BR112013009552B1 - Microorganismo recombinante que produz 1-butanol e método para a produção de 1-butanol - Google Patents

Microorganismo recombinante que produz 1-butanol e método para a produção de 1-butanol Download PDF

Info

Publication number
BR112013009552B1
BR112013009552B1 BR112013009552-0A BR112013009552A BR112013009552B1 BR 112013009552 B1 BR112013009552 B1 BR 112013009552B1 BR 112013009552 A BR112013009552 A BR 112013009552A BR 112013009552 B1 BR112013009552 B1 BR 112013009552B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
butanol
microorganism
dehydrogenase
seq
exogenous
Prior art date
Application number
BR112013009552-0A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112013009552A2 (pt
Inventor
Michael Koepke
Fung-Min Liew
Sean Dennis Simpson
Original Assignee
Lanzatech Nz, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/049,263 external-priority patent/US20110236941A1/en
Application filed by Lanzatech Nz, Inc filed Critical Lanzatech Nz, Inc
Publication of BR112013009552A2 publication Critical patent/BR112013009552A2/pt
Publication of BR112013009552B1 publication Critical patent/BR112013009552B1/pt

Links

Abstract

PRODUÇÃO DE BUTANOL A PARTIR DE MONÓXIDO DE CARBONO POR UM MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE. A invenção refere-se, de modo geral, a novos micro- organismos geneticamente modificado capazes de utilizar CO para produzir 1-butanol e/ou um precursor do mesmo, metiltransferases e novos ácidos nucleiios que codificam a mesma, métodos de produção de micro-organismos geneticamente modificados utilizando as referidos novas metiltransferases e métodos de produção de 1-butanol e/ou um precursor do mesmo por meio de fermentação microbiana.

Description

CAMPO
A presente invenção refere-se a métodos para a produção de bi- ocombustíveis por meio de fermentação microbiana e micro-organismos ge- neticamente modificados adequados para uso em tais métodos.
ANTECEDENTES
Butanol é um produto químico importante com uma ampla faixa de usos industriais que tem uma produção mundial de 4,5-5,5 milhões de toneladas por ano. Ele é usado como um precursor para a produção de éste- res de acrilato e metacrilato (usados em revestimentos, plásticos, têxteis, adesivos, etc.), glicol éteres (revestimentos, componentes eletrônicos) e ace- tato de butila (tintas, revestimentos, flavorizantes de fruta sintéticos), bem como butilaminas (produção de pesticidas e produtos farmacêuticos) e resi- nas de amina. Ele também tem uso direto como um solvente (em tinta, co- rantes, etc.), um agente de extração (para a produção de fármacos e subs- tâncias naturais, tais como alcaloides, antibióticos, hormônios e vitaminas) e em fluidos de degelo, cosméticos e cromatografia.
Butanol também tem potencial como um biocombustível de se- gunda geração e, neste contexto, é referido como Biobutanol (Kopke & Dür- re, 2010). Ele tem propriedades similares à gasolina e propriedades superio- res ao etanol. Especificamente, ele tem alta octanagem em virtude de maior densidade de energia, pode ser misturado com a gasolina em qualquer con- centração (enquanto que o etanol pode ser misturado apenas até 85%) e não é higroscópico ou corrosivo.
Biocombustíveis para transporte são substitutos atraentes para a gasolina e são combustíveis que entram rapidamente no mercado como mis- turas de baixa concentração. Biocombustíveis, derivados de fontes vegetais naturais, são mais ambientalmente sustentáveis do que aqueles derivados de recursos fósseis (tal como gasolina), seu uso permitindo uma redução nos níveis do assim denominado gás dióxido de carbono (CO2) fóssil que é liberado na atmosfera como um resultado de combustão de combustível. Além disso, biocombustíveis podem ser produzidos localmente em muitas localidades e podem atuar para reduzir a dependência de recursos de ener- gia fóssil importada.
A grande maioria dos biocombustíveis é produzida via processos de fermentação baseados em levedura tradicionais que usam carboidratos derivados de culturas como a principal fonte de carbono e são conhecidos como biocombustíveis de primeira geração. Contudo, estas culturas são re- queridas para alimentação e muitas culturas também requerem altos insu- mos agrícolas na forma de fertilizantes. Estas limitações significam que bio- combustíveis de primeira geração não são considerados sustentáveis e as reduções de gás de efeito estufa que podem ser obtidas são limitadas. O objetivo de biocombustíveis secundários é o uso sustentável de partes não destinadas à alimentação de culturas atuais ou outros resíduos industriais para reduzir as emissões de gás de efeito estufa e reduzir a dependência de combustíveis fósseis.
Produção recente de 1-butanol tem sido principalmente por meio de oxo síntese (Weiβermel & Arpe, 2003). Petroquímicos, incluindo petróleo bruto, são craqueados para formar propileno, o qual é usado durante a oxo síntese. No entanto, o processo de síntese requer o uso de recursos naturais não renováveis, bem como sofre pelo fato de ser dispendioso e não especí- fico quanto aos produtos formados.
Butanol também pode ser produzido através de métodos de pro- dução biológicos, o mais comum sendo a fermentação de Acetona-Butanol- Etanol (ABE), a qual tem sido usada industrialmente desde 1913 (Kõpke & Dürre, 2010). Este método tem o subproduto indesejável de acetona, o qual é usualmente produzido em cerca de metade do volume de butanol o qual, portanto, reduz substancialmente o rendimento. Adicionalmente, este méto- do de fermentação é limitado pela toxicidade do butanol para o micro- organismo, resultando no crescimento sendo quase completamente inibido em concentrações tão baixas de butanol quanto 1,5% (Kõpke e Dürre 2010). Além disso, fermentação ABE usa açúcar de milho, amido, cassava e cana- de-açúcar como matérias-primas. Isso resulta no uso indesejável de terras aráveis para produzir combustível em vez de alimento. Isto também pode agravar os problemas relacionados ao desmatamento e desertificação.
Apenas alguns organismos são conhecidos por produzir natu- ralmente butanol e nenhum destes produz butanol em um elevado rendimen- to a partir de fontes abundantes (tal como monóxido de carbono - CO). Dois organismos conhecidos por produzir naturalmente butanol a partir de CO são Butyribacterium methylotrophicum (o qual sintetiza apenas traços de butanol (Heiskanen et al., 2007)) e Clostridium carboxidivorans (o qual produz baixos rendimentos de 1-butanol como um subproduto aos principais produtos de fermentação de etanol e acetato (Liou et al., 2005)).
Uma série de organismos foi geneticamente modificada para produzir 1-butanol, incluindo E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevi- siae, Pseudomonas putida ou Lactobacillus brevis. No entanto, todos esses organismos ainda dependem de açúcar como matéria-prima (Kõpke & Dürre, 2010). Apesar de mais de 250 espécies de Clostridium serem conhecidas, apenas algumas são geneticamente acessíveis. Não há competência natural (absorção de DNA extracelular a partir do ambiente da célula) conhecida em Clostridia e eletrotransformação ou conjugação são os únicos métodos dis- poníveis para transformação. Estas questões representam dificuldades signi- ficativas na transformação eficaz de espécies Clostridium. A maioria dos Clostridia tem um ou mais sistemas de restrição/metilação para proteger contra DNA estranho e de fago, o que significa que a transformação é parti- cularmente difícil e imprevisível.
Detalhes bibliográficos das publicações mencionadas aqui são compilados ao final da descrição.
É um objetivo da invenção superar um ou mais inconvenientes da técnica anterior ou pelo menos fornecer ao público uma alternativa útil para tecnologias conhecidas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com a invenção, descobriu-se que um micro- organismo geneticamente modificado é capaz de usar CO para produzir 1- butanol ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção.
Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um micro- organismo recombinante acetogênico carboxitrófico que produz 1-butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação.
Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um micro- organismo recombinante acetogênico que é capaz de produzir 1-butanol e/ou um precursor do mesmo por meio de fermentação de um substrato que compreende CO em uma concentração maior do que aproximadamente 1 mM ou 0,075 g/l por litro de caldo de fermentação.
De preferência, o micro-organismo compreende ácidos nucleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais enzimas na via de bios- síntese de butanol.
Em uma modalidade, a um ou mais enzimas são escolhidas do grupo que consiste em: Tiolase de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA Crotonase/hidratase de crotonil-CoA De-hidrogenase de butiril-CoA Flavoproteína A de Transferência de Elétrons Flavoproteína B de Transferência de Elétrons
De preferência, o micro-organismo compreende um ou mais áci- dos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais das enzimas.
De preferência, o um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas são escolhidos de ácidos nucleicos SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 6 ou variantes funcionalmente equivalentes das mesmas.
De preferência, o micro-organismo compreende um ou mais áci- dos nucleicos exógenos que codificam cada uma de tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril-CoA, Flavopro- teína de Transferência de Elétrons A e Flavoproteína de Transferência de Elétrons B.
De preferência, o micro-organismo compreende um plasmídeo que codifica uma ou mais das mesmas ou, de preferência, cada uma de tio- lase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril-CoA, Flavoproteína de Transferência de Elétrons A e Flavoproteína de Transferência de Elétrons B
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam cada uma das enzimas tiola- se, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, crotonase/hidratase de crotonil- CoA e de-hidrogenase de butiril-CoA.
De preferência, o micro-organismo compreende ainda um pro- motor de quinase de acetato/fosfotransacetilase exógeno. De preferência, o promotor corresponde à SEQ ID NO. 7 ou uma variante funcionalmente e- quivalente da mesma.
