BR112014003311B1 - método para obtenção de uma célula vegetal, método de obtenção de uma planta, vetor - Google Patents

Abstract

TERMINADOR DE TRANSCRIÇÃO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE CÉLULA VEGETAL, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE PLANTA, VETOR, MÉTODO PARA REDUZIR EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, USO DE UM TERMINADOR DE TRANSCRIÇÃO PARA PRODUZIR UM ÁCIDO NUCLEICO E PARA PRODUZIR UMA PLANTA O documento provê métodos e materiais referentes aos terminadores de transcrição. Por exemplo, métodos e materiais referentes aos terminadores de transcrição e moléculas de ácido nucleico (por exemplo, vetores e construções) que contêm uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição são providos. Além disso, plantas, células vegetais, e sementes de plantas tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição são providas

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA APLICAÇÕES RELACIONADAS

[0001] Esta aplicação reivindica o beneficio do Pedido Provisório No. US61/523,012, depositado em 12 de agosto de 2011. A divulgação do pedido anterior é considerada parte da divulgação (e é incorporada por referência) deste pedido.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO 1. Campo Técnico

[0002] Este documento se refere a métodos e materiais envolvidos no terminador de transcrição. Por exemplo, este documento provê terminadores de transcrição que podem ser utilizados para terminar a transcrição de ácidos nucleicos exógenos inseridos em células vegetais.

2. Informações de Fundamento

[0003] Um das metas da agricultura moderna é a produção de plantas com fenótipos vantajosos, tais como resistência às doenças, resistência às pragas, resistência ao frio e à seca, aumento da produtividade e melhoria da nutrição. A geração de plantas com essas características reforçadas pode ser feita utilizando técnicas de engenharia genética modernas, incluindo a transformação de plantas com os transgenes envolvidos nestes processos. Desenvolver plantas modificadas com características reforçadas pode levar ao aumento da produtividade das culturas, bem como estabilidade de produção sob várias condições ambientais.

RESUMO

[0004] Este documento provê métodos e materiais referentes aos terminadores de transcrição. Por exemplo, este documento provê terminadores de transcrição e moléculas de ácido nucleico (por exemplo, vetores) que contêm uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição. Tais terminadores de transcrição podem ser utilizados para terminar a transcrição de um ácido nucleico exógeno. Este documento também provê plantas, células vegetais e sementes de planta que contêm moléculas de ácido nucleico que têm uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição. Ter a capacidade de utilizar os terminadores de transcrição aqui providos para terminar a transcrição de um ácido nucleico inserido em uma célula vegetal pode prevenir a transcrição inapropriada dos genes à jusante, permitir a reciclagem eficiente de polimerases de RNA, e reduzir a probabilidade de silenciamento do gene (ou seja, a inativaçao), ao inserir múltiplas moléculas de ácido nucleico. Os terminadores de transcrição aqui providos são derivados de uma espécie de planta, não como uma espécie bacteriana, reduzindo assim a dificuldade de obtenção de aprovação reguladora.

[0005] Em geral, um aspecto deste documento apresenta um terminador de transcrição isolado que consiste de uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência de nucleotideos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, e SEQ ID NO:5. O terminador de transcrição isolado pode ter pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição isolado pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição isolado pode ter pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição isolado pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição isolado pode ter pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição isolado pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição isolado pode ter pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição isolado pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição isolado pode ter pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. 0 terminador de transcrição isolado pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[0006] Em outro aspecto, este documento apresenta uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo, ou consistindo essencialmente de uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição, em que a sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao terminador de transcrição, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO:5. A molécula de ácido nucleico isolada pode ser um vetor. O terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 3. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 4. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[0007] Em outro aspecto, este documento apresenta uma célula veqetal que compreende uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo funcionalmente liqado a um terminador de transcrição, em que a sequência de nucleotideos que é heteróloqa em relação ao terminador de transcrição, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5. A célula vegetal pode ser uma canola, milho, algodão, Míscanthus, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba sacarina, girassol, gramineas ou célula vegetal de trigo. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 3. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 4. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. A sequência de nucleotideos e o terminador de transcrição podem estar localizados em uma molécula de ácido nucleico que não está integrada no genoma da célula vegetal. A sequência de nucleotideos e o terminador de transcrição podem estar localizados dentro do genoma da célula vegetal.

[0008] Em outro aspecto, este documento apresenta uma planta compreendendo uma célula vegetal que compreende uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição, em que a sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao terminador de transcrição, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5. A planta pode ser uma canola, milho, algodão, míscanthus, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba sacarina, girassol, gramineas, ou trigo. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:5.

[0009] Em outro aspecto, este documento apresenta uma semente compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a urn terminador de transcrição, em que a sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao terminador de transcrição, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO:5. A semente pode ser uma canola, milho, algodão, míscanthus, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba sacarina, girassol, gramineas ou semente de trigo. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO: 3. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:5.

[0010] Em outro aspecto, este documento apresenta um vetor que compreende, ou consiste essencialmente de, uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição, em que a sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao terminador de transcrição, e em que a o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO: 5.

[0011] Em outro aspecto, este documento apresenta uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo, ou consistindo essencialmente de, uma direção de 5' para 3' , pelo menos, uma porção de uma sequência de ácido nucleico de uma planta a ser silenciada, seguido por uma sequência de terminador anti-sentido (antisense), seguido por uma sequência de ciclo, seguido de um terminador de transcrição, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5. A porção da sequência de ácido nucleico de uma planta a ser silenciada pode estar entre cerca de 50 e cerca de 150 nucleotideos de comprimento. A sequência de terminador anti-sentido (antisense) pode compreender a sequência complementar inversa da sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. A sequência de ciclo pode estar entre cerca de 60 e cerca de 70 nucleotideos de comprimento.

[0012] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para reduzir a expressão de um polipeptídeo de planta endógena dentro de uma planta. 0 método compreende, ou consiste essencialmente de, inserir uma molécula de ácido nucleico na planta, em que a molécula de ácido nucleico compreende, ou consiste essencialmente de, uma direção de 5' para 3', pelo menos uma porção de uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo de planta seguido por uma sequência de terminador anti-sentido (antisense), seguido por uma sequência de ciclo, seguido por um terminador de transcrição, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO: 5. A porção da sequência de ácido nucleico de uma planta a ser silenciada pode estar entre cerca de 50 e cerca de 150 nucleotideos de comprimento. A sequência anti-sentido (antisense) pode compreender a sequência complementar inversa da sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. A sequência do ciclo pode estar entre cerca de 60 e cerca de 70 nucleotideos de comprimento.

[0013] Em outro aspecto, este documento apresenta a utilização de um terminador de transcrição para produzir um ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo e que termina a transcrição da sequência de ácido nucleico a jusante da sequência de ácido nucleico, em que o terminador de transcrição é heterólogo em relação à sequência de ácido nucleico e está localizado a jusante da sequência de ácido nucleico, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5. O terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. O terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2. O terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 3. O terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. O terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[0014] Em um outro aspecto, este documento exibe a utilização de um terminador de transcrição para produzir um ácido nucleico para terminar transcrição de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo dentro de uma planta, em que o ácido nucleico compreende o terminador de transcrição e a sequência de ácido nucleico, em que o terminador de transcrição é heterólogo em relação à sequência de ácido nucleico e está localizado a jusante da sequência de ácido nucleico, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO:5. A planta pode ser uma canola, milho, algodão, Miscanthus, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba sacarina, girassol, gramineas, ou planta de trigo. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO 4. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos possuindo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO:5.

[0015] Em outro aspecto, este documento apresenta a utilização de um terminador de transcrição para produzir uma planta que compreende um ácido nucleico exógeno, o ácido nucleico exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo e que termina a transcrição da sequência de ácido nucleico a jusante da sequência de ácido nucleico, em que o terminador de transcrição é heterólogo em relação à sequência de ácido nucleico e está localizado a jusante da sequência de ácido nucleico, e em que o terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5. A planta pode ser uma canola, milho, algodão, míscanthus, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba sacarina, girassol, gramineas, ou planta de trigo. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO:1. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:2. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:3. 0 de terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 3. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:4. 0 terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 4. 0 terminador de transcrição pode compreender uma sequência de nucleotideos tendo pelo menos 99% de identidade em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO:5. O terminador de transcrição pode compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 5.

[0016] Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendido ao que diz respeito esta invenção por qualquer um versado na técnica. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados para praticar a invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições irão controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Em alguns casos, os aspectos da invenção podem consistir essencialmente de tal aspecto, em vez de compreender tal aspecto. Os titulos das seções são providos por simples conveniência. A palavra "que compreende" nas reivindicações pode ser substituída por "que consiste essencialmente de" ou por "que consiste de", de acordo com a prática padrão na lei de patentes.

[0017] DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0018] A Figura 1 representa um vetor que pode ser utilizado para confirmar a eficácia de um terminador de transcrição para terminar transcrição.

[0019] DESCRIÇÃO DETALHADA

[0020] Este documento provê métodos e materiais relacionados aos terminadores de transcrição. Por exemplo, o presente documento provê terminadores de transcrição e moléculas de ácido nucleico (por exemplo, vetores) que contêm uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição.

[0021] Em geral, os terminadores de transcrição podem ser posicionados dentro da região da borda 3' de um transgene e prover terminação de transcrição eficiente e adição de uma cauda poli-A ao transcrito de RNA para a sintese de mRNA maduro. Tal como aqui descrito, um terminador de transcrição tendo a sequência estabelecida em SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4, ou 5 pode ser utilizado para terminar a transcrição de um ácido nucleico a montante que codifica um polipeptídeo.

Definições

[0022] "Amino ácido" se refere a um dos vinte aminoácidos existentes biologicamente e a aminoácidos sintéticos, incluindo a D/L isómeros óticos.

[0023] "Célula promotora do tipo preferencial" ou "promotor de tecido preferencial" se refere a um promotor que dirige a expressão de preferência em um tipo de célula ou tecido alvo, respectivamente, mas também pode levar a alguma transcrição em outros tipos de células ou tecidos também.

