BR112013023177B1 - métodos para regular negativamente a função biológica de uma proteína, usos de moléculas, dispositivo implantável, e métodos para triagem de novos compostos inibidores e/ou de detecção, para identificar novos alvos para compostos inibidores, e para detectar uma proteína em uma amostra - Google Patents

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Abstract

MOLÉCULAS E MÉTODOS PARA INIBIÇÃO E DETECÇÃO DE PROTEÍNAS, USOS DAS REFERIDAS MOLÉCULAS, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA DE MICRO- ORGANISMO, MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA E AGROQUÍMICA, DISPOSITIVO IMPLANTÁVEL , KIT E SUPORTE SÓLIDO. O presente pedido pertence ao campo dos peptídeos funcionais e mais particularmente ao campo de agregação de proteína controlada. A invenção revela moléculas de uma estrutura de peptídeos conforme definido nas reivindicações e métodos para utilizar as referidas moléculas para aplicações terapêuticas e para usos de diagnóstico, bem como em outras aplicações tais como no campo agbio e em biotecnologia industrial. As moléculas podem ser usadas para cura e/ou estabilização de infecções tais como doenças bacterianas, fúngicas e virais, porém também são úteis em doenças não infecciosas humanas e veterinárias. As moléculas também podem ser usadas para a detecção de biomarcadores de proteínas e para o prognóstico e o diagnóstico de uma variedade de doenças.

Description

MÉTODOS PARA REGULAR NEGATIVAMENTE A FUNÇÃO BIOLÓGICA DE UMA PROTEÍNA, USOS DE MOLÉCULAS, DISPOSITIVO IMPLANTÁVEL, E MÉTODOS PARA TRIAGEM DE NOVOS COMPOSTOS INIBIDORES E/OU DE DETECÇÃO, PARA IDENTIFICAR NOVOS ALVOS PARA COMPOSTOS INIBIDORES, E PARA DETECTAR UMA PROTEÍNA EM UMA AMOSTRA Campo da Invenção
[001] O presente pedido pertence ao campo de peptídeos funcionais e mais particularmente ao campo de agregação controlada de proteínas. A invenção revela moléculas de uma estrutura de peptídeo conforme definido nas reivindicações e métodos para utilizar as moléculas referidas para aplicações terapêuticas e para usos de diagnóstico, bem como em outras aplicações tais como no campo agbio e em biotecnologia industrial. As moléculas podem ser usadas para a cura e/ou estabilização de infecções tais como doenças bacterianas, fúngicas e virais, mas também são úteis em doenças não infecciosas humanas e veterinárias. As moléculas também podem ser usadas para a detecção de biomarcadores de proteína e para o prognóstico e o diagnóstico de uma variedade de doenças.
ANTECEDENTES
[002] A agregação de proteínas é causada pelo dobramento incorreto e subsequente aglutinação de proteínas em aglomerados insolúveis. A agregação de proteínas é essencialmente um processo de auto-associação no qual muitas moléculas de proteínas idênticas formam conglomerados de ordem superior de baixa solubilidade que eventualmente precipitam. Com base em sua morfologia macroscópica, são geralmente classificadas quer como agregados ordenados quer como agregados desordenados. Sob condições fisiológicas, quase toda proteína pode ser induzida em alta concentração para formar agregados amorfos; sob as mesmas condições, um conjunto muito menor de proteínas formam fibras ricas em β-amiloide altamente ordenadas. No entanto, em um nível microscópico, a diferenciação entre estes dois tipos de agregados é mais sutil. Agregados amorfos são não somente aglomerados de proteínas dobradas incorretamente que aderem umas às outras através de contatos hidrofóbicos inespecíficos. De preferência, também são frequentemente enriquecidos em estrutura cruzada-β e sua tendência a formação se correlaciona não somente com hidrofobicidade, mas também com tendência a estrutura secundária e carga, sugerindo um mecanismo específico de formação (Chiti et al., PNAS 99:16419-16426 (2002); Chiti et al., Nature 424:805-808 (2003); Chiti et al., Nat Struct Biol 9:137-143 (2002)). Por outro lado, nem todos os agregados e fibras reportados são enriquecidos em estrutura β-, uma vez que foi reportado que tanto agregados amorfos quanto fibras conservam propriedades espectrais semelhantes às nativas e mesmo atividade enzimática. Nestes casos, é proposto que a agregação ocorre por outros mecanismos de oligomerização, tais como permuta de domínio tridimensional (Rousseau et al., PNAS 98: 5596-5601, 2001; Liu e Eisenberg, Protein Sci 11: 1285-1299, 2002) conforme é frequentemente visto em dímeros de proteínas. O foco sobre a agregação de proteínas é inspirado, em uma grande parte, pela observação de que uma série de doenças humanas são caracterizadas por depósitos de proteína compostos de uma ou de um número muito limitado de proteínas.
[003] Exemplos de semelhantes doenças onde se sabe que a conversão de proteínas normalmente solúveis em proteínas insolúveis estruturalmente alteradas é de relevância causal são, por exemplo, a ocorrência de peptídeo beta amiloide na doença de Alzheimer e na angiopatia amiloide cerebral, depósitos de α-sinucleína em corpos de Lewy da doença de Parkinson, prions na doença de Creutzfeldt-Jacob, superóxido dismutase na esclerose lateral amiotrófica e tau em emaranhados neurofibrilares na demência frontal temporal e na doença de Pick. Até o momento, a agregação de proteínas tem sido estudada essencialmente como um fenômeno indesejado causador de doença e atualmente é amplamente aceito que a agregação cruzada-beta mediada é o mecanismo de agregação que ocorre mais frequentemente e mais relevante biologicamente. Embora a agregação de proteínas tenha sido considerada por muito tempo um processo desordenado mediado por interações hidrofóbicas inespecíficas, atualmente está claro que particularmente a agregação amiloide é em muitos casos essencialmente um processo de auto-associação específico. Os agregados formados tanto in vitro quanto in vivo são geralmente enriquecidos em uma proteína particular e embora a agregação seja um processo espontâneo in vitro, no ambiente celular este processo é ativamente controlado por acompanhantes (chaperones). O mecanismo mais comum por meio do qual proteínas dobradas incorretamente agregam consiste na auto-associação de segmentos de polipeptídeos específicos de proteínas idênticas em um beta sheet de crescimento intermolecular (por exemplo, Makin et al., PNAS 102(2): 315-20 (2005); Sawaya et al., Nature 447(7143):453-7(2007)). Estes segmentos de agregação-nucleação são geralmente curtos, consistindo de 5 a 15 resíduos, e podem ser previstos precisamente usando algoritmos biofísicos disponíveis. Atualmente existem dados abundantes para mostrar que os filamentos individuais interagem de modo a formar uma beta sheet intermolecular e que esta estrutura forma a espinha dorsal do agregado. Sequências de agregação são muito comuns em proteínas globulares, e ocorrem com em torno da mesma frequência em proteínas α, β, α+β e α/β (classificação SCOP: Lo Conte et al., Nucleic Acids Res 28:257259 (2000)) (Linding et al., J Mol Biol 342: 345-353 (2004)). Estes trechos propensos a agregação curtos são suficientes para induzir a agregação de uma proteína, conforme demonstrado por experimentos de enxertação os quais demonstraram que o transplante de um segmento de agregação-nucleação de uma proteína de agregação sobre uma proteína não agregante transfere tanto a tendência a agregação quanto a estrutura agregada do primeiro para o último (Esteras-Chopo et al., PNAS 102: 16672-16677, 2005).
[004] Pode ser considerado que sequências de proteínas sensíveis a agregação são o preço a ser pago pela existência de estruturas de proteínas globulares: como interações de cadeias laterais terciárias ocorrem essencialmente no núcleo hidrofóbico, os trechos de proteína abrangendo esta região geralmente têm uma propensão a agregar. No entanto, para proteínas globulares nativas, a agregação geralmente não é um problema, uma vez que os trechos de proteínas propensos a agregação geralmente são sequestrados pela estrutura das proteínas e deste modo são protegidos contra auto-associação. Por outro lado, durante a translação e o dobramento da proteína, ou no caso de stress celular ou mutações desestabilizantes, estados parcialmente desdobrados são muito mais prováveis de auto-associarem e induzirem agregação e amiloideose.
[005] Como a maioria das proteínas abrigam sequências de peptídeos propensas a agregação dentro de sua estrutura primária, e como a agregação é sequência específica, foi demonstrado previamente com sucesso que foi possível desenvolver uma estratégia geral para a indução específica de agregação de uma proteína-alvo escolhida (vide a publicação de patente internacional No. WO2007071789). No último método uma proteína-alvo foi exposta a um veículo apresentando um peptídeo propenso a agregação-alvo-específico curto (isto é, uma região de beta-agregação derivada de uma proteína-alvo escolhida); foi demonstrado surpreendentemente que a exposição a uma região de nucleação agregante curta tirada da proteína é uma condição suficien- te para agregação). Este veículo (designado como uma porção de solubilização, vide, por exemplo, a Figura 1 e sua legenda na publicação de patente internacional No. WO2007071789) foi essencial para prevenir a agregação - e portanto também a estabilidade - da região de β-agregação antes desta região ter sido exposta ao-alvo.
[006] Seria vantajoso proporcionar moléculas de interferon adicionais e aprimoradas, as quais não necessitem de um veículo ou de uma porção de solubilização para permanecerem em solução e ainda tenham sucesso na inibição da função de proteínas por co-agregação. As moléculas referidas seriam mais fáceis de sintetizar ou produzir. Além disso, seria vantajoso definir com precisão os determinantes estruturais que possibilitem que as moléculas por um lado permaneçam solúveis como tais, enquanto por outro lado sejam capazes de induzir a agregação de uma proteína-alvo. Além disso, moléculas que são capazes de induzir a formação de beta-agregados intermoleculares estáveis com cinética favorável podem ser muito úteis para aplicações de diagnóstico e terapêuticas (biotecnologia ‘vermelha’), bem como em aplicações de agro-biotech (biotecnologia ‘verde’), aplicações para organismos marinhos e de água doce (biotecnologia ‘azul’), biotecnologia industrial (‘branca’) ou para uso em pesquisa.
SUMÁRIO
[007] A presente invenção proporciona moléculas aprimoradas (aqui, neste pedido de patente, designadas adicionalmente como moléculas de interferon) para provocar a agregação de proteínas selecionadas depois de contato. Estas moléculas de interferon aprimoradas não requerem mais a presença de uma porção de solubilização enquanto conservando as propriedades de estabilidade (isto é, para prevenir agregação prematura) e enquanto ainda sendo capazes de causar co-agregação com uma proteína-alvo. Com agregação prematura, se indica que as moléculas se agregam em um modo tal que não po- dem obter agregação ou inibição de uma proteina-alvo.
[008] Surpreendentemente, foi visto que sequências que induzem agregação as quais são flanqueadas por sequências ou resíduos com um baixo potencial de formação de beta-sheet (isto é, resíduos de ruptura de agregação) são não somente mais solúveis mas conservam ao mesmo tempo propriedades de indução de agregação extremamente eficientes e também específicas. As moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, podem ter mais de uma região de indução de agregação, as quais são então cada uma flanqueadas por resíduos de ruptura de agregação - o mais particularmente, as regiões de indução de agregação são separadas por um ligante. Se as proteínas visadas forem biologicamente ativas ou funcionais, a indução de agregação tipicamente resultará em inibição funcional da proteína. Conforme será evidente a partir dos exemplos anexados, os interferons aprimorados da invenção têm importantes aplicações terapêuticas e de diagnóstico, bem como aplicações em agbio, biotecnologia branca e como uma ferramenta de pesquisa.
[009] Portanto, de acordo com um primeiro aspecto, são proporcionadas moléculas que têm a seguinte estrutura:
[0010] - (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[0011] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[0012] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F esti- ver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[0013] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[0014] Particularmente para moléculas onde n=1, podem ser aplicadas limitações adicionais. Por exemplo, uma série de limitações que é prevista para moléculas onde n é 1, é como se segue:
[0015] - X1 e X2 são 1 ou 2 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;e
[0016] - Y1 é um trecho de 6 a 11 aminoácidos contíguos,
[0017] - no mínimo 75% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos,
[0018] - no qual no mínimo 50% dos aminoácidos são resíduos alifáticos ou F,
[0019] - no qual nenhum resíduo P, R, K, D, E ou H está presente,
[0020] - no qual não mais de um resíduo C, M, N, Q, W, G, S, A ou T está presente,
[0021] - no qual não mais de 3 resíduos Y ou F estão presentes,
[0022] - no qual não dois resíduos não alifáticos idênticos contíguos estão presentes
[0023] - no qual não mais de 2 resíduos alifáticos idênticos contíguos estão presentes,
[0024] - no qual não dois resíduos polares não aromáticos consecutivos estão presentes,
[0025] - em que não mais de 50% de resíduos idênticos estão presentes,
[0026] - em que o 1o. e/ou último resíduo é um resíduo alifático ou F,
[0027] - em que a soma de resíduos A e G é não mais de 2,
[0028] - em que a percentagem total de resíduos A, G e S é não mais de 25%,
[0029] - em que a percentagem total de resíduos C, M, N, Q e W é não mais de 25%,
[0030] - e em que a percentagem total de resíduos pequenos diferentes de V (isto é, selecionados entre A, C, G, S, N, T) é não mais de 25%.
[0031] Será entendido pela pessoa versada que, como Zi é um ligante entre as unidades individuais X2i-1-Yi-X2i e Zn é um ligante opcional em uma extremidade da molécula, a fórmula (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n é equivalente à fórmula (Zi-X2i-1-Yi-X2i)n, em que cada Z2 a Zn é um ligante, e Z1 é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada. Ao invés de afirmar que Zn (ou o Z1 N-terminal equivalente) é nada, também pode ser dito que esta porção está ausente - isto é, Zn ou é um ligante ou está ausente (ou na íntegra: cada Zi é um ligante selecionado de modo independente, e Zn (ou o Z1 N-terminal equivalente) ou é um ligante ou está ausente.
[0032] Uma fórmula alternativa portanto também pode ser: (X2i-1-Yi-X2i)n - com X2i-1 e X2i, Yi, i e n conforme definido acima - em que as n unidades são fundidas juntas com ligantes selecionados de modo independente. As moléculas podem compreender adicionalmente N-e/ou C-terminalmente um ligante adicional. De acordo com esta fórmula, os ligantes estão presentes na porção X2i da i-ésima unidade e uma porção X2i-1 da (i+1)-ésima unidade subsequente, e existe um total de (n-1) ligantes na molécula (isto é, Zi a Zn-1 ou Z2 a Zn); o último ligante (Zn ou Z1 respectivamente) ou é um ligante ou está ausente. Ainda outro modo de reformular a frase, a fórmula é Z0-(X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que X2i-1 e X2i, Yi, i e n são conforme definido acima, cada Zi é um ligante e tanto Z0 quanto Zn são selecionados de modo independente entre um ligante ou nada (isto é, as moléculas têm ou um ligante C- ou N-terminal, nenhum ou ambos).
[0033] Embora as moléculas tipicamente consistiram na estrutura descrita acima, também é previsto que as moléculas consistam essencialmente desta estrutura. Por isto, se indica que, de acordo com modalidades particulares, as moléculas podem conter N- ou C-terminalmente aminoácidos adicionais (isto é, são fundidas N- ou C-terminalmente a aminoácidos adicionais), particularmente 1 a 10 aminoácidos, mais particularmente 1 a 5 aminoácidos. Os aminoácidos adicionais referidos são particularmente previstos para modalidades onde n é no mínimo dois. Os aminoácidos adicionais particularmente não têm nenhum perfil específico, isto é, não são um trecho hidrofóbico tal como a uma ou mais porções Yi - em outras palavras, contêm menos de 50% resíduos hidrofóbicos - ou não são somente selecionados entre os resíduos que compõem uma porção numerada X. No entanto, em alguns casos, particularmente onde uma porção X não contém aminoácidos carregados, é previsto que esta seja adicionalmente flanqueada com um ou dois aminoácidos hidrofóbicos (sobre o lado da porção X que não flanqueia a porção Y). Este é particularmente o caso onde a porção X (não carregada) e os aminoácidos hidrofóbicos são idênticos à sequência de proteína flanqueando a sequência correspondente à porção Yi na proteína; em outras palavras, onde a parte na molécula correspondente na sequência à sequência de proteína compreende no mínimo um porção X além da porção Yi. O mais particularmente, no entanto, as moléculas terminam tanto N- quanto C-terminalmente com uma porção X.
[0034] Conforme mencionado, na fórmula acima n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição. Em outras palavras, i inicia em 1 e é aumentado com 1 com cada repetição até n ser atingido; ou i é o número da repetição (e é um inteiro de 1 a n).
[0035] A fórmula portanto engloba as seguintes estruturas: X1-Y1-X2-Z1 (isto é, n=1),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (isto é, n=2),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3 (isto é, n=3),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4 (isto é, n=4), e
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4-X9-Y5-X10-Z5 (isto é, n=5), em que cada X, Y e Z numerados são conforme definido acima.
[0036] Deve ser observado que as moléculas são lineares, de modo a garantir que as porções Yi possam ser trazidas em contato com as proteínas a serem visadas. Moléculas lineares ramificadas (onde no mínimo duas unidades X2i-1-Yi-X2i de repetição são ligadas de modo independente através de um ligante a outra unidade X2i-1-Yi-X2i) e moléculas cíclicas são somente previstas na medida que as porções Yi sejam acessíveis a outras moléculas.
[0037] Os Yi na fórmula acima são sequências que induzem agregação, pelas quais se indicam sequências de indução de beta-agregação. O mais particularmente, as sequências são sequências de beta-agregação não amiloide (algumas vezes referidas como sequências de beta-agregação amorfas). Beta-agregação amiloide e não amiloide difere na estrutura de ordem superior, na cinética de agregação e nas sequências de proteínas adequadas para agregação (Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006). Na verdade, as preferências de aminoácidos serão muito mais específicas das posições em uma fibra amiloide do que em agregados cruzados-β amorfos. Por exemplo, em hexapeptídeos amiloides, as posições 3 e 4 são extremamente seletivas, uma vez que somente alguns tipos de aminoácidos são compatíveis com uma estrutura amiloide altamente ordenada. Por outro lado, as posições 1, 2 e 6 são muito mais tolerantes, uma vez que quase qualquer tipo de resíduo possibilita a formação de amiloide (Lopez de la Paz et al., PNAS 101:87-92, 2004). Em contraste, quase qualquer resíduo pode ser acomodado em qualquer posição de um hexapeptídeo para ocorrer β-agregação, contanto que a sequência como um todo tenha uma boa propensão a estar em uma conformação β-estendida, e é suficientemente hidrofóbica e/ou de carga neutra (Fernandez-Escamilla et al., Nat Biotechnol 22:1302-1306, 2004). Portanto sequências amilogênicas são mais posição específicas, porém também mais tolerantes a resíduos polares e carregados do que sequências de β-agregação. Isto também vai ter consequências sobre a cinética de ambos os processos. Devido a seus requisitos conformacionais menos rigorosos, a β-agregação é geralmente muito mais rápida do que a amiloideose. Notar no entanto que existe somente uma linha fina dividindp sequências compatíveis com estruturas cru-zadas-β amiloides altamente ordenadas e sequências que formam agregados cruzados-β amorfos (Lopez de la Paz et al., PNAS 101:8792, 2004; Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006). Embora a agregação de amorfos seja essencialmente prevista aqui, neste pedido de patente, uma vez que em algumas situações a agregação de amiloides não é desejável (e portanto deve ser excluída), para muitas aplicações a natureza dos agregados não importa. Portanto, agregados amiloides também são previstos.
[0038] Foi visto que as sequências conforme definido acima têm uma elevada tendência de beta-agregação (esta pode ser determinada usando, por exemplo, algoritmos tais como TANGO, Zyggregator, ...), particularmente uma tendência de beta- agregação não amiloide, em vista das restrições sobre resíduos polares e carregados.
[0039] Específico para as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, é que as sequências que induzem agregação (com alto potencial de formação de beta-sheet) são flanqueadas por resíduos que têm baixo potencial de formação de beta-sheet ou mrdmo ‘rompem’ beta-sheets, denominados resíduos gatekeepers (guardiões). Estas são as porções numeradas X na fórmula. Surpreendentemente, foi visto que sequências que induzem agregação as quais são demar- cadas por semelhantes resíduos específicos, são não somente mais solúveis do que sequências as quais não são flanqueadas por semelhantes gatekeepers, mas conservam ao mesmo tempo propriedades muito boas e específicas de indução de agregação. Especialmente o último é surpreendente, uma vez que geralmente se presume que em proteínas, sequências hidrofóbicas são intercaladas com resíduos polares ou carregados de modo a evitar agregação. Nas moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, os gatekeepers flanqueantes asseguram que a sequência que induz agregação seja adequadamente apresentada à proteína de interesse. Sem ser limitado a um mecanismo em particular, isto pode ser ajudado por estabilização de interações (por exemplo, ligações de H ou complementaridade de carga) entre os resíduos gatekeepers e a proteína de interesse. Isto também pode levar a aumentada especificidade de interação. Notar que a tendência de agregação é em parte determinada pelo ambienteb, as propriedades listadas acima são particularmente previstas em condições fisiológicas, por exemplo, em faixas de pH fisiológico. Isto não implica que os métodos são limitados a condições fisiológicas, uma vez que, por exemplo, a detecção de proteínas pode ocorrer em condições não fisiológicas.
[0040] Os X2i-1 e X2i são trechos contíguos de 1 a 4 aminoácidos específicos selecionados de modo independente: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q. Embora estes aminoácidos possam todos ser usados, são obtidos melhores resultados quando se usa resíduos que raramente estão presentes, ou mesmo não estão presentes, nos trechos Yi hidrofóbicos, particularmente resíduos carregados e/ou não hidrofóbicos, particularmente R, K, E, D, P, N, S, H, Q e G (notar que embora G seja tipicamente considerado como resíduo hidrofóbico, a ausência de cadeias laterais e seu minúsculo tamanho significa que não favorece particularmente a agregação de beta sheet), mais particularmente R, K, E, D, P, e H (isto é, resíduos carregados incluindo H, ou prolina), ainda mais particularmente R, K, E, D, e P (isto é, resíduos carregados ou prolina, a qual devido a sua cadeia lateral particular induz uma torção e é um bom quebrador de peptídeo), o mais particularmente R, K e P (resíduos positivos ou prolina), ou R e P (resíduo positivo não hidrofóbico ou prolina). Alternativamente, R, D e P são previstos como gatekeepers: R é um resíduo mais volumoso e não hidrofóbico do que o K (hidrofóbico) e portanto mais disruptivo para formação de beta-sheet. Apesar de D ser menor, sua carga é mais próxima à espinha dorsal do peptídeo ou da proteína e mais difícil de negar. De acordo com modalidades muito particulares, o mais particularmente quando n é 1, K não é previsto como um gatekeeper - deste modo, os aminoácidos da porção X são selecionados entre R, E, D, P, N, S, A, H, G, e Q ou um subgrupo dos mesmos.
[0041] Conforme será explicado adicionalmente, para modalidades onde n=1, podem ser aplicadas limitações adicionais às moléculas. Isto não é porque estas moléculas são não funcionais, mas ao invés porque a arte anterior pode ter descrito moléculas de natureza peptídica (para um propósito diferente) que têm a mesma estrutura geral conforme descrito aqui. As limitações são particularmente sobre a extensão, e a natureza de resíduos previstos em porções específicas, conforme descrito na descrição detalhada. Embora estas limitações mais rigorosas tipicamente somente serão necessárias para moléculas onde n=1, também são previstas para n=2 (ou mesmo n superior).
[0042] De acordo com modalidades particulares, cada X2i-1 e X2i é 1 ou 2 aminoácidos. Resíduos adicionais da sequência de agregação desempenham menos de um papel na manutenção da molécula em solução. De acordo com modalidades alternativas, mas não exclusivas, cada X2i-1 e X2i tem uma carga total de não mais de 2. Alternativamente, o número total de aminoácidos em ambas as porções X é 5 ou menos, particularmente 4 ou menos. Modalidades alternativas proporcionam que a carga total de ambas as porções X em torno da região Y hidrofóbica é menos de 5, particularmente 4 ou menos. As modalidades neste parágrafo são o mais particularmente previstas para moléculas onde n é 1, ou moléculas onde n é dois.
[0043] O Yi conforme descrito na fórmula aqui, neste pedido de patente, é uma sequência de beta-agregação. Mais particularmente, é um trecho de 4 a 17, particularmente de 4 a 16, ou de 4 a 15 aminoácidos contíguos selecionado de modo independente, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T. Particularmente, não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente na sequência. No entanto, de acordo com modalidades muito particulares, dois resíduos selecionados entre R, K, D e E podem estar presentes, contanto que a carga líquida seja zero (isto é, se suas cargas forem opostas). Como K é mais previsto do que R em um trecho hidrofóbico, dois resíduos selecionados entre K, D e E podem estar presentes na porção Yi. Como a carga precisa ser zero nestas modalidades, isto é equivalente a dizer que dois resíduos carregados estão presentes, um dos quais é um resíduo K e o outro é selecionado entre um resíduo D e E. De acordo com modalidades adicionais específicas, ou nenhum resíduo P, R, K, D ou E está presente na porção Yi, ou dois resíduos carregados estão presentes os quais têm uma carga complementar (de modo que a carga líquida é zero).
[0044] A extensão da sequência de agragação tipicamente será influenciada pela especificidade desejada, a facilidade de síntese e a sequência da proteína de interesse. De acordo com modalidades particulares, no mínimo um, e particularmente todos, Yi são um trecho de 4 a 17 aminoácidos, de 4 a 16 aminoácidos, de 4 a 15 aminoácidos, de 4 a 14 aminoácidos, de 4 a 13 aminoácidos, particularmente de 4 a 11 aminoácidos, de 4 a 10 aminoácidos, de 4 a 9 aminoácidos, ou de 4 a 8 aminoácidos. De acordo com modalidades adicionais específicas, a extensão do trecho Yi for de no mínimo 5 aminoácidos. Por conseguinte, no mínimo um, e particularmente todos, Yi são um trecho de 5 a 13 aminoácidos, particularmente de 5 a 11 aminoácidos, de 5 a 10 aminoácidos, de 5 a 9 aminoácidos, ou de 5 a 8 aminoácidos. De acordo com modalidades adicionais específicas, a extensão do trecho Yi for de no mínimo 6 aminoácidos. Por conseguinte, no mínimo um, e particularmente todos, Yi são um trecho de 6 a 13 aminoácidos, particularmente de 6 a 11 aminoácidos, de 6 a 10 aminoácidos, de 6 a 9 aminoácidos, ou de 6 a 8 aminoácidos.O mais particularmente, no mínimo um, e particularmente todos, Yi são trechos de 6 ou 7 aminoácidos. Os trechos referidos mais curtos do que 16 aminoácidos são particularmente previstos em modalidades onde n é 1.
[0045] Notar que trechos mais longos do que 16 aminoácidos (por exemplo, até 20 aminoácidos) são possíveis, mas apenas adicionam especificidade a uma proteína de interesse (vide a Figura 2) enquanto aumentam a dificuldade e o custo de síntese, bem como a redução a solubilidade das moléculas. A facilidade de síntese e manipulação também é o motivo pela qual moléculas em que n é 1 ou 2 são particularmente previstas aqui, neste pedido de patente. No entanto, para abordagens transgênicas ou quando as moléculas são produzidas de modo recombinante, a extensão é muito menos de um fator de limitação (de custo), e particularmente nestas abordagens também é previsto que funcione com moléculas mais longas.
[0046] É um objetivo proporcionar moléculas que são capazes de especificamente hiporregulação de proteínas, particularmente em uma maneira sequência-dependente. Portanto, de acordo com um aspecto específico, no mínimo um do Yi na molécula é um trecho de 4 a 16 aminoácidos que é idêntico a um trecho contíguo que ocorre naturalmente em uma proteína. De acordo com aspectos adicionalmente específicos, este é o caso para mais de um Yi na molécula, particularmente para dois Yi ou no mínimo dois Yi na molécula, o mais particularmente para todos os Yi na molécula. As diferentes extensões previstas também se aplicam a esta modalidade.
[0047] Isto se baseia na surpreendente observação de que a beta-agregação não amiloide é sequência-específica. Na verdade, geralmente foi aceito que como, contrário à agregação amiloide, quase qualquer resíduo pode ser acomodado em qualquer posição para ocorrer β-agregação, contanto que a sequência como um todo tenha uma boa propensão a estar em uma conformação β-estendida, e seja sufficientemente hidrofóbica e/ou neutra em carga, a beta-agregação amorfa não foi sequência-específica mas dependeu de interações hidrofóbicas e de ligação de H. Surpreendentemente, a tendência de agregação para uma dada sequência é muito maior com um trecho de sequência idêntica do que com outra sequência hidrofóbica, na medida que possa ser usado para agregação específica (inibição e/ou detecção) de proteínas em misturas de complexos.
[0048] De acordo com modalidades particulares, o no mínimo um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína é único para a referida proteína no organismo (ou espécie) no genoma do qual a proteína é codificada. Em outras palavras, a sequência corresponde ou é idêntica a somente uma outra sequência de proteína no proteoma do referido organismo / da referida espécie. O resultado é que, se a molécula referida for administrada a um organismo da referida espécie, somente aquela proteína será hiporregulada.
[0049] De acordo com modalidades alternativas, a sequência não é necessariamente única para a proteína, mas é única para o orga- nismo ou a espécie. Isto pode ser previsto quando as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, são administradas a mais de uma espécie diferente simultaneamente (por exemplo, uma mistura de micro-organismos), ao passo que somente em uma espécie uma ou mais proteínas precisam ser reguladas negativamente (por exemplo, para ter por alvo uma espécie patogênica, ao mesmo tempo não interferindo com organismos benéficos). De acordo com modalidades adicionais particulares, a sequência é única para a proteína e única para o organismo / a espécie.
[0050] Ao invés de espécie, as considerações acima também podem se aplicar a um gênero, a uma família, a uma ordem ou a uma classe de organismos, embora a probabilidade de conservação de sequência, e de descoberta de uma sequência única, diminua com o aumento na classificação taxonômica.
[0051] De acordo com ainda outras modalidades alternativas, o no mínimo um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína está presente em mais de uma proteína do organismo ou espécie no genoma do qual a referida proteína é codificada. Isto é, a sequência corresponde ou é idêntica a mais de uma sequência de proteína diversa no proteoma do referido organismo / da referida espécie. Isto possibilita que mais de uma proteína seja hiporregula-da. Ainda outra alternativa (não exclusiva) é que o trecho de sequência está presente em uma proteína de mais de um organismo / espécie. Portanto, a sequência corresponde ou é idêntica a no mínimo uma sequência de proteína diversa no proteoma de no mínimo dois organismos / espécies diferentes. Isto possibilita a hiporregulação de uma proteína em mais de um organismo. Isto pode ser útil para reatividade cruzada (por exemplo, para permitir a uso de uma molécula em sujeitos de diferentes espécies). No entanto, também é prevista particularmente para hiporregulação simultânea de proteínas em organismos (particularmente infec- ciosos) enquanto administrando somente uma molécula a um sujeito. Logicamente também são previstas combinações de ambos, isto é, o trecho está presente em mais de uma proteína e mais de um organismo / espécie. Aqui também, espécie pode ser substituída com gênero, família, ordem ou classe de organismos.
[0052] Deve ser observado que o direcionamento de mais de uma proteína ou mais de um organismo / espécie também podem ser obtido usando moléculas com no mínimo duas regiões Yi, em que no mínimo duas das regiões Yi correspondem a um trecho em no mínimo duas proteínas diferentes, e/ou a um trecho em no mínimo dois organismos / espécies / etc diferentes. As no mínimo duas regiões Yi podem ser (cada uma de modo independente) única para uma proteína ou organismo, ou pode ocorrer em mais de uma proteína ou organismo.
[0053] Tipicamente, o trecho Yi que é idêntico a um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína será completamente idêntico ao da proteína. No entanto, em alguns casos, é previsto que podem ser usadas sequências não idênticas, porém intimamente relacionadas, isto é, sequências as quais têm uma ou duas substituições. De modo a manter a especificidade, é previsto que para substituições não conservadoras, para trechos Yi de menos de 6 aminoácidos, somente é tolerada uma diferença de aminoácidos. Para sequências de no mínimo 6 aminoácidos (particularmente no mínimo 7 ou no mínimo 8 aminoácidos), um ou dois aminoácidos podem ser substituídos. Portanto, de acordo com modalidades específicas, no mínimo um Yi difere com não mais de uma substituição de aminoácido de um trecho em uma proteína que ocorre naturalmente se a extensão daquele Yi for de menos de 6 aminoácidos, ou no mínimo um Yi difere com uma ou duas substituições de aminoácido de um trecho em uma proteína que ocorre naturalmente se a extensão daquele Yi for de no mínimo 6 aminoácidos. Em tais casos, as substituições são tipicamente em comparação com o trecho presente na proteína de interesse (isto é, o trecho Yi é idêntico ao trecho presente na proteína de interesse com a exceção da uma (ou duas) substituições de aminoácido). Conforme a pessoa versada perceberá, fazer uma substituição (particularmente não conservadora) pode resultar em especificidade alterada (isto é, fazer o trecho idêntico a um trecho de outra proteína no organismo), portanto deve ser verificado se isto acontece se o direcionamento alterado for indesejado. (Em alguns casos, pode ser desejado o direcionamento de mais de uma proteína, vide também abaixo). De modo a assegurar que a substituição não resulte em excessiva perda de especificidade, preferencialmente a substituição é feita somente em uma ou duas das regiões Yi. De acordo com modalidades específicas, se uma região Yi com um aminoácido substituído estiver presente, no mínimo uma outra região Yi está presente em que não ocorreu nenhuma substituição.
[0054] De acordo com modalidades particulares, a substituição é com um resíduo gatekeeper, particularmente com um resíduo selecionado entre R, K, E, D, P, N, S, A, H, G, Q, mais particularmente selecionado entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionado entre resíduos R, K e P.
[0055] De acordo com modalidades alternativas, substituição é substituição conservadora. Isto é previsto quando é prevista a hiporre-gulação de uma família de proteínas, e as proteínas compartilham um motivo de sequência conservado, mas não idêntico. Em tais casos, pode ser obtida agregação destas proteínas intimamente relacionadas usando um motivo de sequência de consenso (isto é, uma sequência similar, mas não idêntica, onde ‘similar’ é usado no contexto de alinhamento de sequência). No entanto, é possível que a agregação seja menos eficiente quando a correspondência de sequência não é de 100%.
[0056] De acordo com ainda modalidades adicionais alternativas, substituição é substituição de um resíduo com tendência a beta-sheet relativamente baixa por um resíduo com maior tendência a beta-sheet; de modo a reforçar a agregação. Tipicamente, um resíduo com um escore de Chou-Fasman P(b-sheet) menor do que 100 pode ser substituído com um resíduo com um escore de P(b-sheet) > 100.
[0057] Notar que substituição é sempre com o mesmo número de resíduos; deleções ou inserções vão abolir a beta-agregação específica.
[0058] De acordo com modalidades específicas, n é maior do que um (isto é, dois a cinco), significando que mais de uma região Yi está presente na molécula (no mínimo duas, e até cinco). Para ter por alvo uma proteína, somente uma região Yi idêntica a um trecho nesta proteína precisa estar presente na molécula. Regiões Yi adicionais podem ser, por exemplo, sequências sintéticas que induzem agregação. Tipicamente no entanto, de acordo com modalidades particulares para detecção ou hiporregulação de proteínas, quando n é maior do que um, no mínimo dois, e particularmente todos, Yi são um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína. (Para cada trecho independentemente, aplicam-se as considerações acima). De acordo com modalidades adicionais particulares, os no mínimo dois Yi ocorrem na mesma proteína. Isto aumenta a probabilidade de fazer com que a proteína agregue. De acordo com modalidades adicionais particulares, os referidos no mínimo dois Yi estão parcialmente sobrepostos. Este pode ser o caso quando a proteína de interesse tem um longo trecho que satisfaze os critérios para a região Yi da molécula. Neste caso, um Yi da molécula pode corresponder a uma parte do trecho na proteína, enquanto outro Yi corresponde a outro, parcialmente sobrepondo parte do mesmo trecho. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, os no mínimo dois Yi são idênticos. Portanto, quando duas regiões Yi correspondem a trechos na mesma proteína, podem ser idênticas ou diferentes.
[0059] Em modalidades alternativas, no entanto, é previsto que os no mínimo dois Yi podem ser usados para obter direcionamento de mais de uma proteína. Portanto, nestas modalidades, os no mínimo dois Yi são derivados de (no mínimo duas) proteínas diferentes, isto é, sobre sua extensão, a sequência dos no mínimo dois Yi corresponde a ou é idêntica a no mínimo duas sequências de proteínas diferentes. O número de proteínas pode ser tão elevado quanto o número de regiões Yi, mas logicamente, também é possívle que, por exemplo, 4 regiões Yi são usadas para ter por alvo duas proteínas diferentes.
[0060] De modo similar, de acordo com modalidades alternativas, os no mínimo dois Yi podem ser usados para obter direcionamento de mais de um organismo / espécie. Portanto, nestas modalidades, os no mínimo dois Yi são derivados de (no mínimo dois) organismos / espécies diferentes, isto é, a sequência dos no mínimo dois Yi corresponde a ou é idêntica a no mínimo uma sequência de proteína diversa no proteoma de no mínimo dois organismos / espécies diferentes. Aqui também, espécie pode ser substituída por gênero, família, ordem ou classe de organismos.
[0061] Conforme mencionado anteriormente, sequências de β-agregação são menos tolerantes à presença de resíduos polares e particularmente carregados do que sequências amilogênicas. Por conseguinte, em modalidades específicas, a carga total de no mínimo um Yi, particularmente de no mínimo dois Yi, mais particularmente de cada Yi é não maior do que 1. De acordo com modalidades adicionais específicas, o número de resíduos carregados em no mínimo um Yi, particularmente de no mínimo dois Yi, mais particularmente de cada Yi é não maior do que 1. O mais particularmente no entanto, o número de resíduos carregados ou prolinas em uma porção Yi é zero.
[0062] Conforme esboçado na fórmula acima, as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, também contêm porções de ligante, Zi. De acordo com modalidades particulares, as moléculas somente contêm ligantes internos e não contêm ligantes de N- ou C-terminal. Portanto, em modalidades específicas, Zn é nada (ou é um ligante de zero unidades de ligação).
[0063] A natureza das porções de ligante não é vital para a invenção, enbora ligantes flexíveis e longos não sejam usados preferencialmente. De acordo com modalidades particulares, cada Zi é selecionado de modo independente entre um trecho de entre 0 e 20 unidades idênticas ou não idênticas, em que uma unidade é um aminoácido, um monossacarídeo, um nucleotídeo ou um monômero. Unidades não idênticas podem ser unidades não idênticas da mesma natureza (por exemplo, diferentes aminoácidos, ou alguns copolímeros). Também podem ser unidades não idênticas de uma natureza diferente, por exemplo, um ligante com unidades de nucleotídeos e aminoácidos, ou um heteropolímero (copolímero) compreendendo duas ou mais espécies monoméricas diferentes. De acordo com modalidades particulares, a extensão de no mínimo um, e particularmente cada Zi diferente de Zn, é de no mínimo 1 unidade. De acordo com outras modalidades particulares, Zn é 0 unidades. De acordo com modalidades particulares, todos os Zi ligantes diferentes de Zn são idênticos. De acordo com modalidades adicionais, todas as porções Zi são idênticas.
[0064] De acordo com modalidades específicas, no mínimo um, e particularmente todos, Zi são de entre 0 e 10 unidades da mesma natureza, particularmente entre 0 e 5 unidades da mesma natureza. De acordo com modalidades particulares, no mínimo uma porção Zi, e particularmente todas as porções Zi com a exceção de Zn, é um ligante de peptídeos ou polipeptídeos. Sequências previstas em particular de semelhantes ligantes incluem, mas não estão limitadas a, PPP, PP ou GS. O ligante também pode ser de uma natureza química. Ligantes químicos previstos em particular incluem PEG e Ttds (tambérm conhe- cido como ácido 4,7,10-trioxatridecan-13-succinâmico).
[0065] Tipicamente, não são usados ligantes longos. No entanto, de acordo com as modalidades particulares onde as porções Yi correspondem a regiões de indução de agregação de mais de uma proteína, é previsto que podem ser usados ligantes longos. Na verdade, de modo a assegurar que a molécula pode (por exemplo, simultaneamente) interagir com mais de uma proteína, pode ser benéfico aumentar a distância entre as diferentes porções Yi de direcionamento, de modo a que a interação não seja evitada devido a impedimento estérico. Nestes casos, o Zi ligante pode ser um trecho de entre 0 e 100 unidades idênticas ou não idênticas, em que uma unidade é um aminoácido, um monossacarídeo, um nucleotídeo ou um monômero; ou de entre 0 e 90, 0 e 80, 0 e 70, 0 e 60, 0 e 50, 0 e 40, 0 e 30 ou 0 e 20. Particularmente, a mínima extensão do Zi ligante é de no mínimo 1 unidade, no mínimo 2 unidades, no mínimo 3 unidades, no mínimo 4 unidades, ou no mínimo 5 unidades.
[0066] No caso das porções Yi serem idênticos a regiões de agregação de duas proteínas diferentes, as moléculas são denominadas bi-específicas (para três proteínas, tri-específicas, e assim por diante).
[0067] De acordo com modalidades específicas, a extensão total das moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, não excede 60, 55 ou 50 aminoácidos. Mais particularmente, a extensão não excede 40 aminoácidos, 30 aminoácidos, 25 aminoácidos ou ainda 20 aminoácidos.
[0068] Moléculas em previstas particular são aquelas onde n=1 ou n=2, por exemplo, aquelas com a seguinte estrutura: X1-Y1-X2-Z1 (isto é, n é 1), em que X1 e X2 são no total não mais de 5 aminoácidos; Y1 é um trecho de entre 4 e 10 aminoácidos e Z1 é um trecho de 0 unidades; e X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (isto é, n é 2), em que Z1 é um ligante e Z2 é nada.
[0069] A molécula pode compreender adicionalmente (ou pode ser adicionalmente fundida a) outras porções. É previsto particularmente que a molécula compreende adicionalmente uma etiqueta detectável. A etiqueta detectável pode ser fundida à molécula N- ou C-terminalmente ou mesmo internamente (por exemplo, através do ligante, ou o ligante pode ser usado como a etiqueta detectável). Alternativametne, a etiqueta detectável pode se referir à uso de um ou mais aminoácidos marcados em uma ou mais das porções X-Y-Z da molécula (por exemplo, aminoácidos com etiqueta fluorescente ou radioativa).
[0070] Como as porções Yi idênticas a uma região em uma proteína podem direcionar a proteína especificamente (com a condição de que a sequência seja única para a proteína no organismo no genoma do qual a referida proteína é codificada), outra porção que pode ser anexada às moléculas é uma molécula pequena ou um fármaco, de modo que esta molécula pequena ou fármaco pode ser direcionada para a proteína correta, compartimento celular, tipo de célula, ... onde precisa ser liberado. Nestes casos, no mínimo uma das regiões Yi será idêntica a uma sequência de uma proteína que está presente onde o fármaco ou molécula pequena precisa ser liberado.
[0071] Outra porção a qual pode ser anexada à molécula é uma porção que aumenta a solubilidade da molécula. As porções referidas são de conhecimento geral na arte, e exemplos incluem, mas não estão limitados a PEG (polietileno glicol) ou derivados de PEG, um peptídeo, uma proteína ou um domínio de proteína. A natureza da porção vai depender a aplicação, conforme pode ser determinado pela pessoa versada.
[0072] Notar que, para modalidades onde Zn está presente, a etiqueta detectável (ou outra porção, como uma etiqueta de solubilização) pode ser fundida à porção de ligante de Zn. (Embora esta notação venha a implicar que a etiqueta é adicionada no C-término, também são previstas etiquetas N-terminal - isto corresponde à notação equivalente de (Zi-X2i-1-Yi-X2i)n, em que cada Z2 a Zn é um ligante, e Z1 é o ligante ao ual a etiqueta é fundida).
[0073] Nestes casos onde outras porções são funfidas às moléculas, é previsto em modalidades particulares que estas porções podem ser removidas da molécula. Tipicamente, isto será feito através de incorporação de um sítio de clivagem de protease específico ou uma abordagem equivalente. O sítio de clivagem pode ser incorporado separadamente ou pode ser uma parte integral do ligante de Zn externo (ou ligante de Z1 externo se a porção for N-terminal). De acordo com modalidades muito específicas, a porção pode ser parte de um ligante de Zi interno, ou pode ainda ser o ligante de Zi inteiro.
[0074] Em muitas aplicações típicas, as moléculas de interferon descritas aqui, neste pedido de paente, podem ser usadas ou adicionadas no estado em que se encontram. No entanto, de acordo com um aspecto muito particular, é previsto que estas moléculas sejam proporcionadas como ácidos nucleicos codificando as moléculas. É desnecessário dizer que as moléculas de interferon de acordo com estas modalidades são intireiramente de natureza polipeptídica, uma vez que precisam ser capazes de ser codificadas. Isto é, todas as porções X, Y e Z numeradas presentes nas moléculas de interferon são de natureza polipeptídica.
[0075] Portanto, de acordo com estas modalidades, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que codifica (ou cuja sequência codifica) uma molécula tendo a estrutura conforme descrito acima, particularmente a seguinte estrutura:
[0076] (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[0077] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[0078] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[0079] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[0080] É previsto em particular que as sequências de ácidos nucleicos codificam as moléculas com todas as limitações e variações descritas aqui, neste pedido de patente, mutatis mutandis. Portanto, o polipeptídeo codificado é em essência conforme descrito aqui, neste pedido de patente, isto é, as variações mencionadas para as moléculas de interferon que são compatíveis com este aspecto também são previstas como variações para o polipeptídeos codificado pelas sequências de ácidos nucleicos. A título de exemplo, modalidades especificando a sequência ou a extensão das porções X ou Y são compatíveis com serem codificadas em ácidos nucleicos, modalidades em que a porção Z é de uma natureza de não aminoácido não são.
[0081] De acordo com modalidades específicas, a sequência de polipeptídeo codificada é um polipeptídeo que não ocorre naturalmente. De acordo com modalidades adicionais particulares, a molécula de ácido nucleico é um gene artificial. Como o aspecto do ácido nucleico é o mais particularmente adequado em aplicações que fazem uso de expressão transgênica, modalidades previstas em particular são aque- las onde a molécula de ácido nucleico (ou o gene artificial) é fundida a outra porção, particularmente a ácidos nucleicos adicionais codificando uma porção que aumenta a solubilidade e/ou a estabilidade do produto genético. Na verdade, a expressão transgênica de peptídeos algumas vezes pode ser difícil devido à rápida degradação do produto.
[0082] Também proporcionados neste aspecto são vetores recombinantes compreendendo a referida uma molécula de ácido nucleico codificando (ou com uma sequência codificando) uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Estes vetores recombinantes são idealmente convenientes como um veículo para carregar a sequência de ácido nucleico de interesse para dentro de uma célula onde a proteína a ser hiporregulada é expressada, e acionar a expressão do ácido nucleico na referida célula. O vetor recombinante pode persistir como uma entidade separada na célula (por exemplo, como um plasmídeo ou um veículo viral ou não viral), ou pode ser integrado no genoma da célula.
[0083] Por conseguinte, são proporcionadas células aqui, neste pedido de patente, compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando (ou com uma sequência codificando) uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente, ou compreendendo um vetor recombinante que contém uma molécula de ácido nucleico codificando a molécula de interferon referida. A célula pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. No último caso, pode ser uma célula de levedura, de algas, de planta ou de animal (por exemplo, célula de inseto, de mamífero ou humana). De acordo com modalidades particulares, a célula é proporcionada como uma linhagem celular.
[0084] No entanto, a célula pode ser também parte de um organismo (ou por exemplo, a célula-tronco). Por conseguinte, em modalidades particulares são proporcionados organismos transgênicos, não humanos compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando (ou com uma sequência codificando) uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente, ou compreendendo um vetor recombinante que contém uma molécula de ácido nucleico codificando uma molécula de interferon referida. O organismo pode ser qualquer organismo (inclusive micro-organismo). É previsto em particular que o organismo transgênico é um organismo mamífero, não humano. De acordo com ainda outras modalidades alternativas, a abordagem transgênica é usada em animais não humanos, por exemplo, para validação alvo em modelos de doenças em animais. Isto pode ser em mamíferos (por exemplo, camundongos transgênicos) ou outros vertebrados, ou ainda em animais não vertebrados, por exemplo, nematódeos (tais como C. elegans) ou moscas das frutas (tais como D. melanogaster).
[0085] De acordo com modalidades particulares alternativas, a abordagem transgênica (isto é, a provisão de moléculas de interferon codificadas em ácido nucleico ao invés de diretamente como polipeptídeos) é particularmente adequada para uso em plantas. Por conseguinte, são proporcionadas plantas, ou células de plantas, ou sementes de plantas, aqui, neste pedido de patente, que contêm uma molécula de ácido nucleico, gene artificial ou um vetor recombinante conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Ou, as células ou organismos transgênicos proporcionados aqui, neste pedido de patente, são plantas, células de plantas ou sementes de plantas.
[0086] De acordo com um aspecto adicional, as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, podem ser usadas para hiporregu-lação de ou inibir a função de uma proteína. Tipicamente, isto é obtido por indução de agregação da referida proteína. De acordo com estas modalidades, são proporcionados métodos para hiporregulação da função de uma proteína compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[0087] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[0088] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[0089] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína; e
[0090] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[0091] Particularmente, para moléculas onde n é 1, podem ser aplicadas limitações adicionais. Por exemplo, X1 e X2 podem ser cada um 1 ou 2 aminoácidos ao invés de 1 a 4. X1 e X2 também podem ser selecionados entre P, R, K, D, E. A extensão da porção Y1 pode ser adaptada.
[0092] Nenhuma destas limitações é necessária para resultar em hiporregulação de moléculas, porém elas descrevem modalidades que funcionam particularmente bem. Uma limitação em particular que também é prevista para métodos para hiporregulação de proteína onde n é 1, é que Y1 é um trecho de 4 a 11 aminoácidos contíguos. Outra limitação em particular (a qual, como a maioria das limitações aqui, neste pedido de patente, pode ser combinada) é que Z1 não é um ligante de aminoácidos. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, Z1 é nada (isto é, um ligante de 0 unidades).
[0093] Para as moléculas, aplicam-se as mesmas considerações e limitações conforme acima. Em particular, deve ser observado que, contanto que seja obtida a regulação para baixao da função, uma ou duas substituições no Yi que ocorre na proteína podem ser toleradas, conforme descrito anteriormente.
[0094] De acordo com modalidades adicionais particulares, estes métodos são proporcionados para hiporregulação de uma proteína em uma situação de doença, ou para produzir um diagnóstico. Isto é equivalente a dizer que, nestas modalidades, uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[0095] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n (ou i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição);
[0096] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[0097] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 15 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína; e
[0098] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[0099] para uso como um medicamento ou diagnóstico.
[00100] Aqui também, é particularmente previsto que se n for 1, Y1 é um trecho de 4 a 11 aminoácidos contíguos. Além disso, se ni for 1, é particularmente previsto que Z1 não é um ligante de aminoácidos. De acordo com modalidades adicionais, Z1 é nada.
[00101] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, métodos e usos são frequentemente intercambiáveis, isto é, uma molécula para uso como um medicamento, ou mais particularmente uma molécula para uso no tratamento de uma doença específica é equivalente a um método para tratar a doença compreendendo a uso de (por exemplo, contactar com) a molécula, é equivalente à uso das moléculas para a fabricação de um medicamento para o tratamento da doença. Portanto, reivindicações de ‘segundo uso para fins medicinais’, reivindicações de ‘método de tratamento’ e as chamadas reivindicações de ‘estilo suíço’ são usadas de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente, e quando um destes é listado, os outros também estão implícitos.
[00102] Uma vez que as moléculas são proporcionadas para uso como um medicamento ou diagnóstico, ou em métodos de tratamento ou diagnóstico, também é previsto que podem ser proporcionadas como farmacêutico. Por conseguinte, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo as moléculas conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Particularmente, as composições farmacêuticas compreendem no mínimo uma molécula tendo a seguinte estrutura:
[00103] (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00104] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00105] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 15 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00106] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00107] e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00108] Mais particularmente, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo no mínimo uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00109] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00110] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 15 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; em que no mínimo um Yi é um trecho de 4 a 15 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína; e
[00111] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo indepen- dente entre um ligante ou nada;
[00112] e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00113] O mais particularmente, nas composições farmacêuticas, no mínimo um Yi das moléculas está presente em uma proteína a ser hiporregulada no sujeito ao qual a composição será administrada. Notar que isto não implica que esta proteína é codificada no genoma deste sujeito. Na verdade, para sujeitos que estejam sofrendo de infecção, é previsto que as moléculas são administradas para as proteínas-alvo do organismo infeccioso e não do próprio sujeito.
[00114] De acordo com modalidades particulares, a molécula pode ser proporcionada em forma liofilizada com um tampão fisiológico. De acordo com modalidades particulares, as composições farmacêuticas, se um líquido, são proporcionadas em pH fisiológico, em particular entre pH 5 e 9, mais particularmente entre pH 6 e pH 8.
[00115] Em modalidades específicas, as moléculas podem ser usadas para hiporregulação de uma (uma ou mais) proteína que precise ser hiporregulada em uma situação de doença.
[00116] Por conseguinte, moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n são proporcionadas para uso em tratamento ou prevenção de uma doença, em que:
[00117] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n (ou i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição);
[00118] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00119] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifáti- co ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com a doença; e
[00120] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00121] Conforme mencionado anteriormente, as moléculas proporcionadas para uso no tratamento ou prevenção de uma doença é equivalente a dizer que são proporcionados métodos para tratar ou prevenir doença em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo: administrar ao sujeito uma molécula tendo a estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00122] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n (ou i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição);
[00123] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00124] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre natural- mente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com a doença; e
[00125] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00126] Outro modo equivalente de reformular isto é que são proporcionadas usos de moléculas tendo esta estrutura para a fabricação de um medicamento para tratamento da doença.
[00127] O sujeito particularmente é um animal, mais particularmente um mamífero (por exemplo, gato, cão, coelho, cavalo, vaca, porco, carniro, cabra, lhama, camundongo, rato, macaco, primata diverso...), o mais particularmente um ser humano.
[00128] Doenças previstas em particular incluem, mas não estão limitadas a, câncer, degeneração macular relacionada com a idade (AMD) e inflamação. Portanto, as moléculas podem ser proporcionadas para tratamento destas doenças (ou são proporcionados métodos para o tratamento destas doenças; ou usos de moléculas para a fabricação de um medicamento para o tratamento destas doenças), em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com câncer, degeneração macular relacionada com a idade, ou inflamação / doença inflamatória respectivamente.
[00129] O mais particularmente, a proteína a ser hiporregulada no câncer é VEGFR-2 ou EGFR. Além disso o mais particularmente, a proteína a ser hiporregulada na degeneração macular relacionada com a idade é VEGFR-2. As proteínas mais particularmente previstas para hiporregulação em doença inflamatória incluem TNF-α e IL-1β.
[00130] De acordo com um aspecto adicional, as moléculas são usadas como um medicamento em doença infecciosa. Isto é, são usadas para hiporregulação da função de proteínas em organismos causando infecções em um sujeito, os referidos organismos como vírus, bactérias, fungos, ou macroparasitas tais como carrapatos, ácaros, nematódeos, platelmintos etc. Por conseguinte, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00131] - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00132] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00133] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo patogênico; e
[00134] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00135] para uso como um composto antipatogênico.
[00136] Isto é equivalente a dizer que são proporcionados métodos para prevenir ou tratar infecção patogênica em um sujeito que necessite dos mesmos, compreendendo:
[00137] administrar ao sujeito uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00138] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00139] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00140] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo patogênico; e
[00141] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00142] Outra reformulação equivalente é que são proporcionados usos de moléculas tendo esta estrutura para a fabricação de um medicamento para tratamento de infecção com um organismo patogênico.
[00143] De acordo com modalidades muito específicas, a região Yi pode conter exatamente 2 resíduos carregados (selecionados entre R, K, D, E), contanto que a carga líquida da região Yi seja zero. Mais particularmente no entanto, a região Yi não contém qualquer resíduo carregado (ou prolina para esta questão).
[00144] Os patógenos podem ser organismos virais. Por conseguinte, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00145] - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00146] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00147] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo viral; e
[00148] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00149] para uso como um antiviral.
[00150] Isto é equivalente a dizer que são proporcionados métodos para prevenir ou tratar infecção viral em um sujeito que necessite dos mesmos, compreendendo:
[00151] administrar ao sujeito uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00152] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00153] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00154] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo viral; e
[00155] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo indepen- dente entre um ligante ou nada.
[00156] Outra expressão equivalente é que são proporcionadas usos de moléculas tendo esta estrutura para a fabricação de um medicamento para tratamento de infecção com um organismo viral.
[00157] Particularmente, as moléculas são usadas como agentes antimicrobianos. Portanto, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00158] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n (ou i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição);
[00159] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00160] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano; e
[00161] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00162] para uso como um antimicrobiano.
[00163] Isto é equivalente a dizer que são proporcionados métodos para prevenir ou tratar infecção microbiana em um sujeito que necessite dos mesmos, compreendendo:
[00164] administrar ao sujeito uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00165] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00166] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00167] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano; e
[00168] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00169] Outro expressão equivalente é que são proporcionadas usos de moléculas tendo esta estrutura para a fabricação de um medicamento para tratamento de infecção com um organismo microbiano.
[00170] Etapas adicionais destes métodos podem incluir a avaliação (ou a medição) da presença do organismo patogênico, viral ou microbiano.
[00171] De acordo com modalidades particulares onde o patógeno é um organismo microbiano, a proteína de um organismo microbiano é uma proteína de um organismo microbiano selecionado entre bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, micobactérias, protozoários, Archaea, fungos (tais como leveduras e mofos). Mais particularmente, é uma proteína de bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, micobactérias, e fungos.
[00172] De acordo com modalidades particulares, o organismo pa- togênico é um organismo, cepa ou variante resistente a fármaco. Portanto, a proteína do organismo patogênico é uma proteína de um organismo, cepa ou variante resistente a fármaco. A administração de moléculas direcionadas para estes organismos ainda terá um efeito sobre estes organismos, conforme é mostrado na seção de Exemplos.
[00173] Um exemplo particular de resistência a fármaco é resistência a antibiótico. De acordo com modalidades particulares, a proteína de um organismo microbiano é uma proteína de um organismo, cepa ou variante resistente a antibiótico. A administração de moléculas direcionadas para estes organismos ainda terá um efeito sobre estes organismos, conforme é mostrado na seção de Exemplos. Mais particularmente, são proporcionados métodos para administração em que as moléculas conforme descrito aqui, neste pedido de patente, são administradas no mínimo uma vez ao dia por no mínimo dez dias. Particularmente, este regime de tratamento não é acompanhado pelo desenvolvimento de resistência a antibiótico. Portanto, estas modalidades pressupóem que os valores da MIC acima desta faixa no tempo não aumentam mais de quatro vezes, ou não dobram. O mais particularmente, é previsto que, durante administração prolongada, o valor da MIC da molécula de interferon para o organismo microbiano específico permanece abaixo do ponto de interrupção clínico da molécula de interferon para o organismo microbiano específico.
[00174] De acordo com modalidades específicas, as moléculas podem ser usadas para matar o organismo patogênico (por exemplo, microbiano), ou os métodos resultam na destruição do organismo patogênico (por exemplo, microbiano). De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, as moléculas têm sucesso em destruir rapidamente o organismo patogênico (por exemplo, microbiano), particularmente dentro de uma hora ou menos, ou dentro de 30 minutos ou menos. De acordo com modalidades alternativas, os métodos usando as moléculas inibem o crescimento e/ou a reprodução do organismo patogênico (por exemplo, microbiano) sem o matar. Vírus neste contexto também são considerados como organismos ‘vivos’, por exemplo uma redução no título viral é indicativa de destruição do organismo viral, ao passo que, por exemplo, a estabilização do título viral é indicativa de inibição de reprodução.
[00175] De acordo com modalidades particulares, a proteína do organismo patogênico / viral / microbiano é uma proteína essencial, isto é, o organismo não pode sobreviver caso exaurido da proteína. De acordo com outras modalidades particulares (não exclusivas), a proteína do organismo patogênico (por exemplo, microbiano) está envolvida na formação de biofilme. De acordo com modalidades adicionais, são proporcionados métodos para tratar ou prevenir a formação de biofilme, em que a proteína do organismo patogênico (por exemplo, microbiano) está envolvida na formação de biofilme. De acordo com ainda modalidades adicionais, a formação de biofilme é sobre um objeto, particularmente um dispositivo implantável, tal como um cateter ou um stent.
[00176] Portanto, de acordo com estas modalidades, são proporcionados métodos para prevenir, inibir ou reverter o crescimento de biofilme microbiano sobre uma superfície, compreendendo contactar a superfície com uma molécula da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00177] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00178] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00179] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; em que no mínimo um Yi é um trecho presente em uma proteína de um organismo microbiano; e
[00180] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00181] O mais particularmente, a proteína do organismo microbiano é uma proteína envolvida na formação de biofilme. A superfície sobre a qual a formação de biofilme é prevenida, inibida ou revertida pode ser uma superfície biótica ou abiótica. Superfícies previstas em particular são as de dispositivos implantáveis, tais como as de catéteres ou stents.
[00182] Com respeito a superfícies abióticas, dispositivos revestidos com as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, também são previstos dentro do âmbito da invenção. O revestimento dos dispositivos pode ser feito diretamente por aplicação das moléculas ao dispositivo. Alternativamente, podem ser revestidas sobre o dispositivo usando ligantes (cruzados). Os dispositivos podem ser totalmente revestidos (por exemplo, por submersão do dispositivo em uma solução das moléculas), ou somente partes do dispositivo podem ser revestidas. É previsto em particular que os dispositivos são revestidos com moléculas contra uma proteína presente em um organismo microbiano, particularmente uma proteína envolvida na formação de biofilme.
[00183] Portanto, são proporcionados dispositivos implantáveis no mínimo parcialmente revestidos com moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00184] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00185] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00186] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00187] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada
[00188] De acordo com um aspecto adicional, são proporcionados métodos para triagem para novos compostos. Estes compostos são as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, e podem ser usados como compostos inibidores ou compostos em detecção. Os métodos de triagem compreendem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00189] - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00190] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00191] - cada Yi é selecionado de modo independente entre 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína identificada na etapa a); e
[00192] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) trazer a molécula produzida na etapa b) em contato com a proteína da etapa a); e
d) avaliar a função e/ou agregação da proteína.
[00193] Estes métodos têm vantagens particulares: podem ser usados para triagem não tendenciosa, uma vez que pode ser usada qualquer proteína do proteoma de um organismo. Alternativamente, podem ser usados para triagem seletiva, por exemplo, para descobrir novos alvos (isto é, proteínas as quais ainda são não visadas para compostos inibidores). De acordo com estas modalidades, a proteína na etapa
a) não é um alvo conhecido para compostos inibidores.
[00194] A ação de trazer em contato a molécula e a proteína na etapa c) pode ser inteiramente in vitro, por exemplo, com proteína puri- ficada em um tubo de ensaio ou em uma lâmina. No entanto, os métodos também podem ser usados em sistemas cllulares: as moléculas produzidas na etapa b) podem ser contactadas, por exemplo, com a proteína, adicionando as moléculas a uma linhagem celular. O modo em que as moléculas serão contactadas com a proteína vai depender, por exemplo, do organismo ou da célula no qual a proteína está presente, uma vez que isto determinará a disponibilidade da proteína em condições naturais ou in vitro.
[00195] A função pode ser avaliada, por exemplo, usando read-outs de repórteres adequados. Se a triagem for para detecção de compostos ao invés de compostos inibidores, a detecção da presença ou agregação dos compostos tipicamente será a leitura ao invés de uma funcional. No entanto, é previsto que o mesmo composto pode ser usado tanto para inibição quanto para detecção (vide, por exemplo, o Exemplo 4).
[00196] Estes métodos também podem ser usados para triagem para compostos aprimorados (ao invés de somente triagem para novos compostos). Por exemplo, quando um composto inibidor é conhecido, variações deste composto podem ser triadas, por exemplo, variando os resíduos usados para as porções X, experimentando diferentes ligantes, por encurtamento ou alongamento da porção Yi, e semelhantes.
[00197] Para uma triagem para compostos antipatogênicos (isto é, em que a proteína na etapa a) é uma proteína de um organismo patogênico), é particularmente previsto que o contato pode ser feito por adição ou administração da molécula ao organismo patogênico, especialmente para micro-organismos patogênicos.
[00198] Além disso é particularmente previsto que, se a no mínimo uma proteína for uma proteína de um organismo patogênico, a avaliação a função e/ou agregação da proteína na etapa d) pode se feita por avaliação da sobrevida, da reprodução e/ou do crescimento do organismo patogênico.
[00199] Aqui também, a no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos identificada na etapa a) pode ocorrer em mais de uma proteína de um organismo patogênico. Isto provavelmente vai aumentar a probabilidade de sucesso, uma vez que mais de uma proteína é visada deste modo.
[00200] Do mesmo modo, a no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos identificada na etapa a) pode ocorrer em no mínimo uma proteína de mais de um organismo patogênico. Isto possibilita o direcionamento para mais de um organismo patogênico com o mesmo composto, similar a, por exemplo, antibióticos de amplo espectro.
[00201] De acordo com um aspecto adicional, são proporcionados métodos para triagem para novos compostos antimicrobianos. Estes métodos compreendem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína microbiana no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e na qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e na qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar no mínimo uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00202] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n (ou i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição);
[00203] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados en- tre R, K, E, D e P;
[00204] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano identificado na etapa a); e
[00205] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) adicionar a no mínimo uma molécula produzida na etapa b) ao organismo microbiano no genoma do qual a proteína da etapa a) é codificada; e
d) avaliação da sobrevida e/ou do crescimento ou da reprodução do organismo microbiano.
[00206] Na avaliação da sobrevida, podem ser determinados os valores da MIC. De modo a identificar um composto com atividade antimicrobiana, isto é, de modo a classificar uma molécula como um hit, a MIC deve ser particularmente menor do que 100 μg/ml.
[00207] Em modalidades cobrindo métodos para a identificação de novos-alvos para compostos antimicrobianos, é particularmente previsto que a proteína microbiana na etapa a) não é um alvo conhecido para antibióticos. Isto tornaria os compostos identificados particularmente úteis em terapia de combinação, uma vez que diferentes-alvos são abordados.
[00208] Outra vantagem em particular é que os métodos de triagem podem ser realizados sem propensão de seleção por uma proteína em particular como um alvo interessante. Na verdade, todo o proteoma do organismo microbiano pode ser analisado, e as sequências adequadas podem ser usadas nas moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, e testadas para eficácia. Isto tem uma alta probabilidade de produzir novos-alvos. Além disso, quando a análise referida é realizada, é previsto que as regiões identificadas na etapa a) são regiões que ocorrem mais de uma vez no proteoma. Mais particularmente, a no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos identificados na etapa a) ocorre em mais de uma proteína do organismo microbiano.
[00209] Uma vez que em muitos casos, é desejável ter por alvo mais de um organismo microbiano (por exemplo, antimicrobianos de amplo espectro), também pode ser assegurado que a no mínimo uma região de 4 a 15 aminoácidos contíguos identificados na etapa a) ocorre em uma proteína, ou no mínimo uma proteína, de mais de um organismo microbiano.
[00210] O mais particularmente, os organismos microbianos-alvo aqui, neste pedido de patente, são organismos microbianos patogênicos. De modo a assegurar que organismos microbianos benéficos não sejam destruídos (por exemplo, micro-organismos benéficos na flora intestinal de um sujeito), pode ser verificado se o trecho identificado no organismo microbiano é específico para um ou mais organismos patogênicos e não ocorre em micro-organismos benéficos.
[00211] De acordo com um aspecto adicional, a molécula é usada em detecção ou como diagnóstico. Por conseguinte, são proporcionados métodos para detecção e diagnóstico. Portanto, são proporcionados métodos para detectar uma proteína em uma amostra, compreendendo as etapas de:
  • a) contactar uma amostra suspeita de conter a proteína com uma (isto é, no mínimo uma) molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00212] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n (ou i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição);
[00213] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00214] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada; e
[00215] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
b) detectar a presença de moléculas reagidas com a proteína.
[00216] A amostra pode ser proporcionada como tal ou pode ser pré-processada. A detecção pode ser direta ou indireta (isto é, ou a fração reagida ou não reagida é detectada) e pode ser feita através de detecção das moléculas (por exemplo, moléculas etiquetadas) ou da proteína (por exemplo, detecção da fração reagida ou não reagida). A natureza do método de detecção não é vital para a invenção, pode ser usado qualquer método adequado conhecido por uma pessoa versada na arte (por exemplo, à base de anticorpos, à base de massa, à base de adsorção, ...).
[00217] De acordo com modalidades particulares, o no mínimo um Yi que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada é único para a referida proteína na referida amostra. Portanto, por exemplo, em uma amostra de origem humana, a sequência também ocorrendo na proteína a ser detectada é codificada somente uma vez no genoma humano (ou ocorre somente uma vez no proteoma humano), isto é, na (sequência codificando a) proteína a ser detectada. Embora esta singularidade não seja sempre necessária - por exemplo, quando diferentes proteínas têm uma sequência de agregação idêntica e são detectadas juntas, elas ainda podem ser adicionalmente discriminadas, por exemplo, com base no tamanho - é particularmente previsto para facilitar a detecção. A parte ‘na referida amostra’ é importante na determinação da singularidade do trecho da proteína: por exemplo, se a amostra for pré-processada, é provável que contenha menos proteínas diferentes do que detecção em misturas complexas ou em amostras de diferentes (micro-)organismos.
[00218] De acordo com modalidades muito específicas, a região Yi pode conter exatamente 2 resíduos carregados (selecionados entre R, K, D, E), contanto que a carga líquida da região Yi seja zero. Mais particularmente no entanto, a região Yi não contém qualquer resíduo carregado (ou prolina para esta questão).
[00219] Deve ser observado que os presentes métodos de detecção são altamente similares aos métodos estabelecidos, tipicamente métodos de detecção à base de anticorpos. A diferença significativa é a uso das moléculas particulares. De fato, deve ser observado que nos métodos de detecção descritos aqui, neste pedido de patente, as moléculas conforme definido aqui, neste pedido de patente, realizam um papel similar como anticorpos. Portanto, em métodos de detecção os quais são normalmente à base de anticorpos, as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, podem substituir no mínimo um anticorpo. Por exemplo, moléculas onde no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada podem substituir um anticorpo primário em provas de detecção (e podem ser ‘interferons primários’ etiquetados), moléculas onde Yi é um trecho que ocorre naturalmente em um anticorpo primário usado para detecção podem substituir um anticorpo secundário. Alternativamente, a molécula de interferon secundária pode ser direcionada para uma etiqueta tah ou etiqueta fundida a um anticorpo primário, ou pode ser direcionada para um ‘interferon primário’ ou porção fundida a este. Conforme com anticorpos, um ‘interferon primário’ também pode servir como um agente de captura, onde o resto da detecção ocorre com anticorpos (ou por exemplo, com outro interferon primário e anticorpo). Esta configuração é geralmente referida como um ensaio de sanduíche.
[00220] De acordo com modalidades específicas, a molécula usada para detecção compreende uma etiqueta detectável. De acordo com modalidades adicionais específicas, a detecção na etapa b) é através de detecção da etiqueta detectável.
[00221] De acordo com modalidades particulares, os métodos adicionalmente compreendem uma separação de moléculas reagidas com a proteína e moléculas não reagidas com a proteína antes de detecção na etapa b). Alternativamente, os métodos podem compreender uma separação de proteína reagida com as moléculas e proteína não reagida com as moléculas antes de detecção na etapa b).
[00222] A detecção na etapa b) pode ser direta ou indireta, por exemplo, através de detecção da fração não reagida de moléculas. A detecção pode ser qualitativa, semi-quantitativa ou quantitativa.
[00223] De acordo com modalidades particulares, a amostra é de um sujeito, particularmente de um sujeito animal ou vegetal, mais particularmente de um sujeito mamífero, o mais particularmente de um sujeito humano.
[00224] No entanto, pode ser usada qualquer amostra que pode conter proteínas, e de acordo com modalidades particulares, a amostra não é de um organismo. Este é particularmente o caso para aplicações em biotecnologia branca, onde por exemplo é feita análise para pureza de produtos, ou para detecção de proteínas em alimento ou ração, ou para detecção de proteínas poluentes na água, e semelhantes.
[00225] Embora a detecção da proteína possa ser a última etapa do método, frequentemente pode se seguir uma etapa seguinte de correlacionar a presença (ou ausência, ou quantidade) da proteína detectada com um status particular. Por exemplo, nas aplicações de biotecnologia branca mencionadas, a presença da proteína pode dar uma indicação de poluição ou pureza. Por exemplo, em amostras de material de planta, a quantidade de uma proteína detectada pode indicar qual linha produz a maior parte de um produto em particular, informação a qual pode ser usada, por exemplo, para selecionar plantas para reprodução adicional.
[00226] De acordo com modalidades específicas, a presença, ausência ou quantidade de proteína detectada na amostra é indicativa de um estado de doença. Um estado de doença semelhante pode ser, por exemplo, presença de doença, ausência de doença, progressão de doença (por exemplo, malignidade, metástase, resposta terapia com fármaco, recidiva). Exemplos de proteínas associadas com estado de doença, por exemplo, biomarcadores, estão bem documentados na arte. Exemplos não limitantes de semelhantes proteínas incluem CRP (frequentemente usada para monitorar inflamação) e PSA (usada na detecção precoce do câncer de próstata), bem como IL-Ιβ e TNF-α, as quais também são marcadores de inflammação. De acordo com modalidades adicionais específicas, estes métodos compreendem adicionalmente uma etapa c) correlacionando a presença, a ausência ou a quantidade de proteína detectada na amostra com um estado de doença no sujeito. Conforme também visto a partir dos marcadores, doenças particularmente previstas para diagnóstico são câncer e doença inflamatória.
[00227] Como um equivalente, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00228] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00229] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00230] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína a qual é indicativa de um estado de doença; e
[00231] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00232] para uso no diagnóstico do referido estado de doença.
[00233] Aqui também, câncer e doença inflamatória são dois tipos de doença que são particularmente previstas (ou similares, é proporcionado uso das moléculas para a fabricação de um diagnóstico para doença (por exemplo, câncer, doença inflamatória)).
[00234] Como por exemplo, diagnóstico in vitro são previstos aqui, neste pedido de patente, também são proporcionados kits compreendendo no mínimo uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente, (incluindo uma molécula de ácido nucleico codificando a referida molécula ou um vetor recombinante conforme descrito aqui, neste pedido de patente) e no mínimo um tampão adequado.
[00235] Como uma forma especial de kit, podem ser proporciona- dos suportes sólidos que contêm no mínimo duas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00236] - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00237] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00238] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína; e
[00239] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00240] De acordo com modalidades particulares, as moléculas são encadeadas ao suporte sólido através de um ligante. As no mínimo duas moléculas tipicamente serão no mínimo duas moléculas diferentes. Exemplos particulares de suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, micro-arranjos, lâminas pré-revestidas, nanopartículas e dispositivos de lab-on-a-chip. Como muitos destes dispositivos são usados para detectar mais de uma proteína (frequentemente mesmo até dezenas ou centenas de proteínas ao mesmo tempo), é previsto que suportes sólidos são proporcionados compreendendo no mínimo 5 moléculas, no mínimo 10 moléculas, no mínimo 20 moléculas, no mí- nimo 50 moléculas, no mínimo 100 moléculas, no mínimo 200 moléculas, no mínimo 500 moléculas ou no mínimo 1000 moléculas.
[00241] De acordo com um aspecto adicionalmente específico, as moléculas são usadas para hiporregulação das funções de proteínas em plantas, células de plantas ou sementes de plantas. Por conseguinte, são proporcionados métodos para hiporregulação da função biológica de uma proteína em uma planta ou célula de planta ou semente de planta, compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00242] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00243] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00244] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína na referida planta, célula de planta ou semente de planta; e
[00245] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00246] O mais particularmente, a molécula é um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos presente sobre um vetor recombinante e a qual, depois de introdução dentro da célula de planta, da semente de planta ou da planta, produz o referido polipeptídeo na referida célula de planta, semente de planta ou planta.
[00247] De acordo com modalidades muito específicas, a região Yi pode conter exatamente 2 resíduos carregados (selecionados entre R, K, D, E), contanto que a carga líquida da região Yi seja zero. Mais particularmente no entanto, a região Yi não contém qualquer resíduo carregado (ou prolina para esta questão).
[00248] Também são proporcionadas composições agroquímicas. Estas composições compreendem no mínimo uma molécula com a seguinte estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00249] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00250] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00251] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00252] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00253] e um veículo agronomicamente aceitável.
[00254] Para composições agroquímicas, o no mínimo um Yi parti- cularmente será um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína em ou sobre uma planta, uma célula de planta ou uma semente de planta. Isto pode ser proteínas de uma planta (tipicamente a planta sobre a qual ou próxima à qual a composição agroquímica é aplicada), ou pragas de proteínas de planta que podem ocorrer sobre plantas.
Breve Descrição das Figuras
[00255] Figura 1: Diagrama de Venn de conjuntos de aminoácidos de acordo com suas propriedades. Adaptado de Livingstone & Barton, CABIOS, 9, 745-756, 1993.
[00256] Figura 2: Percentagem de sequências únicas para uma dada extensão de peptídeo no proteoma de diferentes organismos. De modo a produzir a figura, a sequência do genoma de um organismo foi tirada, todos os peptídeos da extensão X codificados no genoma foram produzidos, em seguida foi contado com que frequência ocorre cada peptídeo, e a fração que é única (isto é, sequências únicas vs toda a sequência desta extensão) é representada graficamente.
[00257] Figura 3: Quantificação de biofilmes maduros de cepas expressando o constructo agregador Als3 sob condições de indução e de repressão. Biofilmes maduros foram cultivados sobre discos quadrados de silicone por 48 horas em succinato (barras brancas) ou em YNB, 4% de D-glicose (barras pretas). C. albicans SC5314 foi usada como um controle. Cepas recombinantes expressando interferons Als3p apresentaram capacidade de formação de biofilme significativamente reduzida quando induzida em comparação com controle (*p< 0,001). Quantificação foi realizada por contagem de CFU e os dados são apresentados como a percentagem das células viáveis comparada com o controle (100%). Desvios padrões foram calculados a partir de dois experimentos independentes.
[00258] Figura 4: Constructos de interferon de Candida albicans induzidos demonstraram reduzida adesão (painel A) e invasão (painel B) a linhagem celular epitelial TR-146.