De preferência, o promotor está contido em um construto que codifica uma ou mais das enzimas aqui antes mencionadas.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende ácidos nu- cleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais das enzimas esco- lhidas do grupo que consiste em: Fosfotransbutirilase; quinase de butirato; óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina; de-hidrogenase de butiraldeído; de-hidrogenase de butanol; uma de-hidrogenase de butiraldeído e de-hidrogenase de buta- nol bifuncional.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende ácidos nu- cleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e uma de-hidrogenase de buti- raldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional. De preferência, o micro- organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codifi- cam uma ou mais de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e uma de-hidrogenase de butiraldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende ácidos nu- cleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais de fosfotransbutiri- lase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredo- xina e de-hidrogenase de butanol. De preferência, o micro-organismo com- preende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais de fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído de- pendente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol. Em modalidades par- ticulares, o micro-organismo compreende ácidos nucleicos exógenos adap- tados para expressar cada uma de fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol.
Em uma modalidade, o um ou mais ácidos nucleicos que codifi- cam uma ou mais enzimas são escolhidos dos ácidos nucleicos descritos nas Tabelas 7 a 10 aqui depois e variantes funcionalmente equivalentes das mesmas.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos adequados para expressar pelo menos duas das en- zimas na via de biossíntese de butanol, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 das enzimas.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos adequados para expressar tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase/hidratase de crotonil-CoA, de-hidrogenase de butiril-CoA, Flavoproteína A de Transferência de Elétrons, Flavoproteína B de Transferência de Elétrons e uma ou ambas de desidrogenase de butiral- deído e de-hidrogenase de butanol (ou uma enzima bifuncional).
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos adequados para expressar tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase/hidratase de crotonil-CoA, de-hidrogenase de butiril-CoA, Flavoproteína A de Transferência de Elétrons, Flavoproteína B de Transferência de Elétrons e pelo menos uma de fosfotransbutirilase e quinase de butirato e óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina e desidrogenase de butanol.
De preferência, o micro-organismo é selecionado do grupo de bactérias acetogênicas carboxitróficas. Em determinadas modalidades, o micro-organismo é selecionado do grupo que compreende Clostridium au- toethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyribacteri- um limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Al- kalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella ther- moacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii e Thermoanae- robacter kiuvi. De preferência, o micro-organismo é Clostridium autoethanoge- num DSM23693.
Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante da inven- ção tem as características que definem o micro-organismo depositado na DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha) sob o número de acesso DSM24138.
Em um segundo aspecto, a invenção proporciona um gene re- combinante de metiltransferase de acordo com Nucleotídeo SEQ ID NO. 27 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma.
Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona uma metiltrans- ferase de acordo com SEQ ID NO. 28 ou uma variante de aminoácidos fun- cionalmente equivalentes das mesmas.
Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um micro- organismo recombinante que compreende um gene de metiltransferase de acordo com o segundo aspecto. O gene de metiltransferase pode estar pre- sente em um construto de ácido nucleico ou integrado no genoma do micro- organismo.
Em um quarto aspecto, a invenção proporciona um ácido nuclei- co compreendendo SEQ ID NO. 1 a 6 ou variantes funcionalmente equiva- lentes das mesmas, em qualquer ordem.
De preferência, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO. 1 a 6, na ordem mostrada na Figura 2.
De preferência, o ácido nucleico compreende ainda um promotor de butiril/acetil transferase de fosfato. De preferência, o promotor correspon- de à SEQ ID NO. 7 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma.
Em um quinto aspecto, a invenção proporciona um construto de expressão que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico em que o construto, quando expresso em um micro-organismo acetogênico, re- sulta em 1-butanol e/ou um precursor do mesmo sendo produzido como o principal produto de fermentação.
De preferência, a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificam uma ou mais enzimas que são parte da via de biossíntese de 1- butanol.
De preferência, os ácidos nucleicos são selecionados de ácidos nucleicos que codificam tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, cro- tonase, de-hidrogenase de butiril-CoA, Flavoproteína A de transferência de elétrons e/ou Flavoproteína B de transferência de elétrons.
De preferência, a uma ou mais sequências de ácido nucleico são selecionadas de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 6 ou variantes funcionalmente equivalentes das mesmas.
Em uma modalidade, os ácidos nucleicos são ainda seleciona- dos de ácidos nucleicos que codificam Fosfotransbutirilase, quinase de buti- rato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina, de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e uma de-hidrogenase de buti- raldeído/de-hidrogenase de butanol bifuncional.
Em uma modalidade, os ácidos nucleicos são selecionados do grupo de ácidos nucleicos descritos nas Tabelas 7 a 10 aqui depois e varian- tes funcionalmente equivalentes das mesmas.
Em uma modalidade, o construto de expressão codifica pelo menos duas enzimas na via de biossíntese de butanol, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 das enzimas.
De preferência, o construto de expressão compreende ainda um promotor do óperon de butiril/acetil transferase de fosfato. Em outra modali- dade, o construto de expressão compreende outro promotor altamente ativo , tal como o promotor óxido-redutase de ferredoxina:piruvato (SEQ ID NO. 48), o agrupamento gênico de Wood-Ljungdahl (SEQ ID NO. 47), óperon de Rnf (SEQ ID NO. 49) ou o óperon de sintase de ATP (SEQ ID NO. 50). De preferência, o promotor do óperon de butiril/acetil transferase de fosfato cor- responde à SEQ ID NO. 7 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma.
Em um sexto aspecto, a invenção proporciona um construto que compreende um gene de metiltransferase, conforme descrito aqui.
Em um sétimo aspecto, a invenção proporciona uma composi- ção compreendendo o construto de expressão do quinto aspecto e o cons- truto de metilação do sexto aspecto.
De preferência, a composição é capaz de produzir um micro- organismo recombinante que produz 1-butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação.
Em um oitavo aspecto, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. introdução, em um micro-organismo de transporte, de (i) um construto de expressão e (ii) um construto de metilação de acordo com o sexto aspecto que compreende um gene de metiltransferase; b. expressão do gene de metiltransferase; c. isolamento de um ou mais construtos do micro-organismo de transporte; e d. introdução de pelo menos um construto de expressão em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no.
Em uma modalidade, expressão do gene de metiltransferase na etapa b. é constitutiva. Em outra modalidade, expressão do gene de metil- transferase na etapa b. é induzida.
Em uma modalidade, o construto de metilação e o construto de expressão são ambos isolados na etapa c. Em outra modalidade, o construto de expressão é isolado na etapa c.
Em uma modalidade, apenas o construto de expressão é intro- duzido no micro-organismo de destino. Em outra modalidade, o construto de expressão e o construto de metilação são ambos introduzidos no micro- organismo de destino.
De preferência, o construto de expressão é conforme definido no quinto aspecto.
De preferência, o micro-organismo recombinante produz 1- butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção.
Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. metilação de um construto de expressão in vitro por uma me- tiltransferase de acordo com SEQ ID NO. 28 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma; b. introdução de um construto de expressão em um micro- organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no. De preferência, o construto de expressão é conforme definido no quinto aspecto.
De preferência, o micro-organismo recombinante produz 1- butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção.
De preferência, a metiltransferase é produzida por meio de ex- pressão de um gene de metiltransferase, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 27 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma, em um micro-organismo e isolamento da enzima metiltransferase.
Em um outro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. introdução, no genoma de um micro-organismo de transporte, de um gene de metiltransferase, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 27 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma; b. introdução de um construto de expressão no micro-organismo de transporte; c. isolamento de um ou mais construtos do micro-organismo de transporte; e d. introdução de pelo menos um construto de expressão em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no.
De preferência, o construto de expressão é conforme definido no quinto aspecto.
De preferência, o micro-organismo recombinante produz 1- butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção.
Em um outro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. metilação de um construto de expressão de acordo com o quinto aspecto in vitro por uma metiltransferase; b. introdução do construto de expressão em um micro-organismo de destino.
De preferência, a metiltransferase é codificada por um gene de metiltransferase conforme definido no segundo aspecto ou uma metiltransfe- rase conforme definido no terceiro aspecto.
De preferência, o micro-organismo recombinante produz 1- butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção.
Em um nono aspecto, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. introdução de (i) um construto de expressão de acordo com o quinto aspecto e (ii) um construto de metilação compreendendo um gene de metiltransferase em um micro-organismo de transporte; b. expressão do gene de metiltransferase; c. isolamento de um ou mais construtos do micro-organismo de transporte; e d. introdução de pelo menos um construto de expressão em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no.
Em uma modalidade, expressão do gene de metiltransferase na etapa b. é constitutiva. Em outra modalidade, expressão do gene de metil- transferase na etapa b. é induzida.
Em uma modalidade, o construto de metilação e o construto de expressão são ambos isolados na etapa c. Em outra modalidade, o construto de expressão é isolado na etapa c.
Em uma modalidade, apenas o construto de expressão é intro- duzido no micro-organismo de destino. Em outra modalidade, o construto de expressão e o construto de metilação são ambos introduzidos no micro- organismo de destino.
De preferência, o micro-organismo recombinante produz 1- butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção.
Em um décimo aspecto, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante que produz 1-butanol ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação que compre- ende: a. introdução de (i) um construto de expressão e (ii) um constru- to de metilação que compreende um gene de metiltransferase em um micro- organismo de transporte; b. expressão do gene de metiltransferase; c. isolamento de um ou mais construtos do micro-organismo de transporte; e d. introdução de pelo menos um construto de expressão em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no.