[0024] "Exógeno" em relação a um ácido nucleico indica que o ácido nucleico é

[0025] parte de uma construção de ácido nucleico recombinante, ou não está no seu ambiente natural. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode ser uma sequência de alguma espécie introduzida em outra espécie, ou seja, um ácido nucleico heterólogo. Tipicamente, tal ácido nucleico exógeno é introduzido em outra espécie por meio de uma construção de ácido nucleico recombinante. Um ácido nucleico exógeno também pode ser uma sequência que é nativa para um organismo e que foi reintroduzido em células desse organismo. Um ácido nucleico exógeno que inclui uma sequência nativa pode frequentemente ser distinguido da sequência que ocorre naturalmente pela presença de sequências que não são naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas flanqueando uma sequência nativa em uma construção de ácido nucleico recombinante. Além disso, ácidos nucleicos exógenos estavelmente transformados são tipicamente integrados em posições diferentes onde a sequência nativa é encontrada. Será reconhecido que um ácido nucleico exógeno pode ter sido introduzido em um progenitor e não na célula em questão. Por exemplo, uma planta transgénica que contém um ácido nucleico exógeno pode ser da progénie de um cruzamento entre uma planta estavelmente transformada e uma planta que não é transgénica. Tais progénies são consideradas por conter o ácido nucleico exógeno.

[0026] "Expressão" se refere ao processo de conversão de informação genética de um polinucleotideo no RNA através de transcrição, que é catalisada por uma enzima, a RNA polimerase e, em proteina, através de tradução de mRNA nos ribossomos.

[0027] "Polipeptideo heterólogo", como aqui utilizado se refere a um polipeptideo que não é um polipeptideo que ocorre naturalmente em uma célula vegetal, por exemplo, uma planta Panicum virgatum transgénica transformada com e expressando a sequência de codificação para um polipeptideo transportador de nitrogênio a partir de uma planta Zea mays.

[0028] "Ácido nucleico isolado", como aqui utilizado, inclui um ácido nucleico que ocorre naturalmente, desde que uma ou ambas as sequências que flanqueiam imediatamente esse ácido nucleico no seu genoma que ocorre naturalmente estejam removidas ou ausentes. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, um ácido nucleico que existe como uma molécula purificada ou uma molécula de ácido nucleico que é incorporado em um vetor ou um virus. Um ácido nucleico existente entre as centenas de milhões de outros ácidos nucleicos dentro de, por exemplo, bibliotecas de cDNA, de bibliotecas genômica, ou fatias de gel contendo um análogo da restrição de DNA genômico, não deve ser considerado um ácido nucleico isolado.

[0029] "Ácido nucleico" e "polinucleotideo" são aqui utilizados indiscriminadamente, e se referem a ambos RNA e DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, DNA sintético, e DNA ou RNA contendo os análogos de ácidos nucleicos. Um ácido nucleico pode ser de fita dupla ou de fita simples (ou seja, uma fita no sentido (sense) ou uma fita anti-sentido (antisense)) . Exemplos não limitativos de polinucleotideo incluem genes, fragmentos de genes, exons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, siRNA, micro-RNA, ribozimas, cDNA, polinucleotideos recombinantes, polinucleotideos ramificados, as sondas de ácidos nucleicos e iniciadores de ácido nucleico. Um polinucleotideo pode conter nucleotideos não convencionais ou modificados.

[0030] "Funcionalmente ligado" se refere ao posicionamento de uma região regulatória (por exemplo, um terminador de transcrição que é aqui provido) dentro de uma sequência de ácido nucleico em relação à região de codificação de um ácido nucleico, de tal modo que a região regulatória tenha efeito na estabilidade ou transcrição desse ácido nucleico. Por exemplo, uma região regulatória pode ser um promotor ou potencializador posicionado a montante da região codificadora de um gene que aumenta a transcrição do gene. Um promotor ou potencializador pode ser posicionado, tanto quanto cerca de 5000 nucleotideos a montante do local de iniciação da tradução, ou cerca de 2000 nucleotideos a montante do local de inicio da transcrição. Por exemplo, para ligar funcionalmente uma sequência de codificação e uma região reguladora, o local de iniciação da tradução do quadro de leitura translacional da sequência de codificação é tipicamente posicionado entre um e cerca de 50 nucleotideos a jusante da região reguladora. A região reguladora pode ser também um terminador de transcrição, que é posicionado a jusante da região codificadora de um ácido nucleico. Por exemplo, um terminador de transcrição pode ser posicionado dentro do 3'UTR de um gene e pode acionar o término de transcrição desse gene.

[0031] "Polipeptídeo" tal como aqui utilizado se refere a um composto de dois ou mais amino ácidos da subunidade, análogos de aminoácidos ou outros peptidomiméticos, independentemente da modificação pós-tradução, por exemplo, fosforilação ou glicosilação. As subunidades podem estar ligadas por ligações peptidicas ou outras ligações, tais como, por exemplo, éster ou ligações de éter. Polipeptideos de corpo inteiro, polipeptideos truncados, mutantes pontuais, mutantes de inserção, splicing alternativo, proteínas quiméricas, e fragmentos dos mesmos são englobados por esta definição.

[0032] "Progénie" inclui descendentes de uma linha de planta ou planta em particular. Progénie de uma planta instantânea inclui sementes formadas em Fi, F2, F3, F4, F5, Fe e posterior geração de plantas, ou sementes formadas em BCi, BC2, BC3 e posterior geração de plantas, ou sementes formadas em F1BC1, F1BC2, F1BC3 e posterior geração de plantas. A designação Fi se refere a progénie de um cruzamento entre dois progenitores que são geneticamente distintos. As designações F2, F3, F4, Fs e Fç se referem a posteriores gerações de autopolinização ou progénie de irmãos de uma planta Fi.

[0033] "Região reguladora" se refere a um ácido nucleico com sequências de nucleotideos que influenciam a transcrição ou de iniciação de tradução ou taxa, ou a estabilidade e/ou mobilidade de um produto de transcrição ou tradução. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências de reforço, elementos de resposta, sitios de reconhecimento de proteína, elementos induziveis, sequências de ligação de proteínas, regiões não traduzidas (UTRs) 5'e 3', sitios de iniciação de transcrição, sequências de terminador de transcrição, sequências de poliadenilação, introns, e suas combinações. A região reguladora compreende tipicamente pelo menos um promotor de núcleo (basal). A região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência de reforço, um elemento a montante ou um região de ativação a montante (UAR). Por exemplo, um reforço adequado é um elemento cis-regulador (-212 a -154) da região a montante da octopina sintase (ocs) de genes. From et al., The Plant Cell, 1 : 977-984 (1989) .

[0034] "Transgene" como aqui utilizado se refere a qualquer sequência de ácido nucleico que é introduzido no genoma de uma célula de manipulação experimental. Um transgene pode ser uma "sequência de DNA endógeno" ou uma "sequência de DNA heterólogo" (ou seja, "DNA estranho"). O termo "sequência de DNA endógeno" se refere a uma sequência de nucleotideos que se encontra naturalmente na célula na qual é transformado, desde que ele não contenha algumas modificações (por exemplo, um ponto de mutação, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) em relação à sequência que ocorre naturalmente. 0 termo "sequência de DNA heterólogo" se refere a uma sequência de nucleotideos que é funcionalmente ligada para, ou é manipulada para se tornar funcionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico, ao qual não é funcionalmente ligada na natureza, ou ao que é funcionalmente ligada a uma diferente localização na natureza. DNA heterólogo não é endógeno em relação à célula na qual é transformado, mas sim obtido a partir de outra célula. DNA heterólogo também inclui uma sequência de DNA endógeno que contém algumas modificações. Geralmente, embora não seja necessário, o DNA heterólogo codifica RNA e proteínas que não são normalmente produzidas pela célula em que é transformado. Exemplos de DNA heterólogo incluem genes repórter, sequências reguladoras da transcrição e tradução, terminadores de transcrição, proteínas marcadoras selecionáveis (por exemplo, proteínas que conferem resistência aos medicamentos), etc.

[0035] "Vetor" se refere a uma replicon, tal como um plasmideo (por exemplo, T-DNA), fago, ou cosmideo, no qual outro segmento de DNA pode ser inserido, de modo a provocar a replicação do segmento inserido. Geralmente, um vetor é capaz de replicação quando associado com os elementos de controle devidos. O termo "vetor" inclui vetores de clonagem e de expressão, assim como vetores virais e vetores de integração. Um "vetor de expressão" é um vetor que inclui uma região reguladora.

Terminadores de Transcrição

[0036] Os terminadores de transcrição aqui providos podem ser utilizados para facilitar a cessação de transcrição de um transcrito (por exemplo, um transcrito de mRNA). Exemplos de terminadores da transcrição incluem, sem limitação, os terminadores de transcrição tendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. Em alguns casos, um terminador de transcrição aqui provido pode ter uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) de identidade de sequência em relação à sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. Por exemplo, um terminador de transcrição aqui provido pode ter a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5, com um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais adições de nucleotideos, deleções, substituições, ou combinações dos mesmos.

[0037] Porcentagem de identidade de sequência se refere ao grau de identidade de sequência entre qualquer sequência de referência dada, por exemplo, SEQ ID NO:1 ou porção da mesma, e uma sequência candidata. Uma sequência candidata tipicamente tem um comprimento que é de 80% a 200% do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 2 00 por cento do comprimento da sequência de referência. Uma identidade de porcentagem de qualquer ácido nucleico candidato referente a um ácido nucleico de referência pode ser determinada como a seguir. Uma sequência de referência (por exemplo, um sequência de ácido nucleico) é alinhada com uma ou mais sequências candidatas utilizando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros padronizados), o que permite alinhamentos de sequências de ácidos nucleicos serem conduzidos ao longo de todo o seu comprimento (alinhamento global). Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31 (13):3497-500 (2003).