[00259] Figura 5: O peptídeo candidato F9 resulta em forte inibição da formação de biofilme. Candida albicans SC5314 formação de biofilme sobre placa de cavidades de poliestireno de 96 cavidades na presença de diferentes concentrações (250 μΜ, 50 μΜ e 10 μΜ) de peptídeo E1 (RNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 7)), peptídeo E2 (RLQQYTLLLIYLSVATAK (SEQ ID NO: 8)) e peptídeo F9 (RKLLFNL-GSRNGIVIVATTR (SEQ ID NO: (9)). (A) Os peptídeos foram adicionados somente durante a fase de adesão de Candida e o desenvolvimento de biofilme maduro continuou em meio fresco RPMI1640-MOPS, ao passo que em (B), os peptídeos estavam presentes durante todo o desenvolvimento de biofilme, incluindo o período de adesão. Os biofilmes foram quantificados por ensaio de redução de XTT. O controle (100%) continha somente meio fresco com a concentração final de 1% de DMSO. A presença de peptídeo E1 e F9, resultou em significativa redução na formação de biofilme (*p< 0,001). Os dados representam a percentagem da atividade metabólica das células de Candida tratadas com peptídeo comparado com o controle (100%). Desvios padrões foram calculados a partir de três experimentos independentes. Cada concentração do peptídeo foi testada em triplicata.
[00260] Figura 6: O peptídeo F9 diminuiu a adesão e formação de biofilme de Candida albicans SC5314 sobre poliestireno. (A) Adesão de C. albicans SC5314 sob placas de poliestireno de 96 cavidades na presença de peptídeo F9 (50 μΜ, 10 μΜ e 2,5 μΜ). O ensaio de redução de XTT foi realizado depois de 90 min de adesão a 37°C. (B) Formação de biofilme maduro in vitro de células de Candida pré-tratadas com diferentes concentrações de peptídeo durante o período de adesão. Desenvolvimento de biofilme posterior (48 h) continuou em RPMI1640-MOPS. Amostra de controle foi tratada com 1% de DMSO (100%). C. albicans als3Δ/als3Δ foi usada como um controle. O peptí- deo F9 'diminuiu significativamente a adesão e o desenvolvimento de biofilme maduro adicional (*p< 0,001). Os dados representam a percentagem da atividade metabólica das células de Candida tratadas com peptídeo, depois de adesão (90 min) ou 48 h de formação de biofilme, comparado com o controle (100%). Desvios padrões foram calculados a partir de cinco experimentos independentes. Cada concentração do peptídeo foi testada em triplicata.
[00261] Figura 7: Células de Candida albicans SC5314 tratadas com peptídeo reduziram a capacidade para formar biofilme sobre caté-teres de poliuretano in vivo. Células de C. albicans SC5314 foram incubadas na presença de peptídeo F9 (50 μΜ) durante o período de adesão (90 min) a 37°C. Depois disso, os catéteres foram lavados e implandos por via subcutânea. Biofilmes foram formados por 6 dias. C. albicans als1Δ/als1Δ als3Δ/als3Δ foi usada como um controle. C. albicans als3Δ/als3Δ formou biofilmes de modo similar à selvagem. O tratamento das células de Candida durante o período de adesão com o peptídeo F9 resultou em menos formação de biofilme maduro in vivo (*p< 0,001). Os dados são apresentados como a média de Log10 CFU obtida por dispositivo. No total, foram estudados 20 dispositivos. Em cada experimento, dois animais foram usados por cepa ou condição.
[00262] Figura 8: O peptídeo F9 reduziu a capacidade de Candida albicans SC5314 para aderir a catéteres de poliuretano. Células de C. albicans SC5314 foram tratadas com peptídeo F9 (50 μΜ) durante o período de adesão (90 min a 37°C). Os dispositivos foram lavados e a quantificação das células de Candida fixadas foi realizada por contagem de CFU. C. albicans als3Δ/als3Δ e C. albicans als1Δ/als1Δ als3Δ/als3Δ aderiram significativamente menos comparado com o controle (*p< 0,001). Células de Candida selvagens tratadas com o peptídeo F9 demonstraram propriedades reduzidas de adesão comparadas com células não tratadas (*p< 0,001). Os dados são apresentados co- mo a média de Log10 CFU obtida por dispositivo depois do período de adesão. No total, 9 catéteres foram usados por cepa ou condição testada.
[00263] Figura 9: O Peptídeo F9 diminui a capacidade de Candida albicans SC5314 para aderir e invadir células epiteliais. Três concentrações diferentes (50 μΜ, 10 μΜ e 2.5 μΜ) de peptídeo F9 foram administradas durante adesão (1 h) (A) e invasão (3 h) (B) de C. albicans SC5314 à linhagem de células epiteliais TR-146. Partes aderentes e invasoras de células fúngicas dentro de células epiteliais foram coradas com calcofluor branco e contra-coradas com anticorpo secundário Alexa Fluor 488. As lamínulas foram observadas por epifluorescência. A percentagem de células aderidas foi calculada como uma média de células de Candida afixadas sobre uma centena de áreas espalhadas sobre a superfície inteira da lamínula. As capacidades de aderência e de invasão de C. albicans als3Δ/als3Δ foram significativamente reduzidas (*p< 0,001). A percentagem de células de C. albicans invasoras foi determinada dividindo o número de células internalizadas pelo número total de células aderentes. No mínimo 100 células fúngicas foram contadas sobre cada lamínula. Desvios padrões foram calculados a partir de três experimentos independentes e cada concentração do peptídeo foi testada em duplicata.
[00264] Figura 10: O selvagem, o mutante de deleção homozigoto e o transformante Cnb1 têm um fenótipo similar em condições normais de indução / repressão de promotor. Quando é induzido stress por adição de SDS (0,01%) ao meio, o transformante apresenta um fenótipo que é similar ao selvagem em condições de repressão de promotor (meio SD), ao passo que o fenótipo em condições de indução de promotor (meio SCAA) apresenta uma maior semelhância com o mutante de deleção homozigoto. Os dados mostrados são representativos para os 4 constructos.
[00265] Figura 11: A cinética de destruição para S. epidermidis e S. aureus, tratados com diferentes moléculas de interferon, em sua mínima concentração inibitória (MIC) e 2x MIC.
[00266] Figura 12: Monitoramento do desenvolvimento de resistência em S. aureus ATCC
[00267] Figura 13: Estudos de desenvolvimento de resistência de longa duração em MRSA. A linha e a seta vermelhas representam queda de fator 2 na resistência para C30 devido a retirada de peptídeo do meio por 1 dia.
[00268] Figura 14: Propriedades hemolíticas de peptídeos de interferon
[00269] Figura 15: Curva de resistência para S. aureus cultivado em sub-MIC durante 15 dias.
[00270] Figura 16: Liberação de lactato desidrogenase de células renais embrionárias humanas em diferentes concentrações de peptídeo interferons C30 e Hit50
[00271] Figura 17: Percentagem de recuperação da linhagem de células renais epiteliais humanas depois de período de incubação de 24 horas na presença de dois peptídeos interferon antibacterianos diferentes ( composto 30 e Hit50). A figura mostra uma recuperação de 90 por cento das células HEK tratadas com 100 μg/ml de Hit50. A inibição do crescimento é devida à presença de DMSO como tampão ao invés d eser devida ao peptídeo interferon (o tampão usado para solubilização do peptídeo interferon foi 50% de DMSO em água ultrapura).
[00272] Figura 18: Medição da intensidade de fluorescência verde de células tratadas com vários peptídeos interferon ao longo do tempo. Lisostafina (linha superior na figura) representa aqui o controle lítico, uma vez que se sabe que rompe a parede celular dos Estafilococos muito rapidamente e leva a rápida liberação do conteúdo celular. A linha inferior na figura representa o tampão.
[00273] Figura 19: Medição da intensidade de fluorescência verde (Sytox Green) de células tratadas com vários concentração de peptídeo interferon C30.
[00274] Figura 20: Potencial de membrana (DiOC2 gráfico de pontos de fluorescência vermelha / verde) de não bactérias tratadas (A), tratadas com DMSO (B), despolarizadas por CCCP controle (C), tratadas com Lisostafina (G), tratadas com C30 (25 μg/ml) medida nos pontos do tempo de 0 (D), 5 (E) e 15 (F) minutos.
[00275] Figura 21: Ligação de corante de diagnóstico amiloide tio-flavina T a S. aureus tratados com diferentes concentração de composto C30. Notar que peptídeo interferon C30 solubilizado em meio também proporciona uma certa fluorescência de fundo.
[00276] Figura 22: Ligação de corante de diagnóstico amiloide vermelho do Congo a células bacterianas tratadas com concentrações crescentes de Composto C30
[00277] Figura 23: Micrografias SEM de Bacillus cereus não tratado (painel esquerdo) e tratado com composto C30 a 3xMIC por 5 minutos (painel direito, parte de cima) ou for 20 minutes (painel direito, parte de baixo). Há um óbvio encolhimento da parede celular das células tratadas, com aparente liberação do conteúdo. Adicionalmente as células parecem mais curtas, indicando divisão celular impedida. Não há poros visíveis, nem crateras presentes sobre a superfície celular.
[00278] Figura 24: Micrografias SEM de Staphylococcus aureus ATCC não tratado (A) e tratado com C30 (B). Existe uma óbvia diferença em uma série de células contendo septos de divisão, sugerindo divisão impedida em células tratadas com C30. Depois de uma hora de tratamento algumas células bacterianas começam a perder seu conteúdo.
[00279] Figura 25: Micrografias eletrônicas de transmissão de Staphylococcus aureus tratado com C30 (painel direito) e tratado com DMSO (painel esquerdo), fixadas depois de 20 minutos de tratamento. As células são redondas e intactas, com uma membrana celular bem definida. Algumas estruturas semelhantes a mesossoma podem ser vistas na população celular tratada (seta apontando).
[00280] Figura 26: Micrografia TEM de estafilococos tratados com C30 por 20 minutos em 4xMIC. O conteúdo citoplasmático começa a encolher, no entanto não pode ser observada lise celular óbvia. A região de DNA tema densidade eletrônica muito elevada sugerindo condensação de DNA, a qual é um sinal de estágio final de apoptose.
[00281] Figura 27: Micrografias eletrônicas de transmissão de seções ultrafinas imuno-coradas de Staphylococcus aureus exposto a C30 com etiqueta de FITC (duas setas na parte de cima, imagens A a F) e imuno-marcado, não exposto a seções de peptídeo (seta na parte de baixo, imagens nã marcadas). As setas vermelhas mostram agregados de peptídeos. Septos de células tratadas com peptídeo mostram formato irregular e a divisão celular é assimétrica. os peptídeos são retomados pela célula e agregados encontram-se no citoplasma.
[00282] Figura 28: Peptídeo Hit1 (sequência: RWVSMLLRRGSR-WVSMLLRR (SEQ ID NO: 31)) e Hit57A (sequência: RFFIGLSRRGS-RIQAYLYRR (SEQ ID NO: 78)) effectively reduziram de modo eficaz os números de bactérias em monocamadas de células infectadas. Todos os compostos foram usados a 100 μg/ml.
[00283] Figura 29: Blots sondados com peptídeo anti-ClpC
[00284] Figura 30: Intensidade de sinal de estreptavidina-HRP de pontos contendo diferentes concentrações de peptídeo
[00285] Figura 31: Eficácias de vancomicina versus composto C30 liberado por via intravenosa e por via intraperitoneal contra Staphylococcus aureus MRSA 326 no modelo de coxa de camundongo neu-tropênico
[00286] Figura 32: Curvas de crescimento de vírus multietapa so- bre células tratadas com 10 μΜ (painéis A, B) ou 1 μΜ (painéis C, D) de interferons antivirais, Tamiflu ou PBS. Hpi, horas pós infecção.
[00287] Figura 33: Atividade de luciferase relativa depois de transfecção de todos os componentes do minireplicon ou de um subgrupo dos componentes do minireplicon. "Mx1": além de todos os componentes do minireplicon um vetor de expressão para Mx1 também foi transfectado.
[00288] Figura 34: Atividade de luciferase relativa na presença de interferons direcionados contra diferentes proteínas virais. R-GS, R-PP, D-PP, R-PS indicam natureza do gatekeeper (antes do hífen) e do ligante interno (depois do hífen) usados.
[00289] Figura 35: Atividade de luciferase relativa na presença de interferons direcionados contra diferentes proteínas virais internas (M1 e NS1) que não estão envolvida no ensaio de minireplicon. Valor de controle = 1. R-PP, D-PP, R-PS indicam natureza do gatekeeper (antes do hífen) e do ligante interno (depois do hífen) usados.
[00290] Figura 36: Visão geral esquemática da tecnologia de detecção por meio de interferons específicos
[00291] Figura 37: Análise Western blot e PepBlot de β-Gal a partir de lisados de células bacterianas BL21 completos. A alameda 1 mostra a detecção com anticorpo anti-β-Gal policlonal de coelho; a Alameda 2 mostra a detecção com o peptídeo interferon Tango 1 (b~RLAVVLQR (SEQ ID NO:79)); a Alameda 3 mostra a detecção com o peptídeo interferon Tango 2 (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)); e a Alameda 4 mostra a interação com o peptídeo interferon off-target (não visado) (b~RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 81)). As membranas foram expostas com substrato de quimiluminescência HRP por 100 s. A seta superior representa a posição prevista da proteína β-Gal sobre o blot. A seta inferior representa o produto de ligação específico, o qual presumivelmente é SRP livre.
[00292] Figura 38: Análise PepBlot da especificidade de ligação de peptídeo Tango 2 selvagem (wt) e mutante a β-Gal de lisados de células BL21 completos: Alameda 1 -peptídeo wt (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)); Alameda 2 - peptídeo mut_1 (b~RVPIWSLGNR (SEQ ID NO: 82)); Alameda 3 - peptídeo mut_2 (b~RVIPWSLGNR (SEQ ID NO: 83)); e Alameda 4 - peptídeo mut_3 (b~RVIPESLGNR (SEQ ID NO: 84)). As membranas foram expostas com substrato de quimilumi-nescência HRP por 100 segundos. A seta indica a posição de β-Gal sobre as faixas de membrana.
[00293] Figura 39: Análise PepBlot da cinética de ligação de peptídeo Tango 2 (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)) a β-Gal de lisados de células BL21 completos. As proteínas separadas na membrana foram expostas ao peptídeo interferon Tango 2 no tampão de ligação para diferentes pontos do tempo: Alameda 1 - Nenhuma exposição ao peptídeo; Alameda 2 - 30 s; Alameda 3 - 5 min; Alameda 4 - 10 min; Alameda 5 - 15 min; Alameda 6 - 30 min; Alameda 7 - 45 min; e Alameda 8 - 60 min de incubação. As membranas foram expostas com substrato de quimiluminescência HRP por 100 s. A seta indica a posição de β-Gal sobre as faixsas de membrana.
[00294] Figura 40: Análise de diferentes níveis de proteína β-gal adicionados (spiked) em lisados de células BL21 completos não induzidos. A detecção foi realizada usando (A) PepBlot com peptídeo interferon Tango 2 (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)) e (B) WB com anticorpo anti-β-Gal policlonal de coelho. Alameda 1 - Sem β-Gal; Alameda 2 -11,6 ng de β-Gal; Alameda 3 - 58 ng de β-Gal; Alameda 4 - 116 ng de β-Gal; Alameda 5 - 290 ng de β-Gal; Alameda 6 - 580 ng de β-Gal; Alameda 7 - 870 ng de β-Gal; e Alameda 8 - 1160 ng de β-Gal. As membranas foram expostas com substrato de quimiluminescência HRP por 100 s. A seta mostra a posição de β-gal sobre a membrana.
[00295] Figura 41: Comparação da PepBlot e WB densidade do sinal de detecção de peptídeo interferon Tango 2 (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)) (linha preta com círculos) e anticorpo anti-β-Gal (linha vermelha com triângulos) de diferentes níveis de proteína β-gal adicionados (spiked) em lisados de células BL21 completos não induzidos.
[00296] Figura 42: Influência de resíduos gatekeeper sobre a especificidade de detecção PepBlot de β-gal à base de peptídeo interferon em lisado de E. coli completo na presença de proteínas séricas em alameda adjacente. A detecção foi realizada em uma plataforma competitiva com a alameda 1 de cada membrana contendo 7% de soro clínico e a alameda 2 é o β-gal em lisado de células de E. coli BL21 completo. Os peptídeos foram marcados com biotina sobre ambos os términos e ligados por ligante de Ttds. Membranas contendo soro separado e proteínas de E. coli foram incubadas com 25 nM de peptídeos interferon por 15 min, seguido por conjugado de SRP-HRP e expostas a substrato de quimiluminescência HRP por 120 s. Notar que a banda de alto peso molecular observada para soro é devida a reação cruzada do conjugado SRP-HRP.
[00297] Figura 43: Sensorgrama experimental comparando a afinidade de vários peptídeos para ligar β-Gal: Tango 1 (vermelho), Tango 2 (verde, maior curva), peptídeo off-target (amarelo) e o tampão de referência (preto). Notar que os peptídeos (1 μM) fluíram sobre o mesmo chip com uma etapa de regeneração de superfície depois de cada contato.
[00298] Figura 44: Sensorgrama experimental comparando a afinidade de peptídeos Tango 2 selvagens e mutantes para ligar β-Gal: Tango 2 wt (vermelho, maior curva), Tango 2 Mut_1 (verde), Tango 2 Mut_2 (amarelo), Tango 2 Mut_3 (azul) e o tampão de referência (preto). Notar que os peptídeos (1 pM) fluíram sobre o mesmo chip com uma etapa de regeneração de superfície depois de cada contato.
[00299] Figura 45: Sensorgrama representativo de dados adapta- dos a partir da análise cinética do peptídeo, (His)6~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80), ligando a β-Gal imobilizado sobre o chip sensor. A linha sólida é o sensorgrama experimental e a linha pontilhada sobreposta sobre a resposta é a curva adaptada. As concentrações de analito a partir do fundo até o topo foram, 0,5 μM, 1,0 μM, 1,5 μM, 2,0 μM, 2,5 μM, 3,0 μM, 3,5 μM e 4,0 μM, A curva média (2 μM) foi rodada em duplicata. Notar que os peptídeos fluíram sobre o mesmo chip com uma etapa de regeneração de superfície depois de cada contato.
[00300] Figura 46: Sensorgrama experimental comparando a afinidade de peptídeos Tango 2 único (linha sólida) e Tango 2 em tandem (linha tracejada) para ligar β-Gal. O tampão de referência é mostrado como linha pontilhada. Notar que os peptídeos (1 μM) fluíram sobre o mesmo chip com uma etapa de regeneração de superfície depois de cada contato.
[00301] Figura 47: Comparação da cinética de co-agregação de peptídeo Tango 1 (triângulo) e peptídeo Tango 2 (quadrado) com β-gal. As concentrações de peptídeos interferon e β-gal foram de 10 pM. Os círculos pretos representam o β-gal na ausência do peptídeo. As setas apontam para o raio hidrodinâmico (RH) das partículas medidas usando DLS no ponto do tempo respectivo.
[00302] Figura 48: Comparação da cinética de co-agregação de peptídeo Tango 2 único (quadrado) e peptídeo Tango 2 de repetição em tandem (triângulo) com β-gal. A quantidade de peptídeos interferon e β-gal foram 10 pM. Os círculos pretos representam β-gal na ausência do peptídeo. A seta aponta para o raio hidrodinâmico (RH) das par-tículças medidas usando DLS no ponto do tempo respectivo.
[00303] Figura 49: Efeito da concentração de peptídeo sobre a cinética de co-agregação de peptídeo Tango 2 com β-gal. A proporção molar de peptídeo para β-gal foi: 1:5 (triângulo), 1:2 (quadrado) e 1:1 (losango). Os círculos pretos representam o β-gal na ausência do pep- tídeo. A seta aponta para o raio hidrodinâmico (RH) das partículas medidas usando DLS no ponto do tempo respectivo.
[00304] Figura 50: Efeito dof peptídeo interferon Tango 2 sobre a atividade enzimática de β-gal para clivar o substrato não fluorescente FDG para fluoresceína fluorescente. A maior intensidade de fluorescência é obtida com 10 μΜ de beta-Gal nativo sem interferon, seguido por 10 μΜ de β-Gal + 1 μΜ de peptídeo interferon, seguido por 10 μΜ de beta-Gal + 5 μΜ de peptídeo interferon. Não foi observada fluorescência na condição de 10 μΜ de β-Gal + 10 μΜ de peptídeo interferon.
[00305] Figura 51: Espectros FT-IR de reflectância total atenuada de β-Gal nativo (linha sólida) e suspensão de co-agregado de peptídeo interferon β-Gal-Tango 2 (linha pontilhada) em 20 mM de PB, pH 6,8.
[00306] Figura 52: Espectros CD de β-Gal nativo (linha sólida) e suspensão de co-agregado de peptídeo interferon β-Gal-Tango 2 (linha pontilhada) em 20 mM de PB, pH 6.8.
[00307] Figura 53: EM de (A) β-Gal nativo e (B) co-agregado de peptídeo interferon β-Gal-Tango 2
[00308] Figura 54: Análise PepBlot e WB de PSA usando peptídeo interferon, b~RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85) (painel A) e anticorpo anti-PSA monoclonal de coelho (painel B). A membrana contém 1,55 μg de PSA adicionado (spiked) em 5% de soro humano. A seta representa a posição do PSA sobre os blots. As membranas com peptídeo interferon e anticorpo anti-PSA foram expostas com substrato de qui-miluminescência HRP por 180 s e 10 s, respectivamente. A banda de alto peso molecular notável em PepBlot e WB é devida a ligação inespecífica do conjugado SRP-HRP e do anticorpo secundário-HRP, respectivamente.
[00309] Figura 55: Análise PepBlot e WB de 1,25 μg de CRP adicionado (spiked) em 5% de soro humano usando peptídeo interferon, b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86) (painel A) e anticorpo anti-CRP mono- clonal de coelho (painel B). As membranas com peptídeo interferon e anticorpo anti-CRP foram expostas a substrato de quimiluminescência HRP por 60 s e 10 s, respectivamente. A seta representa a posição do CRP nos blots. A banda de alto peso molecular notável em blot de interferon e anticorpo é devida a ligação inespecífica do conjugado SRP-HRP e do anticorpo secundário-HRP, respectivamente.
[00310] Figura 56: Análise PepBlot e WB de 0,6 μg de β-2M adicionado (spiked) em 5% de soro humano usando peptídeo interferon, b~RWSFYLLYYTR (SEQ ID NO: 87) (painel A) e anticorpo anti-β-2M (painel B). As membranas com peptídeo interferon e anticorpo anti-β-2M foram expostas a substrato de quimiluminescência HRP por 180 s e 10 s, respectivamente. A seta representa as posições de β-2M nos blots.
[00311] Figura 57: Detecção de CRP em amostras de soro clínico por WB usando anticorpo anti-CRP monoclonal de coelho e PepBlot usando peptídeo interferon b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86).
[00312] Figura 58: Detecção de CRP em amostras de soro clínico de 20 pacientes por PepBlot usando o peptídeo interferon b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86) (painel superior). As concentrações de CRP em soro clínico determinadas por ensaio imunoturbidimétrico foram na faixa de 1 μgml-1 a 317 μgml-1. O painel inferior mostra o gráfico da densidade de sinal da banda de CRP detectado pelo peptídeo b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86) versus concentração determinada de modo independente com um ensaio imunoturbidimétrico em um laboratório clínico.
[00313] Figura 59: (A) Detecção de PSA secretado em plasma seminal humano por PepBlot usando os peptídeos b~RWQVLASD (SEQ ID NO: 88) (alameda 2) e b~RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85) (alameda 3). O WB de anticorpo monoclonal (EP1588Y) específico para a sequência C-terminal de PSA é mostrado na alameda 1. (B) Detecção de PSA usando o peptídeo interferon de repetição em tandem b~RQWVLTAARGSGSAPAARQWVLTAAR (SEQ ID NO: 89). A biotina (b) é ligada ao peptídeo pelo ligante ‘Ttds-APAA’ (SEQ ID NO: 77) e as duas sequências de agregação foram ligadas pelo ligante ‘GSGSA-PAA’ (SEQ ID NO: 90). Notar que a concentração do peptídeo único e do peptídeo de repetição em tandem foram de 250 nM e 250 pM, respectivamente. As membranas foram expostas a substrato de quimilu-minescência HRP por 36 s.
[00314] Figura 60: Detecção por PepBlot (isto é, à base de interferon) de 5 μg de IL1β adicionado (spiked) em 5% de soro humano
[00315] Figura 61: Detecção por PepBlot de 5 μg de TNFα adicionado (spiked) em 5% de soro humano
[00316] Figura 62: Detecção quantitativa de diferentes níveis de β-gal adicionado (spiked) em lisados celulares completos de E. coli usando o peptídeo b~RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 91). A biotina (b) é ligada ao peptídeo pelo ligante ‘Ttds-APAA’(SEQ ID NO: 77) e as duas sequências de agegação foram ligadas pelo ligante ‘GSGSAPAA’(SEQ ID NO: 90).
[00317] Figura 63: Caracterização cinética da interação do peptídeo b~RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 91) com β-Gal. As concentrações da proteína-alvo β-Gal foram na faixa de 31 pM a 1 μΜ.
[00318] Figura 64: Caracterização cinética da interação do peptídeo b~RILIFWSRGSGSAPAARILIFWSR (SEQ ID NO: 92) com CRP. As concentrações da proteína-alvo CRP foram na faixa de 37 μΜ a 582 mM.
[00319] Figura 65: Detecção de CRP em soro clínico usando peptídeo interferon único flanqueado por ‘R’ (painel superior) ou microarranjo de peptídeo interferon de repetição em tandem flanqueado por ‘R’ (painel inferior). O eixo X mostra peptídeos pontilhados, o eixo Y indica a proporção de sinal para ruído. A concentração de CRP no so- ro foi de 317 μgml-1.
[00320] Figura 66: A, Análise Western blot de fosfo- e total ERK1/2 de células Hek293 transfectadas com mVEGFR2, seguida por uma privação de um dia para o outro em presença ou ausência de peptídeos de diferentes fontes, e estimuladas por 5 minutos com VEGF (25 ng/ml). B, quantificação da proporção dos níveis de ERK1/2 fosforilado versus total para alguns dos peptídeos mostrados em A.
[00321] Figura 67: Especificidade do peptídeo B8 para o receptor VEGFR2. Análise Western blot para ERK1/2 fosforilado em células HeLa que foram estimuladas por 5 min com EGF (25 ng/ml) depois de privação de um dia para o outro na presença de DMSO ou peptídeo B8 na concentração indicada. Não pode ser observada redução na fosforilação de ERK1/2 induzida pelos peptídeos direcionados contra VEGFR2.
[00322] Figura 68: Coloração imunohistoquímica para mVEGFR2, expressada em células HEK293 tratadas com ou DMSO (painel superior) ou 10 μΜ de peptídeo B8 (painel inferior).
[00323] Figura 69: Neovascularização de vasos no olho de camundongos tratados com controle, peptídeos interferon anti-VEGFR2, ou mAb anti-VEGFR2. O eixo Y denota a % de área TRITC-positiva sobre a área da borda total da lesão.
[00324] Figura 70: Níveis de ERK1/2 fosforilado em células HeLa depois de estimulação de EGF, na presença ou na ausência de peptídeos direcionados contra EGFR. O eixo Y mostra os níveis de fosfo-ERK corrigidos para controle negativo. Sequência de A5, RWGLL-LALRPPRWGLLLALR (SEQ ID NO: 93); A11, RTGYLYIS- RPPRTGYLYISR (SEQ ID NO: 94); A12, RIISAVVGRPPRIISAVVGR
[00325] (SEQ ID NO: 95); B9, DVWSYGVTDPPDVWSYGVTD (SEQ ID NO: 96); B10, DITGYLYIDPPDITGYLYID (SEQ ID NO: 97); B11, DLLGISLTDPPDLLGISLTD (SEQ ID NO: 98); B12, DWGLL- LALDPPDWGLLLALD (SEQ ID NO: 99)
[00326] Figura 71: Indução de A20 (Western blot no painel superior) e IL-8 (ELISA no painel do meio) ou IL-6 (bio-ensaio no painel inferior) em diferentes pontos do tempo depois de estimulação com hTNF.
[00327] Figura 72: Indução relativa dos níveis de IL-8 de células A549 tratadas com diferentes interferons depois de estimulação com TNF, em comparação com tratamento com meio sem soro e 2% de DMSO (DMSO na figura). A e B apresentam resultados de 2 experimentos independentes.
[00328] Figura 73: Indução relativa dos níveis de IL-6 de células A549 tratadas com diferentes interferons depois de estimulação com TNF, em comparação com tratamento com meio sem soro e 2% de DMSO (DMSO na figura).
[00329] Figura 74. (a) Diagrama de gráfico de TANGO para BIN2; os picos representam as sequências de peptídeo com a maior propensão para agregar dentro da proteína BIN2. (b) Representação esquemática dos vetores de expressão bait249 contendo um reforço de agregação N-terminalmente fundido a GFP. (c) Representação de vetores de expressão bait249 incluindo diferentes sequências de ligante e flanqueante (sequências de aa são indicadas) mas não contendo qualquer reforço de agregação.
[00330] Figura 75. (a-e) Avaliação CLSM da formação de agregados em folhas agro-infiltradas de N. benthamiana transformadas transitoriamente com os constructos expressando GFP indicados acima de cada painel. Células epidermais são positivas para GFP mas apresentam diferentes padrões de localização principalmente na área perinuclear. A seta branca indica um corpo de inclusão insolúvel. Barras de tamanho: 10 μm.
[00331] Figura 76. Painel superior: Imagens de CLSM de células epidermais de N. benthamiana depois de 4,5 dias de co-injeção com cepas expressando 35SBIN2GFP e pMDCbait249NF_Tand. No painel inferior: imagens correspondentes representando quantificação de colocalização realizada pelo software ImageJ MBF. São indicados os coeficientes de sobreposição de Mander (0<R<1) para cada fotografia; barras de tamanho representaj 50 μm.
[00332] Figura 77. Co-imunoprecipitação de 35S::bait249-GFP variantes co-expressadas em N. benthamiana com 35S::BIN2:HA. No painel esquerdo a detecção por Western blot das frações não ligadas dos extratos de proteínas de planta depois de 4 horas de incubação com contas anti-GFP e detecção com anticorpo anti-HA (painel superior esquerdo) ou com anticorpos anti-GFP (painel inferior esquerdo). No painel direito a detecção das contas Imuno Precipitadas (IP) com anticorpo anti-HA (painel superior direito) ou com anticorpo anti-GFP (painel inferior direito).
[00333] Figura 78. (a-d) Imagens de CLSM de Arabidopsis 8 D.A.S. Plântulas T3 expressando o constructo 35S::bait249R-GFP. Células epidermais em cotilédones (a), hipocótilo (b) e células de raiz (c) mostram agregação perinuclear (setas brancas). A ponta da raiz não mostra agregação citosólica nítida e fraco sinal de GFP (d). (e-h) Imagens de CLSM de Arabidopsis 8 D.A.S. Plântulas T3 expressando o constructo 35S::bait249NF_Tand-GFP. Células epidermais em cotilédones (e), hipocótilo (f) e de raiz (g) mostram agregação citosólica. A ponta da raiz mostra intensidade de GFP mais fraca (h). São indicadas barras de tamanho.
[00334] Figura 79. (a-d) Imagens de CLSM de Arabidopsis 8 D.A.S. Plântulas T3 expressando o constructo 35S::bait249-GFP. Não é visível agregação clara nos tecidos da planta mas somente é visível expressão de GFP fraca nas células em cotilédones (a), em hipocótilos (b), e na ponta da raiz (d). Em células da raiz (c) é evidenciada a presença de agregados insolúveis sob a forma de corpos de formato re- dondo (seta branca). (e-h) Imagens de CLSM de Arabidopsis 8 D.A.S. Plântulas T3 expressando o constructo 35S::bait249NF -GFP. A isaca é expressada em qualquer tecido da planta apresentando agregação perinuclear somente nas células da raiz (g). São indicadas barras de tamanho.
[00335] Figura 80. Avaliação TEM de seção ultrafina marcada com imunogold de 8 D.A.S. plântulas de Arabidopsis incubadas com um anticorpo anti-GFP. (a) Célula do parênquima vascular do hipocótilo expressando 35S::bait249R-GFP apresentando material fibrilar citosólico marcado (a) ampliada na inserção. (b-c) Detalhes de células da área de alongamento da raiz apresentando marcação aglomerada de bait249NF_Tand-GFP in the cytosol (b) e close to a Golgi stack (c). (d) Célula de paliçada de cotilédone expressando bait249NF_Tand-GFP evidenciando marcação perinuclear, ampliada na inserção. (e) Célula da área de alongamento da raiz apresentando marcação de bait249NF_Tand no citosol. São indicadas barras de tamanho.
[00336] Figura 81. (a) Native-PAGE e detecção anti-GFP de complexos de alto peso molecular (emoldurados) em extratos de proteína de plantas de Arabidopsis transgênicas expressando de modo estável as linhagens BIN2 bait249 com respeito a extratos de plantas selvagens (Col-0). (b,c) Espectroscopia FT-IR sobre material imuno-precipitado de plantas transgênicas expressando 35S::bait249-GFP, 35S::bait249R-GFP, 35S::bait249NF_Tand-GFP e 35S::bait249NF-GFP. A aumentada absorvência em valores de 1616 e em 1680 (setas pretas) indicam a presença de agregados de β-sheet.
[00337] Figura 82. (a) Fenótipo de plântulas de Arabidopsis 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP comparadas com crescimento de Col-0 verticalmente in vitro por 8 dias sob fotoperíodo de dia longo e em solo por 1,5 meses (1 mês e meio). Também é representada a quantificação das extensões das raízes e dos hipocótilos sobre uma média de 50 8 plântulas D.A.S. por linhagem. (b) Ensaio de resposta a dose de resistência a Brazzinazole para 4 linhagens de plântulas D.A.S. de Arabidopsis 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP comparadas com Col-0 e triplo GSKs grupo II T-DNA mutante (trGSKsII_k.o.). A quantificação correspondente das extensões dos hipocótilos sobre uma média de 50 plântulas por linhagem é representada no gráfico.
[00338] Figura 83 a) Níveis de expressão relativos dos genes BR-biosintéticos DWF4 e CPD e do gene para o fator de transcrição NAC responsivo a BR (At5g46590) em 8 plântulas de Arabidopsis D.O. cultivadas in vitro sob condições de dia longo. b) Níveis de expressão de genes chaperone (HSP70, HSP90-1, HSP101, HSC70-1, HSC70-2 e HSC70-3) medidos nas mesmas condições experimentais. Em cada caso a quantidade de mRNA foi normalizada para o nível de CDKA1 como gene de referência.
[00339] Figura 84. Avaliação ultraestrutural por TEM da citotoxicidade de 35S::bait249R-GFP em plantas de Arabidopsis. É mostrada uma comparação em baixa ampliação entre hipocótilos e células da raiz em Col-0 (a,c) e no mutante (e,g). Micrografias de alta ampliação das mesmas áreas em Col-0 (b,d) e em mutante (f,h). São indicadas barras de tamanho.
[00340] Figura 85. Painel superior: Imagens de CLSM de 8 plântulas de Arabidopsis D.A.S. expressando 35S::BIN2-GFP e pMDC::bait249NF_Tand_RFP depois de 24 horas de indução. No painel inferior: imagens correspondentes representando quantificação por co-localização realizada pelo software ImageJ MBF. São indicados os coeficientes de sobreposição de Mander (0<R<1) para cada fotografia.
Descrição detalhada Definições
[00341] A presente invenção será descrita com respeoto a modali- dades particulares e com referência a determinados desenhos porém a invenção não está limitado a estes mas somente pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser considerados como limitando o âmbito. Os desenhos descritos são somente esquemáticos e são não limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não desenhado em escala para fins de ilustração. Onde o termo "compreendendo" é usado na presente descrição e reivindicações, não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou definido é usado quando se referindo a um substantivo singular por exemplo, "um" ou "uma", "o" ou "a", isto inclui um plural daquele substantivo a menos que algo mais seja especificamente determinado.
[00342] Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e semelhantes na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos usados deste modo são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção descritas aqui, neste pedido de patente, são capazes de operação em outras sequências além das descritas ou ilustradas aqui, neste pedido de patente.
[00343] Os termos ou definições que se seguem são proporcionados unicamente para auxiliar no entendimento da invenção. A menos que especificamente definido aqui, neste pedido de patente, todos os termos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo significado que teriam para uma pessoa versada na arte da presente invenção. Aos profissionais são particularmente indicados Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999), para definições e termos da arte. As definições proporci- onadas aqui, neste pedido de patente, não devem ser consideradas como tendo um âmbito menor do que o entendido por uma pessoa com conhecimento ordinário na arte.
[00344] As moléculas indutoras de beta-agregação ou de agrega-ção-nucleação descritas aqui, neste pedido de patente, são algumas vezes referidas como "interferons" ou "moléculas de interferon". Com este termo, são pretendidas as moléculas contendo gatekeeper conforme descrito aqui, neste pedido de patente, (isto é, as moléculas com porções X2i-1 e X2i), o termo portanto não é sinônimo com os "interferons" conforme usado no pedido de patente internacional No. WO2007071789. "Interferons" conforme usado aqui, neste pedido de patente, portanto deve ser lido como moléculas com a estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n. O termo "peptídeos de interferon" é usado algumas vezes se forem de natureza completamente peptídica. O termo "isca" (bait) também é algumas vezes usado como um sinônimo, embora isto também possa se referir à região de agregação como tal. As moléculas de interferon conforme descrito aqui, neste pedido de patente, são moléculas que não ocorrem naturalmente. São sintéticas (no sentido de produzidas pelo homem) e não pretendem englobar fragmentos de proteínas (devido aos requisitos de sequência específica, é improvável que fragmentos de proteínas naturais encontrados em organismos sejam incluídos sob esta definição).
[00345] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "aminoácidos hidrofóbicos" se refere aos seguinte 13 aminoácidos: isoleucina (I), leucina (L), valina (V), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), histidina (H), metionina (M), treonina (T), lisina (K), alanina (A), cisteína (C), e glicina (G). O termo "aminoácidos alifáticos" se refere aos resíduos I, L ou V. O termo "aminoácidos carregados" se refere a arginina (R), lisina (K) - ambos carregados positivamente; e ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E) - ambos carregados negativamente. Embora histidina seja algumas vezes referida como carregada positivamente, uma vez que o nitrogênio em sua cadeia lateral pode ser protonado em condições acidíferas, não é previsto aqui, neste pedido de patente, sob os aminoácidos carregados, a menos que explicitmente declarado de modo diverso. Isto porque a carga positiva em condições fisiológicas não é comparável à dos resíduos R ou K, e é a carga em condições fisiológicas que é importante aqui, neste pedido de patente.
[00346] Do início ao fim do pedido, será usada a notação de aminoácidos de uma letra de rotina. Tipicamente, o termo "aminoácido" vai se referir a "aminoácido proteinogênico", isto é, os aminoácidos que estão naturalmente presentes em proteínas. O mais particularmente, os aminoácidos estão sob a forma isomérica L. Aminoácidos D também estão previstos, mas tipicamente têm diferentes tendências de agregação.
[00347] A expressão "um trecho de X aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína", em que X é um número, conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere ao fato de que estes X aminoácidos estão presentes como um trecho não interrompido, na mesma ordem, em uma proteína de um organismo. Em outras palavras, o trecho corresponde à sequência da proteína exata sobre uma extensão de X resíduos.
[00348] A "carga total" de um trecho de aminoácidos é a soma do número de aminoácidos carregados positivamente menos a soma do número de aminoácidos carregados negativamente ou vice versa. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, é sempre um valor absoluto. Portanto, se um trecho contiver por exemplo, um resíduo carregado positivamente e três aminoácidos carregados negativamente, a carga total daquele trecho é dois.
[00349] O termo "monômero" conforme usado no pedido é um átomo ou uma molécula pequena que pode ligar quimicamente a outros monômeros para formar um polímero. Isto pode se referir a monômeros naturais, tais como aminoácidos (cujos polímeros são polipeptídeos ou proteínas), nucleotídeos (os polímeros sendo ácidos nucleicos), ou monossacarídeos - por exemplo, glicose, cujos polímeros são amidos, glicogênio ou glicose; ou xilose, a qual tem xilano como um polímero). O mais particularmente, no entanto, monômero é usado aqui, neste pedido de patente, para se referir a moléculas orgânicas fora destas três categoris, as quais podem formar polímeros sintéticos ou outros polímeros naturais, tal como por exemplo, vini cloreto ou isopreno. Um monômero previsto o mais particularmente é óxido de etileno, cujo oligômero ou polímero é polietileno glicol (PEG), algumas vezes também referido como óxido de polietileno (PEO) ou polioxietileno (POE).
[00350] No contexto de monômeros, uma "unidade da mesma natureza" é usada aqui, neste pedido de patente, para se referir a monômeros da mesma estrutura geral, mas não necessariamente idênticos. Por exemplo, dois aminoácidos diferentes são unidades da mesma natureza, ao passo que um aminoácido e um monossacarídeo são unidades de uma natureza diferentes.
[00351] Um "sujeito" conforme usado aqui, neste pedido de patente, tipicamente se refere tanto a "sujeitos animais" quanto a "sujeitos vegetais". Um "sujeito animal" é usado aqui, neste pedido de patente, para se referir a um organismo vertebrado, mais particularmente um mamífero, o mais particularmente um humano. Sujeitos mamíferos particularmente previstos são os mantidos como um animal de estimação, tais como cães, gatos, coelhos, gerbos, hamsters, chinchilas, camundongos, ratos, porquinhos da índia, jumentos, mulas, furões, cabras pigméias, porcos barrigudos (pot-bellied), animais de estimação aviários tais como canários, periquitos, papagaios, frangos, perus; animais de estimação répteis, tais como lagartos, cobras, jabutis e tar- tarugas; e animais de estimação aquáticos, tais como peixe, salamandras e sapos. Outros animais particularmente previstos são espécies usadas para análise toxicológica, tais como camundongos, ratos, porquinhos da índia, coelhos, cães, porcos, macacos, furões e carneiro. Além disso são particularmente previstos animais de pecuária tais como alpaca, banteng, bisão, camelo, gado vacum (vacas), gamo, burro, gayal, cabra, cavalo, lhama, mula, porco, poney, rena, carneiro, búfalo d’água e iaque. Um "sujeito vegetal" conforme usado aq ui, neste pedido de patente, se refere a organismos vivos do reino Plantae. Plantas particularmente previstas incluem colheitas comerciais (isto é, colheitas cultivadas para lucro), tais como, mas não limitadas a, milho, arroz, trigo, soja, cevada, sorgo, milheto, aveia, centeio, triticale, trigo sarraceno, quinoa, fonio, einkorn, trigo duro, batata, café, cacau, mandioca, chá (tea), seringueira, coqueiro, dendê, cana de açúcar, beterraba sacarina, bananeira, laranjeira, abacaxizeiro, macieira, pereira, limoeiro, oliveira, pé de amendoim, feijão verde, alface, tomate, cenoura, abo-brinha, couve flor, canola, jatrofa, mostarda, jojoba, linho, girassol, algas verdes, juta, algodão, cânhamo (ou outras cepas de Cannabis sativa), canola, ou tabaco.
[00352] Um "organismo" conforme usado do início ao fim do pedido se refere a qualquer sistema vivo contíguo (tal como animal, fungo, micro-organismo, ou planta), bem como vírus (uma vez que estes também são entitidades separadas (‘sistemas contíguos’) que contêm proteínas). Organismos particularmente previstos são sujeitos (vide acima), organismos previstos que não são sujeitos incluem organismos não vertebrados como a espécie Drosophila ou a espécie Caenorhabditis. Também são particularmente previstos micro-organismos e/ou organismos patogênicos.
[00353] Uma "infecção" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere à colonização de um organismo hospedeiro (tipicamen- te um sujeito) por espécies (organismos) parasitas ou patogênicas. Patógenos ou parasitas infectantes procuram usar os recursos do hospedeiro para reproduzi, frequentemente resultando em doença infecciosa. "Doença infecciosa" é usado aqui, neste pedido de patente, para se referir a qualquer tipo de doença causada pela presença de um organismo externo (patógeno) em ou sobre o sujeito ou organismo com a doença. Infecções são geralmente consideradas como sendo causdas por micro-organismos ou microparasitas como vírus, príons, bactérias, e viroides, embora organismos maiores como macroparasi-tas e fungos também possam infectar. Os organismos que podem causa rinfecção são referidos aqui, neste pedido de patente, como "patógenos" (no caso de causarem doença) e "parasitas" (no caso de se benefiarem às custas do organismo hospedeiro, deste modo reduzindo a adequação biológica do organismo hospedeiro, mesmo sem doença evidente estar presente) e incluem, mas não estão limitados a, vírus, bactérias, fungos, protistas (por exemplo, Plasmodium, Phytophthora) e protozoários (por exemplo, Plasmodium, Entamoeba, Giardia, Toxoplasma, Cryptosporidium, Trichomonas, Leishmania, Trypanosoma) (microparasitas) e macroparasitas tais como vermes (por exemplo, nematódeos como ascarídeos, filárias, ancilóstomos, nematódeos e tricurídeos ou platelmintos como tênias e solhas (flukes)), mas também ectoparasitas tais como carrapatos e ácaros. Parasitoides, isto é, organismos parasitários que esterilizam ou matam o organismo hospedeiro, são previstos dentro do termo parasitas. De acordo com modalidades particulares onde as moléculas podem ser administradas diretamente a ectoparasitas ao invés de através do organismo hospedeiro, é previsto que ectoparasitas não estão incluídos dentro do sentido de parasitas que causam uma infecção.
[00354] Notar que embora doença infecciosa frequentemente seja usado para sujeitos que são animais, particularmente mamíferos, o mais particularmente humanos, é previsto aqui, neste pedido de patente, que doença infecciosa também se aplica a plantas (especialmente quando se refere a doença em um organismo). Na verdade, patógenos de plantas também podem causar infecções em plantas e incluem, mas não estão limitados a, fungos (por exemplo, Ascomicetos, Basidi-omicetos, Oomicetos), bactérias, Fitoplasma, Espiroplasma, vírus, nematódeos, protozoários e plantas parasitárias.
[00355] Uma "praga" ou "praga de plantas" conforme usado no pedido se refere a organismos que causam dano às plantas, particularmente plantas usadas em agricultura. Notar que o termo "praga de plantas" é usado no sentido de que a praga tem por alvo plantas, não é necessariamente o caso de que a praga é uma espécie de planta. Na verdade, pragas são em particular animais (vertebrados que comem ou destroem as plantas, ou invertebrados), outras plantas (ervas daninhas de colheitas e plantas parasitárias), micro-organismos e vírus. O mais particularmente, pragas são animais invertebrados (por exemplo, insetos (incluindo insetos de pragas agrícolas, pragas de insetos de plantas ornamentais, pragas de insetos de florestas, vetores de insetos de patógenos humanos, de animais ou plantas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, afídeos, lagartas, moscas, vespas, e semelhantes), nematódeos (vivendo livremente no solo ou particularmente espécies parasitárias de raízes de plantas, tais como nema-tódeo do nó da raiz, nematódeo do cisto da soja e nematódeo do cisto da batata), ácaros (tais como ácaros aranha, thread-footed mites e gall mites) e gastrópodes (incluindo lesmas tais como Deroceras spp., Mi-lax spp., Tandonia sp., Limax spp., Arion spp. e Veronicella spp. e cramujos tais como Helix spp., Cernuella spp., Theba spp., Cochlicella spp., Achatina spp., Succinea spp., Ovachlamys spp., Amphibulima spp., Zachrysia spp., Bradybaena spp., e Pomacea spp.), fungos patogênicos (incluindo Ascomicetos (tais como Fusarium spp., Thielavio- psis spp., Verticillium spp., Magnaporthe spp.), Basidiomicetos (tais como Rhizoctonia spp., Phakospora spp., Puccinia spp.), e Oomicetos semelhantes a fungos (tais como Pythium spp. e Phytophthora spp.), bactérias (tais como Burkholderia spp. e Proteobactérias tais como Xanthomonas spp. e Pseudomonas spp.), Fitoplasma, Espiroplasma, vírus (tais como o vírus do mosaico do tabaco e o vírus do mosaico da couve-flor), e protozoa. O termo "praga" apresenta importante sobreposição com os "patógenos" e "parasitas" relacionados com infecção, particularmente para micro-organismos e vírus. No entanto, para pragas de plantas, ectoparasitas e animais (invertebrados) que se alimentam sobre as plantas são sempre incluídos na definição.
[00356] "Doenças não infecciosas" são todas as doenças que não são doenças infecciosas, isto é, são as doenças que não são causadas por um patógeno e não podem ser transmitidas de uma pessoa para outra. Doenças não infecciosas podem ser causadas ou pelo meio-ambiente, por deficiências nutricionais, por escolhas do estilo de vida, ou pos heranças genéticas, e incluem por exemplo a maioria das formas de câncer, asma, e doença do coração. Uma classe de doença não infecciosa prevista o mais particularmente são os transtornos fisiológicos que são causados pelas próprias proteínas do organismo com a doença (por exemplo, através de expressão aberrante ou através de mutação).
[00357] Conforme usado no pedido, o termo "resistência a fármaco" se refere a uma redução na eficácia de um fármaco para curar uma doença ou condição. Particularmente, aplica-se no contexto de resistência adquirida por patógenos. Quando um organismo é resistente a mais de um fármaco, diz-se que é multidroga-resistente. O termo "resistência a antibiótico" conforme usado aqui, neste pedido de patente, é um tipo de resistência a fármaco onde um micro-organismo é capaz de sobreviver a exposição a um antibiótico. De modo a determinar a resistência a antibiótico na prática, pode ser usado o ponto de interrupção (breakpoint) clínico. Um ponto de interrupção de antibiótico é um limiar da MIC (Mínima concentração inibitória, a menor concentração de um antimicrobiano que vai inibir o crescimento visível de um micro-organismo depois de incubação) máxima para prever o sucesso da terapia com antibiótico. Durante o intervalo de dosagem do antibiótico, espera-se que os organismos com uma MIC neste limiar ou abaixo deste limiar sejam (no mínimo) inibidos ou mortos. Em outras palavras, se o valor da MIC de um antibiótico para um dado organismo for maior do que o valor do ponto de interrupção daquele antibiótico para o dado micro-organismo, diz-se que o micro-organismo é resistente. Pontos de interrupção clínicos são testados e monitorados pelo Comitê Europeu sobre Ensaio de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), na Europa, e valores de ponto de interrupção podem ser encontrados em seu site. Pontos de interrupção clínicos também são determinados separadamente pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute) nos Estados Unidos, estes são reconhecidos pela agência FDA dos Estados Unidos.
[00358] A resistência a fármaco, e particularmente a antibiótico, pode ser resistência natural (por exemplo, devido à proteína-alvo pelos fármacos não estar presente no organismo) ou pode ser resistência adquirida (por exemplo, através de mutações, as auais podem estar no gene-alvo pelo fármaco, ou por mutações que por exemplo aumentam a atividade de bombas de efluxo, de modo que o fármaco (por exemplo, antibiótico) é removido do organismo microbiano. Alternativamente, a resistência pode ser adquirida através de transferência genética horizontal, significando que (para antibióticos) organismos microbianos que são resistentes a uma informação genética de permuta de antibiótico em particular com organismos microbianos (da mesma espécie ou de espécies diferentes) que são sensíveis a este antibiótico, deste modo tornando os organismos sensíveis resistentes).
[00359] Um "biofilme", conforme usado aqui, neste pedido de patente, é um agregado de micro-organismos nos quais células aderem uma à outra e/ou a uma superfície. Estas células aderentes são frequentemente embutidas dentro de uma matriz auto produzida geralmente composta de DNA extracelular, proteínas, e polissacarídeos em várias configurações. Biofilmes pdoem conter muitos tipos diferentes de micro-organismo, por exemplo, bactérias, archaea, protozoários, fungos e algas. No entanto, também ocorrem biofilmes de monoespécie. Micro-organismos vivos em um biofilme geralmente têm propriedades significativamente diferentes de micro-organismos flutuantes livres (planctônicos) da mesma espécie, como um resultado do meio-ambiente denso e protegido do filme. Por exemplo, frequentemente é observada resistência aumentada a detergentes e antibióticos, uma vez que a matriz extracelular densa e a camada externa de células protegem o interior da comunidade. A formação de biofilme é um problema encontrado frequentemente com cirurgia de implante, uma vez que biofilmes podem ser formados sobre as superfíciese inertes de dispositivos implantados tais como catéteres, stents, válvas cardíacas prostéticas e dispositivos intrauterinos.
[00360] O termo "identidade de sequência " conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere à extensão que sequências são idênticas em uma base de nucleotídeo por nucleotídeo ou em uma base de aminoácido por aminoácido sobre uma janela de comparação. Portanto, uma "percentagem de identidade de sequência" é calculada comparando duas sequências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições com correspondência, dividindo o número de posições com correspondência pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. Para os tins da presente invenção, "identidade de sequência" será entendido como significando a "percentagem de correspondência" calculada pelo programa de computação DNASIS (Versão 2.5 for Windows; disponível na Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Calif., EUA) usando defaults de rotina conforme usado no manual de referência que acompanha o software. "Similaridade" se refere à percentagem do número de aminoácidos que são idênticos ou constituem substituições conservadoras. A similaridade pode ser determinada usando programas de comparação de sequências tais como GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). Deste modo, sequências de uma extensão similar às citadas ou substancialmente diferente das citadas aqui, neste pedido de patente, podem ser comparadas por inserção de espaços (gaps) dentro do alinhamento, os gaps referidos sendo determinados, por exemplo, pelo algoritmo de comparação usado pelo GAP.
[00361] Um "microarranjo" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um arranjo bidimensional sobre um substrato sólido. Pode servir como um ensaio multiplex, isto é, simultaneamente medem múltiplos analisados (até dúzias ou mais) em um único ensaio. Pode ser um dispositivo de lab-on-a-chip que faz uso de microfluídi-cos. Como substrato sólido, são usados tipicamente lâminas de vidro ou géis de filme fino de silício, porém outros materiais também podem ser usados (por exemplo, nitrocelulose, plásticos, ...). Como as moléculas apresentadas aqui, neste pedido de patente, ligam a proteínas, um microarranjo revestido com moléculas também pode ser referido como um microarranjo de proteína, microarranjo de ligação de proteína, ou chip de proteína. Microarranjos de proteína são geralmente usados em aplicações biomédicas para determinar a presença e/ou a quantidade (referida como quantificação relativa) de proteínas em amostras biológicas. Tipicamente, nos microarranjos descritos aqui, neste pedido de patente, as moléculas do pedido são usadas como moléculas de captura pontilhadas ou sintetizadas sobre o microarranjo.
Estrutura das Moléculas Estrutura geral
[00362] As moléculas proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem ser descritas com a seguinte fórmula:
[00363] (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00364] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K e P;
[00365] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00366] - cada Zi é um ligante selecionado de modo independente e Zn ou é um ligante ou está ausente.
[00367] Esta fórmula portanto engloba as seguintes estruturas:
X1-Y1-X2-Z1 (isto é, n=1),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (isto é, n=2),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3 (isto é, n=3),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4 (isto é, n=4), e
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4-X9-Y5-X10-Z5 (isto é, n=5), em que cada X, Y e Z numerados são conforme definido acima.
[00368] Porções Yi: regiões de agregação-nucleação
[00369] As porções Yi numeradas nestas moléculas são regiões indutoras de beta-agregação. Isto é, estas regiões são responsáveis por indução da agregação das moléculas, particularmente quando trazidas em contato com uma proteína-alvo. Aqui, será explicado em mais detalhes as restrições de sequência destas regiões.
[00370] Estudos mutacionais da cinética de agregação de proteínas de extensão total revelaram simples correlações entre as propriedades de agregação e físico-químicas tais como propensão de β-sheet, hidrofobicidade e carga. Isto induziu o desenvolvimento de algoritmos de computação que identificam regiões propensas a agregação na sequência de aminoácidos de uma proteína. Um destes é o algoritmo Zyggregator de Dobson et al. (Pawar et al., J Mol Biol350: 379-392 (2005)), o qual identifica sequências propensas a agregação por comparação do escore de propensão de agregação de uma dada sequência de aminoácido com uma propensão média calculada para uma série de sequências de extensão similar. O algoritmo mecânico estatístico TANGO (Fernandez-Escamilla et al., Nat Biotechnol 22:1302-1306 (2004)), por outro lado, equilibra os parâmetros físico-químicos mencionados acima, suplementados pela hipótese de que um aminoácido é totalmente enterrado no estado agregado: isto significa que se torna totalmente dessolvatado e restrito entropicamente. A partir de uma sequência de entrada (input), TANGO gera uma amostra extensiva de fragmentos para a qual propensões estruturais concorrentes, tais co- mo formação de hélice ou hairpina, são considerados. Todos os fragmentos são então equilibrados em uma soma de partição global, a qual possibilita a identificação de regiões de sequência que formam predominantemente agregados. O algoritmo TANGO tem uma precisão de mais de 90% para uma série de 176 peptídeos validados experimentalmente (Fernandez-Escamilla et al., Nat Biotechnol 22:1302-1306 (2004)). De modo importante, tanto o algoritmo Zyggregator quanto TANGO têm performance boa para peptídeos e proteínas desnaturadas.
[00371] Para proteínas globulares, uma molécula dobrada parcialmente pode ou redobrar para o estado nativo ou dobrar erroneamente em um estado agregado. Em consequência, ambas as reações estão em competição e é essencial um preciso entendimento da cinética para prever o resultado final em termos de dobramento ou dobramento / agregação incorreto. Portanto, no contexto da presente invenção, é importante identificar sequências que favorecem cineticamente a indução de agregação.
[00372] O mais particularmente, as sequências são sequências de beta-agregação não amiloide (algumas vezes referidas como sequências de beta-agregação amorfas). Beta-agregação amiloide e não amiloide difere em estrutura de ordem superior, em agregação cinética e na sequências de proteínas adequada para agregação (Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006). A comparação do espaço de sequência de β-agregação prevista por TANGO ou Zyggregator com o espaço de sequência de amiloideose (por exemplo, derivado a partir de estudos experimentais tais como Lopez de la Paz e Serrano, PNAS 101: 87-92, 2004) revela as similaridades, mas também diferenças interessantes entre ambos os processos. Na verdade, como tanto a formação de amiloide quanto a agregação cru-zada-β de amorfos requer composições de aminoácidos que são compatíveis com uma conformação de β-filamento, deve ser esperada uma sobreposição no espaço das sequências. No entanto, a estrutura de agregados cruzados-β amorfos não está clamente definida e parece ser caracterizada por um alto grau de flexibilidade. Por outro lado, a estrutura de fibras amiloides é semi-cristalina. Em consequência, as preferências de aminoácidos serão muito mais posição específicas em uma fibra amiloide do que em agregados cruzados-β amorfos. Considerando a sobreposição no espaço das sequências, modalidades específicas prevêm que a sequência de beta-agregação da no mínimo uma porção Yi é adequada no mínimo para beta-agregação amorfa. De acordo com estas modalidades, beta-agregação amorfa é prevista e agregação de amiloide pode ocorrer ou não além disso - esta é não vital, contanto que esteja presente no mínimo beta-agregação não amiloide.
[00373] Devido a seus requisitos conformacionais menos rigorosos, a β-agregação é geralmente muito mais rápida do que amiloideose, embora também tenha sido observada rápida amiloideose. Como β-agregados são frequentemente observados como precursores sobre o caminho para formação de fibra, a estabilidade destes agregados de precursores vão influenciar fortemente a cinética da amiloideose. Sequências amilogênicas polares, conforme observado em proteínas de príons de levedura, terão uma tendência a β-agregação muito menor e portanto serão muito mais favorável para a cinética da amiloideose. Em resumo, agregação cruzada-β amorfa e amiloideose pode ocorrer em comum, e a estabilidade e cinética de ambos processos será determinada pela extensão na qual são satisfeitos os requisitos estruturais de ambos os processos.
[00374] Portanto, de modo a favorecer cineticamente a indução de agregação, é desejável não usar somente sequências de beta-agregação, mas sequências de beta-agregação não amiloide. Por conseguinte, em modalidades particulares, a no mínimo uma região Yi não é uma sequência de beta-agregação amiloide. Deste modo, pode ser obtida rápida agregação de uma proteína-alvo. Geralmente sequências altamente hidrofóbicas têm uma forte tendência a formar agregados cruzados-β amorfos, mas não formam fibras amiloides devido a restrições estéricas. Por outro lado, geralmente sequências mais polares são mais prováveis de formar fibras amiloides. Entre estes dois extremos, provavelmente será observado um amplo espectro de comportamentos. O algoritmo Tango, em particular, é muito adequado para identificar sequências de beta-agregação com alta tendência a agregação e baixa tendência a amiloide. Na verdade, o algoritmo Tango oferece escores separados para tendência para amiloide e tendência a beta-agregação.
[00375] O algoritmo Tango foi descrito em mais detalhes alhures (particularmente Fernandez-Escamilla et al., Nat. Biotechnol. 22:13021306, 2004, especialmente a seção de Métodos às páginas 1305 e 1306 são especificamente incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referência. Vide também as Supplementary Notes 1 e 2 do mesmo artigo para detalhes adicionais sobre os métodos e as séries de dados usados para a calibração e a ensaio do algoritmo TANGO; mais fundo também pode ser encontrado no pedido de patente internacional No. WO2007071789). Em resumo, para prever regiões de auto-associação de um peptídeo, TANGO simplesmente calcula a função de partição do espaço de fase. Para estimar a tendência de agregação de uma sequência de aminoácidos em particular, foram sugeridas as seguintes hipóteses: (i) em um aggregado de beta-sheet ordenado, a estrutura secundária principal é o filamento beta-. (ii) as regiões envolvidas no processo de agregação são totalmente enterradas, deste modo pagando os custos e ganhos integrais de solvatação, plena entropia e otimização de seu potencial de ligações de H (isto é, o número de ligações de H produzidas no agregado está relacionado com o número de grupamentos doadores que são compensados por aceitadores. Um excesso de doadores ou aceitadores permanece insatisfeito). (iii) cargas complementares na janela selecionada estabelecem interações eletrostáticas favoráveis, e a carga líquida total do peptídeo dentro mas também fora da janela desfavorece agregação. TANGO pode ser acessado na Internet.
[00376] Um alto escore Tango de um trecho de sequência tipicamente corresponde a uma sequência com alta tendência (e cineticamente favorável) a beta-agregação. Portanto, o espaço das sequências de "sequências de alto escore tango" as quais não são polares demais e bastante hidrofóbicas define as porções Yi ideais (ou indutoras de beta-agregação, agregação-nucleação).
[00377] Melhores propriedades de agregação são obtidas quando, em uma molécula de acordo com a fórmula esboçada acima, cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente. (Embora deva ser mencionado que resíduos 2 R, K, D, E também possam estar presentes se forem um resíduo carregado positivamente e um resíduo carregado negativamente). De acordo com modalidades muito específicas, a região Yi pode conter exatamente 2 resíduos carregados (selecionados entre R, K, D, E), contanto que a carga líquida da região Yi seja zero. Mais particularmente no entanto, a região Yi não contém qualquer resíduo carregado (ou prolina para esta questão).
[00378] De acordo com este requisito, no mínimo 50% dos aminoácidos no trecho Yi são aminoácidos hidrofóbicos, isto é, são aminoáci- dos selecionados entre I, L, V, F, Y, W, H, M, T, K, A, C, e G. De acordo com modalidades adicionais particulares, no mínimo 60% dos aminoácidos são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 2/3 dos aminoácidos são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 70% são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 75% são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 80% são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 85% são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 90% são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 95% são aminoácidos hidrofóbicos, ou mesmo todos os aminoácidos são aminoácidos hidrofóbicos. Alternativamente, pode ser dito que no mínimo 3 aminoácidos no trecho Yi são aminoácidos hidrofóbicos, particularmente no mínimo 4 são aminoácidos hidrofóbicos, mais particularmente no mínimo 5 são aminoácidos hidrofóbicos, no mínimo 6 ou mesmo mais de 6 são aminoácidos hidrofóbicos.
[00379] Alguns dos aminoácidos hidrofóbicos listados são melhores adaptados para indução de beta-agregação (a qual é porque existem requisitos adicionais para a sequência). De acordo com modalidades particulares, os aminoácidos hidrofóbicos não englobam G (uma vez que as cadeias laterais são pequenas demais). De acordo com outras modalidades particulares, os aminoácidos hidrofóbicos não englobam C (uma vez que isto pode complicar questões em consequência da possível formação de pontes de dissulfeto). De acordo com ainda outras modalidades particulares, os aminoácidos hidrofóbicos não englobam K (em vista da carga positiva deste resíduo). De acordo com ainda outras modalidades particulares, os aminoácidos hidrofóbicos não englobam H (em vista da carga parcialmente positiva deste resíduo). Por conseguinte, modalidades específicas prevêm que os aminoácidos hidrofóbicos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A.
[00380] Em cada trecho Yi, no mínimo está presente um resíduo selecionado entre I, L, V e F (um resíduo alifático ou F), o mais particularmente mais de um resíduo semelhante está presente. Se somente um dos resíduos do trecho Yi for um resíduo I, L, V ou F, no mínimo um resíduo no trecho é selecionado entre Y, W, M, T ou A. Mais particularmente, nestas modalidades, no mínimo dois resíduos são selecionados entre Y, W, M, T ou A. De acordo com modalidades muito específicas, no mínimo dois resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, e W (isto é, entre resíduos alifáticos ou aromáticos não carregados). De acordo com outras modalidades específicas, no mínimo três resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A. De acordo com modalidades adicionais específicas, no mínimo quatro resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A. De acordo com outras modalidades específicas, no mínimo 40% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A. De acordo com modalidades adicionais específicas, no mínimo 50% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A. De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, no mínimo 50% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, e Y (isto é, são resíduos alifáticos ou F ou Y). De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, no mínimo 50% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, e F (isto é, são resíduos alifáticos ou F). De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, no mínimo 50% dos resíduos no trecho Yi são resíduos alifáticos, isto é, selecionados entre I, L, e V.De acordo com modalidades alternativas específicas, no mínimo 60% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A. De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, no mínimo 60% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, F, e Y (isto é, são resíduos alifáticos ou F ou Y). De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, no mínimo 60% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V, e F (isto é, são resíduos alifáticos ou F). De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, no mínimo 60% dos resíduos no trecho Yi são resíduos alifáticos, isto é, selecionados entre I, L, e V. De acordo com ainda modalidades adicionais alternativas, no mínimo dois terços dos resíduos são selecionados entre I, L, V, F, Y, W, M, T, e A; ou são particularmente selecionados entre I, L, V, F, e Y; ou são mais particularmente selecionados entre I, L, V, e F (isto é, são resíduos alifáticos ou F); ou no mínimo dois terços dos resíduos no trecho Yi são resíduos alifáticos (isto é, selecionados entre I, L e V). Alternativamente, pode ser dito que no mínimo 3 aminoácidos no trecho Yi são selecionados entre os resíduos acima, particularmente no mínimo 4 aminoácidos, mais particularmente no mínimo 5 aminoácidos, no mínimo 6 ou mesmo mais de 6 aminoácidos. De acordo com modalidades adicionais particulares, no mínimo 3 aminoácidos no trecho Yi são selecionados entre I, L, V ou F, particularmente no mínimo 4 aminoácidos são resíduos alifáticos ou F, mais particularmente no mínimo 5 aminoácidos são resíduos I, L, V ou F. De acordo com ainda modalidades adicionais, no mínimo 3 aminoácidos no trecho Yi são resíduos alifáticos, no mínimo 4 aminoácidos no trecho Yi são resíduos alifáticos, ou no mínimo 5 resíduos no trecho Yi são resíduos alifáticos.
[00381] De acordo com outras modalidades específicas, o número de determinados resíduos hidrofóbicos é limitado no trecho Yi. Por exemplo, em um trecho Yi (isto é, no mínimo um, até cada um), existe não mais de um resíduo C. De acordo com outras modalidades específicas, existe não mais de um resíduo H em um trecho Yi. De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos G estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo G está presente. De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos T estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo T está presente. De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos M estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo M está presente. De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos W estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo W está presente. De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos A estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo A está presente.De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos Y estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo Y está presente. Notar que, como para outras modalidades, estas modalidades são não exclusivas. Isto é, uma combinação de 2 ou mais destas restrições pode se aplicar a um dado trecho Yi.
[00382] É desnecessário dizer que quando não mais de um número determinado de resíduos particulares está presente, sempre é possível que nenhum destes resíduos particulares esteja presente.
[00383] Aminoácidos carregados, bem como prolina, tipicamente diminuem o potencial de beta-agregação de um dado trecho Yi. Embora um resíduo carregado ou prolina tipicamente possa ser tolerado, ou dois aminoácidos carregados se eles forem de carga oposta, de acordo com modalidades particulares, o trecho Yi é livre de resíduos P, R, K, D e E. Alternativamente, o trecho contém não mais de um resíduo P, R, K, D ou E (isto é, não mais de um resíduo selecionado entre P, R, K, D e E). De acordo com modalidades muito específicas, o trecho pode conter um resíduo K, mas não conter nenhum resíduo P, R, D ou E (em vista da natureza hidrofóbica dos resíduos lisina). De acordo com modalidades particulares, não há resíduos P, R, K, D, E presentes na região Yi. De acordo com modalidades adicionais particulares, não há resíduos P, R, K, D, E ou H presentes no trecho Yi. Isto porque resíduos H podem ser parcialmente carregados positivamente, e regiões Yi neutras são geralmente preferenciais.
[00384] É particularmente previsto que no mínimo uma (e até cada uma) região Yi carrega uma carga máximal de 1, e mais particularmen- te não carrega uma carga. Ainda mais particularmente, é previsto que o número de resíduos carregados é não maior do que um, o mais particularmente, nenhum resíduo carregado está presente em no mínimo uma (e particularmente cada) região Yi.
[00385] De acordo com outras modalidades não exclusivas, o trecho Yi, mesmo quando não contém resíduos carregados, também não contém mais de 75% resíduos polares não carregados, isto é, resíduos selecionados entre Y, W, T, Q, S, N, e H (C não é considerado como um resíduo polar aqui, e H não é considerado um resíduo carregado). Mais particularmente, não contém mais de 67% resíduos polares não carregados, ainda mais particularmente, não contém mais de 60% resíduos polares não carregados (ou mesmo menos de 60% resíduos polares não carregados). Em outras palavras, mesmo se os trechos tiverem muitos resíduos Y, W ou T (os quais são polares, não carregados e hidrofóbicos), ainda precisa haver suficientes resíduos apolares. De acordo com modalidades adicionais particulares, o trecho Yi não contém mais de 50% resíduos polares não carregados. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, o trecho Yi não contém mais de 40% resíduos polares não carregados. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, o trecho Yi não contém mais de um terço de resíduos polares não carregados. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, o trecho Yi não contém mais de 25% resíduos polares não carregados.
[00386] Resíduos polares, não hidrofóbicos, não carregados (isto é, S, N e Q) podem estar presentes em uma região Yi, mas seu número é preferencialmente limitado. De acordo com outras modalidades específicas, existe não mais de um resíduo Q. De acordo com outras modalidades específicas, existe não mais de um resíduo N. De acordo com modalidades alternativas, não mais de um ou dois resíduos S estão presentes no trecho Yi, particularmente não mais de um resíduo S está presente.
[00387] Resíduos polares, não aromáticos, não carregados (isto é, S, N, T e Q) podem estar presentes em uma região Yi, mas é particularmente previsto que eles não estão adjacentes um ao outro (isto é, não estão presentes 2 resíduos contíguos polares, não aromáticos, não carregados).
[00388] Conforme é evidente a partir do exposto acima, pode ser benéfico limitar a presença de resíduos específicos por razões particulares. Além disso pode ser benéfico limitar a soma de grupos de resíduos. De acordo com modalidades particulares, os resíduos em um trecho Yi não contêm mais de 60% resíduos selecionados entre C, M, N, Q e W. De acordo com modalidades adicionais particulares, os resíduos em um trecho Yi não contêm mais de 50% resíduos selecionados entre C, M, N, Q e W. De acordo com modalidades adicionais particulares, os resíduos em um trecho Yi não contêm mais de 40% resíduos selecionados entre C, M, N, Q e W. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, os resíduos em um trecho Yi não contêm mais de um terço de resíduos selecionados entre C, M, N, Q e W. De acordo com modalidades particulares, os resíduos em um trecho Yi não contêm mais de 25% resíduos selecionados entre C, M, N, Q e W.
[00389] De acordo com ainda outras modalidades particulares, o trecho Yi, mesmo quando não contém resíduos carregados ou prolina, também contém menos de 75% resíduos pequenos diferentes de V (isto é, selecionados entre A, T, C, G, S, N), mais particularmente menos de 67% resíduos pequenos diferentes de V, ainda mais particularmente, menos de 60% resíduos pequenos diferentes de V. Em outras palavras, mesmo se os trechos tiverem uma grande quantidade de resíduos T e A, ainda precisa haver suficientes resíduos hidrofóbicos grandes. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de 50% (mas inclusive 50%) dos resíduos na região Yi são resíduos pequenos diferentes de V. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de 40% dos resíduos na região Yi são resíduos pequenos diferentes de V. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de um terço (isto é, 33,33...%) dos resíduos na região Yi são resíduos pequenos diferentes de V. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de 25% dos resíduos na região Yi são resíduos pequenos diferentes de V.
[00390] Particularmente, é previsto que o número de resíduos minúsculos é limitado no trecho Yi. Embora C possa ser considerado um resíduo minúsculo quando não está envolvido na formação de ponte de dissulfeto, é particularmente previsto que resíduos minúsculos são resíduos A, G e S. De acordo com modalidades particulares, não mais de 50% dos resíduos no trecho Yi são resíduos A, G e S. De acordo com modalidades adicionais particulares, não mais de 40% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre A, G e S. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de um terço dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre A, G e S. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de 25% dos resíduos no trecho Yi são selecionados entre resíduos A, G e S.
[00391] Alternativamente ou adicionalmente, o número de resíduos minúsculos pode ser limitado. Isto é particularmente verdadeiro para os resíduos não polares A e G. De acordo com modalidades particulares, o número total de resíduos A e G em um trecho Yi é não mais de 4. De acordo com modalidades adicionais particulares, o número total de A e G resíduos em um trecho Yi é não mais de 3. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, a soma total de A e G resíduos em um trecho Yi é não mais de 2. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, a soma total de resíduos A e G em um trecho Yi é não mais de um.
[00392] Para obter agregação sequência-específica, é previsto que as porções Yi selecionadas para indução de agregação têm suficiente complexidade de sequência. Por isto, se indica que sequências que têm muito de um aminoácido em particular não são particularmente adequadas para agregação sequência-específica. Por exemplo, um trecho de polileucina tipicamente não obterá agregação sequência-específica (muito embora seja suficientemente hidrofóbico e possa agregar). Portanto, de acordo com modalidades particulares, não mais de 3 aminoácidos idênticos contíguos estão presentes em um trecho Yi. De acordo com ainda mais modalidades particulares, não mais de 2 aminoácidos idênticos contíguos estão presentes em um trecho Yi. De acordo com modalidades específicas, somente um aminoácido alifático pode estar adjacente ao mesmo aminoácido em um trecho Yi. Isto é, de acordo com estas modalidades, somente 2 aminoácidos contíguos (consecutivos) I, L ou V podem estar presentes em um trecho Yi. De acordo com modalidades adicionais particulares, não mais de 3 aminoácidos alifáticos consecutivos idênticos podem estar presentes em uma região Yi. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, não mais de 2 aminoácidos alifáticos consecutivos idênticos podem estar presentes em uma região Yi. Portanto, de acordo com estas modalidades, somente dois aminoácidos alifáticos idênticos podem estar adjacentes um ao outro em um trecho Yi.
[00393] De acordo com modalidades alternativas, mas não exclusivas, nenhum aminoácido não alifático único está presente mais de 3 vezes em um trecho Yi (isto é, o número de idêntico aminoácidos para um resíduo não alifático é limitado a 3 em um trecho Yi). De acordo com modalidades adicionais particulares, nenhum aminoácido não alifático único está presente mais de duas vezes (ou 2 vezes) em um trecho Yi.De acordo com modalidades adicionais particulares, nenhum aminoácido não alifático único está presente mais de 1 vez em um trecho Yi. De acordo com modalidades alternativas, nenhum aminoácido alifático único está presente mais de 3 vezes em um trecho Yi.De acordo com modalidades adicionais, nenhum aminoácido alifático único está presente mais de 2 vezes em um trecho Yi.
[00394] De acordo com outras modalidades particulares, nenhum aminoácido em particular compõe mais de 50% dos resíduos em um trecho Yi (isto é, não mais de metade do trecho Yi é composto de um aminoácido em particular). De acordo com modalidades adicionais particulares, nenhum aminoácido único compõe mais de 40% dos resíduos em um trecho Yi. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, nenhum aminoácido compõe mais de um terço dos resíduos em um trecho Yi.
[00395] De acordo com ainda outras modalidades particulares, o trecho Yi não é composto de, ou mesmo não contém, repetições de di-aminoácidos. Com repetições de di-aminoácidos se indica três ou mais, ou mesmo duas ou mais, repetições de dois resíduos não idênticos. De acordo com modalidades adicionais particulares, o trecho Yi não é composto de, ou mesmo não contém, repetições de tri-aminoácidos. Com repetições de tri-aminoácidos se indica três ou mais, ou mesmo duas ou mais, repetições de três resíduos, no mínimo dois dos quais são não idênticos. A título de exemplo, enquanto isoleucina e triptofano são perfeitamente aceitáveis em uma região Yi, uma região Yi que é exclusivamente construída de repetições IW ou IIW também não será particularmente adequada para agregação sequência-específica. Notar que agregação sequência-específica não é descartada para qualquer uma destas sequências, mas é preferencial usar sequências mais complexas para obter agregação específica.
[00396] A extensão do trecho de agregação é tipicamente uma compensação entre a especificidade desejada e o custo e a facilidade de síntese de sequências hidrofóbicas. Conforme msotrado na Figura 2, as sequências não precisam ser muito
[00397] longas para serem únicas dentro do proteoma de um dado organismo. Por exemplo, 60% das sequências com uma extensão de 5 aminoácidos que estão presentes nas proteínas são únic\as em humanos (isto é, somente 40% de semelhantes sequências ocorrem mais de uma vez). Para organismos com genomas menos complexos, tais como E. coli, mais de 80% das sequências de 5 aminoácidos codificadas pelo genoma são únicas. Pode ser visto a partir da figura que o aumento na especificidade se estabiliza, de modo que raramente é necessário usar sequências muito longas para obter especificidade. De acordo com modalidades particulares, a região Yi contém no mínimo 5 resíduos. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, a região Yi contém no mínimo 6 resíduos. De acordo com outras modalidades particulares, não exclusivas, a região Yi contém no máximo 12 resíduos. De acordo com ainda modalidades adicionais, a região Yi contém no máximo 11 resíduos. De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, a região Yi contém no máximo 10 resíduos.
[00398] Em alguns casos, pode ser desejável trabalhar com sequências que não são únicas em um dado organismo. Este é por exemplo o caso em aplicações direcionadas contra (não auto) patógenos, onde a inibição do crescimento e/ou a destruição do organismo patogênico é mais importante do que o direcionamento de somente uma proteína específica. Conforme pode ser visto a partir da figura, os trechos de beta-agregação tipicamente serão mais curtos nestas modalidades, de modo que mais proteínas podem ser visadas.
