al. (2004) J Biochem Biophys Methods. 58 (3):239-51; Pak et al. (2006) Blood 108 (12):3730-5. Pedaços de 100 mg de fígado e baço são homogeneizados e ácido é adicionado para libertar ferro ligado não-heme, que é detectado por reação colorimétrica utilizando ferrozina e comparado com os controles. O tratamento com mini-hepcidinas seria esperado para causar redistribuição de ferro a partir de outros tecidos do baço.

Ao longo de semanas a meses, a administração de mini- hepcidinas seria esperado para diminuir o conteúdo de ferro no tecido em todos os tecidos por causa da absorção reduzida de ferro da dieta.

[95] Ensaios hematológicos. Ensaios hematológicos podem ser usados para identificar as mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção e/ou determinar a quantidade terapeuticamente eficaz de um determinado peptídeo ou mini- hepcidina de acordo com a presente invenção. Resumidamente, o sangue de sujeitos tratados é coletado em tubos contendo heparina. Hemoglobina, RBC, MCV, EPO, parâmetros de células brancas, contagem de reticulócitos e conteúdo de Hb de reticulócitos são determinados utilizando métodos conhecidos na técnica e, em comparados com os controles. O tratamento com mini-hepcidinas seria esperado para causar uma diminuição no MCV e diminuir o teor de Hb de reticulócitos. Administração de mini-hepcidinas em quantidades excessivas seriam esperado para diminuir Hgb.

[96] ENSAIOS DE EXPORTAÇÃO DE FERRO. Ensaios de exportação de ferro (55Fe) conhecidos na técnica usando hepatócitos primários e macrófagos podem ser usados para identificar as mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção e/ou determinar a quantidade terapeuticamente eficaz de um determinado peptídeo ou mini-hepcidina de acordo com a presente invenção. Peptídeos com atividade hepcidina diminuirão ou reduzirão a liberação de 55Fe das células. Resumidamente, as células são incubadas com 55Fe- NTA ou 55Fe-Tf durante 36 horas. Após eliminação de 55Fe não incorporado, as células são tratadas com um dado peptídeo ou um controle. No caso de mutantes de ferroportina, a transfecção é realizada antes da adição de 55Fe e expressão deixada prosseguir durante o período de carga de ferro de 36 horas. Alíquotas do meio são recolhidas após 1, 4, 8, 24, 36, 48 e 72 horas e a radioatividade é determinada por um contador de cintilação. Radioatividade associada às células pode ser medida por centrifugação das células através de óleo de silicone para diminuir a ligação não específica de ferro radiomarcado às células usando métodos conhecidos na técnica.

[97] Para se determinar se um dado peptídeo modifica a internalização e degradação de ferroportina endógena, os níveis de proteína e distribuição celular de ferroportina em hepatócitos e macrófagos tratados com o peptídeo podem ser testados utilizando Western blotting, imunohistoquímica e anticorpos de ferroportina conhecidos na técnica.

MINI-HEPCIDINAS MODIFICADAS

[98] As mini-hepcidinas adicionais de acordo com a presente invenção são mostradas na Tabela 3 e Tabela 4 como se segue:

[101] Nas Tabelas 3 e 4, PR47, PR48, PR49, PR50, PR51, PR52, PR76, PR77, PR78, e PR79 são mini-hepcidinas retroinvertidas e são mostradas, da esquerda para a direita, a partir de sua extremidade C-terminal para a extremidade N-terminal, a fim de exemplificar o alinhamento entre os resíduos de aminoácidos e dos resíduos 1-10 de Hep25. Assim, a menção convencional destas mini-hepcidinas retroinvertidas a partir de seus N-terminais para seus C- terminais são os seguintes (os D-aminoácidos estão sublinhados):

[102] Como mostrado na Tabela 4, a via de administração pode desempenhar um papel na atividade da mini-hepcidina determinada (comparar, por exemplo, PR65 e PR66). Assim, a indicação de nenhuma atividade de algumas das mini-hepcidinas nas Tabelas 3 e 4 não deve ser interpretada como uma indicação de que determinada mini- hepcidina não tem qualquer atividade em qualquer via de administração e/ou dosagem. De fato, como mostrado na Tabela 3, muito poucas dessas mini-hepcidinas exibem atividade significativa in vitro em dosagens consideravelmente menores como as mini-hepcidinas originais.

[103] Estas mini-hepcidinas adicionais são modificações das mini-hepcidinas conforme estabelecido no PCT/US2009/066711 (adiante designado por “mini-hepcidinas originais” e com a fórmula estrutural I). Como aqui utilizado, mini-hepcidinas são modificações das mini- hepcidinas originais que são aqui referidas como mini- hepcidinas “modificadas”. Como aqui utilizado, “mini- hepcidinas” refere-se a ambas as mini-hepcidinas originais e mini-hepcidinas modificadas. Mini-hepcidinas modificadas de acordo com a presente invenção têm a seguinte fórmula estrutural IA ou IB: A1 é Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, piroglutamato, D- piroglutamato, Gln, D-Gln, Asn, D-Asn, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos, como bhAsp, Ida, Ida(NHPal), e N-MeAsp, preferencialmente Ida e N-MeAsp; A2 é Thr, D-Thr, Ser, D-Ser, Val, D-Val, Ile, D-Ile,

Ala, D-Ala ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos, como Tle, Inp, Chg, bhThr, e

N-MeThr;

A3 é His, D-His, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos, como L-His (π-Me), D-His (π-Me), L-

His (τ-Me), ou D-His (τ-Me);

A4 é Phe, D-Phe, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Trp, D-Trp,

Tyr, D-Tyr, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos, como Phg, bhPhe,

Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal, bhDpa, Amc, PheF5, hPhe, Ig1 ou ciclohexilalanina, preferencialmente Dpa;

como Oic, bhPro, trans-4-PhPro, cis-4-PhPro, cis-5-PhPro,

Idc e, preferencialmente, bhPro;

A6 é Arg, D-Arg, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Thr, D-Thr,

Lys, D-Lys, Val, D-Val, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos, como D-

Νω,ω-dimetil-arginina, L-Nω,ω-dimetil-arginina, D-

homoarginina, L-homoarginina, D-norarginina, L-norarginina,

Ach, N-MeArg, e N-MeIle, preferencialmente, Arg;

A7 é Cys, D-Cys, Ser, D-Ser, Ala, D-Ala, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos, como Cys (S-tBut), homoCys, Pen, (D)

Pen, preferencialmente S-tert-butil-cisteína, Cys(S-S-Pal),

Cys(S-S-cisteamina-Pal), Cys(S-S-Cys-NHPal) e Cys(S-S-Cis)

ou qualquer derivado de aminoácido com uma cisteína permutável;

A8 é Arg, D-Arg, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Thr, D-Thr,

Νω,ω-dimetil-arginina, L-Nω,ω-dimetil-arginina, D-

homoarginina, L-homoarginina, D-norarginina, L-norarginina,

citrulina, um Arg modificado, em que o grupo guanidínio é modificado ou substituído, norleucina, norvalina, bhIle,