[0038] ClustalW calcula a melhor equiparação entre uma referência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinha para que identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. Lacunas de um ou mais residues podem ser inseridos em uma sequência de referência, uma sequência candidata, ou ambos, para maximizar os alinhamentos da sequência. Para rápido alinhamento emparelhado de sequências de ácidos nucleicos, os seguintes parâmetros padronizados são utilizados: tamanho da palavra: 2; tamanho da janela: 4; método de pontuação: porcentagem, número de diagonais superiores: 4; e penalidade para lacuna: 5. Para o alinhamento múltiplo de sequências de ácidos nucleicos, os seguintes parâmetros são utilizados: penalidade para abertura de lacuna: 10.0; penalidade para extensão de lacuna: 5.0, e transições de peso: sim. O resultado de ClustalW é um alinhamento de sequência que reflete a relação entre as sequências. ClustalW pode ser executado, por exemplo, no seu website na World Wide Web, Baylor College of Medicine (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) e no website do Instituto de Bioinformática da Europa na World Wide Web (ebi.ac.uk/ClustalW) . Para determinar a identidade de porcentagem de uma sequência de ácido nucleico candidata em relação à sequência de referência, as sequências são alinhadas utilizando ClustalW, o número de equiparações idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência, e o resultado é multiplicado por 100. Deve notar-se que o valor da porcentagem de identidade pode ser arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 78.11, 78.12, 78.13, 78.14 e são arredondados para baixo para 78,1, enquanto 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 78.19 e são arredondados para 78,2.

[0039] Em alguns casos, um terminador de transcrição pode ser obtido utilizando a sintese de DNA ou reação em cadeia da polimerase (PCR). PCR se refere a um procedimento ou técnica em que os ácidos nucleicos alvos são amplificados a partir de um molde de ácido nucleico, incluindo DNA e RNA. Por exemplo, a PCR pode ser utilizada para se obter cópias de ácido nucleico da sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. Vários métodos de PCR são descritos, por exemplo, em PCR Primer:A Laboratory Manual, Dieffenbach, C. & Dveksler, G., Eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Geralmente, a informação de sequência das bordas da região de interesse ou além é empregada para projetar iniciadores oligonucleotideos que são idênticos ou similares em sequência a fitas opostas do molde a ser amplificado.

[0040] Várias estratégias de PCR também estão disponíveis através das quais modificações na sequência de nucleotideos de local especifico podem ser introduzidas em um molde de ácido nucleico. Os métodos anteriormente mencionados para calcular a identidade de porcentagem podem ser utilizados juntamente com a PCR para criar variantes de moldes de ácidos nucleicos. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 ou mais alterações de nucleotideos podem ser introduzidos na sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5. Em alguns casos, um terminador de transcrição aqui provido pode ser obtido utilizando técnicas de amplificação (por exemplo, PCR) projetadas para amplificar sequências a partir de um gene da metalotioneina 2b, urn gene da proteina ribossomal L8, um gene da ribulose-bifosfato- carboxilase, um gene do complexo de citocromo b6f, ou gene do fator de alongamento alfa 1 de planta. Em alguns casos, os terminadores da transcrição podem ser obtidos a partir de outros genes de plantas, genes de plantas que não são de Arabidopsis thalíana, ou a partir de genes de organismos que não são plantas. Por exemplo, um terminador de transcrição pode ser obtido a partir do gene do fator de alongamento alfa Ide uma planta sorgo.

[0041] Um terminador de transcrição pode ser testado para confirmar sua eficácia para terminar transcrição em células vegetais utilizando, por exemplo, métodos similares àqueles descritos no Exemplo 2. Por exemplo, um terminador de transcrição pode ser inserido a jusante de um gene repórter e a montante de um terminador de transcrição conhecido (por exemplo, um terminador de transcrição de NOS), para formar uma construção que pode ser transformada em células vegetais. Após um periodo de crescimento, as transcrições podem ser isoladas e sequenciadas para determinar se cessação ocorreu na sequência do terminador de transcrição sendo avaliado, ou fora dessa sequência (por exemplo, dentro do terminador de transcrição conhecido) (Figura 1).

[0042] Em alguns casos, um terminador de transcrição aqui provido pode ser utilizado para terminar a transcrição de um transgene em uma planta, tendo dois ou mais transgenes. Em alguns casos, um ou mais dos terminadores de transcrição aqui providos podem ser utilizados para terminar a transcrição de um transgene em uma planta contendo múltiplos transgenes diferentes, em uma maneira onde a transcrição de cada transgene é terminada por diferentes terminadores de transcrição. Por exemplo, a transcrição de um primeiro transgene dentro de uma planta pode ser terminada utilizando um terminador de transcrição tendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1 e a transcrição de um segundo transgene dentro dessa planta pode ser terminada utilizando um terminador de transcrição tendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2. A utilização de um terminador de transcrição diferente para cada transgene dentro de uma planta pode minimizar o risco de acionar o silenciamento de cada transgene, ou seja, silenciamento cruzado inadvertido, que pode ocorrer quando o mesmo terminador de transcrição é utilizado para múltiplos transgenes.

[0043] A expressão de uma sequência desejada pode ser reduzida utilizando técnicas de interferência de RNA ou silenciamento de gene. Em alguns casos, um terminador de transcrição aqui provido pode ser utilizado em métodos e materiais para induzir a interferência de RNA ou silenciamento de gene. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser projetada para incluir, em uma direção de 5' a 3' uma sequência de ácido nucleico introduzida, que corresponde tipicamente a sequência endogenamente expressa de uma planta ou a uma sequência de agente patogênico, e que pode estar em orientação no sentido (sense) ou anti-sentido (antisense) seguido por uma sequência de terminador anti-sentido (antisense), seguido por um sequência de ciclo, e seguido pela sequência no sentido (sense) do terminador de transcrição.

[0044] A sequência introduzida não necessita ser de comprimento total em relação tanto ao produto de transcrição de mRNA primário quanto ao mRNA totalmente processado destinado a ser silenciado. Geralmente, maior identidade pode ser utilizada para compensar a utilização de uma sequência mais curta. Em algumas modalidades, a sequência alvo é uma região de codificação, uma região 5' não traduzida, ou uma região 3' não traduzida do gene alvo para a regulação negativa. Em algumas modalidades, a sequência introduzida pode incluir um códon de terminação prematuro, que inibe a tradução da sequência expressa. A sequência introduzida não necessita de ter o mesmo padrão de intron ou éxon como o gene natural e identidade de segmentos não codificadores podem ser eficazes. Uma sequência introduzida pode ter um comprimento de pelo menos cerca de 25 nucleotideos, às vezes uma sequência de comprimento de cerca de 25 a cerca de 50 nucleotideos, às vezes uma sequência de comprimento de cerca de 50 a cerca de 100 nucleotideos, às vezes uma sequência de comprimento de cerca de 150 a cerca de 200 nucleotideos, às vezes uma sequência de comprimento de cerca de 200 a cerca 500, e às vezes uma sequência de comprimento de cerca de 500 a cerca de 1000 ou mais nucleotideos, até a uma molécula que corresponde em tamanho a um gene de comprimento total como alvo para silenciar.

[0045] Quaisquer sequências de terminador anti-sentido (antisense) adequadas podem ser utilizadas em combinação com um terminador de transcrição correspondente aqui provido para induzir interferência de RNA ou silenciamento de genes dentro de uma planta. Em geral, uma sequência de terminador anti-sentido (antisense) se refere a uma sequência de ácido nucleico que é o complemento inverso de uma sequência do terminador de transcrição (ou seja, sequência de terminador no sentido) . Por exemplo, uma sequência de terminador no sentido (sense) inverso pode ter uma sequência que é o complemento inverso de um terminador de transcrição aqui provido. Como os versados na técnica constatam, a sequência de terminador anti-sentido (antisense) não necessita abranger todo o comprimento da sequência no sentido, desde que mantenham a capacidade para formar uma estrutura de caule de RNA de fita dupla. Sequências de terminador de transcrição anti-sentido (antisense) e no sentido podem ser incluídas na mesma molécula de ácido nucleico e pode ser separado por uma sequência de ligação (por exemplo, uma sequência de ciclo). Um DNA de terminador de transcrição no sentido de fita única ou molécula de RNA podem hibridizar com o seu correspondente DNA de terminador de transcrição anti-sentido (antisense) de fita única ou molécula de RNA para formar uma repetição invertida fita dupla. Exemplos de sequências de terminador anti-sentido (antisense) incluem, sem limitação, o complemento inverso da SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. Em alguns casos, sequências de um terminador anti-sentido (antisense) podem ser posicionadas 3' da sequência de ácido nucleico de uma planta a ser silenciada (por exemplo, entre cerca de 1 a cerca de 100 nucleotideos 3' da sequência de ácido nucleico de uma planta a ser silenciada) e 5' de uma sequência de ciclo.

[0046] Qualquer sequência de ciclo apropriado pode ser utilizada em combinação com um terminador de transcrição aqui provido para induzir interferência de RNA ou silenciamento de genes dentro de uma planta. Em geral, uma sequência de ciclo (ou seja, ciclo de caule ou ciclo de hairpin) se refere a uma sequência em que duas regiões dentro de uma única molécula de DNA ou RNA que são complementos inversos de cada um separados por uma região não complementar, de tal modo que as regiões complementares hibridizam e formam um "caule", enquanto que a região não complementar forma um "ciclo". Em alguns casos, uma sequência de ciclo pode ser de cerca de 15 a cerca de 200 nucleotideos de comprimento, mais preferencialmente entre 20 e 100 nucleotideos de comprimento, e pode estar entre 60 e 70 nucleotideos de comprimento, e posicionada a 3' de uma sequência de terminador anti-sentido (antisense) e a 5' de um terminador de transcrição aqui provido. Em alguns casos, uma sequência de ciclo pode ser de cerca de 67 nucleotideos de comprimento. Exemplos de vetores e moléculas de ácido nucleico que podem ser projetados incluem um terminador de transcrição aqui provido para induzir interferência de RNA ou silenciamento de gene que incluem, sem limitação, esses vetores e as moléculas de ácido nucleico, descrito na Patente No. US7.109.393.