[00399] De modo a evitar extensão desnecessária do trecho Yi, de acordo com modalidades particulares, é previsto que o resíduo N- e/ou C-terminal do trecho Yi é um resíduo que é particularmente suscetível a β-agregação, particularmente um resíduo selecionado entre I, L, V, F, Y, W, A, M e T. De acordo com modalidades adicionais particulares, o resíduo N- e/ou C-terminal (isto é, no mínimo um resíduo seleciona-do entre o resíduo N- e C-terminal, ou o primeiro e/ou último resíduo) de um trecho Yi é selecionado entre I, L, V, F, Y e W. De acordo com modalidades adicionais particulares, o resíduo N- e/ou C-terminal de um trecho Yi é selecionado entre I, L, V, F, e Y. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, o resíduo N- e/ou C-terminal de um trecho Yi é selecionado entre I, L, V, e F. De acordo com ainda modalidades adicionais particulares, o resíduo N- e/ou C-terminal de um trecho Yi é selecionado entre I, L, e V (isto é, é um resíduo alifático). De acordo com modalidades adicionais particulares, estas limitações se aplicam tanto ao resíduo N- quanto C-terminal do trecho Yi.
[00400] Uma vez que é um objetivo proporcionar moléculas que sejam capazes de especificamente hiporregulação de proteínas, particularmente em uma maneira sequência-dependente, são particularmente previstas as moléculas onde no mínimo um dos Yi na molécula é um trecho de 4 a 17 (particularmente de 4 a 16 ou de 4 a 15) aminoácidos é idêntico a um trecho contíguo que ocorre naturalmente em uma proteína. Pode ser dito que este trecho contíguo na proteína é a região cognata da porção Yi. De acordo com aspectos específicos adicionais, este é o caso para mais de um Yi na molécula, particularmente para dois Yi ou no mínimo dois Yi na molécula, o mais particularmente para todos os Yi na molécula. De acordo com modalidades muito específicas, no entanto, Yi não é idêntico a um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína. Isto é previsto, por exemplo, para proteínas com uma etiqueta artificial, onde Yi é idêntico a uma sequência na etiqueta artificial. As etiquetas referidas podem ser úteis, uma vez que o desenho da sequência artificial permite mais liberdade na determinação da tendência de agregação da sequência. Deste modo, torna-se viável para proteínas-alvo que não têm uma nítida região de agregação de núcleo.
[00401] Uma vez que o no mínimo um trecho Yi confere especificidade, em algumas modalidades é particularmente previsto que este tre- cho não corresponde a (parte de) um trecho de repetição de um ou dois aminoácidos (por exemplo, um trecho de polileucina ou alternando leu-cinas e valinas). Este é particularmente o caso para as modalidades onde n=1. De acordo com modalidades adicionais particulares, o trecho Yi contém no mínimo 3 diferentes aminoácidos em sua sequência.
[00402] No entanto, de acordo com modalidades particulares, no mínimo um Yi é idêntico a um trecho contíguo que ocorre naturalmente em uma proteína, ao passo que no mínimo um outro Yi na mesma molécula não é idêntico a um trecho em uma proteína no organismo no genoma do qual a proteína-alvo é codificada. O último Yi é tipicamente uma sequência de ‘reforço’, isto é, uma sequência conhecida por ter uma tendência muito alta para agregação. Esta sequência pode aumentar a cinética de agregação, ou assegurar que a agregação da proteína-alvo ocorra / seja iniciada em menores concentrações. As sequências referidas podem ser sintéticas, ou podem ser derivadas de uma sequência (isto é, idêntica ou altamente similar a um trecho de sequência) presente em outro organismo / espécie.
[00403] Se for previsto ter por alvo específico uma proteína, o no mínimo um trecho de 4 a 15 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína devem ser únicos para a referida proteína no organismo (ou espécie) no genoma do qual a proteína é codificada (isto é, devem ser únicos no proteoma do referido organismo / da referida espécie), para assegurar que somente uma proteína no organismo seja na verdade visada. A unicidade é tipicamente somente necessária em um genoma específico (isto é, o genoma do organismo em que a proteína a ser hiporregulada está presente). Na verdade, se a sequência estiver presente em outro organismo ao qual o interferon não é administrado (ou no qual não pode atingir seu-alvo), isto não tem importância. Isto também se aplica nos casos em que não tem importância que uma proteína em um organismo diferente, tipicamente um mi- cro-organismo ou um organismo patogênico, é visada.
[00404] Algumas vezes, particularmente quando tendo por alvo patógenos ou tratando ou estabilizando infecções, é previsto que mais de uma proteína pode ser visada. Nestes casos, a sequência de proteína não precisa ser única no genoma do organismo. Pode ainda ser única para o organismo ou espécie, no entanto. Isto pode ser previsto quando as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, são administradas a mais de uma espécie diferente simultaneamente (por exemplo, uma mistura de micro-organismos), ao passo que somente em uma espécie uma ou mais proteínas precisam ser reguladas negativamente (por exemplo, para ter por alvo uma espécie patogênica, ao mesmo tempo não interferindo com organismos não patogênicos ou benéficos. Notar que isto também se aplica, por exemplo, quando se administra, por exemplo, uma molécula de interferon tendo por alvo uma proteína antimicrobiana, a um sujeito humano: nestes casos, a sequência da porção Yi não deve ser idêntica à sequência de uma proteína humana, ou no mínimo não deve ser idêntica a uma proteína humana com a qual o interferon pode entrar em contato.). De acordo com modalidades adicionais particulares, a sequência é única para a proteína e única para o organismo / a espécie.
[00405] Ao invés de espécie, as considerações acima também podem se aplicar a um gênero, a uma família, a uma ordem ou a uma classe de organismos, embora a probabilidade de conservação de sequência, e de descoberta de uma sequência única, diminua com o aumento na classificação taxonômica.
[00406] As no mínimo duas porções Yi presentes (em modalidades onde n é no mínimo dois) podem ser idênticas (isto é, tendo por alvo a(s) mesma(s) proteína(s), aqui, neste pedido de patente, algumas vezes referidas como ‘peptídeos de repetição em tandem’), podem ser diferentes porém presentes na mesma proteína (tendo por alvo a mesma proteína em diferentes modos, isto é, interferons "biagretópi-cos", em que no mínimo dois diferentes "agretopos" ou regiões de agregação são visadas), podem ser diferentes e estar presentes em diferentes proteínas (para visar mais de uma proteína em um organismo (isto é, interferons bi-específicos verdadeiros), ou a proteínas-alvo em diferentes organismos se o interferon for administrado a ou trazido em contato com mais de um (micro)organismo). Notar que "administração a um organismo" pode ser administração indireta. Por exemplo, no caso de patógenos, é previsto que o interferon será administrado ao organismo hospedeiro (tipicamente um sujeito, quer sujeito vegetal ou animal) para visar o organismo patogênico. Uma vez que a molécula de interferon nestes casos conterá no mínimo yna sequência de agregação presente no organismo patogênico e tem por objetivo agregar a proteína na qual esta sequência está presente, será evidente pata a pessoa versada que isto deve ser interpretado como "administração da molécula ao organismo patogênico" - é o contato (atingir o-alvo) que conta a este respeito.
[00407] Geralmente, de modo a obter direcionamento específico, uma perfeita correspondência entre a região Yi e o trecho de sequência na proteína de interesse é prevista. No entanto, em alguns casos, é previsto que podem ser usadas sequências não idênticas, mas intimamente relacionadsa, , isto é, sequências as quais têm uma ou duas substituições. De modo a manter a especificidade, é previsto que para substituições não conservadoras, para trechos Yi de menos de 6 aminoácidos, somente é tolerada uma diferença de aminoácido. Para sequências de no mínimo 6 aminoácidos (particularmente no mínimo 7 ou no mínimo 8 aminoácidos), podem ser substituído um ou dois aminoácidos. Alternativamente, a identidade de sequência entre o trecho Yi e o trecho de agregação na proteína de interesse é de no mínimo 70%, de no mínimo 75%, particularmente de no mínimo 80%, de no mínimo 85%, de no mínimo 90% ou mesmo maior. No caso de substituições conservadoras, a similaridade de sequência entre o trecho Yi e o trecho de agregação na proteína de interesse é de no mínimo 70%, de no mínimo 75%, particularmente de no mínimo 80%, de no mínimo 85%, de no mínimo 90% ou mesmo maior.
[00408] Conforme a pessoa versada perceberá, fazer uma substituição (particularmente não conservadora) pode resultar em especificidade alterada (isto é, tornar o trecho idêntico a um trecho de outra proteína no organismo, ou a um trecho de uma proteína em outro organismo com o qual o interferon pode entrar em contato), portanto deve ser verificado se isto acontece caso o direcionamento alterado seja indesejado. (Em alguns casos, o direcionamento para mais de uma proteína pode ser desejado, vide também abaixo).
[00409] Substituição conservadora é a substituição de aminoácidos com outros aminoácidos cujas cadeias laterais têm propriedades bioquímicas similares (por exemplo, são alifáticos, são aromáticos, são carregados positivamente, ...) e is é de conhecimento geral da pessoa versada. Substituição não conservadora é então a substituição de aminoácidos com outros aminoácidos cujas cadeias laterais não têm propriedades bioquímicas similares (por exemplo, substitução de um resíduo hidrofóbico com um resíduo resíduo). Substituições conservadoras vão tipicamente produzir sequências as quais não são mais idênticas, mas ainda são altamente similares.
[00410] As razões para introduzir uma substituição podem variar. De acordo com modalidades particulares, a substituição é com um resíduo gatekeeper, particularmente com um resíduo selecionado entre R, K, E, D, P, N, S, A, H, G, Q, mais particularmente selecionado entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionado entre R, K e P resíduos. Isto pode ser previsto para aumentar a solubilidade ou reduzir a auto-agregação (‘rompendo’ o potencial de formação de beta-sheet da região Yi hidrofóbica), ou para reduzir a especificidade enquanto mantendo a agregação (Isto é exemplificado no Exemplo 3). Embora as substituições referidas em geral reduzam a especificidade, em algumas modalidades, isto pode ser previsto para proporcionar acesso mais fácil a uma sequência que induz agregação (por ‘abertura’ da hidrofóbica região). Este é particularmente o caso para modalidades onde a agregação é favorecida em relação à especificidade (por exemplo, em aplicações antimicrobianas).
[00411] De acordo com modalidades alternativas, substituição é substituição conservadora. Isto é previsto quando é prevista a hiporre-gulação de uma família de proteínas, e as proteínas compartilham um motivo de sequência conservado, mas não idêntico. Em tais casos, pode ser obtida agregação destas proteínas intimamente relacionadas usando um motivo de sequência de consenso (isto é, uma sequência similar, mas não idêntica, onde ‘similar’ é usado no contexto de alinhamento de sequência). No entanto, é possível que a agregação seja menos eficiente quando a correspondência de sequência não é de 100%.
[00412] Outra razão para considerar substituição é aumentar a propensão de agregação inerente da sequência. Por exemplo, pode-se considerar substituir um resíduo em particular com um resíduo com maior potencial de propensão ou agregação de beta-sheet. Isto não é necessariamente uma substituição conservadora. Métodos para determinar o potencial de propensão ou agregação de beta-sheet são de conhecimento geral na arte. A título de exemplo, a propensão de beta-sheet de um resíduo em particular pode ser determinada tendo em conta os parâmetros de Chou-Fasman (Chen et al., BMC Bioinformatics 7 (Suppl 4): S14, 2006). Um ou mais resíduos com um escore P(b-sheet) menor do que 100 podem ser substituídos com resíduos com um escore P(b-sheet) > 100. Resíduos de alto escore de beta-sheet no método de Chou-Fasman são (em ordem descendente): valina, Isoleucina, tirosina, fenilalanina, triptofano, leucina, treonina, cisteína, glutamina e metionina. Particularmente substituição com valina ou isoleucina é prevista para aumentar o potencial de formação de beta-sheet. Logicamente, a especificidade sempre deve ser verificada, e aqui novamente, substituição é particularmente prevista para aplicações onde a agregação é favorecida em relação à especificidade.
[00413] Se a porção Yi precisar ser idêntica a um trecho que ocorre em uma proteína, as sequências específicas que induzem agregação podem ser identificadas à primeira vista na sequência de proteína (usando as diretrizes acima) ou usando algoritmos específicos para identificar trechos de sequências que satisfazem estes requisitos. Usando o mesmo método ou os mesmos algoritmos ou método ou algoritmos diversos, pode ser verificado se a sequência ocorre em outra proteínas (ou é codificada em genomas de outros organismos) também.
[00414] Um modo particularmente fácil de identificar as sequências referidas em uma proteína é usando um algoritmo de previsão de beta-agregação primeiro (preferencialmente um algoritmo tendo em conta parâmetros biofísicos), e selecionando as sequências mais apropriadas com base nas limitações de sequência acima. Tango e Zyggrega-tor já foram listados como exemplos de semelhantes algoritmos, porém muitos mais foram descritos na arte, incluindo, mas não limitados aos descritos por Bryan et al., PLoS Comput Biol. 5(3):e1000333, 2009; Caflish, Curr Opin Chem Biol. 10(5):437-44, 2006; Conchillo-Sole et al., BMC Bioinformatics 8:65, 2007; Galzitskaya et al., PLoS Comput Biol. 29;2(12):e177, 2006; Goldschmidt et al., PNAS 107(8):3487-92, 2010; Maurer-Stroh et al., Nat Methods 7(3):237-42, 2010; Rojas Quijano et al., Biochemistry 45(14):4638-52, 2006; Saiki et al., Biochem Biophys Res Commun 343(4):1262-71,2006; Sanchez de Groot et al., BMC Struct Biol 5:18, 2005; Tartaglia et al., Protein Sci. 14(10):2723-34, 2005; Tartaglia et al., J Mol Biol. 380(2):425-36, 2008; Thompson et al., PNAS 103(11):4074-8, 2006; Trovato et al., Protein Eng Des Sel. 20(10):521-3, 2007; Yoon e Welsh, Protein Sci. 13(8):2149-60, 2004; Zibaee et al., Protein Sci. 16(5):906-18, 2007. Notar que muitos destes estão essencialmente envolvidos com sequências de agregação amiloide e não somente com beta-agregação amorfa. Conforme explicado acima, o espaço de sequência de ambas as formas de agregação se sobrepõe (Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006), e ambas as formas de agregação estão previstas, contanto que a cinética e as condições da reação favoreçam agregação da proteína de interesse. Tipicamente no entanto, os algoritmos referidos também podem identificar trechos polares (tais como os presentes em proteínas de príons de levedura) que não satisfaz as restrições da sequência Yi definidas aqui, neste pedido de patente.
[00415] Porções X2i-1 e X2i: resíduos gatekeeper
[00416] Nas moléculas de interferon descritas aqui, neste pedido de patente, as sequências que induzem agregação são flanqueadas sobre ambos os lados por 1 a 4 aminoácidos específicos (as porções Xi) que têm baixo potencal de beta-agregação. Estas são algumas vezes referidas como resíduos gatekeeper (Pedersen et al., J Mol Biol 341: 575-588, 2004), e são essenciais para evitar auto-agregação das moléculas de interferon (particularmente antes de estarem em contato com uma proteína-alvo).
[00417] No estado nativo das proteínas, a agregação é frequentemente contida ou oposta por resíduos carregados que ocorrem naturalmente mas também por, por exemplo, prolinas e glicinas nos flancos de segmentos de sequências de agregação. Estes agem de modo eficaz como resíduos gatekeeper, isto é, resíduos que não necessariamente estabilizam o estado nativo, mas os quai8s bloqueiam a forma- ção de estados indesejados dobrados incorretamente ou agregados por, por exemplo, choques estéricos ou eletrostáticos. Além disso foi reportado em várias ocasiões que a introdução de resíduos carregados, prolinas ou glicinas em sequências propensas a agregação reduz a agregação. As propriedades de oposição a agregação de prolina e glicina se originam essencialmente de suas propriedades de rompimento de estrutura. Identicamente resíduos carregados também são muito eficazes em oposição a agregação, devido à imensa força repulsiva gerada sobre a auto-montagem. De modo interessante, in nature, arginina e lisina são preferenciais em relação a glutamato e aspartato nos flancos de sequências fortemente agregantes (Rousseau et al., J Mol Biol 355:1037-1047, 2006). A razão para esta preferência pode ser que, além de carga, arginina e lisina também têm muito maior entropia conformacional, tornando muito caro immobilizar as mesmas em agregados densamente comprimidos.
[00418] No pedido de patente internacional No. WO2007071789, foi declarado que semelhantes gatekeepers reduzem a propensão a agregação. De modo a otimizar a co-agregação de interferons com uma dada proteína-alvo, a região de auto associação da proteína-alvo que é incluída no interferon pode ser mutada de modo a que os resíduos gatekeeper sejam substituídos por resíduos que promovem agregação. Em outras palavras, a presença de gatekeepers foi considerada indesejável.
[00419] Agora, foi demonstrado surpreendentemente que, para as regiões de forte beta-agregação que compõem as porções Yi, flanqueando as mesmas com gatekeepers (isto é, as duas porções numeradas X) na verdade reduz sua propensão a auto-agregação, mas não interfere substancialmente com sua capacidade para indução de agregação da proteína de extensão total. Por um lado, é surpreendente que apesar da alta hidrofobicidade e da propensão a agregação intrín- seca, estas moléculas ainda permanecem em solução; por outro lado, o efeito dos gatekeepers proporcionados nas moléculas não evita co-agregação da (extensão total) proteína com a molécula. Esta combinação única de características torna as moléculas proporcionadas aqui, neste pedido de patente, particularmente adequadas para obter agregação de proteínas induzidas.
[00420] Estes resíduos gatekeeper são particularmente selecionados entre resíduos R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q. Além disso podem ser usados resíduos alanina, mas uma vez que estes também podem estar presentes nas porções Yi, é particularmente previsto que uma porção X conforme usado aqui, neste pedido de patente, não é somente composta de resíduos A. Mais específico, é previsto que resíduos A somente são usados como gatekeeper se outra parte da porção X for no mínimo um resíduo selecionado entre R, K, P, D ou E.
[00421] Notar que, com a exceção de G e P, estes são todos resíduos polares. Os resíduos G e P são bons gatekeepers devido a sua estrutura de cadeia lateral específica (prolina) ou carecem da mesma (glicina). Embora S, H, N e Q sejam resíduos polares, podem ser tolerados em um trecho de beta-agregação em baixos números (vide acima). Uma consideração similar se aplica para os resíduos G.
[00422] De acordo com modalidades particulares, os resíduos nas porções X flanqueantes são resíduos que não estão presentes na porção Yi entre estas porções flanqueantes.
[00423] Nestes casos, as porções X são tipicamente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D, P e H. Mais particularmente, são 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D,e P. Ainda mais particularmente, são selecionados entre R, D e P. Notar que P permanece nesta seleção de gatekeepers uma vez que é quebrador muito eficiente da estrutura de beta sheet. No entanto, de acordo com modalidades particulares, especialmente onde n é 1, P não é previsto como gatekeeper.
[00424] Normalmente, um ou dois aminoácidos são suficientes para romper a beta-sheet e manter as moléculas em solução. Porções X mais curtas são benéficas em termos de facilidade e custo de síntese, enquanto sendo tão eficientes em sua função de ‘gatekeeping’, isto é, em demarcação e/ou apresentação das porções Y hidrofóbicas. Por conseguinte, em algumas modalidades particulares, cada X2i-1 e X2i é 1 ou 2 aminoácidos (os quais podem ser selecionados de modo independente entre cada outros).
[00425] De modo similar, peptídeos os quais são limitados em carga podem facilitar a interação com proteínas de interesse: enquanto ainda proporcionando possibilidade de ligações de H, é reduzido o risco de repulsão eletrostática. Portanto, de acordo com modalidades alternativas, mas não exclusivas, cada X2i-1 e X2i tem uma carga total de não mais de 2. Alternativamente, o número total de aminoácidos em ambas as porções X é 5 ou menos, particularmente 4 ou menos. Modalidades alternativas proporcionamk que a carga total de ambas as porções X em torno da região Y hidrofóbica é menos de 5, particularmente 4 ou menos. As modalidades neste parágrafo são o mais particularmente previstas para moléculas onde n é 1, ou moléculas onde n é dois.
[00426] Como é particularmente previsto que as porções Yi não contêm resíduos carregados, a carga total das moléculas tipicamente será não maior do que 5 quando n é 1, e não maior do que 10 quando n é 2. Para moléculas onde n é 2, é particularmente previsto que a carga total da molécula é entre 2 e 10, mais particularmente entre 2 e 8, mais particularmente entre 4 e 8, ainda mais particularmente entre 2 e 6 (por exemplo, 3, 4, 5), entre 4 e 6, tal como 4, 5 ou 6. É particularmente previsto que a carga é mais ou menos uniformemente distribuída entre a molécula, isto é, todas as porções X têm uma carga similar (para pór em outros termos: a diferença de carga entre as porções X contidas em uma molécula é particularmente não mais de um). De acordo com modalidades específicas, a molécula não é neutra, isto é, contém alguma carga. Isto porque porções carregadas tipicamente vão ajudar a atingir a especificidade, isto é, ao fazer a porção Yi das moléculas interagir somente com trechos de polipeptídeos quase completamente idênticos ou completamente idênticos. Além disso, a carga pode ajudar a prevenir auto-associação e agregação prematura das moléculas (isto é, sem co-agregação do-alvo). Portanto, em modalidades específicas, no mínimo uma - e até cada uma - porção X numerada tem uma carga de 1 ou 2. De modo a ser econômico, as porções X são iparticularmente compostas predominantemente ou exclusivamente de resíduos carregados de modo idêntico dentro da porção. É possível que uma porção X2i-1 tenha uma carga com um signo diferente do signo da porção X2i correspondente.
[00427] De acordo com modalidades particulares, X2i-1 e X2i em torno de uma região Yi são idênticos. De acordo com modalidades adicionais, cada X2i-1 na molécula é idêntico a cada X2i. De acordo com ainda modalidades adicionais, todos os X2i-1 e X2i na molécula são idênticos. De acordo com outras modalidades específicas, os resíduos de no mínimo um, e particularmente de todos os X2i-1 espelham a ordem de sequência dos resíduos no X2i correspondente. Isto é, se os resíduos gatekeeper de X2i-1 são por exemplo N-P (isto é, um N-terminal do aminoácido asparagina de um aminoácido prolina), os resíduos em X2i são P-N (um C-terminal de asparagina do resíduo prolina).
[00428] De acordo com modalidades alternativas, a carga de no mínimo um, e particularmente de todos os, X2i-1 tem o mesmo signo que seu X2i correspondente. De acordo com modalidades adicionais específicas, a carga de no mínimo um, e particularmente de todos os, X2i-1 é idêntica à do X2i correspondente. Resíduos carregados identicamente combatem mais fortemente agregação através de auto- associação. De acordo com outras modalidades, a carga de todas as porções X na molécula ou é neutra ou tem o mesmo signo. Isto pode ajudar a prevenir atração eletrostática entre as moléculas.
[00429] De acordo com algumas modalidades muito específicas, no mínimo parte de no mínimo uma porção X flanqueando a região Yi também está presente na proteína de interesse. Na verdade, sequências hidrofóbicas em proteínas são frequentemente flanqueadas por resíduos gatekeeper, para prevenir agregação. De acordo com modalidades específicas onde no mínimo um Yi é idêntico a uma sequência que ocorre naturalmente em uma proteína, no mínimo um gatekeeper flanqueando o Yi nas porções X das moléculas é idêntico a um resíduo gatekeeper que ocorre na proteína. Este é particularmente o caso em exemplos onde a sequência Yi corresponde à sequência completa entre os gatekeepers na proteína, de modo que a sequência da molécula corresponde à sequência da proteína para no mínimo um trecho Yi e no mínimo parte de no mínimo um trecho X vizinho ao trecho Yi. Também se aplica particularmente para proteínas onde o um ou mais gatekeepers flanqueantes naturalmente não são tão fortes, isto é, são resíduos que também podem ser parte de um trecho Yi, tal como por exemplo, N ou S. Portanto, a sequência da molécula e a proteína de interesse correspondem sobre uma região contígua de no mínimo um aminoácido mais longo do que o trecho Yi da molécula (isto é, no mínimo um gatekeeper flanqueante da sequência de agregação na proteína é incluído na molécula ).
[00430] De acordo com modalidades particulares alternativas, é previsto que as porções de gatekeeper facilitem ou estabilizem a interação da porção Yi com sua região cognata na proteína. Este pode ser o caso onde os resíduos flanqueando a região de agregação na proteína (sobre o lado N- e/ou C-terminal) carregam uma carga. Para reduzir a probabilidade de repulsão por cargas similares, e deste modo maximizar a probabilidade de interação, a carga dos igatekeepers X2i-1 e/ou X2 pode ser escolhida para ser complementar à carga da sequência flanqueante na proteína. Para ilustrar isto com um exemplo, a proteína calcineurina em levedura (vide o exemplo 1.5) tem duas regiões de indução de agregação as quais são flanqueadas por resíduos carregados na sequência de proteína. As duas regiões de proteína são como se segue: NKLR FAFNIY DIDRD (SEQ ID NO: 100), e GNGE LFIVM KMMV (SEQ ID NO: 101) (são mostradas as duas regiões de agregação (sublinhadas) com 4 ou 5 resíduos flanqueantes N- ou C-terminal das mesmas). NKLR (SEQ ID NO: 102) tem dois aminoácidos carregados positivamente, ao passo que a carga líquida de DIDRD (SEQ ID NO: 103) é menos 2 (três resíduos D carregados negativamente, 1 resíduo R positivo). Portanto, para modalidades onde as porções de gatekeeper têm cargas complementares, a porção X sobre o N-términuo de FAFNIY (SEQ ID NO: 104) deve ser carregada negativamente, ao passo que a porção X no lado C-terminal deve ser carregada positivamente. Para a sequência LFIVM (SEQ ID NO: 105), o oposto se aplica: esta é flanqueada na proteína calcineurina por uma carga negativa em seu lado N-terminal e por um resíduo K positivo em sua extremidade de terminal carbóxi. Portanto, moléculas com gatekeepers complementares têm uma carga positiva na extremidade N-terminal e uma carga negativa na outra extremidade. No Exemplo 1.5, este é o caso para os constructos 6 e 7.
[00431] Conforme é evidente a partir do exemplo de DIDRD (SEQ ID NO: 103), cargas opostas podem estar presentes em regiões flan-queantes. Para determinar a carga líquida, tipicamente não mais de 7 aminoácidos flanqueando a sequência são levados em conta, preferencialmente mesmo menos, tal como 5, 4 ou 3. A carga líquida é então a soma da carga dos resíduos neste trecho. Resíduos imediatamente adjacentes ao trecho de indução de agregação frequentemente têm uma contribuição mais importante para a carga real. Portanto, por exemplo, se um resíduo carregado positivamente flanqueia imediatamente a sequência de agregação, enquanto um resíduo negativo é, por exemplo, quatro aminoácidos adicionais a jusante ou a montante, então o flanco pode ser considerado positivamente carregado ao invés de neutro, uma vez que o efeito de carga do resíduo imediatamente adjacente será muito mais forte. De acordo com modalidades mais particulares, somente o resíduo flanqueando imediatamente a sequência propensa a agregação é levado em conta para determinação da carga da sequência natural.
[00432] Porções Zi: ligantes
[00433] Conforme esboçado na fórmula acima, as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, também contêm porções de ligante, Zi. De acordo com modalidades particulares, as moléculas somente contêm ligantes internos e não contêm ligantes N- ou C-terminal (lembrar: a fórmula (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n conforme usado aqui, neste pedido de patente, é equivalente à fórmula (Zi-X2i-1-Yi-X2i)n, em que cada Z2 a Zn é um ligante, e Z1 é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada). Em outras palavras, as moléculas têm resíduos gatekeeper (isto é, as porções X) em ambos os seus N- e C-términos. Isto corresponde a moléculas da seguinte fórmula: (X2i-1-Yi-X2i)n em que n, i, X2i-+1 e X2i, e Yi são conforme definido acima, em que as porções são fundidas umas às outras por uso de porções de ligante opcionais. Uma vez que um ligante externo (N- e ou C-terminal) pode ser usado para, por exemplo, fundir outras porções às moléculas, isto também pode ser escrito como Z0-(X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, com X2i-1 e X2i, Yi, i e n conforme definido acima, em que Z0 é uma porção de ligante N-terminal opcional, Z1 a Zn-1 é um ligante, e Zn é uma porção de ligante C-terminal opcional.
[00434] Portanto, em modalidades específicas, Zn é nada (ou é um ligante de zero unidades de ligação).
[00435] A natureza das porções de ligante não é vital para a invenção, embora ligantes flexíveis longos tipicamente não sejam usados. De acordo com modalidades particulares, cada Zi é selecionado de modo independente entre trecho de entre 0 e 20 unidades idênticas ou não idênticas, em que uma unidade é um aminoácido, um monossaca-rídeo, um nucleotídeo ou um monômero. Unidades não idênticas podem ser unidades não idênticas da mesma natureza (por exemplo, diferentes aminoácidos, ou alguns copolímeros). Também podem ser unidades não idênticas de uma natureza diferente, por exemplo, um ligante com unidades de aminoácido e nucleotídeo, ou um heteropolí-mero (copolímero) compreendendo duas ou mais espécies monoméricas diferentes. De acordo com modalidades particulares, a extensão de no mínimo um, e particularmente cada Zi diferente de Zn, é no mínimo 1 unidade. De acordo com outras modalidades particulares, Zn é 0 unidades. De acordo com modalidades particulares, todos os ligantes de Zi diferentes de Zn são idênticos. De acordo com modalidades adicionais, todas as porções de Zi são idênticas.
[00436] Aminoácidos, monossacarídeos e nucleotídeos e monômeros t~em o mesmo significado que na arte. Notar que exemplos particulares de monômeros incluem miméticos de monômeros naturais, por exemplo, aminoácidos não proteinogênicos ou que não ocorrem naturalmente (por exemplo, carnitina, GABA, e L-DOPA, hidroxiprolina e selenometionina), monômeros de ácido nucleico de peptídeo, e semelhantes. Exemplos de outros monômeros adequados incluem, mas não estão limitados a, óxido de etileno, cloreto de vinila, isopreno, ácido láctico, olefinas tais como etileno, propileno, amidas ocorrendo em polímeros (por exemplo, acrilamida), monômeros de acrilonitrilo-butadieno-estireno, etileno vinil acetato, e outras moléculas orgânicas que são capazes de formação de polímeros.
[00437] De acordo com modalidades alternativas, as unidades de li- gantes são ligantes químicos, tais como os produzidos por acoplamento de carbodiimida. Exemplos de carbodiimidas adequadas incluem, mas não estão limitados a, 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N,N'-Diisopropilcarbodiimida (DIC), e Diciclohexilcarbodiimida (DCC). Outro ligante químico particularmente previsto é ácido 4, 7, 10-trioxatridecan-succínico (algumas vezes também designado como ácido 4, 7, 10-trioxatridecan-succinâmico) ou Ttds.
[00438] De acordo com modalidades específicas, no mínimo um, e particularmente todos, Zi são de entre 0 e 10 unidades da mesma natureza, particularmente entre 0 e 5 unidades da mesma natureza. Se os ligantes forem flexíveis, é particularmente previsto usar ligantes curtos. O uso de ligantes curtos evita que dois trechos Yi da mesma molécula venham a dobrar de volta sobre si mesmos, uma vez que isto os tornaria menos acessíveis para a(s) proteína(s) de interesse. Além disso, assegurando que os diferentes trechos Yi de uma molécula não podem interagir um com o outro, a solubilidade da molécula é aumentada. De acordo com modalidades particulares, os ligantes são tão curtos que não permitem o dobramento dos trechos Yi em modo antipara-lelo. Por exemplo para aminoácidos, no mínimo três ou quatro aminoácidos são necessários para fazer uma volta completa, de modo que ligantes de não mais de quatro ou de não mais de três aminoácidos são particularmente previstos. Isto também depende da natureza dos aminoácidos, de modo que a uso de aminoácidos que não têm uma propensão estrutural particular, ou uma propensão para uma estrutura torcida, tais como G, S e P é particularmente prevista. De acordo com modalidades particulares, no mínimo uma porção Zi, e particularmente toda as porções Zi com a exceção de Zn, é um ligante de peptídeos ou polipeptídeos. Sequências particularmente previstas de semelhantes ligantes incluem, mas não estão limitadas a, PPP, PP ou GS. Para porções Zi que são compostas de aminoácidos, pode-se levar em con- ta a estrutura primária (por exemplo, na sequência do ligante incluem muitos aminoácidos sem um tendência para uma estrutura em particular), mas também a estrutura secundária ou terciária. Por exemplo, pode-se escolher aminoácidos que não formam nenhuma estrutura secundária em particular, ou formam uma alfa hélice (linear). Ou, aminoácidos podem ser escolhidos de modo a que não formem uma estrutura terciária estável, uma vez que isto pode resultar nas porções Yi se tornarem inacessíveis. Os ligantes de aminoácidos podem formar uma espiral aleatória. Outro ligante particularmente previsto é polietileno glicol (PEG), isto é, um oligômero ou polímero de grupamentos óxido de etileno monoméricos. Oligômeros PEG são frequentemente abreviados enquanto indicando o número de unidades monoméricas, por exemplo, PEG2, PEG3 ou (PEG)4. De acordo com modalidades particulares, no mínimo uma porção Zi é um oligômero PEG (abreviado PEG). De acordo com modalidades adicionais particulares, todas as porções Zi são porções PEG. De acordo com ainda modalidades alternativas, no mínimo uma porção Zi, e particularmente todas as porções Zi com a exceção de Zn, são um ligante de PEG.
[00439] O ligante é preferencialmente curto para prevenir interações antiparalelas das porções Yi da mesma molécula. Notar no entanto que em muitos casos, a formação de uma beta sheet antiparalela não é favorecida, muito embora a extensão do ligante tornaria isto possível. Por exemplo, para moléculas onde Yi tem a mesma sequência que o próximo Yi (isto é, Yi+1) e esta sequência não é simétrica, não será formada nenhuma beta sheet. Para semelhantes moléculas, o ligante deve ser suficientemente curto para evitar dobramento de trechos Yi em modo paralelo - a extensão de semelhantes ligantes depende da extensão do trecho Yi e da quantidade de unidades necessária para fazer duas voltas de hairpina (isto é, mínima extensão necessária para permitir que o Yi seja arranjado em paralelo). Digno de nota, isto se aplica a ligantes flexíveis que permitem o dobramento das moléculas. Se puder ser assegurado que os ligantes são rígidos e as diferentes regiões Yi de uma molécula não podem ser trazidas em contato uma com a outra (isto é, não podem interagir uma com a outra), a extensão do ligante não é realmente importante. Em semelhantes casos, pode ser mais de 20 unidades, embora tipicamente a extensão venha a ser limitada por razões práticas.
[00440] Um exemplo em particular onde ligantes mais longos são favorecidos em relação a outros ligantes são os casos em que no mínimo duas proteínas diferentes, particularmente duas proteínas diferentes no mesmo organismo, são visadas (isto é, as porções Yi correspondem a regiões de indução de agregação de mais de uma proteína). De modo a assegurar que a molécula possa (por exemplo, simultaneamente) interagir com mais de uma proteína, pode ser benéfico aumentar a distância entre as diferentes porções Yi de direcionamento, de modo que a interação não é evitada devido a impedimento estérico. Nestes casos, o ligante de Zi pode ser um trecho de entre 0 e 100 unidades idênticas ou não idênticas, em que uma unidade é um aminoácido, um monossacarídeo, um nucleotídeo ou um monômero; ou de entre 0 e 90, 0 e 80, 0 e 70, 0 e 60, 0 e 50, 0 e 40, 0 e 30 ou 0 e 20. Particularmente, a mínima extensão do ligante de Zi é no mínimo 1 unidade, no mínimo 2 unidades, no mínimo 3 unidades, no mínimo 4 unidades, ou no mínimo 5 unidades.
[00441] Quando são usados ligantes mais longos, são preferencialmente não idênticos a sequências das proteínas a partir das quais a no mínimo uma região Yi é derivada. De acordo com modalidades muito particulares, um ligante de mais de 20 unidades não é um ligante peptídico, isto é, as unidades não são aminoácidos. De acordo com modalidades alternativas, ligantes mais longos podem ser ligantes peptídicos, mas ligantes peptídicos contendo motivos de repetição (por exemplo, ligantes de GS, GGS, PP ou outros ligantes contendo repetições de mono-, di- ou tri- aminoácidos). Particularmente, o ligante é essencialmente livre de estrutura de polipeptídeo secundário, por exemplo, de trechos de alfa-hélice ou beta-sheet. Qualquer predisposição do ligante de polipeptídeos para um motivo de estrutura secundária de polipeptídeo necessariamente vai limitar o grau de liberdade espacial experimentada pelas extremidades do ligante.
Observações gerais sobre estrutura molecular
[00442] Como inúmeros peptídeos já foram descritos na arte, é possível que algumas moléculas com uma estrutura peptídica que se encaixa sob a fórmula geral já tenham sido descritas na arte (para uma finalidade diferente) - particularmente aquelas onde n é 1 (embora, de acordo com nosso melhor conhecimento, este não seja o caso). É por isto que previu-se que o âmbito da reivindicação do produto direcionado para as moléculas, particularmente quando n é 1, será diferente do âmbito dos usos e métodos nos quais estas moléculas podem ser aplicadas. Por conseguinte, para modalidades quando n é 1, é previsto que as porções X são mais rigorosamente selecionadas (por exemplo, somente entre R, K, E, D, P; ou por exemplo, excluindo K, cf. acima), que as porções X são mais curtas (por exemplo, 1 ou 2 aminoácidos) e não existem exclusivamente de resíduos K, que as porções Y são mais curtas (por exemplo, não mais de 13, 11 ou 10 aminoácidos), selecionadas entre uma faixa de extensão diferente (por exemplo, 5 a 12 aminoácidos, ou 5 a 10 aminoácidos) ou são selecionadas mais rigorosamente (por exemplo, ausência de resíduos específicos como P, R, K, D, E, por exemplo, mais de 60% hidrofóbicos, ...) do que é o caso para modalidades onde n é no mínimo dois.
[00443] Moléculas particularmente previstas são aquelas com a seguinte estrutura: X1-Y1-X2-Z1 (isto é, n é 1), em que X1 e X2 são no total não mais de 5 aminoácidos; Y1 é um trecho de entre 4 e 10 aminoáci- dos e Z1 é um trecho de 0 unidades; e X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (isto é, n é 2), em que Z1 é um ligante e Z2 é nada.
[00444] Combinações particulares de limitações que são previstas para modalidades onde n=1 incluem:
[00445] X1 e X2 são iguais um ao outro e são 1 ou 2 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;e
[00446] Y1 é um trecho de 6 a 10 aminoácidos contíguos no mínimo 3 dos quais são hidrofóbicos, no qual nenhum resíduo P, R, K, D, E ou H está presente, no qual a soma total de C, M, N, Q, e W resíduos é não mais de 1, dos quais menos de 60% são aminoácidos pequenos diferentes de V (isto é, selecionados entre A, C, G, S, P, N, T, D), no qual não mais de 2 aminoácidos idênticos consecutivos estão presentes, no qual nenhum resíduo não alifático está presente mais de duas vezes, e no qual o primeiro e último resíduo são alifáticos ou selecionados entre F, Y, W, A, M e T.
[00447] Outra combinação particular onde n = 1 é
[00448] X1 e X2 são 1 ou 2 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;e
[00449] Y1 é um trecho de 6 a 11 aminoácidos contíguos, no mínimo 75% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, no qual no mínimo 50% dos aminoácidos são resíduos alifáticos ou F, no qual nenhum resíduo P, R, K, D, E ou H está presente, no qual não mais de um resíduo C, M, N, Q, W, G, S, A ou T está presente, no qual não mais de 3 resíduos Y ou F estão presentes, no qual náo há dois resíduos não alifáticos idênticos contíguos presentes (isto é, náo há 2 resíduos Y ou F contíguos presentes, ou somente I, L e V podem ser resíduos idênticos contíguos) e não mais de 2 resíduos alifáticos idênticos contíguos estão presentes, no qual não estão presentes dois resíduos polares não aromáticos consecutivos (isto é, selecionados entre S, N, T e Q), em que não mais de 50% de resíduos idênticos estão presentes, em que o 1°· e/ou último resíduo é um resíduo alifático ou F, em que a soma de resíduos A e G é não mais de 2, em que a percentagem total de resíduos A, G e S é não mais de 25%, em que a percentagem total de resíduos C, M, N, Q e W é não mais de 25%, e em que a percentagem total de resíduos pequenos diferentes de V (isto é, selecionados entre A, C, G, S, N, T) é não mais de 25%.
[00450] De acordo com algumas modalidades particulares, Z1 não está presente (isto é, Z1 é zero unidades). De acordo com outras modalidades, Z1 também está presente, e pode ser N- ou C-terminal.
[00451] Digno de nota, embora estas combinações sejam particularmente previstas e na verdade descrevam um espaço de sequência de compostos de bom funcionamento, estas limitações são essencialmente pretendidas para assegurar que não existe nenhuma sobreposição entre os compostos presentemente reivindicados e o que está descrito na arte anterior. Pode muito bem ser que estas limitações sejam rigorosas demais, ou que algumas sejam rigorosas demais e outras não sejam suficientemente rigorosas. Portanto, é previsto que qualquer um único destes critérios pode ser variado de acordo com os limites descritos acima para as porções individuais, e/ou que alguns dos critérios podem ser omitidos ou substituídos com outras limitações, e/ou que outras limitações podem ser acrescentadas.
Outras porções
[00452] A molécula pode compreender adicionalmente (ou pode ser adicionalmente fundida a) outras porções. Para todas as porções, a natureza da fusão ou do ligante não é vital para a invenção, contanto que a porção e a molécula agregadora possa exercer sua função específica. De acordo com modalidades particulares, as porções as quais são fundidas às moléculas podem ser clivadas (por exemplo, usando uma porção de ligante que tem um sítio de reconhecimento de protease). Deste modo, a função da porção e a molécula podem ser separadas, o que pode ser particularmente interessante para porções maiores, ou para modalidades onde a porção não é mais necessária depois de um ponto no tempo específico (por exemplo, uma etiqueta que é clivada depois de uma etapa de separação usando a etiqueta).
[00453] É particularmente previsto que a molécula compreende adicionalmente uma etiqueta detectável. A etiqueta detectável pode ser N- ou C-terminalmente ou mesmo internamente fundida à molécula (por exemplo, através do ligante, ou o ligante pode ser usado como a etiqueta detectável). Alternativamente, a etiqueta detectável pdoe ser referir à uso de um ou mais aminoácidos marcados em uma ou mais das porções X-Y-Z da molécula (por exemplo, aminoácidos marcados com fluorescente ou radioativamente).
[00454] Notar que, para modalidades onde Zn está presente, a etiqueta detectável pode ser fundida à porção do ligante de Zn. (Embora esta notação venha a acarretar que a etiqueta é adicionado ao C-término, também são previstas etiquetas N-terminais - isto corresponde à notação equivalente de (Zi-X2i-1-Yi-X2i)n, em que cada Z2 a Zn é um ligante, e Z1 é o ligante ao qual a etiqueta é fundida).
[00455] No entanto, como a natureza do ligante ao qual a etiqueta detectável é fundida pode diferir significativamente da natureza do ligante usado na molécula, particularmente com respeito a restrições de extensão, pode ser preferencial se referir a moléculas marcadas deste modo como moléculas onde a porção de Zn está ausente, e onde uma etiqueta detectável é fundida à molécula usando um ligante separado. Na verdade, os ligantes usados para adicionar a etiqueta às moléculas podem ser tanto longos quanto flexíveis. No entanto, o modo real no qual a etiqueta detectável é afixada às moléculas não é vital para a invenção e tipicamente dependerá da natureza da etiqueta usada e/ou da finalidade da marcação (a qual pode determinar a proximidade requerida). Notar que a princípio pode ser usada qualquer etiqueta co- nhecida para moléculas de natureza proteinácea, contanto que a etiqueta possa ser detectada. Etiquetas particularmente previstas incluem, mas não estão limitadas a, tags, etiquetas fluorescentes, substratos enzimáticos, enzimas, pontos quânticos, nanopartículas as quais podem ser (para)magnéticas, radiomarcadores, etiquetas óticas e semelhantes.
[00456] Como com outras porções, uma vez que as moléculas têm duas extremidades, é previsto que as moléculas serão fundidas a outra porção (por exemplo, uma etiqueta) em amboos os seus N- e C-términos. Estas duas etiquetas podem ser idênticas (produzindo um sinal mais forte) ou diferentes (for diferentes detecção purposes). Porções tais como etiquetas podem ser fundidas através de ligantes de Z0 e/ou Zn, ou através de ligantes mais longos.
[00457] De acordo com modalidades particulares, a etiqueta detectável não é GFP ou biotina. De acordo com outras modalidades particulares, biotina ou GFP pode ser a etiqueta detectável.
[00458] De acordo com outras modalidades particulares, as moléculas podem ser fundidas a outras porções, por exemplo, para prolongar sua meia-vida in vivo. Além de aumentar a estabilidade, as porções referidas também podem aumentar a solubilidade da molécula a que são fundidas. Embora a presença de gatekeepers (as porções X numeradas) seja a princípio suficiente para prevenir agregação prematura das moléculas e as manter em solução, a adição adicional de uma porção que aumenta a solubilidade (isto é, previne agregação) pode proporcionar manipulação mais fácil das moléculas, e particularmente aumentar a estabilidade e a vida de prateleira. Um exemplo de conhecimento geral de semelhante porção é PEG (polietileno glicol). Esta porção é particularmente prevista, uma vez que pode ser usada como ligante bem como porção de solubilização. Outros exemplos incluem peptídeos e proteínas ou domínios de proteína, ou mesmo proteínas inteiras (por exemplo, GFP). A este respeito, deve ser observado que, como PEG, uma porção pode ter diferentes funções ou efeitos. Por exemplo, uma etiqueta flag (sequência DYKDDDDK (SEQ ID NO: 106)) é uma porção peptídica que pode ser usada como uma etiqueta, mas devido a sua densidade de carga, também vai aumentar a solubilização. Foi demonstrado frequentemente que PEGuilação aumenta a solubilidade de biofármacos (por exemplo, Veronese and Mero, BioDrugs. 2008; 22(5):315-29). A adição de uma etiqueta de peptídeo, polipeptídeo, proteína ou domínio de proteína a uma molécula de interesse tem sido extensivamente descrita na arte. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, peptídeos derivados a partir de sinucleína (por exemplo, Park et al., Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17:251-260), SET (etiqueta de reforço da solubilidade, Zhang et al., Protein Expr Purif 2004; 36:207-216), thioredoxin (TRX), Glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação de maltose (MBP), substância de Uso de N (NusA), pequeno modificador semelhante a ubiquitina (SUMO), ubiquitina (Ub), ligação de dissulfeto C (DsbC), proteína de dezessete kilo-daltons (Skp), fragmento de proteína quinase Fago T7 (T7PK), domínio de Proteína G B1, domínio de repetição de Proteína A IgG ZZ, e domínios de ligação de imunoglobulina bacteriana (Hutt et al., J Biol Chem.;287(7):4462-9, 2012). A natureza da etiqueta vai depender da aplicação, conforme pode ser determinado pela pessoa versada. Por exemplo, para expressão das moléculas transgênicas descritas aqui, neste pedido de patente, pode ser previsto fundir as moléculas a um domínio maior para prevenir degradação prematura pelo mecanismo celular. Outras aplicações podem visar fusão a uma etiqueta de solubilização menor (por exemplo, menos de 30 aminoácidos, ou menos de 20 aminoácidos, ou mesmo menos de 10 aminoácidos) de modo a não alterar demais as propriedades das moléculas.
[00459] Além de prolongar a meia-vida, as moléculas podem ser fundidas a porções que alteram outras propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas ou propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmi-cas adicionais. Por exemplo, é sabido que fusão com albumina (por exemplo, albumina sérica humana), domínio de ligação de albumina ou um peptídeo de ligação de albumina sintético aumenta a farmacocinética e a farmacodinâmica de diferentes proteínas terapêuticas (Lange-nheim and Chen, Endocrinol.; 203(3):375-87, 2009). Outra porção que é frequentemente usada é uma região cristalizável de fragmento (Fc) de um anticorpo. A natureza destas porções não é para a invenção e pode ser determinada pela pessoa versada na arte dependendo da aplicação.
[00460] De acordo com modalidades particulares, as moléculas não são fundidas a uma conta de agarose, uma conta de latex, uma conta de celulose, uma conta magnética, uma conta de sílica, uma conta de poliacrilamida, uma microsfera, uma conta de vidro ou qualquer suporte sólido (por exemplo, poliestireno, plástico, membrana de nitrocelulose, vidro), ou a proteína NusA. (Notar no entanto, que estar fusões são possíveis, e em modalidades específicas, também são previstas).
[00461] Outras porções as quais também são previstas em combinação com as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, são porções de direcionamento. Por exemplo, as moléculas podem ser fundidas a, por exemplo, um anticorpo, um peptídeo ou uma molécula pequena com uma especificidade para um dado-alvo, e a molécula iniciaa agregação no sítio do-alvo (neste caso, a uma ou mais regiões Yi terão uma sequência idêntica a uma sequência presente na mesma proteína-alvo ou em uma proteína-alvo diferente, ou a sequência será uma sequência com alta propensão a agregação). Isto é similar à estratégia a qual é esboçada no pedido de patente internacional No. WO2008148751. Uma lista extensiva de possíveis porções-alvo (também designada como ‘regiões de ligação’ ou ‘domínios de ligação’ no pedido de patente internacional No. WO2008148751) as quais podem ser combinadas com as moléculas da invenção é descrita no pedido de patente internacional No. WO2008148751 à página 3 (iniciando à linha 26) e à página 4 (terminando à linha 34): o termo 'região de ligação' ou 'domínio de ligação' tipicamente se refere a uma molécula que interage com a proteína-alvo. Em determinados casos um domínio de ligação é um composto químico (por exemplo, um composto pequeno com uma afinidade por no mínimo uma proteína-alvo) e em determinados outros casos um domínio de ligação é um polipeptídeo, em determinados outros casos um domínio de ligação é um domínio de proteína. Um um domínio de ligação de proteína é um elemento da estrutura de proteína global que é auto-estabilizante e frequentemente dobra de modo independente do resto da cadeia de proteína. Os domínios de ligação variam em extensão a partir de entre cerca de 25 aminoácidos até 500 aminoácidos e mais. Muitos domínios de ligação podem ser classificados em dobras e são estruturas tridimensionais reconhecíveis e identificáveis. Algumas dobras são tão comuns em muitas proteínas diferentes que recebem nomes especiais. Exemplos não limitantes são dobras de Rossman, barris TIM, repetições de tatu (armadillo repeats), zíperes de leucina, domínios de caderina, domínios efetores de morte, domínios semelhantes a imunoglobulina, domínio de ligação de fosfoti-rosina, domínio de homologia com pleckstrina, domínio 2 de homologia com src, o domínio BRCT de BRCA1 , domínios de ligação da proteína G, o domínio de homologia com Eps 15 (EH) e o domínio de ligação de proteína de p53. Anticorpos são o protótipo natural de proteínas de ligação especificamente com especificidade mediada através de regiões de loop hipervariáveis, as chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR). Embora em geral, andaimes (scaffolds) semelhantes a anticorpos tenham se comprovado como funcionando bem como ligantes específicos, se tornou evidente que não é compulsório se ater estritamente ao paradigma de um andaime rígido que apresenta loops semelhantes a CDR. Além de anticorpos, muitas outras proteínas naturais mediam interações entre domínios específicas de alta afinidade. Alternativas a imunoglobulinas têm proporcionado pontos de partida atraentes para o esquema de novas moléculas de ligação (reconhecimento). O termo andaime (scaffold), conforme usado nesta invenção, se refere a uma estrutura de proteína que pode carregar aminoácidos alterados ou inserções de sequência que conferem ligação a proteínas-alvo específicas. A manipulação de andaimes e a concepção de bibliotecas são processos mutuamente interdependentes. De modo a obter ligantes específicos, tem de ser gerada uma biblioteca combinatorial do andaime. Isto geralmente é feito no nível de DNA por randomização dos codons em posições de aminoácidos apropriadas, usando ou codons degenerados ou trinucleotídeos. Uma ampla gama de andaimes não imunoglobulina diferentes com origens e características amplamente diverse são usados atualmente para display de biblioteca combinatorial. Alguns destes são comparáveis em tamanho a um scFv de um anticorpo (cerca de 30 kDa), ao passo que a maioria destes são muito menores. Andaimes modulares à base de de proteínas de repetição variam de tamanho dependendo do número de unidades repetitivas. Uma lista não limitante de exemplos compreende ligantes à base do 10°. domínio de fibronectina humana tipo III, ligantes à base de lipocalinas, ligantes à base de domínios SH3, ligantes à base de membros da família da knottina, ligantes à base de CTLA-4, receptores de células T, neocarzinostatina, módulo de ligação de carboidrato 4-2, tendamistat, inibidores do domínio kunitz, domínios PDZ, domínio de homologia com Src (SH2), toxinas de escorpião, de-fensina A de inseto, proteínas de dedo de homeodomínio de plantas, enzima bacteriana TEM- 1 beta-lactamase, domínio de ligação de Ig da proteína A de Staphylococcus aureus, proteína de imunidade colici-na E7 de E. coli, citocromo b562 de E. coli, domínios de repetição de anquirina. Além disso são incluídos como domínios de ligação compostos com uma especificidade para uma determinada proteína-alvo, ligantes de peptídeos cíclicos e lineares, aptâmeros de peptídeos, proteínas multivalentes avimer ou drogas imunofarmacêuticas modulares pequenas, ligantes com uma especificidade para um receptor ou um co-receptor, parceiros de ligação de proteína identificados em uma análise de dois híbridos, domínios de ligação à base da especificidade da interação de alta afinidade entre biotina-avidina, domínios de ligação à base da especificidade de proteínas de ligação ciclofilina-FK506. Além disso são incluídas lectinas com uma afinidade por uma estrutura de carboidrato específica.
[00462] Digno de nota, para as modalidades onde as moléculas são fundidas a uma porção de direcionamento, é especificamente previsto que no mínimo uma, porém até cada porção Yi é uma sequência sintética, mais particularmente uma sequência que não está presente em uma proteína do organismo ao qual a molécula é administrada. Na verdade, em semelhantes casos, pode ser previsto nuclear a agregação in situ (depois de atingir a proteína-alvo) pela agregação nucleada da moléculas de interferon fundidas à porção de direcionamento.
[00463] Notar no entanto que as porções de direcionamento não são necessárias, uma vez que as próprias moléculas são capazes de encontrar seu-alvo através de reconhecimento de sequência específica. Portanto, de acordo com modalidades alternativas, as moléculas podem ser usadas de modo eficaz como porção de direcionamento e ser adicionalmente fundidas a outras porções tais como fármacos, toxinas ou moléculas pequenas. Por direcionamento das moléculas para proteínas específicas (por exemplo, proteínas que ocorrem somente em um tipo de célula em particular ou em um compartimento celular em particular), estes compostos podem ser direcionados para o tipo de célula / compartimento celular específico. Portanto, por exemplo, toxi- nas podem ser liberadas seletivamente para células cancerosas, ou fármacos podem ser liberados no citoplasma.
[00464] De acordo com ainda outras modalidades, as moléculas podem compreender adicionalmente uma sequência a qual media a penetração na célula (ou translocação celular), isto é, as moléculas são adicionalmente modificadas através da fixação recombinante ou sintética de uma sequência de penetração celular. A molécula de interferon (por exemplo, como um polipeptídeo) pode ser adicionalmente fundida ou quimicamente acoplada a uma sequência facilitando a transdução da fusão ou proteínas acopladas quimicamente dentro de células procarióticas ou eucarióticas. Sequências de peptídeos penetrantes celulares (CPP) ou domínio de transdução de proteína (PTD) são de conhecimento geral na arte e incluem, mas não estão limitadas à proteína TAT do HIV, uma sequência de poliarginina, penetratina e pep-1. Ainda outros peptídeos permeáveis celulares comumente usados (tanto peptídeos naturais quanto artificiais) são revelados por exemplo, em Sawant and Torchilin, Mol Biosyst. 6(4):628-40, 2010; Noguchi et al., Cell Transplant. 19(6):649-54, 2010 e em Lindgren and Langel, Methods Mol Biol. 683:3-19, 2011.
[00465] Típica para CPP é sua carga, portanto é possível que algumas moléculas carregadas descritas aqui, neste pedido de patente, não necessitem de um CPP para penetrar em uma célula. Na verdade, conforme será mostrado nos exemplos, é possível ter por alvo peptídeos de sinal ou regiões intracelulares, as quais requerem que as moléculas sejam tomadas pela célula, e isto acontece sem fusão a um CPP.
[00466] Nestes casos onde outras porções são fundidas às moléculas, é previsto em modalidades particulares que estas porções podem ser removidas da molécula. Tipicamente, isto será feito através de incorporação de um sítio de clivagem de protease específico ou uma abordagem equivalente. Este é particularmente o caso em que a porção é uma proteína grande: em semelhantes casos, a porção pode ser clivada antes de usar a molécula em qualquer um dos métodos descritos aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, durante purificação das moléculas). O sítio de clivagem pode ser incorporado separadamente ou pode ser uma parte integral do ligante de Zn externo (ou ligante de Z1 externo se a porção for N-terminal). De acordo com modalidades muito específicas, a porção pode ser parte de um ligante de Zi interno, ou pode mesmo ser o ligante de Zi inteiro. A título de exemplo, uma molécula com n=2 pode ter a seguinte estrutura: X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4, em que Z1 (em parte ou no todo) é uma sequência de hexahisti-dina: esta é então tanto o ligante quanto a sequência de detecção. Embora seja possível, nestes casos normalmente nenhum sítio de clivagem será construído, uma vez que isto levaria a clivagem da própria molécula. Notar que de acordo com as modalidades em que a porção adicional é fundida internamente, somente sequências não proteiná-ceas (por exemplo, PEG) ou sequências de peptídeo com limitado extensão (menos de 30, 20 ou 10 aminoácidos, cf. acima) são previstas como porções de solubilização. De modo diverso, o domínio de proteína pode interferir com a indução de agregação.
[00467] De acordo com modalidades específicas, a extensão total das moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, não excede 50 aminoácidos. Mais particularmente, a extensão não excede 40 aminoácidos, 30 aminoácidos, 25 aminoácidos ou mesmo 20 aminoácidos. . De acordo com modalidades adicionais específicas onde as moléculas são fundidas a porções adicionais, a limitação da extensão somente se aplica à parte (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n da molécula total (e portanto não se aplica, por exemplo, à etiqueta). Portanto, se um sítio de clivagem tiver sido construído na molécula, a limitação da extensão tipicamente se aplica à extensão depois de clivagem.
[00468] Para moléculas que são completamente proteináceas, é previsto que podem ser proporcionadas como ácidos nucleicos, por exemplo, como um vetor recombinante incluindo uma sequência codificando no mínimo uma molécula descrito aqui, neste pedido de patente.
Aplicações particulares das moléculas
[00469] De acordo com um aspecto adicional, as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, podem ser usadas para hiporregu-lação ou inibição da função de uma proteína. Tipicamente, isto é obtido induzindo agregação daquela proteína. De acordo com estas modalidades, são proporcionados métodos para hiporregulação da função de uma proteína compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00470] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00471] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K e P;
[00472] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína; e
[00473] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00474] O mais particularmente, em modalidades em que n é 1, Yi será um trecho de 4 a 11 aminoácidos contíguos.De acordo com estas modalidades, Z1 pode ser nada (isto é, um trecho de 0 unidades). De acordo com modalidades alternativas, Z1 é um ligante diferentes de um ligante de aminoácidos. De acordo com ainda outras modalidades alternativas, Z1 pode ser qualquer ligante previsto aqui, neste pedido de patente, (isto é, não se aplicam limitações adicionais a Z1).
[00475] Para as moléculas, aplicam-se as mesmas considerações e limitações que acima. Particularmente, deve ser observado que, contanto que seja obtira hiporregulação da função, podem ser toleradas uma ou duas substituições no Yi que ocorre na proteína, conforme descrito anteriormente. Tipicamente, no entanto, Yi será idêntico.
[00476] As moléculas podem ser usadas através de uma ampla série de campos, incluindo biotecnologia branca (ou biotecnologia industrial), biotecnologia vermelha ou médica, biotecnologia verde ou agrícola, biotecnologia azul (ou aquática). Podem ser usadas para inibir proteínas, bem como para detectar proteínas, e isto em todos estes campos. Conforme será visto, aplicações nas quais as moléculas são administradas a um sujeito apresentam significativas similaridades através dos campos, isto é, tanto em aplicações médicas (sujeitos animais) quanto em aplicações agrícolas (sujeitos vegetais), pode ser feita uma subdivisão em aplicações infecciosas e não infecciosas.
Aplicações médicas para interferons
[00477] Existem dois grandes campos de aplicações médicas para as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, a saber doença infecciosa e doença não infecciosa. A grande diferença entre as aplicações é que, em situações de doenças infecciosas, a molécula de interferon tipicamente terá por alvo no mínimo uma proteína do um ou mais patógenos que estão provocando a infecção, enquanto é normalmente administrada a um sujeito cujo proteoma não é visado (isto é, o trecho Yi corresponde a um no proteoma de um patógeno, mas não ocorre no proteoma do sujeito com a infecção). No entanto também é previsto direcionamento direto do patógeno (por exemplo, ao tratar infecções com ectoparasitas).
[00478] Em distúrbios não infecciosos, a molécula de interferon tipicamente terá por alvo no mínimo uma proteína presente no sujeito ao qual o interferon é administrado.
[00479] A mesma consideração (administração a um organismo e presença no proteoma do trecho Yi no referido organismo) de doença não infecciosa e infecciosa se aplica para aplicação de interferons em plantas, mas estas tipicamente não são consideradas como aplicações médicas. Portanto, apesar de métodos similares poderem ser praticados sobre as plantas (vide posteriormente), os métodos descritos nesta seção são considerados métodos médicos uma vez que tipicamente envolvem um sujeito animal ao invés de um sujeito vegetal.
[00480] De acordo com modalidades adicionais particulares, estes métodos são proporcionados para hiporregulação de uma proteína em uma situação de doença, ou para fazer um diagnóstico. Isto é equivalente a dizer que, nestas modalidades, é proporcionada uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00481] - n é 1 a 5 e i aumenta de 1 a n com cada repetição;
[00482] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00483] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F esti- ver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína; e
[00484] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00485] em que se n for 1, Y1 é um trecho de 4 a 11 aminoácidos contíguos (e de acordo com modalidades adicionais particulares, Z1 não é um ligante de aminoácidos);
[00486] para uso como um medicamento ou diagnóstico.
[00487] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os métodos e usos são frequentemente intercambiáveis, isto é, uma molécula para uso como um medicamento, ou uma molécula para uso no tratamento de uma doença específica é equivalente a um método para tratar a doença compreendendo a uso de (por exemplo, contato com) a molécula.
[00488] De acordo com modalidades particulares, se a molécula for usada como medicamento ou diagnóstico, é previsto que são usadas como moléculas exógenas que são administradas, e não como um transgene. Isto também se aplica para moléculas não usadas como medicamento. De acordo com modalidades alternativas, as moléculas podem ser administradas como um transgene bem como como uma molécula exógena.
[00489] Se as moléculas são administradas como transgenes (isto é, como ácidos nucleicos codificando as moléculas), é desnecessário dizer que as moléculas de interferon de acordo com estas modalidades são intireiramente de natureza polipeptídica, uma vez que precisam ser capazes de serem codificadas. Isto é, todas as porções X, Y e Z numeradas presentes nas moléculas de interferon são de natureza polipeptídica. Aplicações médicas nas quais é prevista liberação de transgênicos incluem, mas não estão limitadas a, métodos de terapia genética (por exemplo, usando lentivírus) ou aplicações de células-tronco.
[00490] Portanto, de acordo com estas modalidades, é proporcionada uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma molécula tendo a seguinte estrutura:
[00491] (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00492] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00493] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00494] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00495] É particularmente previsto que as sequências de ácidos nucleicos codificam as moléculas com todas as limitações e variações descritas aqui, neste pedido de patente, mutatis mutandis. Portanto, o polipeptídeo codificado é em essência conforme descrito aqui, neste pedido de patente, isto é, as variações mencionadas para as moléculas de interferon que são compatíveis com este aspecto também são previstas como variações para os polipeptídeos codificados pelas sequên- cias de ácidos nucleicos. A título de exemplo, modalidades especificando a sequência ou a extensão das porções X ou Y são compatíveis com serem codificadas em ácidos nucleicos, ao passo que modalidades em que a porção Z é de uma natureza não aminoácido não são.
[00496] De acordo com modalidades específicas, a sequência de polipeptídeo codificada é um polipeptídeo que não ocorre naturalmente. De acordo com modalidades adicionais particulares, a sequência de ácido nucleico é um gene artificial. Uma vez que o aspecto de ácido nucleico é o mais particularmente adequado em aplicações fazendo uso de expressão transgênica, modalidades particularmente previstas são aquelas em que a sequência de ácido nucleico (ou o gene artificial) é fundida a outra porção, particularmente uma porção que aumenta a solubilidade e/ou a estabilidade do produto genético. Na verdade, a expressão transgênica de peptídeos algumas vezes pode ser difícil devido a rápida degradação do produto.
[00497] Deve ser observado que todos os métodos e as usos envolvendo as moléculas do pedido portanto também englobam métodos e usos onde as moléculas são proporcionadas como a sequência de ácido nucleico codificando as mesmas, e as moléculas são expressadas a partir da sequência de ácido nucleico.
[00498] Além disso são proporcionados a este respeito vetores recombinantes compreendendo uma tal sequência de ácidos nucleicos codificando uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Estes vetores recombinantes são idealmente adequados como um veículo para carregar a sequência de ácido nucleico de interesse dentro de uma célula onde a proteína a ser hiporregulada é expressada, e conduzir a expressão do ácido nucleico na referida célula. O vetor recombinante pode persistir como uma entidade separada na célula (por exemplo, como um plasmídeo), ou pode ser integrado dentro do genoma da célula. Vetores recombinantes incluem, entre outros, veto- res de plasmídeos, vetores binários, vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de vai-vem (shuttle) e vetores virais. Portanto, também são englobados aqui, neste pedido de patente, métodos e usos onde as moléculas são proporcionadas como vetores recombinantes com uma sequência de ácidos nucleicos codificando as moléculas, e as moléculas são expressadas a partir da sequência de ácido nucleico proporcionada no vetor recombinante.
[00499] Por conseguinte, são proporcionadas células aqui, neste pedido de patente, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente, ou compreendendo um vetor recombinante que contém uma sequência de ácidos nucleicos codificando a molécula de interferon referida. A célula pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. No último caso, pode ser uma célula de levedura, de algas, de planta ou de animal (por exemplo, célula de inseto, de mamífero ou humana). Portanto, também são englobados aqui, neste pedido de patente, métodos e usos onde as moléculas são proporcionadas como células com uma sequência de ácidos nucleicos codificando as moléculas, e as moléculas são expressadas a partir da sequência de ácido nucleico proporcionada nas células. Este pode ser o caso, por exemplo, em terapia de células-tronco.
[00500] Notar que a abordagem transgênica não é limitada a aplicações médicas. De acordo com modalidades muito particulares, a provisão de moléculas de interferon codificadas em ácido nucleico ao invés de diretamente como polipeptídeos é particularmente adequada para uso em plantas, conforme será discutido abaixo.
[00501] Por conseguinte, são proporcionadas plantas, ou células de plantas, ou sementes de plantas, aqui, neste pedido de patente, que contêm uma sequência de ácidos nucleicos, gene artificial ou um vetor recombinante conforme descrito aqui, neste pedido de patente.
[00502] Em modalidades específicas a invenção proporciona um método para a produção ou fabricação de um medicamento ou de uma composição farmacêutica compreendendo no mínimo uma molécula de interferon e além disso misturando a no mínimo uma molécula de interferon referida com um veículo farmaceuticamente aceitável. Isto é, o interferon é proporcionado para uso como um medicamento, ou são proporcionadas composições farmacêuticas contendo interferons.
[00503] Em uma modalidade preferencial a molécula de interferon é um polipeptídeo (o que significa que todas as porções de ligante, Zi, presentes são de natureza polipeptídica) e podem ser produzidas por síntese químíca ou alternativamente como uma proteína recombinante. (Notar que as caractgerísticas das moléculas de interferon para uso médica também são previstas para uso não médica, onde aplicável).
[00504] Um "Polipeptídeo" se refere a um polímero no qual os monômeros são aminoácidos e são unidos juntos através de ligações de amida, referido alternativamente como um peptídeo. Quando os aminoácidos são alfa-aminoácidos, pode ser usado ou o isômero ótico Lou o isômero ótico D-. Adicionalmente, também são incluídos aminoácidos não naturais, por exemplo, beta-alanina, fenilglicina e homoargi-nina. Aminoácidos comumente encontrados que não são codificados geneticamente também podem ser usados na presente invenção. Todos ou parte dos aminoácidos usados nos interferons podem ser ou o isômero D- ou L-. Além disso, outros peptidomiméticos também são úteis na presente invenção. especificamente refere-se e incorpora-se aqui, neste pedido de patente, a revisão do desenvolvimento e uso de peptidomiméticos como antagonistas para interações proteína-proteína de Sillerud LO e Larson RS (2005) Curr Protein Pept Sci. 6(2):151-69. Além disso, D-aminoácidos podem ser adicionados à sequência de peptídeo para estabilizar características de rotação (especialmente no caso de glicina). Em outra abordagem simuladores de rotação alfa, beta, gama ou delta (tais como alfa, beta, gama, ou delta di-peptídeos) podem ser empregados para simular motivos estruturais e características de rotação em um peptídeo e simultaneamente proporcionar estabilidade de proteólise e reforçar outras propriedades tais como, por exemplo, estabilidade conformacional e solubilidade.
[00505] Um interferon recombinante pode ser fabricado usando sistemas de expressão adequados compreendendo células bacterianas, células de levedura, células de animais, células de inseto, células de plantas ou animais ou plantas transgênicas. O interferon recombinante pode ser purificado por qualquer procedimento de purificação de proteína ou peptídeo convencional próximo à homogeneidade e/ou ser misturado com aditivos. Em ainda outra modalidade o referido interferon é um polipeptídeo quimicamente modificado. Síntese química permite a conjugação de outras moléculas pequenas ou incorporação de aminoácidos não naturais por design. Em uma modalidade particular a conjugação de moléculas pequenas a um peptídeo interferon pode levar a uma aplicação potencial destas moléculas na área de crescimento de agentes citotóxicos visados para terapia anti-tumoral. A incorporação de aminoácidos não naturais no peptídeo abre a possibilidade de maior diversidade química, de modo análogo a abordagens de química medicinal de molécula pequena para desenvolvimento de reconhecimento molecular de alta afinidade e de alta especificidade. Aminoácidos não naturais também podem prevenis rápida degradação do peptídeo interferon tornando o peptídeo irreconhecível para proteases (por exemplo, soro ou estômago). Em ainda outra modalidade as moléculas de interferon da invenção compreendem aminoácidos modificados tais como um D-aminoácido ou um aminoácido quimicamente modificado. Em ainda outra modalidade o referido interferon consiste em uma mistura de aminoácidos naturais e aminoácidos não naturais. Em ainda outra modalidade a meia-vida de um peptídeo pode ser prolongada por modificações tais como glicosilação (Haubner R. et al (2001) J. Nucl. Med. 42, 326-336), conjugação com polietileno glicol (PEGuilação, vide Kim TH et al (2002) Biomaterials 23, 2311-2317), ou manipulação do peptídeo para associar com albumina sérica (vide Koehler MF et al (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 2883-2886). A administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de interferon pode ser por meio de administração oral, inalada, transdérmica ou parenteral (incluindo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, in-tracavitária, intratecal, e subcutânea). Exemplos particularmente preferenciais de métodos de liberação para interferons são um emplastro transdérmico (Henry S et al (1998) J. Pharm. Sci. 87, 922-925), ionto-forese (Suzuki Y et al (2002) J. Pharm. Sci. 91, 350-361), sonophore-sis (Boucaud A et al (2002) J. Control. Release 81, 113-119), aerossóis (Duddu SP et al (2002) Pharm. Res. 19, 689-695), transfersomas ou lipossomas (Guo J et al (2000) Drug Deliv. 7,113-116). O interferon pode ser administrado isolado ou preferencialmente formulado como uma composição farmacêutica. (Isto significa que são proporcionados métodos compreendendo a administração do interferon isolado, ou formulado como composição farmacêutica).
[00506] É preferencial que o interferon ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo seja administrado sob a forma de uma composição de unidade de dose, tal como uma composição de unidade de dose oral, parenteral, transdérmica ou inalada. As composições referidas são preparadas por mistura e são convenientemente adaptadas para administração oral, inalada, transdérmica ou parenteral, e como tais podem estar sob a forma de comprimidos, cápsulas, preparações líquidas orais, pós, grânulos, pastilhas, pós reconstituíveis, soluções ou suspensões injetáveis e para infusão ou supositórios ou aerossóis.
[00507] Uma vez que as moléculas são proporcionadas para uso como um medicamento ou diagnóstico, ou em métodos de tratamento ou diagnóstico, também é previsto que podem ser proporcionadas como fármacos. Por conseguinte, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo as moléculas conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Particularmente, as composições farmacêuticas compreendem no mínimo uma molécula tendo a seguinte estrutura:
[00508] (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00509] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00510] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00511] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00512] e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00513] Mais particularmente, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo no mínimo uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00514] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00515] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; em que no mínimo um Yi é um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína; e
[00516] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00517] e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00518] Em modalidades em que n é 1, Y1 tipicamente será um trecho de 4 a 11 aminoácidos contíguos e Z1 não é um ligante de aminoácidos (ou pode mesmo ser nada).
[00519] O mais particularmente, nas composições farmacêuticas, no mínimo um Yi das moléculas está presente em uma proteína a ser hiporregulada no sujeito ao qual a composição será administrada. Notar que isto não implica que esta proteína é codificada no genoma daquele sujeito. Na verdade, para sujeitos sofrendo de infecção, é previsto que moléculas são administradas para as proteínas-alvo do infeccioso organismo e não do próprio sujeito. (Novamente, notar que considerações similares se aplicam para composições a serem administradas a sujeitos vegetais, isto é, composições agroquímicas. Estas podem ter por alvo ou proteínas de plantas, ou proteínas de organismos infecciosos).
[00520] Esta invenção também se refere a composições farmacêuticas contendo um ou mais interferons da presente invenção. Estas composições podem ser utilizadas para atingir o efeito farmacológico desejado por administração a um paciente que necessite do mesmo. Um paciente, para os fins desta invenção, é um mamífero, incluindo um humano, que necessite de tratamento para a condição ou doença em particular. Portanto, a presente invenção inclui composições farmacêuticas que são compostas de um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um interferon, ou sal do mesmo, da presente invenção. Um veículo farmaceuticamente aceitável é preferencialmente um veículo que é relativamente não tóxico e inócuo para um paciente em concentrações consistentes com atividade eficaz do ingrediente ativo de modo que quaisquer efeitos colaterais atribuíveis ao veículo não viciam os efeitos benéficos do ingrediente ativo. Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de interferon é preferencialmente a quantidade a qual produz um resultado ou exerce uma influência sobre a condição em particular sendo tratada. Os interferons da presente invenção podem ser administrados com veículos farmaceuticamente aceitáveis de conhecimento geral na arte usando quaisquer formas de unidade de dosagem convencionais eficazes, incluindo preparações de liberação imediata, lenta e gradual, por via oral, por via parenteral, topicamente, por via nasal, por via oftálmica, por via ótica, por via sublingual, por via retal, por via vaginal, e semelhantes.
[00521] Para administração oral, os interferons podem ser formulados em preparações sólidas ou líquidas tais como cápsulas, pílulas, comprimidos, trociscos, pastilhas, fusões, pós, soluções, suspensões, ou emulsões, e podem ser preparados de acordo com métodos de conhecimento na arte para a fabricação de composições farmacêuticas. As formas de unidade de dosagem sólida podem ser uma cápsula que pode ser do tipo de gelatina comum de concha dura ou de concha mole contendo, por exemplo, tensoativos, lubrificantes, e enchimentos inertes tais como lactose, sacarose, fosfato de cálcio, e amido de milho.
[00522] Em outra modalidade, os interferons desta invenção podem ser modelados em tabletes com bases de comprimidos convencionais tais como lactose, sacarose e amido de milho em combinação com ligantes tais como goma acácia, amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes pretendidos para ajudar a decomposição e a dissolução do comprimido depois de administração tais como fécula de batata, ácido algínico, amido de milho, e goma guar, goma tragacanto, goma acácia, lubrificantes pretendidos para aumentar o fluxo de granulação do comprimido e para prevenir a adesão do material do comprimido às superfícies dos moldes e punches dos comprimidos, por exemplo, talco, ácido esteárico, ou estearato de magnésio, de cálcio ou de zinco, corantes, agentes colorante, e agentes aromatizantes tais como hortelã-pimenta, óleo de gualtéria, ou aroma de cereja, pretendidos para reforçar as qualidades estéticas dos comprimidos e para os tornar mais aceitáveis para o paciente. Excipientes adequados para uso em formas de dosagem líquida oral incluem dicálcio fosfato e diluentes tais como água e alcoóis, por exemplo, etanol, álcool benzílico, e alcoóis de polietileno, ou com ou sem a adição de um tensoativo, agente de suspensão ou agente emulsificante farmaceuticamente aceitável. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar de modo diverso a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma laca, açúcar ou ambos.
[00523] Pós e grânulos dispersíveis são adequados para a preparação de uma suspensão aquosa. Proporcionam o ingrediente ativo (isto é, o no mínimo um interferon) em mistura com um agente dispersante ou umectante, um agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersintes ou umectantes adequados e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles já mencionados acima. Excipien- tes adicionais, por exemplo, os agentes adoçantes, aromatizantes e colorantes descritos acima, também podem estar presentes.
[00524] As composições farmacêuticas desta invenção também podem estar sob a forma de emulsões de óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal tal como parafina líquida ou uma mistura de óleos vegetais. Agentes emulsificantes adequados podem ser (1) gomas que ocorrem naturalmente tais como goma acácia e goma tragacanto, (2) fosfatídeos que ocorrem naturalmente tais como feijão soja e lecitina, (3) ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, mono-oleato de sorbitano, (4) produtos da condensação dos ésteres parciais referidos com óxido de etileno, por exemplo, mono-oleato de sorbitano de polioxietileno. As emulsões também podem conter agentes adoçantes e aromatizantes.