Ach, N-MeArg, e N-MeIle, preferencialmente, Arg;

A9 é Phe, D-Phe, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Tyr, D-Tyr,

Trp, D-Trp, Phe-Ra, D-Phe-Ra, Dpa-Ra, D-Dpa-Ra, Trp-Ra,

bhPhe-Ra, ou um aminoácido não natural comumente usado como um substituto dos mesmos como PheF5, N-MePhe, benzilamida,

2-aminoindano, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal, bhDpa, e ciclohexilalanina que podem ou não ter Ra ligado a este,

preferencialmente bhPhe e bhPhe-Ra, em que Ra um é palmitoil-PEG, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3, palmitoil-

PEG-PEG, em que o PEG é PEG11 ou miniPEG3, butanoil (C4)-

PEG11-, octanoil(C8 caprílico)-PEG11, palmitoil (C16)-

PEG11, ou tetracosanoil (C24, lignocérico)- PEG11; e

A10 é Cys, D-Cys, Ser, D-Ser, Ala, D-Ala, ou um aminoácido não natural, como Ida, Ida(NHPal) Ahx e Ida(NBzl2) Ahx; em que o aminoácido carboxi-terminal está na forma de amida ou carboxi; em que pelo menos um aminoácido sulfidril está presente como um dos aminoácidos na sequência (e, preferencialmente, o grupo sulfidril é capaz de troca); e em que A1, A1 a A2, A10, ou uma combinação dos mesmos são opcionalmente ausentes, com a condição de que o peptídeo não é um dos peptídeos conforme definido na Tabela 1. Em algumas modalidades, as mini-hepcidina modificadas formam uma estrutura cíclica por uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, o aminoácido N-terminal é uma amina livre. Em algumas modalidades, o aminoácido N-terminal é uma amina bloqueada como com um grupo acetil. Em algumas modalidades, A6 e/ou A8 é um derivado da lisina, como Ν-ε- dinitrofenil-lisina, Ν-ε-metil-lisina, Ν,Ν-ε-dimetil- lisina, e Ν,Ν,Ν-ε- trimetil-lisina.

[104] Cinco das mini-hepcidinas modificadas na Tabela 4 contêm triptofano a fim de facilitar as medições de suas concentrações. Assim, em algumas modalidades, as mini-hepcidinas modificadas da presente invenção contêm triptofano. Em algumas modalidades, os resíduos de triptofanos são eliminados ou substituídos por outro aminoácido. Outras mini-hepcidinas modificadas foram feitas por modificação das mini-hepcidinas originais, substituindo as duas isoleucinas flanqueando a cisteína com argininas ou derivados de arginina. Inesperadamente, verificou-se que a substituição destas isoleucinas com argininas resultou em mini-hepcidinas com aumento da atividade. Acredita-se que a atividade inesperadamente superior é o resultado da presença de arginina na 6ª posição do aminoácido e/ou a 8ª posição do aminoácido. Assim, em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido na posição A6 e/ou A8 de fórmula estrutural I é a arginina. Modificações adicionais de tais mini-hepcidinas também resultaram em atividades inesperadamente superiores. As mini-hepcidinas modificadas de acordo com a presente invenção apresentam uma atividade inesperadamente superior em comparação com as mini- hepcidinas modificadas exemplificadas em USSN 13/131.792.

Além disso, verificou-se que muitas das mini-hepcidinas modificadas retêm suas atividades quando administradas por via subcutânea.

[105] Em algumas modalidades, o aminoácido N- terminal possui uma amina livre. Em algumas modalidades a amina N-terminal é bloqueada com um grupo que remove a carga, preferencialmente um grupo acetil ou grupo formal.

Em algumas modalidades a amina N-terminal é modificada para ser conjugada com uma cadeia acil com modalidades preferenciais, com um ácido graxo como o ácido caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, ou de tal forma que uma cadeia acil está em N-terminal. A cadeia acil também pode ser ligada através de um ligante conhecido na técnica, por exemplo, um ligante de polietileno-glicol, preferencialmente PEG3.

[106] Em algumas modalidades, a cadeia lateral do aminoácido A1 pode ser modificada, como indicado para a amina N-terminal. Por exemplo, o grupo carbonil livre no aminoácido A1 pode ser modificado, por exemplo, bloqueado por um grupo acil, como palmitoil (ver PR71).

[107] Em algumas modalidades, A4 é um aminoácido hidrofóbico volumoso como Phe, Tyr, Trp, Leu, ou Ile ou qualquer aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo que contém quatro ou mais átomos de carbono na sua cadeia lateral, preferencialmente, uma estrutura cíclica, como Phg, Bip, 1Nal, 2Nal, Amc, PheF5, Igl (L-2-indanilglicina) ou Cha (L-ciclohexilalanina), preferencialmente Dpa. Em algumas modalidades, A4 contém a forma beta-homo dos aminoácidos volumosos hidrofóbicos acima, por exemplo, bhPhe, ou bhDpa. Outras modificações na cadeia lateral incluem substituintes aromáticos, como os divulgados em Wang et al. (2002) Tetrahedron 58:3101-3110 e Wang et al. (2002) Tetrahedron 58:7365-7374. Em algumas modalidades, o resíduo de A4 é um D-aminoácido.

[108] Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A9 é um aminoácido hidrofóbico volumoso como Phe, Tyr, Trp, Leu, ou Ile ou qualquer aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos que contém quatro ou mais átomos de carbono na sua cadeia lateral, preferencialmente, uma estrutura cíclica, como Phg, Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal, Amc, PheF5, Igl ou Cha, como um grupo cíclico ou aromático que contém um ou mais anéis aromáticos ou substituintes. Em algumas modalidades, o resíduo A9 é Dpa ou Trp.

[109] Em algumas modalidades, as mini-hepcidinas da presente invenção são modificadas ou formuladas de forma a manter e/ou aumentar a sua biodisponibilidade in vivo.

Por exemplo, em algumas modalidades, a cadeia de peptídeo é conjugada com uma cadeia acil. Em algumas modalidades, a cadeia acil pode ser conjugada com o aminoácido N-terminal ou C-terminal ou um resíduo de cisteína. Em algumas modalidades, a cadeia de acil é conjugada com o resíduo A7.

A cadeia acil pode incluir um ácido graxo como o ácido caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, ou esteárico. A cadeia acil também pode conter um espaçador, como um espaçador de polietileno glicol. Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador de polietilenoglicol (1-11 PEG), preferencialmente PEG3 ou PEG11. Em algumas modalidades, o espaçador compreende de um aminoácido em que o número de átomos de carbono entre o grupo amino e o grupo ácido carboxílico estão separados por cerca de 2-8 carbonos, como o ácido 6-amino-hexanoico (ver, por exemplo, PR73). Outros espaçadores adequados incluem uma estrutura hidrofóbica que tem um anel e/ou de caracter aromático (ver, por exemplo, PR74).