Em uma modalidade, expressão do gene de metiltransferase na etapa b. é constitutiva. Em outra modalidade, expressão do gene de metil- transferase na etapa b. é induzida.
Em uma modalidade, o construto de metilação e o construto de expressão são ambos isolados na etapa c. Em outra modalidade, o construto de expressão é isolado na etapa c.
Em uma modalidade, apenas o construto de expressão é intro- duzido no micro-organismo de destino. Em outra modalidade, o construto de expressão e o construto de metilação são ambos introduzidos no micro- organismo de destino.
De preferência, o construto de expressão é conforme definido no quinto aspecto.
De preferência, o construto de metilação é conforme definido no sexto aspecto.
Em um décimo primeiro aspecto, a invenção proporciona um método de produção de 1-butanol e/ou um precursor do mesmo por meio de fermentação microbiana que compreende fermentação de um substrato u- sando um micro-organismo recombinante.
De preferência, 1-butanol e/ou um precursor do mesmo é o prin- cipal produto de fermentação.
De preferência, o micro-organismo recombinante é conforme descrito em qualquer um dos oitavo a décimo aspectos.
De preferência, 1-butanol e/ou um precursor do mesmo é produ- zido em um rendimento de aproximadamente de 0,075 gramas por litro de caldo de fermentação ( g/l) a cerca de 20 g/l. Em uma modalidade, o rendi- mento é aproximadamente 0,15 g/l a aproximadamente 1,54 g/l. Em outras modalidades, o rendimento é aproximadamente 10 g/l, aproximadamente 5 g/l ou aproximadamente 2 g/l. De preferência, o rendimento de 1-butanol é até o limite em que o butanol se torna tóxico para o meio circundante.
De preferência, o substrato compreende CO. De preferência, o substrato é um substrato gasoso que compreende CO. Em uma modalidade, o substrato compreende um gás residual industrial. Em determinadas moda- lidades, o gás é gás residual ou syngas de usinagem de aço.
Em uma modalidade, o substrato conterá, tipicamente, uma grande proporção de CO, tal como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO em volume, de 20% a 70% de CO em volume, de 30% a 60% de CO em volume e de 40% a 55% de CO em volume. Em modalidades par- ticulares, o substrato compreende cerca de 25% ou cerca de 30% ou cerca de 35% ou cerca de 40% ou cerca de 45% ou cerca de 50% de CO ou cerca de 55% de CO ou cerca de 60% de CO em volume.
Embora não seja necessário que o substrato contenha qualquer hidrogênio, a presença de H2 não deverá ser prejudicial para a formação de produto de acordo com os métodos da invenção. Em modalidades particula- res, a presença de hidrogênio resulta em uma eficiência global aumentada da produção de álcool. Por exemplo, em modalidades particulares, o subs- trato pode compreender uma proporção aproximada de H2ÍCO de 2:1 ou 1:1 ou 1:2. Em uma modalidade, o substrato compreende cerca de 30% ou me- nos de H2 em volume, 20% ou menos de H2 em volume, cerca de 15% ou menos de H2 em volume ou cerca de 10% ou menos de H2 em volume. Em outras modalidades, a corrente de substrato compreende baixas concentra- ções de H2, por exemplo, menos de 5% ou menos de 4% ou menos de 3% ou menos de 2% ou menos de 1% ou é substancialmente livre de hidrogê- nio. O substrato também pode conter algum CO2, por exemplo, tal como cer- ca de 1% a cerca de 80% de CO2 em volume ou 1 % a cerca de 30% de CO2 em volume.
De preferência, o precursor produzido por meio do método de qualquer um dos aspectos anteriores é convertido em 1-butanol na presença de fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído de- pendente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol.
De preferência, o micro-organismo produz fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol, tanto antes quanto após introdução de um ácido nucleico exógeno.
De preferência, o precursor produzido por meio do método de qualquer um dos aspectos anteriores é convertido em 1-butanol na presença de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e/ou uma de- hidrogenase de butiraldeído/de-hidrogenase de butanol bifuncional.
De preferência, o micro-organismo produz de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e/ou uma de-hidrogenase de buti- raldeído/de-hidrogenase de butanol bifuncional antes e após introdução de um ácido nucleico exógeno.
Em um décimo segundo aspecto, a invenção proporciona 1- butanol ou um precursor do mesmo produzido por meio do método do déci- mo primeiro aspecto.
Em um décimo terceiro aspecto, a invenção proporciona um mi- cro-organismo de transporte que compreende um construto de metilação, conforme definido aqui.
De preferência, o micro-organismo de transporte compreende ainda um construto de expressão conforme definido aqui.
De preferência, o micro-organismo transporte é E. coli, Bacillus subtillis ou Lactococcus lactis.
De preferência, o construto de metilação de qualquer um dos aspectos anteriores compreende um promotor lac e o gene de metiltransfe- rase e é induzido por isopropil-β-tio-D-galactosideo (IPTG). Expressão de metiltransferase pode também ser controlada por outros sistemas promoto- res induzíveis, tais como ara, tet ou T7.
Em um décimo quarto aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico tendo uma sequência escolhida do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 8 a 13.
Em um décimo quinto aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico tendo uma sequência escolhida do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 16 a 23.
Em um décimo sexto aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo pelo menos a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO. 7 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma, um constru- to de ácido nucleico ou vetor compreendendo a mesma e micro-organismos que compreendem o referido ácido nucleico ou construto de ácido nucleico ou vetor.
Em um décimo sétimo aspecto, a invenção proporciona um áci- do nucleico o qual codifica uma metiltransferase de acordo com SEQ ID NO. 28.
Em um décimo oitavo aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo escolhido dos grupos listados nas Tabelas 7 a 10 aqui depois e variantes funcionalmente equiva- lentes de qualquer uma ou mais das mesmas.
Em um décimo nono aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico escolhido dos grupos listados nas Tabelas 7 a 10 aqui depois e variantes funcionalmente equivalentes de qualquer uma ou mais das mesmas.
Em um vigésimo aspecto, a invenção proporciona construtos e micro-organismos compreendendo um ácido nucleico dos décimo oitavo ou décimo nono aspectos da invenção.
Em um vigésimo primeiro aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico tendo uma sequência escolhida do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 32 a 38 e 123 a 135.
Em um vigésimo segundo aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um polipeptí- deo escolhido dos grupos listados nas Tabelas 7 a 10 aqui depois e varian- tes funcionalmente equivalentes de qualquer uma ou mais das mesmas.
A invenção pode também ser referido amplamente como consis- tindo nas partes, elementos e características referidos ou indicados no rela- tório descritivo do pedido, individual ou coletivamente, em qualquer ou todas as combinações de duas ou mais das referidas partes, elementos ou carac- terísticas e, onde números inteiros específicos são mencionados aqui, os quais têm equivalentes conhecidos na técnica à qual a invenção se refere, tais equivalentes conhecidos são considerados como sendo incorporados aqui como se individualmente apresentados.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Estes e outros aspectos da presente invenção, os quais deverão ser considerados em todos os seus novos aspectos, serão evidentes a partir da descrição a seguir, a qual é fornecida a título de exemplo apenas, com referência às Figuras anexas, nas quais:
A Figura 1 mostra a via de biossíntese de butanol a partir de CO.
A Figura 2 mostra um plasmídeo de expressão de genes de co- dificação exemplificativos envolvidos na biossíntese de 1-butanol.
A Figura 3 mostra os resultados de sequenciamento de pM- TL85245-thlA-crt-hbd, os quais demonstram que os genes de biossíntese de 1-butanol encontrados no plasmídeo de expressão estavam livres de muta- ções.
As Figuras 4a, 4b e 4c mostram um alinhamento de nucleotídeos de C. autoethanogenum (CAU), C. Ijungdahlii (CLJ), C. ragsdalei (CRA) e os genes de metiltransferase concebidas (DMT).
A Figura 4d mostra um alinhamento de aminoácidos das metil- transferases de C. autoethanogenum (CAU 1+2), C. Ijungdahlii (CLJ), C. ragsdalei (CRA1+2) e a metiltransferase concebida (DMT).
A Figura 5 mostra um plasmídeo de metilação exemplificative da invenção.
A Figura 6 mostra uma imagem de eletroforese em gel de aga- rose do DNA de plasmídeo isolado. Fileiras 1,6, 11, 16, 21 e 26 mostram Ladder de Plus DNA de 100 bp. Fileira 2-5 mostram PCR com mistura de plasmídeo metilado original como modelo na seguinte ordem: ermB, ColE1, thIA, crt. Fileiras 7-10, 12-15, 17-20, 22-25 e 27-30 mostram PCR com plas- mídeos isolados de 4 clones diferentes como modelo, cada um na seguinte ordem: ermB, ColE1, thIA, crt. Fileiras 32-35 mostram plasmídeo prep de 4 clones diferentes. Fileira 36 mostra plasmídeo prep de C. autoethanogenum DSM23693 original.
A Figura 7 mostra os resultados de HPLC mostrando a produção de 1-butanol com C. autoethanogenum abrigando o plasmídeo de butanol pMTL85245-thlA-CRT-hbd.
A Figura 8 mostra uma análise de expressão de mais de 200 genes durante uma fermentação típica com Clostrídium autoethanogenum em condições convencionais usando PCR em tempo real para identificar regiões promotoras adequadas para a expressão de genes heterólogos.
A Figura 9 mostra a sequência de SEQ ID NOs. 1, 2 e 3.
A Figura 10 mostra a sequência de SEQ ID NOs. 4, 5 e 6.