[00525] Suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo o ingrediente ativo em um óleo vegetal tal como, por exemplo, óleo de araquis, azeite de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco, ou em um óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante tal como, por exemplo, cera de abelha, parafina dura, ou álcool cetílico. As suspensões também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo, etil ou n-propil p-hidroxibenzoato; um ou mais agentes colorantes; um ou mais agentes aromatizantes; e um ou mais agentes adoçantes tais como sacarose ou sacarina. Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes tais como, por exemplo, glicerol, propileno glicol, sorbitol ou sacarose. As formulações referidas também podem conter um emoliente, e conservante, tal como metil e propil parabenos e agentes aromatizantes e colorantes. Os interferons desta invenção também podem ser administrados por via parenteral, isto é, por via subcutânea, por via intravenosa, por via intraocular, por via intrasinovial, por via intramuscular, ou por via intraperitoneal, como dosagens injetáveis do interferon preferencialmente em um diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico o qual pode ser um líquido estéril ou uma mistura de líquidos tais como água, salina, soluções aquosas de dextrose e de açúcar relacionadas, um álcool tal como etanol, isopropanol, ou álcool hexadecílico, glicóis tal como propileno glicol ou polietileno glicol, glicerol cetais tal como 2,2-dimetil-1 ,1 -dioxolano-4- metanol, éteres tais como poli(etileno glicol) 400, um óleo, um ácido graxo, um éster de ácido graxo ou, um glicerídeo de ácido graxo, ou um glicerídeo de ácido graxo acetilado, com ou sem a adição de um tensoativo farmaceuticamente aceitável tal como um sabão ou um detergente, agente de suspensão tal como pectina, carbômeros, metil celulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou carboximetilcelulose, ou agente emulsificante e outros adjuvantes farmacêuticos.
[00526] Ilustrativo de óleos os quais podem ser usados nas formulações parenterais desta invenção são os óleos de origem de petróleo, animal, vegetal, ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de gergelim, óleo de algodão, óleo de milho, azeite de oliva, petrolato e óleo mineral. Ácidos graxos adequados incluem ácido oleico, ácido esteárico, ácido isoesteárico e ácido mirístico. Ésteres de ácidos graxos adequados são, por exemplo, etil oleato e isopropil miristato. Sabões adequados incluem sais de metais de álcali de ácidos graxos, de amônio, e de trietanolamina e detergentes adequados incluem detergentes catiônicos, por exemplo, haletos de dimetil dialquil amônio, haletos de alquil piridínio, e acetatos de alquilamina; detergentes aniônicos, por exemplo, sulfonatos de alquila, arila, e olefina, sulfatos de alquila, olefina, éter, e monoglicerídeo, e sulfossuccinatos; detergentes não iônicos, por exemplo, óxidos de aminas graxas, alcanolamidas de ácidos graxos, e poli(oxietileno- oxipropileno)s ou copolímeros de óxido de etileno ou óxido de propileno; e detergentes anfotéricos, por exemplo, alquil-beta-aminopropionatos, e sais de amônio quaternário de 2-alquilimidazolina, bem como misturas.
[00527] As composições parenterais desta invenção tipicamente vão conter a partir de cerca de 0,5% a cerca de 25% em peso do ingrediente ativo em solução. Conservantes e tampões também podem ser usados vantajosamente. De modo a minimizar ou eliminar irritação no sítio de injeção, as composições referidas podem conter um tentoa-tivo não iônico tendo um equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB) preferencialmente de a partir de cerca de 12 a cerca de 17. A quantidade de tensoativo em semelhante formulação preferencialmente vaira a partir de cerca de 5% a cerca de 15% em peso. O tensoativo pode ser um único componente tendo o HLB acima ou pode ser uma mistura de dois ou mais componentes tendo o HLB desejado. Ilustrativo de tensoativos usados em formulações parenterais são a classe de ésteres de ácidos graxos de sorbitano de polietileno, por exemplo, mono-oleato de sorbitano e os adutos de alto peso molecular de óxido de etileno com uma base hidrofóbica, formados pela condensação de óxido de propileno com propileno glicol.
[00528] As composições farmacêuticas podem estar sob a forma de suspensões aquosas injetáveis estéreis. As suspensões referidas podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos usando agentes dispersante ou umectantes adequados e agentes de suspensão tais como, por exemplo, sódio carboximetilcelulose, metilcelulose, hi-droxipropilmetil-celulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou umectantes os quais podem ser um fosfatídeo que ocorre naturalmente tal como lecitina, um produto da condensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo, por exemplo, estearato de polioxietileno, um produto da condensação de óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa, por exemplo, heptadeca-etilenooxicetanol, um produto da condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um hexitol tal como mono-oleato de sorbitol de polioxietileno, ou um produto da condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um anidrido de hexitol, por exemplo, mono-oleato de sorbitano de polioxietileno.
[00529] A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico aceitável por via parenteral. Diluentes e solventes que podem ser empregados são, por exemplo, água, solução de Ringer, soluções de cloreto de sódio isotônicas e soluções de glicose isotônicas. Além disso, óleos fixos estéreis são empregados convencionalmente como solventes ou meios de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado inclusive mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como ácido oleico podem ser usados na preparação de injetáveis.
[00530] Uma composição da invenção também pode ser administrada sob a forma de supositórios para administração retal do fármaco. Estas composições podem ser preparadas misturando o fármaco com um excipiente não irritante adequado o qual é sólido em temperaturas ordinárias mas líquido na temperatura retal e portanto fundirá no reto para liberar o fármaco. Os materiais referidos são, por exemplo, manteiga de cacau e polietileno glicol.
[00531] Outra formulação empregada nos métodos da presente invenção emprega dispositivos de liberação transdérmica ("emplastros"). Os emplastros transdérmicos referidos podem ser usados para proporcionar infusão contínua ou descontínua dos interferons da presente invenção em quantidades controladas. A construção e uso de emplastros transdérmicos para a liberação de agentes farmacêuticos é de conhecimento geral na arte (vide por exemplo, a patente dos Estados Unidos No. US 5.023.252). Os emplastros referidos podem ser construídos para liberação contínua, pulsátil, ou sob demanda de agentes farmacêuticos. Formulações de liberação controlada para administração parenteral incluem formulações lipossômicas, de microsferas poliméricas e de gel polimérico que são conhecidas na arte. Pode ser desejável ou necessário introduzir a composição farmacêutica no paciente através de um dispositivo de liberação mecânica. A construção e o uso de dispositivos de liberação mecânica para a liberação de agentes farmacêuticos é de conhecimento geral na arte. Técnicas diretas para, por exemplo, administração de um fármaco diretamente no cérebro geralmente envolvem a colocação de um cateter de liberação de fármaco dentro do sistema ventricular do paciente para bypassar a barreira cérebro-sanguínea. Um sistema de liberação implantável semelhante, usado para o transporte de agentes para regiões anatômicas específicas do corpo, é descrito na patente dos Estados Unidos No. US 5.011 .472.
[00532] As composições da invenção também podem conter outros ingredientes de produção de compostos farmaceuticamente aceitáveis convencionais, geralmente referidos como veículos ou diluentes, conforme necessário ou desejado. Podem ser utilizados procedimentos convencionais para preparar as composições referidas em formas de dosagem apropriadas. Os ingredientes e procedimentos referidos incluem os descritos nas seguintes referências, cada uma das quais é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência: Powell, M. F. et al., "Compendium of Excipients for Parenteral Formulations" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1998, 52(5), 238-311 ; Strickley, R.G "Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the United States (1999)-Part-1" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1999, 53(6), 324-349 ; e Nema, S. et al., "Excipients and Their Use in Injectable Products" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1997, 51 (4), 166-171.
[00533] Ingredientes farmacêuticos comumente usados que podem ser usados conforme apropriado para formular a composição para sua via de administração pretendida incluem:
[00534] - agentes acidificantes (exemplos incluem mas não estão limitados a ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido clorídrico, ácido nítrico); agentes alcalinizantes (exemplos incluem mas não estão limitados a solução de amônia, carbonato de amônio, dietanolamina, monoetanolamina, hidróxido de potássio, borato de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, trietanolamina, trolamina); adsorventes (exemplos incluem mas não estão limitados a celulose em pó e carvão vegetal ativado); propelentes para aerossol (exemplos incluem mas não estão limitados a dióxido de carbono, CCl2F2, F2ClC-CClF2 e CCF3) agentes de deslocamento de (exemplos incluem mas não estão limitados a nitrogênio e argônio); conservantes antifúngicos (exemplos incluem mas não estão limitados a ácido benzoico, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio); conservantes antimicrobianos (exemplos incluem mas não estão limitados a cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, álcool benzílico, cloreto de cetilpiridínio, clorobutanol, fenol, álcool feniletílico, nitrato fenilmercúrico e timerosal); antioxidantes (exemplos incluem mas não estão limitados a ácido ascórbico, ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propil galato, ascorbato de sódio, bissulfito de sódio, sulfoxilato de formaldeído de sódio, metabissulfito de sódio); materiais de ligação (exemplos incluem mas não estão limitados a polímeros em bloco, borracha natural e sintética, poliacrilatos, poliuretanos, silicones, polissiloxanos e copolímeros de estireno-butadieno); agentes de tamponamento (exemplos incluem mas não estão limitados a metafosfato de potássio, fosfato dipotássico, acetato de sódio, citrato de sódio anídri-co e citrato di-hidrato de sódio) agentes de transporte (exemplos inclu- em mas não estão limitados a xarope de acácia, xarope aromático, elixir aromático, xarope de cereja, xarope de cacau, xarope de laranja, xarope, óleo de milho, óleo mineral, óleo de amendoim, óleo de gergelim, injeção de cloreto de sódio bacteriostática e água para injeção bacteriostática) agentes quelantes (exemplos incluem mas não estão limitados a dissódio edetato e ácido edético) colorantes (exemplos incluem mas não estão limitados a vermelho FD&C Red No. 3, vermelho FD&C Red No. 20, amarelo FD&C Yellow No. 6, azul FD&C Blue No. 2, verde D&C Green No. 5, laranja D&C Orange No. 5, vermelho D&C Red No. 8, caramelo e óxido férrico vermelho) ;
[00535] - agentes clarificantes (exemplos incluem mas não estão limitados a bentonita);
[00536] - agentes emulsificantes (exemplos incluem mas não estão limitados a acácia, cetomacrogol, álcool cetílico, gliceril monoestearato, lecitina, mono-oleato de sorbitano, monoestearato de polioxietileno 50);
[00537] - agentes encapsulantes (exemplos incluem mas não estão limitados a gelatina e ftalato de acetato de celulose);
[00538] - aromatizantes (exemplos incluem mas não estão limitados a óleo de anis, óleo de canemla, cacau, mentol, óleo de laranja, óleo de hortelã-pimenta e vanilina);
[00539] - umectantes (exemplos incluem mas não estão limitados a glicerol, propileno glicol e sorbitol);
[00540] - agentes de levigação (exemplos incluem mas não estão limitados a óleo mineral e glicerina);
[00541] - óleos (exemplos incluem mas não estão limitados a óleo de araquis, óleo mineral, azeite de oliva, óleo de amendoim, óleo de gergelim e óleo vegetal);
[00542] - bases para pomadas (exemplos incluem mas não estão limitados a lanolina, pomada hidrofílica, pomada de polietileno glicol, petrolato, petrolato hidrofílico, pomada branca, pomada amarela, e pomada de água de rosas);
[00543] - reforçadores de penetração (liberação transdérmica) (exemplos incluem mas não estão limitados a mono-hidróxi ou polihidróxi alcoóis, alcoóis mono-ou polivalentes, alcoóis graxos saturados ou insaturados, ésteres graxos saturados ou insaturados, ácidos dicarboxílicos saturados ou insaturados, óleos essenciais, derivados de fosfatidila, cefalina, terpenos, amidas, éteres, cetonas e uréias)
[00544] - plastificantes (exemplos incluem mas não estão limitados a dietil ftalato e glicerol);
[00545] - solventes (exemplos incluem mas não estão limitados a etanol, óleo de milho, óleo de semente de algodão, glicerol, isopropanol, óleo mineral, ácido oleico, óleo de amendoim, água purificada, água para injeção, água estéril para injeção e água estéril para irrigação);
[00546] - agentes de endurecimento (exemplos incluem mas não estão limitados a álcool cetílico, cera de ésteres cetílicos, cera microcristalina, parafina, álcool estearílico, cera branca e cera amarela);
[00547] - bases para supositório (exemplos incluem mas não estão limitados a manteiga de cacau e polietileno glicóis (misturas);
[00548] - tensoativos (exemplos incluem mas não estão limitados a cloreto de benzalcônio, nonoxinol 10, oxtoxinol 9, polissorbato 80, lauril sulfato de sódio e mono-palmitato de sorbitano);
[00549] - agentes de suspensão (exemplos incluem mas não estão limitados a ágar, bentonita, carbômeros, sódio carboximetilcelulose, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, caulim, metilcelulose, tragacanto e veegum);
[00550] - agentes adoçantes (exemplos incluem mas não estão limitados a aspartame, dextrose, glicerol, manitol, propileno glicol, sacarina de sódio, sorbitol e sacarose);
[00551] - anti-aderentes para comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a estearato de magnésio e talco) ;
[00552] - aglutinantes de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a acácia, ácido algínico, sódio carboximetilcelulose, açúcar compressível, etilcelulose, gelatina, glicose líquida, metilcelulose, polivinil pirrolidona não reticulada, e amido pré-gelatinizado);
[00553] - diluentes de comprimido e cápsula (exemplos incluem mas não estão limitados a fosfato de cálcio dibásico, caulim, lactose, manitol, celulose microcristalina, celulose em pó, carbonato de cálcio precipitado, carbonato de sódio, fosfato de sódio, sorbitol e amido);
[00554] agentes de revestimento de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a glicose líquida, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, acetato ftalato de celulose e goma laca) ;
[00555] excipientes para compressão direta de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a fosfato de cálcio dibásico);
[00556] - desintegrantes de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a ácido algínico, cálcio carboximetilcelulose, celulose microcristalina, potássio polacrilina, polivinilpirrolidona reticulada, alginato de sódio, glicolato de amido de sódio e amido);
[00557] - deslizantes de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a sílica coloidal, amido de milho e talco);
[00558] - lubrificantes de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a estearato de cálcio, estearato de magnésio, óleo mineral, ácido esteárico e estearato de zinco);
[00559] - opacificantes de comprimidos / cápsulas (exemplos incluem mas não estão limitados a dióxido de titânio);
[00560] - agentes de polimento de comprimidos (exemplos incluem mas não estão limitados a cera de carnaúba e cera branca);
[00561] - agentes espessantes (exemplos incluem mas não estão limitados a cera de abelha, álcool cetílico e parafina);
[00562] - agentes de tonicidade (exemplos incluem mas não estão limitados a dextrose e cloreto de sódio);
[00563] - agentes de aumento da viscosidade (exemplos incluem mas não estão limitados a ácido algínico, bentonita, carbômeros, sódio carboximetilcelulose, metilcelulose, polivinil pirrolidona, alginato de sódio e tragacanto); e
[00564] - agentes umectantes (exemplos incluem mas não estão limitados a heptadecaetileno oxicetanol, lecitinas, mono-oleato de sorbitol, mono-oleato de sorbitol de polioxietileno, e estearato de polioxietileno).
[00565] Exemplos não limitados de composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser ilustrados como se segue:
[00566] Solução IV Estéril: Uma solução a 5 mg/mL do interferon desejado desta invenção pode ser produzida usando água estérila, injetável, e o pH é ajustado caso necessário. A solução é diluída para administração a 1 a 2 mg/mL com 5% de dextrose estéril e é administrada como uma infusão IV durante cerca de 60 minutos.
[00567] Pó liofilizado para administração IV: Uma preparação estéril pode ser preparada com (i) 100 a 1000 mg do interferon desejado desta invenção como um pó liofilizado, (ii) 32- 327 mg/mL de citrato de sódio, e (iii) 300 a 3000 mg de Dextran 40. A formulação é reconstituída com salina injetável estéril ou dextrose a 5% até uma concentração de 10 a 20 mg/mL, a qual é adicionalmente diluída com salina ou dextrose a 5% a 0,2 a 0,4 mg/mL, e é administrado ou bolus IV ou por infusão IV durante 15 a 60 minutos.
[00568] Suspensão intramuscular: A solução ou suspensão que se segue pode ser preparada, para injeção intramuscular:
50 mg/mL do interferon desejado, insolúvelo em água (ou solúvel em água) desta invenção
5 mg/mL de carboximetilcelulose de sódio
4 mg/mL de TWEEN 80
9 mg/mL de cloreto de sódio
9 mg/mL de álcool benzílico
[00569] Cápsulas de Concha Dura: Um grande número de unidade de cápsulas são preparadas por preenchimento de cápsulas padrão de galantina dura de duas peças cada uma com 100 mg de ingrediente ativo pulverizado, 150 mg de lactose, 50 mg de celulose e 6 mg de estearato de magnésio.
[00570] Cápsulas de Gelatina Mole: Uma mistura de ingrediente ativo em um óleo digerível tal como óleo de soja, óleo de semente de algodão ou azeite de oliva é preparada e injetada por meio de uma bomba de deslocamento positivo para dentro de gelatina fundida para formar cápsulas de gelatina mole contendo 100 mg do ingrediente ativo. As cápsulas são lavadas e secadas. O ingrediente ativo pode ser dissolvido em uma mistura de polietileno glicol, glicerina e sorbitol para preparar uma mistura de medicamento miscível em água.
[00571] Comprimidos: Um grande número de comprimidos são preparados por procedimentos convencionais de modo a que a unidade de dosagem seja 100 mg de ingrediente ativo, 0,2 mg de dióxido de silício coloidal, 5 mg de estearato de magnésio, 275 mg de celulose microcristalina, 11 mg. de amido, e 98,8 mg de lactose. Revestimentos apropriados aquosos e não aquosos podem ser aplicados para aumentar a palatabilidade, melhorar a elegância e a estabilidade ou retardar a absorção.
[00572] Comprimidos / Cápsulas de Liberação Imediata: Estes são formas de dosagens orais sólidas produzidas por processos convencionais e novos. Estas unidades são tomadas por via oral sem água para imediata dissolução e liberação da medicação. O ingrediente ativo é misturado em um líquido contendo ingrediente tal como açúcar, gelatina, pectina e adoçantes. Estes líquidos são solidificados em comprimidos sólidos ou cápsulas por técnicas de liofilização e de extração em estado sólido. Os interferons do fármaco podem ser comprimidos com açúcares e polímeros viscoelásticos e termoelásticos ou componentes efervescentes para produzir matrizes porosas pretendidas para liberação imediate, sem a necessidade de água.
[00573] Em uma modalidade particular os interferons são formulados em formulações parenterais de liberação controlada. Uma lista não limitante de semelhantes sistemas de liberação parenteral de liberação controlada os quais podem ser aplicados para a administração de interferons incluem injeções à base de óleo, implantes, lipossomas, nanopartículas, PEGuilação, mircrosferas e bombas. Em uma modalidade particular nanopartículas de lipídeos sólidos podem ser desenvolvidas como sistemas de veículo para interferons. Em outra modalidade particular interferons podem ser microencapsulados. Microsferas são pós de livre escoamento, idealmente de menos de cerca de 125 μm de diâmetro, os quais podem ser suspendidos em veículos aquosos adequados para injeção com uma seringa convencional usando uma agulha calibre 18 ou 20. Os mais polímeros promissores para semelhante utilizaçlão são co-polímeros de lactida / glicolídeo, poli(orto ésteres) e polianidridos. Poli (D,L-lactida-co-glicolídeo) (PLGA) é um polímero biodegradável que hidrolisa com uma reação catalisada por ácido ou base para formar os metabólitos naturais ácido glicólico e ácido láctico. PLGA é aprovado pela agência americana FDA.
[00574] De acordo com modalidades particulares, a molécula pode ser proporcionada em forma liofilizada com um tampão fisiológico. De acordo com modalidades particulares, as composições farmacêuticas, se um líquido, são proporcionadas em pH fisiológico, em particular entre pH 5 e 9, mais particularmente entre pH 6 e pH 8.
[00575] O termo ‘administração’ conforme usado aqui, neste pedido de patente, tem o objetivo de contactar a uma ou mais proteínas de interesse com as moléculas. Notar que, por exemplo, no caso de doença infecciosa, a administração pode ser a um organismo diferente do organismo em que a uma ou mais proteínas devem ser agregadas. Administração intracelular pode ser através de liberação mediada por veículo, por exemplo, por veículos lipossômicos ou nano-partículas ou por injeção. Em ainda outra modalidade alternativa a molécula agre-gadora pode penetrar em uma célula através de uma sequência a qual media a penetração na célula (ou translocação celular). No último caso a molécula agregadora é adicionalmente modificada através da fixação recombinante ou sintética de uma sequência de penetração na célula.
Terapias de combinação
[00576] Em uma modalidade particular os interferons desta invenção podem ser administrados como o único agente farmacêutico ou em combinação com um ou mais agentes farmacêuticos diversos onde a combinação não provoca efeitos adversos inaceitáveis. A presente invenção se refere também a semelhantes combinações. Por exemplo, os interferons desta invenção podem ser combinados com agentes anti-microbianos conhecidos (por exemplo, anti-fúngicos ou antibióticos) ou agentes para outra indicação, e semelhantes, bem como com misturas e combinações dos mesmos.
[00577] O termo "tratar" ou "tratamento" conforme declarado do início ao fim deste documento é usado de modo convencional, por exemplo, o manejo ou cuidado de um sujeito para o fim de combater, aliviar, reduzir, suavizar, melhorar a condição de , etc., de uma doença ou distúrbio, tal como um carcinoma. Tratamento pode ser aplicado tanto par doenças infecciosas quanto para distúrbios não infecciosos.
Dose e administração:
[00578] Com base em técnicas laboratoriais de rotina conhecidas para avaliar interferons úteis para o tratamento de doença infecciosa (conforme msotrado nos exemplos, em particular infecções fúngicas, infecções bacterianas, ou infecções virais, em particular infecções por Candida albicans, infecções por Staphylococcus sp. e infecções pelo vírus da gripe), , ou para o tratamento de doença não infecciosa (tal como câncer, AMD e inflamação, conforme mostrado nos Exemplos) por ensaios de toxicidade de rotina e por provas farmacológicas de rotina para a determinação de tratamento das condições identificadas acima em mamíferos, e por comparação destes resultados com os resultados de medicamentos conhecidos que são usados para tratar estas condições, a dosagem eficaz dos interferons desta invenção pode ser prontamente determinada para tratamento de cada indicação desejada. A quantidade do ingrediente ativo a ser administrado no tratamento de uma destas condições pode variar amplamente de acordo com considerações tais como o interferon em particular e a unidade de dosagem empregada, o modo de administração, o período de tratamento, a idade e o sexo do paciente tratado, e a natureza e a extensão da condição tratada.
[00579] A quantidade total do ingrediente ativo a ser administrado geralmente vai variar a partir de cerca de 0,001 mg/kg até cerca de 200 mg/kg de peso corporal por dia, e preferencialmente a partir de cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 50 mg/kg de peso corporal por di-ab.Esquemas de dosagem clinicamente úteis vão variar a partir de administração de um a três vezes ao dia até administração uma vez a cada quatro semanas. Além disso, "feriados do fármaco" nos quais um paciente não é dosado com um fármaco por um período de tempo determinado, podem ser benéficos para o balanço global entre efeito farmacológico e tolerabilidade. Uma unidade de dosagem pode conter a partir de cerca de 0,5 mg até cerca de 1500 mg de ingrediente ativo, e pode ser administrada uma ou mais vezes por dia ou menos de uma vez ao dia. A dosagem diária média para administração por injeção, incluindo injeções intravenosas, intramusculares, subcutâneas e parenterais, e uso de técnicas de infusão, preferencialmente será de a partir de 0,01 até 200 mg/kg de peso corporal total. O regime de dosagem retal diária média preferencialmente será de a partir de 0,01 até 200 mg/kg de peso corporal total. O regime de dosagem vaginal diária média preferencialmente será de a partir de 0,01 até 200 mg/kg do peso corporal total. O regime de dosagem tópica diária média preferencialmente será de a partir de 0,1 até 200 mg administrados entre um a quatro vezes ao dia. A concentração transdérmica preferencialmente será a necessária para manter uma dose diária de a partir de 0,01 até 200 mg/kg. O regime de dosagem por inalação diária média preferencialmente será de a partir de 0,01 até 100 mg/kg de peso corporal total. Preferencialmente, composições para inalação são apresentadas para administração ao trato respiratório como um rapé ou um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó microfino para insuflação, isolado ou em combinação com um veículo inerte tal como lactose. Em tal caso as partículas de interferon ativo convenientemente têm diâmetros de menos de 50 micra, preferencialmente de menos de 10 micra, por exemplo, entre 1 e 5 micra, tal como entre 2 e 5 micra. Alternativamente, podem ser usadas nanopartículas revestidas, com uma medida de partícula entre 30 e 500 nm. Uma dose inalada favorecida será na faixa de 0,05 a 2 mg, por exemplo, 0,05 a 0,5 mg, 0,1 a 1 mg ou 0,5 a 2 mg.
[00580] É evidente para o técnico versado que o regime de dosagem específica inicial e contínuo para cada paciente vai variar de acordo com a natureza e a gravidade da condição conforme determinado pelo diagnosticador assistente, pela atividade do interferon específico empregado, a idade e a condição geral do paciente, a hora de administração, a via de administração, a taxa de excreção do fármaco, combinações de fármacos, e semelhantes. O modo de tratamento desejado e o número de doses de um interferon da presente invenção ou de um sal ou éster farmaceuticamente aceitável ou composição dos mesmos podem ser discernidos pelas pessoas versadas na arte usando ensaios de tratamento convencionais.
[00581] Em determinados modalidades, os medicamentos da invenção são administrados à classe dos mamíferos, incluindo as ordens dos carnívoros (por exemplo, cães e gatos), roedores (por exemplo, camundongos, porquinhos da índica, e ratos), lagomorfos (por exemplo, coelhos) e dos primatas (por exemplo, humanos, chimpanzés, e macacos).
[00582] Conforme é comum na prática, as composições geralmente serão acompanhadas por instruções por escrito ou impressas para uso no tratamento médico de interesse.
[00583] A presente invenção também inclui interferons marcados isotopicamente, os quais são idênticos aos definidos aqui, neste pedido de patente, com a exceção do fato de que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou um número de massa diferente da massa atômica ou do número de massa encontrado geralmente na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos interferons da presente invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 11C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, e 36CI, respectivamente. Interferons da presente invenção e sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos interferons ou os quais contêm os isótopos mencionados acima e/ou outros isótopos de outros átomos estão dentro do âmbito desta invenção. Alguns interferons marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais isótopos radioativos tais como 3H e 14C são incorporados, são úteis em provas de distribuição tecidual de fármaco e/ou substrato. Isótopos tri- tiados, isto é, 3H, e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente preferenciais devido a sua facilidade de preparação e detectabilidade. Além disso, a substituição com isótopos mais pesados tais como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar determinadas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da meia-vida in vivo ou requisitos de dosagem reduzida e, portanto, podem ser preferenciais em algumas circunstâncias, linterferons marcados isotopicamente de fórmula I desta invenção geralmente podem ser preparados realizando os procedimentos revelados nos Exemplos abaixo, substituindo um reagente marcado isotopicamente prontamente disponível por um reagente marcado não isotopicamente.
[00584] Conforme mencionado, as moléculas podem ser aplicadas para tratar tanto doença não infecciosa quanto doença infecciosa. De acordo com uma primeira modalidade, as moléculas da invenção podem ser usadas para o tratamento de doenças (não infecciosas) (alternativamente para a fabricação de um medicamento para tratar do-enças(não infecciosas)), tais como câncer, uma doença inflamatória ou um distúrbio imuno relacionado, associado com a expressão aberrante de uma proteína em particular (por exemplo, através da superexpressão de uma proteína particular ou da (hiper)-expressão de uma variante de união de uma proteína em particular ou uma versão mutante de uma proteína em particular, a (hiper)-expressão de uma proteína ancorada a membrana, a (hiper)-expressão de uma proteína transmembrana (mutante), a (hiper)-expressão de uma proteína secreta\da (por exemplo, uma protease, um anticorpo ou uma citocina presente no sangue ou no plasma), a (hiper)-expressão de uma proteína na matriz extracelular (por exemplo, uma metaloproteína da matriz ou uma proteína transmembrana (por exemplo, um receptor de fator de crescimento). O termo ‘expressão aberrante’ se refere, por exemplo, à (hi-per)expressão de um fator de crescimento oncogênico no caso de câncer, também inclui a expressão de um receptor negativo dominante ou um receptor de mutante ou a ocorrência de um receptor disseminado no sangue ou a expressão (ou hiper-expressão) de uma citocina ou um fator de crescimento em um fluido corporal. Em uma modalidade particular a "expressão aberrante" se refere à presença indesejada de uma proteína modificada pós-translacionalmente ou à presença indesejada de uma proteína modificada não pós-translacionalmente. As modificações pós-translacionais alteram as propriedades fisico-químicas dos aminoácidos modificados, e deste modo têm o potencial de alterar a tendência de agregação de um dado segmento polipeptídico que pode ser explorado para ter por alvo especificamente a forma que tem a mais forte tendência de agregação. Portanto se uma modificação pós-translacional diminui significativamente a tendência de agregação da região de beta-agregação, então a interferência será mais eficiente com a proteína não modificada. Em contraste, no caso de modificações pós-translacionais que aumentam a tendência de agregação da região de beta-agregação, então a interferência será mais eficiente com a proteína modificada. Com base na hidrofobicidade somente, presumiu-se que modificações tais como fosforilação e glicosilação vão diminuir a tendência de agregação, ao passo que a fixação de lipídeo vai aumentar a tendência de agregação.
[00585] Em modalidades específicas, as moléculas podem ser usadas para hiporregulação de uma (uma ou mais) proteína que precisa ser hiporregulada em uma situação de doença. Uma proteína semelhante tipicamente é uma proteína cuja superexpressão está associada com a doença, e preferencialmente é causadora da doença (por exemplo, VEGFR-2 é uma proteína cuja superexpressão é ligada de modo causal com câncer e AMD, EGFR é uma proteína cuja superexpressão é ligada de modo causal com câncer, TNF é uma proteína cuja superexpressão é ligada de modo causal com inflamação). No en- tanto, também pode ser uma proteína que é somente expressada em situações de doenças e normalmente não é expressada nas células / no tecido / no sujeito a ser visado quando as células / o tecido / o sujeito está saudável (por exemplo, PlGF é uma proteína não expressada normalmente em tecido adulto, mas é expressada em tumores). Uma proteína a ser hiporregulada também pode ser uma proteína que está (tipicamente a jusante) no mesmo caminho de sinalização de uma proteína causadora da doença (por exemplo, um receptor quando o ligante é associado com doença) de modo que o sinal aberrante possa ser interrompido.
[00586] Por conseguinte, moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n são proporcionadas para uso em tratamento, estabilização ou prevenção de uma doença, em que:
[00587] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00588] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00589] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com a referida doença; e
[00590] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo indepen- dente entre um ligante ou nada.
[00591] Doenças particularmente previstas a serem tratadas incluem, mas não estão limitadas a, câncer, AMD e doença inflamatória. Portanto, moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n são proporcionadas para uso em tratamento, estabilização ou prevenção de câncer, em que:
[00592] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00593] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00594] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com câncer; e
[00595] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00596] De modo similar, moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n são proporcionadas para uso em tratamento, estabilização ou prevenção de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), em que:
[00597] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00598] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00599] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com AMD; e
[00600] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00601] Do mesmo modo, moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n são proporcionadas para uso em tratamento, estabilização ou prevenção de doença inflamatória, em que:
[00602] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00603] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00604] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com doença inflamatória; e
[00605] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00606] O mais particularmente, a proteína a ser hiporregulada em câncer ou AMD é VEGFR-2. Alternativamente, a proteína a ser hiporre-gulada em câncer é EGFR2. Proteínas particulares que podem ser reguladas negativamente em doença inflamatória incluem TNF-α e IL-1β.
[00607] Conforme mencionado anteriormente, isto é equivalente a dizer que são proporcionados métodos para tratar, estabilizar ou preveni ruma doença (particularmente câncer, AMD ou doença inflamatória, respectivamente) em um sujeito que necessite dos mesmos, compreendendo: administrar ao sujeito uma molécula tendo a estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00608] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00609] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K e P;
[00610] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre natural- mente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com a doença (particularmente câncer, AMD ou doença inflamatória, respectivamente); e
[00611] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00612] Ou, em formato da fórmula suíça, a uso de moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n é proporcionada para a fabricação de um medicamento para tratamento, estabilização ou prevenção de doença (particularmente câncer, AMD ou doença inflamatória, respectivamente), em que:
[00613] n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00614] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K e P;
[00615] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína cuja expressão ou superexpressão está associada com a doença (particularmente câncer, AMD ou doença inflamatória, respectivamente); e
[00616] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00617] Estas três formulações equivalentes são incluídas para atender diferentes requisitos nacionais da legislação de patentes.
[00618] O sujeito particularmente é um animal, mais particularmente um mamífero (por exemplo, gato, cão, coelho, cavalo, vaca, porco, carneiro, cabra, lhama, camundongo, rato, ...), o mais particularmente um humano. Outros sujeitos são previstos também (vide definições).
[00619] Observar no entanto que estes métodos também podem ser aplicados a organismos diferentes de mamíferos, particularmente para tratar doença em plantas (vide mais adiante).
[00620] Em uma modalidade particular, a molécula de interferon é direcionada contra um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento, ou um receptor transmembrana de quinase (por exemplo, um receptor de tirosina quinase). Uma lista de exemplos não limitantes compreende proteína PDGF-beta (e interferons específicos podem ser usados para tratar um sujeito tendo um distúrbio caracterizado por expressão indesejada de PDGF-beta, por exemplo, cânceres testiculares e pulmonares), a proteína Erb-B (e interferons específicos podem ser usados para tratar um sujeito tendo um distúrbio caracterizado por expressão indesejada de Erb-B, por exemplo, câncer de mama), a proteína VEGF (e interferons específicos podem ser usados para tratar um sujeito tendo expressão indesejada de VEGF, por exemplo, cânceres de esôfago, de cólon ou angiogênese patológica), a proteína EGFR (e interferons específicos podem ser usados para tratar um sujeito tendo um distúrbio caracterizado por expressão indesejada de EGFR, por exemplo, câncer de mama), a proteína WNT-1 (e interferons específicos podem ser usados para tratar um sujeito tendo expressão indesejada de WNT-1, por exemplo, carcinoma de células basais), a proteína Her2/Neu (e interferons podem ser usados para tratar um sujeito tendo um distúrbio caracterizado por expressão indesejada de Her2/Neu, por exemplo, câncer de mama), a proteína alfa v-integrina (e interferons podem ser usados para tratar um sujeito tendo um distúrbio caracteri- zado por expressão indesejada de alfa v-integrina, por exemplo, tumores cerebrais ou tumores de origem epitelial), a proteína receptora de Flt-1 (e interferons podem ser usados para tratar um sujeito tendo um distúrbio caracterizado por receptores de Flt-l indesejados por exemplo, câncer e artrite reumatoide). Ainda outros exemplos de interferons específicos podem ser projetados com uma especificidade para co-ligantes de integrinas por exemplo, VLA4, VCAM, ICAM, selectina ou co-ligante da mesma, por exemplo, P-selectina, E-selectina (ELAM), L-selectina, ou P-selectina glicoproteína-(PSGL1), um componente do sistema do complemento, por exemplo, C3, C5, C3aR, C5aR, C3 con-vertase, C5 convertase, a função de uma quimiocina ou receptor da mesma, por exemplo, TNF-α, IL-1 α, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI, TNFRII, IgE, SCYA11 ou CCR3, um componente de um canal iônico, um componente de um receptor acoplado à proteína G ou com a função de um receptor de neurotransmissor ou ligante do mesmo.
[00621] De acordo com outro aspecto, aplicações médicas particularmente previstas são a uso das moléculas proporcionadas aqui, neste pedido de patente, como um medicamento em doença infecciosa.
[00622] Portanto, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00623] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00624] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00625] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F esti- ver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo patogênico; e
[00626] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00627] para uso como um fármaco anti-patogênico (ou anti-infeccioso).
[00628] De acordo com uma modalidade particular, as moléculas são usadas como agentes antimicrobianos. Portanto, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00629] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00630] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00631] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano; e
[00632] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00633] para uso como um antimicrobiano.
[00634] O uso dos interferons portanto é contemplado para o trata- mento de infecção com patógenos bacterianos de animais e humanos, para patógenos fúngicos de animais e humanos e para patógenos parasitários de animais e humanos. Uma lista não exclusiva de patógenos de animais e humanos é encontrada na Tabela 1A da patente dos Estados Unidos No. 8.088.888 (iniciando à página 8, terminando à página 15). Uma lista não exclusiva de patógenos fúngicos de animais e humanos é encontrada na Tabela 1B da patente dos Estados Unidos No. 8.088.888 (iniciando à página 15, terminando à página 18). Uma lista não exclusiva de patógenos parasitários de animais e humanos é encontrada na Tabela 1C da patente dos Estados Unidos No. 8.088.888 (iniciando à página 18, terminando à página 20). Tabelas 1A, 1B e 1C da patente dos Estados Unidos No. 8.088.000 são por este incorporadas em sua totalidade por meio de referência.
[00635] De acordo com outra modalidade particular, as moléculas são usadas como agentes antivirais. Portanto, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00636] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00637] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00638] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo viral; e
[00639] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00640] para uso como um antiviral.
[00641] Outra formulação equivalente é que o uso destas moléculas é proporcionado para a fabricação de um medicamento para tratamento de infecção por patógeno (ou infecção microbiana ou viral, respectivamente), isto é, uma reivindicação da fórmula suíça.
[00642] Isto também é equivalente a dizer que são proporcionados métodos para prevenir ou tratar infecção por patógeno em um sujeito que necessite dos mesmos, compreendendo:
[00643] administrar ao sujeito uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00644] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00645] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00646] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de a patógeno; e
[00647] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00648] Ou, no caso de antimicrobianos, é equivalente a métodos proporcionados para tratar infecção microbiana em um sujeito que ne- cessite dos mesmos, compreendendo:
[00649] administrar ao sujeito uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-i-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00650] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00651] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00652] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano; e
[00653] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00654] Ou, no caso de antivirais, é equivalente a métodos proporcionados para tratar infecção viral em um sujeito que necessite dos mesmos, compreendendo:
[00655] administrar ao sujeito uma molécula tendo a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00656] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00657] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00658] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo viral; e
[00659] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00660] Etapas adicionais dos métodos podem incluir a avaliação (ou a medição) da presença do organismo patogênico (por exemplo, microbiano, viral) (por exemplo, monitoração do crescimento, reprodução ou sobrevida do organismo patogênico).
[00661] "Organismo microbiano" conforme usado aqui, neste pedido de patente, pode se referir a bactérias, tais como bactérias Gram-positivas (por exemplo, cocos tais como Staphylococcus sp., Enterococcus sp., bacilos tais como Bacillus sp.), bactérias Gram-negativas (por exemplo, espécie Escherichia, espécie Yersinia), Espiroquetas (por exemplo, espécies de Treponema tal como Treponema pallidum, espécies de Leptospira, espécies de Borrelia, tal como Borrelia burgdorferi), Mollicutes (isto é, bactérias sem uma parede celular, tais como a espécie Mycoplasma), bactérias de ácido rápido (por exemplo, espécies de Mycobacterium tais como Mycobacterium tuberculosis, espécies de Nocardia). "Organismos microbacterianos" também engloba fungos (tais como leveduras e mofos, por exemplo, espécie Candida, espécie Aspergillus, espécie Coccidioides, espécie Cryptococcus, espécie Histoplasma, espécie Pneumocystis, ou espécie Trichophyton), protozoários (por exemplo, espécie Plasmodium, espécie Entamoeba, espécie Giardia, espécie Toxoplasma, espécie Cryptospo- ridium, espécie Trichomonas, espécie Leishmania, espécie Trypanosoma) e Archaea. De acordo com modalidades particulares, a proteína de um organismo microbiano é uma proteína de um organismo microbiano selecionado entre bactérias, fungos ou protozoários. Mais particularmente, a proteína é uma entre bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, micobactérias, Mollicutes, protozoários, ou fungos. Mais particularmente, é uma proteína de bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, micobactérias, ou fungos tais como leveduras e mofos.
[00662] "Organismo viral" ou "vírus", os quais são usados como equivalentes aqui, neste pedido de patente, são pequenos agentes infecciosos que podem replicar somente dentro de células vivas de organismos. Incluem vírus de dsDNA (por exemplo, Adenovírus, Herpes vírus, Poxvírus), vírus de ssDNA (por exemplo, Parvovírus), vírus de dsRNA (por exemplo, Reovírus), vírus de (+)ssRNA (por exemplo, Picornavírus, Togavírus), vírus de ssRNA (por exemplo, Ortomixovírus, Rhabdovírus), vírus de ssRNA-RT (de transcrição reversa), isto é, vírus com RNA (+)sense com DNA intermediário no ciclo de vida (por exemplo, Retrovírus), e vírus de dsDNA-RT (por exemplo, Hepadnavírus). Uma classe particular de vírus são bacteriófagos (ou fagos em suma), vírus os quais infectam bactérias e injetam seu material genético (ssRNA, dsRNA, ssDNA, ou dsDNA). Os fagos são particularmente abundantes na água do mar e muitas bactérias marinhas são infectadas com fagos. Os bacteriófagos podem representar um problema em processos industriais onde são usadas bactérias (por exemplo, na produção de alimentos tais como iogurte, queijo, e semelhantes).
[00663] Em métodos direcionados para tratar uma infecção viral ou para inibir infectividade viral em um animal não humano, o vírus do animal é preferencialmente selecionado entre um picornavírus, tal como um enterovírus bovino, um enterovírus B porcino, um vírus da do- ença do pé e da boca, um vírus da rinite A equina, um vírus da rinite B bovina, um ljungan vírus, vírus da rinite B equina, um aichi vírus, um kobuvírus bovino, um teschovírus porcino, um sapelovírus porcino, um sapelovírus simiesco, um sapelovírus aviário, um vírus da encefalomielite aviária, um vírus da hepatite A do pato, ou um enterovírus A simiesco; um pestivírus, tal como o vírus da doença da fronteira, uma diarréia viral bovina, ou um vírus da febre suína classica; um arterivírus, tal como um vírus da arterite equina, um vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, um vírus de elevação da lactato desidrogenase, ou um vírus da febre hemorrágica simiesca; um coronavírus, tal como um coronavírus bovino, um coronavírus porcino, um coronavírus felino, ou um coronavírus canino; um paramixovírus, tal como um hendra vírus, um nipah vírus, um vírus da cinomose canina, um vírus da peste bovina, um vírus da doença de Newcastle, e um vírus sincicial respiratório bovino; um ortomixovírus, tal como um vírus da influenza A, um vírus da influenza vírus, ou um vírus da influenza C; um reovírus, tal como um vírus da lingua azul; um circovírus porcino, um herpes vírus, tal como um pseudorabies vírus ou um herpes vírus 1 bovino; um asfarvírus, tal como um vírus da febre suína africana; um retrovírus, tal como um vírus da imunodeficiência simiesca, um vírus da imunodeficiência felina, um vírus da imunodeficiência bovina, um vírus da leucemia bovina, um vírus da leucemia felina, um retrovírus da ovelha de Jaagsiekte, ou um vírus da artrite encefalite caprina; um flavivírus, tal como um vírus da febre amarela, um vírus de West Nile, um vírus da febre da dengue, um vírus da encefalite transmitido pela carrapato, ou uma diarréia viral bovina; ou um rhabdovírus, tal como um vírus da raiva.
[00664] Em métodos direcionados para tratamento de uma infecção viral ou para inibição da infectividade viral em um human, o vírus humano é preferencialmente selecionado entre um adenovírus, um as- trovírus, um hepadnavírus, um herpes vírus, um Papovavírus, um poxvirus, um arenavírus, um bunyavírus, um calcivírus, um coronavírus, um filovírus, um flavivírus, um ortomixovírus, um paramixovírus, um picornavírus, um reovírus, um retrovírus, um rhabdovírus, ou um togavírus. Em modalidades preferenciais, o adenovírus inclui, mas não está limitado a, um adenovírus humano. Em modalidades preferenciais, o astrovírus inclui, mas não está limitado a, um mamastrovírus. Em modalidades preferenciais, o hepadnavírus inclui, mas não está limitado ao vírus da hepatite B. Em modalidades preferenciais, o herpes vírus inclui, mas não está limitado a, um herpes simplex vírus tipo I, um herpes simplex vírus tipo 2, um citomegalovírus humano, um vírus Epstein-Barr, um vírus da varicella zoster, um roseolovírus, e um herpes vírus associado com o sarcoma de Kaposi. Em modalidades preferenciais, o papovavírus inclui, mas não está limitado a, papiloma vírus humano e um polioma vírus humano. Em modalidades preferenciais, o poxvírus inclui, mas não está limitado a, um vírus da variola, um vírus da vaccinia, um vírus da varíola bovina, um vírus da varíola do macaco, um vírus da varíola, um vírus da pseudovaríola bovina (pseu-docowpox), um vírus da estomatite papular, um tanapox vírus, um vírus do tumor do macaco yaba, e um vírus do molusco contagioso. Em modalidades preferenciais, o arenavírus inclui, mas não está limitado a vírus da coriomeningite linfocítica, um lassa vírus, um machupo vírus, e um junin vírus. Em modalidades preferenciais, o bunyavírus inclui, mas não está limitado a, um hanta vírus, um nairovírus, um ortho-bunyavírus, e um phlebovírus. Em modalidades preferenciais, o calci-vírus inclui, mas não está limitado a, um vesivírus, um norovírus, tal como o vírus Norwalk e um sapovírus. Em modalidades preferenciais, o coronavírus inclui, mas não está limitado a, um coronavírus humano (agente etiológico da síndrome respiratória aguda grave (SARS)). Em modalidades preferenciais, o filovírus inclui, mas não está limitado a, um virus Ebola e um virus Marburg. Em modalidades preferenciais, o flavivírus inclui, mas não está limitado a, um vírus da febre amarela, um vírus West Nile, um vírus da febre da dengue, um vírus da hepatite C, um vírus da encefalite transmitido pelo carrapato, um vírus da encefalite japanesa, um vírus da encefalite de Murray Valley, um vírus da encefalite de St. Louis, um vírus da encefalite da primavera-verão da Rússia, um vírus da febre hemorrágica de Omsk, um vírus da diarréia viral bovina, um vírus da doença da Floresta de Kyasanus, e um vírus da encefalite de Powassan. Em modalidades preferenciais, o ortomixovírus inclui, mas não está limitado a, vírus da gripe tipo A, vírus da gripe tipo B, e vírus da gripe tipo C. Em modalidades preferenciais, o paramixovírus inclui, mas não está limitado a, um parainfluenza vírus, um rubula vírus (cachumba), um morbilivírus (sarampo), um pneumovírus, tal como um vírus sincicial respiratório humano, e um vírus da pa-nencefalite esclerosante subaguda. Em modalidades preferenciais, o picornavírus inclui, mas não está limitado a, um poliovírus, um rhinoví-rus, um coxsackievírus A, um coxsackievírus B, um vírus da hepatite A, um echovírus, e um eneterovírus. Em modalidades preferenciais, o reovírus inclui, mas não está limitado a, um vírus da febre do carrapato do Colorado e um rotavírus. Em modalidades preferenciais, o retrovírus inclui, mas não está limitado a, um lentivírus, tal como um vírus da imunodeficiência humana, e um vírus T- linfotrófico humano (HTLV). Em modalidades preferenciais, o rhabdovírus inclui, mas não está limitado a, um lissavírus, tal como o vírus da raiva, o vírus da estomatite vesicular e o vírus da necrose hematopoiética infecciosa. Em modalidades preferenciais, o togavírus inclui, mas não está limitado a, um alfavírus, tal como um vírus do Rio Ross, um vírus de O'nyong'nyong, um Sindbis vírus, um vírus da encefalite equina Venezuelana, um vírus da encefalite equina do Leste, e um vírus da encefalite equina do Oeste, e um vírus da rubéola.
[00665] De acordo com modalidades particulares, a proteína de um organismo patogênico é uma proteína de um patógeno, cepa ou variante resistente a fármaco. Sabe-se que a resistência a fármaco surge em vários patógenos, particularmente em vírus e micro-organismos.
[00666] Um exemplo particular de resistência a fármaco é resistência a antibiótico, portanto de acordo com modalidades adicionais particulares, a proteína de um organismo microbiano é uma proteína de um organismo, cepa ou variante resistente a antibiótico, ou também ocorrendo em um organismo resistente a antibiótico. Vide também a seção de Exemplos. Uma vez que as presentes moléculas têm um mecanismo de ação completamente diferente dos antibióticos conhecidos (isto é, agregam uma proteína-alvo do organismo microbiano), é previsto que organismos resistentes a antibiótico não sejam resistente a estas moléculas. Além disso, como a maior parte das regiões hidrofóbicas das proteínas estão em partes conservadas da proteína, é previsto que se desenvolverá resistência a antibiótico (ou resistência antimicrobiana) mais lentamente contra estas moléculas do que contra antibióticos convencionais. Na verdade, de acordo com modalidades particulares, o métodos comprise administração prolongada das moléculas sem um aumento significativo nos valores da MIC. Portanto, são proporcionados métodos para administração em que as moléculas conforme descrito aqui, neste pedido de patente, são administradas no mínimo uma vez ao dia por no mínimo dez dias, ou no mínimo uma vez ao dia por quatorze dias. Particularmente, este regime de tratamento não é acompanhado pelo desenvolvimento de resistência a antibiótico. Portanto, estas modalidades prevêm que os valores da MIC sobre esta faixa de tempo não aumentam mais de qratro vezes, ou não dobram. O mais particularmente, é previsto que, durante administração prolongada, o valor da MIC da molécula de interferon para o organismo microbiano específico permanece abaixo do ponto de interrupção clínico da molécula de interferon para o organismo microbiano específico.
[00667] De acordo com modalidades específicas, as moléculas podem ser usadas para matar o organismo patogênico (por exemplo, microbiano), ou os métodos resultam na morte do organismo patogênico (por exemplo, microbiano). De acordo com ainda modalidades adicionais específicas, as moléculas têm êxito em matar rapidamente o organismo patogênico (microbiano), particularmente dentro de uma hora ou menos, ou dentro de 30 minutos ou menos. Um rápido efeito bactericida (ou um rápido efeito de destruição de microorganismos) não somente produz melhores resultados clínicos mesmo em monoterapia (Finch et al., Antimicrob Agents Chemother; 46(6):1746-54, 2002), mas também podem encurtar a duração da terapia antimicrobiana e a extensão da estadia hospitalar, bem como contribuir para a diminuição do desenvolvimento de resistência. Isto foi mostrado, por exemplo, para os antibióticos de fluoroquinolona de morte rápida (Albertson et al., Int J Clin Pract.; 64(3):378-88, 2010).
[00668] De acordo com modalidades alternativas, os métodos usando as moléculas inibem o crescimento e/ou a reprodução do organismo patogênico (por exemplo, microbiano ou viral) sem matar o mesmo.
[00669] De acordo com modalidades particulares, a proteína do organismo microbiano é uma proteína essencial, isto é, o organismo não pode sobreviver se for exaurido da proteína. De acordo com outras modalidades particulares (não exclusivas), a proteína do organismo microbiano está envolvida na formação de biofilme. A formação de biofilme é um fenômeno bem caracterizado, e múltiplas proteínas envolvidas na formação de biofilme têm sido identificadas e/ou caracterizadas, conforme a pessoa versada estará ciente. Estas proteínas podem diferir entre espécies microbianas (ou podem ser homólogas, mas ter um nome diferente). Exemplos de semelhantes proteínas incluem, mas não estão limitados a, Hwp1, a família Als de proteínas (particularmente em C. albicans), proteínas codificadas pela família do gene EPA, a família do gene AWP1-4 e o gene PWP (particularmente em C. glabrata), Em proteínas de Yersinia codificadas pelos gentes hmsHFRS, gmhA, yrbH, waaAE-coaD, hmsT, hmsP, speA, speC, nghA , rcsA, rcsC , rcsDB, phoPQ (vide a tabela 1 de Zhou and Yang, Protein Cell 2011), em proteínas de Staphylococcus codificadas pelos genes icaADBC, icaR, sar, agr, rbf, sigma(B).
[00670] De acordo com modalidades adicionais, são proporcionados métodos para tratar ou prevenir a formação de biofilme, em que a proteína do organismo microbiano está envolvida na formação de biofilme. De acordo com ainda modalidades adicionais, a formação de biofilme é sobre um objeto, particularmente um dispositivo implantável, tal como um cateter ou um stent.
[00671] Portanto, de acordo com estas modalidades, são proporcionados métodos para prevenir, inibir ou reverter o crescimento de biofilme microbiano sobre uma superfície, compreendendo contactar a superfície com uma molécula da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00672] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00673] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00674] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, ou- tros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; em que no mínimo um Yi é um trecho presente em uma proteína de um organismo microbiano; e
[00675] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00676] O mais particularmente, a proteína do organismo microbiano é uma proteína envolvida na formação de biofilme. A superfície sobre a qual a formação de biofilme é prevenida, inibida ou revertida pode ser uma superfície biótica ou abiótica. Particularmente, a superfície pode estar sobre ou dentro do corpo do sujeito, quer do próprio corpo, ou de um objeto exógeno dentro do corpo, tal como de um dispositivo implantado.
[00677] Embora seja essencialmente prevista para prevenir ou tratar infecções microbianas em sujeitos, deve ser observado que as moléculas podem ser usadas como um agente antimicrobiano para prevenir ou curar clinicamente a presença de microorganismos (patogênicos) sobre superfícies ou objetos fora do corpo do sujeito também. Esta aplicação é essencialmente pretendida para revestimento de material de valor elevado ou estérila, por exemplo, materiais usados para dispositivos implantáveis. Por conseguinte, são proporcionados métodos para prevenir, inibir ou reverter o crescimento de biofilme microbiano sobre uma superfície de um dispositivo implantável, tal como um cateter ou um stent.
[00678] Consequentemente, os dispositivos revestidos também são previstos dentro do âmbito da invenção. O revestimento dos dispositivos pode ser feito diretamente aplicando as moléculas ao dispositivo. Alternativamente, podem ser revestidos sobre o dispositivo usando ligantes (cruzados). Os dispositivos podem ser totalmente revestidos (por exemplo, por submersão do dispositivo em uma solução das mo- léculas), ou somente partes do dispositivo podem ser revestidas. É particularmente previsto que os dispositivos são revestidos com moléculas contra uma proteína presente em um organismo microbiano, particularmente uma proteína envolvida na formação de biofilme. No entanto, também é previsto que os dispositivos são revestidos com moléculas direcionadas contra outras proteínas (ou com moléculas que são bi-específicas e têm por alvo uma proteína de um organismo microbiano e proteína diversa através de diferentes porções Yi). Por exemplo, a implantação de dispositivos frequentemente pode provocar reações imunes adversas localizadas. Estas podem ser neutralizadas revestindo no mínimo parte do dispositivo com moléculas direcionadas contra proteínas envolvidas nestas reações imunes (ou com, por exemplo, moléculas bi-específicas contra as duas proteínas diferentes). Como outro exemplo, para combater infecção concomitante por fungos e bactérias (em particular formadores de biofilme), no mínimo parte do dispositivo pode ser revestida com moléculas direcionadas contra proteínas fúngicas e parte revestida com moléculas direcionadas contra proteínas bacterianas (ou com moléculas que são (no mínimo bi)específicas para uma proteína fúngica e uma proteína bacteriana).
[00679] Portanto, são proporcionados dispositivos (em particular dispositivos implantáveis) que são no mínimo parcialmente revestidos com moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00680] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00681] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00682] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e
[00683] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00684] O mais particularmente, no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano, especificamente uma proteína envolvida na formação de biofilme.
Métodos de triagem
[00685] De acordo com um aspecto adicional, são proporcionados métodos para triagem para novos compostos em linhagens celulares (incluindo, mas não limitadas a, linhagens celulares humanas, de mamíferos, de insetos e de plantas), patógenos ou organismos microbianos. Estes métodos permitem a rápida identificação de compostos os quais têm efeito sobre o crescimento, a reprodução ou a sobrevida da linhagem celular ou do organismo em estudo, ou de compostos os quais inibem a função da proteína e/ou agregam proteínas na referida linhagem celular ou proteína, mesmo sem conhecimento anterior do alvo. No entanto, como a hiporregulação por agregação é sequência-específica, a sequência dos compostos de trabalho vai permitir a rápida identificação do alvo. Portanto, não somente podem ser obtidos novos compostos usando estes métodos de triagem, mas também permitem a identificação de novos alvos dos fármacos. Por este motivo, também pode ser particularmente interessante usar linhagens celulares que modelam doença (tais como por exemplo, linhagens celulares de câncer, ou mesmo células isoladas diretamente a partir de um tumor).
[00686] Os métodos de triagem referidos compreendem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar no mínimo uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00687] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00688] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionados entre R, K e P;
[00689] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente na no mínimo uma proteína identificada na etapa a); e
[00690] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) adicionar a no mínimo uma molécula produzida na etapa b) à proteína da etapa a); e
d) avaliar a função e/ou agregação da proteína.
[00691] Particularmente, os métodos de triagem serão realizados em sistemas celulares, ou diretamente sobre patógenos. Estes métodos envolvem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína da linhagem celular, patógeno ou organismo microbiano no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar no mínimo uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00692] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00693] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionados entre R, K e P;
[00694] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente na no mínimo uma proteína da linhagem celular, patógeno ou organismo microbiano identificada na etapa a); e
[00695] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) adicionar a no mínimo uma molécula produzida na etapa b) à linhagem celular, patógeno, ou organismo microbiano no genoma do qual a proteína da etapa a) é codificada; e
d) avaliação da sobrevida e/ou crescimento ou reprodução da linhagem celular, patógeno ou organismo microbiano.
[00696] Conforme mencionado acima, caso desejado, os métodos podem compreender adicionalmente uma etapa de correlacionar a sequência Yi de uma molécula (sintetizada na etapa b) que afeta a sobrevida, o crescimento e/ou a reprodução da linhagem celular, do patógeno ou do organismo microbiano com uma proteína identificada na etapa a) para identificar a proteína que é visada. No entanto, esta etapa de correlação não é necessária - para compostos antipatogênicos, pode ser mais importante que tenham êxito em inibir a sobrevida, a reprodução ou o crescimento do patógeno do que saber a exata proteína que é visada.
[00697] Como a inibição da sobrevida, do crescimento ou da reprodução do organismo visado é essencialmente prevista para organismos patogênicos (por exemplo, organismos microbianos ou virais), estes métodos são particularmente adequados para triagem para novos compostos antipatogênicos (por exemplo, antimicrobianos ou antivirais) .
[00698] Portanto, de acordo com modalidades específicas, são proporcionados métodos para triagem para novos compostos antipatogênicos. Estes métodos compreendem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína de um patógeno no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifá-tico ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar no mínimo uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00699] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00700] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionados entre R, D e P;
[00701] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo patogênico identificado na etapa a); e
[00702] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) adicionar a no mínimo uma molécula produzida na etapa b) ao organismo patogênico no genoma do qual a proteína da etapa a) é codificada; e
d) avaliação da sobrevida e/ou crescimento ou reprodução do organismo patogênico.
[00703] De acordo com modalidades específicas, são proporciona-dos métodos para triagem para novos compostos antimicrobianos. Estes métodos compreendem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína microbiana no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar no mínimo uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00704] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00705] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionados entre R, D e P;
[00706] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo microbiano identificado na etapa a); e
[00707] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) adicionar a no mínimo uma molécula produzida na etapa b) ao organismo microbiano no genoma do qual a proteína da etapa a) é codificada; e
d) avaliação da sobrevida e/ou crescimento ou reprodução do organismo microbiano.
[00708] Ao avaliar a sobrevida, podem ser determinados os valores da MIC. De modo a identificar um composto com atividade antimicrobiana, isto é, para classificar uma molécula como um hit, a MIC deve ser particularmente menor do que 100 μg/ml, mais particularmente menor do que 50 μg/ml, 20 μg/ml ou o mais particularmente menor do que 10 μg/ml (tal como por exemplo, 5 μg/ml, 2 μg/ml ou 1 μg/ml.
[00709] Embora os valores da MIC sejam tipicamente expressados em μg/ml, deve ser observado que o peso molecular dos presentes compostos é em média significativamente maior do que os de compostos antibióticos clássicos. Na verdade, considerando que um antibiótico tipicamente tem uma massa molecular na faixa de 200 a 700 Dalton, devido à presença de aminoácidos em no mínimo as porções X e Y, e devido ao fato de que mais de uma ‘unidade’ podem estar presentes nas moléculas (isto é, n pode ser maior do que um), o peso molecular tipicamente será (muito) maior do que 1000 Dalton. Em consequência, uma concentração molar similar proporcionará massas moleculares muito maiores, e portanto valores da MIC muito maiores. Em outras palavras, para determinar o efeito antimicrobiano eficaz, pode ser interessante calcular o equivalente molar dos valores em μg/ml (e por exemplo, comparar estes com valores molares para outros antibióticos).
[00710] De acordo com modalidades adicionais específicas, são proporcionados métodos para triagem para novos compostos antivirais. Estes métodos compreendem as etapas de:
  • a) identificar em no mínimo uma proteína viral no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
  • b) sintetizar no mínimo uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00711] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00712] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P, o mais particularmente selecionados entre R, D e P;
[00713] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo viral identificado na etapa a) ; e
[00714] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
c) adicionar a no mínimo uma molécula produzida na etapa b) ao organismo viral no genoma do qual a proteína da etapa a) é codificada; e
d) avaliação da sobrevida e/ou crescimento ou reprodução do organismo viral.
[00715] Tipicamente, para os virus, a sobrevida pode ser medida indiretamente avaliando o efeito (por exemplo, a sobrevida) sobre células infectadas. Este método indireto também pode ser aplicado para outros organismos patogênicos. No entanto, métodos diretos são geralmente preferenciais, uma vez que são mais quantitativos. Para os vírus, pode ser determinado o título viral. Alternativamente, pode ser estabelecido um sistema de minireplicon no qual somente proteínas virais particulares estão presentes, e onde uma proteína repórter é uma indicação do efeito sobre a reprodução ou a ‘sobrevida’ do vírus.
[00716] Digno de nota, embora os métodos de triagem sejam descritos aqui, neste pedido de patente, como métodos para identificar novos compostos antipatogênicos, a pessoa versada vai reconhecer prontamente que estes métodos também podem ser usados para identificar novos compostos direcionados contra proteínas não patogênicas para selecionar o composto mais eficaz. Por exemplo, moléculas previstas para tratar uma doença por hiporregulação de uma proteína podem ser primeiro triadas para eficácia em uma célula ou modelo animal com uma leitura adequada (contanto que a conservação de sequência da região correspondente ao no mínimo um trecho Yi seja suficiente para usar o mesmo composto na célula ou no modelo animal e o organismo ao qual o composto deve ser administrado). Isto pode ser feito, por exemplo, para proteínas que contêm diferentes regiões de beta-agregação, ou para identificar a melhor combinação de regiões de beta-agregação.
[00717] Na verdade, similar a métodos de triagem para moléculas que afetam o crescimento, a reprodução e/ou a sobrevida de organismos patogênicos (e que em consequência podem ser usados no tratamento de doença infecciosa), os métodos podem ser usados para triagem para moléculas que podem ser usadas em doença não infec- ciosa. Os métodos podem ser usados para identificar o composto mais eficaz contra um alvo conhecido (por exemplo, por triagem em uma linhagem celular que tem um repórter ligado à atividade alvo, ou que depende da presença do alvo para sua sobrevida), ou para identificar novos alvos. O último é particularmente verdadeiro para aplicações onde morte celular pode ser uma leitura, uma vez que não dependem de um ensaio repórter. No entanto, os métodos podem ser usados para identificar novos alvos em um caminho para o qual um ensaio repórter também estádisponível.
[00718] Os métodos de triagem apresentados aqui, neste pedido de patente, proporcionam consideráveis vantagens em relação aos métodos de triagem existentes. Por um lado, não são triagens aleatórias, e portanto é mais provável que produzam compostos de cuscesso. Por outro lado, não é necessário que estruturas de proteínas alvo estejam disponíveis para eficiente triagem, uma vez que o direcionamento é inteiramente à base de sequência. A identificação de novos alvos é conhecida por ser um problema particular para antimicrobianos ou antibióticos.
[00719] De modo a assegurar que o composto identificado seja eficaz e sem efeitos colaterais, a toxicidade do composto deve ser testa-dad, particularmente sobre vertebrados, o mais particularmente em sistemas de mamíferos. Além disso, de modo a evitar o direcionamento de proteínas não relevantes (por exemplo, proteínas não microbianas no caso de ser identificada uma nova molécula antibiótica), deve ser testada a reatividade cruzada. Isto pode em, primeira instância ser feito facilmente comparando a sequência identificada na etapa a) a sequências de organismos / espécies às quais o composto (por exemplo, composto antimicrobiano ou antiviral ) deve ser administrado, por exemplo, por programas de alinhamento de sequência tais como BLAST. Para moléculas direcionadas contra patógenos (a serem usadas em aplicações anti-infecciosas), é particularmente previsto que a uma ou mais porções Yi que são idênticas a trechos em proteínas patogênicas (por exemplo, microbianas) presentes nas moléculas não são codificadas no genoma do organismo / sujeito (tipicamente mamífero, particularmente humano) ao qual as moléculas são administradas.
[00720] Em modalidades cobrindo métodos para identificar novos alvos para compostos antipatogênicos (por exemplo, antimicrobianos), é particularmente previsto que a proteína patogênica (por exemplo, microbiana) na etapa a) não é um alvo conhecido para fármacos (por exemplo, antibióticos). Isto tornaria os compostos identificados particularmente úteis em terapia de combinação, uma vez que são combatidos diferentes alvos. Além disso, se o alvo não for um alvo conhecido para fármacos (tais como antibióticos), ainda não foi desenvolvida nenhuma resistência a fármaco (antibiótico).
[00721] Outra vantagem particular é que os métodos de triagem podem ser realizados sem propensão de seleção para uma proteína em particular como um alvo interessante. Na verdade, todo o proteoma do organismo (ou linhagem celular) pode ser analisado, e as sequências adequadas podem ser usadas dentro de moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, e testadas para eficácia. Isto tem uma alta probabilidade de produzir novos alvos. Além disso, quando semelhante análise é realizada, particularmente para aplicações antipatogênicas é previsto que as regiões identificadas na etapa a) são regiões que ocorrem mais de uma vez no proteoma. Mais particularmente, a no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos identificada na etapa a) ocorre em mais de uma proteína do organismo patogênico (por exemplo, microbiano ou viral).
[00722] Na verdade, quando confrontado com infecção, em muitos casos, é desejável ter por alvo mais de um organismo patogênico. Isto é evidente, por exemplo, em infecções com organismos microbianos, onde frequentemente são usados antimicrobianos de amplo espectro. Isto permite combater infecção mesmo sem conhecer a identidade precisa do organismo infeccioso. Nos presentes métodos, também pode ser assegurado que a no mínimo uma região de 4 a 16 aminoácidos contíguos identificada na etapa a) ocorre em uma proteína, ou no mínimo uma proteína, de mais de um organismo microbiano.
[00723] O mais particularmente, os organismos microbianos visados aqui, neste pedido de patente, são organismos microbianos patogênicos. De modo a assegurar que organismos microbianos benéficos não sejam destruídos (por exemplo, microorganismos benéficos na flora intestinal de um sujeito), pode ser verificado se o trecho identificado no organismo microbiano é específico para o um ou mais organismos patogênicos e não ocorre em microorganismos benéficos.
Isolamento, depleção, detecção e diagnóstico
[00724] Em outra modalidade a invenção proporciona um método para isolar uma proteína específica a partir de uma amostra compreendendo contactar a referida amostra com no mínimo uma molécula de interferon e isolar o complexo de interferon-proteína co-agregado resultante da referida amostra. Isto é, a molécula de interferon age como um agente de ligação que arrebata a proteína-alvo. Esta pode ser usada em todos os campos onde é necessária detecção (por exemplo, em biotecnologia branca para medir os níveis de poluentes, em biotecnologia vermelha ou verde para medir, por exemplo, os níveis de biomarcadores ou metabólitos, etc.).
[00725] Em uma modalidade adicional o método para o isolamento de uma proteína específica para uma amostra compreende adicionalmente a separação da referida no mínimo uma proteína da amostra. Uma aplicação da separação de no mínimo uma proteína de uma amostra é a remoção (ou depleção) de proteínas altamente abundantes de uma amostra. Na verdade, um desafio importante em descober- ta e validação de proteina-alvo é como especificamente dissecar amostras de proteínas complexas (por exemplo, plasma, urina, fluido cerebrospinal) e medir alvos traço (isto é, alvos abundantes muito baixos). Tipicamente, proteínas abundantes são frequentemente 6 a 10 ordens de magnitude mais concentradas do que proteínas de baixa abundância. Portanto em determinadas ocasiões proteínas altamente abundantes devem ser removidas para detectar e medir proteínas traço de importância médica. Uma vez que albumina, IgG, antitripsina, IgA, transferrina e haptoglobina compõem aproximadamente 90% do teor de proteína total no soro humano, existe uma necessidade crucial de ferramentas de diagnóstico para rapidamente depletar estas proteínas abundantes indesejadas e revelar os biomarcadores de proteínas de baixo peso molecular, menos abundantes. Vários métodos já são usados na arte: 1) imunoglobulina G (IgG) como reagentes de afinidade para capturar e separar alvos de proteínas abundantes, 2) imunoglobulina da gema (IgY) são anticorpos semelhantes a IgG isolados a partir da gema do ovo de aves imunizadas, 3) pré-fracionamento é usado para separar uma mistura de proteínas em diferentes frações para remover determinadas proteínas na mistura original, e 4) proteína A e proteína G são proteínas da parede celular bacteriana com uma especificidade para anticorpos de IgG, portanto resinas de afinidade com proteína A e G proporcionam uma remoção de IgG e 5) microcontas de IgG e de IgY são usadas para detecção de proteína.
[00726] Em outra modalidade específica o método para o isolamento de no mínimo uma proteína compreende adicionalmente a detecção de no mínimo uma proteína no referido complexo de molécula -proteína. A detecção pode ser realizada separando o um ou mais complexos de molécula de interferon-proteína-alvo por meio de, por exemplo, eletroforese, cromatografia de coluna, filtração, atração eletrostática, atração magnética ou paramagnética, espectrometria de massa e semelhantes.
[00727] De acordo com um aspecto adicional, as moléculas de interferon, conforme adicionalmente definido nas reivindicações, são usadas em detecção ou como um diagnóstico. Portanto as moléculas de interferon, conforme adicionalmente definido nas reivindicações, podem ser usadas em um método de diagnóstico. Por conseguinte, são proporcionados métodos para detecção e diagnóstico.
[00728] Portanto, são proporcionados métodos para detectar uma proteína em uma amostra, compreendendo as etapas de:
  • a) contactar uma amostra suspeita de conter a proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00729] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00730] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00731] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada; e
[00732] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
b) detectar a presença de moléculas reagidas com a proteína.
[00733] A amostra pode ser proporcionada como tal ou pode ser pré-processada. As ‘moléculas reagidas com a proteína’ na etapa b) contempla tanto moléculas reagindo com a proteína (isto é, detecção em tempo real) como moléculas que tenham reagido com a proteína. Estas moléculas ainda podem estar em contato com a proteína ou podem não estar mais em contato. Esta detecção também podem ser feita através da proteína, isto é, por detecção da presença de proteína reagida com as moléculas. Em ambos os casos a detecção pode ser direta (medindo as moléculas ou proteínas que tenham reagido) ou indireta (medindo a fração que não tenha reagido).
[00734] De acordo com modalidades particulares, o no mínimo um Yi que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada é único para a referida proteína na referida amostra. Portanto, por exemplo, em uma amostra de origem humana, a sequência também ocorrendo na proteína a ser detectada é codificada somente uma vez no genoma humano (ou ocorre somente uma vez no proteoma humano), isto é, na (sequência codificando a) proteína a ser detectada. Embora esta singularidade não seja sempre necessária - por exemplo, quando diferentes proteínas têm a mesma sequência e são detectadas juntas, elas ainda podem ser adicionalmente discriminadas, por exemplo, com base no tamanho - é particularmente previsto para facilitar a detecção. A parte ‘na referida amostra’ é importante na determinação da singularidade do do trecho da proteína: por exemplo, se a amostra for pré-processada, é provável que contenha menos proteínas diferentes do que detecção em misturas complexas ou em amostras de diferentes (micro-)organismos.
[00735] Deve ser observado que os presentes métodos de detecção são altamente similares a métodos estabelecidos, tipicamente métodos de detecção à base de anticorpo. A diferença significativa é a uso das moléculas particulares. De fato, deve ser observado que nos métodos de detecção descritos aqui, neste pedido de patente, as mo- léculas conforme definido aqui, neste pedido de patente, desempenham um papel similar a anticorpos. Portanto, em métodos de detecção os quais são normalmente à base de anticorpo, as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, podem substituir no mínimo um anticorpo. Por exemplo, moléculas onde no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada podem substituir um anticorpo primário em provas de detecção (e podem ser rotuladas ‘interferons primários’), moléculas onde Yi é um trecho que ocorre naturalmente em um anticorpo primário usado para detecção podem substituir um anticorpo secundário. Alternativamente, a molécula de interferon secundário pode ser direcionada para uma etiqueta ou etiqueta fundida a um anticorpo primário, ou pode ser direcionada para um ‘interferon primário’ ou porção fundida ao mesmo.
[00736] De acordo com modalidades específicas, a molécula usada para detecção compreende uma etiqueta detectável. De acordo com modalidades adicionais específicas, a detecção na etapa b) é através de detecção da etiqueta detectável.
[00737] De acordo com modalidades particulares, os métodos adicionalmente compreendem uma separação de moléculas reagidas com a proteína e moléculas não reagidas com a proteína antes de detecção na etapa b). O oposto também pode ser feito: separando as proteínas reagidas com as moléculas das proteínas não reagidas com as moléculas antes de detecção. Qual das duas é separada tipicamente depende da configuração do experimento, e por exemplo, se proteínas ou moléculas são imobilizadas.
[00738] A detecção na etapa b) pode ser direta ou indireta, por exemplo, através de detecção da fração não reagida de moléculas. A detecção pode ser qualitativa (por exemplo, a proteína está presente ou não), semi-quantitativa (por exemplo, há mais ou menos da proteína presente) ou quantitativa (por exemplo, quanto da proteína está presente).
[00739] De acordo com modalidades particulares, a amostra é de um sujeito, particularmente de um sujeito mamífero, o mais particularmente de um sujeito humano. No entanto, a princípio, qualquer proteína contendo uma região de nucleação de agregação pode ser detectada, portanto a fonte da amostra pode ser de qualquer organismo (por exemplo, plantas, insetos, patógenos, mamíferos). A amostra não precisa igualmente ser de um organismo, contanto que contenha proteínas. Por exemplo, pode ser uma amostra de fluido (por exemplo, água, cerveja) onde a presença de proteínas (por exemplo, hormônios, estrogênios) é medida, ou pode ser uma amostra de alimento ou ração. É importante salientar que, para amostras originárias de um organismo, a amostra e a proteína a ser detectada não precisam de da mesma espécie. Por exemplo, no caso de detectar a presença de um patógeno, é previsto que uma amostra será colhida de um sujeito ou planta, enquanto a proteína a ser detectada é de um patógeno (por exemplo, vírus ou microorganismo).
[00740] De modo geral um método de diagnóstico inclui as seguintes etapas: i) uma fase de examinação (a coleta de dados, isto é, a detecção qualitativa ou quantitativa de um biomarcador de proteína em uma amostra), ii) a comparação dos dados obtidos com valores padrão (por exemplo, de amostras de sujeitos não doentes), iii) a descoberta de qualquer desvio significativo entre os dados obtidos e os dados de referência (isto é, comparando os dados) e iv) atribuindo o desvio a um quadro clínico em particular (sujeito animal) ou status (sujeito vegetal). Notar que estas etapas também podem ser tomadas para métodos de detecção regulares. Neste caso, o status obtido na etapa iv) não é de um estado de doença, mas por exemplo, a presença de poluentes.
[00741] Por conseguinte, em modalidades específicas, a presença, ausência ou quantidade de proteína detectada na amostra é indicativa de um estado de doença (ou de saúde). Um estado de doença semelhante pode ser por exemplo, presença de doença, ausência de doença (isto é, a descoberta de saúde), progressão da doença (por exemplo, malignidade, metástase, resposta à terapia). Exemplos de proteínas associadas com estado de doença, por exemplo, biomarcadores, são bem documentados na arte. Portanto, são proporcionados métodos para a detecção de um biomarcador de proteína (isto é, uma proteína indicativa de estado de doença) em uma amostra compreendendo contactar a referida amostra com no mínimo um interferon, com uma especificidade para o referido biomarcador de proteína, opcionalmente isolando o complexo de interferon-biomarcador de proteína co-agregado resultante a partir da amostra referida e detectando o referido interferon-biomarcador de proteína. Biomarcadores de proteína são usados crescentemente na clínica para prever o surto de doença, diagnosticar esta, monitorar sua progressão, e proporcionar prognóstico quanto a sua responsividade a terapêuticos (isto é, em prognóstico de resposta a terapêuticos, eventos adversos e interações com fármaco e no estabelecimento do risco basal). Exemplos de conhecimento geral de biomarcadores para sujeitos humanos incluem antígeno prostático específico (PSA) para (detecção precoce de) câncer de próstata, antígeno carcinoembrionário para câncer gastrointestinal, proteína C-reativa (CRP) para inflamação sistêmica, fator reumatoide, anticorpo anti- peptídeo citrulinado cíclico (anti-CCP) para artrite reumatoide, MMP-3 para lesão articular e anticorpos beta amiloides para doença de Alzheimer. Biomarcadores de proteína são teoricamente melhores do que marcadores de mRNA devido a sua aumentada estabilidade e à gama mais ampla de tecnologias para os estudar. A explosão de interesse na pesquisa de biomarcadores está impulsionando o desenvolvimento de novos produtos preditivos, de diagnóstico e prognóstico na prática médica moderna, e os biomarcadores também estão de- sempenhando um papel cada vez mais importante na descoberta e no desenvolvimento de novos fármacos. Os biomarcadores de proteína podem ser identificados em fluidos corporais (por exemplo, soro, urina, sangue, saliva, lágrimas, líquido cefalorraquidiano, fluido sinovial, sangue, fluido de aspiração do mamilho, ascite, esperma, suor, um biópsia tumoral). Os biomarcadores podem ser divididos nas categorias de preditivos ou de prognóstico. Um biomarcador de prognóstico está associado com a probabilidade de um resultado tal como sobrevida, resposta (por exemplo, a uma terapia em particular) e recidiva. Um biomarcador preditivo é um biomarcador que está presente antes da ocorrência de um evento e o qual prevê este resultado. Um biomarcador preditivo pode ser ou positivo ou negativo. Os biomarcadores podem ser usados não somente para diagnosticar uma doença mas também para seleção ou seguimento de pacientes. À medida que a pesquisa continua, tem evoluído o entendimento do papel que os biomarcadores podem desempenhar no manejo de áreas de doenças tais como câncer, cardiologia, neurologia, doenças metabólicas, autoimunes e inflamatórias.