[110] As mini-hepcidinas modificadas foram demonstradas em um modelo de camundongos de hemocromatose cuja administração diária das mini-hepcidinas modificadas, por exemplo, PR65, impediu a sobrecarga de ferro. Portanto, as mini-hepcidinas modificadas de acordo com a presente invenção, sozinhas ou em combinação com um ou mais mini- hepcidinas originais, podem ser administradas aos indivíduos, a fim de tratar, por exemplo, inibir e/ou reduzir, a sobrecarga de ferro em indivíduos, como seres humanos. Portanto, mini-hepcidinas originais e modificadas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas em medicamentos e tratamentos para tratar distúrbios de sobrecarga de ferro, por exemplo, beta-talassemia e hemocromatose hereditária, através da inibição e/ou redução da sobrecarga de ferro em sujeitos. Em algumas modalidades, pelo menos uma mini-hepcidina modificada e/ou, pelo menos, uma mini-hepcidina inicial é administrada aos sujeitos antes de, durante, após, ou uma combinação dos mesmos, os sintomas de sobrecarga de ferro ser observados e/ou ser diagnosticados como tendo um distúrbio de sobrecarga de ferro.

[111] Assim, em algumas modalidades, uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, sozinhas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, são fornecidas sob a forma de uma composição que compreende um veículo adequado para a sua finalidade pretendida. As composições podem também incluir um ou mais ingredientes adicionais adequados para os fins pretendidos. Por exemplo, para os ensaios, as composições podem incluir lipossomas, niclosamida, agente de solubilização SL220 (NOF, Japão), cremophor EL (Cysma), etanol, e DMSO. Para tratar uma doença de sobrecarga de ferro, as composições podem compreender diferentes promotores de absorção e inibidores de protease, micropartículas sólidas ou nanopartículas para encapsulamento de peptídeo (como quitosano e hidrogéis), a conjugação de macromoléculas, lipidização e outra modificação química.

[112] A presente invenção também fornece kits compreendendo uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, e/ou composições da presente invenção embaladas em conjunto com os reagentes, dispositivos, material de instrução, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, os kits podem incluir os reagentes utilizados para a realização de ensaios, drogas e composições para o diagnóstico, tratamento, ou monitoramento de distúrbios do metabolismo do ferro, os dispositivos para a obtenção de amostras a serem ensaiadas, dispositivos para a mistura dos reagentes e a realização de ensaios, e outros semelhantes.

[113] Como os peptídeos da presente invenção exibem atividade hepcidina, ou seja, atuam como agonistas de degradação de ferroportina, uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, podem ser utilizadas para tratar doenças de sobrecarga de ferro. Por exemplo, uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, podem ser administradas a um sujeito para melhorar os sintomas e/ou patologias associadas a sobrecarga de ferro em anemias de carregamento de ferro (especialmente β-talassemias) onde flebotomia é contraindicado e quelantes de ferro são o pilar do tratamento, mas são muitas vezes mal tolerados.

Uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, podem ser utilizadas para tratar a hemocromatose hereditária, particularmente em sujeitos que não toleram a flebotomia de manutenção. Uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, podem ser utilizadas para tratar a toxicidade aguda de ferro. Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais, podem ser combinadas com a flebotomia ou quelação.

[114] Assim, uma ou mais mini-hepcidinas modificadas, isoladas ou em combinação com uma ou mais mini-hepcidinas originais podem ser administradas a um indivíduo, preferencialmente um mamífero como um humano. Em algumas modalidades, a administração ao sujeito é, antes, durante e/ou após o sujeito apresentar um aumento dos níveis de ferro e/ou de níveis anormalmente elevados de ferro. Em algumas modalidades, o sujeito a ser tratado é aquele que está em risco de ter níveis elevados de ferro e/ou tem uma predisposição genética para ter uma doença de sobrecarga de ferro. Em algumas modalidades, os peptídeos são administrados em uma forma de uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, os peptídeos são administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Como aqui utilizado, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade que melhora os sintomas e/ou patologia de uma dada doença do metabolismo do ferro, em comparação com um controle, como um placebo.

[115] Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser prontamente determinada por métodos convencionais conhecidos na técnica. As doses a serem administradas podem ser determinadas por um especialista na técnica dependendo da gravidade clínica da doença, da idade e do peso do sujeito, ou a exposição do sujeito ao ferro. Quantidades eficazes preferenciais de mini-hepcidinas variam de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 a cerca de 2 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal para formulações parenterais. As quantidades eficazes para administração oral podem ser de até cerca de 10 vezes maior. Além disso, tratar um sujeito com um peptídeo ou composição da presente invenção pode incluir um único tratamento ou, preferencialmente, pode incluir uma série de tratamentos.

Será apreciado que as dosagens podem variar de acordo com o peptídeo ou composição, a formulação particular, o modo de administração especial, e o local particular, hospedeiro e doença a ser tratada. Também será apreciado que a dose eficaz utilizada para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo do curso de um tratamento em particular.

As dosagens ideais para um dado conjunto de condições podem ser determinadas pelos especialistas na técnica utilizando testes convencionais de determinação de dosagem, tendo em vista os dados experimentais para um determinado peptídeo ou composição. As alterações na dosagem podem resultar e tornar-se aparente por ensaios de diagnóstico padrão conhecidos na técnica. Em algumas condições pode ser necessária a administração crônica.

[116] As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em uma forma apropriada de dosagem unitária para o modo desejado de administração. As composições da presente invenção podem ser administradas para terapia por qualquer via adequada incluindo oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Uma variedade de vias de administração pode ser utilizada de acordo com a presente invenção, incluindo por via oral, tópica, transdérmica, nasal, pulmonar, transpercutânea (em que a pele tenha sido quebrada, por meios mecânicos ou de energia), retal, bucal, vaginal, por meio de um reservatório implantado, ou parenteral. Parenteral inclui subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, intra- sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, técnicas de injeção ou infusão intralesionais e intracranianas, bem como materiais injetáveis (incluindo polímeros) para terapia localizada. Em algumas modalidades, a via de administração é subcutânea. Em algumas modalidades, a composição está em um frasco de vidro estéril selado. Em algumas modalidades, a composição contém um conservante. As composições farmacêuticas podem ser formuladas como um pó a granel, comprimidos, líquidos, géis, liofilizadas, e outros semelhantes, e podem ser processadas posteriormente para administração. Ver, por exemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th ed. (2000) Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD, que é aqui incorporado por referência.

[117] Será apreciado que a via preferencial variará com a condição e idade do beneficiário, a natureza da condição a ser tratada, e o peptídeo e a composição escolhidos.

[118] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo como aqui divulgado e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, que pode ser inerte. Como aqui utilizado, a expressão “veículo farmaceuticamente aceitável” pretende incluir todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, agente de volume, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, conservantes, agentes de retardamento da absorção e isotônicos, e outros semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica e conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições é contemplada.

[119] Os compostos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Compostos suplementares incluem niclosamida, lipossomas, agente de solubilização SL220 (NOF, Japão), Cremophor EL (Cysma), etanol, e DMSO.