Moléculas de Ácido Nucleico

[0047] Este documento também provê moléculas de ácido nucleico possuindo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição. Conforme aqui provido, o polipeptideo codificado pela sequência de ácido nucleico pode ser, sem limitação, um polipeptideo repórter, um polipeptideo de enzima, um polipeptideo receptor, ligante de um polipeptideo, um polipeptideo de membrana, um polipeptideo estrutural, ou um polipeptideo nuclear. Em alguns casos, o polipeptideo pode ser um polipeptideo de planta. Por exemplo, o polipeptideo pode ser um polipeptideo que ocorre naturalmente no milho, sorgo, girassol, gramineas, miscanthus, arroz, centeio, trigo ou plantas. Em alguns casos, o polipeptideo pode ser um polipeptideo que não é vegetal. Por exemplo, o polipeptideo pode ser um polipeptideo que ocorre naturalmente em um organismo que não é vegetal (por exemplo, um organismo bacteriano). Em alguns casos, o polipeptideo pode ser um polipeptideo endógeno, com relação a uma planta, célula vegetal, semente de planta, ou uma semente de planta que é construída para conter o ácido nucleico que codifica esse polipeptideo endógeno. Por exemplo, o polipeptideo pode ser um polipeptideo que é naturalmente encontrado dentro da planta na qual uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo é inserida. Em alguns casos, o polipeptideo pode ser um polipeptideo exógeno com relação à respeito a uma planta, célula vegetal, semente de planta, ou que é construído para conter o ácido nucleico que codifica esse polipeptideo exógeno. Por exemplo, o polipeptideo pode ser um polipeptideo que não é naturalmente encontrado dentro da planta na qual uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo é inserida. Exemplos de sequências de ácidos nucleicos exógenos que podem ser utilizados nos métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, as sequências que codificam genes ou fragmentos que modulam a tolerância ao frio, a tolerância geada, tolerância ao calor, tolerância à seca, a eficiência utilizada da água, eficiência de utilização de nitrogênio, resistência a pragas, resistência a herbicidas, biomassa, composição quimica, arquitetura da planta, propriedades de conversão biopower e/ou conversão de propriedades de biocombustiveis. Em particular, sequências de exemplos são descritos nos seguintes pedidos são aqui incorporados por referência na suas totalidades: W02010/033564 , WO2011/011412, PCT/US2011/035345, WO2011/044254, US61/407,280, US20080131581, US20080072340, US20070277269, US20070214517, US20070192907, US20070174936, US20070101460, US20070094750, US20070083953, US20070061914, US20070039067, US20070006346, US20070006345, US20060294622, US20060195943, US20060168696, US20060150285, US20060143729, US20060134786, US20060112454, US20060057724, US20060010518, US20050229270, US20050223434, e US20030217388 .

[0048] Em alguns casos, as moléculas de ácido nucleico tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição aqui provido pode estar na forma de um vetor. Em adição à sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo e o terminador de transcrição, um vetor pode conter uma sequência maior que serve como a espinha dorsal do vetor. Espinhas dorsais de vetor adequadas incluem, por exemplo, os utilizados rotineiramente na técnica, tais como plasmideos, T-DNAs, virus, cromossomos artificiais, BACs, YACs ou PACs. Vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmideos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófago, baculovirus, e retrovirus. Numerosos vetores e sistemas de expressão são comercialmente disponíveis a partir de tais empresas como Novagen ® (Madison, WI), Clontech ® (Paio Alto, CA), Stratagene ® (La Jolla, CA), e Invitrogen/Life Technologies ® (Carlsbad, CA).

[0049] Em alguns casos, um vetor aqui provido pode incluir, por exemplo, uma origem de replicação, uma região de associação com a matriz nuclear (SARs), e/ou um marcador. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável à célula vegetal. Por exemplo, um marcador pode conferir resistência a biocidas, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina, ou higromicina), ou um herbicida (por exemplo, glifosato, glufosinato, clorsulfurona ou fosfinotricina). Além disso, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de marcação projetada para facilitar a manipulação ou a detecção (por exemplo, purificação ou localização) de um polipeptideo expresso. Sequências de marcação, tais como sequências luciferase, β-glucuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S-transferase (GST), poli-histidina, c-myc, hemaglutinina, ou Flag™ tag (Kodak, New Haven, CT) são tipicamente expressas como uma fusão com o polipeptideo codificado. Tais marcações podem ser inseridas em qualquer lugar dentro do polipeptideo, incluindo tanto no terminal carboxilo ou amino.

[0050] Em alguns casos, uma molécula de ácido nucleico aqui provido pode ser configurada como um sistema de vetor binário comumente utilizado para transgênese em plantas. Tais vetores binários podem incluir (além do T-DNA desarmado, com suas sequências de região), sequências procarióticas, tanto para a replicação em Agrobacterium quanto E. coli. É uma vantagem da transformação mediada por Agrobacterium, que, em geral, apenas o DNA flanqueado pelas regiões é transferido para o genoma e que, preferencialmente, apenas uma copa é inserida. Descrições de sistemas vetoriais Agrobacterium e métodos para a transferência de genes mediada por Agrobacterium são conhecidos na técnica. Ver Miki et al. , "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods In Plant Molecular Biology And Biotechnology: pg. 67-88 (1993); Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238-242 (1989) . A utilização de T-DNA para a transformação de células vegetais tem sido estudado e descrito de intensivamente. Ver Fraley et al. , CRC Crit. Rev. Plant. Sei, 4:145 (1985). Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais estão comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., USA).

[0051] Para a transformação mediada por Agrobacterium, uma construção de rastreamento pode ser integrada em um vetor de rastreamento ou uma construção de rastreamento pode consistir de plasmideos específicos, tais como vetores bidirecionais ou intermediários ou vetores binários. Vetores binários são geralmente preferenciais em relação a outros sistemas de vetores. Os vetores binários são capazes de replicação tanto em E. coii quanto em Agrobacterium. Elas podem compreender, por exemplo, um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante flanqueado pela sequência da região direita e esquerda do T-DNA. Eles podem ser transferidos diretamente para Agrobacterium. Ver Holsters

[0052] et al. , Mol. Gen Genet, 163:181-187 (1978). O gene marcador de seleção permite a seleção do Agrobacterium transformado e é, por exemplo, o gene NPT 11, o qual confere resistência à canamicina. Um Agrobacterium transformado deste modo pode ser utilizado para a transformação de células vegetais. A utilização de T-DNA para a transformação de células vegetais tem sido estudada e descrita intensamente. Ver Hoekema, "O sistema de Vetor binário para plantas", Offsetdrukkerij Kanters B. V, Alblasserdam, Capitulo V (1985) .

[0053] Vetores binários comuns com base em plasmideos "broad host range" como pRK252, pTJS75, ou vetores derivados do plasmideo RK2 do tipo P. A maioria destes vetores são derivados de pBIN19. Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais estão comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN 19 (Clontech Laboratories, Inc., EUA). Vetores adicionais foram melhorados em relação ao tamanho e manuseio (por exemplo, pPZP) . Ver Watson et al, EMBO J 4 (2) :277-284 (1985); Bevan et al, Nucl Acid Res. 12, 8711-8720 (1984). Sistemas de vetores melhorados são também descritos em WO 02/00900 .

[0054] Em alguns casos, a cepa de Agrobacterium utilizada para transformar o tecido de planta précultivado com o composto fenólico de plantas contém um plasmideo Ti do tipo octopina, preferencialmente desarmado, tais como pAL4404. Geralmente, quando se usa plasmideos Ti do tipo octopina ou plasmideos auxiliares, é preferencial que o gene virF seja deletado ou inativado. Em alguns casos, as cepas de Agrobacterium em particular podem ser utilizadas para aumentar ainda a eficiência de transformação, tais como cepas de Agrobacterium em que a expressão e/ou a indução do gene vir do mesmo é alterada devido à presença de genes mutantes ou virA quiméricos ou virG. Ver Chen e Winans, J. Bacteriol. 173:1139-1144 (1991); Hansen et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7603-7607 (1994).

[0055] Um vetor binário ou qualquer outro vetor pode ser modificado por técnicas de recombinação de DNA comuns, multiplicados em E. coli, e introduzido na Agrobacterium por eletroporação ou outras técnicas de transformação. Ver Mozo & Hooykaas, Plant Mol. Biol. 16:917-918 (1991). Agrobacterium pode ser cultivado e utilizado tal como descrito na técnica O vetor que compreende cepa de Agrobacterium pode ser, por exemplo, cultivado durante três dias com meio YP (5 g/L extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 5 g/L Nail, de 15 g/L ágar, pH 6,8) suplementado com o antibiótico apropriado (por exemplo, 50 mg/L espectinomicina). As bactérias podem ser coletadas com um ciclo do meio sólido e resuspensas.

[0056] Após a construção de um vetor, o vetor pode ser propagado em uma célula hospedeira para sintetizar moléculas de ácido nucleico para a geração de um polinucleotideo. Vetores, frequentemente referidos como "vetores bidirecionais", são capazes de se replicar em pelo menos dois sistemas de expressão independentes. Para facilitar tal replicação, o vetor deve ter pelo menos duas origens da replicação, uma eficaz em cada sistema de replicação. Tipicamente, vetores de bidirecionais são capazes de se replicar em um sistema eucariota e um sistema procariota. Isto possibilita a detecção de expressão de proteína em hospedeiros eucariotas, o "tipo de célula de expressão", e a amplificação do vetor nos hospedeiros procariotas, o "tipo de célula de amplificação". A titulo de ilustração, uma origem de replicação pode ser derivada de SV40, enquanto uma outra origem de replicação pode ser derivado a partir de pBR322. Aqueles versados na técnica conhecem numerosas origens de replicação adequadas.

[0057] Após a construção de um vetor, o vetor é tipicamente propagado em uma célula hospedeira. A propagação do vetor pode ser convenientemente conduzida em uma célula hospedeira procariótica, tal como, E. coli ou Bacillus subtilis. Cepas adequadas de E. coli incluem BL21 (DE3), BL21 (DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DB2, DB3.1, DH1, DH4I, DHS, DHSI, DHSIF, DHSIMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, 15 JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451,e ER1647 (Ver, por exemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax, Academic Press (1991)). Cepas adequadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, M1119, M1120, e B170. As técnicas- padrão para vetores de propagação em hospedeiros procarióticos são bem conhecidas dos versados na técnica. Ver Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., John Wiley & Sons, Inc. (1995).