[00742] Uma lista não limitante de biomarcadores de proteína os quais podem ser detectados com as moléculas de interferon e os métodos da presente invenção compreende o diagnóstico de biomarcadores de câncer pulmonar (conforme descrito na patente internacional No. WO2005098445), o diagnóstico de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (conforme descrito na patente internacional No. WO2005034727), o diagnóstico de aneurisma aórtico abdominal (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. WO2009046267), o diagnóstico de doenças mediadas pelo HTLV (conforme descrito na patente internacional No. WO2004029575), o diagnóstico de carcinoma ductal da mama (conforme descrito na patente internacional No. WO2009039023), o diagnóstico de câncer de próstata (conforme des- crito na patente internacional No. WO2004030511), o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono (conforme descrito na patente internacional No. WO2006020567), o prognóstico de pacientes com GBM tratados com Gefitinib (conforme descrito na patente internacional No. WO2010033993), o diagnóstico do surto e/ou progressão de esclerose lateral amiotrófica (conforme descrito na patente internacional No. WO2006060799), o diagnóstico de disfunção cognitiva branda e doença de Alzheimer (conforme descrito na patente internacional No. WO2008014314), o diagnóstico de fibrose hepática (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US20100323374), o diagnóstico de lesão do sistema nervoso (conforme descrito na patente Européia No. EP2207033), a detecção de dano muscular esquelético (conforme descrito na patente internacional No. WO2007066129), o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono (conforme descrito na patente internacional No. WO2006020567), o diagnóstico de carcinomas de mama malignos (conforme descrito na patente internacional No. WO20052463), o diagnóstico de distúrbios urológicos (conforme descrito na patente internacional No. WO2010078403), a experimentação in vitro de toxicidade e embriotoxicidade do desenvolvimento (conforme descrito na patente internacional No. WO2009146915), o prognóstico e resultado do tratamento de glioblastoma (conforme descrito na patente internacional No. WO2009102729), a avaliação de lesão por radiação e exposição a such (conforme descrito na patente internacional No. WO2008140463), a detecção de câncer do fígado (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US20050202485), a detecção de carcinoma nasofaringeano (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US20050158745), a detecção de câncer de ovário (conforme descrito na patente internacional No. WO2003057014), o prognóstico da resposta clínica a anticorpos anti-TNF-alfa em pacientes com artrite psoriática (conforme descrito na patente internacional No. WO2011014349), a de-tecção de biomarcadores salivares para a identificação de câncer oral e doença periodontal (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US20110021370), o diagnóstico de esôfago de Barrett e adenocarcinoma de esôfago (conforme descrito na patente internacional No. WO2010115077), o diagnóstico de fibrilação atrial e derrame (conforme descrito na patente internacional No. WO2010113185), o prognóstico de rejeição de aloenxerto (conforme descrito na patente internacional No. WO2010093869), o prognóstico da resposta clínica a anticorpos anti-TNF em pacientes com espondilite anquilosante (conforme descrito na patente internacional No. WO2010077722), o diagnóstico de cistite intersticial (conforme descrito na patente internacional No. WO2010068747), o diagnóstico e o prognóstico de septicemia (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US20100292131), o prognóstico para câncer colorretal metacrono (conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US20090155842), o monitoramento do tratamento de ALS com nimesulida (conforme descrito na patente internacional No. WO2004043444).
[00743] De acordo com modalidades adicionais específicas onde um biomarcador de proteína é detectado (isto é, no mínimo um Yi nas moléculas é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína a qual é indicativa de um estado de doença), estes métodos compreendem além das etapas a) e b) esboçadas acima uma etapa c) correlacionando a presença, a ausência ou a quantidade de proteína detectada na amostra com um estado de doença no sujeito.
[00744] Como um equivalente, são proporcionadas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00745] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00746] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos seleciona- dos entre R, K, E, D e P;
[00747] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína a qual é indicativa de um estado de doença; e
[00748] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00749] para uso no diagnóstico do referido estado de doença.
[00750] Notar que os mesmos métodos podem ser usados em plantas, para determinar o estado de doença da planta.
[00751] Uma modalidade específica dos métodos acima é o diagnóstico da presença de infecção. De acordo com esta modalidade, a proteína indicativa de estado de doença (isto é, infecção) é uma proteína de um patógeno (causa da infecção, e portanto indicativa de infecção). Por conseguinte, são proporcionados métodos da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00752] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00753] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
[00754] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F esti- ver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em um patógeno; e
[00755] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
[00756] para uso em diagnóstico de infecção com o referido patógeno.
[00757] Novamente, estes métodos de diagnóstico podem ser aplicados a sujeitos bem como a plantas (ou outros organismos nos quais uma infecção pode estar presente).
[00758] No entanto, diagnóstico não precisa ser sempre de um estado de doença. Conforme mencionado, alguns métodos de detecção podem ser usados para determinar níveis de proteína em amostras não derivadas de um sujeito (conforme tipicamente encontrado em biotecnologia industrial), ou podem ser usados para determinar níveis de proteína (por exemplo, metabólito) em amostars de organismos sem isto ser ligado a doença. Este é particularmente o caso em biotecnologia de plantas, o mais particularmente para plantas transgênicas. Na verdade, pode ser útil medir níveis aumentados ou reduzidos de proteína, por exemplo, para avalias quais plantas têm os níveis de expressão mais elevados de uma proteína útila, ou quais plantas têm menos expressão de proteínas prejudiciais ou proteínas as quais tornam a planta desagradável ao paladar, ou quais plantas têm uma melhor resposta a condições de stress.
[00759] Como diagnósticos in vitro são previstos aqui, neste pedido de patente, também são proporcionados kits compreendendo no mínimo uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente, e no mínimo um tampão adequado. Um kit semelhante idealmente será adaptado para o protocolo de detecção específico usado. Os kits podem conter qualquer uma das composições farmacêuticas ou composições agroquímicas descritas aqui, neste pedido de patente. Além disso, o kit pode conter um ou mais dispositivos, tipicamente dispositivos usados para detecção da proteína, tais como suportes sólidos (por exemplo, placas, micro-arranjos, nanopartículas, ...), opcionalmente pré-revestidos com as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente. O kit pode adicionalmente conter instruções para uso. Obviamente, os kits não precisam ser limitados a aplicações de diagnóstico ou de detecção. No entanto, no caso de kits proporcionados para tratamento de sujeitos animais ou plantas, os kits opcionalmente vão conter dispositivos para fins de administração (por exemplo, uma seringa, um recipiente com bocal de pulverização) ao invés de dispositivos de laboratório.
[00760] Na arte anterior são conhecidos uma variedade de diferentes maneiras para avaliação dos níveis de proteína (ou biomarcadores de proteína), um tipo representativo e conveniente de protocolo para avaliar os níveis de proteína é ELISA. Em ensaios ELISA e ensaios à base de ELISA, um ou mais anticorpos específicos para as proteínas de interesse (ou biomarcadores de proteína) podem ser imobilizados sobre uma superfície sólida selecionada, preferencialmente uma superfície apresentando uma afinidade com a proteína tal como as cavidades de uma placa de microtítulo de poliestireno. Depois de lavagem para remover o material incompletamente adsorvido, as cavidades da placa de ensaio são revestidas com uma proteína de "bloqueio" inespecífica que é conhecida por ser antigenicamente neutra com respeito à amostra de ensaio tal como albumina sérica bovina (BSA), caseína ou soluções de leite em pó. Isto permite o bloqueio de sítios de adsorção inespecífica sobre a superfície de imobilização, deste modo reduzindo o fundo causado por ligação inespecífica de antígeno sobre a superfície. Depois de lavagem para remover proteína de bloqueio não ligada, a superfície de imobilização é contactada com a amostra a ser testada sob condições que são propícias para a formação de complexo imune (antígeno / anticorpo). As condições referidas incluem diluição da amostra com diluentes tais como BSA ou gama globulina bovina (BGG) em salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween ou PBS/Triton-X 100, os quais também tendem a ajudar na redução de fundo inespecífico, e permitindo que a amostra incube por cerca de 2 a 4 horas em temperaturas da ordem de cerca de 25° a 27°C (embora possam ser usadas outras temperaturas). Depois de incubação, a superfície contactada com anti-soros é lavada de modo a remover material que não formou imunocomplexos. Um procedimento de lavagem exemplar inclui lavagem com uma solução tal como PBS/Tween, PBS/Triton-X 100, ou tampão de borato. A ocorrência e a quantidade de formação de imunocomplexo pode ser então determinada submetendo os imunocomplexos ligados a um segundo anticorpo tendo especificidade para o alvo que difere do primeiro anticorpo e detectando ligação do segundo anticorpo. Em determinadas modalidades, o segundo anticorpo terá uma enzima associada, por exemplo, urease, peroxidase, ou fosfatase alcalina, as quais vão gerar um precipitado colorido depois de incubação com um substrato cromogênico apropriado. Por exemplo, pode ser empregada uma IgG anti-humana conjugada a urease ou peroxidase, por a período de tempo e sob condições as quais favorecem o desenvolvimento da formação de imunocomplexo (por exemplo, incubação por 2 horas em temperatura ambiente em uma solução contendo PBS tal como PBS/Tween). Depois de semelhante incubação com o segundo anticorpo e lavagem para remover o material não ligado, a quantidade de etiqueta é quantificada, por exemplo, por incubação com um substrato cromogênico tal como uréia e púrpura de bromocresol no caso de uma etiqueta de urease ou ácido 2,2'-azino-di-(3-etil- benztiazolina)-6-sulfônico (ABTS) e H2O2, no caso de uma etiqueta de peroxidase. Em seguida é realizada quantitação medindo o grau de geração de cor, por exemplo, usando um espectrofotômetro do espectro visível. Alternativamente, o formato precedente pode ser alterado primeiro ligando a amostra à placa de ensaio. Então, anticorpo primário é incubado com a placa de ensaio, seguido por detecção de anticorpo primário ligado usando um segundo anticorpo marcado com especificidade para o anticorpo primário. Alternativamente, podem ser empregados métodos não à base de ELISA para medir os níveis de um ou mais biomarcadores de proteína em uma amostra. Exemplos representativos incluem mas não estão limitados a espectrometria de massa, arranjos proteômicos, xMAP™ tecnologia de microsferas, citometria de fluxo, western blotting, e imunohistoquímica. De acordo com os métodos da invenção, e adicionalmente exemplificado na seção de exemplos, o anticorpo primário é substituído por um interferon específico o qual liga ao biomarcador de proteína. Em uma modalidade específica o interferon referido é marcado com uma molécula de detecção.
[00761] Em uma modalidade específica o substrato sólido sobre o qual o interferon ou interferons específicos são imobilizados pode ser feito de uma ampla variedade de materiais e em uma ampla variedade de formatos, por exemplo, placa de microtítulo, microconta, vareta, partícula de resina, etc. O substrato pode ser escolhido para maximizar as proporções de sinal para ruído, para minimizar a ligação de fundo, bem como para facilidade de separação e custo. As lavagens podem ser efetuadas em uma maneira mais apropriada para o substrato sendo usado, por exemplo, removendo uma conta ou vareta de um reservatório, empregando ou diluindo um reservatório tal como uma cavidade de placa de microtítulo, ou enxaguando uma conta, partícula, coluna cromatográfica ou filtro com uma solução de lavagem ou solvente.
[00762] Em uma modalidade particular a detecção de um biomarcador de proteína específica é quantitativa. Em outra modalidade particular a detecção de um biomarcador de proteína específica é qualitativa. Deste modo, onde a detecção é qualitativa, os métodos proporcionam uma leitura ou avaliação, por exemplo, avaliação, de se ou não o biomarcador de proteína está presente na amostra que está sendo avaliada. Em ainda outras modalidades, os métodos proporcionam uma detecção quantitativa de se o biomarcador de proteína está presente na amostra que está sendo avaliada, isto é, uma avaliação ou apreciação da real quantidade ou relativa abundância do analito alvo. Em semelhantes modalidades, a detecção quantitativa pode ser absoluta ou, se o método for um método de detecção de dois ou mais biomarcadores de proteína diferentes em uma amostra, relativa. Deste modo, o termo "quantificação" quando usado no contexto de quantificação de um biomarcador de proteína em uma amostra pode se referir a quantificação absoluta ou a quantificação relativa. Quantificação absoluta pode ser realizada por inclusão de uma ou mais concentrações conhecidas de um ou mais biomarcadores de proteína de controle e fazendo referência ao nível detectado do biomarcador de proteína com os biomarcadores de proteína de controle (por exemplo, através de geração de uma curva padrão). Alternativamente, quantificação relativa pode ser realizada por comparação dos níveis detectados ou quantidades entre dois ou mais biomarcadores de proteína diferentes para proporcionar uma quantificação relativa de cada um dos dois ou mais biomarcadores de proteína diferentes, por exemplo, um em relação ao outro.
[00763] Em determinadas modalidades é avaliada a detecção de somente um biomarcador de proteína. Em ainda outras modalidades, é avaliada a expressão de dois ou mais, por exemplo, cerca de 3 ou mais, cerca de 10 ou mais, cerca de 15 ou mais biomarcadores de proteína. Um modo típico no qual isto pode ser feito é usando um microar- ranjo de ligação de proteína (vide abaixo).
[00764] Em semelhantes modalidades, o prognóstico, diagnóstico, ou caracterização pode ser proporcionado provendo, isto é, gerando, um relatório por eescrito que inclui a avaliação de monitoramento do técnico, isto é, o prognóstico do técnico do início de uma doença em particular, o diagnóstico do técnico da doença do sujeito, ou a caracterização do técnico do prognóstico da doença do sujeito. Portanto, um método em questão pode incluir adicionalmente uma etapa de gerar ou produzir um relatório proporcionando os resultados de uma avaliação de monitoramento, cujo relatório pode ser proporcionado sob a forma de um meio eletrônico (por exemplo, um display eletrônico em um monitor de computador), ou sob a forma de um meio tangível (por exemplo, um relatório impresso sobre papel ou outro meio tangível). Um "relatório," conforme descrito aqui, neste pedido de patente, é um documento eletrônico ou tangível o qual inclui elementos de relatório que proporcionam informação de interesse relativa a avaliação de monitoramento de um sujeito e seus resultados. Um relatório em questão sujeito report pode ser completamente ou parcialmente gerado eletronicamente. Um relatório em questão pode incluir adicionalmente um ou mais de: 1 ) informação relativa à instalação de ensaio; 2) informação do serviço de provedor; 3) dados do paciente; 4) dados da amostra; 5) um relatório de avaliação, o qual pode incluir várias informações inclusive: a) valores de referência empregados, e b) dados de ensaio, onde dados de ensaio podem incluir, por exemplo, uma determinação do nível de proteína; 6) outras características.
[00765] O relatório pode incluir informação sobre a instalação de ensaio, cuja informação é relevante para o hospital, clínica, ou laboratório no qual foi conduzida a obtenção de amostra e/ou a geração de dados. Obtenção de amostra pode incluir obtenção de uma amostra de fluido, por exemplo, sangue, saliva, urina etc. de umaa amostra de te- cido, por exemplo, uma biópsia de tecido, etc. de um sujeito. Geração de dados pode incluir medição do nível de concentração de biomarcador de polipeptídeo para um ou mais biomarcadores que são diferencialmente expressados ou estão presentes em diferentes níveis em diferentes sujeitos.
[00766] Em muitas modalidades, os sujeitos estão dentro da classe dos mamíferos, incluindo as ordens dos carnívoros (por exemplo, cães e gatos), roedores (por exemplo, camundongos, porquinhos da índia, e ratos), lagomorfos (por exemplo, coelhos) e primatas (por exemplo, humanos, chimpanzés, e macacos). Em determinadas modalidades, os animais ou hospedeiros, isto é, sujeitos (também referidos aqui, neste pedido de patente, como pacientes) são humanos.
[00767] Conforme explicado acima aqui, neste pedido de patente, as technologies de bio-detecção mais amplamente usadas são baseadas na uso de anticorpos. Os anticorpos reconhecem e ligam a outras moléculas com base em seu formato e propriedades fisicoquímicas. Os anticorpos são altamente adequados para detecção de pequenas quantidades de proteínas alvo na presença de misturas complexas de proteínas. A presente invenção mostra que a uso de moléculas de interferon é uma alternativa para a uso de anticorpos (como o elemento de reconhecimento) para a captura específica de proteínas alvo. Na verdade, moléculas de interferon podem ser usadas em numerosas aplicações nas quias anticorpos são tipicamente usados. Para nomeas somente algumas, são previstas aplicações em diagnóstico, micro-analítica, forense e na detecção específica de patógenos. Para as aplicações de detecção e separação da invenção pode ser conveniente que a molécula de interferon seja ligada a um veículo (ou um suporte). Um suporte pode ser uma superfície lisa tal como plástico ou nitrocelulose ou uma coluna cromatográfica mas é preferencialmente uma conta tais como contas de microsferas. Uma discussão geral so- bre vários tipos de contas e microsferas, as quais servem para o propósito de ligação de moléculas de interferon, é descrita às páginas 9 e 10 da patente dos Estados Unidos No. US6682940 e é especificamente incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência. Em uma modalidade particular a molécula de interferon é ligada a um tipo de carboidrato de veículo, por exemplo, celulose ou agarose. Um interferon pode ser ligado ao referido veículo carboidrato de com um agente de reticulação tal como glutaraldeído. Em outra modalidade particular o veículo pode ser celulose, vidro ou um polímero sintético. A anexação covalente entre o interferon e o veículo pode ser realizada através de resíduos aminoácidos do interferon e uma azida, uma carbodiimida, um isocianato ou outros derivados químicos presentes sobre o interferon.
[00768] Em ainda outra modalidade particular, o veículo é uma micro conta de vidro silanizado poroso. O interferon pode ser ligado de modo covalente ao veículo através de seus grupamentos de amina do peptídeo (por reação de Schiff seguida por redução com boridreto de sódio) a grupamentos de aldeído formados por oxidação por periodato de grupamentos de glicidoxipropilsilano ligados quimicamente aos átomos de sílica (esta ligação é descrita em Sportsman and Wilson (1980) Anal. Chem. 52, 2013-2018).
[00769] Em uma modalidade específica o veículo é envelopado por um filme proteináceo ao qual o interferon é reticulado (vide as reivindicações 1 a 50 e os exemplos relativos ao veículo no pedido de patente dos Estados Unidos No. US4478946).
[00770] Em outra modalidade específica o suporte é uma conta fluorescente tal como uma partícula de latex fluorescente. A patente dos Estados Unidos No. US4550017, e especialmente à página 4 na mesma, descreve compostos fluorescentes os quais podem ser usados para a fabricação de contas fluorescentes.
[00771] Em outra modalidade específica as contas variam de tamanho e também podem conter ou ser impregnadas com pigmentos fluorescentes. Devido aos variáveis tamanhos e pigmentos das contas, múltiplas proteínas podem ser detectadas e quantificadas em uma única reação. Procedimentos para desenvolvimento de semelhantes contas são descritos na patente dos Estados Unidos No. US6159748.
[00772] Em ainda outra modalidade particular, a ligação entre a conta e o interferon é através de uma poli(treonina), uma poli(serina), dextrano ou poli(etileno glicol). Os Exemplos 6, 7, 8 e 9 da patente dos Estados Unidos No. US6399317 ilustram como esta ligação pode ser realizada.
[00773] Em ainda outra modalidade particular, o suporte é uma conta magnética. Contas magnéticas, ligação entre as contas magnéticas e um agente de proteína e suas usos são descritas à página 8 do pedido de patente dos Estados Unidos No. US6489092.
[00774] De acordo com um aspecto adicional, o suporte é um microarranjo. Estes são particularmente previstos para detecção multiplexada de proteínas. Por conseguinte, são proporcionados microarranjos compreendendo moléculas descritas aqui, neste pedido de patente. Isto é, são proporcionados microarranjos compreendendo no mínimo duas moléculas da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00775] - n é 1 a 5 e i vai de 1 a n;
[00776] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00777] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifáti- co ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína; e
[00778] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00779] De acordo com modalidades particulares, as moléculas são ligadas ao microarranjo através de um ligante (por exemplo, uma porção Z0 conforme descrito aqui, neste pedido de patente). O microarranjo pode ser um arranjo, um chip, uma conta, uma placa, um blot, ou semelhante.
[00780] De acordo com outras modalidades particulares, as no mínimo duas moléculas são no mínimo duas moléculas diferentes. Particularmente, no mínimo uma região Yi das moléculas difere entre as no mínimo duas moléculas. Mais particularmente, no mínimo uma região Yi de uma primeira das moléculas é idêntica a um trecho em uma proteína que é uma proteína diferente do que o trecho ao qual no mínimo uma outra região Yi de uma segunda das moléculas corresponde.
Aplicação em plantas
[00781] As moléculas descritas aqui, neste pedido de patente, também podem ser usadas para hiporregulação das funções de proteínas em plantas, células de plantas ou sementes de plantas. Notar que aqui também, isto se aplica a situações não infecciosas e infecciosas, isto é, direcionamento para proteínas de planta ou direcionamento para proteínas de patógenos em ou sobre a planta. Por conseguinte, são proporcionados métodos para hiporregulação da função biológica de uma proteína em uma planta ou célula de planta ou semente de planta, compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00782] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00783] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00784] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína in ou on a referida planta, célula de planta ou semente de planta; e
[00785] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00786] Etapas adicionais do método podem incluir beta-agregação intermolecular ocorrendo entre a proteína e a molécula que não ocorre naturalmente, deste modo hiporregulando a função biológica da proteína. Como sujeitos vegetais, contrários a sujeitos animais, são imóveis, são particularmente vulneráveis a infecções com ectoparasitas e - patógenos (isto é, pragas). Na verdade, muitas espécies infecciosas não penetram necessariamente na planta para exercer seu efeito patogênico, ou não penetram durante os estágios iniciais de infecção (por exemplo, como também as plantas não têm um sistema digestivo e uma parede celular, tornando mais difícil para os patógenos entrarem dentro de uma planta). Portanto, uma "proteína sobre uma planta, célula de planta ou semente de planta" tipicamente se refere a uma proteína de outro organismo que está presente sobre a planta, célula de planta ou semente de planta. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, proteínas de nematódeos, afídeos, ácaros, lagartas, lesmas, mofos, e semelhantes. Notar que estes organismos podem estar presentes sobre qualquer parte da planta (por exemplo, os nematódeos tipicamente aminfect através das raízes das planta, ao passo que os afídeos geralmente estarão presentes sobre partes verde da planta, tais como caule e folhas).
[00787] Portanto, os métodos podem ser subdivididos em métodos para hiporregulação da função biológica de uma planta proteína em uma planta (por exemplo, para obter uma propriedade particular tal como aumentada produção ou tolerância ao stress, ou em situações de doenças não infecciosas) e em métodos para hiporregulação da função biológica de uma proteína de um organismo de praga em ou sobre uma planta (como é o caso em doença infecciosa).
[00788] Os métodos precedentes (proporcionados para hiporregulação da função biológica de uma planta proteína em uma planta ou célula de planta ou semente de planta), incluem a etapa de contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00789] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00790] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00791] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína da referida planta, célula de planta ou semente de planta; e
[00792] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00793] Os últimos métodos (para hiporregulação da função biológica de uma proteína de um organismo de praga de planta em uma planta ou célula de planta ou semente de planta), compreendem contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
[00794] - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
[00795] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00796] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente n7enhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo de praga presente em ou sobre a referida planta, célula de planta ou semente de planta; e
[00797] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00798] O termo "planta" conforme usado aqui, neste pedido de patente, engloba plantas inteiras, predecessoras e progênie das plantas e partes das plantas, incluindo sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, e tecidos e órgãos, em que cada um dos supracitados compreendem o gene / ácido nucleico de interesse. O termo "planta" também engloba células de plantas, culturas de suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos, novamente em que cada um dos supracitados compreende o gene / ácido nucleico de interesse.
[00799] Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo legumes forrageiros ou de forragem, plantas ornamentais, colheitas de alimentos, árvores ou arbustos selecionados entre a lista compreendendo Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, oilseed rape, turnip rape]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Ci- trus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Cor-chorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Fes-tuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glicine spp. (por exemplo, Glicine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersi-cum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Ma-nilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Mis-canthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virga-tum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Pru-nus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Se-cale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Tri-ticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeo-lum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outros.
[00800] Pragas de plantas conforme usado aqui, neste pedido de patente, são em particular insetos, aracnídeos, helmintos, fungos, vírus, bactérias, nematódeos e moluscos encontrados em agricultura, em horticultura, em florestas, em jardins e em instalações de lazer. As composições de acordo com a invenção são ativas contra espécies normalmente sensíveis e resistentes e contra todos ou alguns estágios de desenvolvimento. Estas pragas de planta incluem: pragas do filo: Arthropoda, em particular da classe dos aracnídeos, por exemplo, Acarus spp., Aceria sheldoni, Aculops spp., Aculus spp., Amblyomma spp., Amphitetranychus viennensis, Argas spp., Boophilus spp., Brevipalpus spp., Bryobia praetiosa, Centruroides spp., Chorioptes spp., Dermanyssus gallinae, Dermatophagoides pteronyssius, Dermatophagoides farinae, Dermacentor spp., Eotetranychus spp., Epitrimerus pyri, Eutetranychus spp., Eriophyes spp., Halotydeus destructor, Hemitarsonemus spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Latrodectus spp., Loxos-celes spp., Metatetranychus spp., Nuphersa spp., Oligonychus spp., Ornithodorus spp., Ornithonyssus spp., Panonychus spp., Phyllocop-truta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Rhizoglyphus spp., Sarcoptes spp., Scorpio maurus, Stenotarsonemus spp., Tarsonemus spp., Tetranychus spp., Vaejovis spp., Vasates lycopersici.
[00801] Outros exemplos são da ordem das Anoplura (Phthirapte- ra), por exemplo, Damalinia spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Ptirus pubis, Trichodectes spp.
[00802] Ainda outros exemplos são da ordem das Chilopoda, por exemplo, Geophilus spp., Scutigera spp.
[00803] Ainda outros exemplos são da ordem das Coleoptera, por exemplo, Acalymma vittatum, Acanthoscelides obtectus, Adoretus spp., Agelastica alni, Agriotes spp., Alphitobius diaperinus, Amphi-mallon solstitialis, Anobium punctatum, Anoplophora spp., Anthonomus spp., Anthrenus spp., Apion spp., Apogonia spp., Atomaria spp., Atta-genus spp., Bruchidius obtectus, Bruchus spp., Cassida spp., Ceroto-ma trifurcata, Ceutorrhynchus spp., Chaetocnema spp., Cleonus men-dicus, Conoderus spp., Cosmopolites spp., Costelytra zealandica, Cte-nicera spp., Curculio spp., Cryptorhynchus lapathi, Cylindrocopturus spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Dichocrocis spp., Diloboderus spp., Epilachna spp., Epitrix spp., Faustinus spp., Gibbium psylloides, Hellula undalis, Heteronychus arator, Heteronyx spp., Hylamorpha elegans, Hylotrupes bajulus, Hypera postica, Hypothenemus spp., Lachnosterna consanguínea, Lema spp., Leptinotarsa decemlineata, Leucoptera spp., Lissorhoptrus oryzophilus, Lixus spp., Luperodes spp., Lyctus spp., Megascelis spp., Melanotus spp., Meligethes aeneus, Melolontha spp., Migdolus spp., Monochamus spp., Naupac-tus xanthographus, Niptus hololeucus, Oryctes rhinoceros, Oryzaephi-lus surinamensis, Oryzaphagus oryzae, Otiorrhynchus spp., Oxyceto-nia jucunda, Phaedon cochleariae, Phyllophaga spp., Phyllotreta spp., Popillia japonica, Premnotrypes spp., Prostephanus truncatus, Psyllio-des spp., Ptinus spp., Rhizobius ventralis, Rhizopertha dominica, Si-tophilus spp., Sphenophorus spp., Stegobium paniceum, Sternechus spp., Symphyletes spp., Tanymecus spp., Tenebrio molitor, Tribolium spp., Trogoderma spp., Tychius spp., Xylotrechus spp., Zabrus spp.
[00804] Ainda outros exemplos são da ordem dos Collembola, por exemplo, Onychiurus armatus.
[00805] Ainda outros exemplos são da ordem das Diplopoda, por exemplo, Blaniulus guttulatus.
[00806] Ainda outros exemplos são da ordem das Diptera, por exemplo, Aedes spp., Agromyza spp., Anastrepha spp., Anopheles spp., Asphondylia spp., Bactrocera spp., Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis capitata, Chironomus spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Cochliomyia spp., Contarinia spp., Cordylobia anthro-pophaga, Culex spp., Culicoides spp., Culiseta spp., Cuterebra spp., Dacus oleae, Dasyneura spp., Delia spp., Dermatobia hominis, Drosophila spp., Echinocnemus spp., Fannia spp., Gasterophilus spp., Glos-sina spp., Haematopota spp., Hydrellia spp., Hylemyia spp., Hyp-pobosca spp., Hypoderma spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Lutzomia spp., Mansonia spp., Musca spp., Nezara spp., Oestrus spp., Oscinella frit, Pegomyia spp., Phlebotomus spp., Phorbia spp., Phormia spp., Prodiplosis spp., Psila rosae, Rhagoletis spp., Sarcophaga spp., Simu-lium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp., Tetanops spp., Tipula spp.
[00807] Ainda outros exemplos são da ordem dos Heteroptera, por exemplo, Anasa tristis, Antestiopsis spp., Boisea spp., Blissus spp., Calocoris spp., Campylomma livida, Cavelerius spp., Cimex spp., Col-laria spp., Creontiades dilutus, Dasynus piperis, Dichelops furcatus, Diconocoris hewetti, Dysdercus spp., Euschistus spp., Eurygaster spp., Heliopeltis spp., Horcias nobilellus, Leptocorisa spp., Leptoglossus phyllopus, Lygus spp., Macropes excavatus, Miridae, Monalonion atra-tum, Nezara spp., Oebalus spp., Pentomidae, Piesma quadrata, Pie-zodorus spp., Psallus spp., Pseudacysta persea, Rhodnius spp., Sahl-bergella singularis, Scaptocoris castanea, Scotinophora spp., Stepha-nitis nashi, Tibraca spp., Triatoma spp.
[00808] Ainda outros exemplos são da ordem das Homoptera, por exemplo, Acyrthosipon spp., Acrogonia spp., Aeneolamia spp., Ago-noscena spp., Aleurodes spp., Aleurolobus barodensis, Aleurothrixus spp., Amrasca spp., Anuraphis cardui, Aonidiella spp., Aphanostigma pin, Aphis spp., Arboridia apicalis, Aspidiella spp., Aspidiotus spp., Atanus spp., Aulacorthum solani, Bemisia spp., Brachycaudus heli-chrysii, Brachycolus spp., Brevicoryne brassicae, Calligypona margina-ta, Carneocephala fulgida, Ceratovacuna lanigera, Cercopidae, Cero-plastes spp., Chaetosiphon fragaefolii, Chionaspis tegalensis, Chlorita onukii, Chromaphis juglandicola, Chrysomphalus ficus, Cicadulina mbi-la, Coccomytilus halli, Coccus spp., Cryptomyzus ribis, Dalbulus spp., Dialeurodes spp., Diaphorina spp., Diaspis spp., Drosicha spp., Dysa-phis spp., Dysmicoccus spp., Empoasca spp., Eriosoma spp., Erythro-neura spp., Euscelis bilobatus, Ferrisia spp., Geococcus coffeae, Hie-roglyphus spp., Homalodisca coagulata, Hyalopterus arundinis, Icerya spp., Idiocerus spp., Idioscopus spp., Laodelphax striatellus, Lecanium spp., Lepidosaphes spp., Lipaphis erysimi, Macrosiphum spp., Maha-narva spp., Melanaphis sacchari, Metcalfiella spp., Metopolophium dirhodum, Monellia costalis, Monelliopsis pecanis, Myzus spp., Naso-novia ribisnigri, Nephotettix spp., Nilaparvata lugens, Oncometopia spp., Orthezia praelonga, Parabemisia myricae, Paratrioza spp., Parla-toria spp., Pemphigus spp., Peregrinus maidis, Phenacoccus spp., Phloeomyzus passerinii, Phorodon humuli, Phylloxera spp., Pinnaspis aspidistrae, Planococcus spp., Protopulvinaria pyriformis, Pseudaula-caspis pentagona, Pseudococcus spp., Psylla spp., Pteromalus spp., Pyrilla spp., Quadraspidiotus spp., Quesada gigas, Rastrococcus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoides titanus, Schizaphis graminum, Selenaspidus articulatus, Sogata spp., Sogatella furcifera, Sogatodes spp., Stictocephala festina, Tenalaphara malayensis, Tino-callis caryaefoliae, Tomaspis spp., Toxoptera spp., Trialeurodes spp., Trioza spp., Typhlocyba spp., Unaspis spp., Viteus vitifolii, Zygina spp.
[00809] Ainda outros exemplos são da ordem das Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex spp., Athalia spp., Atta spp., Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Solenopsis invicta, Tapinoma spp., Vespa spp.
[00810] Ainda outros exemplos são da ordem das Isopoda, por exemplo, Armadillidium vulgare, Oniscus asellus, Porcellio scaber.
[00811] Ainda outros exemplos são da ordem das Isoptera, por exemplo, Coptotermes spp., Cornitermes cumulans, Cryptotermes spp., Incisitermes spp., Microtermes obesi, Odontotermes spp., Reticu-litermes spp.
[00812] Ainda outros exemplos são da ordem das Lepidoptera, por exemplo, Acronicta major, Adoxophyes spp., Aedia leucomelas, Agrotis spp., Alabama spp., Amyelois transitella, Anarsia spp., Anticarsia spp., Argyroploce spp., Barathra brassicae, Borbo cinnara, Bucculatrix thurbe-riella, Bupalus piniarius, Busseola spp., Cacoecia spp., Caloptilia theivo-ra, Capua reticulana, Carpocapsa pomonella, Carposina niponensis, Chematobia brumata, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocerus spp., Cnephasia spp., Conopomorpha spp., Conotrache-lus spp., Copitarsia spp., Cydia spp., Dalaca noctuides, Diaphania spp., Diatraea saccharalis, Earias spp., Ecdytolopha aurantium, Elasmopal-pus lignosellus, Eldana saccharina, Ephestia spp., Epinotia spp., Epi-phyas postvittana, Etiella spp., Eulia spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Galleria mellonella, Gracillaria spp., Grapholitha spp., Hedylepta spp., Helicoverpa spp., Heliothis spp., Hofmannophila pseudospretella, Homoeosoma spp., Homona spp., Hyponomeuta padella, Kakivoria flavofasciata, Laphygma spp., Las-peyresia molesta, Leucinodes orbonalis, Leucoptera spp., Lithocolletis spp., Lithophane antennata, Lobesia spp., Loxagrotis albicosta, Lyman-tria spp., Lyonetia spp., Malacosoma neustria, Maruca testulalis, Ma-mestra brassicae, Mocis spp., Mythimna separata, Nymphula spp., Oi- keticus spp., Oria spp., Orthaga spp., Ostrinia spp., Oulema oryzae, Pa-nolis flammea, Parnara spp., Pectinophora spp., Perileucoptera spp., Phthorimaea spp., Phyllocnistis citrella, Phyllonorycter spp., Pieris spp., Platynota stultana, Plodia interpunctella, Plusia spp., Plutella xylostella, Prays spp., Prodenia spp., Protoparce spp., Pseudaletia spp., Pseudo-plusia includens, Pyrausta nubilalis, Rachiplusia nu, Schoenobius spp., Scirpophaga spp., Scotia segetum, Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Stathmopoda spp., Stomopteryx subsecivella, Synan-thedon spp., Tecia solanivora, Thermesia gemmatalis, Tinea pellionella, Tineola bisselliella, Tortrix spp., Trichophaga tapetzella, Trichoplusia spp., Tuta absoluta, Virachola spp.
[00813] Ainda outros exemplos são da ordem das Orthoptera, por exemplo, Acheta domesticus, Blatta orientalis, Blattella germanica, Dichroplus spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Melanoplus spp., Periplaneta spp., Pulex irritans, Schistocerca grega-ria, Supella longipalpa.
[00814] Ainda outros exemplos são da ordem das Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp., Ctenocephalides spp., Tunga penetrans, Xenopsylla cheopis.
[00815] Ainda outros exemplos são da ordem das Symphyla, por exemplo, Scutigerella spp.
[00816] Ainda outros exemplos são da ordem das Thysanoptera, por exemplo, Anaphothrips obscurus, Baliothrips biformis, Drepanothris reuteri, Enneothrips flavens, Frankliniella spp., Heliothrips spp., Herci-nothrips femoralis, Rhipiphorothrips cruentatus, Scirtothrips spp., Tae-niothrips cardamoni, Thrips spp.
[00817] Ainda outros exemplos são da ordem das Zygentoma (=Thysanura), por exemplo, Lepisma saccharina, Thermobia domestica.
[00818] Em outra modalidade pragas do filo Mollusca, em particular da classe das Bivalvia, por exemplo, Dreissena spp. também são pra- gas de plantas importantes.
[00819] Em outra modalidade pragas da classe dos Gastropoda são pragas de plantas importantes, por exemplo, Anion spp., Biomphalaria spp., Bulinus spp., Deroceras spp., Galba spp., Lymnaea spp., Onco-melania spp., Pomacea spp., Succinea spp.
[00820] Em ainda outra modalidade pragas de plantas são do filo Nematoda são pragas de plantas importantes, isto é, nematódeos fito-parasitários, portanto significando nematódeos parasitários de plantas que causam dano para plantas. Nematódeos de plantas englobam nematódeos parasitários de plantas e nematódeos que vivem no solo. Nematódeos parasitários de plantas incluem, mas não estão limitados a, ectoparasitas tais como Xiphinema spp., Longidorus spp., e Tricho-dorus spp.; semiparasitas tais como Tylenchulus spp.; endoparasitas migratórios tais como Pratylenchus spp., Radopholus spp., e Scutello-nerna. spp.; parasitas sedentários tais como Heterodera spp., Globo-dera spp., e Meloidogyne spp., e endoparasitas do caule e das folhas tais como Ditylenchus spp., Aphelenchoides spp., e Hirshmaniella spp. Além disso, nematódeos do solo parasitários das raízes prejudiciais são nematódeos formadores de cisto dos gêneros Heterodera ou Glo-bodera, e/ou nematódeos do nó da raiz do gênero Meloidogyne. Espécies prejudiciais destes gêneros são, por exemplo, Meloidogyne incog-nata, Heterodera glicines (nematódeo do cisto da soja), Globodera pallida e Globodera rostochiensis (nematódeo do cisto da batata). Ainda outros gêneros importantes de importância como pragas de plantas compreendem Rotylenchulus spp., Paratriclodorus spp., Pratylenchus penetrans, Radolophus simuli, Ditylenchus dispaci, Tylenchulus semi-penetrans, Xiphinema spp., Bursaphelenchus spp., e semelhantes, em particular Aphelenchoides spp., Bursaphelenchus spp., Ditylenchus spp., Globodera spp., Heterodera spp., Longidorus spp., Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus similis, Trichodorus spp., Tylen- chulus semipenetrans. e Xiphinema spp.
[00821] Em ainda outra modalidade pragas de plantas são virus e os métodos da invenção são direcionados para o tratamento de uma viral infecção ou a inibição da infectividade viral em uma planta, o vírus da planta é selecionado entre um alfamovírus, um allexivírus, um al-facryptovírus, um anulavírus, um apscaviroide, um aureusvírus, um avenavírus, um aysunviroide, um badnavírus, um begomovírus, um benyvírus, um betacryptovírus, um betaflexiviridae, um bromovírus, um bymovírus, um capillovírus, um carlavírus, um carmovírus, um cauli-movírus, um cavemovírus, um cheravírus, um closterovírus, um coca-dviroide, um coleviroide, um comovírus, um crinivírus, um cucumoví-rus, um curtovírus, um cytorhabdovírus, um dianthovírus, um enamoví-rus, um umbravírus e vírus satélite tipo B, um fabavírus, um fijivírus, um furovírus, um hordeivírus, um hostuviroide, um idaeovírus, um ilar-vírus, um ipomovírus, um luteovírus, um machlomovírus, um maclura-vírus, um marafivírus, um mastrevírus, um nanovírus, um necrovírus, um nepovírus, um nucleorhabdovírus, um oleavírus, um ophiovírus, um oryzavírus, um panicovírus, um pecluvírus, um petuvírus, um fitorreoví-rus, um polerovírus, um pomovírus, um pospiviroide, um potexvírus, um potyvírus, um reovírus, um rhabdovírus, um rymovírus, um sadwa-vírus, um vírus semelhante a SbCMV, um sequivírus, um sobemovírus, um tenuivírus, um vírus satélite semelhante a TNsatV, um tobamoví-rus, um topocuvírus, um tospovírus, um trichovírus, um tritimovírus, um tungrovírus, um tymovírus, um umbravírus, um varicosavírus, um vitiví-rus, ou um waikavírus.
[00822] Em ainda outra modalidade pragas de plantas podem ser fungos patogênicos para plantas, Os fungos de plantas referidos incluem, mas não estão limitados a, os selecionados entre o grupo consistindo dos Gêneros: Alternaria; Ascochyta; Botrytis; Cercospora; Colletotrichum; Diplodia; Erysiphe; Fusarium; Leptosphaeria; Gaeumano- myces; Helminthosporium; Macrophomina; Nectria; Peronospora; Phoma; Phymatotrichum; Phytophthora; Plasmopara; Podosphaera; Puccinia; Puthium; Pyrenophora; Pyricularia; Pythium; Rhizoctonia; Scerotium; Sclerotinia; Septoria; Thielaviopsis; Uncinula; Venturia; e Verticillium. Exemplos específicos de infecções por fungos de plantas as quais podem ser tratadas com os interferons da presente invenção incluem, Erysiphe graminis em cereais, Erysiphe cichoracearum e Sphaerotheca fuliginea em cucurbitáceas, Podosphaera leucotricha em maçãs, Uncinula necator em vinhas, Puccinia sp. em cereais, Rhizoctonia sp. em algodão, batatas, arroz e gramados, Ustilago sp. em cereais e cana de açúcar, Venturia inaequalis (sarna) em maçãs, Helminthosporium sp. em cereais, Septoria nodorum em trigo, Septoria tritici em trigo, Rhynchosporium secalis em cevada, Botrytis cinerea (podridão cinzenta) em morangos, tomates e uvas, Cercospora arachi-dicola em amendoins, Peronospora tabacina em tabaco, ou outros Peronospora em várias colheitas, Pseudocercosporella herpotrichoides em trigo e cevada, Pyrenophera teres em cevada, Pyricularia oryzae em arroz, Phytophthora infestans em batatas e tomates, Fusarium sp. (tal como Fusarium oxysporum) e Verticillium sp. em várias plantas, Plasmopara viticola em uvas, Alternaria sp. em frutos, verduras e legumes, Pseudoperonospora cubensis em pepinos, Mycosphaerella fijiensis em banana, Ascochyta sp. em grão de bico, Leptosphaeria sp. em canola, e Colleotrichum sp. em várias colheitas.
[00823] Em ainda outra modalidade particular, pragas de plantas são bactérias patogênicas para as plantas incluindo, mas não limitadas a, Acidovorax avenae subsp. avenae (causando a listra marrom (brown stripe) bacteriana do arroz), Acidovorax avenae subsp. cat-tleyae (causando a mancha parda bacteriana da cattleya), Acidovorax konjaci Konnyaku (causando a ferrugem bacteriana da folha), Agrobacterium rhizogenes (causando a raiz cabeluda (hairy root) do melão), Agrobacterium tumefaciens (causando a galha da coroa), Burkholderia andropogonis (causando a mancha bacteriana do cravo), Burkholderia caryophylli (causando a murcha bacteriana do cravo), Burkholderia cepacia (causando a mancha parda bacteriana do cimbí-dio), Burkholderia gladioli pv. gladioli (causando a podridão do pescoço (neck rot) do gladíolo), Burkholderia glumae (causando bacteriana a podridão do grão do arroz), Burkholderia plantarii (causando a ferrugem bacteriana da plântula do arroz), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (causando o cancro bacteriano do tomate), Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (causando a podridão anelar (ring rot) da batata), Clostridium spp. (causando a podridão viscosa da batata), Curtobacterium flaccumfaciens (causando o cancro bacteriano da cebola), Erwinia amylovora (causando o fogo bacteriano da pera), Erwinia ananas (causando o escurecimento bacteriano (palea browning) do arroz), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (causando o pé preto da batata), Erwinia carotovora subsp. carotovora (causando a podridão mole bacteriana dos vegetais), Erwinia chrysanthemi (causando a ferrugem bacteriana da plântula do inhame), Erwinia chrysanthemi pv. zeae (causando a ferrugem bacteriana do pé (foot rot) do arroz), Erwinia herbicola pv. millettiae (causando a galha bacteriana das glicínias), Pseudomonas cichorii (causando a mancha do crisântemo), Pseudomonas corrugate Pith (causando a necrose do tomate), Pseudomonas fuscovaginae (causando a podridão parda da bainha (sheath brown rot) do arroz), Pseudomonas marginalis pv. margi-nalis (causando a podridão mole do repolho) Pseudomonas rubrisu-balbicans (causando a listra mosqueada (mottled stripe) da cana de açúcar), Pseudomonas syringae pv. aptata (causando a ferrugem bacteriana da beterraba sacarina), Pseudomonas syringae pv. atropurpu-rea (causando a praga (halo blight) do azevém), Pseudomonas syringae pv. castaneae (causando o cancro bacteriano da castanha), Pseudomonas syringae pv. glicinaa (causando a ferrugem bacteriana da soja), Pseudomonas syringae pv. lachrymans (causando a mancha bacteriana do pepino), Pseudomonas syringae pv. maculicola (causando a mancha preta bacteriana do repolho), Pseudomonas syringae pv. mori (causando a ferrugem bacteriana da amoreira), Pseudomonas syringae pv. morsprunorum (causando o cancro bacteriano das ameixas), Pseudomonas syringae pv. oryzae (causando a praga (halo blight) do arroz), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (causando a praga (halo blight) do feijão), Pseudomonas syringae pv. pisi (causando a ferrugem bacteriana da ervilha), Pseudomonas syringae pv. sesame (causando a mancha bacteriana do gergelim), Pseudomonas syringae pv. striafaciens (causando a ferrugem (stripe blight) bacteriana da aveia), Pseudomonas syringae pv. syringae (causando a mancha parda bacteriana do feijão vermelho pequeno), Pseudomonas syringae pv. tabaci (causando o fogo selvagem do tabaco), Pseudomonas syringae pv. theae (causando a praga bacteriana (bud shoot blight) do chá), Pseudomonas syringae pv. tomato (causando a mancha foliar bacteriana do tomate), Pseudomonas viridiflava (causando a mancha parda bacteriana do feijão), Ralstonia solanacearum (causando a murcha bacteriana), Rathayibacter rathayi (causando a ferrugem bacteriana (head blight) da grama de pomar), Streptomyces scabies (causando a sarna vulgar da batata), Streptomyces ipomoea (causando a podridão do solo da batata doce), Xanthomonas albilineans (causando a listra branca (white streak) da cana de açúcar), Xanthomonas campestris pv. cerealis (causando a listra bacteriana (streak) do centeio), Xanthomonas campestris pv. campestris (causando a raiz preta), Xanthomonas campestris pv. citri (causando o cancro dos cítricos), Xanthomonas campestris pv. cucurbitae (causando a mancha parda bacteriana do pepino), Xanthomonas campestris pv. glicinas (causando a pústula bacteriana da soja), Xanthomonas campestris pv. incanae (causando a podridão preta da haste), Xanthomonas campestris pv. malvacearum (causando a mancha angular da folha do algodão), Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae (causando o cancro bacteriano da manga), Xanthomonas campestris pv. mellea (causando a mancha foliar bacteriana do tabaco de wisconsin), Xanthomonas campestris pv. nigromaculans (causando a mancha bacteriana da bardana grande), Xanthomonas campestris pv. phaseoli (causando a pústula bacteriana do feijão), Xanthomonas campestris pv. pisi (causando a podridão bacteriana da raiz do feijão), Xanthomonas campestris pv. pruni (causando o furo de bala bacteriano do pessegueiro), Xanthomonas campestris pv. raphani (causando a mancha bacteriana do rabanete japonês), Xanthomonas campestris pv. ricini (causando a mancha bacteriana da planta de mamona), Xanthomonas campestris pv. theicola (causando o cancro do chá), Xanthomonas campestris pv. translucens (causando a ferrugem bacteriana da grama do pomar), Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (causando a mancha bacteriana do tomate), Xanthomonas oryzae pv. oryzae (causando a ferrugem bacteriana da folha do arroz).
[00824] Apesar da molécula poder ser administrada como tal, em plantas, é particularmente previsto usar uma abordagem transgênica. Nestes casos, os métodos fazem uso de sequências de ácidos nucleicos que não ocorrem naturalmente codificando uma molécula tendo a seguinte estrutura:
[00825] (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição; e em que
[00826] - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P; o mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, D e P;
[00827] - cada Yi é selecionado de modo independente entre um trecho de 4 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho que ocorre naturalmente em uma proteína em uma planta, célula de planta ou semente de planta (ou em uma proteína de uma planta patógeno); e
[00828] - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
[00829] Os métodos acima podem ser então reformulados como métodos para hiporregulação da função biológica de uma planta proteína em uma planta ou célula de planta ou semente de planta (ou para hiporregulação da função biológica de uma proteína de um organismo de praga em uma planta ou célula de planta ou semente de planta, respectivamente), compreendendo transformar a referida planta, célula de planta ou semente de planta, com uma (isto é, no mínimo uma) sequência de ácido nucleico que não ocorre naturalmente codificando uma molécula tendo a estrutura conforme esboçado acima.
[00830] Alternativamente, os métodos podem ser reformulados como métodos para hiporregulação da função biológica de uma planta proteína em uma planta ou célula de planta ou semente de planta (ou para hiporregulação da função biológica de uma proteína de um organismo de praga em uma planta ou célula de planta ou semente de planta, respectivamente), compreendendo expressar, na referida planta, célula de planta ou semente de planta, algumas sequências de ácidos nucleicos que não ocorrem naturalmente codificando uma molécula tendo a estrutura conforme esboçado acima.
[00831] De acordo com modalidades específicas, a sequência de polipeptídeo codificada é um polipeptídeo que não ocorre naturalmente. De acordo com modalidades adicionais particulares, a sequência de ácido nucleico é um gene artificial. Um gene artificial tipicamente compreende os seguintes elementos de DNA ligados operavelmente: a) um promotor expressável em plantas b) uma sequência de ácido nucleico (particularmente DNA) codificando a molécula descrita acima e c) uma região 3’ terminal compreendendo terminação de transcrição e sinais de poliadenilação funcionando em células da referida planta.
[00832] Uma vez que o aspecto do ácido nucleico é o mais particularmente adequado em aplicações que fazem uso de expressão transgênica, modalidades particularmente previstas são aquelas onde a sequência de ácido nucleico (ou o gene artificial) é fundida a outra porção, particularmente uma porção que aumenta a solubilidade e/ou a estabilidade do produto genético. Na verdade, a expressão transgênica de peptídeos algumas vezes pode ser difícil devido à rápida degradação do produto. Portanto, gene artificial compreendendo os seguintes elementos de DNA ligados operavelmente: a) um promotor expres-sável em plantas b) um ácido nucleico codificando uma molécula de interferon fundido a uma porção que reforça a solubilidade (previne agregação) da molécula de interferon e c) uma região 3’ terminal compreendendo terminação de transcrição e sinais de poliadenilação funcionando em células da referida planta.
[00833] Também são proporcionados neste aspecto vetores recombinantes compreendendo uma tal sequência de ácidos nucleicos codificando uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Estes vetores recombinantes são idealmente adequados como um veículo para carregar a sequência de ácido nucleico de interesse dentro de uma célula onde a proteína a ser hiporregulada é expressada, e acionar a expressão do ácido nucleico na referida célula. O vetor re- combinante pode persistir como uma entidade separada na célula (por exemplo, como um plasmídeo), ou pode ser integrado no genoma da célula.
[00834] O mais particularmente, a molécula é um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos presente sobre um vetor recombinante e a qual, depois de introdução dentro da célula de planta, da semente de planta ou da planta, produz o referido polipeptídeo na referida célula de planta, semente de planta ou planta. Nestes casos, o contato entre a proteína e a molécula que não ocorre naturalmente é produzido por expressão da referida molécula que não ocorre naturalmente na referida planta ou célula de planta. Deste modo a função biológica da proteína é hiporregulada por expressão da molécula de interferon.
[00835] Por conseguinte, são proporcionadas plantas, ou células de plantas, ou sementes de plantas aqui, neste pedido de patente, que contêm uma sequência de ácidos nucleicos, gene artificial ou um vetor recombinante conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Além disso são previstos aqui, neste pedido de patente, protoplastos de plantas contendo as referidas sequências.
[00836] Na presente invenção um "promotor expressável em plantas" compreende elementos reguladores, os quais mediam a expressão de um segmento de sequência codificante em células de plantas. Para expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico deve ser ligada operavelmente a ou compreender um promotos adequado o qual expressa o gene no ponto no tempo correto e com o padrão de expressão espacial requerido. Para a identificação de promotores funcionalmente equivalentes, a potência do promotos e/ou o padrão de expressão de um promotor candidato podem ser analisados por exemplo, ligando operavelmente o promotor a um gene repórter e avaliando o nível de expressão e o padrão do gene repórter em vários tecidos da planta. Genes repórter de conhecimento geral adequados incluem por exemplo, beta-glucuronidase ou beta-galactosidase. A atividade do promotor é avaliado medindo a atividade enzimática da beta-glucuronidase ou da beta-galactosidase. A potência do promotor e/ou o padrão de expressão podem ser então comparados com o de um promotor de referência (tal como o promotor usado nos métodos da presente invenção). Alternativamente, a potência do promotor pode ser avaliada quantificando os níveis de mRNA ou comparando os níveis de mRNA do ácido nucleico usado nos métodos da presente invenção, com os níveis de mRNA de genes housekeeping tais como 18S rRNA, usando métodos conhecidos na arte, tais como Northern blotting com análise densitométrica de autorradiogramas, PCR quantitativo em tempo real ou RT- PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986994). Geralmente por "promotor fraco" se pretende um promotor que aciona a expressão de uma sequência codificante em um baixo nível. Por "baixo nível" se pretende em níveis de cerca de 1/10.000 transcrip-tos até cerca de 1/100.000 transcriptos, até cerca de 1/500.0000 transcriptos por célula. Ao contrário, um "promotor forte" acina a expressão de uma sequência codificante em alto nível, ou a cerca de 1/10 transcriptos até cerca de 1/100 transcriptos até cerca de 1/1000 transcriptos por célula. Geralmente, por "promotor de potência média" se pretende um promotor que aciona a expressão de uma sequência codificante em um nível menor do que um promotor forte, em particular em um nível que é em todos os casos abaixo do nível obtido quando sob o controle de um promotor 35S CaMV.
[00837] O termo "ligado operacionalmente" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a uma ligação funcional entre a sequência de promotor e o gene de interesse, de tal modo que a sequência de promotor é capaz de iniciar a transcrição do gene de interesse.
[00838] Um "promotor constitutivo" se refere a um promotor que é transcricionalmente ativo durante a maioria, mas não necessariamente todas, as fases de crescimento e desenvolvimento e sob a maioria das condições ambientais, em no mínimo uma célula, tecido ou órgão. Um promotor "ubíquo" é ativo em substancialmente todos os tecidos ou células de um organismo. Um promotor regulado pelo desenvolvimento é ativo durante determinados estágios do desenvolvimento ou em partes da planta que sofrem alterações do desenvolvimento. Um promotor indutível tem iniciação de transcrição induzida ou aumentada em resposta a um estímulo químico (para uma revisão vide Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89- 108), ambiental ou físico, ou pode ser "indutível por stress", isto é, ativado quando uma planta é exposta a várias condições de stress, ou um "indutível por patógeno " isto é, ativado quando uma planta é exposta a exposição a vários patógenos. Um promotor órgão-específico ou tecido-específico é um promotor que é capaz de iniciar transcrição preferencialmente em determinados órgãos ou tecidos, tais como o tecido das folhas, raízes, sementes etc. Por exemplo, um "promotor raiz-específico" é um promotor que é transcricionalmente ativo predominantemente nas raízes da planta, substancialmente até a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, apesar de qinda permitir qualquer expressão que passe nestas outras partes da planta. Promotores capazes de iniciar transcrição em determinadas células somente são referidos aqui, neste pedido de patente, como "célula-específicos". Um promotor semente-específico é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido de semente, mas não necessariamente exclusivamente em tecido de semente (em casos de expressão que passa). O promotor semente-específico pode ser ativo durante o desenvolvimento e/ou durante a germinação da semente. O promotor semente-específico pode ser específico de endosperma / aleurona / embrião. Exemplos de pro- motores semente-específicas são dados em Qing Qu and Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 1 13-125, 2004), cuja descoberta é incorporada por meio de referência aqui, a este pedido de patente, como se totalmente estipulada. Um promotor específico de tecido verde conforme definido aqui, neste pedido de patente, é um promotor que é transcri-cionalmente ativo predominantemente em tecido verde, substancialmente até a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, apesar de ainda permitir qualquer expressão que passa nestas outras partes da planta.
[00839] O termo "terminador" engloba uma sequência de controle a qual é uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade trans-cripcional a qual sinaliza 3' processamento e poliadenilação de um transcripto primário e terminação de transcrição. O terminador pode ser derivado a partir do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes de planta, ou a partir de T-DNA. O terminador a ser adicionado pode ser derivado a partir de, por exemplo, os genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente a partir de outro gene de planta, ou menos preferencialmente a partir de qualquer outro gene eucariótico.
[00840] "Marcador selecionável", "marcador genético selecionável" ou "gene repórter" inclui qualquer gene que confere um fenótipo a uma célula na qual é expressado para facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com um constructo de ácido nucleico da invenção. Estes marcadores genéticos permitem a identificação de uma transferência com sucesso das moléculas de ácido nucleico através de uma serie de princípios diferentes. Marcadores adequados podem ser selecionados entre marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida, que introduzem um novo traço metabólico ou que permitem seleção visual. Exemplos de marcadores genéticos selecionáveis incluem genes que conferem resis- tência a antibióticos (tais como nptll que fosforila neomicina e canami-cina, ou hpt, fosforilando higromicina, ou genes que conferem resistência a, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, bar o qual proporciona resistência a Basta®; aroA ou gox proporcionando resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência a, por exemplo, imidazolinona, fosfinotricina ou sulfoniluréia), ou genes que proporcionam um traço metabólico (tal como manA que permite que as plantas usam manose como única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utili-sação de xilose, ou marcadores antinutritivos tais como a resistência a 2-desoxiglicose). A expressão de marcadores genéticos visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β-glucuronidase, GUS ou β- galac-tosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (tal como o sistema de luciferina / luceferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde, GFP, e derivados da mesma). Esta lista representa somente um pequeno número de marcadores possíveis. O técnico versado está familiarizado com os marcadores referidos. Marcadores diferentes são preferenciais, dependendo do organismo e do método de seleção.
[00841] É sabido que depois de integração estável ou transitória de ácidos nucleicos em células de plantas, somente uma minoria das células captura o DNA estranho e, caso desejado, o integra em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene codificante para um marcador selecionável (tais como os descritos acima) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Estes marcadores podem ser usados, por exemplo, em mutantes nos quais estes genes são não funcionais, por exemplo, por deleção por métodos convencionais. Além disso, molécu- las de ácido nucleico codificando um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira sobre o mesmo vetor que compreende a sequência codificando os polipeptídeos da invenção ou usada nos métodos da invenção, ou ainda em um vetor separado. Células as quais tenham sio transfectadas de modo estável com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, por seleção (por exemplo, células as quais têm integrado o marcador selecionável sobrevivem ao passo que as outras células morrem).
[00842] Uma vez que os marcadores genéticos, particularmente genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais ne3cessários ou são indesejados na célula hospedeira transgênica assim que os ácidos nucleicos tenham sido introduzidos com sucesso, o processo de acordo com a invenção para introdução dos ácidos nucleicos emprega vantajosamente técnicas as quais permitem a remoção ou a excisão destes marcadores genéticos. Um método semelhante é o que é conhecido como co-transformação. O método de co-transformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor carregando o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo carregando o um ou mais marcadores genéticos. Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores. Em caso de transformação com Agrobactérias, os transformantes geralmente recebem somente uma parte do vetor, isto é, a sequência flanqueada pelo T-DNA, a qual geralmente representa o cassete de expressão. Os marcadores genéticos em seguida podem ser removidos da planta transformada realizando cruzamentos. Em outro método, marcadores genéticos integrados em um transposon são usados para a transformação junto com o ácido nucleico desejado (conhecida como a tecnologia de Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com um constructo de ácido nucleico conferindo expressão de uma transposase, transitoriamente ou estável. Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposon salta do genoma da célula hospedeira uma vez que tenha ocorrido a transformação com sucesso e é perdido. Em uma série de casos adicionais, o transposon salta para uma localização diferente. Nestes casos o marcador genético deve ser eliminado realizando cruzamentos. Em microbiologia, foram desenvolvidas técnicas as quais tornam possível, ou facilitam, a detecção de semelhantes eventos. Um método adicionalmente vantajoso se baseia no que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O melhor sistema co-nhhecido deste tipo é o que é conhecido como o sistema Cre/lox. Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o marcador genético for integrado entre as sequências loxP, é removido assim que a transformação tenha sido realizada com sucesso, por expressão da recombinase. Sistemas de recombinação adicionais são o sistema HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). É possível uma integração sítio-específica dentro do genoma da planta das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção.
[00843] Para os fins da invenção, "transgênico", "transgene" ou "recombinante" significa com resspeito a, por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos, um cassete de expressão, constructo genético ou um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as sequências de ácidos nucleicos, os cassetes de expressão ou os vetores de acordo com a invenção.
[00844] Uma planta transgênica para os fins da invenção é portanto entendida como significando, conforme acima, que os ácidos nucleicos usados no método da invenção (por exemplo, os genes artificiais) não estão presentes no, ou são originários do, genoma da referida planta, ou estão presentes no genoma da referida planta mas não em seu locus natural no genoma da referida planta, sendo possível para os ácidos nucleicos serem expressados homologamente ou heterologamen-te. No entanto, conforme mencionado, transgênico também significa que, apesar dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou usados no método da invenção estarem em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi modificada com respeito à sequência natural, e/ou que as sequências reguladoras das sequências naturais foram modificadas. Transgênico é preferencialmente entendido como significando a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um locus não natural no genoma, isto é, ocorre expressão homóloga ou, heteróloga dos ácidos nucleicos. Plantas transgênicas preferenciais são mencionadas aqui, neste pedido de patente.
[00845] O termo "expressão" ou "expressão genética" significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou constructo genético específico. O termo "expressão" ou "expressão genética" em particular significa a transcrição de um gene ou genes ou constructo genético em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem translação subsequente do último para uma proteína. O processo inclui transcrição de DNA e processamento do produto de mRNA resultante.
[00846] O termo "expressão aumentada" ou "superexpressão" conforme usado aqui, neste pedido de patente, significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão selvagem original. Para os fins desta invenção, o o nível de expressão tipo selvagem original também pode ser zero, isto é, ausência de expressão ou expressão incomensurável.
[00847] Métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos genéticos estão bem documentados na arte e incluem, por exemplo, superexpressão acionada por promotores apropriados (conforme descrito acima aqui, neste pedido de patente), a uso de reforçadores de transcrição ou reforçadores de translação. Ácidos nucleicos isolados os quais servem como promotor ou elementos reforçadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróloga de um poliinucleotídeo de modo a hiperre-gular a expressão de um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de interesse. Se a expressão do polipeptídeo for desejada, geralmente é desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região codificante de poliinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada a partir do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes de planta, ou a partir de T-DNA. A sequência da extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente a partir de outro gene de planta, ou menos preferencialmente a partir de qualquer outro gene eucariótico.
[00848] Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5' (UTR) ou à sequência codificante da sequência codificante parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Foi demonstrado qeu a inclusão de um íntron spliceable na unidade de transcrição tanto em constructos de expressão vegetal quanto animal aumenta a expressão genética tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína até 1000 vezes (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1 183-1200). O reforço da expressão genética por íntrons referido é tipicamente o maior quando disposto próximo à extremidade 5' da unidade de transcrição. A uso de íntrons de milho Adh1 -S íntron 1 , 2, e 6, e do íntron Bronze-1 são conhecidas na arte. Para informação geral vide: The Maize Handbook, Chapter 1 16, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
[00849] O termo "introdução" ou "transformação" conforme referido aqui, neste pedido de patente, engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno dentro da célula hospedeira, independente do método usado para transferência. Tecido de planta capaz de propagação clonal subsequente, quer por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um constructo genético da presente invenção e uma planta inteira pode ser regenerada a partir deste. O tecido em particular escolhido vai variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis, e mais adequados para, a espécie em particular sendo transformada. Exemplos de alvos teciduais incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente (por exemplo, meristema apical, brotações axilares, e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido transitoriamente ou de modo estãvel em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro. A célula de planta transformada resultante pode ser então usada para regenerar uma planta transformada em uma maneira de conhecimento da pessoa versada na arte.
[00850] A transferência de genes estranhos para o genoma de uma planta é denominada transformação. A transformação de espécies de plantas é atualmente uma técnica bastante rotineira. Vantajosamente, qualquer um dos vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula predecessora adequada. Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos de plantas ou células de plantas podem ser utilizados para transformação transitória ou para transformação estável. Os métodos de transformação incluem a uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a captação de DNA li- vre, injeção do DNA diretamente dentro da planta, bombardeamento de pistola de partículas, transformação usando vírus ou pólen e micro-projeção. Os métodos podem ser selecionados entre o método de cálcio / polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363- 373); eletroporação de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinjeção dentro do material da planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeamento de partículas revestidas com DNA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não integrativo) e semelhantes. Plantas transgênicas, incluindo plantas de safras transgênicas, são preferencialmente produzidas através de transformação mediada por Agrobacté-rias. Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta. Para este fim, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias ajam sobre as sementes das plantas ou inocular o me-ristema da planta com agrobactérias. Foi comprovado particularmente conveniente de acordo com a invenção permitir que uma suspensão de agrobactérias transformadas ajam sobre a planta intacta ou no mínimo sobre os primórdios das flores. A planta é em seguida cultivada até serem obtdias as sementes da planta tratada (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Métodos para transformação mediada por Agrobacterium do arroz incluem métodos de conhecimento geral para transformação do arroz, tais como os descritos em qualquer um dos seguintes: pedido de patente européia No. EP1198985, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994), cujas descobertas são incorporadas por meio de referência aqui, a este pedido de patente, como se totalmente estipuladas. No caso de transformação de milho, o método preferencial é conforme descrito ou em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou em Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cujas descobertas são incorporadas por meio de referência aqui, a este pedido de patente, como se totalmente estipuladas. Os métodos referidos são adicionalmente descritos a título de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou o constructo a ser expressado é preferencialmente clonado em um vetor, o qual é adequado para transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, pBin19 (Bevan et al (1984) Nucl. Acids Res. 12-8711). Agrobactérias transformadas por um vetor semehante podem ser então usadas em maneira conhecida para a transformação de plantas, tais como plantas usadas como um modelo, como Arabidopsis ou plantas de colheitas tais como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, por imersão de folhas moídas ou folhas picadas em uma solução agrobacteriana e em seguida cultivando as mesmas em meios adequados. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hof-gen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida entre outras a partir da referência F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
[00851] Além da transformação de células somáticas, as quais então devem ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar as células de meristemas de plantas e em particular as células as quais se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento natural da planta, dando origem a plantas transgênicas. Portanto, por exemplo, sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e são obtidas sementes a partir das plantas em desenvolvimento das quais uma determinada proporção é transformada e portanto transgênica [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1 -9; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Métodos alternativos são baseados na remoção repetida das inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com agrobactérias transformadas, por meio do que sementes transformadas podem ser igualmente obtidas em um ponto no tempo posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método especialmente eficaz é o método de infiltração a vácuo com suas modificações tais como o método de "imersão floral". No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, plantas intactas sob reduzida pressão são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). CR Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1 194-1 199], ao passo que no caso do método de "imersão floral" o tecido floral em desenvolvimento é incubado rapidamente com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativo [Clough, SJ e Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. Uma determinada proporção de sementes transgênicas são colhidas em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas de sementes não transgênicas por cultura sob as condições seletivas acima descritas. Além da transformação estável de plastídeos ser vantajosa porque os plastídeos são herdados maternalmente na maioria das colheitas reduzindo ou eliminando o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma do cloroplasto é geralmente obtida por um processo o qual foi apresentado esquematicamente em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Em resumo as sequências a serem transformadas são clonadas junto com um marcador genético selecionável entre sequências flanqueantes homólogas ao genoma do cloroplasto. Estas sequências flanqueantes homólogas direcionam a integração sítio específica para dentro do plas- toma. A transformação plastidal tem sido descrita para muitas espécies de plantas diferentes e uma visão geral é dada em Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21 , 20-28. Progresso biotecnológico adicional foi reportado recentemente sob forma de transformantes de plastídeo livres de marcadores, os quais podem ser produzidos por um marcador genético co-integrado transitoriamente (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).
[00852] As células de plantas geneticamente modificadas podem ser regeneradas através de todos os métodos com os quais o trabalhador versado está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.
[00853] Geralmente depois de transformação, células de plantas ou agrupamentos de células são selecionados para a presença de um ou mais marcadores os quais são codificados por genes expressáveis em planta co-transferidos com o gene de interesse, depois do qual o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material da planta obtido na transformação é, via de regra, submetido a condições seletivas de modo que plantas transformadas podem ser distinguidas de plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas na maneira acima descrita podem ser plantadas e, depois de um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por pulverização. Uma possibilidade adicional consiste em cultivar as sementes, caso apropriado depois de esterilização, sobre placas de agar usando um agente de seleção adequado de modo a que somente as sementes transformadas possam crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são triadas para a presença de um marcador selecionável tais como os descritos acima.
[00854] Depois de transferência de DNA e regeneração, plantas transformadas putativamente também podem ser avaliadas, por exemplo usando análise Southern, para a presença do gene de interesse, o número de cópias e/ou a organização genômica. Alternativamente ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados usando análise Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo de conhecimento geral das pessoas tendo conhecimento ordinário na arte.
[00855] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tais como por técnicas de propagação clonal ou de reprodução clássica. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser autopolinizada e transformantes homozigóticos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem ser então adicionalmente propagadas através de técnicas de reprodução clássica. Os organismos transformados gerados podem tomar uma variedade de formas. Por exemplo, podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células tecidas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um enxerto transformado enxertado em um rebento não transformado).
[00856] A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte de rotina de uma situação experimental e pode incluir plantas selvagens correspondentes ou plantas correspondente sem o gene de interesse. A planta de controle é tipicamente da mesma espécie da planta ou ainda da mesma variedade que a planta a ser avaliada. A planta de controle também pode ser um nulizigoto da planta a ser avaliada. Nuli-zigotos são indivíduos carecendo do transgene por segregação. Uma "planta de controle" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere não somente a plantas inteiras, mas também a partes das plantas, incluindo sementes e partes de sementes.
[00857] O termo "cassete de expressão" se refere a qualquer sistema de expressão recombinante para o propósito de expressão de uma sequência de ácidos nucleicos da invenção in vitro ou in vivo, constitutivamente ou indutivelmente, em qualquer célula, incluindo, além de células de plantas, células procarióticas, de levedura, fúngicas, de inseto ou de mamífero. O termo inclui sistemas de expressão lineares e circulares. O termo inclui todos os vetores. Os cassetes podem permanecer epissômicos ou integrar no genoma da célula hospedeira. Os cassetes de expressão podem ter a capacidade de auto-replicar ou não (isto é, acionar somente expressão transitória em uma célula). O termo inclui cassetes de expressão recombinantes que contêm somente os mínimos elementos necessários para transcrição do ácido nucleico recombinante.
[00858] De acordo com modalidades alternativas, as moléculas são administradas às plantas como tais, e não como um transgene. Como as plantas não têm um sistema digestivo, o termo administração aqui particularmente também visa aplicações tópicas das moléculas (proporcionando as moléculas sobre a planta ao invés de na planta), ou vias de administração indiretas (por exemplo, proporcionando as moléculas no solo, de modo a que elas podem ser absorvidas pelas raízes da planta). Embora esta via de administração seja particularmente adequada para combater infecções das planta, também pode ser aplicada para hiporregulação de proteínas das plantas.
[00859] As moléculas podem ser proporcionadas como tais, como um agroquímico. Tipicamente no entanto, as moléculas para uso em plantas (ou os ácidos nucleicos codificando as mesmas) podem ser proporcionadas como uma composição junto com um veículo agrono- micamente aceitável (ao invés de um veículo farmaceuticamente aceitável). Por "veículo agronomicamente aceitável" se indica um sólido ou líquido de enchimento, diluente ou substânciaa de encapsulação que pode ser usado com segurança na administração tópica ou sistêmica de uma molécula de interferon a uma planta, semente de planta, célula de planta ou protoplasto de planta. As moléculas para aplicações em plantas descritas aqui, neste pedido de patente, combinadas com um veículo agroquimicamemte aceitável, também são referidas como uma formulação agroquímica ou composição agroquímica. Uma "formulação agroquímica" conforme usado aqui, neste pedido de patente, significa uma composição para uso agrícola ou hortícola, compreendendo um ingrediente ativo (isto é, no mínimo uma molécula conforme descrito aqui, neste pedido de patente), opcionalmente com um ou mais aditivos favorecendo ótima dispersão, atomização, umidificação das folhas, distribuição, retenção e/ou capatação de agroquímicos. Como um exemplo não limitante de semelhantes aditivos estão diluentes, solventes, adjuvantes, tensoativos, agentes umectantes, agentes de dispersão, óleos, aderentes, penetrantes, agentes de tamponamento, acidificantes, agentes desespumantes ou agentes de controle de dispersão. Um "agroquímico" conforme usado aqui, neste pedido de patente, inclui não somente compostos ou formulações de compostos que estão prontas para uso, mas também precursores em uma forma inativa, os quais podem ser ativados por fatores externos. Como um exemplo não limitante, o precursor pode ser ativado por alterações de pH, caused by planta wounds upon insect damage, por ação enzimática provocada por ataque fúngico, ou por alterações de temperatura ou alterações na umidade. Agroquímicos, conforme usado aqui, neste pedido de patente, não somente inclui agentes (por exemplo, pesticidas, reguladores do crescimento, nutrientes / fertilizantes, repelentes, desfolhantes etc.) que são adequados e/ou pretendidos para uso em colheitas de campo (agricultura), mas também inclui agentes (por exemplo, pesticidas, reguladores do crescimento, nutrientes / fertilizantes, repelentes, desfolhantes etc.) que são pretendidos para uso em colheitas de estufa (horticultura / floricultura) e mesmo agentes ue são adequados e/ou pretendidos para usos não de colheita tais como usos em jardins privados, usos domésticas (por exemplo, herbicidas ou inseticidas para uso doméstica), ou usos por operadores de controle de pragas (por exemplo, controle de ervas daninhas etc.). Preferencialmente, o referido agroquímico ou combinação de agroquímicos é selecionado entre o grupo consistindo de herbicidas (por exemplo, uma molécula com uma região Yi direcionada contra proteínas de ervas daninhas), inseticidas (por exemplo, uma molécula com uma região Yi direcionada contra proteínas de insetos), fungicidas (por exemplo, uma molécula com uma região Yi direcionada contra proteínas de mofos), nematicidas (por exemplo, uma molécula com uma região Yi direcionada contra proteínas de nematódeos), biocidas (por exemplo, uma molécula com uma região Yi direcionada contra proteínas de patógenos), ou compostos para regular o crescimento de plantas (por exemplo, uma molécula com uma região Yi direcionada contra proteínas da planta à qual é administrada). Ingredientes ativos adicionais (que não são moléculas conforme descrito aqui, neste pedido de patente) são particularmente selecionados entre herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, micro-nutrientes ou compostos para regular o crescimento de plantas.
[00860] Em particular, uma composição agroquímica semelhante da invenção pode compreender uma microcápsula, microsfera, nanocáp-sula, nanosfera, lipossomas ou vesículas etc. nos quais o um ou mais agroquímicos são convenientemente encapsulados, encerrados, embutidos, incorporados ou incluídos de modo diverso; e um ou mais agentes de direcionamento que cada um compreende um ou mais domínios de ligação para ligação a um ou mais antígenos presentes em ou no referido sítio de ligação ou que formam o referido um ou mais sítios de ligação on uma planta ou partes de uma planta, tais como uma folha, caule, flor, fruto, bulbo ou tubérculo de uma planta). O veículo com o um ou mais agentes de direcionamento ligados, acoplados ou anexados de modo diverso a este ou associados com este pode ser dissolvido, emulsificado, suspendido ou dispersado ou incluído de modo diverso em um meio líquido adequado (tal como água ou outro meio aquoso, orgânico ou oleoso) d emodo a proporcionar uma solução (concentrada), suspensão, dispersão ou emulsão que pode ser armazenada e (quando necessário depois de diluição adicional) aplicada a uma planta, a uma ou mais partes de uma planta (tais como folhas, caule, raízes, frutos, cones, flores, bulbos ou tubérsculo), ou ao ambiente de uma planta (por exemplo, ao solo no qual a planta cresce), por exemplo, por pulverização, derramamento, gotejamento, escovação, revestimento por gotejamento ou qualquer outra técnica adequada. Em consequência, a composição pode ligar no ou ao sítio de ligação (ou a um ou mais antígenos presentes em ou no referido sítio de ligação ou que formam o referido sítio de ligação, tais como tricomas, estômato, cutícula, lenticelas, abrolhos, espinhos ou camada de cera) através de um ou mais domínios de ligação que formam parte do um ou mais agentes de direcionamento compreendidos na composição, preferencialmente em uma maneira direcionada. Em consequência, os agroquímicos são liberados pelo veículo (por exemplo, devido a degradação do veículo ou transporte passivo através da parede da microcápsula, microsfera, nanocápsula, nanosfera, lipossoma ou vesícula etc.) em um modo tal que podem proporcionar a uma ou mais ações agroquímicas desejadas. Como uma alternativa à uso de um veículo, o agroquímico ou combinação de agroquímicos também pode ser proporcionado sob a forma de (pequenas) partículas as quais são propor- cionads com um revestimento adequado ou camada (externa) ao qual o agente de direcionamento é acoplado ou pode ligar e o qual também pode servir para estabilizar ou melhorar a integridade física ou a estabilidade das partículas. Como outra alternativa, o agroquímico ou combinação de agroquímicos pode ser misturado convenientemente com um excipiente ou ligante ao qual o agente de direcionamento é acoplado ou pode ligar, e o qual novamente também pode servir para estabilizar ou melhorar a integridade física ou a estabilidade das partículas. As partículas revestidas ou compostas referidas estão preferencialmente sob a forma de uma pasta semifluida, torta úmida ou pó de livre escoamento, comprimido, cápsula ou concentrado líquido (tal como uma emulsão, suspensão, dispersão).