[120] A toxicidade e eficácia terapêutica dos peptídeos e composições da presente invenção podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão de LD50/ED50. São preferenciais os peptídeos que exibem índices terapêuticos grandes. Embora os peptídeos que exibem efeitos colaterais tóxicos podem ser utilizados, deve ser tomado cuidado para conceber um sistema de liberação que alveje tais peptídeos para o local de tecido afetado de forma a minimizar o dano potencial às células não infectadas e, desse modo, reduzir os efeitos secundários.

[121] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para utilização em seres humanos. A dosagem dos peptídeos da presente invenção situa-se preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer peptídeo utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentrações plasmáticas circulantes que inclua a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas) como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência ou por espectroscopia de massa.

MINI-HEPCIDINA MODIFICADA, PR65

[122] SÍNTESE PEPTÍDICA. Mini-hepcidinas modificadas acordo com a presente invenção foram sintetizadas utilizando a química padrão Fmoc de fase sólida e foram purificadas por HPLC de fase reversa. Para PR65, de A1 a A9 de fórmula estrutural IA (isto é, a partir de N para C terminal), a sequência principal foi todos os L-aminoácidos como se segue: ácido iminodiacético, treonina, histidina, difenilalanina, beta-homo prolina, arginina, cisteína, arginina e beta-homo fenilalanina. A carboxiamida C-terminal foi derivatizada com ligante polietilenoglicol (PEG) e os grupos de ácido palmítico (Figura 10A). Hepcidina humana foi adquirida a partir de Peptides International (Louisville, KY).

[123] ESTUDOS EM ANIMAIS. Todos os estudos foram aprovados pelo UCLA Office of Animal Research Oversight.

Camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade tipo selvagem foram utilizados para comparar as atividades de hepcidina nativa e PR65, e para testar o efeito de PR65 após via de administração intraperitoneal contra subcutânea. Hepcidina e PR65 foram administradas em 100 µl de SL220, um solubilizador baseado em PEG-fosfolipídeo (NOF Corporation, Japão) (Preza CG, et al. (2011) J Clin.

Invest. 121 (12):4880-4888) e os parâmetros de ferro foram medidos após 4 horas. Este solvente não altera significativamente as concentrações séricas de ferro em camundongos (<5 µΜ mudança, dados não mostrados).

[124] Os efeitos terapêuticos de PR65 foram estudados em camundongos knockout de hepcidina-1 (Hamp1-/-) (Lesbordes-Brion JC, et al. (2006) Blood 108 (4):1402-1405) e retrocruzados para background C57BL/6 (N4, 99% do gene marcador de identidade), utilizando retrocruzamento acelerado assistido por marcador (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). PR65 foi administrado por via subcutânea em 100 µl de solubilizante SL220. Estudos em curto prazo foram realizados para até 48 horas para determinar a eficácia da injeção única. Estudos de longo prazo (“prevenção” e “tratamento”) foram realizados por 2 semanas usando injeções diárias e ferro e parâmetros hematológicos medidos 24 horas após a última injeção.

[125] Para testar a capacidade de PR65 para prevenir, inibir, ou reduzir a carga de ferro (estudos “prevenção”), camundongos machos Hamp1-/- foram esgotados em ferro, colocando-os em uma dieta pobre em ferro (4 ppm de ferro) por 2 meses, com início na idade de 5-6 semanas. O regime foi desenvolvido para combinar com o teor de ferro hepático de camundongos C57B6 do tipo selvagem, cerca de 2- 3 µmoles/g de fígado úmido (Ramos E, et al. (2011) Hepatology 53 (4):1333-1341). Um grupo de camundongos foi analisado imediatamente após a depleção de ferro (grupo de base), e os animais restantes foram mudados para uma dieta de carregamento de ferro (ração padrão, cerca de 300 ppm de Fe) e a injeção subcutânea diária recebida de solvente ou PR65 (20, 50 ou 100 nmoles) durante 2 semanas. Todas as dietas de rato foram obtidas de Harlan-Teklad (Madison, WI).

[126] Para testar o efeito de PR65 em camundongos Hamp1-/- carregados em ferro (estudos de “tratamento”), os camundongos machos foram mantidos na dieta normal durante toda a sua vida útil. Começando em 12-14 semanas de idade, 50 nmoles de PR65 ou solvente foi injetado diariamente por via subcutânea durante 2 semanas.

[127] MEDIÇÃO DE FERRO E PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS.

As concentrações de ferro sérico e ferro não-heme foram determinadas como anteriormente descrito (Ramos E, et A1 (2011) Hepatology 53 (4): 1333-1341), utilizando o tratamento ácido seguido por um ensaio colorimétrico para a quantificação de ferro (Genzyme, Cambridge, MA). Secções desparafinizadas foram coradas com o corante azul prussiano de Perls para o ferro não-heme, reforçada com o kit de substrato SG peroxidase (Vector Labs, Burlingame, CA) e contrastado com o vermelho rápido nuclear. Hemogramas completos foram obtidos com um analisador de sangue Hema Vet (Drew Scientific, Oxford, CT).

[128] ANÁLISE ESTATÍSTICA. A significância estatística das diferenças entre as médias dos grupos foi avaliada utilizando T-Student e o Sigmaplot 11.0 (Systat Software, San Jose, CA).

Regime de Tratamento Mini-hepcidina

[129] PR65 (Figura 10A) foi selecionado para os estudos de prevenção e tratamento em camundongos nulos em hepcidina com base em estudos pilotos no C57BL/6 tipo selvagem. PR65 demonstrou estar entre as mais potentes mini-hepcidinas e sua bioatividade molar após injeção intraperitoneal era comparável à de hepcidina nativa (Figura 10B). Além disso, PR65 manteve a atividade completa com administração subcutânea, em comparação com a administração intraperitoneal (Figura 10C) e o seu custo de síntese foi favorável em comparação com outras mini- hepcidinas. Com base na avaliação qualitativa de mais do que 80 mini-hepcidinas, a elevada bioatividade de PR65 em comparação com o peptídeo protótipo, contendo os nove aminoácidos N-terminais de hepcidina humana (SEQ ID NO: 9), é provavelmente devido ao aumento de aromaticidade, solubilidade, resistência à proteólise, bem como o clearance renal mais baixo, devido ao aumento da ligação às proteínas plasmáticas mediado pelo grupo palmitoil.

[130] Para estabelecer parâmetros de dosagem ideais para um regime de tratamento de mini-hepcidina em longo prazo, experimentos de dose-resposta (Figura 11A) e curso de tempo (Figura 11B) em camundongos knockout de hepcidina com sobrecarga de ferro, Hamp1-/-, foram realizados. Após 24 horas, a injeção subcutânea de 20 e 50 nmoles de PR65 causou 15% e 10%) (p = 0,005, p = 0,004) reduções em ferro no soro, enquanto que doses de 100 e 200 nmoles resultaram em uma redução de 85% e 95% (p <0,001 para ambos). Devido ao fato de que 100 nmoles de PR65 produziram uma hipoferremia próxima da máxima, esta dose foi selecionada para um experimento de curso de tempo para determinar o momento e a duração do seu efeito máximo. A redução máxima (88%) em Fe no soro ocorreu 12 horas após a injeção subcutânea (p <0,001), e Fe no soro manteve-se severamente reprimido (82%) em 24 horas, mas voltou para os níveis de controle de solvente 48 horas após a injeção.