[0058] As moléculas de ácido nucleico e vetores aqui providos, bem como construções tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição podem ser construídas para incluir qualquer região reguladora adicional apropriada. Tais moléculas, vetores e construções tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição podem ser inseridas em células vegetais, tal como aqui descrito. A escolha das regiões reguladoras a serem incluídas pode depender de vários fatores, incluindo, mas não limitado a, eficiência, seletividade, indutibilidade, nivel de expressão desejado, e expressão de célula ou tecido preferencial. A expressão de uma sequência de codificação pode ser modulada ao selecionar e posicionar aproximadamente as regiões reguladoras tais como promotores e reforços relativos à sequência de codificação.

[0059] Algumas regiões reguladoras adequadas iniciam a transcrição apenas, ou predominantemente, em certos tipos de células. Os métodos para a identificação e caracterização de regiões de regulatórias no DNA genômico da planta são conhecidos, incluindo, por exemplo, aqueles descritos nas seguintes referências Jordano et al. , Plant Cell, 1:855-866 (1989); Bustos et al., Plant Cell, 1:839-854 (1989); Green et al., EMBO J., 7:4035-4044 (1988);. Meier et al., Plant Cell, 3:309-316 (1991); e Zhang et al., Plant Physiology, 110:1069-1079 (1996).

[0060] Exemplos de várias classes de regiões reguladoras são descritos abaixo. Alguns das regiões reguladoras indicadas abaixo, bem como regiões reguladoras adicionais estão descritas em mais detalhes nos Pedidos de Patentes com Nos. de Série: US: 60/505, 689; 60/518, 075; 60/544, 771; 60/558, 869; 60/583, 691; 60/619, 181; 60/637, 140; 60/757, 544; 60/776, 307; 10/957, 569, 11/058, 689; 11/172, 703; 11/208, 308; 11/274, 890; 60/583, 609; 60/612, 891, 11/097, 589; 11/233, 726; 11/408, 791, 11/414 142; 10/950, 321; 11/360, 017; PCT/US05/011105; PCT/US05/23639; PCT/US05/034308; PCT/US05/034343, e PCT/US06/038236; PCT/US06/040572, e PCT/US07/62762.

[0061] Por exemplo, as sequências de regiões reguladoras P326, YP0144, YP0190, pl3879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0128, YP0275, PT0660, PT0683, PT0758, PT0613, PT0672, PT0688, PT0837, YP0092, PT0676, PT0708, YP0396, YP0007, YP0111, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120, YP0374, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0137, YP0285, YP0212, YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879, PT0740, PT0535, PT0668, PT0886, PT0585, YP0381, YP0337, PT0710, YP0356, YP0385, YP0384, YP0286, YP0377, PD1367, PT0863, PT0829, PT0665, PT0678, YP0086, YP0188, YP0263, PT0743 e YP0096 são estabelecidas na listagem de sequências de PCT/US06/040572; a sequência da região reguladora PT0625 é estabelecida em listagem de sequências de PCT/US05/034343; as sequências de regiões reguladoras PT0623, YP0388, YP0087, YP0093, YP0108, YP0022 e YP0080 são estabelecidas na listagem de sequências do Pedido de Patente No. USll/172, 703, a sequência da região reguladora PR0924 é estabelecida em listagem de sequências de PCT/US07/62762; e as sequências de regiões reguladoras p530cl0, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYpl02, e pOsYp285 são estabelecidas na listagem de sequências de PCT/US06/038236.

[0062] Será reconhecido que uma região reguladora pode equiparar os critérios para uma classificação com base na sua atividade em uma espécie de planta, e ainda equipara os critérios para uma classificação diferente com base em sua atividade em outras espécies de plantas.

[0063] Um promotor pode ser dito para ser "amplamente expresso" quando se promove a transcrição de muitos, mas não necessariamente todos, os tecidos das plantas. Por exemplo, um promotor amplamente expresso pode promover transcrição de uma sequência ligada funcionalmente em uma ou mais dos ápices, ápices caulinares (ápice), e folhas, porém fraco ou nenhum em todos tecidos, tais como raizes ou caules. Como outro exemplo, um promotor amplamente expresso pode promover a transcrição de uma sequência funcionalmente ligada em uma ou mais da haste, ápice, ápice caulinar (ápice), e folhas, mas pode promover nenhuma ou fraca transcrição, em tecidos, tais como os tecidos reprodutivos de flores e sementes em desenvolvimento. Exemplos que não são limitativos de promotores amplamente expressos que podem ser incluídos em moléculas de ácido nucleico, vetores e construções aqui providas incluem os promotores P326, YP0144, YP0190, pl3879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, e PT0633. Exemplos adicionais incluem o promotor 35S do virus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor da manopina-sintase (MAS),os promotores 1' ou 2' derivados de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor do vírus do mosaico de figwort 34S, promotores de actina, tal como o promotor da actina do arroz, e promotores de ubiquitina, tal como o promotor ubiquitina-1 de milho de. Em alguns casos, o promotor 35S de CaMV pode ser excluído da categoria de promotores amplamente expressos.

[0064] Promotores para raiz ativa conferem a transcrição no tecido da raiz, por exemplo, na endoderme da raiz, na epiderme da raiz, ou tecidos vasculares da raiz. Em alguns casos, promotores para raiz ativa são promotores para raiz preferencial, ou seja, conferem transcrição apenas ou predominantemente no tecido da raiz. Promotores para raiz preferencial incluem os promotores YP0128, YP0275, PT0625, PT0660, PT0683, e PT0758. Outros promotores para raiz preferencial incluem os promotores PT0613, PT0672, PT0688, e PT0837, que dirigem a transcrição principalmente no tecido da raiz e, em menor grau, em óvulos e/ou sementes. Outros exemplos de promotores para raiz preferencial incluem os subdomínios para raiz específica do promotor 35S do CaMV (Lam et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:7890-7894 (1989)), os promotores para células de raiz específica relatados por Conkling et al. Plant Physiol., 93:1203 -1211 (1990), e o promotor RD2 para tabaco.

[0065] Um promotor para caule pode ser específico para um ou mais tecidos do caule ou específico para o caule e outras partes da planta. Promotores para caule podem ter atividade elevada ou preferencial, por exemplo, na epiderme e córtex, câmbio vascular, procambial, ou xilema. Exemplos de promotores para caule incluem YP0018 que é divulgada em US20060015970 e CrylA (b) e CrylA (c) (Braga et al., Journal of New Seeds, 5:209-221 (2003)).

[0066] Em alguns casos, os promotores que dirigem a transcrição de endosperma na maturação podem ser utilizados como aqui descritos. A transcrição a partir de um promotor de endosperma na maturação começa tipicamente após a fertilização e ocorre principalmente no tecido de endosperma durante o desenvolvimento da semente e é tipicamente mais elevada durante a fase de celularização. Exemplos adequados são os promotores que são ativos predominantemente no endosperma de maturação, embora promotores que também são ativos em outros tecidos podem ser utilizados às vezes. Exemplos não limitados de promotores de maturação de endosperma que podem ser incluídos nas moléculas de ácidos nucleicos, vetores e construções aqui providas incluem o promotor da napina, o promotor da Arcelina-5, o promotor da faseolina (Bustos et al., Plant Cell, 1 (9) :839-853 (1989)), o promotor do inibidor de tripsina de soja (Riggs et al. , Plant Cell,l (6) :609-621 (1989)), o promotor de AGP (Baerson et al, Plant Mol. Biol, 22 (2) :255 267 (1993) ) , o promotor de estearoil- ACP dessaturase (Slocombe et al, Plant Physiol, 104 (4) :167- 176 (1994)), promotor da subunidade a' de soja de β-conglicinina (Chen et al, Proc Natl Acad Sei USA, 83:8560 -8564 (1986)), o promotor de oleosina (Hong et al. Plant Mol. Biol., 34 (3) :549- 555 (1997)), e promotores de zeina, tal como o promotor de zeina 15 kD, o promotor de zeina 16 kD, o promotor de zeina 19 kD, o promotor de zeina 22 kD e o promotor de zeina 27 kD. Também são adequados os promotores Osgt-1 a partir da glutelina-1 do gene do arroz, o promotor da beta-amilase, e o promotor de hordeina cevada. Ver Zheng et al. Mol. Cell Biol., 13:5829-5842 (1993). Outros promotores de maturação de endosperma que podem ser utilizados incluem os promotores YP0092, PT0676, e PT0708.

[0067] Os promotores são ativos nos tecidos de ovário, tais como, a parede do óvulo e mesocarpo, podem ser utilizados, por exemplo, um promotor poligalacturonase, o promotor de TRX de banana, o promotor de actina de melão, YP0396 e PT0623. Exemplos de promotores são ativos principalmente em óvulos incluem YP0007, YP0111, YP0092, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120, e YP0374.

[0068] Para atingir expressão no endosperma do saco embrionário/prematuro, regiões reguladoras podem ser utilizadas que são ativas em núcleos polares e/ou a célula central, ou em precursores para núcleos polares, mas não em células de ovo ou precursores de células de ovo. Exemplos de promotores adequados são aqueles que são capazes de apenas ou predominantemente dirigir expressão em núcleos polares ou aos seus precursores e/ou célula central. Um padrão de transcrição que se estende de núcleos polares ao desenvolvimento de endosperma prematuro também pode ser encontrado com promotores de endosperma preferencial para saco embrionário/prematuro, embora a transcrição tipicamente diminua significativamente no desenvolvimento do endosperma depois durante e após a fase celularização. Expressão no zigoto ou embrião em desenvolvimento tipicamente não está presente com promotores de endosperma para saco embrionário/prematuro.

[0069] Promotores que podem ser adequados incluem aqueles derivados a partir dos seguintes genes: Arabídopsís viviparos-1 (ver, GenBank No. U93215); Arabídopsís atmycl (ver, Urao, Planta Mol Bíol., 32:571-57 (1996); Conceicao, Plant, 5:493-505 (1994)); FIE Arabídopsís (GenBank No. AF129516); Arabídopsís MEA; Arabídopsís (GenBank No. AF096096) e FIE 1.1 (Patente No. US6.906.244) . Outros promotores que podem ser adequados incluem os derivados a partir dos seguintes genes: milho MAC1 (ver, Sheridan, Genetics, 142:1009-1020 (1996)); milho Cat3 (ver, GenBank No.L05934; Abler, Plant Mol. Biol., 22:10131-1038 (1993)). Outros promotores incluem os seguintes promotores de Arabidopsis:YP0039, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0119, YP0137, DME, YP0285, e YP0212. Outros promotores que podem ser utilizados como aqui descrito incluem os seguintes promotores de arroz: p530cl0, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYpl02, e pOsYp285.