A Figura 11 mostra a sequência de regiões promotoras codifica- das por SEQ ID NOs. 7, 47, 48, 49 e 50.
A Figura 12 mostra a sequência de SEQ ID NO. 14.
A Figura 13 mostra a sequência de SEQ ID NO. 15.
A Figura 14 mostra a sequência de SEQ ID NOs. 24 e 25.
A Figura 15 mostra a sequência de SEQ ID NO. 26.
A Figura 16 mostra a sequência de SEQ ID NO. 27.
A Figura 17 mostra a sequência de SEQ ID NO. 28.
A Figura 18 mostra a sequência de SEQ ID NO. 29.
A Figura 19 mostra o gene de rRNA 16s de C. autoethanogenum (Y18178, Gl: 7271109)
As Figuras 20 e 21 mostram a sequência de SEQ ID NO. 31.
A Figura 22 mostra Seq. ID 39: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeído bifuncional de C. autoethanogenum.
A Figura 23 mostra Seq. ID 40: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeído bifuncional de C. autoethanogenum.
A Figura 24 mostra Seq. ID 41: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. autoethanogenum e Seq. ID 42: se- quência de aminoácidos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. autoetha- nogenum.
A Figura 25 mostra Seq. ID 43: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. autoethanogenum e Seq. ID 44: se- quência de aminoácidos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. autoetha- nogenum.
A Figura 26 mostra Seq. ID 45: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. autoethanogenum.
A Figura 27 mostra Seq. ID 46: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. autoethanogenum e Seq. ID 119: se- quência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanoge- num.
A Figura 28 mostra Seq. ID 120: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum e Seq. ID 121: sequên- cia de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum.
A Figura 29 mostra Seq. ID 122: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum e Seq. ID 51: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum.
A Figura 30 mostra Seq. ID 52: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum e Seq. ID 53: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum.
A Figura 31 mostra Seq. ID 54: Sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum e Seq. ID 55: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum.
A Figura 32 mostra Seq. ID 56: Sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum e Seq. ID 57: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum.
A Figura 33 mostra Seq. ID 58: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. autoethanogenum e Seq. ID 59: sequência de nucleotídeos de acetil/butiril transferase de fosfato de C. autoethanoge- num e Seq. ID 60: sequência de aminoácidos de acetil/butiril transferase de fosfato de C. autoethanogenum.
A Figura 34 mostra Seq. ID 61: sequência de nucleotídeos de quinase de acetato/butirato de C. autoethanogenum e Seq. ID 62: sequência de aminoácidos de quinase de acetato/butirato de C. autoethanogenum.
A Figura 35 mostra Seq. ID 63: sequência de nucleotideos de ó- xido-redutase de aldeido:ferredoxina de C. autoethanogenum e Seq. ID 64: sequência de aminoácidos de óxido-redutase de aldeido:ferredoxina de C. autoethanogenum.
A Figura 36 mostra Seq. ID 65: sequência de nucleotideos de ó- xido-redutase de aldefdo:ferredoxina de C. autoethanogenum e Seq. ID 66: sequência de aminoácidos de óxido-redutase de aldeido:ferredoxina de C. autoethanogenum.
A Figura 37 mostra Seq. ID 67: sequência de nucleotideos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeido bifuncional de C. Ijungdahlii
A Figura 38 mostra Seq. ID 68: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeido bifuncional de C. Ijungdahlii
A Figura 39 mostra Seq. ID 69: sequência de nucleotideos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeido bifuncional de C. Ijungdahlii
A Figura 40 mostra Seq. ID 70: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeido bifuncional de C. Ijungdahlii e Seq. ID 71: sequência de nucleotideos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. Ijungdahlii.
A Figura 41 mostra Seq. ID 72: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. Ijungdahlii e Seq. ID 73: sequência de nucleotideos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. Ijungdahlii e Seq. ID 74: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butiraldeído de C. Ijungdahlii.
A Figura 42 mostra Seq. ID 75: sequência de nucleotideos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 76: sequência de ami- noácidos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 77: se- quência de nucleotideos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii.
A Figura 43 mostra Seq. ID 78: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 79: sequência de nu- cleotideos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 80: se- quência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii.
A Figura 44 mostra Seq. ID 81: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 82: sequência de ami- noácidos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 83: se- quência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii.
A Figura 45 mostra Seq. ID 84: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. Ijungdahlii e Seq. ID 85: sequência de nu- cleotídeos de acetil/butiril transferase de fosfato de C. Ijungdahlii e Seq. ID 86: sequência de aminoácidos de acetil/butiril transferase de fosfato de C. Ijungdahlii e Seq. ID 87: sequência de nucleotídeos de quinase de aceta- to/butirato de C. Ijungdahlii.
A Figura 46 mostra Seq. ID 88: sequência de aminoácidos de quinase de acetato/butirato de C. Ijungdahlii e Seq. ID 89: sequência de nu- cleotídeos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. Ijungdahlii e Seq. ID 90: sequência de aminoácidos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. Ijungdahlii.
A Figura 47 mostra Seq. ID 91: sequência de nucleotídeos de ó- xido-redutase de aldeídoíerredoxina de C. Ijungdahlii e Seq. ID 92: sequên- cia de aminoácidos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. Ijungda- hlii.
A Figura 48 mostra Seq. ID 93: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeído bifuncional de C. ragsdalei
A Figura 49 mostra Seq. ID 94: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeído bifuncional de C. ragsdalei
A Figura 50 mostra Seq. ID 95: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeído bifuncional de C. ragsdalei.
A Figura 51 mostra Seq. ID 96: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol/butiraldeído bifuncional de C. ragsdalei e Seq. ID 97: sequência de nucleotídeos de desidrogenase de butiraldeído de C. rags- dalei.
A Figura 52 mostra Seq. ID 98: sequência de aminoácidos de desidrogenase de butiraldeído de C. ragsdalei-, Seq. ID 99: sequência de nucleotídeos de desidrogenase de butiraldeído de C. ragsdalei e Seq. ID 100: sequência de aminoácidos de desidrogenase de butiraldeído de C. ragsdalei.
A Figura 53 mostra Seq. ID 101: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 102: sequência de ami- noácidos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 103: se- quência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei.
A Figura 54 mostra Seq. ID 104: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 105: sequência de nu- cleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 106: se- quência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei:
A Figura 55 mostra Seq. ID 107: sequência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 108: sequência de ami- noácidos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 109: se- quência de nucleotídeos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei.
A Figura 56 mostra Seq. ID 110: sequência de aminoácidos de de-hidrogenase de butanol de C. ragsdalei e Seq. ID 111: sequência de nu- cleotídeos de acetil/butiril transferase de fosfato de C. ragsdalei e Seq. ID 112: sequência de aminoácidos de acetil/butiril transferase de fosfato de C. ragsdalei e Seq. ID 113: sequência de nucleotídeos de quinase de aceta- to/butirato de C. ragsdalei.
A Figura 57 mostra Seq. ID 114: sequência de aminoácidos de quinase de acetato/butirato de C. ragsdalei e Seq. ID 115: sequência de nu- cleotídeos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. ragsdalei e Seq. ID 116: sequência de aminoácidos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. ragsdalei.
A Figura 58 mostra Seq. ID 117: sequência de nucleotídeos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. ragsdalei e Seq. ID 118: se- quência de aminoácidos de óxido-redutase de aldeído:ferredoxina de C. ragsdalei.
A Figura 59 mostra SEQ ID 136: o gene de rRNA 16s de Clostri- dium Ijungdahlii (CP001666.1, Gl: 300433347).
A Figura 60 mostra o padrão de expressão gênica de (A) de-
hidrogenase de butiraldeido/butanol bifuncional (Seq ID 39); (B) de- hidrogenase de butiraldeído (SEQ ID 41); (C) de-hidrogenase de butiraldeído (SEQ ID 45); (D) de-hidrogenase de butanol (SEQ ID 53); (E) de- hidrogenase de butanol (SEQ ID 57); (F) acetil/butiril transferase de fosfato (SEQ ID 57); (G), quinase de acetato/butirato (SEQ ID 59); (H) óxido- redutase de aldeidorferredoxina (SEQ ID 63); (I) óxido-redutase de aldei- do.ferredoxina (SEQ ID 65).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O seguinte é uma descrição da presente invenção, incluindo modalidades preferidas da mesma, fornecidas em termos gerais. A invenção é ainda elucidada a partir da descrição fornecida sob o cabeçalho "Exem- plos" aqui abaixo, os quais fornecem dados experimentais que apoiam a in- venção, exemplos específicos de vários aspectos da invenção e meios de realização da invenção.
Dentre outros, os micro-organismos estreitamente relacionado C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii e C. ragsdalei são conhecidos por serem úteis para a produção de etanol como biocombustível a partir de monóxido de carbono. A fim de produzir 1-butanol como um biocombustível a partir de um substrato gasoso, um sistema de transformação universal para estes organismos foi desenvolvido e produção de 1-butanol como o principal pro- duto de fermentação a partir de CO foi demonstrada.
Os inventores descobriram que, quando os genes particulares que codificam proteínas na via de biossíntese de 1-butanol (Figura 1) foram introduzidos em micro-organismos acetogênicos, estes micro-organismos foram capazes de usar um substrato gasoso para produzir 1-butanol ou um precursor do mesmo como o principal produto da fermentação. Embora al- guns micro-organismos não modificados sejam conhecidos por produzir 1- butanol, o rendimento de 1-butanol a partir de CO produzido por estes micro- organismos não modificados é muito baixo. Como um resultado, sua utilida- de para a produção de biocombustíveis a partir de substratos gasosos é ex- tremamente limitada em virtude de sua baixa eficiência e subsequente falta de viabilidade comercial. Clostridium autoethanogenum produz naturalmente etanol, acetato, 2,3-butanodiol e ácido láctico, mas não é conhecido pela produção de 1-butanol.