[131] A atividade do PR65 (100 nmoles) também foi avaliada durante 48 horas, através do seu efeito sobre a retenção de ferro no tecido. Curiosamente, a acumulação de ferro no baço não foi observada durante 48 horas após a injeção de PR65 (Figura 12). Isto é provavelmente porque o baço em camundongos knockout de hepcidina é completamente esgotado de ferro e leva mais de 2 dias para acumular ferro suficiente por isso é conclusivamente detectável pelo aumento de coloração de Perls. Teor de ferro no fígado, que já era elevada nestes camundongos, não alterou visivelmente através do curso do experimento. De 1-4 horas após a injeção, as secções do duodeno mostraram coloração distinta de ferro em torno de redes capilares vilosas indicando alta atividade de ferroportina continuada e a transferência de ferro não ocorreu para o plasma. A partir de 12-24 horas após a injeção PR65, ferro acumulado dentro de enterócitos consistentes com a perda induzida por mini-hepcidina esperado de ferroportina e diminuiu a transferência de ferro para o plasma. Como o efeito de mini-hepcidina se desfez 48 horas após a injeção, o ferro deixou de ser retido em enterócitos.

[132] Assim, em algumas modalidades, os sujeitos são tratados com uma determinada dose, por exemplo, cerca de 100 µg/kg, de uma mini-hepcidina diariamente, e após cerca de uma semana, a dose é reduzida para metade se a concentração sérica de ferro do sujeito está abaixo cerca de 10 µΜ ou dobrada se o ferro sérico está acima de cerca de 30 µΜ. Por volta do início da terceira semana de tratamento, a dose pode ser aumentada ou diminuída em cerca de 25-50% para manter os níveis séricos de ferro entre cerca de 10-30 µΜ. Em algumas modalidades, depois de cerca de 1 semana da administração de uma ou mais mini- hepcidinas, os níveis de ferro, e/ou ferroportina, e/ou os níveis de mini-hepcidina no sujeito podem ser monitorados através de métodos conhecidos na técnica ou como aqui descrito, e, em seguida, com base nos níveis, o sujeito pode ser tratado em conformidade, por exemplo, administradas uma ou mais doses subsequentes de uma ou mais mini-hepcidinas que podem ser maiores ou menores do que a dose inicial. As mini-hepcidinas das doses subsequentes podem ser iguais ou diferentes das mini-hepcidinas da primeira dose.

Administração crônica de mini-hepcidinas previne carregamento de ferro em sujeitos deficientes em hepcidina

[133] A capacidade de PR65 para evitar sobrecarga de ferro em hepcidina em indivíduos foi examinada usando camundongos como modelos. Camundongos KO em hepcidina foram colocados em uma dieta com deficiência de ferro durante 8 semanas para reduzir os seus estoques de ferro a um nível comparável ao de camundongos WT. Após a depleção de ferro, um grupo de camundongos foi analisado para estabelecer os parâmetros de ferro e hematológicos basais e o resto dos camundongos foram colocados com uma dieta de carregamento de ferro (300 ppm de Fe) durante 2 semanas, enquanto simultaneamente recebiam injeções subcutâneas diárias de apenas solvente (controle) ou PR65 (20, 50 ou 100 nmoles) em solvente. Postula-se que, em comparação com o tratamento com solvente, PR65 causaria retenção de ferro no baço, diminui o ferro no soro e impede carregamento de ferro no fígado. Devido à sobrecarga de ferro cardíaco ser um marcador de prognóstico fraco em pacientes carregados com ferro, ferro cardíaco também foi medido. As concentrações de hemoglobina foram monitoradas para detectar potenciais efeitos de restrição de ferro de excesso de hepcidina em eritropoiese.

[134] Atividade agonista de hepcidina das mini- hepcidinas foi confirmada em todos os grupos tratados pelo aumento da retenção de ferro em macrófagos manifestado como um aumento de teor de ferro do baço. Em comparação com o teor de ferro não-heme quase indetectável nos baços de controle injetados com solventes, as três doses de mini- hepcidinas causou um aumento de 15 - 30 vezes no conteúdo de ferro no baço (p = 0,01 para todos) (Figura 13 A). Ferro no soro não se alterou em camundongos que receberam 20 nmoles de PR65 diários (p = 0,26), mas diminuiu em 69% e

83% nos camundongos que receberam 50 e 100 nmoles por dia

(p = 0,01 para ambos) (Figura 13B). A redução nas concentrações de ferro em circulação também foi refletida como reduções dependentes da dose de 3 e de 5 g/dl de hemoglobina nas concentrações nos grupos de 50 e 100 nmoles, respectivamente (p <0,001 para ambos), mas os níveis de hemoglobina não se alteraram significativamente em 20 nmoles (p = 0,13) (Figura 13C). A concentração de ferro do coração diminuiu 33%, 60% e 47% nos camundongos tratados com 20, 50 e 100 nmoles de PR65, respectivamente

(p = 0,08, 0,007, 0,05) (Figura 13D). Além disso, os camundongos tratados com as três doses de PR65 tinham 76%,

53% e 68% menos de ferro no fígado do que os controles tratados com solventes (p = 0,001, 0,06, 0,01) e sem aumentos estatisticamente significativos em ferro no fígado em comparação com os camundongos de grupo basal esgotados em ferro.

Exceto para ferro sérico e hemoglobina, a ausência de uma relação dose-resposta consistente pode indicar que o efeito máximo foi atingido em uma dose relativamente baixa de modo a que as diferenças refletem flutuações estatísticas (ferro no fígado e coração), ou que dois ou mais efeitos de PR65 interagem de um modo complexo

(ferro do baço pode refletir os efeitos combinados de exportação de ferro reduzida a partir do baço, diminuição da absorção de ferro no duodeno, e diminuição do número de hemácias, todos os quais são efeitos esperados de PR65).

[135] Corantes de Perls de secções de órgãos de camundongos tratados com mini-hepcidinas em comparação com camundongos basais depletados com ferro indicou que os estoques de ferro no fígado não aumentaram a partir dos grupos basais de 20 e 50 nmoles, e foram ainda mais baixos do que nos basais na dose de 100 nmoles (Figura 14). Em contraste, as secções de fígado de camundongos injetados com solventes mostraram níveis muito elevados de ferro. Um padrão semelhante de diferenças entre os grupos de solventes e de PR65 foi observado no coração, com uma total ausência de coloração de ferro no coração de camundongos que receberam 100 nmoles de peptídeo. Acumulação significativa de ferro na polpa vermelha do baço foi observada em todos os grupos de mini-hepcidina, mas não nos camundongos que receberam o solvente, ou em camundongos com depleção de ferro basais. Seções duodenais na linha de base não mostrou nenhuma coloração de ferro, enquanto os camundongos tratados com PR65 mostraram retenção de ferro nos enterócitos duodenais, mais uma vez confirmando que PR65 bloqueou o efluxo de ferro de enterócitos.