[00861] Deve ser entendido que embora modalidades particulares, configurações específicas bem como materiais e/ou moléculas, tenham sido discutidos aqui, neste pedido de patente, para células e métodos de acordo com a presente invenção, várias alterações ou modificações na forma e detalhes podem ser feitas sem se afastar do âmbito e do espírito desta invenção. Os exemplos que se seguem são proporcionados para melhor ilustrar modalidades particulares, e não devem ser considerados limitantes para o pedido. O pedido é limitado somente pelas reivindicações.
Exemplos
[00862] Nos exemplos que se seguem, são salientadas diferentes aplicações da tecnologia de interferon. A utilidade das presentes moléculas no tratamento de doença infecciosa é ilustrada nos Exemplos 1 a 3, relativa a aplicações antifúngicas, antibacterianas e antivirais, respectivamente. O Exemplo 1 detalha como o crescimento de biofilme pode ser tratado ou prevenido, e também mostra a hiporregulação de resistência ao stress em levedura. O Exemplo 2 mostra que múltiplas espécies bacterianas, inclusive espécies resistentes a antibiótico, po- dem ser mortas de modo eficaz enquanto não sendo tóxicas para células de mamíferos. Além disso, o Exemplo 2 mostra a viabilidade da administração in vivo dos peptídeos para tratar infecção. O Exemplo 3 caracteriza a identificação de moléculas de interferon direcionadas contra diferentes proteínas do vírus da gripe.
[00863] Diferentes modos nos quais as presentes moléculas podem ser usadas em detecção de proteínas (variando de proteínas bacterianas a proteínas humanas), e como esta pode ser aplicada em diagnóstico de doença por detecção de biomarcadores em amostras complexas, são ilustrados no Exemplo 4.
[00864] O Exemplo 5 detalha aplicações para doença não infecciosa, mostrando agregação específica de duas tirosina quinases receptoras de conhecimento geral, envolvidas no câncer e na degeneração macular relacionada com a idade (AMD). Também é mostrado o conceito de modulação da função imune usando as moléculas de interferon descritas aqui, neste pedido de patente.
[00865] Finalmente, o Exemplo 6 mostra que as presentes moléculas também podem ser aplicadas para obter hiporregulação de proteínas em plantas.
1. Aplicações anti-fúngicas 1.1 Introdução
[00866] Candida albicans forma parte da flora humana normal, e cresce sobre superfícies de mucosa em indivíduos. Em hospedeiros suscetíveis, este organismo fúngico pode provocar tanto doença da mucosa e quanto hematogenicamente disseminada. Para a C. albicans persistir no hospedeiro e induzir doença, deve ser capaz de aderir a superfícies bióticas e abióticas, invadir as células hospedeiras, e obter ferro. A proteína de superfície hifa-específica de C. albicans Als3 é umn membro da família de proteínas de sequência semelhante a aglutinina (Als) e é importante em todos estes processos (Hoyer LL et al (1998) Curr. Genet. 33(6): 451-9) e Liu Y et al (2011) Eukaryotic Cell. 10(2):168-73. Funcionando como uma adesina, Als3 media a anexação a o células epiteliais, células endoteliais, e proteínas da matriz extracelular. Também tem um papel importante na formação de biofilme sobre superfícies protéticas. Als3 é uma das duas invasinas de C. albicans conhecidas. Liga a receptores de células hospedeiras tais como E-caderina e N-caderina e deste modo induz as células hospedeiras a endocitose do organismo. Als3 também liga a ferritina das células hospedeiras e possibilita que a C. albicans utilize esta proteína como uma fonte de ferro. Devido a suas múltiplas funções e seu alto nível de expressão in vivo, Als3 é considerada como um alvo promissor para combater infecções por Candida. No presente exemplo os produtos e os métodos da invenção foram aplicados para visar especificamente a proteína Als3.
1.2 Expressão intracelular de interferons Als3 específicos
[00867] O algoritmo TANGO de prognóstico de beta-agregação foi usado para identificar a sequência, LQQYTLLLIYLSVATAK (SEQ ID NO: 1) derivada a partir de Als3 (representada na SEQ ID NO: 2), como uma sequência com um alto potencial de formação de agregação. Este resíduo de 17 aminoácidos (SEQ ID NO: 1), correspondente aos aminoácidos 2-18 na SEQ ID NO: 2, foi empregado como a sequência de isca em constructos de interferon intracelular. QQ e K agem como resíduos gatekeeper naturais (porções X1 e X2), YTLLLIYLSVATA (SEQ ID NO: 107) é a região Y1 neste caso. A sequência de DNA, codificando para SEQ ID NO: 1, foi clonada no vetor de expressão de C. albicans pPCK1-GFP (Barelle et al., (2004) Yeast 21(4): 333-40) in frame com o gene de GFP (Proteína Fluorescente Verde) otimizado por C. albicans e uma sequência de poliencadeador, adicionalmente geneticamente acoplada a uma sequência de DNA codificando para um reforço de agregador e uma etiqueta de HA. Esta chamada se- quência de reforço (RKLLFNL (SEQ ID NO: 68)) é uma sequência artificial com alta propensão para agregar. A sequência RKLLFNL (SEQ ID NO: 68) mostra DnaK ligação e é uma sequência adaptada (a sequência tipo selvagem é RKLFFNL (SEQ ID NO: 69)) derivada do fator sigma 32 (vide McCarty J. et al (1996) J. Mol. Bio. 256, 829-837). A expressão do constructo de fusão completa foi sob o controle do promotor PCK1. O gene PCK1 é reprimido por glicose e codifica PEP carboxiquinase por fontes de carbono gliconeogenéticas tais como ácidos ou succinato (Leuker et al (1997) Gene 192: 235-240).
[00868] SEQ ID NO: 2: sequência de aminoácidos de Als3 de Candida albicans
1 mlqqytllli ylsvatakti tgvfnsfnsl twsnaatyny kgpgtptwna vlgwsldgts
61 aspgdtftln mpcvfkftts qtsvdltahg vkyatcqfqa geefmtfstl tctvsntltp
121 sikalgtvtl plafnvggtg ssvdledskc ftagtntvtf ndggkkisin vdfersnvdp
181 kgyltdsrvi pslnkvstlf vapqcangyt sgtmgfanty gdvqidcsni hvgitkglnd
241 wnypvssesf sytktcssng ifityknvpa gyrpfvdayi satdvnsytl syaneytcag
301 gywqrapftl rwtgyrnsda gsngivivat trtvtdstta vttlpfdpnr dktktieilk
361 piptttitts yvgvttsyst ktapigetat vivdipyhtt ttvtskwtgt itsttthtnp
421 tdsidtvivq vpspnptvtt teywsqsfat tttitgppgn tdtvlirepp nhtvttteyw
481 sesytttstf tappggtdsv iikeppnptv ttteywsesy tttttvtapp ggtdtviire
541 ppnhtvttte ywsqsytttt tviappggtd sviireppnp tvttteywsq syattttita
601 ppgetdtvli reppnhtvtt teywsqsyat tttitappge tdtvlirepp nhtvttteyw
661 sqsytttttv iappggtdsv iikeppnptv ttteywsqsy attttitapp getdtvlire
721 ppnhtvttte ywsqsyattt titappgetd tvlireppnh tvttteywsq sfattttvta
781 ppggtdtvii reppnhtvtt teywsqsfat tttvtappgg tdtvlirepp nptvttteyw
841 sqpytttttv iappggtdtv iiydtmssse issfsrphyt nht
[00869] O plasmídeo, compreendendo o cassete de expressão, foi linearizado no locus RPS10 antes de transformação da cepa CAI4 de C. albicans (Fonzi and Irwin (1993) Genetics 134: 717-728). Transformantes foram gerados e foi confirmados por análise por PCR que compreendem o cassete de expressão. Três transformantes independentes AFA16a, AFA16b e AFA16c (expressando a GFP + reforçadores + sequência de isca) foram usados em experimentos subsequentes. Como um controle negativo, foi usado um recombinante compreendendo o mesmo plasmídeo mas carecendo da sequência de isca específica. Isto resultou na cepa de controle, AFA15a (expressando a GFP + reforçadores). Para identificar a localização do peptídeo de isca foi usada a expressão de GFP. Todas as cepas foram cultivadas de um dia para o outro sob condições de repressão. Em seguigda, as células foram transferidas para meio YNB, pH 6,5 suplementado com 4% de D-glicose (condições de repressão de promotor) ou ao mesmo meio suplementado com casaminoácidos (condições de indução de promotor). Seguiu-se a expressão do constructo de interferon através de ensaio de fluorescência de GFP depois de 1 h, 2 h, 3 h e 5 h. Sob condições de repressão, nenhuma fluorescência de GFP pode ser detectada (dados não mostrados).
[00870] AFA15a de C. albicans mostrou a presença de um sinal de difuso intracelular, ao invés de uma localização simples dentro do compartimento celular. No entanto, cepas de C. albicans recombinante compreendendo os constructos de interferon apresentaram loci pontuados, especificados como agregados de proteína anti-Als3 dentro do citosol. Este fenômeno foi mostrado já 2 horas pós indução e proliferou dentro de pontos do tempo posteriores. Ao longo do tempo, a quantidade de pontos aumentou em uma faixa de 1 a 3 por célula. Pontos do tempo posteriores indicaram a mesma proporção de focos, de modo similar ao obtido depois de 5 h (dados não mostrados). Isto indicou que a presença das sequências de isca interferentes curtas resulta em uma agregação induzida.
1.2.1 Formação de biofilme in vitro
[00871] Uma vez que se sabe que Als3 é importante para adesão e formação de biofilme, foram também usadas as cepas recombinantes em experimentos de biofilme os quais foram realizados in vitro. A hipótese de partida foi que cepas de C. albicans expressando o constructo de interferon tinham fenótipos similares em adesão e formação de biofilme às cepas obtidas com o mutante de deleção de C. albicans ALS3. Cepas recombinantes expressando os interferons foram testadas para sua capacidade para formar biofilme in vitro sobre discos quadrados de silicone. Biofilmes maduros (48 h) foram obtidos depois de crescimento em YNB, pH 6,5 com ou succinato ou 4% de D-glicose como uma fonte de carbono. Em seguida a arquitetura do biofilme foi avaliada por microscopia por fluorescência. Foi observado que C. albicans AFA15a proliferou dentro de 48 h resultando em robusta anexação e arquitetura de biofilme maduro através de toda a superfície de silicone, independente de crescimento em condições induzidas ou reprimidas. De modo importante, C. albicans SC5314 (C. albicans selvagem conforme referenciada por Gillum et al (1984) Mol Gen Genet 198:179182) desenvolveram biofilme maduro equivalente a AFA15a (dados não mostrados). Por outro lado, a indução de expressão de constructos de interferon Als3 resultou em uma adesão fortemente reduzida e formação de biofilme caracterizada por áreas pretas sem quaisquer células anexadas. O desenvolvimento de biofilme rudimentar referido é similar ao desenvolvimento de biofilme produzido pelo mutante Als3 homozigoto de C. albicans als3Δ/als3Δ. Todos os três transformantes independentes foram capazes de formar biofilmes maduros semelhantes a AFA15a, quando cultivados em YNB, 4% de D-glicose. Adicionalmente a microscopia por fluorescência, os biofilmes foram quantificados por unidades formadoras de colônia (CFU). Os dados são apresentados na figura 3.
[00872] A quantificação dos biofilmes foi em nítido acordo com as observações obtidas a partir da microscopia por fluorescência de GFP. Conforme esperado, as cepas de controle (C. albicans SC5314 e AFA15a) produziram biofilmes maduros sob as duas condições de crescimento. Em contraste, recombinantes expressando os interferons de C. albicans Als3 deixaram significativamente de formar biofilme (p< 0,001) (foi observado quase 80% de inibição) comparados com a cepa selvagem, ao passo que quando cultivados sob condições de repressão, atingiram sua função e produziram biofilmes similares às cepas de controle (quase 100% de formação de biofilme). Estes resultados corroboram o fato de que a agregação induzida de proteínas de Als3 resultou em perda de sua função e os recombinantes expressando os interferons têm um fenótipo similar ao fenótipo obtido com a cepa de C. albicans als3Δ/als3Δ.
1.2.2 Aderência e invasão de células epiteliais humanas
[00873] Além de ter um papel na adesão, Als3 também está envolvido em invasão a células epiteliais e células endoteliais humanas. Portanto em uma etapa seguinte estudou-se a capacidade das cepas de C. albicans recombinante para aderir e para invadir células epiteliais humanas de cepas de controle de C. albicans (SC5314 e AFA15a) e cepas recombinantes expressando os interferons (AFA16a, AFA16b e AFA16c) foram cultivadas em condições de indução / de repressão de um dia para o outro. C. albicans als3Δ/als3Δ foi usada como um controle. O contato de Candida com células epiteliais foi avaliado depois de 1 h, ao passo que a invasão foi monitorada depois de 3 h. A percentagem de células fúngicas aderidas e invadidas é mostrada na figura 4A e B.
[00874] A capacidade de cepas de Candida albicans expressando o constructo de interferon Als3 para (A) aderir e (B) invadir linhagem de células epiteliais TR-146. As cepas foram incubadas de um dia para o outro em YNB, pH 6,5 suplementado com succinato, (barras brancas) ou em YNB, pH 6,5, 4% de D-glicose (barras pretas). Ambos os ensai- os foram realizados em meio DMEM contendo NaHCO3, D-glicose, piruvato de Na e glutamina sem FCS. A aderência foi realizada por 1 h, ao passo qeu a invasão foi por 3 h, ambas em 37°C, 5% de CO2. Células de Candida aderidas foram coradas com calcofluor branco e a percentagem de células aderidas foi calculada como uma média de células de Candida fixadas sobre uma centena de áreas espalhadas sobre toda a superfície da lamínula. A percentagem de células de C. albicans invasoras foi determinada dividindo o número de células internalizadas pelo número total de células aderentes. No mínimo 100 células fúngicas foram contadas sobre cada lamínula. C. albicans SC5314 foi usada como uma cepa de controle (100%) e C. albicans als3Δ/als3Δ como um controle negativo. Uma diferença significativa entre a adesão / invasão de cepas expressando constructo de interferon a células epiteliais comparadas com controle é determinada por p<0,001(*). Desvios padrões foram calculados a partir de dois experimentos independentes.
[00875] A indução do interferon Als3 específica em C. albicans levou a reduzida adesão a células epiteliais em uma faixa de 40% a 50%, conforme mostrado na figura 4A. Esta diferença é estatisticamente significante (p < 0,001). É surpreendente que a cepa recombinante AFA16a aderiu ao mesmo nível que als3Δ/als3Δ (vide a Fig. 3A). Conforme esperado, crescimento recombinante sob condições reprimidas (isto é, não produzidos interferons de proteína Als3) teve comportamento similar às cepas de controle. A cepa AFA15a apresentou capacidade de adesão comparável a C. albicans SC5314, independente das condições usadas. Em seguida, os recombinantes carregando constructos de interferon Als3, apresentaram aproximadamente 40% de redução em invasão, quando cultivados em condições induzidas, ao passo que cultivados em condições de repressão atingiram sua função (vide a figura 4B). Conforme esperado, C. albicans als3Δ/als3Δ não teve èxito em invadir células epiteliais (p < 0,001).
[00876] No presente exemplo foi mostrada que a abordagem recombinante se comprova um sistema confiável que pode ser usado adicionalmente para estudar agregação de proteínas direcionada de proteínas particulares de interesse.
1.3 Aplicação externa de peptídeos interferon Als3 a C. albicans reduz a adesão e a formação de biofilme
[00877] Uma vez que a proteína Als3 está localizada na parede celular, foi cogitada a possibilidade de induzir agregação de Als3 específica por aplicação exógenas de interferons Als3-específicos às células de Candida. Além da sequência usada no cassete de expressão recombinante (YTLLLIYLSV (SEQ ID NO: 70)), o algoritmo TANGO revelou sequências de aminoácido adicionais com forte propensão a agregação em Als3. Portanto, também o nonapeptídeo NGIVIVATT (SEQ ID NO: 71) e o peptídeo TWLCGLITLLSLF (SEQ ID NO: 72) foram previstos para terem altos potenciais de agregação (faixa de 50% a 99% de propensão a agregação). Foram modelados, sintetizados e testados vários derivados destas sequências de TANGO. A Tabela 1 representa os 23 diferentes peptídeos usados.
[00878] Para esclarecer o esquema das moléculas com referência à fórmula geral conforme proposto no pedido, E1 e E2 são moléculas foram n=1. Para E1, X1 e X2 são cada um um resíduo arginina, Y1 é um trecho de 9 resíduos conforme presente na proteína Als3 e Z1 está ausente. Notar que isto pode ser declarado de modo equivalente como X1 é RNG, X2 é R, e Y1 é uma sequência de heptapeptídeo contígua presente na proteína Als3. No entanto, uma vez que NG são os resíduos vizinhos na sequência Als3 (vide a SEQ ID NO: 2), e o nonapeptídeo satisfaz os requisitos de um trecho Yi, a notação precedente é preferencial. Para E2, X1 é R e X2 é K, Y1 é um trecho de 16 resíduos conforme presente na proteína Als3 e Z1 está ausente.
[00879] F9 é uma molécula onde n=2. X1 é RK e X2 é G, Y1 é uma sequência sintética, Z1 é S, X3 e X4 são cada um resíduo arginina, Y2 é um trecho de 9 resíduos conforme presente na proteína Als3 e Z2 está ausente (isto é, a segunda parte da molécula é idêntica a E1). Notar que nesta molécula, X1 e Y1 juntos formam uma sequência artificial derivada do fator sigma 32 (vide McCarty J. et al (1996) J. Mol. Bio. 256, 829-837) com alta propensão a agregação.
[00880] Os próximos 20 peptídeos todos têm um esquema similar onde n=2, todas as porções X são um resíduo, tanto Y1 quanto Y2 são uma sequência que ocorre na proteína Als3, Z1 é um ligante de GS e Z2 está ausente.
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[00881] A triagem inicial e pesquisa para interferons candidatos Als3 ótimos foi baseada no ensaio de adesão de C. albicans SC5314 sobre placas de poliestireno de 96 cavidades depois de administração de todos os peptídeos em três diferentes concentrações (250 μΜ, 50 μΜ e 10 μΜ). Com base nos resultados obtidos com este ensaio de adesão, foi também testado o efeito dos peptídeos sobre o desenvolvimento de biofilme maduro. A escolha final dos peptídeos interferon candidatos mais ótimos foi baseada nos resultados apresentando redução na adesão e formação de biofilme maduro causadas pela menor concentração do peptídeo testada (10 μΜ ou 2,5 μΜ). Um exemplo de três peptídeos interferon adequados é mostrado na figura 5A e 5B.
[00882] Entre os 23 peptídeos interferons diferentes testados, o peptídeo F9 apresentou a melhor atividade contra desenvolvimento de biofilme maduro in vitro, mesmo quando se usa concentrações muito baixas (p < 0,001) (vide a Figura 5). Com base nos dados representados na Figura 5, o peptídeo F9 (RKLLFNLGSRNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 9)) foi selecionado para experimentos adicionais. A principal sequência agregadora do peptídeo F9 é NGIVIVATT (SEQ ID NO: 71) com um alto potencial de agregação. Além do peptídeo F9, também o peptídeo E1 (RNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 7)) manifestou atividade significativa contra o desenvolvimento de biofilme maduro in vitro, ao se usar maiores concentrações (250 μΜ e 50 μΜ).
1.3.1 Determinação da concentração ótima de interferon F9 sobre a adesão e o desenvolvimento de biofilme
[00883] Os resultados iniciais (vide a Figura 5) apresentaram atividade promissora do peptídeo interferon F9 contra biofilme de C. albicans maduro in vitro quando usado em condições de triagem inicial (250 μΜ, 50 μΜ, 10 μΜ). Em uma etapa seguinte, menores concentrações de peptídeo F9 (50 μΜ, 10 μΜ e 2,5 μΜ) também foram testadas. Primeiro, foi elucidado o efeito do peptídeo F9 durante o período de adesão (90 min a 37°C). Em seguida, testou-se seu efeito sobre o desenvolvimento de biofilme adicional, modificando o meio com RPMI1640-MOPS fresco, na ausência de peptídeo por 48 h. Ambos os ensaios foram realizados em placas de poliestireno de 96 cavidades e quantificados pelo ensaio de redução de XTT (vide a seção de material e métodos). Os resultados são mostrados na figura 6A e B.
[00884] Conforme mostrado na figura 6A, mesmo a menor concentração (2,5 μΜ) de peptídeo interferon F9 já diminuiu dramaticamente as propriedades de adesão de células de Candida (p< 0,001). E maiores concentrações de peptídeo interferon F9 (50 μΜ e 10 μΜ) aboliram quase completamente a fixação de Candida. C. albicans als3Δ/als3Δ foi usada como um controle. Foi visto surpreendentemente que a cepa de nocaute ALS3 ainda manifestou melhores propriedades de aderência do que células selvagens tratadas com peptídeo interferon F9. Sem ser limitado a um possível mecanismo, uma explicação plausível pode ser que o peptídeo interferon F9 causa beta-agregação não somente de Als3 mas adicionalmente também das proteínas de Candida albicans homólogas Als1 e Als5.
[00885] Conforme foi demontrado antes na figura 5B, a administração contínua de peptídeo F9 durante o completo desenvolvimento de biofilme de C. albicans (isto é, durante um período de 48 h), incluindo adesão, resultou em forte redução da formação de biofilme matduro. Ao passo que, aqui representado na Figura 6B, é mostrado que células de C. albicans foram tratadas com peptídeo F9 somente durante o período de adesão. Biofilmes maduros foram deixados para formar em meio fresco RPMI1640-MOPS sem peptídeo. De modo importante, o peptídeo interferon F9 diminuiu a capacidade das células de Candida para formar um biofilme de modo similar à cepa de C. albicans als3Δ/als3Δ. Maiores concentrações testadas (50 μΜ), causaram uma inibição de quase 90% de biofilme, ao passo que menores concentra- ções (10 μΜ e 2,5 μΜ), causaram redução do desenvolvimento de biofilme a partir de 40% até 50% (p< 0,001). Concluiu-se que o peptídeo interferon F9 foi capaz de interferir de modo eficaz com duas condições experimentais diferentes de desenvolvimento de biofilme de C. albicans.
[00886] Em uma etapa seguinte também foi investigado um potencial papel inibidor do peptídeo interferon F9 durante o desenvolvimento de biofilme de C. albicans in vivo. Foi usado o modelo de biofilme de C. albicans subcutâneo in vivo em ratos (isto é, biofilmes in vivo formados dentro de pedaços de cateter de triplo lúmen de poliuretano) conforme adicionalmente esboçado na seção de materiais e métodos. Somente uma concentração de peptídeo F9 (isto é, 50 μΜ) foi testada nas condições experimentais. O peptídeo foi administrado ex vivo, durante a frixação inicial de Candida ao substrato (90 min, 37°C). Depois disso, os catéteres foram lavados e implantados subcutaneamente em ratos. Os biofilmes foram estudados seis dias pós implantação e quantificados por CFUs. Os resultados destas análises são mostrados na figura 7.
[00887] As CFUs médias ± desvio padrão obtidas por fragmento de cateter de catéteres tratados com peptídeo (2,25 ± 1,08 log10 CFU/ fragmento de cateter) foi significativamente diferente da quantidade de células de Candida obtidas a partir de catéteres do controle (3,69 ± 0,42 log10 CFU/ fragmento de cateter) (p< 0,001). De modo importantle, quatro catéteres tratados com peptídeo (20%) de 20 continham menos de 2,0 log10 CFU/ fragmento de cateter, o qual é o limiar para determinação de infecção por Candida na prática clínica (Mermel et al (2001) Clin. Infect. Dis. 32:1249-1272. C. albicans als3Δ/als3Δ manifestou capacidade de biofilme similar (3,30 ± 0,55 log10 CFU/ fragmento de cateter) a células selvagens não tratadas mas C. albicans als1Δ/als1Δ als3Δ/als3Δ fracassou significativamente em formar biofilme no mode- lo de biofilme subcutâneo in vivo, conforme ensaiomunhado pelos baixos valores de CFU (1,46 ± 1,24 log10 CFU/ fragmento de cateter) (p< 0,001). A potente atividade do peptídeo F9 pode vir do efeito do peptídeo durante o período de adesão. Portanto, também foi testada a atividade do peptídeo F9 durante a adesão de C. albicans sobre substrato de poliuretano (figura 8).
[00888] O tratamento das células de Candida com peptídeo F9 diminuiu significativamente a fixação a dispositivos de poliuretano (2,18 ± 0,12 log10 CFU/ fragmento de cateter) comparado com o controle (3,06 ± 0,39 log10 CFU/ fragmento de cateter) (p< 0,001). Estes resultados estão de acordo com os dados obtidos durante as propriedades de adesão Candida sobre poliestireno. Isto sugere que a agregação de proteínas de Als3 apareceu durante estágios precoces do desenvolvimento de biofilme. Conforme esperado, C. albicans als3Δ/als3Δ e C. albicans als1Δ/als1Δ als3Δ/als3Δ apresentaram significativamente menos capacidades de aderência sobre poliuretano comparadas com a cepa selvagem (p< 0,001).
1.3.2 Especificidade do interferon F9 para Candida albicans
[00889] A especificidade do peptídeo interferon F9 foi investigada para C. albicans em comparação com uma Candida spp. distante, isto é, Candida glabrata ATCC2001, para inibição da formação de biofilme in vitro. A sequência de beta-agregação do peptídeo F9 (NGIVIVATT (SEQ ID NO: 71)) não está presente em C. glabrata - a sequência mais intimamente relacionada em C. glabrata é NGVVIVAAT (SEQ ID NO: 73). Foi demonstrado que Candida glabrata formar um biofilme eficaz in vitro sobre poliestireno e poliuretano. foram testados o efeito de F9 contra a adesão e a formação de biofilme de C. glabrata sobre placas de poliestireno de 96 cavidades in vitro. Os biofilmes foram quantificados por ensaio de redução de XTT e os resultados salientaram que o peptídeo F9 não interferiu com a adesão e o desenvolvi- mento de biofilme de C. glabrata. Estes dados corroboram o fato de que a eficiência do peptídeo F9 contra a adesão e o desenvolvimento de biofilme maduro é sequência-dependente e altamente específica.
1.3.3 A aplicação do peptídeo interferon F9 também diminui a capacidade de C. albicans para aderir e para invadir células epiteliais
[00890] Conforme discutido acima aqui, neste pedido de patente, C. albicans Als3 também tem um papel na aderência e invasão a células epiteliais e células endoteliais. Mostrou-se (no exemplo 1.2.2) que cepas recombinantes expressando um interferon Als3 específico diminuiu significativamente a capacidade para aderir e para invadir linhagens celulares de células epiteliais sob condições induzidas por interferon. Aqui foi investigado o efeito da aplicação externa do peptídeo interferon F9 sobre a aderência e a invasão de C. albicans SC5314 a células epiteliais. Para isto, células de Candida foram incubadas junto com as células humanas (linhagem de células epiteliais TR-146) na presença do peptídeo F9 durante adesão (1 h) ou invasão (3 h). A quantidade de células aderidas e internalizadas foi determinada por contagem usando epifluorescência. Os resultados são apresentados na figura 9.
[00891] Conforme esperado, C. albicans als3Δ/als3Δ apresentou capacidade significativamente reduzida (60%) para aderir e para invadir células epiteliais (p< 0,001). O efeito do peptídeo F9 sobre a aderência e a invasão de C. albicans SC5314 mostrou ser dependente da concentração (figura 9). A maior concentração (50 μΜ) diminuiu a adesão de Candida por 40% comparada com o controle (sem peptídeo). Menores concentrações (10 μΜ e 2,5 μΜ) provocaram um efeito de aproximadamente 20% a 15%, respectivamente. Além de adesão, também foi determinado o efeito do peptídeo F9 sobre a invasão. Maiores concentrações (50 μΜ) do peptídeo F9 diminuíram a invasão por 34%, ao passo que concentrações intermediárias (10 μΜ) reduziram a invasão por 15%. A menor concentração (2,5 μΜ) não teve qualquer efeito sobre a invasão (100%). Considerando que a adesão foi claramente afetada pela adição de F9, o efeito sobre a invasão foi menos evidente. Sem ser limitado a uma teoria em particular, é swabido que pode ocorrer invasão por mecanismos diferentes e adicionais, dos quais alguns podem ser menos dependentes de Als3.
1.3.4 Especificidade do peptídeo interferon F9 para Als3
[00892] No que foi descrito anteriormente foi mostrado que o peptídeo F9 causa um significativo efeito sobre a adesão de C. albicans a biomateriais (discos quadrados de silicone, poliestireno e poliuretano), também durante a formação de biofilme in vitro e in vivo, e também sobre a adesão e a invasão a células epiteliais. Contudo, estes resultados apontam para o fato de que Als3 é visado precisou ser demonstrado se Als3 é especificamente visado ou não. Para demonstrar especificidade, foi decidido detectar a presença de Als3 sobre a superfície de células de C. albicans depois da administração do peptídeo F9 por microscopia por fluorescência em competição com anticorpos específicos para Als3 disponíveis. Als3 é essencialmente expressado sobre células hifais e portanto a formação de hifas foi primeiro induzida por 20 min. Diferentes concentrações do peptídeo F9 (50 μΜ, 10 μΜ e 2,5 μΜ) foram administraedas a células hifais por 45 min. As células foram em seguida lavadas e incubadas na presença de anti-soro ALS3 por 60 min a 30°C e contra-coradas com IgG anti-coelho secundária conjugada com Alexa Fluor 488. Células de Candida tratadas com 1% de DMSO foram usadas como um controle. Células coradas foram visualizadas com epi-fluorescência usando um conjunto de filtros para detectar Alexa Fluor 488. Foi visto que as células de Candida tratadas com peptídeo interferon foram capazes de competir de modo eficaz com a ligação de anticorpo anti-ALS3 em uma maneira dependente da concentração. Portanto, células de Candida tratadas com a maior concentração (50 μΜ) do peptídeo F9 demonstraram cerca de 50 % de redução na ligação de anti-soro ALS3 em comparação com o controle (sem peptídeo, somente 1% de DMSO foi adicionado). Além disso, também concentrações intermediárias (10 μΜ) diminuíram a capacidade de células de Candida para ligar o anticorpo contra Als3. Estes dados também foram quantificados determinando a capacidade de células de C. albicans SC5314 tratadas com peptídeo interferon para ligar anticorpo anti-ALS3 em uma abordagem de Classificação Celular Ati-vadat por Fluorescência (FACS, Fluorescence-Activated Cell Sorting). Em comparação com microscopia por fluorescência, este método permitiu detectar o sinal de fluorescência a paritr de somente 10.000 células de Candida. Os dados da FACS claramente corroboraram a observação obtida a partir de imagens de microscopia. Células hifais de C. albicans tratadas com peptídeo F9 (50 μΜ), apresentaram uma quantidade significativamente reduzida de sinal fluorescente (54%) comparado com o controle (p< 0,001). Além disso, a concentração intermediária (10 μΜ) também causou uma surpreendente redução na ligação de anti-soro ALS3 (45%), ao passo que a menor concentração (2,5 μΜ) também causou uma redução de 10%. Portanto os dados mostram que o peptídeo F9 especificamente tem por alvo Als3 e induz sua agregação o que resulta em uma quantidade significativamente reduzida de Als3 sobre células hifais, a qual foi caracterizada por uma diminuída ligação de anticorpo anti-ALS3 em uma maneira dependente da concentração de F9.
1.4 Dispositivos médicos revestidos com interferon preveniram a formação de biofilme por C. albicans
[00893] Candida albicans é comumente diagnosticada em catéteres infectados com biofilme. Candida sp. pode formar biofilmes sobre uma ampla variedade de dispositivos médicos de catéteres urinários e vasculares, até próteses dentárias, de quadrila, de joelho e vocais e mesmo marca-passos. Esta ampla gama de biomateriais implantados que podem ser infectados com Candida reflete a capacidade para aderir a muitos tipos de substrato, incluindo materiais de plástico tais como silicone, poliestireno e poliuretano. A infecção destes dispositivos médicos frequentemente leva à perda de sua função, e pode constituir uma fonte de infecção sistêmica. Uma vez que os biofilmes de C. albicans são frequentemente extremamente resistentes a terapia antifúngica comum, os dispositivos infectados frequentemente precisam ser removidos. Os mecanismos de resistência não são bem estabelcidos mas a limitação de acesso do fármaco às células fúngicas é uma explicação possível. Nos exemplos anteriores foi mostrado que uma abordagem alternativa é interferir com a adesão de C. albicans ao substrato (por exemplo, silicone (exemplo 1.2.1), poliestireno (exemplo 1.3.2) e poliuretano (exemplo 1.3.2), isto é, evitando que o biofilme seja formado ao invés de combatendo um biofilme maduro. Nessa abordagem corrente foi preparado um material de cateter o qual é ligado de modo covalente com o peptídeo interferon F9. Métodos para ligar de modo covalente peptídeos a um suporte sólido são descritos na arte. A performance destes catéteres acoplados a interferon é avaiada em um modelo de rato in vivo conforme descrito no exemplo 1.3.2 de acordo com a seção de materiais e métodos 1.6.7.2.
1.5 Hiporregulação de calcineurina usando moléculas transgênicas
[00894] Em Candida albicans, Hsp90 é um chaperone essencial, altamente conservado envolvido na patogenicidade e em resistência a antifúngicos. A fosfatase calcineurina serina/treonina específica (CNB1) é um alvo de Hsp90, e um mutante de deleção homozigoto para cnb1 é sensível ao stress. Portanto, foi decidido ter por alvo a proteína calcineurina usando as moléculas apresentadas aqui, neste pedido de patente.
[00895] Esquema de moléculas de indução agregação de Cnb1
[00896] Análise TANGO da subunidade reguladora de Calcineurina revelou duas regiões propensas a agregação. As sequências de proteínas previstas FAFNIY (SEQ ID NO: 104) e LFIVM (SEQ ID NO: 105) apresentam uma propensão a β-agregação de respectivamente 40% e 96%. Estas duas sequências curtas foram usadas para modelar vários constructos diferentes para hiporregulação de CNB1 usando uma abordagem transgênica. Os constructos tiveram a seguinte estrutura:
[00897] Promotor - yEGFP - etiqueta de HA (sequência YPYDVP-DYA (SEQ ID NO: 108)) - ligante de aminoácidos (sequência MAQW (SEQ ID NO: 109)) - molécula com estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, com n=5 e
X1 = QN
Y1 = STLIVL (SEQ ID NO: 110)
X2 = Q
Z1 = 0
X3 = N
Y2 = STVIF (SEQ ID NO: 111)
X4 = E
Z2 = Q
X5 = N
Y3 = STVIF (SEQ ID NO: 111)
X6 = EQN
Z3 = KPAGAAKPGAAG (SEQ ID NO: 112)
X7, Y4, X8, Z4, X9, Y5, X10 são variados de acordo com o que é mostrado na tabela 2; e Z5 é nada.
Figure img0003
Figure img0004
[00898] Escrito de modo contíguo, a sequência para a qual, por exemplo, o constructo número 1 codifica portanto tem aspecto como se segue:
Promotor - yEGFP - YPYDVPDYA MAQW QNSTLIVLQNSTVIFEQNSTVIFEQNKPAGAAKPGAAGRFAFNIYRGSRLFIVMR (SEQ ID NO: 113)
[00899] As moléculas usadas nestes constructos contêm essencialmente dois tipos de regiões de indução de agregação: Y1, Y2 e Y3 servem como sequências sintéticas (isto é, não ocorrendo em Candida / não parte de CNB1) que reforçam a agregação, ao passo que Y4 e Y5 são as duas regiões propensas a agregação identificadas na proteína CNB1 que asseguram especificidade.
Propriedades dos transformantes
[00900] A caracterização inicial de transformantes carregando estes constructos foi feita por meio de ensaio in vivo para resistência a vários tipos de stress (aos quais mutantes cnb1Δ são sensíveis). Os constructos foram colocados sob o controle de um promotor PCK1 o qual é reprimido em meio contendo glicose (meio de Dextrose Sintética (SD)) e induzido em condições gluconeogenéticas (meio de Casa-mino Ácidos Sintéticos (SCAA)). Conforme mostrado na Fig.10, os transformantes na verdade são mais sensíveis à presença de SDS no meio, e isto somente quando a proteína agregadora é induzida. Não é observado nenhum efeito sobre o crescimento quando não há stress presente, indicando que o fenótipo observado não é devido a efeitos específicos ou tóxicos ligados a expressão dos constructos.
[00901] Os quatro transformantes diferentes diferem, e diferem so- mente, na natureza (e carga) dos gatekeepers X8 e X9 e do ligante de Z4. No entanto, eles também compartilham o mesmo fenótipo típico para hiporregulação de calcineurina. Portanto, nesta situação experimental, a carga dos gatekeepers e a natureza do ligante é somente de importância secundária - o sistema é suficientemente robusto para obter hiporregulação da proteína-alvo independente destas variantes.
[00902] Como os quatro constructos bão comparilhar as mesmas regiões de indução de agregação CNB1 na mesma ordem (isto é, FAFNIY (SEQ ID NO: 104) e LFIVM (SEQ ID NO: 105)), a qual é também a mesma ordem N- a C-terminal que estas regiões ocorrem na proteína calcineurina, foi decidido testar ser a ordem destas regiões determinantes de agregação seria importante.
[00903] Isto foi avaliado criando constructos onde somente as regiões Y4 e Y5 foram trocadas, conforme mostrado na tabela 3.
Figure img0005
[00904] Os transformantes 5 a 8 também foram testados para sua sensibilidade a SDS usando o mesmo ensaio. Todos os transforman- tes tiveram comportamento similarly aos transformantes com os constructos 1 a 4, isto é, o fenótipo se assemelha ao da levedura selvagem em condições de repressão de promotor e se assemelha ao do mutante de deleção cnb1 homozigoto em condições de indução de promotor. Isto nos permite concluir que, no mínimo nesta situação experimental, a ordem das regiões de indução de agregação não é vital para obter hiporregulação específica, e não precisa ser idêntica à ordem na qual as regiões ocorrem na proteína-alvo.
[00905] De modo a verificar se ambas as regiões contribuem para agregação específica, constructos onde Y4 e Y5 são idênticos (e portanto correspondem a ou LFIVM (SEQ ID NO: 105) ou FAFNIY (SEQ ID NO: 104)) também foram testados. Estes transformantes apresentaram o mesmo fenótipo (isto é, a presença de qualquer região isolada é suficiente para obter hiporregulação da calcineurina), mas em uma menor extensão (isto é, o fenótipo não foi observado em todos os transformantes testados, possivelmente devido a maior limiar dos níveis de expressão necessário para induzir agregação específica). A combinação de duas regiões de indução de agregação diferentes na mesma proteína para ter por alvo a proteína por conseguinte pode se comprovar benéfica.
1.6 Materiais e métodos para as aplicações anti-fúngicas 1.6.1. Animais e imunossupressão
[00906] Os animais usados para os experimentos in vivo foram ratos Sprague Dawley fêmeas de 200 g livres de patógeno específico (Janvier, France). A todos os animais foi adminitrada dieta padrão ad libitum e foram imunossuprimidos com 1 mg/L de dexametasona (Organon, Países Baixos) em sua água potável até 24 horas antes e durante todo o procedimento experimental. Tetraciclina (1 g/L) ou Ampici-lina (0,5 g/L) foi adicionada à água para minimizar infecções bacterianas. Todos os experimentos com animais foram mantidos de acordo com as regulações européias relativas à proteção e ao bem estar de animais laboratoriais e foram aprovados pelo comitê de ética em animais da Katholieke Universiteit Leuven.
1.6.2. Terapêuticos à base de peptídeos com a alta propensão para agregar a proteína de interesse - Als3
[00907] Terapêuticos à base de peptídeos específicos de C. albicans com a alta propensão para causar beta-agregação cruzada de Als3p foram sintetizados pela JPT Peptide Technologies GmbH (Berlin, Alemanha). Peptídeos altamente purificados (>90%, pureza detectada por HPLC) foram liberados em forma liofilizada e mantidos a -20°C antes do uso. Solução de estoque de cada peptídeo foi preparada em 50% de DMSO em água ultra pura (Invitrogen) até uma concentração final de 10 mM a 20 mM. Três concentrações diferentes (50 μΜ, 10 μΜ e 2,5 μΜ) de peptídeo positivo F9 foram testadas em cada ensaio. Experimentos incluindo peptídeos foram realizados em material de plástico de baixa adesão (Bioplastics, Países Baixos) para reduzir a auto-agregação.
1.6.3. Condições de cultura de levedura
[00908] Em geral, células de levedura foram cultivadas de um dia para o outro sob agitação contínua a 30°C em meio YP rico contendo 1% (em peso / volume) de extrato de levedura, 2% (em peso / volume) de Bactopeptona e 2% (em peso / volume) de D-glicose (YPD) a menos que declarado de modo diverso. Antes de experimentos de biofilme de C. albicans in vitro e in vivo, as células foram cultivadas sobre meio YPD sólido (contendo 1.5% (em peso / volume) de agar) de um dia para o outro a 37°C. Cepas carregando constructos agregadores foram cultivadas em YNB (base de nitrogênio delevedura, Yeast Nitrogen Base) com aminoácidos e sulfato de amônio, pH 6,5, (Difco, EUA) suplementado com succinato, Casaminoácidos (condições de indução de promotor) ou suplementado com 4% de D-glicose (condições de repressão de promotor). Para estudar o efeito potencial de peptídeos agregadores sobre o crescimento fúngico, as células foram incubadas na presença de concentração de 50 μΜ de cada peptídeo a 30°C. A concentração final de DMSO na amostra de controle não excedeu 1%. As amostras foram coletadas a cada hora e a densidade celular foi medida usando um espectrofotômetro (BioPhotometer, Eppendorf) a 600 nm.
1.6.4. Transição de levedura para hifas
[00909] Células de Candida foram cultivadas de um dia para o outro em meio YPD, lavadas duas vezes e adicionalmente incubadas em água estéril por um adicional de 2 h a 30°C (período de privação). Em seguida, a concentração celular foi ajustada para 1 x 106 células/ml, e as células foram incubadas em meio YP contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) (F7524, Sigma, EUA) ou em RPMI1640-MOPS, pH 7,0 com/ sem peptídeos (50 μΜ). As culturas foram incubadas por 1,5 h a 2 h a 37°C. A proporção de verdadeiras hifas vs. leveduras em brotação foi determinada por microscopia ótica (Axiostar plus, Carl Zeiss, Alemanha) em ampliação de 40x.
1.6.5. Determinação da Mínima Concentração Inibitória (MIC)
[00910] A Mínima concentração inibitória (MIC) de células planctô-nicas para antifúngicos foi determinada de acordo com a NCCLS M27-A3 (2008). Em resumo, cepas de C. albicans foram cultivadas de um dia para o outro a 30°C sobre placa de YPD. Suspensão celular de Candida (1 a 5 x 106 células/ml) foi preparada em meio RPMI1640-MOPS. As células foram adicionalmente diluídas a 1:50 e a partir de semelhante suspensão, 100 μl de células de Candida foi aplicado dentro de cada cavidade de uma placa de poliestireno de 96 cavidades. Em seguida, foi adicionado 100 μl, contendo diferentes concentrações de antifúngicos a serem testados. As cavidades de controle incluíram células de Candida onde somente foi adicionado RPMI1640-MOPS. As células foram deixadas para crescer por dois dias e a eficácia dos antifúngicos foi determinada medindo a densidade ótica (OD) das células usando um espectrofotômetro (Spectra max Plus 384) a 490 nm. Os dados foram determinados como MIC50 e MIC95, o qual representa a mínima concentração inibitória do fármaco a qual inibe crescimento fúngico por 50% ou 95%, respectivamente.
1.6.6. Determinação da Mínima Atividade Fungicida (MFC)
[00911] A Mínima atividade fungicida (MFC) foi determinada conforme descrito por Cantón et al. (2009) Antimicrob Agents Chemother. Jul;53(7): 3108-11. A MFC foi definida somente para anidulafungina, uma vez que este é o único fármaco com atividade fungicida em nesse estudo. Em resumo, 100 μl de suspensão celular de Candida pré-tratada com diferentes concentrações de fármaco antifúngico foi laminada sobre placas de YPD e adicionalmente incubada a 37°C por 24 h. A MFC foi determinada como um resultado de inibição de crescimento de 99%.
1.6.7. Modelos de biofilme de C. albicans 1.6.7.1 Sistema de biofilme de C. albicans in vitro
[00912] Biofilme de C. albicans in vitro foi estudado sobre três tipos de biomateriais diferentes, a saber placa de poliestireno de 96 cavidades de fundo liso (Greiner Bio-One, Alemanha), silicone (CS Hyde, EUA) e catéteres intravenosos de triplo lúmen de poliuretano (2,4 mm de diâmetro) (Arrow International Reading, EUA). Antes do estabelecimento do biofilme, o silicone foi cortado em pequenos pedaços quadrados (1 cm x 1 cm) e poliuretano em pedaços de 1 cm. Dispositivos de silicone ou poliuretano foram incubados em 99% de FBS (F7524, Sigma) de um dia para o outro a 37°C. As células foram lavadas e res-suspendidas em 1 x salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. Suspensão de Candida de 1 x 107 células/ml ou 5,104 células/ml foi preparada em meio RPMI1640-MOPS, Ssuccinato, pH 6,5 ou em meio YNB, 4% de D-glicose. No total, 1 ml da suspensão celular foi adicionado aos discos de silicone ou catéteres de poliuretano colocados em placa de 24 cavidades e 100 μl de suspensão celular foi inoculado em placa de poliestireno de 96 cavidades. A fixação das células a um substrato foi obtida por incubação a 37°C, por 90 min sob condições estáticas (período de adesão). Depois disso, células de Candida não fixadas foram removidas por duas rodadas de etapas de lavagem com 1 x PBS e submergidas em meio fresco por 48 h até 144 h a 37°C (biofilme maduro). Depois do que, os biofilmes foram lavados duas vezes com 1 x PBS e quantificados.
1.6.7.2 Sistema de biofilme de C. albicans subcutâneo in vivo
[00913] A linha do tempo experimental do desenvolvimento de biofilme de C. albicans in vivo em um novo modelo subcutâneo é ilustrada no esquema 1.
Figure img0006
[00914] Esquema 1: Linha do tempo experimental animal de modelo de biofilme de Candida albicans. Linha do tempo experimental do desenvolvimento de biofilme de Candida albicans in vivo em um novo modelo subcutâneo.
[00915] Células de C. albicans foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C sobre placas de YPD, lavadas e ressuspendidas em 1 x PBS. Suspensão celular de Candida (5,104 células/ml) foi preparada em meio RPMI1640-MOPS por contagem. Catéteres intravenosos de poliuretano de triplo lúmen (2,4 mm de diâmetro) cortados em segmentos de 1 cm (Arrow International Reading, EUA) foram incubados de um dia para o outro em FBS a 37°C. Catéteres revestidos com soro foram incubados por 90 min a 37°C em 1 ml de suspensão celular de Candida (período de adesão). Depois do período de adesão, os catéteres foram lavados duas vezes com 1 x PBS antes de serem implan- tados sob a pele de ratos conforme descrito (Van Wijngaerden et al. (1999) J Antimicrob Chemoth 44:669-674). Foi realizada anestesia por um curto período de inalação de gás enflurano (Alyrane™, Pharmacia). Os ratos foram mantidos adormecidos durante o procedimento de implante por uma mistura gasosa de enflurano (20 %) e oxigênio (80 %). A região lombar do rato foi raspada e desinfetada com clorhexidina a 0,5 % em álcool 70 %. Uma incisão de 10 mm foi feita longitudinalmente e a subcutis foi cuidadosamente dissecada para criar 3 túneis subcutâneos. Até dez fragmentos de cateter foram implantados. A incisão foi fechada com grampeadores cirúrgicos (Precise™, EUA), e desinfetada com clorhexidina a 0,5% em álcool 70%. Biofilmes foram formados por 48 h e 144 h. Para explante dos catéteres, os ratos foram eutanizados por inalação de CO2. A pele foi desinfetada e os fragmentos de cateter foram removidos de sob o tecido subcutâneo, lavados duas vezes com 1 x PBS e quantificados ou visualizados. Também foi caracterizado o efeito de peptídeos promovendo a agregação de Als3p durante o desenvolvimento de biofilme de Candida in vivo. Fragmentos de poliuretano revestidos com soro foram incubados com células de Candida (5 x 104 célu-las/ml) na presença de concentração a 50 μΜ de peptídeo positivo F9 e peptídeo negativo F9_negat, p13 e p20 durante o período de adesão (90 min, 37°C). Depois disso, células não aderidas foram removidas por duas rodadas de etapas de lavagem. Os catéteres foram implantados subcutaneamente na parte posterior de ratos imunossuprimidos conforme descrito acima. Os biofilmes foram estudados depois de seis dias pós implante por contagem de CFU.
1.6.8. Métodos de quantificação de biofilme 1.6.8.1 Ensaio de redução de XTT
[00916] A atividade metabólica de células de Candida dentro de biofilmes in vitro foi estudada usando o ensaio de redução de XTT. Este método é baseado em alteração colorimétrica de um substrato especí- fico - XTT (2,3-bis(2-metóxi-4-nitro-5-sulfo-fenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida) (Sigma, EUA) 0 qual é reduzido para XTT formazan por desidrogenases mitocondriais de células ativas metabólicas medidas por espectrofotômetro a 490 nm. A solução de trabalho de XTT (Sigma, EUA) foi preparada em 1 x PBS estéril com a concentração final de 1 mg/ml. Antes de uso, menadiona foi adicionada à solução de XTT em uma concentração final de 1 μΜ. Esta solução foi turbilhonada e 100 μl foi apliado dentro de cada cavidade contendo biofilme e incubado por 3 a 5 h a 37°C no escuro. A intensidade da alteração colorimétrica foi medida por espectrofotômetro (Spectra max Plus 384) a 490 nm. A solução de XTT-menadiona sem células de Candida foi usada como um em branco.
1.6.8.2 Quantificação de biomassa de biofilme fúngico
[00917] A quantidade de biomassa de biofilme fúngico formada dentro do lúmen do cateter de catéteres explantados in vitro e in vivo foi determinadsa por unidades formadoras de colônia (CFU). Em resumo, substratos in vitro e catéteres de biofilmes in vivo foram sonicados por 10 min a 40000 Hz em um sonicador de banho de água (Branson 2210) e adicionalmente turbilhonados por 30 s em 1 x PBS. Amostras originais e uma diluição a 1:10 foram laminadas sobre placas de YPD sempre em duplicata. As CFUs foram contadas depois de dois dias a 37°C.
1.6.9. Visualização de biofilmes de Candida por microscopia 1.6.9.1 Microscopia por fluorescência
[00918] Antes da microscopia por fluorescência catéteres in vitro e in vivo com biofilmes afixados foram cortados longitudinalmente e incubados em 1 x tampão de PBS com 50 μg/ml de calcofluor branco (Sigma, EUA) por 20 min. Estes dispositivos foram observados com um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan 2. As imagens foram adquiridas por uma câmera Zeiss Axiocam HRm usando o software Axiovision 3.0 (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
1.6.9.2 Microscopia eletrônica de varredura
[00919] Catéteres (cortados longitudinalmente) foram fixados em 3% de glutaraldeído em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio (pH 7,4) antes da microscopia. Os catéteres foram removidos da solução de fixação e secados de um dia para o outro. As amostras montadas foram revestidas por pulverização catódica com ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico de varredura XL30 ESEM FEG (Philips).
1.6.9.3 Microscopia a laser de escaneamento confocal
[00920] Catéteres cortados longitudinalmente e fixados foram incubados com 50 μg/ml de concanavalina A por uma hora a 37°C (conca-navalina A, Alexa Fluor®488 conjugado, Invitrogen). Imagens confo-cais foram adquiridas e analisadas com um sistema LSM510/ConfoCor2 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). O laser de Argônio (6 A, filtro regulável acusto-ótico ajustado a 50%) proporcionou a luz de excitação de 488 nm (para fluorescência de Concanavalina A-Alexa 488). A luz de excitação foi refletida por um espelho dicroico (HFT 488) e focalizada através de uma objetiva Plan-NeoFluar 20x NA0.5. A luz de emissão de fluorescência passou através de um filtro de 505 nm de passo longo e um orifício de 1 unidade aérea. Antes, a espessura do biofilme foi avaliada, primeiro, as fotografias tridimensionais (3-D) de biofilmes maduros foram capturados. Aproximadamente 200 seções foram feitas através de toda a arquitetura do biofilme. Então, a espessura do biofilme foi estimada a partir das bordas externas da área onde o sinal fluorescente ganha intensidade acima da metade de seu máximo até a área onde o sinal fluorescente não pode mais ser determina\do.
1.6.10. Microscopia por fluorescência de Proteína Fluorescente Verde (GFP)
[00921] As células foram usadas diretamente sem fixação e visuali- zadas usando um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan 2. A GFP foi visualizada com uma fonte de luz UV e um filtro de GFP de passo longo. As imagens foram tiradas por câmera de dispositivo acoplado a carga Quantix usando o software Axiovision 3.0 (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
1.6.11. Absorção do anti-soro ALS3 de coelho com tubos de germe de C. albicans als3Δ/als3Δ
[00922] A forma liofilizada de anticorpo anti ALS3 foi reconstituída em 500 μl de água esterilizada. O anti-soro foi absorvido com tubos de germe de C. albicans als3Δ/als3Δ antes de o usar para microscopia por fluorescência e FACS. Três frascos contendo 1 x 106 células/ml foram germinados em meio RPMI1640 com L-glutamina e com HEPES (PAA, Áustria) por 90 min a 37°C. Os tubos de germe foram divididos em tubos de micro-centrífuga, misturados com anti-soro ALS3 e incubados por 1 hora sobre gelo com suave agitação. Depois disso, as células foram centrifugadas e o sobrenadante foi transferido para outro frasco contendo tubos de germe fresco de C. albicans als3Δ/als3Δ. Este procedimento foi repetido três vezes no total. Anti-soro ALS3 foi dividido em alíquotas em volume menor (20 μl) e armazenado a -80°C. A especificidade do anticorpo foi confirmada por microscopia por fluorescência (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemanha).
1.6.12. Crescimento e diferenciação de células epiteliais
[00923] Originalmente, a linhagem de células epiteliais TR-146 derivada a partir de carcinoma escamoso da mucosa bucal foi obtida da Cancer Research Technology, Londres. Células TR-146 são capazes de formar camadas estratificadas de células apresentando muitas similaridades comparadas com a mucosa bucal humana normal (Rupniak et al., (1985) J Natl Cancer Inst 75:621-35. As células TR-146 foram cultivadas rotineiramente (4 a 20 passagens) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo NaHCO3, D-glicose, piruvato de Na e glutamina estávle com 10% de soro de feto de vitelo (FCS) (Sigma, EUA), sem antibióticos ou agentes antifúngicos. As células foram mantidas em uma incubadora umidificada a 37°C em 5% de CO2. Para experimentos de aderência e invasão, 1 x 105 de células TR-146 foram semeadas sobre lamínulas de vidro de 12 mm de diâmetro previamente colocadas em placas de 24 cavidades.
1.6.13. Ensaio de aderência
[00924] Cepas de C. albicans foram cultivadas em YPD líquido, succinato, pH 6,5 ou YNB (4% de D-glicose) a 30°C em uma incubadora em agitação de um dia para o outro. As células de Candida foram lavadas três vezes com 1 x PBS e determinadas até uma concentração final de 1 x 105 células/ml em DMEM contendo NaHCO3, D-glicose, piruvato de Na e glutamina estável sem FCS. As células TR-146 foram cultivadas sobre lâminas de vidro de 12 mm e inoculadas com células de Candida. Diferentes concentrações de peptídeo positivo F9 (50 μΜ, 10 μΜ e 2,5 μΜ) e peptídeos negativos F9_negat, 13 e 20 (50 μΜ) foram testadas sobre a adesão de Candida a células epiteliais. O ensaio de adesão foi seguido por 1 h a 37°C, 5% de CO2. Depois de adesão, as células foram lavadas três vezes com 1 x PBS para remover células não aderentes e em seguida fixadas com 4% de paraformaldeído por 30 min em temperatura ambiente. Depois de extensi-vop enxágue com 1 x PBS, as células foram permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100 em água por 5 min, e em seguida coradas com calcofluor branco (diluição a 1:100) por 15 min e adicionalmente lavadas com água, três vezes por 10 min, a 30°C, 180 rpm. As lamínulas foram montadas invertidas sobre uma lâmina de microscópio e quantificadas sob epifluorescência usando um conjunto de filtros para detectar calcofluor branco (filtro para DAPI) (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemanha). A percentagem de células aderidas foi calculada como uma média de células de Candida afixadas sobre uma centena de áreas espa- lhadas sobre toda a superfície da lamínula.
1.6.14. Ensaio de invasão
[00925] As monocamadas de linhagens celulares TR-146 foram infectadas com células de Candida conforme previamente descrito em 6.2.15. Depois de período de incubação de 3 h das monocamadas com células de Candida a 37°C, 5% de CO2, o meio acima das células epiteliais foi aspirado e as monocamadas foram enxaguadas três vezes com 1 x PBS para remover células fúngicas as quais não foram associadas com células epiteliais. Em seguida, as células epiteliais foram fixadas com 4% de Histofix (Roth) por 20 min a 37°C. Todas as células fúngicas permanecendo aderentes à superfície foram coradas por 1 h com um anticorpo policlonal de coelho anti-C. albicans (Acris Antibodies, Alemanha) (diluição a 1:2000) e contra-coradas com uma IgG secundária anti-coelho conjugada com Alexa Fluor 488 (Invitrogen) (diluição a 1:5000). Depois de extensivo enxágue com 1 x PBS, as células foram permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100 em água por 5 min. Além disso, partes de células fúngicas aderentes e invasoras dentro de células epiteliais foram coradas com calcofluor branco (diluição a 1:100) por 15 min e lavadas três vezes com água, por 10 min a 30°C, 180 rpm. As lamínulas foram montadas invertidas sobre lâminas de vidro e as células coradas foram visualizadas com epifluorescência usando um conjunto de filtros para detectar calcofluor branco (filtro para DAPI) e Alexa Fluor 488 (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemanha). A percentagem de células de C. albicans invasoras foi determinada dividindo o número de células internalizadas pelo número total de células aderentes. No mínimo 100 células fúngicas foram contadas sobre cada lamínula.
1.6.15. Detecção de ligação de anticorpo anti- ALS3 de C. albicans por microscopia por fluorescência e por Classificação Celular Ativada por Fluorescência (FACS)
[00926] Culturas de um dia para o outro de células de C. albicans foram coletadas e lavadas três vezes com 1 x PBS. Células de Candida (2,5 x 106 células/ml) foram preparadas em meio RPMI1640 com L-glutamina e com HEPES (PAA, Áustria) com / sem peptídeo F9 (50 μΜ, 10 μΜ e 2,5 μΜ) ou peptídeos negativos F9_negat, 13 e 20 (50 μΜ). A adesão de Candida e a indução de hifas foi realizada sobre lâminas de vidro de 12 mm ou sobre placas de Petri de vidro (5 cm de 0) por 45, 60 ou 90 min a 37°C, 5% de CO2. As células não aderidas foram lavadas com 1 x PBS e imediatamente fixadas com 4% de His-tofix (Roth) por 20 min a 37°C. Depois de extensivo enxágue com 1 x PBS, as células foram permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100 por 5 min, lavadas, e incubadas em 1% de Albumina Sérica Bovina (BSA) por 20 min em temperatura ambiente. Depois disso, as células aderidas foram incubadas na presença de anti-soro ALS3 (diluição a 1:500) por 60 min a 30°C e contra-coradas com IgG secundária anti-coelho conjugada com Alexa Fluor 488 (Invitrogen) (diluição a 1:2000). Depois da etapa de lavagem final, as lamínulas foram montadas invertidas sobre lâminas de vidro e as células coradas foram visualizadas com epifluorescência usando um conjunto de filtros para detectar Alexa Fluor 488 (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemanha). Finalmente, as células foram destacadas das lamínulas usando um raspador celular e res-suspendidas em 0,5 ml 1 x PBS. A intensidade fluorescente das hifas foi medida usando um citômetro de flu.xo LSRII (Becton Dickinson, http://www.bd.com). Foram coletados dados de fluorescência para 10.000 células de cada cepa.
1.6.16. Isolamento de esferoplastos e tintura Coomassie de géis de poli-acrilamida
[00927] Células de Candida (1 x 107 células/ml) foram incubadas em meio YPD na presença de peptídeo F9, F9_negat, 13 e 20 (50 μΜ) a 37°C. As células foram coletadas 5 min, 30 min e 60 min depois da adição de peptídeos, centrifugadas a 4500 rpm, 5 min em temperatura ambiente. Os péletes foram lavados duas vezes com um isovolume de tampão de digestão (2 M de sorbitol, 1 M de KH2PO4, pH 7,5, 0,5 M de EDTA) sem zimoliase, pesados e adicionalmente dissolvidos em tampão de digestão contendo 10 mg de zimoliase 20T (MP Biomedicals, EUA) (5 ml de tampão/1 g de células). A reação foi suplementada com 10 μl de ẞ-mercaptoetanol por 1 ml of digestão tampão. As células foram incubadas por 30 min a 45 min a 37°C. Esferoplastos vs. células intactas foram determinados em um pequeno volume de 0,5% de SDS e observados sob o microscópio. As células intactas não foram influenciadas pela presença de 0,5% de SDS ao passo que os esferoplastos deixam somente "fantasmas". Os esferoplastos foram coletados por centrifugação a 2000 rpm, 2 min, em temperatura ambiente e lavados duas vezes com 1,2 M de sorbitol a frio. De modo importantle, todas as soluções usadas para isolamento de esferoplastos continham mistura de inibidor de protease (completo livre de EDTA, Roche). Finalmente, os esferoplastos foram dissolvidos em tampão de amostra NuPAGE® LDS Sample (Invitrogen) suplementado com 4% de β-mercaptoetanol, fervidos por 5 min a 65°C. Antes de carregar sobre o gel, as amostras foram brevemente centrifugadas. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE (NuPAGE® 4 a 12% de gel Bis-Tris, Invitrogen) em tampão de operação NuPAGE® MES SDS (Invitrogen) em uma voltagem constante de 120 V. Depois de eletroforese, os géis foram transferidos para uma bandeja de plástico e as proteínas foram coradas em 0,25% de azul brilhante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue) em 30% (v/v) de metanol e 10% (v/v) de ácido acético de um dia para o outro com suave agitação. Os géis foram descorados em 30% (v/v) de metanol e 10% de ácido acético até as bandas de proteína se tornarem claramente visíveis.
1.6.17. Análises Estatísticas
[00928] Para as análises estatísticas, foi usado o t-ensaio de student. Os resultados foram considerados como sendo estatisticamente significantes quando p < 0,001. A significância estatística do tratamento antifúngico foi analisada com um ensaio de Mann-Whitney (Software Analyse-it).
[00929] Todos os experimentos foram repetidos no mínimo três vezes em duplicata. Cada ensaio de adesão ou biofilme de C. albicans in vitro foi repetida cinco vezes em triplicata. Biofilmes de C. albicans in vivo foram repetidos quatro vezes, sempre incluindo dois animais por cepa. Durante a determinação da suscetibilidade do biofilme de C. albicans, cada concentração do fármaco foi testada em quadruplicata. Todos os procedimentos experimentais incluindo células epiteliais TR-146 foram realizados em duplicata em ocasiões separadas cinco vezes. Análises FACS e a determinação da ligação de anticorpo anti-ALS3 foram repetidas cinco vezes.
2. Aplicações anti-bacterianas 2.1 Introdução
[00930] A resistência a antibiótico emergente é um processo evolucionário inevitável. Até agora cerca de 90% das bactérias que causam infecções graves são resistentes à maioria dos antibióticos disponíveis. A maioria dos novos antibióticos são derivados dos compostos anteriores ou compostos que pertencem às classes de conhecimento geral. Portanto existe a necessidade de antibacterianos com novos mecanismos de ação.
[00931] No presente exemplo foi modelada uma biblioteca de peptídeos interferon baseada em sequências propensas a agregação presentes em proteínas alvo dos genomas disponíveis publicamente de Staphylococcus epidermidis e de Staphylococcus aureus (cepa MRSA). Estes genomas foram selecionados com base na relevância clínica destas cepas bacterianas; especialmente em um contexto de doenças adquiridas em hospital. No presente exemplo foi mostrado que os interferons modelados têm forte atividade antibacteriana in vitro e in vivo contra uma ampla gama de bactérias Gram positivas, incluindo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) e enterococos resistentes a vancomicina (VRE) e também bactérias gram negativas. Os resultados mostraram de modo convincente que a agregação pode servir como uma estratégia antimicrobiana de sucesso. Esta é uma importante inovação para o tratamento de doenças nosocomiais, especialmente à luz das cepas multi-drogas e pan-resistentes emergentes.
2.2 Triagem primária de biblioteca de peptídeos interferon, determinação da mínima concentração inibitória (MIC)
[00932] Um total de 50 diferentes peptídeos interferon foram modelados com base na ocorrência de regiões propensas a agregação presentes em múltiplas proteínas codificadas pelos genomas de Staphylococcus epidermidis e de Staphylococcus aureus. Devido ao esquema destes peptídeos interferon é provável que algumas destas regiões também estejam presentes em proteínas de outras espécies bacterianas (distantes). No esforço de triagem foi seguido um procedimento de 2 etapas: 1) triagem inicial de todos os peptídeos em maiores concentrações (75 a 300 μg/ml) seguida por 2) uma triagem de menores concentrações (<75 μg/ml) para um conjunto selecionado de compostos com uma atividade demonstrada na etapa 1). As bactérias foram cultivadas em uma incubadora em agitação a 37°C e 160 rpm em 50 ml de BHI, usando colônias individuais recuperadas de uma placa de sangue fresco de ovelha TSA de um dia para o outro. As culturas foram cultivadas até uma densidade de aproximadamente 1x108 células/ml e em seguida diluídas até 5x105 células/ml em CAMHB (Mc Farland 0.5). Cada cavidade continha 100 μl (50 μl de peptídeo contendo MHB mais 50 μl de inóculo). A densidade celular final foi de 1x105 a 5x105/ml. Depois de adição da suspensão celular, as placas foram incubadas a 37°C por 18 até 24 horas. A densidade ótica a 590 nm (OD590) de cada cavidade foi medida depois de 5 segundos de agitação da placa usando espectrofotômetro Perkin Elmer (1420 Multilabel Counter Vicotr 3). O valor da MIC foi lido como a mínima concentração que foi necessária para inibir totalmente o crescimento de bactérias em uma cavidade. Cada cavidade, onde não foi observado nenhum crescimento, também foi laminada sobre placas de agar de sangue de ovelha-TSA, incubadas a 37°C de um dia para o outro e inspecionadas visualmente.
[00933] Isto produziu várias moléculas com alta atividade contra Staphylococcus e outras espécies bacterianas (vide a Tabela 4). Além dos compostos mostrados na tabela, os quais foram essencialmente modelados para serem ativos contra S. aureus, duas moléculas dignas de menção e as quais foram modeladas para serem ativas contra S. epidermidis são C29 (sequência: RLFNFLKRGSRLFNFLKR (SEQ ID NO: 32), isto é, idêntica ao Hit11 na Tabela 4) e C30 (RILLGLIRRGS-RILLGLIRR (SEQ ID NO: 115)).
Figure img0007
2.2.1. Espectro dos compostos antibacterianos
[00934] Na Tabela 4 é mostrada a atividade MIC (em μg/ml) de seis diferentes peptídeos interferon os quais foram selecionados depois da primeira triagem inicial. A estrutura destas moléculas corresponde à fórmula esboçada no pedido onde n é dois, X1 é 1 aminoácido (Hit50, Hit1, Hit11, Hit57A, Hit50A) ou 2 aminoácidos (Hit14), Y1 é 5 (Hit11) ou 6 aminoácidos (os outros), X2 é dois aminoácidos, Z1 é um ligante de dois aminoácidos, X3 é 1 aminoácido, Y2 é 5 (Hit11 e Hit 57A) ou 6 aminoácidos, X4 é dois aminoácidos e Z2 está ausente. Notar que Y1 e Y2 podem ser idênticos ou diferentes. Dlgno de nota, nas porções Y com uma sequência de 5 aminoácidos, o resíduo K flanqueante também está presente em proteínas de S. aureus, de modo que as sequências são idênticas sobre 6 aminoácidos ao invés de 5.
[00935] Estes peptídeos interferon foram originalmente modelados para ter por alvo especificamente a cepa de Staphylococcus aureus MRSA. Devido à presença da mesma sequência propensa a agregação (isto é, sequência TANGO) em genomas de outras bactérias Gram-positivas houve também uma atividade dos peptídeos interferon para outras espécies bacterianas. O peptídeo interferon Hit1 mostra ser um interferon de amplo espectro. O Hit14 parece mais específico para a cepa bacteriana para a qual foi modelado (isto é, Staphylococcus aureus MRSA). O Hit11, embora eficaz contra ambas as espécies de Staphylococcus, é mais ativo contra S. epidermidis, o qual está de acoro com o fato de que a exata sequência das regiões Y mais frequentemente está presente no genoma do S. epidermidis. O valor da MIC (ou Mínima Concentração Inibitória) é a menor concentração de um antibacteriano que vai inibir o crescimento visível da bactéria depois de incubação. A Mínima concentração bactericida (MBC) foi considerada como a menor concentração de peptídeo a qual preveniu o crescimento e reduzui o inóculo por 99,90% dentro de 24 h. As MBCs foram estabelecidas laminando o conteúdo de cada cavidade sobre uma placa de agar de sangue para verificação da viabilidade. Adicionalmente o conteúdo da cavidade também foi usado como um inóculo para uma nova placa de microcavidades (na qual nenhum peptídeo foi adicionado) e alteração progressiva da turbidez foi notada por outras 24 horas. Os valores da MBC foram ou os mesmos ou 2 vezes maiores do que os valores da MIC o que sugere que estes são agentes bactericidas.
[00936] Em uma etapa seguinte peptídeos que mantinham uma alta atividade (baixa MIC) durante varreduras repetidas foram reordenados em forma altamente purificada, escalonada e submetidos a experimentação adicional sobre várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A Tabela 5 representa os valores da MIC do composto 30 (C30) para uma variedade de espécies bacterianas. Conforme pode ser visto na tabela 5, o composto 30 é não somente muito eficaz contra Staphylococcus epidermidis, em cujo genoma a sequência que induz agregação é codificada, cuja sequência foi usada para modelar o composto 30, mas também contra outros patógenos clinicamente importantes tais como S. aureus resistente a meticilina (MRSA) e enterococcos resistentes a vancomicina (VRE), patógeno nosocomial Enterococcus faecalis, um grupo de patógenos transmitidos pelo alimento: Bacillus subtilis, B.cereus, Listeria monocytogenes. É muito promissor ver que a atividade contra cepas resistentes a antibiótico é tão elevada quanto contra cepas sensíveis a antibiótico. Isto é indicativo do novo mecanismo de ação completo destes compostos antimicrobianos. Como a resistência a antibiótico é um problema importante em hospitais, moléculas completamente diferentes oferecem grande perspectiva em aplicações clínicas.
[00937] Recentemente descobriu-se que C30, como alguns dos compostos mostrados na Tabela 4, também é ativo contra o gênero Corynebacterium (não mostrado na Tabela 5). A atividade contra Corynebacteriae é promissora à luz de novo esquema de peptídeos anti-tuberculose, uma vez que a composição da parede celular do Corynebacterium imita a das Micobactérias. A estrutura da parede celular do Mycobacterium tuberculosis merece especial atenção porque é única entre os procariotas, e é um determinante importante de virulência para a bactéria. O complexo da parede celular contém peptidogli-cano, porém de outro modo é composto de lipídeos complexos. Mais de 60% da parede celular micobacteriana é lipídeo. A fração de lipídeo da parede celular das MTB's consiste em três componentes pirncipais, ácidos micólicos, fator corda, e cera-D. A baixa permeabilidade da parede celular micobacteriana, com sua estrutura incomum, atualmente se sabe que é um fator importante nesta resistência. Deste modo agentes hidrofílicos cruzam a parede celular lentamente devido à pori-na miobacteriana ser ineficiente em permitir a permeação de solutos e existir em baixa concentração. Os agentes hidrofílicos são presumivelmente retardados pela bicamada de lipídeos a qual é de fluidez in-comumente baixa e espessura anormal.
[00938] O maior valor da MIC de C30 para bactérias gram-negativas pode refletir o fato de que a estrutura de C30 é um peptídeo interferon em tandem (isto é, um peptídeo com dois trechos de indução de agregação idênticos (2 porções Y idênticas)). Evidência recente mostrou que peptídeos interferon únicos também apresentam baixos valores de MIC para bactérias Gram-negativas. Sem limitar a invenção a um mecanismo de ação em particular isto pode apontar para o fato de que as bactérias Gram-negativas têm menores poros em sua parede celular bacteriana os quais limitariam a entrada de interferons em tandem em comparação com peptídeos interferon únicos. Notar no entanto também que há várias proteínas contendo os trechos de indução de agregação, e estes grupos de proteínas não são idênticos em bac- térias Gram-positivas e Gram-negativas. Portanto, pode ser que uma ou mais proteínas alvo diferentes seja/sejam agregadas em bactérias Gram-positivas do que em bactérias Gram-negativas.
Resultados de bactérias planctônicas:
Valores de MIC para o composto 30
Figure img0008
2.2.2. Efeito da pureza e modificações sobre atividade de peptídeos
[00939] Foi observada uma melhora significativa (até 5 vezes) da atividade dos peptídeos interferon quando sintetizados em uma forma altamente pura. O resultado desta atividade aprimorada é mostrado na Tabela 6. De modo importante este aprimoramento da atividade não aumenta a toxicidade contra células de mamíferos (dados não mostrados).
[00940] Além disso, descobriu-se que peptídeos interferon marcados com Biotina foram tão ativos quanto peptídeos interferon não marcados. O último significa que podem ser usados diferentes métodos de detecção.
Figure img0009
[00941] Não é mostrado na tabela o Hit24. A sequência do Hit24 (isto é, RRLFNFLKRGSRLFNFLKR (SEQ ID NO: 74)) é uma sequência modificada do Hit 11 (vide a Tabela 4) em que o Hit24 tem um duplo gatekeeper na frente. Embora não tenha sido testado contra todas as bactérias, tem considerável atividade contra S. aureus ATCC 29213 (valor da MIC 12,5 μg/ml), contra S. epidermidis ATCC 12228 (MIC 1,5 μg/ml) e contra a E. cloacae Gram negativa (25 μg/ml).
[00942] À parte de biotinilação, foram testadas várias outras modificações dos interferons. Estas foram baseadas em C30 e incluem uma versão de D-aminoácidos de C30.
[00943] Outra modificação que foi testada é PEGuilação do peptídeo C30. Foi testada a fixação covalente de PEG em posição diferente do peptídeo C30. Foi usada tanto internamente (isto é, como a porção de ligante de Zi) e como uma porção N-terminal. O objetivo da introdução de PEG essencialmente foi proporcionar melhor estabilidade do composto in vivo bem como melhor solubilidade.
[00944] Foram sintetizados os seguintes compostos, com base na sequência de C30 (SEQ ID NO: 115):
P2170: Ac-RILLGLIRRGSRILLGLIRR-CONH2, uma versão acetilada e amidada de C30.
P2175: NH2-RILLGLIRR(Peg)2RILLGLIRR-CONH2, uma versão amidada de C30 em que o ligante de Z1 entre as regiões de agregação consiste em duas unidades de PEG (isto é, duas unidades de óxido de etileno ligadas por uma ligação éter) ao invés da sequência de aminoácidos GS.
P2151: NH2-RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH, C30 normal mas preparado usando síntese química de peptídeo diferente.
P2153: NH2-(Peg)2RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH, C30 o qual é N-terminalmente fundido a duas unidades de PEG. Isto também pode ser redigido como C30 com uma porção Z0 adicional que consis-te em duas unidades de PEG.
P2154: NH2-Peg3RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH, C30 o qual é fundido N-terminalmente a três unidades de PEG. Isto também pode ser redigido como C30 com uma porção Z0 adicional que consiste em três unidades de PEG.
DAA: uma versão de D-aminoácidos de C30 em que todos os aminoácidos são D aminoácidos.
[00945] Estes peptídeos foram testados do mesmo modo que para as triagens originais. Um método de diluição de microcaldo foi usado com diluições seriais duas vezes em CAMHB (de acordo com as diretrizes da EMEA) foi usado para triagem da atividade do peptídeo, com concentrações variando a partir de 0,3 μg/ml até 200 μg/ml.
[00946] Os resultados são mostrados na Tabela 7. Para P2170 e P2175, duas frações foram testados correspondentes a dois picos obtidos durante a síntese de peptídeo. Estes são indicados como P1 e P2, respectivamente.
Figure img0010
[00947] Conforme pode ser visto a partir da tabela, todos os peptídeos modificados conservam retain atividade antibacteriana que é comparável ao C30 não modificado. Portanto, modificações tais como D-aminoácidos e PEGuilação não têm nenhum efeito negativo sobre a atividade das moléculas apresentadas aqui, neste pedido de patente. É particularmente estimulante que os valores da MIC (e portanto a atividade antibacteriana) não são afetados por PEGuilação.
2.2.3 Peptídeos de controle não agregantes
[00948] Para validar os princípios do esquema de agregadores foram construídos peptídeos de controle, aqui denominados como peptídeos 'embaralhados'. Estes são compostos dos mesmos aminoácidos que os agregadores originais (e portanto têm a mesma carga), mas a ordem é embaralhada de modo que não obedecem mais os princípios do esquema apresentados aqui, neste pedido de patente. Estes peptídeos não resultam em inibição de crescimento ou sobrevida bacterianos.
2.2.4. Tendo por alvo mais de uma proteína bacteriana
[00949] Conforme mencionado, uma primeira triagem foi baseada na identificação de regiões propensas a agregação presentes em proteínas codificadas pelos genomas de Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus. Como um composto muito promissor, C30, contém sequências que induzem agregação que estão presentes em mais de uma proteína nestes genomas, foi sugerida a hipótese de que isto pode ser usado no esquema de novos compostos. Portanto, em uma etapa seguinte foram modelados peptídeos interferon para os quais mais de um alvo previsto estava disponível nas células bacterianas de S. epidermidis e S. aureus (isto é, contendo sequências de be-ta-agregação que estão presentes em mais de uma proteína codificada por qualquer uma destas bactérias). Esta chamada triagem de peptídeo interferon ‘mtop’ apresentou uma taxa de acerto (hit) muito ele- vada indicando que o esquema de peptídeos interferon antibacterianos pode ser baseado em uma série de alvos disponíveis dentro da célula bacteriana (isto é, quanto mais proteínas alvo que contêm uma região TANGO particular, maior a possibilidade de obter efeito bactericida com o interferon. Isto é lógico, uma vez que mais proteínas são visadas, maior a probabilidade de que a inibição de uma ou mais das mesmas iniba uma função essencial. A Tabela 8 mostra a atividade de MIC de peptídeos interferon bi-específicos que foram modelados com base na descoberta de mais de uma proteína-alvo nas bactérias. É importante mencionar que os interferons usados na Tabela 5 foram sintetizados em formato de microescala; significando que espera-se considerável aumento na atividade de interferon para os peptídeos interferon de alta pureza.