Conforme mostrado na Figura 1, a via de Wood-Ljungdahl con- verte CO em acetil-CoA. Este composto pode ser posteriormente convertido em 1-butanol em micro-organismos acetogênicos pela ação das enzimas tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, crotonase/hidratase de cro- tonil-CoA, de-hidrogenase de butiril-CoA, de-hidrogenase de butiraldeído e de-hidrogenase de butanol. Em uma modalidade particular da invenção, o micro-organismo expressa as primeiras quatro enzimas, as quais podem ser codificadas pelos ácidos nucleicos SEQ ID NOs. 1 a 4 ou variantes funcio- nalmente equivalentes das mesmas. A presente invenção fornece um micro- organismo que facilita a conversão de acetil-CoA em 1-butanol pela ação de enzimas codificadas por ácidos nucleicos recombinantes, bem como enzi- mas que ocorrem naturalmente. A invenção também proporciona o uso de micro-organismos que expressam outras sequências de ácido nucleico re- combinantes, as quais codificam enzimas em outros estágios nas vias de biossíntese de butanol ou Wodd-Ljungdahl. Os inventores também identifica- ram uma série de novas enzimas e ácidos nucleicos.
Uma vez que não há uma competência natural (absorção de DNA extracelular a partir do ambiente da célula) conhecida em Clostridia, eletrotransformação ou conjugação são os únicos métodos disponíveis para transformação. Estas questões representam dificuldades significativas na transformação eficaz de espécies Clostridium. Adicionalmente, os sistemas de restrição/metilação encontrados em Clostridia protegem contra DNA es- tranho e de fago e resultam em sua transformação genética sendo particu- larmente problemática. Foi mostrado que transformação de várias cepas de Clostridium (C. acetobutylicum ATCC824, C. cellulolyticum ATCC35319, C. botulinum ATCC25765 e C. difficile CD3 e CD6) é possível somente se o DNA é metilado in vivo em E. coli ou metilado in vitro em um padrão especí- fico antes de transformação (Memelstein et al., 1993; Herbert et al., 2003; Jennert et al., 2000; Davis et al., 2000). No entanto, a determinação do pa- drão correto de metilação muitas vezes não é possível em virtude de exohu- cleases inespecificas, etc. Adicionalmente, muitas espécies de Clostridium também possuem sistemas de restrição os quais digerem o DNA que é meti- lado em uma posição específica ("errado”).
Os principais obstáculos mencionados acima foram superados pelos inventores no desenvolvimento dos micro-organismos recombinantes da presente invenção. Um sistema de metilação inovador compreendendo um novo gene de metitransferase foi desenvolvido para contornar as barrei- ras de restrição que ocorrem naturalmente presentes em micro-organismos acetogênicos nativos. Consequentemente, o método de metilação e gene de metiltransferase da presente invenção podem ser aplicados a uma série de micro-organismos compatíveis que possuem barreiras que impedem a intro- dução e expressão eficazes de ácidos nucleicos recombinantes desejáveis em micro-organismos.
Definições
Conforme referido aqui, "precursores de 1-butanol" incluem buti- ril-CoA, butiril-fosfato, butirato e butiraldeído.
Conforme referido aqui, um "caldo de fermentação" é um meio de cultura compreendendo pelo menos meios nutrientes e células bacteria- nas.
Conforme referido aqui, um "micro-organismo de transporte" é um micro-organismo no qual uma enzima metiltransferase é expressa e é distinto do micro-organismo de destino.
Conforme referido aqui, um "micro-organismo de destino" é um micro-organismo no qual os genes incluídos no construto de expressão são expressos e é distinto do micro-organismo de transporte.
Conforme referido aqui, o termo "principal produto de fermenta- ção" se destina a significar o primeiro produto de fermentação o qual é pro- duzido em maior concentração e/ou rendimento.
Os termos "aumento da eficiência", "eficiência aumentada" e si- milares, quando usados em relação a um processo de fermentação incluem, porém sem limitações, aumento de um ou mais da taxa de crescimento de micro-organismos que catalisam a fermentação, o volume do produto dese- jado (tais como álcoois) produzido por volume de substrato (tal como açúcar) consumido, a taxa de produção ou o nível de produção do produto desejado e a proporção relativa do produto desejado produzido comparado com outros subprodutos da fermentação.
A frase "substrato que compreende monóxido de carbono" e termos similares deverão ser entendidos como incluindo qualquer substrato no qual monóxido de carbono está disponível para uma ou mais cepas de bactérias para crescimento e/ou fermentação, por exemplo.
A frase "substrato gasoso que compreende monóxido de carbo- no" e frases e termos similares incluem qualquer gás o qual contém um nível de monóxido de carbono. Em determinadas modalidades, o substrato con- tém pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO em volume, de 20% a 70% de CO em volume, de 30% a 60% de CO em volume e de 40% a 55% de CO em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende cerca de 25% ou cerca de 30% ou cerca de 35% ou cerca de 40% ou cerca de 45% ou cerca de 50% de CO ou cerca de 55% de CO ou cerca de 60% de CO em volume.
Embora não seja necessário que o substrato contenha qualquer de hidrogênio, a presença de H2 não deverá ser prejudicial para a formação do produto de acordo com os métodos da invenção. Em modalidades parti- culares, a presença de hidrogênio resulta em uma eficiência global aumen- tada de produção de álcool. Por exemplo, em modalidades particulares, o substrato pode compreender uma proporção aproximada de H2:CO de 2:1 ou 1:1 ou 1:2 Em uma modalidade, o substrato compreende cerca de 30% ou menos de H2em volume, 20% ou menos de H2 em volume, cerca de 15% ou menos de H2 em volume ou cerca de 10% ou menos de H2 em volume. Em outras modalidades, a corrente de substrato compreende baixas concen- trações de H2, por exemplo, menos de 5% ou menos de 4% ou menos de 3% ou menos de 2% ou menos de 1% ou é substancialmente livre de hidro- gênio. O substrato também pode conter algum CO2, por exemplo, tal como cerca de 1 % a cerca de 80% de CO2 em volume ou 1 % a cerca de 30% de CO2 em volume. Em uma modalidade, o substrato compreende menos de ou igual a cerca de 20% de CO2 em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende menos de ou igual a cerca de 15% de CO2 em volu- me, menos de ou igual a cerca de 10% de CO2 em volume, menos de ou igual a cerca de 5% de CO2 em volume ou substancialmente nenhum CO2.
Na descrição a qual segue, modalidades da invenção são descri- tas em termos de distribuição e fermentação de um "substrato gasoso con- tendo CO". No entanto, deverá ser notado que 0 substrato gasoso pode ser fornecido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato gasoso contendo CO pode ser fornecido dissolvido em um líquido. Essencialmente, um líquido é saturado com um gás contendo monóxido de carbono e, então, este líqui- do é adicionado ao biorreator. Isto pode ser obtido usando uma metodologia padrão. A título de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas (Hen- sirisak et al., Scale-Up of Microbubble Dispersion Generator For Aerobic Fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Número 3 / Outubro de 2002) poderia ser usado. A título de exemplo adicional, 0 substrato gasoso contendo CO pode ser adsorvido sobre um suporte sólido. Tais métodos alternativos são abrangidos pelo uso do termo "substrato con- tendo CO" e similares.
Em modalidades particulares da invenção, o substrato gasoso contendo CO é um gás ou efluente residual ou industrial. "Gás ou efluente residual ou industrial" deve ser tomado de forma ampla para incluir qualquer gás compreendendo CO produzido por um processo industrial e incluem ga- ses produzidos como um resultado da fabricação de produtos de metal fer- roso, fabricação de produtos não-ferrosos, processos de refino de petróleo, gaseificação de carvão, gaseificação de biomassa, produção de energia elé- trica, produção de negro de fumo e fabricação de coque. Outros exemplos podem ser fornecidos aqui em outra parte.
A menos que o contexto venha a requerer de outra forma, as frases "fermentação", "processo de fermentação" ou "reação de fermenta- ção" e similares, conforme usado aqui, se destinam a abranger a fase de crescimento e a fase de biossíntese de produto do processo. Conforme será descrito em maiores detalhes a seguir, em algumas modalidades, o biorrea- tor pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo rea- tor de fermentação. Como tal, a adição de metais ou composições a uma reação de fermentação deve ser entendida como incluindo a adição a um ou ambos estes reatores.