[136] Assim, em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de prevenção de sobrecarga de ferro em sujeitos com níveis anormalmente baixos ou nenhum de hepcidina que compreende a administração crônica de uma ou mais mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção.

Efeito de mini-hepcidina em camundongos knockout de hepcidina sobrecarregados em ferro

[137] Para avaliar o potencial de mini-hepcidinas como um tratamento autônomo para sobrecarga de ferro em sujeitos, camundongos knockout em hepcidina sobrecarregados com ferro de 12 semanas de idade foram injetados com 50 nmoles de PR65 diariamente durante 14 dias. Esta dose foi escolhida como a dose máxima tolerada, pois camundongos que receberam 100 nmoles no experimento anterior tornaram-se moderadamente anêmicos. Atividade do peptídeo foi confirmada por aumento em 15 vezes no teor de ferro do baço (p <0,001) (Figura 15A). Em contraste com os camundongos que foram depletados de ferro antes da administração de PR65, em camundongos com níveis de ferro no soro sobrecarregados em ferro não foram reduzidos 24 horas após a última dose em comparação com os camundongos tratados com solvente (p = 0,682) (Figura 15B). No entanto, a diminuição de 2 g/dl em hemoglobina (p = 0,012) (Figura 15C), sugere que o ferro no soro poderia ter sido transitoriamente reduzido durante o tratamento. Em menos de 24 horas do efeito hipoferrêmico de cada dose de 50 nmoles pode ter sido devido à sobrecarga de ferro grave dos camundongos knockout em hepcidina nesta idade. Ferro acumulado no hepatócito pode estimular a síntese de ferroportina e efluxo de ferro a partir de hepatócitos do plasma, aliviando a inibição da tradução de ferroportina por proteínas regulatórias de ferro (IRP) interagindo com elemento regulador de 5’ ferro (5’ IRE) no mRNA de ferroportina e, possivelmente, por outros mecanismos.

Comparado com o grupo controle, os camundongos carregados em ferro tratados com PR65 mostraram uma tendência para a redução das concentrações de ferro cardíaco (redução de 24%, p = 0,085) (Figura 15D), e seus níveis de ferro no fígado diminuíram cerca de 20% (p = 0,009) ou cerca de 200 µg/g (Figura 15E), uma quantidade equivalente ao conteúdo de ferro hepático total em camundongos selvagens.

[138] Coloração de Pearls melhorada demonstrou a retenção de ferro no baço e duodeno em camundongos tratados com PR65 e uma mudança no padrão de distribuição de ferro no fígado (Figura 16). Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi perceptível nas seções de coração e pâncreas dos camundongos tratados com solventes e PR65. No total, coloração e análise quantitativa indicam que o tratamento com mini-hecepdina de 2 semanas, não só pode inibir a absorção de ferro da dieta, mas também redistribuir uma quantidade modesta de ferro do fígado para o baço.

[139] Assim, em algumas modalidades, os sujeitos humanos sendo tratados para uma doença de sobrecarga em ferro são tratados com uma ou mais mini-hepcidinas por um período de, pelo menos, o período mínimo necessário para detectar que o tratamento impediu a acumulação de ferro no fígado por tecnologias de imagem disponíveis (por exemplo, FerriScan), por exemplo, cerca de três meses. Em alguns sujeitos, o tratamento pode ser continuado por vários anos, ou durante a vida do sujeito.

[140] Como mostrado na Figura 13, PR65 atuou predominantemente na redução da absorção de ferro, mas também redistribuiu ferro em macrófagos do baço quando administrado profilaticamente. Assim, em algumas modalidades, uma ou mais mini-hepcidinas podem ser administradas a um sujeito como um tratamento profilático contra a sobrecarga de ferro no sujeito. Por exemplo, onde um sujeito tendo ferro no fígado que está dentro de uma faixa normal, mas tem uma predisposição para uma doença de sobrecarga de ferro (por exemplo, geneticamente predispostos a adsorção de excesso de ferro), ou está em risco de desenvolvimento de um nível anormalmente elevado de ferro, o sujeito pode ser administrado com uma ou mais mini-hepcidinas para prevenir e/ou reduzir a probabilidade de que o sujeito vá desenvolver uma doença de sobrecarga de ferro e/ou níveis anormalmente elevados de ferro.

[141] De acordo com a Figura 13, a distribuição de ferro foi calculada com base nas seguintes premissas e equações: Massas de órgãos estimados com base no peso médio de 25 g, volume de sangue (5,5%) = 1,4 ml, massa de fígado (5%) = 1,3 g, massa do baço (0,3%) = 0,08 g,% Fe em Hb = 0,34% com base na massa molecular da Hb = 64.000 Dalton e 4 átomos de ferro com uma massa atômica total de 224 Dalton, ferro total em Hb = (concentração de Hb) x (volume de sangue) x (% Fe em Hb) e ferro Total em um órgão = concentração molar de ferro x massa de órgão x 56 g/mol. Os valores para o grupo solvente e o grupo PR65 são apresentados da seguinte forma: TABELA 5 Tratamento com solvente Ferro no órgão total (mg) Hb = 15 g/dl 0,7 Concentração de ferro no 1,2 fígado = 1,7 µmoles/g Concentração de ferro no 0,002 baço = 0,5 µmole/g Total 1,9 PR65: 50 nmoles Ferro no órgão total (mg) Hemoglobina = 11,5 g/dl 0,5

Concentração de ferro no 0,6 fígado = 8 µmoles/g Concentração de ferro no 0,1 baço = 30 µmoles/g Total 1,2 (36% redução)

[142] A diminuição resultante de ferro no plasma também pode reduzir os níveis de substâncias tóxicas não transferrina ligadas ao ferro (NTBI) e promover a mobilização de ferro a partir do coração e órgãos endócrinos onde o excesso de ferro não é tolerado. Assim, em algumas modalidades, uma ou mais mini-hepcidinas podem ser administradas a um sujeito, para reduzir os níveis de NTBI e/ou promover a mobilização de ferro a partir do coração e órgãos endócrinos para outros órgãos e tecidos.

[143] Diferente de flebotomia ou quelação, mini- hepcidinas não seriam esperadas para aumentar sensivelmente as perdas de ferro do corpo. Em um modelo relativamente leve de sobrecarga de ferro em camundongos nulos HFE (Viatte L, et al. (2006) Blood 107 (7):2952-2958), expressão da hepcidina transgênica foi relatado para causar redistribuição significativa de ferro em macrófagos hepáticos, um local onde a acumulação de ferro é relativamente não tóxica. Em mais camundongos Hamp1-/- sobrecarregados, os macrófagos de polpa vermelha em camundongos tratados com mini-hepcidina retiveram ferro,

mas a pequena diminuição resultante em estoques de ferro no fígado e no coração sugere que as mini-hepcidinas só conferem um benefício terapêutico modesto uma vez que a carga de ferro no fígado é elevada. O efeito mais curto do que 24 horas de uma dose de mini-hepcidina na saturação de transferrina neste modelo de sobrecarga grave de ferro pode implicar que NTBI continua a fornecer ferro para órgãos parenquimatosos contrariando os efeitos da redistribuição de ferro para macrófagos e diminuição da absorção de ferro.