[0070] Regiões reguladoras que preferencialmente dirigem transcrição em células zigóticas seguinte a fertilização podem prover expressão embrio-preferencial. Exemplos de promotores adequados são aqueles promotores que preferencialmente dirigem a transcrição de embriões no estágio prematuro, antes do estágio do coração, mas a expressão em estágio tardio e maturação de embriões também são adequadas. Promotores embrio-preferencial que pode ser utilizada como aqui descrita inclui promotor (Ltpl) da proteína de transferência de lipideos de cevada (Plant cell Rep 20:647-654 (2001)), YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879, e PT0740.

[0071] Promotores ativos em tecido fotossintético conferem transcrição em tecidos verdes, tais como folhas e caules e pode ser utilizado como aqui descrito. Exemplos adequados incluem aqueles promotores que dirigem expressão apenas ou predominantemente em tais tecidos. Exemplos de tais promotores incluem os promotores de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS), tais como o promotor RbcS de laricio oriental (Larix laricina), o promotor de pinho cabδ (Yamamoto et al, Plant Cell Physiol, 35:773..-778 (1994)), o promotor Cab-1 de trigo (Fejes et al. , Plant Mol. Biol., 15:921-932 (1990)), o promoter CAB-1 de espinafre (Lübberstedt et al., Plant Physiol., 104:997-1006 (1994)), o promoter cablR de arroz (Luan et al., Plant Cell, 4:971-981 (1992)), o promotor (PPDK) de piruvato ortofosfato diquinase do milho (Matsuoka et al,. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:9586-9590 (1993)), o promoter Lhcbl*2 de tabaco (Cerdan et al. , Plant Mol. Biol., 33:245-255 (1997)), o promoter Arabidopsis thaliana SUC2 de sacarose-H+ simportador (Truernit et al., Pl anta, 196:564-570 (1995)), e os promotores de proteinas de membrana tilacói de espinafre (pSAD, PSAF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores de tecidos fotossintéticos incluem PT0535, PT0668, PT0886,5 YP0144, YP0380 e PT0585.

[0072] Exemplos de promotores que têm atividade elevada ou preferencial em feixes vasculares que podem ser utilizadas como aqui descrito incluem YP0087, YP0093, YP0108, YP0022, e YP0080. Outros promotores de tecido preferencial vascular incluem o promotor GRP 1,8 de proteína da parede celular rica em glicina (Keller e Baumgartner, Plant Cell, 3 (10):1051-1061 (1991)), o promotor do virus do mosqueado amarelo de Commelina (CoYMV) (Medberry et al. , Plant Cell, 4 (2) :185-192 (1992)), e o promotor do virus baciliforme do tungro do arroz (RTBV) (Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 101 (2) :687-692 (2004)).

[0073] Os promotores induziveis que conferem transcrição em resposta a estímulos externos, tais como agentes químicos, estímulos ambientais ou podem ser utilizados como aqui descritos. Por exemplo, promotores induziveis podem conferir transcrição em resposta a hormônios, tais como o ácido giberélico ou etileno, ou em resposta à luz ou seca. Exemplos de promotores induziveis por seca que podem ser utilizados como aqui descritos incluem YP0380, PT0848, YP0381, YP0337, PT0633, YP0374, PT0710, YP0356, YP0385, YP0396, YP0388, YP0384, PT0688, YP0286, YP0377, PD1367, e PD0901. Exemplos de promotores de-azoto indutivel que podem ser utilizadas como aqui descrito incluem PT0863, PT0829, PT0665, e PT0886. Exemplos de promotores induziveis por sombra que podem ser utilizados como aqui descrito incluem PR0924 e PT0678. Um exemplo de um promotor induzido por sal é o rd29A. Ver Kasuga et al. Nature Biotech, 17:287-291 (1999).

[0074] Um promotor basal, que pode ser utilizado como aqui descrito pode ter uma sequência minima necessária para a montagem de um complexo de transcrição requerido para a iniciação da transcrição. Promotores basais frequentemente incluem um elemento "caixa TATA" que pode ser localizado entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotideos a montante do local de iniciação da transcrição. Promotores basais também pode incluir um elemento "caixa CCAAT" (tipicamente a sequência CCAAT) e/ou uma sequência GGGCG, que pode ser localizado entre cerca de 40 e cerca de 200 nucleotideos, tipicamente cerca de 60 a cerca de 120 nucleotideos a montante do local de inicio da transcrição.

[0075] Outras classes de promotores que podem ser utilizados como aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, ápice- preferencial, calo-preferencial, célula preferencial tricoma, célula preferencial guarda, tal como PT0678, tubérculo preferencial, célula preferencial parênquima, e os promotores de senescência preferencial. Promotores projetados YP0086, YP0188, YP0263, PT0758, PT0743, PT0829, YP0119, e YP0096, como descrito nos pedidos de patentes acima referidos.

[0076] Uma UTR 5' pode ser incluída em uma molécula de ácido nucleico, vetor, ou construção aqui providos. Uma UTR 5' é transcrita, mas não é traduzida, e pode se encontrar entre o sítio de início da transcrição e o códon de iniciação de tradução e pode incluir o nucleotídeo +1.

[0077] Será entendido que mais do que uma reqião reguladora pode estar presente em uma molécula de ácido nucleico, vetor, ou construção aqui providos, por exemplo, introns, reforços, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição, e elementos induzíveis. Assim, por exemplo, mais do que uma região reguladora pode ser funcionalmente ligada à sequência de um polinucleotideo que codifica um polipeptideo.

[0078] Regiões reguladoras, tais como promotores para genes endógenos podem ser obtidas por síntese química ou por subclonagem de um DNA genômico que inclui tal região reguladora. Um ácido nucleico compreendendo tal região reguladora também pode incluir sequências de flanqueamento que contém locais de enzimas de restrição que facilitam a manipulação subsequente. Plantas Transgênicas, Células Vegetais e Sementes de Plantas

[0079] Este documento também provê células vegetais (por exemplo, células vegetais transgênicas), plantas (por exemplo, plantas transgênicas), e sementes de plantas (por exemplo, sementes de plantas transgênicas) com uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição aqui provido. Como aqui descrito, a sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo pode ser heteróloga em relação ao terminador de transcrição. Em alguns casos, as células vegetais (por exemplo, células vegetais transgênicas), plantas (por exemplo, plantas transgênicas, ou sementes de plantas (por exemplo, sementes de plantas transgênicas) aqui providas podem incluir pelo menos uma molécula de ácido nucleico, vetor, ou construção aqui providos.

[0080] Uma célula vegetal ou planta pode ser transformada ao ter uma construção integrada em seu genoma, ou seja, podem ser transformadas de forma estável. As células transformadas de forma estável podem reter a molécula de ácido nucleico introduzida, vetor, ou construção em cada divisão celular. A planta ou célula vegetal pode também ser transitoriamente transformada de tal modo que a molécula de ácido nucleico, vetor, ou construção não são integradas no seu genoma. Células Transitoriamente transformadas podem perder toda ou alguma porção da molécula de ácido nucleico introduzida, vetor, ou construção em cada divisão celular de tal modo que a molécula de ácido nucleico introduzida, vetor, ou construção não podem ser detectadas em células filhas após um número suficiente de divisões celulares. Tanto plantas transgênicas e células vegetais transitoriamente transformadas quanto plantas transgênicas e células vegetais estavelmente transformadas podem ser feitas e utilizadas como aqui descrito.

[0081] Células vegetais transgênicas aqui descritas podem constituir parte ou a totalidade de uma planta integral. Tais plantas podem ser cultivadas de uma maneira adequada para a espécie em consideração, seja em uma câmara de crescimento, uma estufa, ou um campo. As plantas transgênicas podem ser procriadas como desejado para uma finalidade especifica, por exemplo, para introduzir uma molécula de ácido nucleico, vetor, ou construção aqui provida em outras linhas, para transferir uma molécula de ácido nucleico, vetor, ou construção aqui providas para outras espécies, ou para ainda selecionar outros traços desejáveis. Alternativamente, as plantas transgênicas podem ser propagadas vegetativamente para as espécies passíveis em relação a tais técnicas. Como aqui descrito, uma planta transgênica também se refere à progénie de uma planta transgênica inicial uma vez que a progénie herda o transgene. Sementes produzidas por uma planta transgênica podem ser cultivadas e, então autofecundadas (ou outclassed e autofecundadas) para obter sementes homozigotas para uma molécula de ácido nucleico, vetor ou construção aqui provida.

[0082] As plantas transgênicas podem ser cultivadas em cultura com suspensão, ou tecido, ou cultura de órgãos. As técnicas de cultura de tecidos sólidos e/ou liquidos podem ser utilizadas como aqui descrito ou como conhecido na técnica Ao utilizar meio sólido, as células vegetais transgênicas podem ser colocadas diretamente no meio, ou podem ser colocado em um filtro, que é então colocado em contato com o meio. Ao utilizar meio liquido, as células vegetais transgênicas podem ser colocadas sobre um dispositivo de flotação, por exemplo, uma membrana porosa, que contata com o meio liquido. Exemplos de um meio sólido que pode ser utilizado como aqui descrito incluem meio de Murashige e Skoog (MS) que contém ágar e uma concentração adequada de uma auxina, por exemplo, ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), e uma concentração adequada de uma citocinina, por exemplo, cinetina.

[0083] Quando as células vegetais transformadas de forma transiente são utilizadas tal como aqui descrito, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo repórter tendo uma atividade repórter pode ser incluído no processo de transformação, e um ensaio para atividade repórter ou a expressão pode ser realizada em um tempo adequado após a transformação. Um tempo adequado para a condução do ensaio pode ser de cerca de 1- 21 dias após a transformação, por exemplo, cerca de 1-14 dias, cerca de 1-7 dias, ou cerca de 1-3 dias. Ensaios transientes podem ser utilizados como aqui descrito para a análise rápida em espécies diferentes, ou para confirmar a expressão de um polipeptideo (por exemplo, um polipeptideo heterólogo) cuja expressão não foi previamente confirmada em células receptoras particulares.