O termo "biorreator" inclui um dispositivo de fermentação que consiste em um ou mais vasos e/ou torres ou configuração de tubulação, a qual inclui o Reator de Tanque Agitado Contínuo (Continuous Stirred Tank Reactor - CSTR), Reator de Células Imobilizadas (Immobilized Cell Reactor - ICR), Reator de Leito de Gotejamento (Trickle Bed Reator - TBR), Coluna de Bolhas, Fermentador por Elevação a Gás, Misturador Estático ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para contato gás-líquido. Conforme é ainda descrito aqui depois, em algumas modalidades, o biorreator pode compre- ender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermenta- ção. Como tal, quando de referência à adição de substrato ao biorreator ou reação de fermentação, isto deverá ser entendido como incluindo a adição a um ou ambos destes reatores, onde apropriado. "Ácidos nucleicos exógenos" são ácidos nucleicos os quais se originam fora do micro-organismo no qual eles são introduzidos. Ácidos nu- cleicos exógenos podem ser derivados de qualquer fonte apropriada incluin- do, porém sem limitações, o micro-organismo no qual eles têm de ser intro- duzidos, cepas ou espécies de micro-organismos que diferem do organismo no qual elas devem ser introduzidas ou eles podem ser criados artificial ou recombinante. Em uma modalidade, os ácidos nucleicos exógenos represen- tam sequências de ácidos nucleicos presentes naturalmente no micro- organismo no qual elas têm de ser introduzidas e eles são introduzidos para aumentar a expressão ou superexpressão de um gene em particular (por exemplo, mediante aumento do número de cópias da sequência (por exem- plo, um gene)). Em outra modalidade, os ácidos nucleicos exógenos repre- sentam sequências de ácido nucleico não naturalmente presentes dentro do micro-organismo no qual eles devem ser introduzidos e permitem a expres- são de um produto não naturalmente presente no micro-organismo ou ex- pressão aumentada de um gene nativo ao micro-organismo (por exemplo, no caso de introdução de um elemento regulador, tal como um promotor). O ácido nucleico exógeno pode ser adaptado para se integrar no genoma do micro-organismo no qual ele tem de ser introduzido ou permanecer em um estado extra-cromossômico.
Será apreciado que a invenção pode ser praticada usando áci- dos nucleicos cuja sequência difere das sequências especificamente exem- plificadas aqui, contanto que eles desempenhem substancialmente a mesma função. Para sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína ou um peptídeo, isto significa que a proteína ou peptídeo codificado tem subs- tancialmente a mesma função. Para sequências de ácidos nucleicos que representam sequências promotoras, a sequência variante terá a capacida- de de promover a expressão de um ou mais genes. Tais ácidos nucleicos podem ser referidos aqui como "variantes funcionalmente equivalentes". A título de exemplo, variantes funcionalmente equivalentes de um ácido nucle- ico incluem variantes alélicas, fragmentos de um gene, genes os quais inclu- em mutações (deleção, inserção, substituições de nucleotídeos e similares) e/ou polimorfismos e similares. Genes homólogos de outras bactérias capa- zes de fermentação de ácido butírico ou butanol podem também ser consi- derados como exemplos de variantes funcionalmente equivalentes das se- quências especificamente exemplificadas aqui. Estes incluem os genes ho- mólogos em espécies tais como Clostridium acetobutylicum, Clostridium bei- jerinckii, Clostridium tetani, Clostridium pasteurianum, Clostridium kluyveri, Clostridium cellulovorans, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum cepa DSM10702, Clostridium tyrobutyricum cepa ATCC 25755, Anaerococcus prevotii DSM 20548, Thermoanaerobacter tengcongensis , Brachyspira pilosicoli, Bacillus megaterium, Streptococcus pyogenes e Clostridium saccharoperbutylacetonicum, cujos detalhes estão disponíveis ao público em sites tais como o Genbank ou NCBI. A frase "vari- antes funcionalmente equivalentes" também deve ser tomada para incluir ácidos nucleicos cuja sequência varia como um resultado de otimização de códons para um organismo particular. "Variantes funcionalmente equivalen- tes" de um ácido nucleico aqui terão, de preferência, pelo menos cerca de 70%, de preferência cerca de 80%, mais preferivelmente cerca de 85%, de preferência cerca de 90%, de preferência cerca de 95% ou mais de identida- de de sequência de ácido nucleico com o ácido nucleico identificado. Em uma modalidade particular, a variante funcionalmente equivalente do gene de tiolase, conforme definido aqui, pode ser o gene atoAB em E. coli (NC-000913.2; atoA = GenelD: 946719; atoB = GenelD: 946727). Variantes funcionalmente equivalentes do gene eftAB, conforme definido aqui, podem ser encontradas em Tsai e Saier (1995).
Será também apreciado que a invenção pode ser praticada u- sando polipeptídeos cuja sequência difere das sequências de aminoácidos especificamente exemplificadas aqui. Estas variantes podem ser referidas aqui como "variantes funcionalmente equivalentes". Uma variante funcional- mente equivalente de uma proteína ou um peptídeo inclui aquelas proteínas ou peptídeos que compartilham pelo menos 40%, de preferência 50%, de preferência 60%, de preferência 70%, de preferência 75%, de preferência 80%, de preferência 85%, de preferência 90%, de preferência 95% ou mais de identidade de aminoácidos com a proteína ou peptídeo identificado e tem substancialmente a mesma função que o peptídeo ou proteína de interesse. Tais variantes incluem, dentro de seu escopo, fragmentos de uma proteína ou um peptídeo, em que o fragmento compreende uma forma truncada do polipeptídeo, em que deleções podem ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 aminoácidos e podem se estender do resíduo 1 a 25 em cada término do polipeptídeo e em que deleções podem ser de qualquer comprimento dentro da região; ou podem estar em uma localização interna. Variantes funcional- mente equivalentes dos polipeptídeos específicos aqui também deve ser tomado para incluir polipeptídeos expressos por genes homólogos em outras espécies de bactérias, por exemplo, conforme exemplificado no parágrafo anterior. "Substancialmente a mesma função", conforme usado aqui, se destina a significar que o ácido nucleico ou polipeptídeo é capaz de desem- penhar a função do ácido nucleico ou polipeptídeo do qual ele é uma varian- te. Por exemplo, uma variante de uma enzima da invenção será capaz de catalisar a mesma reação que a enzima. No entanto, isso não deve ser to- mado como significando que a variante tem o mesmo nível de atividade que o polipeptídeo ou ácido nucleico do qual ela é uma variante.
Pode-se avaliar se uma variante funcionalmente equivalente tem substancialmente a mesma função que o ácido nucleico ou polipeptídeo do qual ela é uma variante usando qualquer número de métodos conhecidos. No entanto, a título de exemplo, os métodos descritos em Inui et al. (2008) podem ser usados para avaliar a atividade enzimática. "Superexpressar", "superexpressão" e termos e frases similares, quando usados em relação à invenção, deverão ser tomados de forma am- pla para incluir qualquer aumento na expressão de uma ou mais proteínas quando comparado com o nível de expressão da proteína de um micro- organismo parental sob as mesmas condições. Ele não deve ser tomado para significar que a proteína é expressa em qualquer nível particular.
Um "micro-organismo parental" é um micro-organismo usado pa- ra gerar um micro-organismo recombinante da presente invenção. O micro- organismo parental pode ser um que ocorre na natureza (isto é, um micro- organismo do tipo silvestre) ou um que tenha sido previamente modificado, mas o qual não expressa ou superexpressa uma ou mais das enzimas da presente invenção. Consequentemente, os micro-organismos recombinantes da presente invenção foram modificados para expressar ou superexpressar uma ou mais enzimas que não eram expressas ou superexpressas no micro- organismo parental.
Os termos "construtos de ácido nucleico" ou "vetores" e termos similares deverão ser tomados de forma ampla para incluir qualquer ácido nucleico (incluindo DNA e RNA) apropriado para uso como um veículo para transferir material genético para uma célula. Os termos deverão ser entendi- dos como incluindo plasmídeos, vírus (incluindo bacteriófagos), cosmídeos e cromossomos artificiais. Construtos ou vetores podem incluir um ou mais elementos reguladores, uma origem de replicação, um sítio de clonagem múltipla e/ou um marcador selecionável, dentre outros elementos, sítios e marcadores. Em uma modalidade particular, os construtos ou vetores são adaptados para permitir expressão de um ou mais genes codificados pelo construto ou vetor. Construtos de ácido nucleico ou vetores incluem ácidos nucleicos livres, bem como ácidos nucleicos formulados com um ou mais agentes para facilitar a distribuição a uma célula (por exemplo, ácido nuclei- co conjugado a lipossoma, um organismo no qual o ácido nucleico está con- tido).
Deverá ser notado que os ácidos nucleicos da invenção podem estar em qualquer forma adequada, incluindo RNA, DNA ou cDNA, incluindo ácidos nucleicos fita dupla e fita simples.
Em um aspecto, a invenção proporciona micro-organismos ge- neticamente modificados capazes de usar CO para produzir 1-butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação. O micro- organismo é, de preferência, um micro-organismo recombinante acetogênico que produz 1-butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação. Em uma modalidade particular, o micro-organismo recom- binante acetogênico é capaz de produzir 1-butanol ou um precursor do mesmo por meio de fermentação de um substrato que compreende CO em uma concentração maior do que aproximadamente de 1 mM ou 0,075 g/l de butanol por litro de caldo de fermentação.
Em uma modalidade particular, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos adaptados para expressar ou super- expressar uma ou mais enzimas na via de biossíntese de butanol. Em uma modalidade, o micro-organismo é adaptado para expressar uma ou mais enzimas na via de biossíntese de butanol que não estão naturalmente pre- sentes no micro-organismo parental do qual ele é derivado ou superexpres- sar uma ou mais enzimas na via de biossíntese de butanol que estão natu- ralmente presentes no micro-organismo parental.
O micro-organismo pode ser adaptado para expressar ou super- expressar uma ou mais enzimas por meio de qualquer número de métodos recombinantes incluindo, por exemplo, aumento de expressão de genes na- tivos dentro do micro-organismo (por exemplo, mediante introdução de um promotor forte ou constitutivo para disparar a expressão de um gene), au- mento do número de cópias de um gene que codifica uma enzima em parti- cular mediante introdução de ácidos nucleicos exógenos que codificam e adaptados para expressar a enzima, introdução de um ácido nucleico exó- geno que codifica e adaptado para não expressar uma enzima naturalmente presente no micro-organismo parental.