[144] Assim, em sobrecarga de ferro estabelecida em sujeitos humanos, o tratamento eficaz com uma ou mais mini-hepcidinas pode incluir mais do que uma dose por dia, um período de tratamento prolongado antes de um efeito benéfico do ferro no fígado poder ser detectado, ou pode ser combinado com a remoção de ferro por flebotomia ou quelação.

Dosagens

[145] A utilização exclusiva de L-aminoácidos em PR65 demonstrou reduzir significativamente os custos de produção de peptídeos. Além disso, os resíduos não naturais e altamente aromáticos em PR65 inesperadamente demonstraram reduzir substancialmente a dose mínima eficaz em camundongos a 20 nmoles/d ou 1,3 mg/kg/d.

[146] De acordo com as diretrizes de ajuste de dosagem do U.S. Food and Drug Administration, a diferença nas taxas metabólicas entre o camundongo e o humano requer uma conversão baseada no fator Km que normaliza doses para a área de superfície corporal (Reagan-Shaw S, et al. (2008) FASEB J 22 (3):659-661). Uma dose humana equivalente (HED) pode ser estimada por HED = dose de animal (mg/kg) x (Km animal/Km humano), em que o Km para o camundongo e um ser humano adulto é de 3 e 37, respectivamente. Assim, de acordo com a presente invenção, uma dose subcutânea de mini-hepcidina em um ser humano pode ser de até cerca de 50-100 µg/kg/d, cerca de 75-125 µg/kg/d, ou cerca de 90-110 µg/kg/d, preferencialmente cerca de 100 µg/kg/d (esta dose é uma quantidade facilmente administrável do peptídeo de cerca de três vezes a dose basal média da droga peptídica mais amplamente utilizada, insulina subcutânea, comumente utilizada em 0,75 U/kg/d ou 33 µg/kg/d em diabéticos do tipo 2 (Rosenstock J, et al. (2001) Diabetes Care 24 (4):631-636)). Naturalmente, as doses mais baixas, bem como as doses mais elevadas, dependendo da mini-hepcidina particular, forma de administração, formulação, sujeito e grau de sobrecarga de ferro, podem ser administradas ao sujeito.

[147] As diferenças importantes entre metabolismo de ferro murino e humano que podem alterar o efeito de uma mini-hepcidina, por exemplo, PR65, em seres humanos incluem um maior tempo de vida dos eritrócitos humanos (120 dias vs

40 dias) e as perdas de ferro em frações muito baixas em humanos (perdas de ferro diárias em comparação com ferro corporal total) como estimado a partir da depleção mais lenta dos estoques de ferro em dietas com deficiência de ferro (em machos: 300-600 dias vs 15-20 dias). O efeito líquido destas diferenças é a contribuição muito menor da absorção intestinal de ferro para o fluxo diário de ferro em seres humanos (4-8% em comparação com mais de 50% em camundongos) (Ramos E, et al. (2011) Hepatology 53 (4): 1333-1341). Se hepcidina e seus análogos exercem efeitos mais fortes em macrófagos do que em enterócitos (Reagan- Shaw S, et A1 (2008). FASEB J 22 (3):659-661) este pode diminuir ainda mais as doses relativas das mini-hepcidinas necessárias para um efeito hipoferrêmico semelhante em humanos. Assim, em algumas modalidades, uma dose terapeuticamente eficaz de uma ou mais mini-hepcidinas varia de cerca de 10-500 µg/kg/d. Mais uma vez, as doses mais baixas, bem como as doses mais altas, dependendo da mini-hepcidina particular, forma de administração, formulação, sujeito e o grau de sobrecarga de ferro, podem ser administradas ao sujeito.

[148] Como aqui fornecida, mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para inibir, reduzir ou tratar a sobrecarga de ferro em sujeitos em risco devido aos defeitos genéticos ou aqueles que já tenham sido submetidos à depleção de ferro, mas não mais toleram terapia de quelação ou venesecção. As mini- hepcidinas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para tratar um sujeito possuindo β-talassemia principal e/ou um sujeito tendo níveis de hepcidina que são mais altos do que o normal, mas são mais baixos do que o que é apropriado para o grau de sobrecarga de ferro, e o sujeito particular. Por exemplo, um ou mais mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para tratar um sujeito que sofre de hiperabsorção de ferro da dieta, mas tem níveis normais de ferro, a fim de reduzir a quantidade de ferro no sujeito e compensar a hiperabsorção.

Uma ou mais mini-hepcidinas de acordo com a presente invenção pode ser usada para tratar a eritropoiese ineficaz e melhorar a anemia em sujeitos.

[149] Por causa do tamanho relativamente pequeno das mini-hepcidinas da presente invenção, as mini- hepcidinas podem ser adequadamente formuladas e otimizadas para a administração oral ou a administração por outros meios não invasivos, como os utilizados para a administração de insulina (Roach P. (2008) Clinical Farmacokinetics 47 (9):595-610), como a inalação, ou liberação transcutânea, ou liberação por mucosa nasal ou bucal.

[150] Na medida necessária para entender ou completar a revelação da presente invenção, todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes aqui mencionados são expressamente incorporados por referência na mesma para a mesma extensão como se cada um fosse individualmente assim incorporado.

[151] Tendo assim descrito as modalidades exemplificativas da presente invenção, deve ser notado pelos especialistas na técnica que as divulgações aqui são somente exemplares e que várias outras alternativas, adaptações e modificações podem ser feitas dentro do escopo da presente invenção. Por conseguinte, a presente invenção não está limitada às modalidades específicas, como aqui ilustradas, mas é apenas limitada pelas reivindicações seguintes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo isolado caracterizado pelo fato de que tem a seguinte fórmula estrutural IA ou IB: A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10 IA A10-A9-A8-A7-A6-A5-A4-A3-A2-A1 IB em que A1 é Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, piroglutamato, D- piroglutamato, Gln, D-Gln, Asn, D-Asn, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como bhAsp, Ida, Ida(NHPal), e N-MeAsp, preferencialmente Ida e N-MeAsp; A2 é Thr, D-Thr, Ser, D-Ser, Val, D-Val, Ile, D-Ile, Ala, D-Ala ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como Tle, Inp, Chg, bhThr e N- MeThr; A3 é His, D-His, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como L-His (π-Me), D-His (π-Me), L-His (τ-Me), ou D-His (τ-Me); A4 é Phe, D-Phe, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Trp, D-Trp, Tyr, D-Tyr, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como Phg, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal, bhDpa, Amc, PheF5, hPhe, Igl ou ciclohexilalanina, preferencialmente Dpa; A5 é Pro, D-Pro, Ser, D-Ser, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto dos mesmos,

como Oic, bhPro, trans-4-PhPro, cis-4-PhPro, cis-5-PhPro,

Idc e, preferencialmente, bhPro;

A6 é Arg, D-Arg, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Thr, D-Thr,

Νω,ω-dimetil-arginina, L-Nω,ω-dimetil-arginina, D-

homoarginina, L-homoarginina, D-norarginina, L-norarginina,

Ach, N-MeArg, e N-MeIle, preferencialmente, Arg;