[0084] As técnicas para a introdução de moléculas de ácidos nucleicos, construções, ou vetores nas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas são conhecidas na técnica, e os exemplos que podem ser utilizados como aqui descrito incluem, sem limitação, a transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetor virai, eletroporação e transformação por arma de partículas, por exemplo, Patentes No. US5.538.880; US5.204.253; 6.329.571 e 6.013.863. Se uma célula ou tecido cultivado é utilizado como o tecido receptor para a transformação, tal como aqui descrito, as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas transformadas, se desejado, por técnicas conhecidas daqueles que são versados na técnica.

[0085] A população de plantas transgénicas pode ser rastreada e/ou selecionada para os membros da população que têm um traço ou fenótipo conferido pela expressão do transgene. Por exemplo, uma população de progénie de um único evento de transformação pode rastrear aquelas plantas que têm um nivel desejado de expressão de um polipeptideo ou ácido nucleico. Os métodos fisicos e bioquímicos podem ser utilizados para identificar níveis de expressão. Exemplos que podem ser utilizados incluem a análise de Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção de RNase Sl, de extensão de iniciadores, ou de amplificação por RT-PCR para a detecção de transcritos de RNA, ensaios enzimáticos para a detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptideos e polinucleotídeos; e eletroforese de proteína em gel, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzimas para detectar polipeptideos. Outras técnicas, tais como hibridação in situ, coloração de enzima, e imunocoloração também pode ser utilizadas para detectar a presença ou a expressão de polipeptideos e/ou polinucleotídeos. Os métodos aqui descritos para realizar todas as técnicas ditas são conhecidos na técnica. Como uma alternativa, uma população de plantas que compreende eventos de transformação independentes, podem rastrear aquelas plantas tendo um traço desejado, tal como um nível modulado de um ácido nucleico ou polipeptídeo. Seleção e/ou de rastreamento pode ser conduzido por uma ou mais gerações, e/ou em mais do que uma localização geográfica. Em alguns casos, as plantas transgênicas podem ser selecionadas e cultivadas sob condições que induzem a um fenótipo desejado ou que de outro modo são necessárias para gerar um fenótipo desejado uma planta transgênica. Além disso, a seleção e/ou rastreio pode ser aplicado durante um estágio desenvolvente particular, no qual se espera que o fenótipo a seja exibido pela planta. Seleção e/ou rastreamento pode ser conduzido para escolher essas plantas transgênicas tendo uma diferença estatisticamente significativa na expressão de um transgene em relação a uma planta de controle que não possui o transgene. Plantas transgênicas selecionadas ou rastreadas aqui descritas podem ter um fenótipo alterado em comparação com uma planta de controle correspondente.

[0086] As moléculas de ácido nucleico, vetores e construções aqui descritas podem ser utilizados para transformar uma série de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células vegetais. Exemplos de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas que podem ser utilizadas como aqui descrito incluem, sem limitação, as seguintes plantas: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae , Amaryllidaceae, Apocynaceae , Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plant aginaceae,

[0087] Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, ou Vitaceae.

[0088] Exemplos de plantas adequadas que podem ser utilizadas como aqui descrito incluem membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemísia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calêndula, Camélia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Crisântemo, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Efedrina, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Folium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petúnia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, poinsétia Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopoli-A, Secale, Solanum, sorgo, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, e Zea.

[0089] Exemplos de plantas adequadas que podem ser utilizadas como aqui descrito incluem Panicum spp., Sorghum spp. , Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (big bluestemj, Pennisetum purpureum (capim- elefante; , Phalaris arundinacea (cana canarygrass), Cynodon dactylon (bermudagrass) , Festuca Arundinacea (tall fescuej, Spartina pectinata (Prairie cord-grass,), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (Triticum-trigo centeio X) e bambu. 1. Exemplos de plantas adequadas que podem ser utilizadas como descrito aqui também incluem Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (pinhão-manso), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (dendê), Linum usitatissimum (linho), Beta vulgaris (beterraba), Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisíaca (de banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de Bruxelas),! o Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau),Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (quente e doce de pimenta), Allium cepa (cebola), melo (Melão), Cucumis sativus (pepino) , Cucurbita maxima (polpa), Cucurbita moschata (polpa), oleracea Spinacea (espinafre) , Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschuslδ esculentus (quiabo) e Solanum melongena (berinjela).

[0090] Exemplos de plantas adequadas que podem ser utilizadas como descrito aqui descritas também incluem Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientar, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminado, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculate, Atropa beladona, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopoli-A spp., Lycopodium serratum (Huperzia), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp. , Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, e Tanacetum parthenium.

[0091] Exemplos de plantas adequadas que podem ser utilizadas como aqui descrito também incluem Parthenium argentatum (guaiule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, e Alstroemeria spp.

[0092] Exemplos de plantas adequadas que podem ser utilizadas como aqui descrito incluem Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), poinsétia pulcherrima (amendoim), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (Aspen), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (FIR), Acer spp. (maple), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (bluegrass), folium spp. (azevém) e Phleum pratense (Timóteo).

[0093] Em alguns casos, uma espécie adequada que podem ser utilizada como aqui descrito, inclui uma espécie selvagem, erva daninha, ou Pennisetum cultivada, incluindo, sem limitação, Pennisetum alopecuroid.es, Pennisetum arnhemicum, Pennisetum caffrum, Pennisetum clandestinum, Pennisetum divisum, Pennisetum glaucum, Pennisetum lati folium, Pennisetum macrostachyum, Pennisetum macrourum, Pennisetum orientar, Pennisetum pedicellatum, Pennisetum polystachion, Pennisetum polystachion ssp. , Setosum, Pennisetum purpureum, Pennisetum setaceum, Pennisetum subangustum, Pennisetum typhoides, Pennisetum villosum, ou seus hibridos (por exemplo, Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

[0094] Em alguns casos, uma espécie adequada que pode ser utilizada tal como aqui descrito inclui uma espécie selvagem, erva daninha, ou Miscanthus cultivada e/ou variedade incluindo, sem limitação, Miscanthus x giganteus, Miscanthus sinensis, Miscanthus x ogiformis, Miscanthus floridulus , Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus oligostachyus, Miscanthus nepalensis, Miscanthus sacchariflorus, Miscanthus x giganteus 'Amur!', Miscanthus x giganteus 'Nagara', Miscanthus x giganteus 'Illinois', Miscanthus sinensis var. 'Gollas', Miscanthus sinensis var. 'Roland', Miscanthus sinensis var. 'África', Miscanthus sinensis var. 'Fern Osten', Miscanthus sinensis var. gracillimus, Miscanthus sinensis var. variegatus, Miscanthus sinensis var. purpurascens, Miscanthus sinensis var. 'Malepartus', Miscanthus sacchariflorus var. 'Robusta', Miscanthus sinensis var. 'Silberfedher' (aka. Silver Feather), Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus condensatus , Miscanthus yakushimanum, Miscanthus var. 'Alexander', Miscanthus var. 'Adagio', Miscanthus var. 'Autumn Light', Miscanthus var. 'Cabaret', Miscanthus var. 'Condensatus', Miscanthus var. 'Cosmopolitan', Miscanthus var. 'Dixieland', Miscanthus var. 'Gilded Tower' (Patente No. PP14. 743), Miscanthus var. 'Gold Bar' (Patente No. PP15.193), Miscanthus var. 'Gracillimus', Miscanthus var.'Graziella', Miscanthus var. 'Grosse Fontaine', Miscanthus var. ’Hinjo aka Little Nicky'™, Miscanthus var. 'Juli', Miscanthus var. 'Kaskade', Miscanthus var. 'Kirk Alexander', Miscanthus var. 'Kleine Fontaine', Miscanthus var. 'Kleine Silberspinne' (aka.'Little Silver Spider'), Miscanthus var. ’Gatinho', Miscanthus var. ’Pequeno Zebra' (Patente No. US PP13.008), Miscanthus var. ’Lottum', Miscanthus var. ’’Malepartus', Miscanthus var. ’Morning Light', Miscanthus var. 'Solteira Misteriosa' (Patente No. PP16.176), Miscanthus var. 'Nippon', Miscanthus var. 'Novembro Sunset', Miscanthus var. 'Parachute', Miscanthus var. 'Positano', Miscanthus var. 'Puenktchen' (aka 'Pouco Dot'), Miscanthus var. 'Rigoletto', Miscanthus var. 'Sarabande', Miscanthus var. 'Silberpfeil' (aka. Silver Arrow) , Miscanthus var. 'Silverstripe', Miscanthus var. 'Super Stripe' (Patente No. PP18. 161), Miscanthus var ’Strictus', ou Miscanthus var. ’Zebrinus' .

[0095] Em alguns casos, uma espécie adequada que pode ser utilizada como aqui descrito, inclui uma espécie selvagem, erva daninha, ou espécies de sorgo cultivadas e/ou variedade incluindo, sem limitação, Sorghum almum, Sorghum amplum, Sorghum angustum, Sorghum arundinaceum, Sorghum bicolor (como bicolor, guiné, caudatum, kafir, e durra), Sorghum brachypodum, Sorgo bulbosum, Sorghum burmahicum, Sorghumio controversum, Sorghum drummondii, Sorghum ecarinatum, exstans Sorgo, Sorghum grandioso, Sorghum halepense, Sorghum interj ectum, intrans Sorgo, Sorghum laxiflorum, Sorghum leiocladum, Sorghum macrospermum, Sorghum matarankense, Sorghum miliaceum, Sorghum nigrum, Sorghum nitidum, Sorghum plumosum, Sorghum propinquum, Sorghum purpureosericeum, Sorghum stipoideum,15 Sorghum sudanensese, Sorghum timorense, Sorghum trichocladum, Sorghumversicolor, Sorghum virgatum, Sorghum vulgare, ou híbridos, como Sorghum X almum, sorgo x capim-sudão ou sorgo x drummondii.