Em determinadas modalidades, o micro-organismo parental po- de ser transformado para proporcionar uma combinação de expressão au- mentada ou superexpressão de um ou mais genes nativos ao micro- organismo parental e introdução de um ou mais genes que não são nativos ao micro-organismo parental.
De preferência, o micro-organismo compreende um ou mais áci- dos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais das enzimas escolhidas do grupo que consiste em: tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA; Crotonase/hidratase de crotonil-CoA; de-hidrogenase de butiril-CoA; Flavo- proteína A de Transferência de Elétrons; e Flavoproteína B de Transferência de Elétrons. Em uma modalidade, o um ou mais ácidos nucleicos que codifi- cam uma ou mais enzimas são escolhidos dentre ácidos nucleicos de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 6 ou variantes funcionalmente equivalentes das mesmas.
Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante é adap- tado para expressar um ou mais dos genes os quais codificam as enzimas tiolase (nomenclatura de enzima no IUBMB EC: 2.3.1.9) (thIA), de- hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA (EC: 1.1.1.157) (hbd), crotona- se/hidratase de crotonil-CoA (EC: 1.1.1.157) (crt ou cch) e/ou de- hidrogenase de butiril-CoA (EC4.2.1.55) (bed). Em uma modalidade, o micro- organismo é adaptado para expressar todas estas enzimas. Em outra moda- lidade, os genes que correspondem a uma ou mais das sequências de ácido nucleico selecionadas de SEQ ID NOs. 1 a 4 ou variantes funcionalmente equivalentes das mesmas. O micro-organismo recombinante da invenção também pode conter duas proteínas de transferência de elétrons. Em uma modalidade, as proteínas de transferência de elétrons são flavoproteínas de transferência de elétrons (EC1.3.99.2) (etfAB) codificadas por SEQ ID NOs. 5 e 6 ou variantes funcionalmente equivalentes das mesmas. O uso destas flavoproteínas de transferência de elétrons aumenta a eficiência do micro- organismo em produzir 1-butanol. As flavoproteínas proporcionam um com- plexo estável que é necessário para atividade de Bed.
Em uma modalidade particular, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam cada uma de tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril- CoA, Flavoproteína de Transferência de Elétrons A e Flavoproteína de Transferência de Elétrons B.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende um plas- mídeo que codifica uma ou mais ou, de preferência, cada uma de tiolase, de- hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril- CoA, Flavoproteína de Transferência de Elétrons A e Flavoproteína de Transferência de Elétrons B.
Em uma modalidade ou alternativamente, o micro-organismo compreende ainda ácidos nucleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais das enzimas escolhidas do grupo que consiste em: fosfotrans- butirilase; quinase de butirato; óxido-redutase de aldeído dependente de fer- redoxina (ou, em outras palavras, óxido-redutase de aldeídoíerredoxina); de-hidrogenase de butiraldeído; de-hidrogenase de butanol; uma de- hidrogenase de butiraldeído/de-hidrogenase de butanol bifuncional.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende ácidos nu- cleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e uma de-hidrogenase de buti- raldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional. De preferência, o micro- organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codifi- cam uma ou mais de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e uma de-hidrogenase de butiraldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende ácidos nu- cleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais de fosfotransbutiri- lase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredo- xina e de-hidrogenase de butanol. De preferência, o micro-organismo com- preende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais de fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído de- pendente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol. Em modalidades par- ticulares, o micro-organismo compreende ácidos nucleicos exógenos adap- tados para expressar cada uma de fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos adequados para expressar pelo menos duas das en- zimas na via de biossíntese de 1-butanol, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, em menos 8, pelo menos 9, pelo me- nos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 das enzimas.
Em uma modalidade, o micro-organismo compreende ainda um promotor de quinase de acetato/fosfotransacetilase, embora possam ser u- sados outros promotores. De preferência, o promotor corresponde à SEQ ID NO. 7 ou uma variante funcionalmente equivalente à mesma. De preferên- cia, o promotor está contido em um construto que codifica uma ou mais das enzimas aqui antes mencionadas.
De preferência, o micro-organismo parental é selecionado do grupo de bactérias acetogênicas carboxitróficas. Em determinadas modali- dades, o micro-organismo é selecionado do grupo que compreende Clostri- dium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clos- tridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyri- bacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woo- dii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii e Thermoa- naerobacter kiuvi.
Em uma modalidade particular, o micro-organismo parental é se- lecionado dentre o grupo de Clostridia etanologênicos, acetogênicos com- preendendo a espécie C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii e C. ragsdalei e isolados relacionados. Estes incluem, porém sem limitações, cepas de C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) [Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clos- tridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351], C. autoe- thanogenum LBS1560 (DSM19630) [Simpson SD, Forster RL, Tran PT, Ro- we MJ, Warner IL: Novel bacteria and methods thereof. Patente International 2009, WO/2009/064200], C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. Ijungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) [Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium Ijungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236], C. Ijungdahlii ERI- 2 (ATCC 55380) [Gaddy JL: Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases. Patente US 1997, 5.593.886], C. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) [Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparati- on of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. Patente US, 2002, 6.368.819], C. Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989) [Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. Patente US, 2002, 6.368.819], C. ragsdalei P11T (ATCC BAA-622) [Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. Patente International 2008, WO 2008/028055], isolados relaciona- dos, tais como "C. coskatii" [Zahn JA, Saxena J, Do Y, Patel M, Fishein S, Datta R, Tobey R: Clostridium coskatii, sp. nov., an Anaerobic Bacterium that Produces Ethanol from Synthesis Gas. Poster SIM Annual Meeting and E- xhibition, San Francisco, 2010] ou cepas com mutação, tais como C. Ijung- dahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium Ijungdahlii. Tese de PhD, North Carolina State Uni- versity, 2010). Estas cepas formam um subgrupo dentro do agrupamento I de rRNA Clostridial e seu gene de rRNA 16s é mais de 99% idêntico, com um baixo teor similar de GC de cerca de 30%. No entanto, re-associação DNA-DNA e experimentos de caracterização de perfil de DNA mostraram que estas cepas pertencem à espécies distintas [Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. Pa- tente International 2008, WO 2008/028055],
Todas as espécies deste agrupamento têm uma morfologia e tamanho (células em crescimento logarítmico entre 0,5-0,7 x 3-5 μm) simila- res, são mesofílicas (temperatura de crescimento ótima entre 30-37 °C) e estritamente anaeróbicas [Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium Ijung- dahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostri- dium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces e- thanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. Patente International 2008, WO 2008/028055], Além disso, todas elas compartilham os mesmos principais traços filogenéticos, tais como mesma faixa de pH (pH de 4-7,5, com um pH inicial ótimo de 5,5-6), forte crescimento autotrófico sobre gases contendo CO com taxas de crescimento similares e um perfil metabólico similar, com etanol e ácido acético como principais produtos finais de fermentação e pequenas quantidades de ácido 2,3-butanodiol e ácido láctico formadas sob determinadas condições [Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium Ijungdahlii sp. nov., an Acetogenic Speci- es in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232- 236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. Patente International 2008, WO 2008/028055]. Foi observada produção de indola com todas as três espé- cies. No entanto, as espécies diferenciam quanto à utilização de substrato de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por exemplo, arginina, histidina) ou outros substratos (por exemplo, betaína, butanol). Além disso, descobriu-se que algumas das espécies são auxotróficas para determinadas vitaminas (por exemplo, tiamina, biotina), enquanto que outras não.
Em uma modalidade, o micro-organismo produz fosfotransbutiri- lase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredo- xina e de-hidrogenase de butanol, tanto antes quanto após introdução de um ácido nucleico exógeno.
Em uma modalidade, o micro-organismo produz de-hidrogenase de butiraldeído e/ou de-hidrogenase de butanol, tanto antes quanto após introdução de um ácido nucleico exógeno.
Em uma modalidade particular, o micro-organismo é Clostridium autoethanogenum DSM23693.
Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante da inven- ção tem as características que definem o micro-organismo depositado na DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha) sob o número de acesso DSM24138.
Os um ou mais ácidos nucleicos exógenos podem ser distribuí- dos a um micro-organismo parental como ácidos nucleicos livres ou podem ser formulados com um ou mais agentes para facilitar o processo de trans- formação (por exemplo, ácido nucleico conjugado a lipossoma, um organis- mo no qual o ácido nucleico está contido). Os um ou mais ácidos nucleicos podem ser DNA, RNA ou combinações dos mesmos, conforme apropriado.
Os micro-organismos da invenção podem ser preparados a partir de um micro-organismo parental e um ou mais ácidos nucleicos exógenos, usando qualquer número de métodos conhecidos na técnica para a produ- ção de micro-organismos recombinantes. A título apenas de exemplo, trans- formação (incluindo transdução ou transfecção) pode ser obtida por meio de eletroporação, conjugação ou competência química e natural. Técnicas de transformação adequadas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al., 1989.
Em determinadas modalidades, em virtude dos sistemas de res- trição os quais são ativos no micro-organismo a ser transformado, é neces- sário metilar o ácido nucleico a ser introduzido no micro-organismo. Isto po- de ser feito usando uma variedade de técnicas, incluindo aquelas descritas abaixo e adicionalmente exemplificadas na seção Exemplos aqui depois.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo as etapas a seguir: a. introdução, em um micro-organismo de transporte, de (i) um construto de expressão e (ii) um construto de metilação compreendendo um gene de metiltransferase; b. expressão do gene de metiltransferase; c. isolamento de um ou mais construtos do micro-organismo de transporte; e d. introdução de um ou mais construtos em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no organismo de destino.