[00950] As moléculas listadas na Tabela 5 correspondem à fórmula conforme esboçado no pedido onde n é 2, X1 e X4 são dois aminoácidos, Y1 e Y2 são 6 aminoácidos, X2 e X3 são 1 aminoácido, Z1 é um ligante de dois aminoácidos e Z2 está ausente.
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2.3 Cinética de destruição antimicrobiana das moléculas de interferon
[00951] Curvas de tempo-morte foram obtidas para estudar a cinética da atividade bactericida. Os Compostos C30, Hit50 e C29 (para sequências vide acima) foram testados contra S. epidermidis cepa ATCC 12228 e S. aureus ATCC na MIC do composto e duas vezes valor da MIC. Foi mostrado que o composto C30 diminuiu as contagens viáveis por 100% dentro de 5 min, enquanto o Hit50 reduziu as contagens viáveis por ~3 log unidades depois do mesmo periodo de incubação, ambos em uma concentração que igualou seu valor da MIC (vide a Figura 11). Todos os peptídeos apresentaram uma atividade dependente da concentração, uma vez que o dobramento da concentração até duas vezes o valor da MIC resultou em morte mais rápida. Por exemplo, o tempo necessário para diminuir o número de CFU/ml uma vez para C29 foi de 60 minutos (na mínima concentração inibitória), e somente de 10 minutos para 2xMIC. Este é um efeito importante, uma vez que se acredita que antibióticos que têm um efeito bactericida mais rápido geralmente são mais eficientes e a resistência a semelhantes compostos se desenvolve mais lentamente.
2.4 Monitoramento de desenvolvimento de resistência bacteriana contra interferons anti-bacterianos
[00952] A capacidade da cepa clínica de S. aureus MRSA 204 para desenvolver resistência ao interferon C30 foi avaliada por passagens repetidas e determinação da MIC. Células de S. aureus cultivadas na presença de C30 na metade da MIC em um dia foram usadas no dia seguinte a um ensaio da MIC do mesmo composto. Deste modo, as células bacterianas foram continuamente expostas a um único composto (isto é, C30) na metade do valor da MIC enquanto sendo passadas durante 15 dias. Pode ser demonstrado que a contínua exposição ao peptídeo interferon C30 somente resultou em uma tendência menor para desenvolver resistência uma vez que dez passagens em metade da MIC inicial foram necessárias para aleviar a MIC de duas vezes. Nove passagens em sub-MIC foram necessárias antes da MIC ter sido elevada 2 vezes, no entanto esta resistência não teve êxito em ser mantida ao lonto do tempo e depois de 12 passagens a MIC voltou para seu valor original. Vide a Fig. 15. Resultados similares foram obtidos com outros dos peptídeos listados acima. Quando a resistência foi monitorado por um período de tempo mais longo (31 ao invés de 15 dias), não foi observado nenhum aumento adicional no valor da MIC (vide adiante).
[00953] Em contraste a MIC da rifampina fica significativamente aumentada durante o mesmo período de tempo (tanto quanto 512 vezes durante 15 dias) — rifampina é um agente para o qual se sabe que resistência aumenta muito facilmente por mutações de pontos cromossômicos espontâneas. De modo similar aos peptídeos testados, a MIC da vancomicina sob estas condições somente aumentou duas vezes; geralmente a vancomicina é considerada como um antibiótico para qual é improvável que ocorra desenvolvimento de resistência espontânea sob condições onde é excluída a transferência genética horizontal entre espécies. Vale a pena mencionar os compostos que têm por alvo regiões hidrofóbicas enterradas dentro de proteínas. Acredita-se que estas regiões sejam geralmente bem conservadas e não possam ser facilmente mutadas, uma vez que isto daria origem a proteínas dobradas incorretamente (não funcionais). Sem ser limitado a um mecanismo em particular, isto pode contribuir para o lento desenvolvimento de resistência observado.
[00954] Como o desenvolvimento de resistência é um processo estocástico, foi repetido o experimento anterior usando o mesmo método de microdiluição de caldo (sempre 4 duplicatas), e também adicionando antibióticos comuns como Ampicilina e Gentamicina. Pode ser visto que tanto C30 quanto C29 mostam um início de resistência muito mais lento do que a Ampicilina, e que os valores da MIC aumentam consideravelmente menos do que os da gentamicina e da ampicilina (Fig. 12). Notar que, como os valores iniciais da MIC da gentamicina são menores do que os dos compostos, o aumento múltiplo é ainda muito mais pronunciado do que mostrado na figura.
[00955] Uma segunda série de experimentos consistiu de inoculação de 2 ml de caldo BHI suplementado com concentrações definidas do peptídeo C30 com uma cepa de MRSA 326. Cada dia a MIC foi testada conforme previamente descrito. A concentração do peptídeo em meio foi ajustada de acordo com a MIC do dia anterior, de modo que os meios de crescimento suportaram seleção de resistência. Isto foi repetido 3 vezes por 31 dias. A MIC para C30 apresentou flutuações similares conforme durante o experimento prévio, e nunca aumentou mais de 4 vezes. No último dia do experimento a MIC foi de 12,5 μg/ml. Em comparação, o nível da MIC para células tratadas com Ampicilina flutuou altamente, aumentando a té 7 vezes (MIC ao final do experimento = 100 μg/ml). Concentrações crescentes de Ampicilina durante incubações de um dia para o outro levaram a seleção de bactérias resistente e um aumento adicional no nível da MIC, ao passo que aumento da concentração de C30 não acelerou o desenvolvimento de resistência. Os resultados são mostrados na Fig. 13.
[00956] De modo interessante a retirada do C30 da cultura causou ou 50% de redução do nível da MIC ou não teve qualquer efeito sobre a suscetibilidade da cepa.
2.5 Permeabilidade de membrana causada por interferons antibacterianos
[00957] O efeito de peptídeos interferons sobre as membranas de células microbianas vivas foi estudada com o corante de ligação de DNA impermeante de membrana Sytox Green (Invitrogen). A permea-bilização de membrana permite a entrada do corante o qual é monitorado por um aumento na fluorescência. Tintura de ácido nucleico Sytox Green foi usada para monitorar a permeabilidade da membrana bacteriana no tempo (na concentração de peptídeo interferon constante de 25 μg/ml (vide a Figura 18) e em várias concentrações de peptídeos (vide a Figura 19) em um tempo constante de 15 minutos). Foi observado um nítido aumento na ligação de Sytox Green nos primeiros 5 minutos o qual foi estabilizado depois destte ponto do tempo, com somente um menor aumento adicional depois de 5 minutos. Este menor aumento adicional pode ser atribuído à rápida inserção dos peptídeos interferon anfifílicos dentro da bicamada de lipídeo bacteriana, a qual induz defeitos locais na arrumação dos lipídeos e provoca adicionalmente aumentada permeabilidade. Comparado com o agente de controle lítico (Lisostafina), a qual lisa Staphylococcus de modo muito eficaz, o sinal do Sytox Green foi ligeiramente menor para as bactérias tratadas com interferons antibacterianos. A Figura 11 mostra que a curva de morte de S. aureus tratado com composto 30 a 3 pg/ml (que é aproximadamente seu valor da MIC) foi capaz de destruir estas bactérias muito rapidamente (uma vez que a destruição foi dependente da concentração); portanto seria esperado que ocorresse um aumento igualmente rápido na ligação de Sytox Green se a lise de membrana for o mecanismo de ação. Este não é o caso, no entanto. Para corro- borar a hipótese de que a lise de membrana não é uma causa primária de morte celular, progrediu-se com abordagens proteômicas para verificar o alvo intracelular que está envolvido em interação peptídeo primário e alvo, bem como com análise por microscopia eletrônica para mostrar células intactas.
[00958] Em uma etapa seguinte foi estudada a alteração do potencial de membrana (MP) para o peptídeo interferon C30. Para isto foi usado o kit BacLight (Invitrogen). A Figura 20 mostra que em células bacterianas tratadas com composto C30 houve uma diminuição significativa na fluorescência vermelha depois de somente 5 minutos, apresentando uma proporção igual de vermelho para verde a qual indica uma total despolarização do potencial de membrana. Em comparação, o controle lítico (Lisostafina) apresentou uma despolarização de membrana muito mais lenta. O padrão de gráfico de pontos de células tratadas com C30 é muito similar ao controle despolarizado. Ao combinar estes dados pode-se assumir que depois de 5 minutos de tratamento com C30 existe um colapso parcial no potencial de membrana levando a um influxo da tintura de ácido nucleico Sytox Green, o qual indica em alguma extensão uma permeabilização de membrana. Despolarização causada por estes interferons mostrou ser dependente do tempo ao invés de dependente da concentração (dados não mostrados). Estes resultados adicionalmente comprovam o rápido mecanismo de ação bactericidana dos interferons antibacterianos.
2.6 Detecção de agregados em bactérias
[00959] Agregados foram visualizados em bactérias tratadas com interferon antibacteriano com dois corantes de diagnóstico amiloides diferentes (tioflavina-T e vermelho do Congo). A fluorescência da tio-flavina-T foi descrita como um marcador específico para a conformação de sheet estendida de estruturas beta-agregadaes. Quando este corante liga a fibrilas amiloides existe um grande aumento na fluores- cência de Th-T em relação ao corante livre. Th-T foi usada nos ensaios bacterianos para investigar se peptídeos interferons induzem agregação dentro das células bacterianas. Como um controle foram usadas diluições de duas vezes do peptídeo interferon isolado em água fisiológica, para assegurar que peptídeos interferon auto agregantes externos não proporcionam um falso sinal. Observou-se, claramente, um significativo aumento concentração-dependente na ligação de corante Th-T em células bacterianas tratadas com peptídeos interferon (vide a Figura 21), indicando a presença de mais estruturas em β-sheet em células bacterianas tratadas com peptídeos interferon. Além disso, mostrou-e também que vermelho do Congo (CR) liga a beta estruturas agregadas (vide a Figura 22) e esta ligação induz uma permuta característica na máxima ótica absorvência do vermelho do Congo de 490 nm para 540 nm. Este experimento confirma o experimento de ligação dependente da concentração de Th-T, confirmando de modo independente o aumento na formação de β-estrutura durante o tratamento com peptídeo.
2.7 Alteraçõoes morfológicas induzidas por interferons em bactérias
[00960] Microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram usadas para examinar as alterações ultra estruturais em bactérias induzidas por peptídeos interferon. Tanto Estafilococcos quanto Bacilos foram usados para uma comparação. Pode ser observado que tanto Bacillus cereus quanto Staphylococcus aureus apresentaram uma superfície lisa e intacta depois de 5 minutos de tratamento com interferon antibacteriano C30, não apresentando crateras óbvias, orifícios nem poros em seu envelope. No entanto depois de cerca de 20 minutos a superfície dos Bacilos começou a enrugar e encolher depois do tratamento o qual não foi evidente em Estafilococcos provavelmente devido a seu tamanho redondo pequeno. Em ambas as espécies bacterianas o conteúdo da célula começou a ser liberado, em Bacilos já depois de 20 minutos (vide Figura 23, painel direito, parte inferior) de tratamento e em S. aureus contanto que depois de 1 hora (vide Figura 24). Durante a divisão de células saudáveis o Bacillus cereus forma cadeias muito longas, as quais são não separadas de células mãe. No entanto foi registrado que em populações de células bacterianas de Bacillus cereus tratadas com peptídeo C30 estas cadeias longas são menos comuns indicando uma divisão celular prejudicada. Uma conclusão similar pode ser deduzida a partir do fato de que significativamente menos Estafilococcos tratados continham septos de divisão em comparação com células bacterianas saudáveis não tratadas. Finalmente pode-se concluir que os dados da Microscopia eletrônica de varredura (SEM) representam uma falta de lise rápida. Além disso, sabendo que o composto 30 necessita de tão pouco quanto 5 a 10 minutos para matar Estafilococcos era esperada uma ruptura muito rápida de células bacterianas a qual nitidamente não foi o caso mesmo depois de uma hora de tratamento com o interferon antibacteriano. Para corroborar adicionalmente essa hipótese, observou-se também seções ultrafinas de Estafilococcos tratados com C30. Microscopia eletrônica de transmissão destas células tratadas também confirma uma falta de lise, embora exista um óbvio encolhimento do citoplasma (vide as figuras 25 e 26). Adicionalmente existe um aumento na densidade eletrônica em uma região de ácido nucleico, sugerindo sua condensação. A condensação de DNA é um dos últimos estágios de respostas apoptóticas. A morte celular apoptótica pode ser corroborada por essa análise de gel bidimensional, a qual revelou aumento de 3 vezes na expressão do regulador transcrip-cional da família MarR, envolvido em atividade autolítica. Análise por microscopia eletrônica de transmissão das seções ultrafinas de Staphylococcus aureus tratados com composto 30 apresentou estruturas membranosas (vide a seta na figura 25) as quais foram previamente descritas como mesossomas.
Análise por microscopia imunoeletrônica
[00961] A localização de agregador imunomarcado foi estudada usando microscopia eletrônica de transmissão. Para este fim peptídeo C30 foi marcado com 5(6)Carboxifluoresceína sobre seu N-término (etiqueta de FITC).
[00962] Bactérias da fase de crescimento exponencial foram tratadas com peptídeo com etiqueta de FITC (2x valor das MICs) por 30 minutos seguidos por fixação com fixador de dupla potência (4% de paraformaldeído + 0,4% de gluteraldeído em 0,1 M de tampão P, pH = 7,4) por 10 minutos e fixador de potência única (metade da acima) por 1 hora. Depois de várias etapas de lavagem (tampão P e tampão P / glicina) o pélete foi suspendido em 12% de gelatina / tampão p, incubado sobre gelo, cortado em pequenos cubos e deixado para incubar de um dia para o outro em 2,3 M de Sacarose. As amostras foram montadas sobre suportes de amostra, congeladas em nitrogênio líquido, e seccionadas com uma faca de diamante a -100°C com um crioultramicrótomo de ul-tracorte S/FCS (Leica). Seções degeladas ultrafinas foram colocadas sobre grades de cobre revestidas com Formavar-carbono (malha 400), as seções flutuaram seis vezes por 10 minutos a cada vez sobre gotas com glicina-PBS. As grades foram em seguigda lavadas em 10 mM de tampão de PBS por 5 minutos, bloqueadas com PBS/BSA (0,1%) e incubadas por 30 minutos em uma gota de anticorpo primário de cabra anti-FITC (Abcam) (diluído a 1:1000 em tampão de PBS), lavadas 5 vezes em tampão de PBS, incubadas por 30 minutos com conjugado de proteína-A-ouro de coelho anti-cabra (5 nm; BB International EM Rag5) diluídas a 1:50 em tampão de PBS. Em seguida a seção foi lavada 6 vezes por 5 minutos em PBS e 3 vezes em ddH20. As grades foram coradas por 5 minutos com uranil acetato - Metil celulose (1%) sobre gelo, secadas cuidadosamente e observadas usando Microscopia ele- trônica de transmissão JEOL JEM 2100, operando em voltagem de aceleração de 80 kV. Não foi detectada nenhuma ligação inespecífica importante de anticorpos nos diferentes procedimentos de controle, a marcação de fundo foi um problema mínimo e a maioria das vezes ligada a insuficientes etapas de lavagem depois de incubação em proteína-A-ouro, a qual foi otimizada.
[00963] Depois de 30 minutos de exposição, os peptídeos FITC-C30 estavam presentes predominantemente no citoplasma bacteriana, aglomerados juntos sob a forma de agregados (Figura 27, setas vermelhas). Como não foi observada nenhuma ligação inespecífica, partículas marcadas com imunogold representam a presença de peptídeos. Estes resultados confirmam a atividade intracelular dos peptídeos. Além disso, células tratadas com peptídeo têm um processo de divisão clamente perturbado. A divisão de células tratadas com peptídeo é assimétrica quando comparada com estafilococcos não tratados; os septos também são muito mais espessos e perdem sua margem. De modo interessante, aglomerados agregados podem ser vistos somente em uma parte da célula, o que sugere pressão evolucionária contra herança de agregados, um processo descrito previamente em E.coli (Rokney, A., M. Shagan, et al. (2009). "E. coli Transports Aggregated Proteins to the Poles by a Specific and Energy-Dependent Process." Journal of Molecular Biology 392(3): 589-601; Lindner, A. B., R. Madden, et al. (2008). "Asymmetric segregation of protein aggregates is associated with cellular aging and rejuvenation." Proceedings of the National Academy of Sciences 105(8): 3076-3081.)
[00964] Os estudos de análise morfológica e permeabilidade de membrana de bactérias tratadas parecem sugerir que peptídeos interferon se inserem dentro da membrana citoplasmática bacteriana, levando a uma rápida despolarização de membrana e perda de sua integridade. Sem ser limitado a um mecanismo em particular, este pare- ce não ser seu modo de ação bactericida, mas ao contrário um ‘’efeito colateral’’. Os peptídeos interferon são somente ativos sobre bactérias que codificam em seu genoma a região de β-agregação também presente na molécula de interferon. Os interferons são capazes de induzir agregação de seua alvos, levando a morte celular. Portanto, é sugerida a hipótese de que a combinação da agregação do alvo intracelular e do efeito de membrana leva à rápida morte celular das bactérias.
2.8 Toxicidade de interferons anti-bacterianos sobre células de mamífero 2.8.1 Ensaio de hemólise
[00965] Para distinguir entre atividade antimicrobiana seletiva de atividade lítica não seletiva sobre células eucarióticas foram medidas as capacidades líticas da maioria dos peptídeos interferon ativos usando eritrócitos humanos. Conforme mostrado na Figura 14, os compostos: C29, Hit57A, Hit 50 e Hit24 não apresentaram nenhuma atividade hemolítica importante em concentrações clinicamente relevantes, ao passo que os peptídeos C30 e Hit1 tiveram HD50s (concentração na qual 50% das hemácias são lisadas) variando entre 25 μg/ml e 50 μg/ml. O detergente Tween foi usado como um controle positivo, provocando 100% de lise das hemácias. Pode ser demonstrado que peptídeos interferon não apresentam hemólise importante em seus valores da MIC (cf. a Tabela 4) e alguns peptídeos interferon são mesmo não hemolíticos em concentrações tão elevadas quanto 100 μg/ml.
2.8.2 Ensaio de Alamar Blue e ensaio de liberação de Lactato Desidrogenase (LDH) sobre células de mamífero
[00966] Células renais embrionárias humanas (HEK293T) tratadas com diferentes concentrações de peptídeo interferon antimicrobiano C30 resultaram em maiores níveis de liberação de LDH quando comparado com o peptídeo interferon Hit50. Foi observado aumento de- pendente da concentração na LDH extracelular, indicando que estes peptídeos causaram alguma perda de integridade da membrana plasmática. A Figura 16 mostra que o peptídeo interferon C30 causa uma liberação da LDH maior do que 50% quando usado a 50 μg/ml ou além enquanto o peptídeo interferon hit 50 causou somente 5% de liberação de LDH na mesma concentração (vide a Tabela 4).
[00967] Ensaio de Alamar blue permitiu o monitoramento da percentagem total de recuperação do crescimento celular no tempo na presença de peptídeos. Para a maioria dos peptídeos interferons (em concentração tão elevada quanto 100 μg/ml) observou-se que 80 a 100% das células de mamífero apresentaram uma recuperação do crescimento total dentro de 3 a 24 horas. A Figura 17 mostra a citotoxicidade por alamar blue sobre células renais embrionárias humanas (linhagem celular HEK293T) para dois peptídeos interferons diferentes. Apesar da liberação de LDH causada por altas concentrações de C30, pode ser visto que com concentrações menores do que 100 μg/ml, a viabilidade das células de mamífero não é afetada significativamente por administração deste composto. Os dados indicam a especificidade dos peptídeos interferons antibacterianos para bactérias com somente um mínimo efeito sobre células de mamífero.
2.8.3 Ensaio de invasão
[00968] Neste ensaio monocamadas de células HCT116 (uma linhagem celular de tumor de colon humano) foram cultivadas no fundo de uma placa de microcavidades. No dia seguinte bactérias frescas de S.aureus ATCC 27853 foram adicionadas (aproximadamente 106 CFU/ml) e foi incluído um controle negativo não infectado. Depois de 90 minutos de infecção, diferentes diluições de peptídeos foram adicionadas e as culturas foram incubadas por outra hora. Como um controle positivo foi usado Gentamicina, dado que tem uma boa atividade intracelular. Cada cavidade foi lavada com água fisiológica pré- aquecida para se livrar de quaisquer bactérias extra-celulares, seguida por tratamento com 1 % de Triton para liberar todas as bactérias aprisionadas de células de mamífero. O conteúdo da cavidade foi diluído serialmente e laminado sobre placas de agar TSA ara contagens de CFU. Os resultados desta ensaio são mostrados na Fig. 28.
[00969] Digno de nota, a concentração de peptídeo pode ser adicionalmente diminuída para tão pouco quanto 12,5 μg/ml enquanto mantendo atividade antibacteriana similar. Isto é interessante para evitar efeitos colaterais tóxicos que possivelmente surgem com altas concentrações dos peptídeos. De qualquer modo, estes resultados mostram que peptídeos agregadores são tolerados por células de mamífero em concentrações relevantes para o efeito bactericida e pode ter por alvo S. aureus residindo em células de Tumor de Colon Humano (HCT-116) cultivadas (isto é, são capturados pelas células e apresentam um efeito bactericida).
2.9 Análise proteômica de proteínas visadas
[00970] A tecnologia de agregação é baseada na hipótese de que trechos de aminoácidos curtos, com uma alta propensão de agregação (por exemplo, avaliados pela classificação TANGO) e que são derivados de uma proteína-alvo, podem induzir agregação daquela proteína. Esta hipótese foi confirmada por uma análise proteômica de shotgun da fração insolúvel. Assumiu-se que os peptídeos agregadores trabalham através de interação específica com seu alvo e causa sua agregação, é esperado que o alvo penetre na fração insolúvel. Por este motivo decidiu-se por dividir o lisado em 2 frações: insolúvel e solúvel e compara estas com frações de células não tratadas. Proteínas presentes tanto em frações insolúveis tratadas (TC30) quanto não tratadas (NT) foram presumidos como apresentando um fundo de proteínas naturalmente não solúveis inespecíficas. Adicionalmente foram examinadas frações solúveis tanto de bactérias tratadas quanto de bactérias não tratadas e conforme esperado a proteína de interesse estava presente somente na fração não tratada. Isto significa que foram usados os seguintes critérios para pesquisa d ealvo:
  • 1) alvos de agregação potenciais são proteínas obtidas a partir da lista de proteínas na fração Insolúvel de células tratadas com C30 menos proteínas na fração Insolúvel de células não tratadas
  • 2) as proteínas na fração insolúvel de células tratadas com C30 menos proteínas na fração solúvel de células tratadas com C30 são alvos potenciais somente se ausentes na fração insolúvel de NT, E caso presentes na fração solúvel de NT, e somente quando contém a sequência tango ou parte da mesma dentro de sua sequência de aminoácidos.
[00971] Por meio do método SOSPA (análise proteômica de espingarda serrada (sawn-off shotgun)) pode-se confirmar a proteína-alvo para cada um dos agregadores. Deste modo, foi confirmado, até o momento, o alvo para o composto 30 em duas cepas bacterianas diferentes: S.aureus e B.cereus. As frações insolúveis de ambas as espécies tratadas continham a proteína prevista in silico; isto é, o regulador negativo de competência genética ClpC/mecB o qual de fato contém o trecho Tango dentro de sua sequência FASTA (número de acesso Uni-prot: Q63HB8). Conforme esperado, a proteína-alvo de C30 mudou de fração solúvel para insolúvel depois de tratamento com peptídeo.
[00972] Adicionalmente foram obtidas diferentes frações e foram usados estes blots para detecção de alvo com peptídeos de reconhecimento específicos. Novamente pode-se confirmar a presença da proteína-alvo, ClpC/MecB (90kDa) na fração insolúvel de Bacillus cereus tratado com C30 (fig 29).
[00973] De modo geral estes resultados comprovam a hipótese de que agregadores possuem a capacidade de interagir com membranas bacterianas (atividade interfacial), penetram no citoplasma das bacté- rias e se o alvo tiver a região tango acessível, o agregador liga a esta, a agregando e deste modo semeando uma cascata de reação adicional. Conforme já mencionado na literatura, agregados causam rearran-jos de lipídeos e permeablização de membrana. Extensiva análise por microscopia eletrônica comprova que os agregadores agem sobre a membrana a partir de dentro da célula e não a partir do exterior. Con-cluíu-se que os agregadores agem tanto sobre a proteína-alvo citoplasmática quanto no estágio posterior, na própria membrana, levando a uma rápida morte celulae.
[00974] Os dados obtidos por SOSPA também podem ser confirmados usando eletroforese por gel bi-dimensional (dados não mostrados).
2.10 Estabilidade sérica de interferons antibacterianos e detecção no soro
[00975] Para avaliar a atividade do interferon na presença de soro, foram estabelecidos valores da MIC para S. aureus (conforme descrito acima) para vários peptídeos interferons antibacterianos em um meio contendo 50% de soro bovino fetal. Conforme esperado a Tabela 9 mostra que os valores da MIC foram um tanto maiores na presença de soro mas de modo importante os peptídeos interferon conservaram sua atividade antimicrobiana indicando uma possível uso in vivo dos peptídeos interferon antibacterianos.
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[00976] Para detectar os peptídeos no soro, foi usado um ensaio dot-blot. Os peptídeos também foram diluídos em PBS, blotted e usados como um guia de quantificação. Iniciando a partir de 100 μg/ml pontos foram borrados sobre uma membrana de nitrocelulose depois de 2 vezes diluições de peptídeo.
[00977] Uma vez que o peptídeo foi marcado com biotina, Strepta-vidin-HRP foi usada para sondagem. Houve uma resposta linear sugerindo que este método é bem sucedido para detecção no soro em uma faixa entre 300 μg/ml e 6 μg/ml (Figura 30). Para mais informação sobre detecção de peptídeos, vide o Exemplo 4.
2.11 Avaliação preliminar de toxicidade in vivo de interferons antibacterianos em ratos e camundongos
[00978] De modo a avaliar a toxicidade dos peptídeos interferons antibacterianos in vivo, oito ratos machos e fêmeas fisher livres de germe, pesando aproximadamente ±350 gramas foram injetados com peptídeo interferon C30 em tampão A: acetato de histidina (pH 6,5) e tampão B: tampão de fosfato (pH 6,5). Dois ratos foram injetados com uma concentração de 1,5 mg/kg e dois com uma concentração de 3 mg/kg. Estas foram injeções únicas não repetíveis em uma veia da cauda. Os ratos foram observados durante vários dias mas não foram visíveis aparentemente mortalidade nem quaisquer outros efeitos colaterais.
[00979] Adicionalmente, três grupos de camundongos Swiss fêmeas de 6 semanas de idade foram injetados com doses crescentes de C30 durante um período de 1 semana. C30 foi dissolvido em água fisiológica e foi administrada 1 injeção por dia. Nos primeiros 3 dias foram administradas injeções na veia da cauda (150 μl por injeção) e durante os 2 dias restantes injeções IP (300 μl por injeção). A dose primária iniciou a partir de 3 mg/kg e a cada dia a dose foi aumentada gradualmente. O grupo de controle recebeu o mesmo volume de salina. A maior dose analisada para injeções IV foi de 50 mg/kg e para as injeções IP foi de 100 mg/kg. Camundongos injetados IV não apresentaram sinais de mortalidade nem quaisquer outros efeitos colaterais visíveis. No entanto, camundongos injetados IP desenvolveram uma lesão subcutânea de inchaço depois da maior dose de 100 mg/kg , sugerindo que a solução de peptídeos foi densa demais e formou agregados insolúveis. Órgãos de camundongos tratados e de controle foram submetidos a análise histológica adicional. Depois de todas as 5 injeções terem sido administradas, foi colhido sangue por punção retro-orbital e analisado. Não foram encontradas anormalidades no sangue.
2.12 Eficácia in vivo do composto C30 Animais:
[00980] Camundongos NIH Swiss fêmeas de 6 semanas de idade livres de patógeno específico (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) pesando 21 a 24 g foram usados para todos os estudos. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética de Experimentos em Animais local.
Modelo de coxa de camundongo neutropênico de cepa de S.aureus MRSA 326.
[00981] Camundongos foram tornados neutropênicos injetando ciclofosfamida (Sigma) por via intraperitoneal 4 dias (150 mg/kg de peso corporal) e 1 dia (100 mg/kg) antes de infecção experimental. Estudos prévios mostraram que este regime produz neutropenia neste modelo por 5 dias. Culturas de caldo de S. aureus MRSA 326 recém laminado foram cultivadas de um dia para o outro em caldo de Mueller-Hinton (MHB). Depois de uma diluição a 1:4.000 em PBS, as contagens bacterianas do inóculo variaram entre 106 e 2 × 106 CFU/ml. Os camundongos foram anestesiados brevemente com aproximadamente 4% de isoflurano logo antes da inoculação. A suspensão bacteriana (0,05 ml) foi injetada por via intramuscular em cada coxa (aproximadamente 5x104CFU). O tratamento foi iniciado 2 h depois de inoculação bacteri-ana através de uma via i.v. (intravenosa) ou i.p. (intraperitoneal). Quatro grupos de 3 animais por grupo foram usados neste estudo:
  • • o grupo A recebeu tampão somente e foi sacrificado 4 horas pós infecção,
  • • o grupo B foi tratado i.v. com 15 mg/kg de C30 (volume total de 150 ul) e foi sacrificado 4 horas pós-infecção,
  • • o grupo C recebeu duas injeções i.p. de 30 mg/kg depois de 2 horas e de 4 horas pós-infecção e foi sacrificado 6 horas pós-infecção.
  • • o grupo D foi injetado i.v com 15 mg/kg de vancomicina e sacrificado 4 horas pós-infecção.
[00982] Em vários pontos do tempo depois do tratamento, grupos de três camundongos foram sacrificados humanitariamente por asfixia com CO2. A massa muscular da coxa foi homogenizada e diluída decimalmente em PBS gelada, e alíquotas de 10 μl de cinco diluições seriais foram laminadas sobre agar de sangue (em 3 repetições de diluição independente por homogenado de coxa). Depois de incubação de um dia para o outro a 37°C, as CFU foram enumeradas para cada coxa e expressadas como o log10 CFU/coxa.
[00983] Conforme mostrado na Fig. 31, foi demonstrado que o composto C30 reduz a expansão do inóculo inicial por 6,9 Log10 CFU/ml quando injetado como uma dose de bolus i.v. de 15 mg/kg. Em comparação, a mesma dose devancomicina reduziu o crescimento por 8,7 Log10 CFU/ml. Dose duplo intraperitoneal de C30 não demonstrou rápido efeito sobre a redução de CFU na coxa (a qual de fato deve ser esperada dada a via de administração). É necessária avaliação posterior desta via de liberação tempo-dependente. Além disso o experimento carece de um grupo de controle de animais sacrificados depois de 6 horas pós-infecção. Não obstante, tendo em conta que as bactérias expandiram 4,7 Log10 CFU/ml dentro de 4 horas de inoculação em camundongos não tratados (1,7 vezes) pode-se arguir que depois de 6 horas pós-infecção a quantidade de CFU deve adicionalmente aumentar logaritmicamente. Por este motivo não deve ainda ser rejeitada liberação i.p..
3. Aplicações antivirais
[00984] O fardo da doença causado por influenza sasonal, o surto pandêmico de H1N1 de 2009 e a aumentada disseminação de vírus da gripe resistentes a fármacos (adamantanos e inibidores da neuraminidase) demonstram que existe uma necessidade médica de novos fármacos os quais possam inibir muitos tipos ou variantes de vírus da gripe e sejam menos sujeitos a variabilidade de vírus sasonal. Atualmente, Tamiflu® da Roche e Relenza® da GSK são os fármacos mais comumente prescritos no tratamento da gripe. Ambos os fármacos têm por alvo a proteína neuraminidase. Os vírus da gripe em circulação estão rapidamente desenvolvendo resistência contra Tamiflu® e existe somente um número muito limitado de fármacos anti-influenza sob desenvolvimento clínico.
[00985] Portanto, decidiu-se modelar interferons contra regiões conservadas de proteínas da gripe, para assegurar uma ampla especificidade de alvo. De modo importantle, o mecanismo de ação da tecnologia do interferon é fundamentalmente diferente das vacinas direcionadas contra doenças infecciosas e todas as outras estratégias de intervenção anti-viral atualmente usadas, isto é, tem por alvo o processo elementar de dobramento da proteína, e portanto, representa uma intervenção molecular inteiramente nova e pressão de seleção sobre a adequação viral. Além disso, permite a identificação de novos alvos virais que até o momento não foram suscetíveis a inibição. Além disso, contanto que os interferons anti-virais apresentem comportamento de alta estabilidade, a liberação dos interferons através de sprays ou aerossóis intranasais ou intratraqueais pode ser possível para adminis- tração local no sítio de infecção e portanto pode revelar ainda uma vantagem adicional dos interferons comparados com os fármacos atualmente prescritos.
[00986] Para o esquema dos interferons, houve foco em particular sobre as subunidades de polimerase viral (PA, PB1, PB2) e sobre a nucleoproteína (NP). Estas proteínas são largamente conservadas, e a ultima proteína viral foi recentemente identificada como um alvo para um composto de molécula pequena que exerce seu efeito anti-viral desencadeando agregação de NP, embora existam vírus da gripe que são naturalmente resistentes contra este fármaco experimental (Kao et al., Nat Biotechnol. 2010; 28(6):600-5). Em resumo, interferons tendo por alvo estas proteínas conservadas proporcionariam uma resposta para a crescente resistência do vírus da gripe contra os antivirais disponíveis atualmente.
[00987] Um painel de 36 peptídeos direcionados contra diferentes proteínas do vírus da gripe A foi avaliado em um experimento preliminar. Células renais caninas de Madin Darby (MDCK) foram cultivadas até a confluência e pré-incubadas por 1 hora a 37°C com interferons em meio livre de soro. As células foram em seguida infectadas por 16 horas com vírus NIBRG-14 (uma cepa de H5N1) ou PR8 (uma cepa de H1N1). Os peptídeos mais promissores para cada uma das proteínas selecionadas foram escolhidos para avaliação adicional. Estes peptídeos são mostrados na Tabela 10.
Figure img0014
O O e o Z na frente da sequência se referem a uma etiqueta ótica e a um ligante respectivamente. O signi- fica 5(6)-Carboxifluoresceína. O ligante usado é ácido N-(3-{2-[2-(3-amino-propoxi)-etoxi]-etoxi}-propil)-succinâmico], algumas vezes também referida como ácido 4, 7, 10-trioxatridecan-succín(âm)ico ou Ttds. A estrutura das moléculas portanto corresponde à fórmula:
[00988] Etiqueta - Z1-X1-Y1-X2-Z2-X3-Y2-X4, isto é, n=2, a etiqueta e Z1 são conforme definido acima, todas as 4 porções X equivalem a um único resíduo R, Z2 é um ligante de GS, Y1=Y2 e equivale à sequência listada na última coluna da tabela, com a exceção de interferon 1,onde a porção Y é LIQLIVS (SEQ ID NO: 124). Para esta região de agregação, o resíduo gatekeeper N-terminal equivale ao resíduo flanqueante na proteína. Todas as regiões de agregação são únicas para a proteína da gripe A que têm por alvo.
[00989] Como um experimento de seguimento, células MDCK foram cultivadas em monocamadas confluentes em um formato de 24 cavidades. Os interferons (200 mg) foram dissolvidos em 45 microl de DMSO para obter uma solução de estoque a 2 mM. 7 microlitros de estoque de interferon foi adicionado a 400 microl de PBS para obter uma solução a 35 microM. As células foram lavadas com meio livre de soro, depois do qual 250 microlitros de meio livre de soro fresco e 100 microlitros de interferon foram adicionados. Os interferons foram diluídos de modo que foram aplicados às células em concentrações de 1 ou 10 μΜ. Em seguida, as células foram incubadas por 4 horas a 37°C e 5% de CO2. Depois de 4 horas de pré-incubação com os peptídeos interferon, as células foram inoculadas com 10 unidades formadoras de placa (pfu) de vírus PR8. O inóculo foi removido e meio contendo tripsina foi adicionado. As amostras foram colhidas em 0, 8, 12, 16, 24 e 36 horas para titulação do vírus. Como controle positivo, as células foram tratadas com 1 μΜ ou 10 nM de Tamiflu. Os resultados de experimentos em duplicata são mostrados na Fig. 32.
[00990] Conforme pode ser visto a partir da figura, a 10 μM todos os peptídeos inibem a replicação do vírus. A 1 μM, os interferons 1 e 4 ainda inibem de modo reprodutível a replicação do vírus, ao passo que o efeito dos interferons 2 e 3 é menos forte. Notar no entanto que Tamiflu também não inibiu completamente a replicação viral em uma situação.
[00991] Foi usado um ensaio de minireplicon de influenza A mais sensível para avaliar o potencial dos interferons candidatos. Este sistema requer a presença de proteínas funcionais PA, PB1, PB2 e NP. Como repórter, foi usado um constructo antisense de luciferase de vaga-lume, o qual foi transfectado em células de mamífero junto com plasmídeos de expressão para PB1, PB2, PA e NP. Foi realizada normalização para transfecção usando um repórter de luciferase Renilla. Um experimento de controle confirmou que o minireplicon de luciferase de vaga-lume produziu atividade de luciferase quando todos os 4 componentes estavam presentes, mas não quando um destes estava faltando ou quando um vetor de expressão codificando proteína Mx1 de camundongo, a qual confere resistência seletiva ao vírus da gripe inibindo a síntese de mRNA viral no núcleo de células infectadas com o vírus da gripe, é cotransfectado (fig. 33)
[00992] Usando este sistema como uma leitura, pode-se confirmar a atividade antiviral dos constructos de interferon. Variações destes interferons com diferentes gatekeepers (R ou D) e/ou diferentes porções de ligante de Z2 (GS, PP ou PS) também foram testadas, assim como interferons com outras sequências de agregação (vide a Fig. 34). Sequências destes constructos são mostradas na Tabela 11.
Figure img0015
Figure img0016
Figure img0017
[00993] O e Z são etiquetas e ligantes idênticos conforme especificado para a Tabela 10 acima.
[00994] A título de controle, interferons modelados contra proteínas virais internas (M1 e NS1) que não estão envolvidas no ensaio de minireplicon também foram testados, e estes na verdade não apresentaram redução na atividade de luciferase (Fig. 35). O esquema destes interferons irrelevantes é idêntico ao dos 4 interferons contra as proteínas de polimerase e contra NP, com gatekeepers e Z2 ligantes (isto é, ligantes internos, a fórmula aqui é Z1-X1-Y1-X2-Z2-X3-Y2-X4) conforme indicado na figura. A sequência de agregação e as sequências de peptídeos para peptídeos contra proteína 1 de matriz e proteína 1 não estrutural também são mostrados na Tabela 11.
[00995] Portanto, peptídeos interferon podem ser modelados contra cada uma das proteínas de polimerase do vírus da gripe, bem como contra nucleoproteína. Estes interferons tiveram êxito em diminuir a replicação do RNA da influenza, um efeito que é específico e dependente de hiporregulação alvo, uma vez que interferons contra alvos não relevantes não resultou em obter hiporregulação.
4. Detecção e diagnóstico 4.1 Detecção de β-galactosidase (β-gal) com interferons específicos 4.1.1 Esquema e síntese de peptídeos interferon específicos
[00996] Os segmentos nucleantes de agregação do alvo a ser detectado, isto é, β-galactosidase, foram identificados usando o algoritmo Tango, um algoritmo mecânico estatístico para prever regiões propensas a β-agregação em proteínas com base em três parâmetros fisioquímicos, a saber, baixa carga líquida, alta hidrofobicidade e propensão de β-sheet. Estes foram em seguida verificado para os requisitos para as porções Yi esboçadas no pedido, para assegurar que estas sequências possuem alta propensão a agregação. Tango compara a propensão de uma dada sequência de aminoácidos con- tra uma série de sequência similar para formar vários elementos estruturais secundários e atribuir um escore (de 0 a 100) proporcional a sua capacidade para formar agregados de β-sheet. Um trecho de sequência de escore total <5 é considerado como tendo baixa propensão para agregar e os >50 são fortemente agregantes. A partir da sequência de proteína β-gal (representada na SEQ ID NO: 3, sem o resíduo iniciador M), dois trechos de sequências de aminoácidos com um escore tango total >50 viz. os resíduos 7 a 12 na SEQ ID NO: 3 (LAVVLQ (SEQ ID NO: 75, Tango 1) e os resíduos 453 a 460 na SEQ ID NO: 3 (VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76), Tango 2) foram selecionados e uma coleção peptídeos de alta pureza (>95%) compreendendo a sequência tipo selvagem flanqueada com um ou mais resíduos gatekeeper (Arg, Lys, Asp, Glu e Pro) foram sintetizados por síntese de fase sólida. Um trecho de sequência compreendendo os resíduos 106 a 113 da SEQ ID NO: 3 apresentando um escore Tango total <5 foi selecionado como um controle negativo para estabelecer a baixa propensão a agregação deste segmento conforme previsto pelo algoritmo Tango. Além disso foram sintetizadas três versões de interferons mutantes compreendendo a VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76) (região Tango 2). As sequências dos 6 peptídeos interferon (compreendendo as regiões Tango identificadas, compreendendo a sequência de controle negativo ou compreendendo a região Tango 2 variante (ou mutada)) são representadas na Tabela 12. O C-término destes 6 peptídeos foram acetilados e marcados com etiqueta de biotina ou poli-histidina (His)6 no N-término para detecção por western blotting (WB) e triagem in vitro, respectivamente (vide o exemplo 2).
[00997] SEQ ID NO: 3, sequência de aminoácido de β-galactosidase. As regiões Tango identificadas são representadas em negrito
1TMITDSLAV VLQRRDWENP GVTQLNRLAA HPPFASWRNS EEARTDRPSQ QLRSLNGEWR
60 FAWFPAPEAV PESWLECDLP DADTVVVPSN WQMHGYDAPI YTNVTYPITV NPPFVPAENP
120 TGCYSLTFNI DESWLQEGQT RIIFDGVNSA FHLWCNGRWV GYGQDSRLPS EFDLSAFLRA
180 GENRLAVMVL RWSDGSYLED QDMWRMSGIF RDVSLLHKPT TQISDFQVTT LFNDDFSRAV
240 LEAEVQMYGE LRDELRVTVS LWQGETQVAS GTAPFGGEII DERGGYADRV TLRLNVENPE
300 LWSAEIPNLY RAVVELHTAD GTLIEAEACD VGFREVRIEN GLLLLNGKPL LIRGVNRHEH
360HPLHGQVMDE QTMVQDILLM KQNNFNAVRC SHYPNHPLWY TLCDRYGLYV VDEANIETHG
420 MVPMNRLTDD PRWLPAMSER VTRMVQRDRN HPSVIIWSLG NESGHGANHD ALYRWIKSVD
480 PSRPVQYEGG GADTTATDII CPMYARVDED QPFPAVPKWS IKKWLSLPGE MRPLILCEYA
540 FIAMGNSLGGF AKYWQAFRQY PRLQGGFVWD WVDQSLIKYD ENGNPWSAYG GDFGDTPNDR
600 QFCMNGLVFA DRTPHPALTE AKHQQQYFQF RLSGRTIEVT SEYLFRHSDN EFLHWMVALD
660 GKPLASGEVP LDVGPQGKQL IELPELPQPE SAGQLWLTVR VVQPNATAWS EAGHISAWQQ
720 WRLAENLSVT LPSASHAIPQ LTTSGTDFCI ELGNKRWQFN RQSGFLSQMW IGDEKQLLTP
780 LRDQFTRAPL DNDIGVSEAT RIDPNAWVER WKAAGHYQAE AALLQCTADT LADAVLITTA
840 HAWQHQGKTL FISRKTYRID GHGEMVINVD VAVASDTPHP ARIGLTCQLA QVSERVNWLG
900 LGPQENYPDR LTAACFDRWD LPLSDMYTPY VFPSENGLRC GTRELNYGPH QWRGDFQFNI
960 SRYSQQQLME TSHRHLLHAE EGTWLNIDGF HMGIGGDDSW SPSVSAEFQL SAGRYHYQLV
1020 WCQK
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# A anotação b~ conforme usado aqui, neste pedido de patente, indica que o peptídeo é biotinilado N-terminalmente e fundido com um ligante.
• As sequências tipo selvagem são mostradas com seus resíduos naturalmente flanqueantes.
[00998] Os nomes dos interferons, conforme usado no esboço dos seguintes exemplos, são representados na coluna 1, as sequências são representadas na coluna 2. Nestas moléculas de interferon, n é 1, X1 e X2 são resíduos R, Y1 é um trecho de 6 (‘Tango 1’) ou 8 (‘Tango 2’) resíduos da proteína-alvo, Z1 é um ligante de aminoácidos N-terminal APAA (SEQ ID NO: 77), e as moléculas são fundidas a uma etiqueta detectável - neste caso biotina (b). Para experimentos adicionais, também foram usados outros ligantes tais como Ttds e PEG, bem como diferentes etiquetas tais como HA-tag (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 108)), Flag-tag (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 106)), e His-tag (po-lihistidina) - são mostrados experimentos representativos. Os peptídeos mutantes compreendem uma região Y1 com 1 ou 2 não substituições conservadoras relativas à sequência da proteína-alvo β-gal.
[00999] Uma visão geral esquemática do método de detecção geral de proteínas por uso de interferons, o qual nas partes que se seguem refere-se como PepBlot, é representada na Figura 36.
4.1.2. Detecção de β-galactosidase através de análise Western Blot e PepBlot com interferons específicos para β-galactosidase
[001000] A β-galactosidase foi primeiro expressada em E. coli. Para isto, células BL21 de E. coli com o constructo de expressão pBad_βgal_WT (vetor pBad obtido da Invitrogen) foram cultivadas em meio LB a 37°C. Quando a cultura atingiu OD600 nm ~0,6, as células foram induzidas com 0,2% de arabinose e deixadas para crescer de um dia para o outro a 37°C. Em paralelo células BL21 competentes que não expressam β-Gal foram cultivadas para controle e experimentos de titulação.
[001001] 0,4 ml de uma suspensão de células BL21 (OD600 nm ~1,2) expressando β-Gal (cultivadas sob condições induzidas) foi centrifugado a 5000 g por 10 min em temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e 0,8 ml de reagente de extração de proteína bacteriana (B-PER, Thermo scientific) contendo inibidor de protease foi adicionado ao pélete bacteriano e misturado por turbilhonamento por 30 s de modo a lisar as células. A 21 μl do lisado de células BL21 completo, 5 μl de tampão de carga de amostra 5x SDS (Fermentas) foi adicionado e aquecido a 99°C por 3 min. Esta mistura (26 μl por cavidade) foi carregada em um gel Bis-Tris NuPage a 4 a 12% de 10 cavidades e as proteínas foram separadas sob condições desnaturantes. As proteínas separadas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e bloqueadas de um dia para o outro com 1% de BSA em salina tamponada com fosfato, 0,05% de Tween 20, pH 7,4 (PBS-T) a 4°C. Cada alameda da membrana foi cortada e incubada separadamente com ou anticorpo anti-β-Gal de coelho ou Tango 1 biotinilado, ou Tango 2 biotinilado, ou o peptídeo off-target (fora do alvo) biotinilado ou um peptídeo mutante Tango 2 biotinilado.
[001002] O procedimento seguido para detecção por western blot (WB) de β-gal com anticorpo anti-β-Gal foi como se segue. A primeira alameda da membrana foi cortada e foi incubada com anticorpo anti-β-Gal policlonal de coelho (diluição a 1:1000) por 1 h sob suave agitação em PBS-T. Isto foi seguido por 3x lavagem por 10 min com PBS-T. Depois da lavagem final a membrana foi incubada com anticorpo de cabra policlonal anti-coelho conjugado a peroxidase de raiz-forte (HRP, diluição a 1:5000) por 1 h em PBS-T. Em seguida esta alameda da membrana foi lavada 3x 10 min com PBS-T e finalmente enxaguada em água desionizada por 10 min. A alameda da membrana foi exposta a reagente de substrato de quimiluminescência HRP (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fisher Scientific) e a proteína-alvo foi visualizada usando sistema de imagiologia Bio-Rad ChemiDoc XRS (vide a Figura 37, alameda 1).
[001003] O procedimento para detecção PepBlot (isto é, um protocolo similar a Western blot porém com interferons ao invés de anticorpo como agente de detecção) de β-gal com peptídeos interferon biotinilados foi como se segue. Uma solução de estoque (10 μM) de cada um dos peptídeos biotinilado (Tango 1, Tango 2, off-target e mutantes de tango 2 (vide a tabela 12) foi preparada em 100% de DMSO. O estoque de peptídeo foi diluído (a 1/40) em 10 mM de tampão MES, 100 mM de Trehalose, 0,02% de Tween 20, pH 5,5 para obter uma concentração final do peptídeo de 250 nM. A solução de peptídeo recém preparada foi imediatamente adicionda à faixa de membrana e suavemente agitada em temperatura ambiente. Depois de 1 h a solução de peptídeo foi decantada e a faixa de membrana foi lavada 4x 10 min com 10 mM de tampão MES, 0,05% de Tween 20, pH 5,5. Então a faixa de membrana foi incubada com reagente de afinidade de biotina (diluição a 1:100.000) estreptavidina (SRP) conjugado a HRP em PBS-T por 1 h em temperatura ambiente. Isto foi seguido por 3x lavagem por 10 min com PBS-T e finalmente enxaguado em água desionizada por 10 min. A faixa de membrana foi exposta a reagente de substrato de quimiluminescência HRP (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fisher Scientific) e a proteína-alvo foi visualizada usando o sistema de imagiologia Bio-Rad ChemiDoc XRS.
4.1.2.1 Seletividade dos diferentes interferons usados
[001004] Na Figura 37a é mostrada comparação de detecção por WB de β-gal de lisados de células bacterianas completos usando anticorpo anti-β-Gal policlonal de coelho e também a detecção usando PepBlot com três interferons diferentes: peptídeo Tango 1 (b~RLAVVLQR (SEQ ID NO:44)) e peptídeo Tango 2 (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 45)) e um peptídeo fora do alvo (off-target) (b~RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 46)). Aqui também, biotina foi usada como etiqueta e APAA (SEQ ID NO: 77) como um ligante de aminoácidos. Foi observado (vide a Figura 37) que os interferons Tango 1 e Tango 2 ligam a β-Gal com alta especificidade. Embora seja previsto que o peptídeo Tango 1 demonstre a propensão mais forte para agregar com β-gal, apresenta uma ligação mais fraca (vide a alameda 2) do que o peptídeo interferon Tango 2. Sem ser limitado a uma mecanismo de ação em particular, uma explicação é que o peptídeo Tango 1 interage de modo menor eficaz para o N-término do β-gal porque este N-término está menos disponível no estado imobilizado de β-gal sobre a faixa de membrana. Esta explicação não limitante é adicionalmente corroborada pelo fato de que a adição do mesmo peptídeo interferon (isto é, peptídeo Tango 1) a β-gal livre in vitro resulta em agregação cinética mais rápida em comparação com o peptídeo Tango 2 (vide mais adiante). A Figura 37 claramente mostra que o peptídeo Tango 2 apresenta forte afinidade para o β-Gal com um sinal comparável à detecção com um anticorpo específico para β-gal (comparar a alameda 1 e a alameda 3). Embora o peptídeo interferon off-target seja populado com aminoácidos hidrofóbicos, a presença de mais de um resíduos P quebradores de β-sheet no centro da sequên-cia provoca disrupção da β-agregação de modo eficaz. A banda na alameda 4 na posição ~20 kDa não é um efeito de reatividade cruzada do peptídeo mas é devida a ligação inespecífica de estreptavidina (SRP) na ausência (ou baixa disponibilidade) de biotina. Os experimentos descritos nas seções que se seguem são essencialmente baseados na sequência Tango 2.
4.1.2.2 Especificidade de ligação de sondas de interferon
[001005] De modo a avaliar a especificidade da interação djo peptídeo interferon Tango 2 com β-Gal, foram realizados experimentos de detecção usando peptídeos adicionais. Primeiro, foi sondado β-Gal com um peptídeo β-Gal não agregante porém hidrofóbico (P106ITVNPPF113), e não foi encontrada nenhuma interação do peptídeo de sonda correspondente b~RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 46) com β-Gal (vide acima, Fig. 37, alameda 4). Segundo, foram empregados quatro peptídeos de sonda cujas sequências correspondem a regiões de agregação identificadas usando TANGO em proteínas não relacionadas bacterianas e humanas. Isto foi feito usando peptídeos com etiqueta de biotina derivados a partir de inibidor B de quinase 4 dependente de ciclina humana (sequência b~FLDTLVVLHRA (SEQ ID NO: 175)), antígeno prostático específico humano (PSA, sequência b~RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85)) e prolina desidrogenase (PD, b~RFFIALSR (SEQ ID NO: 176)) e ClpB ATPase (b~RILLGLIR (SEQ ID NO: 177)), ambos tirados de Staphylococcus epidermidis. O esquema das três últimas sondas corresponde a moléculas com n=1, X1=X2= um resíduo Arg, com a sequência Y1 no meio. Na primeira sonda, FLD e RA são sequências naturalmente flanqueantes da porção TLVVLH (SEQ ID NO: 178) que corresponde a Y1. Nestas sequências flanqueantes, D corresponde ao gatekeeper X1, R ao gatekeeper X2.
[001006] Todos estes peptídeos n ão tiveram êxito em produzir coloração específica da banda correspondente a β-Gal (dados não mostrados) mostrando que a propensão a agregação é necessária mas não suficiente para interação específica. Finalmente, para testar se regiões Tango de alta classificação toleraem substituição com outros resíduos e mantêm suas propriedades, foram gerados mutantes. No primeiro caso, resíduo "I" foi substituído com resíduo "P" quebrador (breaker) de β-sheet e foram gerados 2 peptídeos mutantes diferentes com uma alterção de "I" para "P" (vide a tabela 12 para as sequências específicas). Além disso o efeito de um peptídeo duplo mutante substituindo "IW" com "PE" foi usado para estudar a influência de resíduo gatekeeper carregado sobre a propensão a β -agregação. É esperado que a agregação seja suprimida pela introdução de uma carga repulsiva. Análise PepBlot dos dois peptídeos mutantes de ponto único (b~RVPIWSLGNR (SEQ ID NO: 47) e b~RVIPWSLGNR (SEQ ID NO: 48)) ilustrada na Figura 38 mostra que estes peptídeos mutantes ainda ligam de modo eficaz a β-Gal. No entanto, é evidente que ao introduzir substituições é observada ligação fora do alvo (off-target). Isto não é ilógico, uma vez que o curto trecho de indução de agregação remanescente não é único para a proteína β-Gal em E. coli. Além disso, a introdução adicional de um resíduo carregado leva a uma perda de interação quase completa. Isto demonstra a alta especificidade de sequência da ligação de sonda uma vez que um mutante de ponto único é suficiente para suprimir a especificidade de ligação uma vez que a supressão da propensão a agregação é suficiente para abolir ligação por completo apesar de 80% de identidade de sequência. Estes dados confirmam a hipótese de que a propensão a agregação e a correspondência de sequência são um pré-requisito para a especificidade de interação mediada por peptídeo e estão de acordo com um recente estudo (Sabate, R.,et al. J. Mol. Biol. 404:337-352, 2010) mostrando que versões embaralhadas ou invertidas do polipeptídeo amiloide de ilhota não cross-seed um com o outro ou com a sequência tipo selvagem, confirmando dependência de posição além da mera composição de sequência.
4.1.2.3 Cinética dos interferons sobre a ligação
[001007] De modo a estudar a ligação cinética do peptídeo interferon Tango 2 a β-Gal (isto é, o tempo de contato entre interferon e alvo) em lisado de células BL21 completo, o peptídeo foi incubado com a membrana a partir de 30 s até 1 h. A membrana foi removido de tampão de incubação em intervalos de tempo seletivos e adicionalmente processada conforme descrito acima.
[001008] A Figura 39 ilustra que a detecção de β-Gal a partir de lisado de células BL21 bacterianas completo pode ser realizada em um incubação de curto espaço de tempo (tão baixo quanto 30 segundos) com o peptídeo.
4.1.2.4 Sensibilidade ao método de detecção PepBlot baseado na uso de interferons
[001009] Foi determinada a sensibilidade para detecção PepBlot à base de peptídeo interferon. Para isto, β-Gal na faixa de concentração de 0,1 pmol (11,6 ng) a 10 pmol (1160 ng) foi adicionado (spiked) a um lisado de células BL21 não induzidas completo (OD600 nm ~0,6). A 21 μl do lisado de células BL21 completo foi adicionado 5 μl de 5x tampão de carga SDS (Fermentas) e aquecido a 99 °C por 3 min. 26 μl desta mistura contendo diferentes concentrações de β -Gal foram carregados para 10 cavidades de um gel NuPage Bis-Tris a 4 a 12% e as proteínas foram separadas sob condições desnaturantes. As proteínas separadas foram em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose e bloqueadas de um dia para o outro com 1% de BSA em PBS-T a 4°C. Incubações adicionais e manipulação com os interferons foram conforme descrito acima aqui, neste pedido de patente. A Figura 40 mostra o resultado deste ex- perimento. A partir dos dados é evidente que podem ser detectadas quantidades subpicomolares de β-Gal (tão pouco quanto 58 ng) (vide a detecção de β-Gal na alameda 2 de Figura 40A), o que é comparável ao limite de detecção de um anticorpo. Além disso, o sinal obtido também é comparável à detecção do anticorpo anti-β-Gal (Figura 41).
4.1.2.5 Especificidade de detecção PepBlot
[001010] De modo a determinar a influência de resíduos gatekeeper sobre a especificidade de detecção PepBlot, foram produzidos peptídeos interferon contra a proteína-alvo β-gal com sequência Tango de núcleo "VIIWSLGN" (SEQ ID NO: 76). Para isto, foram gerados 3 peptídeos interferon: 1) Sem resíduo gatekeeper, com a sequência VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76) ligada à etiqueta Flag (Flag-tag) (DYK-DDDDK (SEQ ID NO: 106)) no C-término através do ligante de aminoácidos GSGS (VIIWSLGNGSGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 179)). 2) Sequência Tango flanqueada por resíduos gatekeeper naturais (RDRNHPSVIIWSLGNESGHG (SEQ ID NO: 180)). 3) Resíduos gatekeeper carregados complementares com o resíduo ‘D’ e ‘R’ posicionados para complementar os resíduos polares ‘S’ e ‘E’ (DVIIWSL-GNR (SEQ ID NO: 181)). Os primeiros dois peptídeos confirmam as definições de peptídeos interferon proporcionadas na patente internacional No. WO2007/071789, ao passo que o terceiro peptídeo é uma molécula de interferon de acordo com a definição estrutural proporcionada aqui, neste pedido de patente. Todos os peptídeos listados na Tabela 13 foram duplamente biotinilados (tanto sobre o N-término quanto sobre o C-término) e ligados aos peptídeos interferon por ligante de Ttds.
Tabela 13: Lista dos 3 diferentes peptídeos interferon usados para estudar a influência de gatekeepers sobre a especificidade de detecção de β-Gal em uma plataforma PepBlot competitiva.
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• Os peptídeos interferon foram ligados a biotina tanto sobre o C-término (indicado por ~b) quanto sobre o N-término (b~) com ligante de Ttds. Notar que a sequência Tango está sublinhada em cada peptídeo.
[001011] Foi testada a performance dos peptídeos para ligar seletivamente β-gal em uma plataforma PepBlot competitiva onde soro clínico a 7% foi tirado em uma alameda e β-gal em lisado de E. coli completo em outra alameda. Uma solução de estoque (10 μM) de cada um dos peptídeos biotinilados foi preparado em 100% de DMSO. O estoque de peptídeo foi diluído (a 1/400) em 10 mM de tampão MES, 100 mM de Trehalose, 0,05% de Tween 20, pH 5,5 para obter uma concentração final do peptídeo de 25 nM. A solução de peptídeo recém preparada foi imediatamente adicionada à faixa de membrana e suavemente agitada em temperatura ambiente. Depois de 15 min a solução de peptídeo foi decantada e a faixa de membrana foi lavada 3x 10 min com 10 mM de tampão MES, 0,05% de Tween 20, pH 5,5 e adicionalmente processada conforme descrito acima aqui, neste pedido de patente.
[001012] A Figura 42 mostra a influência de resíduos gatekeeper sobre a especificidade de detecção PepBlot à base de peptídeos interferon. Todos os três peptídeos ligam a β-gal porém de longe a melhor sonda foi o peptídeo interferon com gatekeepers carregados complementares. Este peptídeo apresenta forte interação com β-gal comparado com os outros dois peptídeos e não tem reação cruzada com as proteínas em soro. A complementação de carga junto com a propensão a β-sheet da sequência Tango contribui para associação intermolecular favorável que parece ser altamente específica. Por outro lado, o peptídeo com flancos naturais apresenta baixa especificidade que é evidente a partir de algumas bandas específicas em soro clínico. Os dados sugerem que gatekeepers não são necessariamente requeridos para interação de peptídeo interferon com a proteína-alvo - conforme também foi demonstrado na patente Internacional No. WO2007/071789. No entanto, a detecção pode ser sintonizada aperfeiçoada para obter alta especificidade modelando peptídeos com resíduos de flancos complementares os quais podem incluir aminoácidos polares tais como R, D, E, K, H e P quebrador (breaker) de β-sheet.
4.2. Interações interferon-alvo estudadas com Ressonância de Plasmon Superficial
[001013] Neste experimento in vitro foi medida a afinidade de diferentes peptídeos interferon para ligação a β-gal por meio de ressonância de plasmon superficial (SPR). Experimentos de ressonância de plasmon superficial foram realizados a 25° C usando um Biacore T100 equipado com chip sensor CM5 (GE Healthcare.). Os reagentes de ligação (N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS) e etanolamina-HCl) foram adquiridos da GE Healthcare. BSA e β-gal foram adquiridos da Sigma-Aldrich e Roche Diagnostics, respectivamente. Os peptídeos foram sintetizados em JPT, GmbH e foram de >95% de pureza. As proteínas BSA e β-Gal foram imobilizadas respectivamente, nos canais de referência e de amostra sobre um chip sensor CM5 por química de ligação de amina padrão em um fluxo de 10 μlmin-1. A superfície de carboximetila dextrano foi ativada pela injeção de uma proporção a 1:1 de EDC e NHS por 7 minutos. As proteínas foram diluídas em 10 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,5 até uma concentração final de 0,2 mgml-1 e injetadas em pulsos curtos sobre a superfície ativada até os níveis de imobilização terem atingido 4000 RU ou 8000 RU, para BSA e β-Gal, respectivamente. Os grupamentos reativos remanescentes foram bloqueados com 1 M de etanolamina, pH 8. Depois de completamento da ligação, a superfície foi regenerada com pulsos curtos de 50 mM de NaOH e 8 M de uréia para remover proteínas fixadas de modo não covalente. Os níveis de imobilização depois da regeneração foram tipicamente entre 3500 RU a 4000 RU tanto nos canais de referência quanto de amostra. A afinidade de vários interferons (vide a Tabela 14 para as sequências dos interferons): Tango zona 1, Tango zona 2, off-target, Tango zona 2 mutantes e repetição em tandem de peptídeo Tango zona 2 para ligar β-Gal foi investigada injetando os peptídeos com etiqueta de hexahistidina sobre as superfícies de referência (BSA) e de amostra (β-Gal) a 25°C. Os peptídeos, dissolvidos no tampão de operação (10 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,015% de Tween 20) em uma concentração de 1 μM, foram injetados por 60 s em uma taxa de fluxo de 30 μlmin-1 e então deixados para dissociar por 600 s. A injeção foi repetida sobre a mesma superfície bem como sobre superfícies imobilizadas de modo independente. A superfície foi regenerada entre cada ciclo por pulsos de 30 s de i) 50 mM de NaOH, e ii) 8 M de uréia, e foi deixada para estabilizer por 400 s antes do ciclo seguinte.
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#Os peptídeos são ligados a etiqueta de Histidina (His-tag) com um ligante de aminoácidos adicional ‘APAA’ (SEQ ID NO: 77) no N-término.
• As sequências tipo selvagem são mostradas com seus resíduos naturalmente flanqueantes.
[001014] A cinética da co-agregação de β-gal e do peptídeo Tango 2 (HHHHHHAPAARVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 54)) foi investigada a 25°C. O peptídeo dissolvido no tampão de operação foi injetado por 60 s em uma taxa de fluxo de 30 μl/min-1 sobre as superfícies de referência (BSA) e de amostra (β-Gal) em uma série de concentrações (0 a 4 μM, com uma replicata interna) e foram então deixados para dissociate por 600 s. As séries de concentrações foram repetidas sobre a mesma superfície (três vezes) bem como sobre superfícies imobilizadas de modo independente. A superfície foi regenerada entre cada ciclo por pulsos de 30 s de i) 50 mM de NaOH, e ii) 8 M de uréia, e foi deixada para estabilizar por 400 s antes do ciclo seguinte.
[001015] Todos os sensorgramas foram dupla referência subtraída (Myszka,D.G., et al.J. Mol. Recognit.12: 279-284,1999) por i) subtração da resposta observada sobre a superfície de referência e ii) subtração das respostas observadas para injeções de tampão, a última de modo a remover artefatos sistemáticos. Os dados foram adaptados globalmente a um modelo de três estados, usando o software Biacore T100, presumindo um encontro inicial entre o peptídeo em solução e a proteína sobre o chip seguido por um rearranjo de duas etapas antes de um sítio de ligação idêntico se tornar disponível na β-sheet em crescimento.
[001016] Uma compilação dos dados obtidos a partir da análise por SPR é mostrada nas figuras 43 a 46.
[001017] A proteína β-Gal foi imobilizada sobre o chip sensor por ligação de amina, a qual pode impedir a acessibilidade de Tango zona 1 (resíduos 7 a 12) próximo ao N-término. É provável que a fraca afinidade de ligação do peptídeo Tango 1 com β-Gal observada em SPR seja devida à restrição imposta pelaa proteína no estado imobilizado para interagir com o peptídeo. No entanto, in vitro o peptídeo Tango 1 apresenta maior afinidade com β-Gal livre em solução comparado com o peptídeo Tango 2 que está de acordo com o prognóstico do algoritmo Tango.
[001018] O sensorgrama representando a mudança nas unidades de resposta (RU) do instrumento como uma função da concentração de analito (peptídeo Tango 2) é mostrado na Figura 45. A RUmax calculada para uma estequiometria a 1:1 é ~80 RU, no entanto, esses dados excedem este valor e não é obtida estabilidade mesmo em maior concentração e tempo de contato prolongado (>10 min). Isto porque depois do peptídeo ligar a β-Gal, é criado um novo sítio de ligação permitindo o crescimento de agregados sobre a superfície do chip sensor. Para modelar o crescimento de agregados, foi considerada inadequada uma cinética simples de 1 estado ou 2 estados. Os dados cinéticos são melhor representados usando um processo multietapa envolvendo modelo de 3 estados. De acordo com este modelo o peptídeo limita reversivelmente o alvo seguido por troca de conformação que bloqueia em posição para receber o peptídeo subsequente, o qual liga ao primeiro peptídeo e bloqueia o sítio de ligação. Este modelo foi previamente reportado para descrever o alongamento de fibrilas amiloides sobre chip de SPR. As ka e kd calculadas para o mecanismo de 3 etapas foram: ka1 = 2,744E+4, ka2 = 0,02359, ka3 = 0,005491 e kd1 = 0,4123, kd2 = 0,02509 e kd3 = 0,002654. Devido à complexidade do modelo, não se foi capaz de calcular a constante de associação de equilíbrio Ka e constante de dissociação de equilíbrio Kd. A cinética fica ainda mais complexa se um peptídeo de repetição em tandem (n=2 e ambas as porções Y são idênticas) for usado como um analito (vide a Figura 46). Nesta molécula, todas as porções X são um único resíduo R, e o ligante de Z1 é GSGSAPAA (SEQ ID NO: 90) (cf. Tabela 14).
4.3 Determinação da agregação cinética in vitro
[001019] A co-agregação de peptídeo Tango 1, peptídeo Tango 2 e um peptídeo Tango 2 de repetição em tandem com β-Gal in vitro foi monitorada através de dispersão luminosa da alteração aparente em uma densidade ótica (OD) a 340 nm devido a crescimento de particulados de agregados em temperatura ambiente. A co-agregação de in-terferon-β-Gal foi iniciada adicionando concentração molar equimolar (10 μM) de ou peptídeo Tango 1, ou peptídeo Tango 2, ou peptídeo Tango 2 de repetição em tandem e β-Gal em 20 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,8 seguido por suave agitação da amostra a 50 rpm. A sequência dos interferons é reresentada na Tabela 14.
[001020] De modo a caracterizar o tamanho dos agregados o raio hidrodinâmico (RH) de β-Gal na hora zero e depois de co-incubação com ou o peptídeo Tango 1, ou o peptídeo Tango 2, ou o peptídeo Tango 2 de repetição em tandem (Tabela 14) por 2 h foi medido usando dispersão luminosa dinâmica (DLS), DynaPro DLS (Wyatt Technology Europe, Alemanha).
[001021] A Figura 47 mostra que o peptídeo Tango 1 com maior es- core apresenta co-agregação cinética mais rápida com β-Gal livre em solução comparado com o peptídeo Tango 2 in vitro. Quando um peptídeo Tango 2 de repetição em tandem foi adicionado a β-Gal, foi observada rápida co-agregação cinética e o tamanho dos agregados formados depois de 2 h foi maior comparado com o de peptídeo Tango 2 único (Figura 48).
[001022] De modo a avaliar o limite de peptídeo Tango 2 único para iniciar a co-agregação de β-Gal, foi preparada uma série de amostras com proporção molar de β-Gal para peptídeo de 1:0, 1:0,2, 1:0,5 e 1:1 em 20 mM de tampão de fosfato, pH 6,8. A concentração de β-Gal foi mantida constante a 10 μM enquanto a quantidade de peptídeo foi 2 μM, 5 μM e 10 μM. A co-agregação de interferon -β-Gal foi iniciada agitando suavemente a amostra a 50 rpm.
[001023] Experimentos de dispersão luminosa e DLS mostraram que concentrações sub-estequiométricas do peptídeo foram suficientes para induzir a agregação de β-Gal (vide a Figura 49). Os agregados visíveis formados deste modo foram insolúveis em 8 M de uréia ou 6 M de GdHCl.
4.4. Nocaute funcional da enzima β-gal
[001024] De modo a estudar o efeito do peptídeo interferon Tango 2 sobre a função enzimática de β-Gal, a atividade catalítica foi avaliada antes e depois de incubação com este peptídeo. Foi realizada leitura enzimática funcional usando o substrato fluoresceína-di-β-D-galactopiranosídeo (FDG), o qual é não fluorescente mas em cliagem enzimática por fluoresceína fluorescente β-Gal é liberado com intensidade proporcional à atividade catalítica. A Figura 50 mostra o efeito de concentrações crescentes do peptídeo interferon Tango 2 sobre a atividade enzimática de β-galactosidase. É evidente que concentrações equimolares de enzima e interferon levam a uma completa inibição da atividade enzimática (ou em outras palavras a um nocaute funcional por co-agregação completa).
4.5. Estrutura de co-agregado de β-gal-peptídeo interferon Tango 2 isolado
[001025] O co-agregado de β-gal-peptídeo interferon Tango 2 insolúvel foi isolado depois de co-incubação por 2 h. Os agregados isolados foram repetidamente lavados com 20 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,8, até o sobrenadante apresentar absorvência desprezível a 280 nm e ser suspendido em tampão para caracterização estrutural usando espectroscopia infra-vermelho de transformada de Fourier (FTIR), dicroismo circular (CD) e microscopia eletrônica (EM).
[001026] Espectros de FTIR de β-gal nativa mostra um pico de amida I a 1638 cm-1 característico de elementos estruturais secundários ricos em β-sheets, o qual muda para 1628 cm-1 devido a formação intermolecular de β-sheet depois de co-agregação com o peptídeo interferon Tango 2 (Figura 51). Os espectros de dicroismo circular da solução de β-gal nativa apresentam características de uma classe de estrutura α+β ao passo que os espectros de suspensão de co-agregados com uma banda negativa ~218 nm sugerem completa perda de estrutura de proteína nativa e uma mudança para β-sheets agregados (Figura 52). Finalmente, microscopia eletrônica do co-agregado de β-gal-peptídeo interferon Tango 2 isolado ilustra que os agregados formados são amorfos na natureza (e portanto não amilogênicos) (Figura 53).
4.6. Aplicações de interferons de diagnóstico: detecção de três biomarcadores de proteína diferentes em soro
[001027] No exemplo que se segue foi demonstrada a viabilidade do uso de interferons para aplicações de diagnóstico. Para isto, três biomarcadores medicamente relevantes foram escolhidos como exemplos para detecção em soro humano: 1) antígeno prostático específico (PSA) para o qual a sequência de aminoácidos é representada na SEQ ID NO: 4, 2) Proteína C-reactiva (CRP) para a qual a sequência de aminoácidos é representada na SEQ ID NO: 5 e 3) β-2-microglobulina (β-2Μ) para a qual a sequência de aminoácidos é representada na SEQ ID NO: 6. Sequências são mostradas sem seu peptídeo de sinal. Notar que as regiões Tango usadas para o esquema dos interferons específicos estão sublinhadas nas sequências de aminoácidos respectivas. As sequências dos interferons específicos de biomarcadores são representadas na Tabela 15.
SEQ ID NO: 4: sequência de aminoácidos de Antígeno prostático específico (PSA)
IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
SEQ ID NO: 5: sequência de aminoácidos de Proteína C-Reativa (CRP)
QTDMSRKAFVFPKESDTSYVSLKAPLTKPLKAFTVCLHFYTELSSTRGYSIFSYATKRQDNEILIFWSKDIGYSFTVGGSEILFEVPEVTVAPVHICTSWESASGIVEFWVDGKPRVRKSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGNFEGSQSLVGDIGNVNMWDFVLSPDEINTIYLGGPFSPNVLNWRALKYEVQGEVFTKPQLWP
SEQ ID NO: 6: sequência de aminoácidos de β-2-Microglobulina (β-2M)
IQRTPKIQVY5RHPAENGK5NFLNCYV5GFHP5DIEVDLLKNGERIEKVEH5DL5F5KDW5FYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRM
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• As sequências tipo selvagem são mostradas com seus resíduos naturalmente flanqueantes.
[001028] A membrana para a detecção de biomarcadores de proteína foi preparada como se segue. A 21 μl de soro humano a 5% (Lon-za), foi adicionado 50 pmol dos biomarcadores de proteina-alvo (respectivamente 1,55 ng de PSA, 1,25 ng de CRP e 0,6 ng de β-2Μ) e isto foi misturado com 5 μl de tampão de carga 5xSDSl com e sem DTT (Fermentas) e aquecido a 82°C por 3 min. 26 μl desta mistura contendo PSA ou CRP ou β-2Μ foi carregado para um gel NuPage a 4 a 12% Bis-Tris de 10 cavidades e as proteínas foram separadas sob condição desnaturantes ou desnaturantes reduzidas. As proteínas separadas são então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e bloqueadas de um dia para o outro com 1% de BSA em PBS-T a 4°C.
4.6.1 Detecção PepBlot e WB de PSA adicionado (spiked) em soro humano
[001029] Uma solução de estoque (10 μΜ) do peptídeo biotinilado PSA-específico (para sequência vide a Tabela 15) foi preparada em 100% de DMSO. O estoque de peptídeo foi diluído (1/40) em 25 mM de tampão MES, 100 mM de Trehalose, 0,02% de Tween 20, pH 5,0 de modo que a concentração final do peptídeo foi de 250 nM. A solução de peptídeo recém preparada foi imediatamente adicionada à faixa de membrana e suavemente agitada em temperatura ambiente. Depois de 1 h a solução de peptídeo foi decantada e a membrana foi lavada 4x 10 min com 25 mM de tampão MES, 0,05% de Tween 20, pH 5,0. Em seguida a membrana foi incubada com reagente de afinidade de biotina (diluição a 1:100.000) conjugado de SRP-HRP em PBS-T por 1 h em temperatura ambiente. Isto foi seguido por 3x lavagem por 10 min com PBS-T e finalmente enxaguado em água desionizada por 10 min. Para detecção por WB de PSA adicionado (spiked) em soro humano, a membrana foi incubada com (1:5000) anticorpo anti-PSA monoclonal de coelho (EP1588Y, Abcam) específico para o peptídeo C-terminal de PSA. Isto foi seguido por tintura com (1:30.000) anticorpo policlonal de cabra anti-coelho conjugado a HRP. As membranas foram expostas a reagente de substrato de quimiluminescência HRP (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fisher Scientific) e a proteína-alvo foi visualizada usando sistema de ima-giologia Bio-Rad ChemiDoc XRS.
[001030] A Figura 54 mostra a comparação entre detecção de peptídeo interferon, b~RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85) (painel A) e a detecção de anticorpo para PSA (painel B). Foi demonstrado que a análise WB de PSA apresenta múltiplas bandas dependendo da condição de operação do gel. Em condição desnaturante não reduzida foram observadas duas bandas e em condição desnaturante reduzida (não mostrada) apareceram múltiplos fragmentos devido a clivagem interna (Wang, T.J., et al, Tumor Biol.20: 79-85, 1999).
4.6.2 Detecção PepBlot e WB de CRP adicionado (spiked) em soro humano
[001031] Uma solução de estoque (10 μM) de biotinilado peptídeo foi preparado em 100% de DMSO. O estoque de peptídeo foi diluído (a 1/40) em 25 mM de tampão MES, 100 mM de Trehalose, 0,02% de Tween 20, pH 5,0 de modo que a concentração final do peptídeo foi de 250 nM. A solução de peptídeo recém preparada foi imediatamente adicionada à faixa de membrana e suavemente agitada em temperatura ambiente. Depois de 60 min a solução de peptídeo foi decantada e a membrana foi lavada 4x 10 min com 25 mM de tampão MES, 0,05% de Tween 20, pH 5,0. Em seguida a membrana foi incubada com reagente de afinidade de biotin (diluição a 1:30.000) Neutravidina conju- gado a HRP em PBS-T por 1 h em temperatura ambiente. Isto foi seguido por 3x lavagem por 10 min com PBS-T e finalmente enxaguado em água desionizada por 10 min. Detecção por WB de CRP adicionado (spiked) em soro humano foi realizada por incubação (a 1:2000) de anticorpo anti-CRP monoclonal de coelho (Abcam) por 1 h. Isto foi seguido por coloração com goat (1:30,000) anticorpo policlonal anti-coelho conjugado a HRP. As membranas foram expostas a reagente de substrato de quimiluminescência HRP (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fisher Scientific) e a proteína-alvo foi visualizada usando sistema de imagiologia Bio-Rad ChemiDoc XRS. Os blots são mostrados na Figura 55.