[0096] Os métodos e materiais aqui providos (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos, vetores, ou construções tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador de transcrição) podem ser utilizados em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo espécies de gêneros dicot Brassica, Carthamus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Jatropha, Parthenium, Populus, e Ricinus, e os gêneros monocot Elaeis, Festuca, Hordeum, Lolium, Oryza, Panicum, Pennisetum, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticosecale, Triticum e Zea. Em alguns casos, uma planta que pode ser utilizada como aqui descrito pode ser uma membra das espécies Panicum virgatum (switchgrass) , Sorghum bicolor (sorgo, capim-sudão), Miscanthus giganteus (miscanthus) , Saccharum sp. (energycane) , Populus balsam!fera (choupo) , Zea mays (milho) , Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa30 (arroz), Helianthus annuus (girassol) , Medicago sativa (alfafa) , Beta vulgaris (beterraba) ou Pennisetum annuus (milheto,).

[0097] Em certos casos, as moléculas de ácido nucleico, vetores e construções aqui descritas podem ser utilizadas para transformar uma série de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células vegetais, em que essas plantas são híbridas de diferentes espécies ou variedades de uma espécie especifica (por exemplo, Saccharum sp. X Miscanthus sp., Sorghum sp. X Miscanthus sp., Por exemplo, Panicum virgatum x Panicum amarum, Panicum virgatum x Panicum amarulum e Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

[0098] Uma planta que contem um polipeptideo com os niveis de expressão modulados devido à expressão aumentada ou diminuída do transgene pode ser utilizada como aqui descrito. O fenótipo de uma planta transgênica, em que a expressão de um polipeptideo foi alterada pode ser avaliado em relação a uma planta de controle. Como aqui descrito, uma planta pode "não expressar" um polipeptideo quando a planta exibe menos de 10%, por exemplo, menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01% ou 0,001%, da quantidade de polipeptideo ou mRNA que codifica o polipeptideo exibido pela planta de interesse. Expressão pode ser avaliada utilizando os métodos aqui descritos, incluindo, por exemplo, RT-PCR, Northern blots, proteção SI RNase, extensões de iniciadores, Western blot, eletroforese em gel de proteínas, imunoprecipitação, ensaios imunológicos ligados a enzimas, ensaios de ChIP, e espectrometria de massa. Se um polipeptideo é expresso sob o controle de um promotor de tecido preferencial ou amplamente expresso, a expressão pode ser avaliada na planta inteira ou em um tecido selecionado. Similarmente, se um polipeptideo é expresso em um determinado momento, por exemplo, em um tempo particular em desenvolvimento ou no momento da indução, a expressão pode ser avaliada seletivamente em um periodo de tempo desej ado.

Artigos de Fabricação

[0099] Este documento também provê uma semente de planta que pode ser incorporado em uma composição de sementes de plantas que contêm uma pluralidade de sementes transgênicas estéreis Fi híbridas. A proporção de tais sementes na composição pode ser de 70% a 100%, por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de 100%. As sementes remanescentes na composição podem ser sementes de um dos progenitores de Ei, e a proporção de sementes progenitoras pode ser menos de 5%, por exemplo, de 0% a 0,5%, 1%, 2% ou 4%. A proporção de sementes na composição pode ser medida como o número de sementes de um tipo particular, dividido pelo número total de sementes na composição. Quando grandes quantidades de uma composição de sementes são formuladas, ou quando a mesma composição é formulada repetidamente, pode haver uma certa variação na proporção de cada tipo observado em uma amostra da composição, devido a erro de amostragem. Em alguns casos, tais erros de amostragem podem tipicamente ser de cerca de ± 5%.

[0100] As sementes podem ser condicionadas e ensacadas em material de embalagem por meios conhecidos na técnica, para formar um artigo de fábrica. Tal saco de sementes tem preferencialmente um rótulo de embalagem que acompanha o saco, por exemplo, um rótulo ou etiqueta fixada ao material de embalagem, um rótulo impresso no material de embalagem ou um rótulo inserido dentro da bolsa. O rótulo da embalagem pode indicar que as sementes nela são, por exemplo, sementes transgênicas estéreis F1 híbridas.

[0101] A invenção será ainda descrita nos exemplos seguintes, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS Exemplo 1-Identificar Terminadores de Transcrição

[0102] Arabídopsís thalíana dados de microarranjo e informações de sequência genômica foram utilizadas para selecionar candidatos de terminador de transcrição. Terminadores de transcrição foram selecionados a partir da UTR 3' de genes que expressos de modo elevado, constitutivamente ativos, e funcionais em todos os tecidos. Terminadores de transcrição, também foram selecionados da UTR 3' de genes que tinham um minimo de nucleotideos na sequência de variação na sua transcrição locais de clivagem, e que exibiu vazamento minimo de expressão em arranjos de alta densidade. Além disso, os terminadores de transcrição foram selecionados a partir do 3' UTR de genes cujos genes vizinhos a jusante do local de clivagem de mRNA não foram altamente expressos. A seleção de sequências especificas também foi informada por análise bioinformática das sequências que cercam os sitios de clivagem de transcrição em Arabídopsís thalíana. Os seguintes cinco terminadores de transcrição estavam entre aqueles que foram selecionados a partir de Arabídopsís thalíana, utilizando os critérios acima.

[0103] A sequência foi selecionada a partir de uma área da sequência do genoma a jusante do gene que codifica metalotioneina 2b (At5g02380). Esta sequência foi estabelecida como na SEQ ID NO: 1.

[0104] A sequência foi selecionada a partir de uma área do genoma a jusante do gene que codifica a proteína ribossômica 60S L8 (At2gl8020) . Esta sequência foi estabelecida como na SEQ ID NO: 2 .

[0105] A sequência foi selecionada a partir de uma área do genoma a jusante do gene que codifica a pequena subunidade da carboxilase de ribulose-bifosfato (Atlg67090). Esta sequência foi estabelecida como na SEQ ID NO:3.

[0106] A sequência foi selecionada a partir de uma área do genoma a jusante do gene que codifica a subunidade do complexo de citocromo b6f (At2g26500) . Esta sequência foi estabelecida como na SEQ ID NO:4.

[0107] A sequência foi selecionada a partir de uma área do genoma a jusante do gene que codifica fator 1 alfa de alongamento (Atlg07930) . Esta sequência foi estabelecida como na SEQ ID NO: 5.

Exemplo 2-Avaliação da Eficácia de Terminadores de Transcrição

[0108] Um sistema de vetor foi utilizado para determinar os terminadores de transcrição para a capacidade de terminar a transcrição in vivo de um ácido nucleico heterólogo repórter (por exemplo, GFP) expresso sob o controle de um promotor (Figura 1) . O terminador de transcrição foi considerado eficiente ou "apertado" (tight) se a terminação e poliadenilação ocorressem dentro da sequência do terminador de transcrição. O terminador de transcrição foi considerado ineficiente ou "vazante" (leaky) se a terminação e poliadenilação ocorressem fora da sequência do terminador de transcrição (ou seja, dentro da sequência do terminador de transcrição NOS) .

[0109] As plantas foram transformadas com vetores tendo terminadores de transcrição candidatos, e RNA total foi isolado a partir de folhas de plantas transformadas e foi tratado com DNase I. Então o RNA total foi sujeito à amplificação por RT- PCR utilizando os precursores Pl e P2 (Oligo-dT) indicados na Figura 1. Os produtos de PCR foram clonados em um vetor de transferência (ou seja, pCR II) e transformados em E. coli. 0 produto de PCR em cada clone foi então sequenciado com precursores do vetor que flanqueiam o local de inserção. Todas as transcrições de RNA poliadeniladas dentro, tanto do terminador de transcrição sendo expresso quanto dentro do terminador NOS foram amplificadas por RT-PCR em eficiências similares.

[0110] Os resultados da análise dos terminadores de transcrição que têm a sequência estabelecida em SEQ ID NOs : 1-5 são apresentados nas Tabelas 1-5, respectivamente. O número do sitio de poli-A do nucleotideo corresponde ao local dentro de cada respectivo terminador de transcrição onde ocorreu poliadenilação (3' do nucleotideo indicado nessa posição). Os números de transcritos possuindo um sitio de poli-A em um local em particular quando expresso em Arabidopsis e/ou células de arroz foram determinados. Tabela 1. Terminador de transcrição tendo sequência estabelecida em SEQ ID NO:1

Tabela 2. Terminador de transcrição tendo sequência estabelecida em SEQ ID NO:2

Tabela 3. Terminador de transcrição tendo sequência estabelecida em SEQ ID NO:3

Tabela 4. Terminador de transcrição tendo sequência estabelecida em SEQ ID NO:4 

Tabela 5. Terminador de transcrição tendo sequência estabelecida em SEQ ID NO:5

[0111] Os resultados aqui providos demonstram que os terminadores de transcrição tendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, e 5 tem a capacidade de terminar a transcrição efetivamente in vivo.

OUTRAS MODALIDADES

[0112] Deve ser entendido, que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a detalhada descrição da mesma, a descrição acima mencionada é destinada para ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, que é definida pelo âmbito das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens, e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações a seguir.

Claims (8)

1. Método de obtenção de uma célula vegetal transgénica caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformar uma célula vegetal com uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo funcionalmente ligado a um terminador da transcrição, em que dita sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao dito terminador de transcrição, e em que dito terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos estabelecida em SEQ ID NO: 2; e, b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucleotideos é integrada no genoma de uma célula vegetal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucleotideos e dito terminador de transcrição estão localizados em uma molécula de ácido nucleico que não está integrada no genoma da dita célula vegetal.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucleotideos e dito terminador de transcrição estão localizados dentro do genoma da dita célula vegetal.

5. Método de obtenção de uma planta transgénica caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformar uma célula vegetal com uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador da transcrição, em que dita sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao dito terminador de transcrição, e em que dito terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos estabelecida em SEQ ID NO: 2; b) cultivar a referida célula vegetal sob condições de crescimento de célula vegetal; e, c) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dita planta é uma canola, milho, algodão, miscanthus, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba sacarina, girassol, gramineas ou trigo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito terminador de transcrição compreende a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2.

8. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotideo que codifica um polipeptídeo funcionalmente ligado a um terminador da transcrição, em que a dita sequência de nucleotideos é heteróloga em relação ao dito terminador de transcrição, e em que dito terminador de transcrição compreende uma sequência de nucleotideos estabelecida em SEQ ID NO: 2.

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