A7 é Cys, D-Cys, Ser, D-Ser, Ala, D-Ala, ou um aminoácido não natural comumente utilizado como um substituto do mesmo, como Cys(S-tBut), homoCys, Pen,

(D)Pen, preferencialmente S-terciário butil-cisteína,

Cys(S-S-Pal), Cys(S-S-cisteamina-Pal), Cys(S-S-Cys-NHPal) e

Cys(S-S-Cys);

A8 é Arg, D-Arg, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Thr, D-Thr,

Νω,ω-dimetil-arginina, L-Nω,ω-dimetil-arginina, D-

homoarginina, L-homoarginina, D-norarginina, L-norarginina,

Ach, N-MeArg, e N-MeIle, preferencialmente, Arg;

A9 é Phe, D-Phe, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Tyr, D-Tyr, Trp, D-Trp, Phe-Ra, D-Phe-Ra, Dpa-Da, D-Dpa-Ra, Trp-Ra, bhPhe-Ra, ou um aminoácido não natural comumente usado como um substituto do mesmo, tal como PheF5, N-MePhe, benzilamida, 2-aminoindano, bhPhe, Dpa, Bip, 1Nal, 2Nal, bhDpa, e ciclohexilalanina que pode ou não ter Ra ligado ao mesmo, preferencialmente bhPhe e bhPhe-Ra, em que Ra um é palmitoil-PEG, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3, palmitoil- PEG-PEG, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3, butanoil(C4)- PEG11-, octanoil(C8, Caprílico)-PEG11-, palmitoil(C16)- PEG11-, ou tetracosanoil (C24, Lignocérico)-PEG11-; e A10 é Cys, D-Cys, Ser, D-Ser, Ala, D-Ala, ou um aminoácido não natural como Ida, Ida(NHPal)Ahx, e Ida(NBzl2)Ahx; em que o aminoácido carboxi-terminal está em uma forma amida ou carboxi; em que pelo menos um aminoácido sulfidril está presente como um dos aminoácidos na sequência; e em que A1, A1 a A2, A10, ou uma combinação dos mesmos são opcionalmente ausentes, com a condição de que o peptídeo não seja um dos peptídeos conforme definidos na Tabela 1.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo contém pelo menos um dos seguintes:

a) A1 = N-MeAsp, Ida, ou Ida(NHPal); b) A5 = bhPro; c) A6 = D-Val, D-Leu, Lys, D-Lys, Arg, D-Arg, Ach, bhArg, de N-MeArg; d) A7 = Cys(S-S-Pal), Cys(S-S-cisteamina-Pal), Cys(S- S-Cys-NHPal), ou Cys(S-S-Cys); e/ou e) A8 = D-Val, D-Leu, Lys, D-Lys, Arg, D-Arg, Ach, bhArg, ou N-MeArg.

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: i) quando A1 é Ida e A9 é Phe, então, A10 não é Ahx- Ida(NHPal); ii) quando A1 é Ida, A9 não é bhPhe-Rb, em que Rb é S- (palmitil)tioglicólico-PEG-; iii) quando A4 é D-Phe, A7 não é D-Cys(S-S-tBut) e A9 não é D-Trp-Rc, em que Rc é butanoil-PEG11-, Octanoil- PEG11-, Palmitoil-PEG11-, ou Tetracosanoil-PEG11-; e iv) quando A1 é Ida e A9 é bhPhe-Rd, em que Rd é palmitoil-PEG-miniPEG3-, A6 e A8 não são ambos D-Arg ou ambos bhArg.

4. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que A1 é D-Asp, N-MeAsp, Ida, ou Ida(NHPal); A2 é Thr ou D-Thr; A3 é His ou D-His;

A4 e Dpa ou D-Dpa; A5 é Pro, D-Pro, bhPro, ou Oic; A6 é Ile, D-Ile, Arg, D-Val, D-Leu, Ach, ou N-MeArg; A7 é Cys, D-Cys, Cys(S-S-Pal), Cys(S-S-cisteamina- Pal), Cys(S-S-Cys-NHPal), ou Cys(S-S-Cys); A8 é Ile, D-Ile, Arg, D-Val, D-Leu, Ach, ou N-MeArg; A9 é Phe, D-Phe, Dpa, D-Dpa, Trp, D-Trp, bhPhe, Phe- Ra, D-Phe-Ra, Dpa-Ra, D-Dpa-Ra, Trp-Ra, bhPhe-Ra, em que Ra é palmitoil-PEG-, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3, palmitoil- PEG-PEG, em que PEG é PEG11 ou miniPEG3, butanoil (C4)- PEG11-, octanoil(C8, caprílico)-PEG11-, palmitoil (C16)- PEG11-, ou tetracosanoil (C24, Lignocérico)-PEG11-; e A10, se presente, é Ida(NHPal)Ahx ou Ida(NBzl2)Ahx.

5. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: PR42’, PR47, PR48, PR49, PR50, PR51, PR52, PR53, PR56, PR57, PR58, PR59, PR60, PR61, PR63, PR65, PR66, PR67, PR68, PR69, PR70, PR71, PR72, PR73, PR74, e PR82, preferencialmente, PR47, PR48, PR49, PR50, PR51, PR52, PR53, PR56, PR57, PR58, PR59, PR60, PR61, PR63, PR65, PR66, PR67, PR68, PR69, PR70, PR71, PR72, PR73, PR74, e PR82.

6. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o peptídeo apresenta atividade hepcidina.

7. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o peptídeo se liga a ferroportina.

8. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Método para ligar uma ferroportina ou induzir internalização e degradação de ferroportina caracterizado pelo fato de que compreende contatar a ferroportina com pelo menos um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição conforme definida na reivindicação 8.

10. Método para tratar uma doença de metabolismo de ferro em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende administrar pelo menos um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição conforme definida na reivindicação 8 ao sujeito.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença de metabolismo de ferro é uma doença de sobrecarga de ferro.

12. Kit caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição conforme definida na reivindicação 8, embalados em conjunto com um reagente, um dispositivo, material de instrução ou uma combinação dos mesmos.

13. Complexo caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ligado a uma ferroportina ou um anticorpo.

14. Uso de um ou mais peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou da composição conforme definida na reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença de metabolismo de ferro e/ou abaixar a quantidade de ferro em um sujeito em necessidade do mesmo.

15. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença de metabolismo de ferro e/ou para abaixar a quantidade de ferro em um sujeito em necessidade do mesmo.

16. Uso de um ou mais peptídeos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou da composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença de metabolismo de ferro e/ou abaixar a quantidade de ferro em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o medicamento é preparado para ser administrado em uma dose diária eficaz como uma dose diária única ou em doses diárias divididas.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dose diária eficaz é de cerca de 10 a 500 µg/kg/dia e o medicamento é formulado para injeção subcutânea.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dose diária eficaz é de cerca de 10 a 1000 µg/kg/dia e o medicamento é formulado para administração oral, pulmonar ou por mucosa.