4.6.3 Detecção PepBlot e WB de β-2M adicionado (spiked) em soro humano
[001032] Uma solução de estoque (10 μM) de peptídeo interferon biotinilado específico para β-2M (vide a Tabela 15 para a sequência) foi preparada em 100% de DMSO. O estoque de peptídeo foi diluído (1/40) em 25 mM de tampão MES, 100 mM de Trehalose, 0,02% de Tween 20, pH 5,0 para obter uma concentração final do peptídeo interferon de 250 nM. A solução de peptídeo interferon recém preparada foi imediatamente adicionada à faixa de membrana e suavemente agitada em temperatura ambiente. Depois de 30 min a solução de peptídeo interferon foi decantada e a membrana foi lavada 4x 10 min com 25 mM de tampão MES, 0,05% de Tween 20, pH 5,0. Em seguida a membrana foi incubada com reagente de afinidade de biotina (diluição a 1:100.000) conjugado SRP-HRP em PBS-T por 1 h em temperatura ambiente. Isto foi seguido por 3x lavagem por 10 min com PBS-T e finalmente enxaguado em água desionizada por 10 min.
[001033] De modo a detectar β-2M adicionado (spiked) em soro humano por WB, a membrana foi incubada com (1:5000) anticorpo de coelho monoclonal anti-β-2M (Abcam) por 1 h e corada com (1:30.000) anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado a HRP. As faixas de membrana foram então expostas a reagente de substrato de quimiluminescência HRP (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fisher Scientific) e a proteina-alvo é visualizada usando sistema de imagiologia Bio-Rad ChemiDoc XRS. O resultado desta análise é mostrado na Figura 56.
4.6.4 Detecção de CRP e PSA em amostras humanas de complexos não adicionados
[001034] De modo a explorar se a presente abordagem também pode ser aplicada para detecção quantitativa em situações clínicas para detectar proteínas naturalmente secretadas ou vazadas, com proteo-mas de outra origem, composição e complexidade do que o lisado de E. coli, foram modelados ensaios para detectar biomarcadores de proteína humana nas amostras de complexos relevantes, isto é, CRP em soro de sangue humano e PSA em seminal plasma. CRP é um biomarcador amplamente usado para inflamação, o qual proporcionou uma abundante fonte de amostras de soro clínico para as quais estavam disponíveis determinações de CRP à base de ensaios imunotur-bidimétricas independentes.
[001035] Para detecção de CRP em soro, foi selecionado o peptídeo de sonda b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86), o qual é único para CRP. A detecção de CRP em soro foi realizada usando amostras clínicas de dois pacientes contendo baixo teor (1 μgml-1) e alto teor (317 μgml-1) de CRP. A amostra de soro foi diluída até 7% em água MilliQ e misturada com 5x tampão de carga SDS, aquecida a 82°C por 5 min. Proteínas desnaturadas foram submetidas a eletroforese sobre géis Bis-Tris a 4 a 12%, transferidas para de membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e bloqueadas com 1% de BSA em salina tamponada com fosfato, pH 7,4 e 0,05% de Tween 20 (PBS-T). As membranas foram agitadas com 250 nM de peptídeo b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86) for- mulado em 10 mM de tampão MES pH 5,1, 100 mM de trehalose, 0,05% de Tween 20 e 2,5% de DMSO a 25°C por 1 h. Depois de enxaguar com 10 mM de tampão MES pH 5,1, 0,05% de Tween 20 as membranas foram coradas com conjugado de SRP-HRP e visualizadas usando sistema de imagiologia Bio-Rad ChemiDoc XRS.
[001036] Detecção por imunoblot de CRP foi obtida usando anticorpo anti-CRP monoclonal de coelho (1:2000) sob suave agitação. Depois de 1 h a membrana foi enxaguada com PBS-T, coradas com anticorpo de cabra policlonal anti-coelho conjugado a HRP (Promega) por 1 h, e então exposta a reagente de quimiluminescência (SuperSignal West femto substrato de máxima sensibilidade, Thermo Fisher Scientific) e a proteína foi visualizada usando sistema de imagiologia Bio-Rad ChemiDoc XRS. Os resultados são mostrados na Figura 57.
[001037] Prosseguiu-se, então, para avaliar a utilidade de diagnóstico do peptídeo de sonda para detectar CRP em amostras séricas clínicas. Amostras de sangue de 20 pacientes (Universiteit Ziekenhuis, Leuven) foram processadas de acordo com protocolo padrão e o soro foi separado para analisar CRP com diagnóstico laboratorial padrão empregando um ensaio de imunoturbidimetria e PepBlot. A concentração de CRP foi medida por um método à base de imunoturbidimetria usando partículas de latex acopladas a anticorpo anti-CRP monoclonal de camundongo. O ensaio foi realizado em um sistema Hitachi/Roche Modular P (Roche Diagnostic).
[001038] Análise PepBlot das 20 amostras clínicas mostradas na Figura 58 revelaram coloração específica para uma banda bem definida correspondente ao peso molecular de CRP. A quantificação da intensidade destas bandas compar bem com os dados obtidos a partir do ensaio imunoturbidimétrico clínico padrão conforme realizado de modo independente sobre as mesmas amostras.
[001039] Em seguida, foi modelado um ensaio PepBlot para detec- ção de PSA, um membro da famílica de proteases calicreína tecidual que é sintetizada na glândula prostatática, secretada em fluido seminal e é usada como um biomarcador para câncer de próstata. Foram sintetizados peptídeos tendo por alvo a sequência W14QVLVAS20 e a sequência Q34WVLTAA40 que foram previstas por Tango (cf. Tabela 15).
[001040] Sêmen de um voluntário do sexo masculino foi coletado e deixado para liquefazer em temperatura ambiente. Depois de 2 h o fluido seminal foi centrifugado a 10.000 xg por 15 min para separar o plasma das células do esperma. Uma amostra de 10% de plasma seminal foi fracionada sob condição não redutora usando eletroforese por gel desnaturante e em seguida transferida para membrana de PVDF e bloqueada usando o protocolo descrito para eletroforese de soro. Alamedas de membrana foram agitadas separadamente com 250 nM de peptídeo b~RWQVLASD (SEQ ID NO: 88) ou peptídeo b~RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85) ou 250 pM de peptídeo de repetição em tandem b~RQWVLTAARGSGSAPAARQWVLTAAR (SEQ ID NO: 89) formulado em 10 mM de tampão MES pH 5,1, 100 mM de trehalose, 0,05% de Tween 20 e 2,5% de DMSO a 25°C por 1 h. As membranas foram enxaguada em 10 mM de tampão MES pH 5,1, 0,05% de Tween 20 e coradas com SRP conjugado a HRP e visualizadas com o sistema ECL. Em paralelo foi realizada detecção por WB de PSA em plasma seminal incubando a membrana com (1:5000) anticorpo anti-PSA monoclonal de coelho (EP1588Y, Abcam) específico para o peptídeo c-terminal de PSA. Isto foi seguido por coloração com anticorpo de cabra policlonal anti-coelho conjugado a HRP e visualizado usando o sistema ECL.
[001041] Conforme pode ser visto na Figura 59 A, os peptídeos (b~RWQVLASD (SEQ ID NO: 88) e b~RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85)) acumulados sobre uma banda de proteína em um peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa que foi identificado pelo anti- corpo monoclonal como sendo específico para a sequência C-terminal de PSA. Ambos os peptídeos podem detectar PSA a níveis comparáveis ao anticorpo. Notar que o gatekeeper D do peptídeo WQVLAS é selecionado para proporiconar uma carga complementar ao resíduo flanqueante na sequência de proteína. De modo interessante, um forte sinal de banda pode ser obtido usando uma concentração suficientemente baixa (250 pM) do peptídeo interferon de repetição em tandem (n=2 e ambas as porções Y são idênticas) b~RQWVLTAARGSGSAPAARQWVLTAAR(SEQ ID NO: 89) como a sonda (Figura 59 B). Nesta molécula, todas as porções X são um único resíduo R, e o ligante de Z1 é GSGSAPAA (SEQ ID NO: 90). Este resultado sugere que detecção de biomarcador pode ser reforçada usando sequências de agregação de repetição (isto é, as com n no mínimo 2, e da qual no mínimo dois Yi são idênticos um ao outro e a uma região em uma proteína), e as sondas podem ser adicionalmente diluídas em solução. Como confirmação adicional foram analisadas a digestão por tripsina e a análise por espectrometria de massa como sequenciamento N-terminal, as quais confirmam PSA como o principal componente da banda.
4.6.5 Detecção de citocinas Interleucina 1-β (IL1β) e fator de necrose tumoral α (TNFα) em soro humano
[001042] 5 μg cada de citocinas interleucina 1-β (IL1β) e fator de necrose tumoral α (TNFα) foram adicionados (spiked) separadamente em 5% de soro humano e separados por eletroforese usando um gel Bis-Tris a 4 a 12%, transferidos para membrana de PVDF e bloqueados com 1% de BSA em PBS-T. Como um controle uma alameda adjacente à amostra de soro continha ou 5 μg de IL1β ou 5 μg de TNFα isolado.
[001043] IL1β foi detectada usando os peptídeos (b~RQQVVFSMSFVQD (SEQ ID NO: 184) e b~KQQVVFSMSFVQD (SEQ ID NO: 185)). Uma solução de estoque a 10 μΜ dos peptídeos foram preparadas separadamente em DMSO e diluídas no tampão de formulação (10 mM de MES, 100 mM de trehalose, 0,05% de Tween 20, pH 7,4). As membranas foram suavemente agitadas com a formulação de peptídeo a 25°C por 1 h. Depois de quatro enxágues em 10 mM de MES, 0,05% de Tween 20, tampão de pH 7,4, as membranas foram coradas com o reagente de afinidade de biotina SRP conjugado a HRP. Os resultados desta detecção PepBlot são apresentados na Figura 60.
[001044] Para detecção de TNFα os 10 μΜ de peptídeos (b~RGLYLIYSQVLFP (SEQ ID NO: 186), b~RGLYLIYSQVLFH (SEQ ID NO: 187)) foram diluídos (1/40) separadamente em tampão de formulação (10 mM de MES, 100 mM de trehalose, 0,05% de Tween 20, pH 6,5) e suavemente agitados com as membranas a 25 °C por 1 h. Depois de quatro enxágues em 10 mM de MES, 0,05% de Tween 20, pH 6,5 tampão, the membranas foram coradas com o reagente de afinidade de biotina SRP conjugado a HRP. Os dados de PepBlot da detecção de TNFa usando peptídeos interferon foram mostrados na Figura 61.
4.7 Detecção quantitativa de proteínas usando ELISA
[001045] De modo a explorar as aplicações da presente tecnologia em tecnologia de diagnóstico adicionais, foi incorporada a agregação visada de marcadores de proteínas seletivos em plataforma quantitativa semelhante a ELISA. Nesta abordagem a seletividade e a sensibilidade das sondas de peptídeo para detectar marcadores de proteína de interesse foi investigada em meios complexos em placas de microtítulo. Primeiro, foi intitulado β-gal em lisados de E. coli não induzidos e foram capturados os lisados celulares completos sobre uma placa de microtítulo de 96 cavidades. A proteína capturada foi então sondada com um peptídeo de repetição em tandem, b~RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 91) gerado contra β-Gal. (Repetição em tandem significa que n=2 e ambas as porções Y são idênticas (aqui VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76)). Nesta molécula, todas as porções X são um único resíduo R, e o ligante de Z1 é GSGSAPAA (SEQ ID NO: 90)). O conjugado de SRP HRP agiu como o regente secundário e o sinal detectado por ensaio calorimétrico a 450 nm. Esses resultados mostram boa correlação com a concentração de β-Gal nos lisados celulares completos, conforme mostrado na Fig. 62. (Notar que estes dados são similares a detecção da proteína ClpC em um ensaio de dot blot, mostrado no Exemplo 2 (fig. 30))
4.8 Detecção quantitativa de proteínas usando sensor ForteBio Octet
[001046] Como uma abordagem alternativa, foi testada uma situação de ensaio livre de etiqueta, usando a tecnologia de Bio-Layer Interferometry (BLI) (Octet, ForteBio) na qual os peptídeos de sonda de repetição em tandem gerados contra β-Gal e CRP foram imobilizados sobre as sondas sensoras. Os biomarcadores de proteína recombinante (β-gal e CRP) solubilizados em salina tamponada com fosfato, pH 6,8 contendo 0,015% de Tween 20 e 3 mM de EDTA foram titulados nas placas de microcavidades e a interação com o peptídeo alvo foi então lida diretamente usando um instrumento Octet (ForteBio). Pode ser detectada a alta sensibilidade do sensor significa concentração picomolar dos analitos. Estes resultados (mostrados na Fig. 63 e 64 para β-Gal e CRP respectivamente) sugerem que os ensaios à base de peptídeo têm o potencial para realizar detecção quantitativa de biomarcadores, inclusive biomarcadores humanos, em diagnóstico clínico que podem ser prontamente incorporados em uma plataforma de tecnologia existente.
4.9 Microarranjo de peptídeo para detecção de proteínas
[001047] Similar ao revestimento dos interferons sobre as sondas sensoras no Exemplo 4.8, experimentos iniciais mostraram que os peptídeos interferon descritos aqui, neste pedido de patente, podem ser imobilizados de modo covalente sobre uma membrana de celulose e usados para detecção de proteína (ensaio baseado na plataforma PepSpot™ (JPT, GmbH). Isto permite a detecção de múltiplas proteínas simultaneamente (acima de 50 sondas foram usadas juntas; dados não mostrados).
[001048] De modo a avaliar se estes peptídeos também podem ser usados em outros formatos de microarranjo, foi realizado um experimento preliminar para modelar um microarranjo de peptídeo sobre lâminas de vidro usando microarranjos de peptídeo PepStar™ (JPT, GmbH). Peptídeos foram modelados contra dez alvos diferentes; estes peptídeos incluem Hit1, Hit57 (vide o Exemplo 2), peptídeos contra β-Gal, p53, p16, CS (citrato sintse), CRP, PSA, SEGN (Secretagogina), e A2MG (α-2-Macroglobulina). Os peptídeos foram sintetizados e pintados (spotted) (500 μmol) sobre o lado de vidro com 5 tamanhos de pino diferentes: 62,5 μm, 165 μm, 265 μm, 335 μm e 400 μm. Pontos em triplicata (62,5 pm) de biotina foram incluídos no arranjo junto com cada tamanho de pino como marcador.
[001049] Diferentes variações de peptídeos foram testadas: peptídeos flanqueados com resíduos gatekeeper naturais (isto é, fragmentos de proteína curtos contendo a porção Yi), a porção Yi flanqueada por um gatekeeper de Arg em ambos os lados (isto é, n=1, X1=X2=R), e peptídeos tendo uma repetição em tandem com gatekeepers de Arg (isto é, n=2, todas as porções X equivalem a R, Y1=Y2). Além disso, os peptídeos ‘únicos’ - aqueles com somente uma porção de Y - foram ligados à lâmina de vidro usando duas extensões de ligantes diferentes. Cada lâmina de vidro tem 3 repetições dos peptídeos.
[001050] Uma visão geral de todos os peptídeos é dada na Tabela 16. Para os peptídeos flanqueados naturais, o ligante curto consistiu da sequência de GS (seguida por um ou dois resíduos e em seguida a porção Yi). O ligante longo é GSPGSPGS (SEQ ID NO: 188). Para os únicos peptídeos interferon, o ligante curto consiste da sequência GSA (seguida por um resíduo R, o primeiro gatekeeper) e o ligante longo é GSPGSPGSA (SEQ ID NO: 189). Para os peptídeos de repetição em tandem, GA ou GAS foi usado como ligante.
[001051] Amostra de soro de um paciente contendo 317 μg ml-1 de CRP foi diluída até 10% em PBS-T antes de incubação. Uma quantidade de 300 μl de soro a 10% foi pipetada sobre a lâmina e em seguida coberta com uma lamínula (slip) de vidro e incubada por 1 h a 37°C. As lâminasd foram lavadas 3x 10 min em PBS-T e incubadas com diluição a 1:1000 de anticorpo anti-CRP monoclonal de coelho (Abcam) por 1 h seguida por 1:1000 de anticorpo de cabra anti-coelho marcado com DyLight 488 (Thermo). De modo a visualizar os marcadores de biotina, foi incluída uma etapa adicional onde as lâminas foram incubadas com SRP conjugado a DyLight 594. As lâminas foram escaneadas usando um scanner GenePix 4400 (Molecular devices) em canais de 488 nm e 594 nm.
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Os resultados para os peptídeos flanqueados ‘R’ com ligantes longos e os peptídeos em tandem flanqueados ‘R’ são mostrados na Fig. 65.
[001052] Muito embora este seja somente um experimento preliminar, e necessite de otimização adicional, os resultados são estimulantes. Conforme era esperado, os resultados para a menor concentração de CRP são inconclusivos (dados não mostrados). Para a maior concentração de CRP, no entanto, os peptídeos que mostram relativamente a maior proporção de sinal para ruído são os peptídeos interferon único de CRP e os peptídeos de repetição em tandem de CRP. Além disso, estes também são os maiores sinais para cada uma das lâminas de microarranjo, e ambos os sinais têm uma proporção de sinal para ruído de mais de 2,5 .
[001053] O uso da sequência nativa não parece resultar em detecção de CRP eficaz. Sem ser limitado a um mecanismo em particular, isto pode ser no mínimo devido em parte ao fato de que as sequências naturais flanqueando a porção de agregação de CRP contêm uma carga oposta (resíduo E N-terminal negativo, resíduo K C-terminal positivo). Em semelhantes casos, pode ser melhor proporcionar complementação de cargas nos gatekeepers, para evitar repulsão das cargas idênticas e atração pelas cargas opostas (em outras palavras, para evitar que os peptídeos não venham a alinhar adequadamente devido às cargas os empurrando na orientação reversa).
[001054] Acredita-se que otimização adicional (por exemplo, outros ligantes, variação com resíduos gatekeeper, formulação, pré-tratamento de lâmina, cinética, temperatura e outras variáveis do protocolo) venham a produzir ainda melhores resultados, indicando que os peptídeos interferon podem ser usados em formato de microarranjo para detectar múltiplos analitos em amostras complexas tais como soro clínico.
5. Aplicações médicas não infecciosas 5.1 Agregação direcionada de receptores de hormônio do crescimento 5.1.1 Introdução
[001055] A superfamília das tirosina quinases receptoras (RTK) é um alvo chave para o desenvolvimento de fármacos contra o câncer (Zhang et al., Nat Rev Cancer 2009; 9(1):28). As terapias anti-cancerígenas atuais têm por alvo principalmente quinases, tais como membros dos receptores do fator de crescimento epidermal, os quais geralmente também abrigam efeitos anti-angiogênicos também. No entanto, geralmente permanece uma tarefa difícil identificar inibidores para cada uma destas moléculas que são específicas.
[001056] Portanto, visou-se ter por alvo RTKs usando as moléculas descritas aqui, neste pedido de patente. Por triagem de uma série de peptídeos modelados para induzir agregação especificamente, vários novos peptídeos foram identificados direcionados contra EGFR e VEGFR2 que são capazes de inibir sinalização funcional através destes receptores.
[001057] O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma importante proteína de sinalização envolvida, entre outros na angiogênese. Existem três subtipos principais de receptores de VEGF, numerados 1, 2 e 3. Destes, VEGFR-2 (também conhecido como KDR ou Flk-1) parece mediar a maior parte das respostas celulares conhecidas para VEGF. Um dos caminhos ativado depois de ligação de VEGF a VEGFR-2 é o caminho da ERK, levando a fosforilação de Erk1/2. Considerando a importância da angiogênese nos cânceres, diferentes inibidores de VEGFR-2 estão sendo testados atualmente para seu potencial como fármaco anti-cancerígeno (por exemplo, Guo et al., Biochim Biophys Acta. 2010; 1806(1):108-21; Subramanian et al., Clin Lung Cancer. 2010; 11(5):311-9; ramucirumab: Spratlin, Curr Oncol Rep. 2011; 13(2):97-102; vandetanib: Morabito et al., Drugs Today (Barc). 2010; 46(9):683-98). Além disso, compostos anti-VEGFR2 também se mostram promissores no tratamento de degeneração macular relacionada com a idade combatendo a neovascularização coroi- dal (Miao et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006; 345(1):438-45; Takahashi et al., Curr Eye Res. 2008; 33(11):1002-10; Chappelow and Kaiser, Drugs. 2008; 68(8):1029-36).
[001058] O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) é uma tirosina quinase receptora da família ErbB. Quatro membros da família ErbB foram identificados; EGFR (tambérm conhecido como ErbB1, HER1), EGFR2 (ErbB2 ou HER2), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4). A sinalização de EGFR é iniciada por ligação de ligante ao domínio de ligação de ligante extracelular. A ligação da proteína a um ligante induz dimerização de receptor e autofosforilação de tirosina e leva a proliferação celular. Mutações neste gene estão associadas com câncer pulmonar, e foi demonstrado que a amplificação ou hiper-expressão deste gene tem um papel importante na patogênese e na progressão de determinados tipos agressivos de câncer de mama. Nos últimos anos evoluiu se tornando um importante biomarcador e alvo para terapia para a doença. Por exemplo, EGFR2 é o alvo do anticorpo monoclonal trastuzumab (comercializado como Herceptin).
[001059] Peptídeos de agregação contra estes receptores foram modelados conforme já elaborado aqui, neste pedido de patente. Consistem de duas sequências de agregação de núcleo (as porções Yi tomadas do núcleo de agregação da sequência de proteína), flanqueadas ou por resíduos gatekeeper D- ou por resíduos gatekeeper R- (as porções numeradas X). Na maioria dos casos, as porções Yi são idênticas (peptídeos ‘de repetição em tandem’), mas em algusn, as porções Yi correspondem a dois domínios de agregação diferentes no receptor. Para estas moléculas onde n=2, a porção Z1 é um ligante rico em prolina que assegura que ambos os domínios de núcleo estejam disponíveis para agregação.
5.1.2 Direcionamento de VEGFR2 com peptídeos interferon
[001060] Diferentes peptídeos interferon foram modelados com base na ocorrêncoa de regiões propensas a agregação na proteína VEGFR2 murina (em peptídeo de sinal, região extracelular, região transmembrana ou região citoplasmática). Para testar a capacidade dos peptídeos para interferir com a sinalização de VEGFR depois de ligação de ligante, foi realizado o seguinte ensaio. Primeiro, o mVEGFR2 foi hirerexpressado em células HEK293 através de transfecção de FuGENE. Células HEK293 são destituídas de VEGFR2 endógeno. As células foram cultivadas por um dia e em seguida privadas de alimento de um dia para o outro em presença de 10 ou 20 μΜ de peptídeo (ou veículo de controle) em DMSO. Em seguida, as células foram estimuladas com 25 ng/ml de VEGF por 5 min em meio de privação / peptídeo e foi analisada a sinalização a jusante através da cascata de fosforilação de MAP quinase estudando tanto a fosforilação de ERK1/2 quanto os níveis totais de ERK1/2. Isto foi avaliado usando ou western blot ou um ELISA mais quantitativo.
[001061] Um arranjo de peptídeos foi modelado, e sintetizado por JPT GmbH em escala nanomolar. Os peptídeos tiveram por alvo várias zonas de agregação em VEGFR2 de camundongo. As exacas sequências dos peptídeos são mostradas na tabela 17. Cada peptídeo DMSO em uma concentração de 5 mM, e, depois de uso, mantido congelado a -20°C.
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[001062] Ensaios foram primeiro realizados com peptídeos sintetizados em microescala, a qual produziu dois peptídeos que reduziram significativamente (isto é, mais de 75%) a fosforilação de ERK1/2 depois de tratamento (resultados de 3 experimentos independentes, dados não mostrados). Estes peptídeos apresentando repetidamente o maior efeito sobre a fosforilação de ERK foram reordenados como peptídeos de alta pureza e retestados no mesmo ensaio. Para comparar diferentes protocolos de extrapolação, os peptídeos foram obtidos a partir de duas fontes: JPT GmbH, Berlim e o laboratório do Professor Kris Gevaert (University Gent). Os resultados de 2 destes peptídeos de alta pureza são mostrados na Fig. 66.
[001063] Cada uma das produções de peptídeos se revelou igualmente potente. O peptídeo B8 tem a sequência DLAVALWFDPPDLA-VALWFD (SEQ ID NO: 241), o peptídeo B12 tem a sequência DMISYAGMDPPDMISYAGMD (SEQ ID NO: 249). A estrutura destas moléculas corresponde à fórmula esboçada no pedido onde n é dois, X1 a X4 é 1 aminoácido (isto é, D) Y1 é 7 aminoácidos e é idêntico a Y2, Z1 é um ligante de dois aminoácidos (isto é, PP), e Z2 está ausente. As porções Y de B8 (LAVALWF (SEQ ID NO: 278)) correspondem a parte da sequência do peptídeo de sinal previsto de VEGFR2, as porções Y de B12 (MISYAGM (SEQ ID NO: 279)) são idênticas a parte da sequência extracelular de VEGFR2. Notar que ambas estas sequências de 7 aminoácidos são unicamente codificadas no genoma de camundongo, isto é, estes trechos de 7 aminoácidos contíguos são somente encontrados no mVEGFR2 e não em outras proteínas de camundongo. Sem ser liimitado a uma mecanismo em particular, como o peptídeo B8 tem por alvo o peptídeo de sinal, é mais provável que ocorra inibição depois de translação da proteína VEGFR2 (isto é, antes do peptídeo de sinal ser clivado), indicando que este peptídeo é internalizado pela célula.
[001064] Conforme mostrado na Fig. 66A, ambos os peptídeos abolem quase completamente a fosforilação de ERK1/2, apesar de não interferindo com os níveis totais de ERK1/2. Este efeito já é observado com 5 μΜ de peptídeo. Se a proporção de ERK fosforilada for plotada contra a ERK total presente, pode ser visto que o acréscimo das moléculas de interferon abole quase completamente sinalização, induzida por ligante, de VEGFR-2: a proporção é na faixa das células não estimuladas e muito menor do que as que foram estimuladas com a mesma quantidade de VEGF mas sem peptídeos interferon (Fig. 66B).
[001065] Para avaliar a especificidade dos peptídeos identificados, uma série de peptídeos foi modelada com base na sequência dos peptídeos B8 ou B12, mas contendo mutações adicionais com resíduos prolina nas regiões de agregação do núcleo. O uso destes peptídeos ‘inativados’ não mostrou nenhuma redução significativa na fosforilação de ERK1/2 (dados não mostrados).
[001066] Como uma etapa seguinte, para testar a especificidade do peptídeos VEGFR2, foi testada sua reatividade cruzada com a família do EGFR. Portanto, células HeLa foram tratadas com peptídeo B8 e B12 e subsequentemente estimuladas com EGF (25 ng/ml). Nesta configuração, B8 e B12 não inibem a fosforilação de ERK1/2, indicando que estes peptídeos (i) são específicos para VEGFR2 e (ii) não afetam a atividade celular geral ou a cascata ERK1/2 diretamente uma vez que EGFR2 e VEGFR2 usam cascatas de sinalização quase idênticas (Figura 67)
[001067] De modo a melhor entender o mecanismo celular da inibição de peptídeo, foi realizado um experimento preliminar no qual as células foram coradas com um anticorpo anti-VEGFR2 para rastrear a localização celular. Conforme pode ser visto na Fig. 68, em células tratadas com controle, VEGFR2 estava principalmente presentes sobre a membrana celular de células HEK293. No entanto, depois de trata- mento das células de um dia para o outro com 10 μΜ de peptídeo B8, as moléculas de VEGFR2 não estavam mais presentes sobre a superfície celular, porém presentes em vesículas intracelulares o mais provavelmente contendo VEGFR2 agregado.
[001068] Portanto, conforme estes experimentos mostram, peptídeos interferon podem ser usados para ter por alvo e inibir especificamente a função de uma única proteína (a este respeito, notar que a sequência LAVALWF (SEQ ID NO: 278) de B8 não é codificada no genoma humano (e portanto não está presente em células HEK293), e a sequência MISYAGM (SEQ ID NO: 279) de B12 é única para o VEGFR2 em humanos (mas normalmente não expressada em células HEK293)). Dado o papel estabelecido de VEGFR-2 em câncer e na patologia da degeneração macular relacionada com a idade e os estudos clínicos focalizados sobre a inibição de VEGFR-2, peptídeos como os descritos aqui têm alto potencial no tratamento destas doenças. Como a sequência (de camundongo) usada para o peptídeo B12 também está presente no VEGFR-2 humano, espera-se que este peptídeo venha a apresentar reatividade cruzada e possa ser usado para terapia humana.
5.1.2.1 Inibição de VEGFR2 em um modelo de neovascularização co-roidal (CNV)
[001069] A neovascularização coroidal (CNV) é uma das graves consequências patológicas do estágio final da degeneração macular relacionada com a idade (AMD). Várias linhas de evidência implicam níveis aumentados de sinalização de VEGF nas retinas de pacientes com degeneração macular relacionada com a idade, e foi demonstrado que a inibição de VEGFR2 inibe a neovascularização em um modelo de neovascularização coroidal. Para testar se os peptídeos interferon direcionados contra VEGFR2 podem inibir a função de VEGFR2 in vivo, estes foram avaliados em um modelo murino de neovascularização (isto é, neovascularização coroidal induzida por laser). Este model foi descrito anteriormente (Lambert et al., FASEB Journal;15:1021-1027, 2001).
[001070] Em resumo, a configuração experimental foi como se segue:
[001071] 3 queimaduras a laser foram administradas no dia 1 no olho direito de camundongos C57/Bl6. No dia 1 e no dia 3, 1 μl de ou DMSO (controle negativo), ou B8-FITC ou B12-FITC (os peptídeos interferon marcados com isotiocianato de fluoresceína) ou DC101 (um mAb anti-VEGFR-2, Fischer et al., Cell, 131: 463-475, 2007). Os peptídeos interferon foram proporcionados como uma solução a 5 mM em DMSO, sonicados antes de injeção. No dia 5, os olhos foram perfundi-dos com TRITC-dextrano, os camundongos foram sacrificados huma-nitariamente e dissecados, seguido por montagem plana da retina. Foram tiradas fotografias e foi determinada a % de vasos sobre a área total da lesão. Os resultados são mostrados na Fig. 69
[001072] Conforme pode ser visto a partir da figura, existe uma clara diminuição da neovascularização depois de tratamento com interferons. O efeito ainda não é tão grande quanto o de DC101, mas este é um anticorpo muito bem caracterizado, ao passo que os peptídeos ainda não foram otimizados. O experimento será repetido durante um curso de tempo de 14 dias, possivelmente com administração repetida, uma vez que isto permitirá melhor discriminação entre neovascularização real e resposta de inflamação.
5.1.3 Direcionamento de EGFR2 com peptídeos interferon
[001073] Os peptídeos EGFR2 são modelados para ter por alvo o receptor EGFR2 humano. Portanto, para estes ensaios, células HeLa foram usadas inicialmente, uma vez que estas células expressam endogenamente EGFR1 e EGFR2. Depois de estimulação com EGF (25 ng/ml), também é induzida a fosforilação de ERK1/2, de modo que os mesmos ensaios podem ser usados conforme descrito para VEGFR2.
[001074] Como para VEGFR2, um arranjo de peptídeos foi modelado e sintetizado por JPT em escala nanomolar, cada um tendo por alvo várias zonas de agregação em EGFR2 humano (ErbB2 ou HER2). As exatas sequências dos peptídeos são mostradas na tabela 18. Cada peptídeo foi dissolvido em DMSO em uma concentração de 5 mM, e, depois de uso, mentido congelado a -20°C.
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[001075] Para EGFR2, foi realizada uma triagem similar à para VEGFR2. No entanto, ao invés de usar o método de Western Blot que dispende tempo, foi usado um protocolo de ELISA que pode detectar tanto fosfo- quanto total ERK1/2. Foram identificados 3 peptídeos que reduziram significativamente e repetidamente a sinalização de EGF: RWGLLLALRPPRWGLLLALR(SEQ ID NO: 93) (designado A5, tendo por alvo peptídeo de sinalização), RTGYLYISRPPRTGYLYISR (SEQ ID NO: 94) (designado A11, tendo por alvo o domínio extracelular) e RIISAVVGRPPRIISAVVGR (SEQ ID NO: 95) (designado A12, tendo por alvo domínio transmembrana). Os resultados são mostrados na Fig. 70
[001076] O efeito inibidor é significativo, muito embora a inibição seja incompleta. Isto é devido provavelmente à expressão de outros EG-FRs em células HeLa (Masui et al., Cancer Res. 1984;44(3):1002-7), as quais também sinalizam através de fosforilação de ERK e não são visadas pelos presentes peptídeos.
5.2 Aplicações anti-inflamatórias
[001077] O caminho do fator nuclear (NF)-kappaB tem um papel im- portante na imunidade e a atividade inadequada do caminho do NF-kappaB tem sido ligada a muitas doenças autoimunes e inflamatórias. Múltiplos mecanismos normalmente asseguram a adequada terminação da ativação do caminho do NF-kB. Neste contexto, a proteína de edição de ubiquitina intracelular A20 (também conhecida como Proteína 3 Induzida pelo Fator de Necrose Tumoral Alfa ou TNFAIP3) é uma peça fundamental na regulação do feedback negativo da sinalização de NF-kappaB em resposta a múltiplos estímulos.
[001078] De modo a avaliar o potencial de interferons na modulação de respostas imunes, decidiu-se inibir proteínas envolvidas no caminho do NF-kB (por exemplo, A20) usando peptídeos de interferon.
[001079] Uma vez que A20 regula apoptose induzida pelo fator de necrose tumoral (TNF) e recentes estudos genéticos demonstram uma nítida associação entre várias mutações no locus A20 humano e imu-nopatologias tais como doença de Crohn, artrite reumatoide, lupus eritematoso sistêmico, psoríase e diabetes tipo 1 (Vereecke et al., Trends Immunol.; 30(8):383-9, 2009), esta proteína foi escolhida para uma primeira ensaio de princípio na modulação do caminho do NF-kB.
[001080] Para este fim, foi determinada a cinética da indução de A20 em resposta ao TNF-α. Células A549 (uma linhagem de células epiteliais basais alveolares de humanas de adenocarcinoma) foram estimuladas com 1000 IU/ml de TNF humano. Em 0, 1,3, 6 e 8 horas depois de estimulação, o sobrenadante foi verificado para presença de IL-8 usando um ELISA, e para presença de IL-6 usando um bio-ensaio (a expressão de IL-8 e a expressão de IL-6 são respostas induzidas por NF-kB depois de estimulação com TNF). Ao mesmo tempo, as células foram lisadas e A20 foi detectado nos lisados usando Western blot.
[001081] IL-6 foi avaliado com base na resposta proliferativa de células 7TD1 (Beyaert, Schulze-Osthoff, Van Roy and Fiers, Cytokine 1991). Em resumo, células A549 são tratadas pelos tempos indicados com TNF, o sobrenadante é tirado e usado para tratar as células 7TD1, as quais são dependentes de IL-6 para proliferação. Como um padrão, é usada uma quantidade conhecida de IL-6 recombinante; comparando a proliferação pode-se extrapolar as quantidades de IL-6.
[001082] Os resultados são mostrados na Fig. 71 .
[001083] A indução de IL-8 atinge um pico 6 horas depois da estimulação, ocasião na qual IL-também é nitidamente induzido. Portanto, de modo a testar a atividade de interferons A20 sobre a expressão de A20 e a sinalização de NF-kB, células A549 foram pré-incubadas por 20 horas com 20 μΜ de interferons A20 (dissolvidos em DMSO, diluído em meio livre de soro de modo a conter somente 2% de DMSO). Depois de 6 horas de estimulação com 1000 IU/ml de TNF, foram realizados os mesmos ELISA de IL-8, bio-ensaio de IL-6 e WB de A20.
[001084] Todos os peptídeos testados tiveram a mesma fórmula geral X1-Y-X2-Z1-X3-Y2-X4 (isto é, n=2 sem nenhum ligante externo), em que as porções X são resíduos R únicos. Peptídeos são mostrados na tabela 19.
Figure img0031
[001085] Resultados do ensaio ELISA (2 experimentos independentes) são mostrados na Fig. 72. Conforme pode ser visto a partir da figura, quase todos os interferons tiveram êxito em aumentar significativamente os níveis de IL-8 depois de estimulação com TNF, uma medida para atividade de sinalização de NF-kB. Como A20 é uma proteína citoplasmático, os peptídeos interferon precisam penerar nas células para serem capazes de inibir o caminho. Resultados similares, porém menos acentuados, foram obtidos ao testar os mesmos interferons onde as porções X foram todas um único resíduo D (não mostrado). Western blots mostram uma diminuiçlão dos níveis de proteína A20, mas esta foi difícil de quantificar e precisa de otimização adicional (dados não mostrados). Os resultados de um bio-ensaio de IL-6 representativo são mostrados na Fig. 73, e estes são muito similares aos resultados obtidos com o ensaio de IL-8.
[001086] Estes resultados mostram a viabilidade de influenciar a res- posta imune regulada pelo caminho NF-kB. Em uma etapa seguinte, peptídeos modelados contra TNF serão usados para avaliar a inibição de sinais induzidos por TNF. Exemplos de peptídeos interferon que serão testados ão RGLYLIYSQVLFDPPRGLYLIYSQVLFD (SEQ ID NO: 317), RGLYLIYSQVLFRPPRGLYLIYSQVLFR (SEQ ID NO: 318), RGLYLIYSQVLFPPPRGLYLIYSQVLFP (SEQ ID NO: 319) e RGLYLIYSQVLFHPPRGLYLIYSQVLFH (SEQ ID NO: 320).
6. Aplicação em plantas 6.1 Introdução
[001087] De modo a testar a tecnologia de interferência de proteína in planta, foi selecionado um elemento citosólico do caminho de sinalização dos brassinosteroides (BR). BR são hormônios esteroidal que afetam muitos processos celulares envolvidos em crescimento de órgãos e desenvolvimento das plantas incluindo diferenciação vascular, senescência, fertilidade masculina, floração, fotomorfogênese, tolerân- cia a estresses bióticos e abióticos (Bajguz e Hayat (2009) Plant Physiol. Biochem 47(1): 1-8). Também agem sobre características agronomicamente interessantes em cultivo de plantas como número de rebentos de plantas, tamanho da folha, e ângulo da folha (Morinake Y et al (2006) Plant Physiol 141(3): 924-31.. Como um exemplo, a expressão tecido-específica das esterol C-22 hidroxilases, uma enzima que controla os níveis hormonais de BR, pode aumentar o preenchimento dos grãos em arroz (Wu CY et al (2008) Plant Cell 20(8): 213045).
[001088] Em Arabidopsis BR são percebidos pelas quinases receptor-like (RLK) de repetição rica em leucina (LRR) da membrana plasmática BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 (BRI1) as quais se tornam ativadas depois de ligação de BR e associam com BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1) induzindo eventos de transfosforilação sequencial por meio dos quais o BRI1 totalmente ativado pode fosforilar adicionalmente BR-SIGNALING KINASES (BSKs). Então os BSKs fosforilados são liberados pelo complexo de receptor e ligam aos fosfatos de BRI1 SUPPRESSOR 1 (BSU1), presumivelmente reforçando sua atividade. BSU1 ativado inibe Brassinosteroid Insensitive 2 (BIN2) e outras quinases pertencentes à família da glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) por desfosforilação de seu resíduo fosfo-tirosina . BIN2 não fosforilado permite a acumulação dos fatores de transcrição BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1) e BZR2/bri1-EMS-SUPPRESSOR1 (BZR2/BES1) não fosforilados ativos no núcleo. BZR1 ativo e BZR2/BES1 ligam a DNA genômico para regular a expressão genética alvo de BR, deste modo modulando o crescimento e o desenvolvimento das plantas.
[001089] Neste caminho um bom alvo putativo foi identificado no regulador negativo de BR BIN2 uma vez que espera-se que, interferindo com este, usando a tecnologia de interferência de proteína, resultaria em alterações fenotípicas agronomicamente interessantes. Para este fim a eficiência de nocaute da agregação de proteínas foi correlacionada com as alterações fenotípicas observadas por classificação de parâmetros de crescimento como formato da folha e altura da planta. Estes parâmetros têm importantes efeitos agronômicos sobre a produção da safra uma vez que foi demonstrado em arroz mutantes de sinalização de brassinosteroide de nocaute os quais têm maiores produções em condições de plantio denso.
[001090] No presente estudo são tratadas duas principais questões biológicas; primeiro se é possível visualizar e avaliar o fenômeno de β-agregação em plantas, e em seguida se o direcionamento de uma proteína específica de interesse por iscas de agregação é realizável proporcionando seu nocaute funcional.
6.2. Esquema de constructos expressando interferon BIN2
[001091] A quinase GSK3-like BIN2 foi selecioanda como um alvo vegetal adequado devido a sua localização citosólica e nuclear que pode permitir um direcionamento pelos peptídeos de agregação expressados (isto é, peptídeos interferon). Foram identificados dois trechos aminoacídicos na sequência de aminoácido primária BIN2 (vide a Fig. 74a) com o algoritmo TANGO. O algoritmo prevei que estas duas sequências de aminoácidos propensas a beta-agregação têm uma propensão para agregar maior do que 50%. Estes peptídeos interferon, os quais também são adicionalmente designados aqui, neste pedido de patente, como iscas (baits), cobrem as regiões BIN2 de 44-55aa (bait44) e no domínio quinase de 249-257aa (bait249). Por razões experimentais decidiu-se focalizar esse estudo na bait249. De modo a induzir agregação de BIN2, vários constructos em que bait249 foi fundido C-terminalmente a proteína fluorescente eGFP foram produzidos em vetores de expressão binária em plantas. Estes constructos expressando bait249 foram produzidos com e sem aminoácidos carregados positivamente (aqui, neste pedido de patente, designados como gatekeepers); o constructo compreendendo gatekeepers foi designado como "bait249R" e o constructo sem estes gatekeepers foi designado como "bait249". O último constructo foi produzido para avaliar a função dos resíduos gatekeeper no reforço da localização citosólica da isca expressada. Além disso, uma sequência sintética conhecida para reforçar o processo de agregação (aqui, neste pedido de patente, designada como reforçador) foi inserida entre a isca e a eGFP através de uma sequência de ligante (as sequências específicas são representadas na Fig. 74b). Portanto, o constructo "bait249R" corresponde a uma molécula de interferon em que n=1, isto é, da fórmula X1-Y1-X2-Z1, fundida a porções adicionais. Tanto X1 quanto X2 são R, Y1 é a sequência QLVEIIKVL (SEQ ID NO: 321), Z1 é um ligante de aminoácidos com a sequência KPAGAAKPGAAG (SEQ ID NO: 112), e as porções adicionais são uma sequência de reforço de agregação e é uma porção GFP para detecção.
[001092] De modo a avaliar quais catacterísticas bioquímicas dos peptídeos de agregação foram mais ótimas para obter a formação de agregados e direcionamento específico, diferentes variantes do bait249 também foram produzidos adicionalmente. Foram produzidos dois constructos expressando o bait249, flanqueados por 5-7aa flanqueando naturalmente a sequência de isca na proteína BIN2, inseridos ou em cópia única (designada como bait249NF) ou em repetição em tandem (designada como bait249NF_Tand). Neste segundo grupo de vetores não foi inserido reforçador de agregação (vide a Fig. 74c). Nestes casos, parte dos resíduos flanqueantes naturais agem como gatekeepers. Portanto, bait249NF corresponde a uma molécula de interferon em que n=1, isto é, da fórmula X1-Y1-X2-Z1, em que X1 é D (o último aminoácido da sequência ENAVD flanqueante (SEQ ID NO: 322)), X2 é G (o primeiro aminoácido da sequência GTPTREE flanque- ante (SEQ ID NO: 323)), Y1 é a sequência QLVEIIKVL (SEQ ID NO: 321), Z1 é um ligante de aminoácidos com a sequência AGSPKGA-PAAKGSGA (SEQ ID NO: 324), e a molécula é fundida a uma porção GFP para detecção através do ligante de Z1. Bait249NF_Tand é construído a partir de 2 unidades de bait249NF (isto é, n=2, ou X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 com X1=X3, X2=X4, Y1 =Y2, Z1=Z2 e fusão à porção GFP através do ligante de Z2).
6.3. Visualização de agregação de bait249 por expressão transitória em folhas de N. benthamiana
[001093] As capacidade das diferentes iscas para induzir a formação de agregados em plantas foi inicialmente verificada com o microscópio de varredura a laser confocal (CLSM, Confocal Laser Scanning Microscope) em um sistema de expressão transitória hiperexpressando as iscas através de infiltração mediada por Agrobacterium tumefaciens em folhas de Nicotiana benthamiana. Foi observado que a ausência de gatekeepers no vetor de bait249 induziu fortemente a formação de corpos de inclusão insolúveis ao invés de expressão citosólica (conforme ensaiomunhado na Fig. 75a). Ao contrário a bait249R induziu uma agregação perinuclear citosólica muito forte conforme nitidamente demonstrado comparando o efeito com o padrão de localização de GFP livre (vide a Fig. 75b,e). O sinal detectado foi mais uniforme do que para bait249 e não foram identificados corpos de inclusão, indicando a importância dos resíduos gatekeeper. O segundo grupo de constructos usados neste estudo mostrou uma nítida presença de agregados perinucleares em ambas as versões, em que o constructo expressando a isca em repetições em tandem (bait249NF_Tand) foi o constructo de agregação mais forte conforme observado com o CLSM (vide a Fig. 75c,d). Nestes constructos parece que os aminoácidos extra flanqueantes (incluindo gatekeepers), adicionados às sequências de isca, têm um papel importante para obter a agregação citosólica.
6.4. Bait259 co-localiza e interage fisicamente com a proteina-alvo BIN2 em células de N. benthamiana
[001094] Um ensaio de co-localização transitória em folhas de N. benthamiana de BIN2 e bait249 foi realizado para ter uma rápida indicação do direcionamento da isca e da tendência de co-agregação para seu alvo. Além disso, as folhas foram co-injetadas com cepas de A. tumefaciens expressando a versão de agregação mais forte de bait249 conforme observado no nível de CLSM, isto é, bait249NF_Tand fundida a uma proteína fluorescente RFP e proteína BIN2 fundida a eGFP. A expressão do bait249NF_Tand foi induzida 24 horas antes da avaliação por microscopia de fluorescência subsequente. Análise por CLSM das folhas 4 a 5 dias depois de injeção mostrou uma clara colocalização entre a isca e o alvo evidenceada tanto por sobreposição dos padrões de expressão quanto pelos coeficientes de Mander de colocalização calculados com valores maiores do que 0,8. A formação de agregados citosólicos de co-localização também foi avaliada em microscopia por fluorescência (vide a Fig. 76).
[001095] Em uma etapa seguinte, depois de confirmação por CLSM de co-localização e agregação de proteínas entre as proteínas de bait-GFP e o alvo BIN2, sua interação física estável em um sistema de expressão transitório também foi avaliada por experimentos de co-imunoprecipitação (co-IP). De modo a contornar a falta de um anticorpo contra BIN2 específico, a proteína-alvo foi fundida N-terminalmente a uma etiqueta de imunológica de hemaglutinina (HA). Folhas de N. benthamiana foram então co-injetadas com cepas de Agrobacterium transformadas com diferentes vetores expressando bait249-GFP e o BIN2-HA foi expressa\do sob controle do promotor 35S. Tanto o bait249 com e sem gatekeepers (e com reforçador de agregação) quanto o bait249 em repetições únicas e em tandem (sem reforçador) foram testados. O experimento de co-IP foi realizado por derrubada (pull down) das iscas com etiqueta de GFP por contas acopladas a agarose anti-GFP e detecção por Western blot subsequente foi realizada com um anticorpo monoclonal anti-HA. Controles negativos diferentes foram usados: i) para testar ligação inespecífica de GFP às contas, um vetor codificando GFP livre foi co-injetado com BIN2HA; ii) para testar ligação inespecífica do reforçador sintético às contas, um vetor codificando somente o reforçador e a sequência de ligante fundida a GFP foi produzido e co-injetado com BIN2-HA, iii) para testar ligação inespecífica quer da proteína BIN2 ou da etiqueta de HA às contas, o constructo BIN2-HA foi injetado isolado; e iv) também um extrato de planta selvagem foi usado como controle negativo adicional. O experimento de co-IP indicou uma interação positiva para qualquer versão do bait249 testado com BIN2 deste modo demonstrando fortemente que a isca e o alvo podem interagir através da formação de uma interação bioquímica específica, isto é, uma agregação mediada por cross-β-sheet (vide a Fig. 77). Estes resultado confirmou o que foi observado nas ensaios de co-localização deste modo produzindo ensaio de conceito de que uma interação física entre os dois parceiros ocorre em um sistema in vivo.
6.5. A avaliação da eficiência de agregação de proteínas em plantas transgênicas de Arabidopsis
[001096] Depois de transformação dos vários constructos expressando bait249 marcados com GFP a eficiência de agregação também foi monitorada em plantas transgênicas de Arabidopsis.
[001097] A avaliação dos complexos agregadores induzidos foi avaliada por estudo por imagens da proteína fluorescente GFP no microscópio CLSM em cada linhagem homozigótica.
[001098] Foi observado que as linhagens expressando 35S::bait249R-GFP e as linhagens expressando 35S::bait249NF_Tand-GFP apresentaram o mais forte padrão de expressão de GFP subcelular com uma nítida agregação perinuclear em tecidos de plântulas diferentes (cotilédones, petíolos, hipocótilos, e raiz) (vide a Fig. 78a-d, e-h).
[001099] Em contraste, para as plantas de Arabidopsis compreendendo o constructo 35S::bait249-GFP, a ausência de gatekeepers prejudicou a expressão de quaisquer agregados citosolicamente localizados em células de Arabidopsis levando a uma expressão mais fraca da proteína reporter e à formação de corpos insolúveis de formato redondo nas células, conforme também foi observado em folhas de Nicotia-na transformadas transitoriamente. O padrão de expressão de 35S::bait249NF-GFP foi mais fraco do que para a isca em tandem (vide a Fig. 79a-h). Pelas razões mencionadas acima os constructos 35S::bait249-GFP e 35S::bait249NF-GFP não foram considerados para análises funcionais adicionais.
[001100] De modo a investigar no nível subcelular o padrão de localização de 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP em células de Arabidopsis, foi realizada Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) sobre plântulas de 8 dias depois da semeadura (D.A.S.) expressando de modo estável estes constructos. O padrão de localização de isca-GFP citosólica das linhagens selecionadas para análises adicionai foi confirmado por experimentos de marcação com immunogold. Nesta abordagem, a marcação dos hipocótilos e de células da raiz na linhagem 35S::bait249R-GFP com um anticorpo anti-GFP resultou em localização subcelular específica da isca essencialmente no citosol de células pertencentes à área de alongamento da raiz. As proteínas de agregação pareceram ser arranjadas tanto em estruturas fibrilares quanto em aglomerações apinhadas indicando que os agregados podem adquirir diferentes formatos nas células (Fig. 80a-c). Pilhas de Golgi foram livres de partículas de ouro (vide a Fig. 80c) que ao inve'se pareceram ser mais abundantes em estruturas semelhantes a membrana (isto é, o ER) (Fig. 80b). A presença de pro- teína bait249RGFP citosólica livre também foi encontrada raramente. Para 35S::bait249NF_Tand-GFP foi observada uma localização massiva citosólica e perinuclear em células em pali'cada nos cotilédones e em células da área de alongamento da raiz e não foram detectados formatos peculiares de complexos agregadores (Fig. 80d-e).
[001101] A confirmação bioquímica dos níveis de proteínas agrega-doras foi avaliada para cada linhagem transformada de Arabidopsis por eletroforese Native-PAGE e análise por Western blot subsequente com um anticorpo monoclonal anti-GFP (vide a Fig. 81a).
[001102] A natureza bioquímica dos agregados foi em seguida adicionalmente analisada por Espectroscopia em Infra Vermelho por Trans-formad de Fourier (FT-IR) depois de sua imunoprecipitação (IP) com anticorpo anti-GFP. Os espectros de FT-IR mostraram claramente dois picos em absorvância em valores de 1616 e 1680 λ indicando um alto teor de agregados de β-sheets nas linhagens 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249-GFP, além de seu padrão de localização subcelular diferente (vide a Fig. 81b). Para as linhagens 35S::bait249NF-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP foi detectado um aumento ligeiramente maior nos valores de absorção de 1616 e 1680 indicando um teor de β-sheet no material imunoprecipitado, embora em uma menor extensão do que para as linhagens analisadas previamente (Fig. 81c).
6.5.1 Fenótipo de plantas transgênicas de Arabidopsis
[001103] As linhagens homozigóticas expressando bait249 foram então adicionalmente analisadas tanto in vitro quanto em solo para o aparecimento de fenótipos mostrando que estava ocorrendo um knock-down em BIN2. As plântulas transgênicas 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP, cultivadas verticalmente por 8 dias in vitro, tiveram raízes e hipocótilos mais longos do que a linhagem não transformada Col-0; esta observação também foi confirmada por quantificação com o software ImageJ (Fig. 82a). A avaliação estatística realiza- da indicou uma significância estatística entre as linhagens Col-0 e transgênicas. Plantas transgênicas de um mês de idade cultivadas em solo também resultaram em indivíduos maiores com respeito a Col-0 (Fig. 82a). As plântulas transgênicas 35S::bait249-GFP e 35S::bait249NF-GFP não apresentaram qualquer diferença fenotípica com Col-0 nem in vitro nem em condições de solo e não foram incluídas na análise adicional.
[001104] Em uma etapa seguinte, de modo a proporcionar evidência adicional de que a função de BIN2 é afetada por sua agregação específica, as linhagens 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF-GFP foram examinadas para resistência ao inibidor da síntese de brassinosteroi-de, brassinazol (BRZ). Como um controle positivo, foi usado o triplo mutante de nocaute em BIN2 e seus dois homólogos próximos (atsk22 e atsk23) (Vert G and Chory J (2006) Nature 441 (7089): 96-100). Esperou-se que se a função de BIN2 tivesse sido afetada, resultaria em plantas sendo no mínimo parcialmente resistentes a brassinazol (observar que o triplo mutante (Vert G and Chory J (2006) Nature 441 (7089): 96-100) é resistente a brassinazol. Na verdade pode-se demonstrar que as linhagens transgênicas apresentaram uma resistência parcial ao inibidor brassinazol, conforme quantificado em termos de extensão dos hipocótilos (vide a Fig. 82b).
6.5.2 Alterações da expressão genética em plantas transgênicas de Arabidopsis
[001105] Em uma análise de PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) sobre a expressão genética relacionada com BRs de DWF4 e CPD, foi demonstrado um nível de expressão reduzido de DWF4 nas duas linhagens de agregadores. No caso da expressão genética de CPD, somente foi observado um efeito para 35S:bait249NF_Tand:GFP, indicando uma inibição de feedback, e portanto uma sinalização de BRs ativada (vide a Fig. 83a). Por conseguinte, a análise dos níveis de expres- são relativos deum fator de transcrição responsivo a BR da família NAC apresentou uma expressão ligeiramente aumentada para o constructo 35S:bait249NF_Tand:GFP (vide a Fig. 83a).
[001106] Além de genes relacionados com BR, também foi monitorado o efeito da expressão de 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP em linhagens transgênicas de Arabidopsis na indução da expressão de proteínas chaperones. De modo interessante, as duas linhagens agregadoras, mas em particular a planta transgênica expressando o bait249 em repetições em tandem (35S::bait249NF_Tand-GFP) apresentaram maiores níveis de expressão (induzida) dos genes HSP70, HSP90-1, HSP101, HSC70-1, HSC70-2 e HSC70-3 (vide a Fig. 83b).
6.5.3 Avaliação morfológica de plantas transgênicas de Arabidopsis
[001107] Além de uma avaliação morfológica no nível de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das linhagens transgênico foi realizada para monitorar um possível efeito citotóxico dos constructos agregadores no nível subcelular. Com esta abordagem não pode ser observada alteração peculiar no tamanho e formatos de células e organelas subcelulares em diferentes tecidos da linhagem 35S::bait249R-GFP (vide a Fig. 84). Ocasionalmente uma maior quantidade de plas-toglóbulos foi encontrada em cloroplastos da linhagem transgênica. O último fenômeno é geralmente uma indicação de stress o qual no presente caso também pode ser causado pelas condições de crescimento in vitro sobre malhas de nylon. Também foi realizada avaliação por TEM sobre a linhagem homozigótica expressando o bait249 em repetições em tandem sem reforço de agregação.
[001108] De modo a avaliar a co-localização da proteína-alvo e da isca em linhagens de Arabidopsis transformadas de modo estável, Tem-se por objetivo visualizar a co-localização entre 35S::BIN2-GFP com a variante agregadora fortemente expressada bait249NF_Tand fundida a proteína fluorescente tagRFP expressada sob um promotor indutível (pMDC::bait249NF_Tand-RFP). Para este fim a melhor linhagem expressando 35S::BIN2-GFP foi super-transformada com o constructo pMDC::bait249NF_Tand-RFP indutível por estradiol. As ensaios de co-localização foram realizadas sobre os transformantes primários depois de 24 horas de indução de bait249NF_Tand e em seguida analisadas por CLSM. A análise confocal de plântulas de 8 D.A.S. transformadas apresentou uma nítida sobreposição do padrão de localização da isca e do alvo (vide a Fig. 85). A intensidade da co-localização observada também foi quantificada com um software ad hoc (ImageJ MBF) o qual liberou coeficientes de Mander próximos a 1 para todas as imagens processadas, significando que ocorreu uma alta colocalização entre a isca e a proteína-alvo.
[001109] Como para as alterações morfológicas, de modo interessante, um experimento preliminar mostrou que a expressão do constructo em tandem bait249 resgata o fenótipo do mutante bri1-5. Espera-se que a redução da expressão de BIN2 resgate o fenótipo mutante bri 1 -5 (Li and Nam, Science 295:1299-1301,2002).
6.6 Materiais e Métodos para os exemplos de plantas 6.6.1. Clonagem de agregador de bait259 em vetores Gateway compatíveis com plantas
[001110] Usando a ferramenta de prognóstico TANGO (http://tango.switchlab.org/). dois peptídeos agregadores que têm por alvo duas regiões de iscas diferentes (44-55aa: RVVGTGSFGIVFK (SEQ ID NO: 325); 249-257aa: QLVEIIKVL (SEQ ID NO: 321)) na proteína BIN2 foram inicialmente selecionados. Para a região BIN2 249-257aa, os constructos agregadores foram projetados tanto com (bait249R: RQLVEIIKVLR (SEQ ID NO: 326)) quanto sem (bait249: QLVEIIKVL (SEQ ID NO: 321)) flanqueando gatekeepers, representados por resíduos de arginina carregados positivamente.
[001111] As sequências de iscas respectivas foram fundidas C- terminalmente a um reforçador de agregação de sequência sintética (QWQNSTLIVLQNSTVIFEQNSTVIFEQN (SEQ ID NO: 327)) por análise de PCR, introduzindo uma sequência de ligante flexível KPA-GAAKPGAAG (SEQ ID NO: 112).
[001112] O uso do fundamento lógico de verificação o qual atrai modificações amino acidíferas pode levar ao melhor direcionamento da proteína BIN2, dois outros vetores expressando a bait249 foram então gerados. A bait249 foi modificada adicionando 5-7aa flanqueando naturalmente a região 249-257aa em BIN2 (bait249NF: ENAVDQLVEI-IKVLGTPTREE (SEQ ID NO: 328)), bem como 6 aminoácidos (MADDKE (SEQ ID NO: 329)) correspondentes ao início da sequência de proteína BIN2. A sequência de ligante flexível foi alterada para AGSPKGAPAAKGSGA (SEQ ID NO: 324) e a sequência de reforço foi removida. Em um constructo a isca foi inserida em repetição em tandem (bait249NF_Tand: ENAVDQLVEIIKVLGTPTREEENAVDQLVEI-IKVLGTPTREE (SEQ ID NO: 330)). As sequências de DNA resultantes foram clonadas por Gateway em vetores de entrada pDONR221. Depois de confirmação de sequência, os insertos foram transferidos para o vetor de destinação pK7WG2,0 (Karimi et al. 2007) para gerar vetores binários de planta contendo o promotor 35S e a sequência heteróloga fundida C-terminalmente a etiqueta fluorescente de eGFP. O bait249NF_Tand também foi clonado em um vetor Gateway pMDC-m13GW contendo um promotor indutível de estradiol (Curtis and Gros-sniklaus 2003) e a sequência heteróloga foi inserida C-terminalmente fundida a proteína fluorescente tagRFP (pMDC::bait249NF_Tand-tagRFP). O vetor 35S::BIN2-HA foi manipulado usando vetor de destinação pKWG2,0 para gerar vetores binários de planta contendo o promotor 35S e a sequência heteróloga que foi fundida C-terminalmente por recombinação homóloga a uma etiqueta fluorescente de HA.
6.6.2. Materiais vegetais e condições de crescimento
[001113] Plantas de N. benthamiana foram cultivadas diretamente em solo sob um fotoperíodo de 16 horas de luz / 8horas de escuridão e 21°C por 45 dias e infiltradas antes da floração.
[001114] Plântulas de Arabidopsis thaliana L. (Heyhn.) (ecotipo Columbia, Col-0) foram estratificadas por 2 dias a 4°C e germinadas em placas quadradas sobre meio de Murashige & Skoog (MS) de meia força (half-strength) vertical (Duchefa) contendo 1% de sacarose e 0,8% de agar, pH 5,9, a 22°C em um ciclo de 16 horas de luz / 8 horas de escuridão com uma intensidade de luz de 80 a 100 mE m-2 s-1 suprida por tubos de luz fluorescente branca fria (Spectralux Plus 36W/840; Radium) exceto quando indicado. Plântulas cultivadas in vitro por 21 dias foram transferidas para solo em ambiente de crescimento com condições similares de luz e temperatura. A linhagem mutante seguinte foi usada neste estudo: triplo mutante bin2-3/atsk22/atsk23 (Vert and Chory 2006). As linhagens transgênicas previamente descritas usadas no estudo são: pBIN2::BIN2-GFP e 35S::BIN2-GFP (Vert and Chory, 2006). Brassinazol (BRZ) foi adquirido da TCI EUROPE N.V. (Bélgica), 24-Epibrassinolide (BL) da Fuji Chemical Industries (Japão). A expressão de pMDC::bait249NF_Tand-RFP foi induzida adicionando ou infiltrando 20 μΜ de Estradiol (Sigma) por 24 horas.
6.6.3. Transformação de plantas
[001115] Para produzir plantas transgênicas estáveis de A. thaliana, os constructos manipulados foram transformaod sem A. tumefaciens cepa C58C1. Suspensões das cepas bacterianas transformadas foram então usadas para banhar brotos florais selvagens de A. thaliana Col-0. Transformantes primários foram selecionados por germinaação das sementes das flores transformadas sobre meio antibiótico-seletivo. Através de análise por segregação a 3:1 da próxima geração foram adicionalmente isoladas linhagens transgênicas homozigóticas.
[001116] Para agroinfiltrações, folhas de N. benthamiana foram injetadas com A. tumefaciens cepas C58C1(pCH32) transformadas com os vetores 35S::bait249R-GFP, 35S::bait249-GFP, 35S::bait249NF-GFP, 35S::bait249NF_Tand-GFP, pMDC:bait249NF_Tand-RFP junto com 35S::P19, codificando a proteína p19 inibidora de silenciamento derivada do vírus do enfezamento do tomateiro (Tomato Bushy Stunt Virus) (Voinnet et al. 2003).
[001117] As cepas foram usadas para co-infiltrar, com uma seringa sem agulha, o lado abaxial de folhas de N. benthamiana seguindo um protocolo previamente publicado com modificações menores (English et al. 1996). Em resumo, bactérias foram cultivadas de um dia para o outro a 28°C em meio YEB contendo 10 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico pH 5,5 e 20 μΜ de acetosseringona. Na densidade ótica (O.D.) de 0,8 as bactérias foram peletizadas, ressuspendidas em 10 mM de MES, 10 mM de MgCl2, 100 μΜ de acetosseringona e mantidas em temperatura ambiente por 3 horas antes de infiltração.
6.6.4. Imageamento e análise das imagens
[001118] As sementes foram estudadas por imagens em um microscópio confocal de varredura a laser (Olympus FluoView 1000) com uma lente de imersão em água a 20X ou uma lente de imersão em água a 60X, NA1.2. Foi feita análise de imagens com o software Olympus FluoView FV10-ASW. Para experimentos de co-localização, foram feitos cálculos do coeficiente de sobreposição de Mander com o software ImageJ MBF.
6.6.5. Fixação tecidual e marcação imunológica para microscopia eletrônica
[001119] Para estudos morfológicos, fragmentos (1 a 2 mm2) de cotilédones, hipocótilos e raízes de plântulas de 8 dias depois da (D.A.S.) 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP foram imersas em uma solução fixadora de 3 % de paraformaldeído e 2,5 % de glutaraldeído e foram pós-fixadas em 1% de OsO4 com 1,5% de K3Fe(CN)6 em 0,1 M de tampão de Cacodilato de Na, pH 7,2. As amostras foram desidratadas através de uma série graduada de etanol, incluindo uma coloração em massa com 2% de uranil acetato na etapa de 50% de etanol seguida por incorporação em resina de Spurr. Seções ultrafinas foram produzidas usando um ultramicrótomo (Leica EM UC6) e pós-coradas em uma Leica EM AC20 por 40 min em uranil acetato a 20°C e por 10 min em lead stain a 20°C. As grades foram visualizadas com um microscopia eletrônico de transmissão JEM 1010 (JEOL, Tokyo, Japão) operando a 80 kV.
[001120] Para detecção imunocitoquímica, fragmentos (1 a 2 mm2) de cotilédones, hipocótilos e raízes de plântulas de 8 D.A.S. 35S::bait249R-GFP e 35S::bait249NF_Tand-GFP foram imersas em uma solução fixadora de 2,5 % de paraformaldeído e 0,3% de glutaraldeído em 0,1 M de tampão de Cacodilato de Na, pH 7,2. As amostras foram desidratadas através de uma série graduada de etanol e infiltradas em etapas durante 3 dias a 4°C em LR-White, grau duro (London Resin), seguida por incorporação em cápsulas. Foi realizada polimerização por iluminação UV por 24 horas a 4°C seguidas por 16 horas a 60°C. Seções ultrafinas de cor de interferência dourada foram cortadas com um micrótomo (Leica EM UC6) e coletadas sobre grades de ranhuras de cobre revestidas com formvar. Todas as etapas de muno-marcação foram realizadas em uma câmara úmida em temperatura ambiente. As grades foram flutuadas invertidas sobre 25 μl de solução de bloqueio (5% (em peso/ volume) de albumina sérica bovina (BSA), por 30 min seguidos por lavagem cinco vezes por 5 min cada vez com 1% de BSA em PBS. Incubação em uma diluição a 1:50 (1% de BSA em PBS) de anticorpos primários anti-GFP de coelho (AbCam) por 60 min foi seguida por lavagem cinco vezes por 5 min cada vez com 0.1% de BSA em PBS. As grades foram incubadas com PAG 10 nm em diluição a 1:60 (1% de BSA em PBS) (Cell Biology, Utrecht University, Países Baixos) e lavadas duas vezes por 5 min cada vez com 0,1% de BSA em PBS, PBS, e água duplamente destilada. As seções foram pós-coradas em uma Leica EM AC20 por 40 min em uranil acetato a 20°C e por 10 min em citrato de chumbo a 20°C. As grades foram visualizadas com um JEM 1010 microscópio eletrônico de transmissão (Jeol Ltd., Tokyo, Japão) operando a 80 kV.
6.6.6. Eletroforese e western blot
[001121] Proteínas solúveis totais (TSP) foram extraídas a partir de plântulas de 8 D.A.S. de Arabidopsis ou fragmentos de folhas agroinfil-tradas de N. benthamiana foram trituradas em um almofariz e enxaguadas com 0,01 M de salina tamponada com fosfato gelada (PBS; 10 mM de Na2HPO4, 10 mM de NaH2PO4, 150 mM de NaCl, pH 7,2), adicionada de inibidores de proteases (Complete® livre de EDTA, Roche, Alemanha). Os homogenados foram então centrifugados a 20.000 x g por 20’ a 4°C. Os sobrenadantes foram quantificados para teor de proteína com o ensaio de Bradford (kit Micro Assay, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, E. U. A.).
[001122] O experimento de co-imunoprecipitação foi realizado usando contas anti-GFP acopladas a agarose (Chromotek) de acordo com as instruções do fabricante.
[001123] Extratos de proteína completos ou produtos de IP foram fracionados ou por SDS-PAGE (Biorad) ou por BN-PAGE (Native-PAGE system, Invitrogen) seguindo os manuais dos produtos. Para SDS-PAGE, aproximadamente 60 μg de TSP foram desnaturados a 95°C por 10 min na presença de 1% de SDS e 0,1 M de DTT e então fracionados por 10%, 12% ou 15% (em peso / volume) de géis SDS-PAGE em tampão de operação TGS (25 mM de Tris, 192 mM de glici- na e 0,1% de SDS). As membranas foram bloqueadas de um dia para o outro com 5% (em peso / volume) de leite desnatado em PBS a 4°C antes de immunoblotting.
[001124] Para BN-PAGE, extrato de proteína foi adicionado com 20% de glicerol e 5 mM de Coomassie G-250 antes de carregar sobre gradiente de 3 a 12% de géis Novex Bis-Tris. A eletroforese foi realizada em um tampão de operação contendo 50 mM de BisTris e 50 mM de Tricine (mais 0,004% de Coomassie G-250 em tampão de catodo) sob voltagem fixa (100 V) a 21°C por 120 min. As proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno e coradas com Coomassie G-250 para mostrar marcadores do peso molecular (NativeMark, Invitrogen). Depois de fixação com 8% de ácido acético por 20 min, as membranas de fluoreto de polivinilideno foram secadas ao ar e descoradas com 100% de metanol. As membranas foram bloqueadas de um dia para o outro com 4% de BSA em TBS a 4°C antes de immunoblotting.
[001125] De modo a detectedar BIN2 marcada com HA ou bait249, bait249R, bait249NF, bait249NF_Tand marcados com GFP sobre a membrana, os anticorpos primários (anti-HA de rato, Roche; anti-GFP de camundongo, Living Colors) foram diluídos até 1:1.000 ou 1:5.000 respectivamente em PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBS-T) e 3% (em peso / volume) leite desnatado e incubadas por 1 h em temperatura ambiente. Depois de quatro enxágues com PBS-T, a membrana foi corada com IgG anti-rato de cabra conjugado a peroxidase de raiz-forte (HRP) (GE-Healthcare) ou IgG anti-camundongo de ovelha (GE-Healthcare) ou e visualizada com sistema de luminescência eletroquímica.
6.6.7. qRT-PCR
[001126] RNA foi extraído a partir de plântulas de 8 D.A.S. completas tratadas conforme indicado em 0,5 M de meio S e RNA foi extraído usando o kit RNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do forne- cedor e quantificado em um espectrofotômetro NanoDrop® ND-100 Spectrophotometer. Poli(dT) cDNA foi preparado a partir de 1 μg de RNA total com transcriptase reversa iScript (Biorad). PCR foi realizado sobre placas de reação de 384 cavidades, as quais foram aquecidas por 10 min até 95°C, seguido por 45 ciclos de desnaturação por 10 s a 95°C e anelamento e extensão por 15 s a 60°C e 72°C, respectivamente. Foram realizadas quantificações alvo com pares de iniciadores específicos listados nas Tabela 20. Todas as reações de PCRs foram realizadas em três repetições técnicas, e no mínimo duas repetições biológicas foram usadas para cada amostra. Para análise de expressões de acompanhantes, tripletos de iniciadores Taqman foram adquiridos a partir da Integrated DNA Technologies (IDT). qRT-PCR foi realizado usando a mistura da Applied Biosystems Fast Realtime PCR em uma máquina Biorad iQ5 com detecção do fluoróforo Fam. Níveis de expressão relativa foram normalizados para níveis de expressão de CDKA e EF.
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6.6.8. Espectroscopia FT-IR
[001127] Espectroscopia por Infravermelho de Transformada de Fourier foi realizada em um espectrômetro FT-IR Tensor 37 equipado com uma célula BioATR II (Bruker) conforme previamente reportado (Xu et al.). Em resumo, o detector foi resfriado com nitrogênio líquido, e a célula Bio-ATR II foi purgada por um fluxo contínuo de ar seco de modo a minimizar o vapor d’água que pode interferir com os resultados. Antes e depois de cada medição, o cristal da célula de ATR foi lavado com etanol e água. As amostras foram medidas contra o fundo composto de cristal revestido com tampão.

Claims (32)

  1. Método para regular negativamente a função biológica de uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorre naturalmente na referida proteína; e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada; e
    em que o método não é praticado no corpo humano ou animal.
  2. Uso de uma molécula, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença, em que a molécula apresenta a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repeti-ção;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorre naturalmente em uma proteína; e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
    em que a regulação negativa da função biológica da referida proteína em um indivíduo é terapeuticamente útil na referida doença.
  3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a expressão ou sobreexpressão da referida proteína está associada ou é causadora da referida doença.
  4. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de câncer, tal como em que a expressão ou superexpressão da referida proteína está associada a ou é causadora do câncer.
  5. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de degeneração macular relacionada com a idade (em inglês, AMD), tal como em que a expressão ou superexpressão da referida proteína está associada a ou é causadora da AMD.
  6. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de doença inflamatória, tal como em que a expressão ou superexpressão da referida proteína está associada a ou é causadora da doença inflamatória.
  7. Uso de uma molécula, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença infecciosa causada por organismo patogênico, em que a molécula apresenta a seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repeti-ção;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorre naturalmente em uma proteína de um organismo patogênico; e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
  8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o patógeno é um organismo viral.
  9. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o patógeno é um organismo microbiano selecionado entre bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, micobactérias, fungos, leveduras e mofos.
  10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato da molécula ser fornecida em um dispositivo implantável revestido pelo menos parcialmente com a molécula.
  11. Dispositivo implantável, caracterizado pelo fato de ser no mínimo parcialmente revestido com moléculas da estrutura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente; e em que pelo menos um Yi é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que um aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorrem naturalmente em uma proteína de um organismo patogênico; e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo indepen-dente entre um ligante ou nada.
  12. Método para triagem de novos compostos inibidores e/ou de detecção, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    a) identificar em no mínimo uma proteína no mínimo uma região de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, ou-tro(s) resíduo(s) é (são) selecionado(s) entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente;
    b) sintetizar uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repeti-ção;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi is é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorre naturalmente na prote-ína identificada na etapa a); e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
    c) trazer a molécula produzida na etapa b) em contato com a proteína da etapa a); e
    d) avaliar a função e/ou agregação da proteína.
  13. Método para identificar novos alvos para compostos inibidores, caracterizado pelo fato de que compreende o método como definido na reivindicação 12, em que a proteína na etapa a) não é um alvo conhecido para compostos inibidores.
  14. Método para detectar uma proteína em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    a) contactar uma amostra suspeita de conter a proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repeti-ção;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorre na-turalmente na proteína a ser detectada; e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada;
    b) detectar a presença das moléculas reagidas com a proteína.
  15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o no mínimo um Yi que é idêntico ou difere com não mais do que uma substituição de aminoácido do trecho contíguo de aminoácidos que ocorre naturalmente na proteína a ser detectada é único para a referida proteína na referida amostra.
  16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a molécula compreende uma etiqueta detectável e a detecção na etapa b) é através de detecção da etiqueta detectável.
  17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a molécula é fornecida sobre um suporte sólido.
  18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas moléculas diferentes são fornecidas no suporte sólido.
  19. Método para regular negativamente a função biológica de uma proteína em uma planta ou célula de planta ou semente de planta, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a referida proteína com uma molécula da seguinte estrutura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, em que:
    • - n é um inteiro de 1 a 5 e i aumenta a partir de 1 até n com cada repetição;
    • - cada X2i-1 e X2i são selecionados de modo independente entre 1 a 4 aminoácidos contíguos selecionados entre: R, K, E, D, P, N, S, H, G e Q; mais particularmente 1 a 4 aminoácidos selecionados entre R, K, E, D e P;
    • - cada Yi é uma sequência de agregação beta selecionada de modo independente entre um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos, no mínimo 50% dos quais são aminoácidos hidrofóbicos, e no qual no mínimo um resíduo alifático ou F está presente, e caso somente um resíduo alifático ou F estiver presente, no mínimo um, e preferencialmente no mínimo dois, outros resíduos são selecionados entre Y, W, A, M e T; e no qual não mais de 1, e preferencialmente nenhum, resíduo P, R, K, D ou E está presente, e em que no mínimo um Yi é um trecho idêntico ou diferente com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho contíguo de aminoácidos que ocorre naturalmente na referida proteína na referida planta, célula de planta ou semente de planta; e
    • - cada Zi é um ligante e Zn é selecionado de modo independente entre um ligante ou nada.
  20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a molécula é um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos presente sobre um vetor recombinante e a qual, depois de introdução dentro da célula de planta, da semente de planta ou da planta, produz o referido polipeptídeo na referida célula de planta, semente de planta ou planta.
  21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, ou 12 a 20, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, ou dispositivo implantável de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que cada X2i-1 e X2i são 1 ou 2 aminoácidos.
  22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 21, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21, ou dispositivo implantável de acordo com a reivindicação 11 ou 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos um, e mais particularmente todos, Yi são uma extensão de 6 a 13 aminoácidos, particularmente de 6 a 9 aminoácidos, mais particularmente de 6 ou 7 aminoácidos.
  23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 22, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, 21 ou 22, ou dispositivo implantável de acordo com a reivindicação 11, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois, e particularmente todos, Yi são, cada um, independentemente idênticos ou diferem com não mais do que uma substituição de aminoácido de um trecho de 6 a 16 aminoácidos contíguos que ocorrem naturalmente em uma proteína.
  24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 23, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 23, ou dispositivo implantável de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que cada Zi é independentemente selecionado a partir do trecho entre 0 e 20 unidades, em que uma unidade é um aminoácido, um monossacarídeo, um nucleotídeo, ácido trioxatridecano-succínico (Ttds) ou PEG.
  25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 23, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 23, ou dispositivo implantável de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que cada Zi é independentemente selecionado a partir de um trecho entre 0 e 20 unidades, em que uma unidade é um aminoácido.
  26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 23, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 23, ou dispositivo implantável de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que cada Zi é independentemente selecionado a partir do tre- cho entre 0 e 10 unidades, em que uma unidade é um aminoácido ou PEG.
  27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 26, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 26, ou dispositivo implantável de acordo qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 26, caracterizado pelo fato de que n é 1, X1 e X2 não têm no total mais do que 5 aminoácidos, Y1 é um trecho entre 6 e 10 aminoácidos e Z1 é um trecho de 0 unidades.
  28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 26, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 26, ou dispositivo implantável de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 26, caracterizado pelo fato de que n é 2, Z1 é um linker e Z2 não é nada.
  29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 28, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 28, ou dispositivo implantável de acordo qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 28, caracterizado pelo fato de que a molécula compreende ainda outra porção.
  30. Método, uso ou dispositivo implantável de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a outra porção é uma porção que aumenta a solubilidade da molécula, um marcador detectável, uma molécula pequena ou uma droga.
  31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 30, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 30, ou dispositivo implantável de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 30, caracterizado pelo fato de que a molécula compreende um ou mais D-aminoácidos.
  32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 31, uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10 ou 21 a 31, ou dispositivo implantável de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 21 a 31, caracterizado pelo fato de que a molécula compreende um ou mais aminoácidos modificados quimicamente ou aminoácidos não naturais.
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