Em uma modalidade, o gene de metiltransferase da etapa b é expresso constitutivamente. Em outra modalidade, expressão do gene de metiltransferase da etapa b é induzida.
O micro-organismo é um micro-organismo de transporte, de pre- ferência um micro-organismo restrição-negativo que facilita a metilação das sequências de ácidos nucleicos que compõem o construto de expressão. Em uma modalidade particular, o micro-organismo de transporte é um E. coli, Bacillus subtillis ou Lactococcus lactis restrição-negativo.
Uma vez que o construto de expressão e o construto de metila- ção são introduzidos no micro-organismo de transporte, o gene de metil- transferase presente no construto de metilação é expresso. Em uma modali- dade, onde expressão deve ser induzida, indução pode ser através de qual- quer sistema promotor adequado embora, em uma modalidade particular da invenção, o construto de metilação compreenda um promotor lac induzível (de preferência codificado por SEQ ID NO. 28) e é induzido mediante a adi- ção de lactose ou um análogo do mesmo, mais preferivelmente isopropil-β- tio-D-galactosídeo (IPTG). Outros promotores adequados incluem ara, tetou o sistema T7. Em uma modalidade alternativa da invenção, o promotor do construto de metilação é um promotor constitutivo.
Em uma modalidade, o promotor do construto de expressão é um promotor constitutivo que é, de preferência, altamente ativo sob condi- ções de fermentação adequadas. No entanto, um promotor de indução pode ser usado. Em modalidades preferidas, o promotor do construto de expres- são é selecionado do grupo que compreende promotor do óperon de buti- ril/acetil transferase de fosfato, óxido-redutase de piruvato:ferredoxina (SEQ ID NO. 48), o agrupamento gênico de Wood-Ljungdahl (SEQ ID NO. 47), óperon Rnf (SEQ ID NO. 49 ) ou o óperon de sintase ATP ((SEQ ID NO. 50). De preferência, o promotor do óperon de fosfotransacetylase/quinase de a- cetato corresponde à SEQ ID NO. NO. 7 ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma. A Figura 8 mostra que expressão de genes operati- vamente ligados a estes promotores têm um alto nível de expressão em Clostridium autoethanogenum sob condições padrões.
Em uma modalidade particular, o construto de metilação tem uma origem de replicação específica para a identidade do micro-organismo de transporte, de modo que quaisquer genes presentes no construto de me- tilação sejam expressos no micro-organismo de transporte. De preferência, o construto de expressão tem uma origem de replicação específica para a i- dentidade do micro-organismo de destino, de modo que quaisquer genes presentes no construto de expressão sejamexpressos no micro-organismo de destino.
Expressão da enzima metiltransferase resulta em metilação dos genes presentes no construto de expressão. O construto de expressão pode, então, ser isolado do micro-organismo de transporte de acordo com qualquer um de uma série de métodos conhecidos. A título apenas de exemplo, a me- todologia descrita na seção Exemplos a seguir pode ser usada para isolar o construto de expressão.
Em uma modalidade particular, ambos os construtos são simul- taneamente isolados. O construto de expressão pode ser introduzido no mi- cro-organismo de destino usando qualquer série de métodos conhecidos. No entanto, a título de exemplo, a metodologia descrita na seção Exemplos a seguir pode ser usada. Uma vez que o construto de expressão é metilado, as sequências de ácidos nucleicos presentes no construto de expressão po- dem ser incorporadas no micro-organismo de destino e expressas com su- cesso.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. metilação de um construto de expressão in vitro por uma me- tiltransferase, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 28 ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma; e b. introdução de um construto de expressão, de preferência de acordo com o quinto aspecto, em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no.
Considera-se que um gene de metiltransferase da invenção, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 27 ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma, pode ser introduzido em um micro-organismo de transporte e superexpresso. A enzima metiltransferase resultante pode ser coletada usando métodos conhecidos e usada in vitro para metilar um cons- truto de expressão, de preferência, o construto de expressão é conforme definido no quinto aspecto. O construto de expressão pode, então, ser intro- duzido no micro-organismo de destino para expressão. De preferência, o micro-organismo recombinante produz 1-butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de produção de um micro-organismo recombinante compreendendo: a. introdução, no genoma de um micro-organismo de transporte, de um gene de metiltransferase, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 27 ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma; b. introdução de um construto de expressão no micro-organismo de transporte; c. isolamento de um ou mais construtos do micro-organismo de transporte; e d. introdução de pelo menos um construto de expressão em um micro-organismo de destino; em que o construto de expressão compreende um ou mais ge- nes que codificam enzimas a serem expressas no micro-organismo de desti- no.
São usados métodos padrões para introdução de um gene de metiltransferase, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 27, no genoma do micro-organismo de transporte. A metiltransferase pode ser constitutiva- mente expressa pelo micro-organismo e resultar na produção de uma enzi- ma metiltransferase, de preferência de acordo com SEQ ID NO. 28 ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma. Um construto de expressão é metilado, isolado e introduzido no micro-organismo de destino o qual, de preferência, produz 1-butanol e/ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermentação.
A invenção também inclui micro-organismos compreendendo um gene de metiltransferase recombinante ou construto de metilação, conforme descrito aqui.
A presente invenção também proporciona um gene de metil- transferase híbrido (SEQ ID NO. 28) desenvolvido após análise de sequên- cias de ácidos nucleicos de metiltransferase e sistemas de barreira de restri- ção de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii e C. ragsdalei.
O gene de metiltransferase é expresso em um micro-organismo de transporte, o qual resulta na produção de uma enzima metiltransferase que metila a sequência do construto de expressão. O gene de metiltransfe- rase pode estar presente em um construto ou integrado no genoma do mi- cro-organismo de transporte. O gene de metiltransferase híbrido tem o có- don otimizado para E. coli e pode ser incorporado em um construto de meti- lação (Figura 5). O gene de metiltransferase pode ter o códon otimizado para uso em outra espécie de micro-organismo se for o caso, por exemplo, Bacil- lus subtilis. Métodos para otimização de códons são padrões e serão conhe- cidos por aqueles versados na técnica (Carbone et al., 2003). Também in- corporados dentro do âmbito da invenção são genes de metiltransferase que têm pelo menos 70%, de preferência 75%, de preferência 80%, de preferên- cia 85%, de preferência 90%, de preferência 95% ou mais de identidade de sequência de ácido nucleico à SEQ ID NO. 28 e expressam um polipeptídeo que é capaz de metilar DNA.
Será apreciado por aqueles versados na técnica que o método de metilação do gene de metiltransferase terá utilidade em uma variedade de micro-organismos. Em uma modalidade, o micro-organismo de destino é selecionado do grupo que compreende Clostridium autoethanogenum, Clos- tridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clos- tridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyribacterium limosum, Butyri- bacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii e Thermoanaerobacter kiuvi. Em uma modalidade particular, o micro-organismo de destino é selecionado do grupo que consiste Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii e Clostri- dium ragsdalei. Em uma modalidade particular, o micro-organismo de desti- no é Clostridium autoethanogenum DSM23693.
A invenção também fornece vários ácidos nucleicos ou constru- tos de ácido nucleico, conforme descrito nos aspectos 4, 5, 14, 15, 16, 18, 19 e 21 da invenção descritos aqui antes.
Em outra modalidade da invenção, há um construto de expres- são que compreende um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas escolhidas de tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril-CoA e uma proteína de transferência de elétrons ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas. De preferência, a proteína de transferência de elétrons é Flavoproteína A de Transferência de Elétrons ou Flavoproteína B de Transferência de Elétrons. Em uma modalidade particular, tanto Flavoproteína A de Transferência de Elétrons quanto Flavoproteína B de Transferência de Elétrons estão incluí- das no construto de expressão.
Informação de sequência exemplificativa para cada gene e en- zima equivalente é fornecida no GenBank, conforme detalhado na Tabela 1 aqui depois. Aqueles versados na técnica apreciarão prontamente genes e enzimas alternativos os quais podem ser usados. Em uma modalidade, as enzimas são codificadas pelo ácido nucleico SEQ ID NO. 1 a 6, o qual pode estar presente em qualquer ordem no construto ou na ordem mostrada na Figura 2. SEQ ID NO. 8 a 13 e NOS SEQ ID 16 a 23 são novas sequências usadas para clonar e sequenciar os genes mencionados no parágrafo imedi- atamente anterior.
A fim de obter 1-butanol a partir de um precursor, atividade de uma ou mais de de-hidrogenase de butiraldeído (EC 1.2.1.10), desidrogena- se de álcool (EC 1.1.1.1), fosfotransbutirilase (EC 2.3.1.19), quinase de buti- rato (EC 2.7.2.7), óxido-redutase de aldeídoíerredoxina (EC1.2.7.5) e desi- drogenase álcool (EC 1.1.1.1): 2,7 podem ser requeridas. A desidrogenase de álcool da invenção é uma de-hidrogenase de butanol. Em determinadas modalidades, de-hidrogenase de butiraldeído (EC 1.2.1.10) e desidrogenase de álcool (EC 1.1.1.1) ou fosfotransbutirilase (EC 2.3.1.19), quinase de buti- rato (EC 2.7.2.7), óxido-redutase de aldeído.ferredoxina (EC 1.2.7. 5) e desi- drogenase de álcool (EC 1.1.1.1) ou uma combinação de ambos os conjun- tos de enzimas é requerida. Em uma modalidade, a atividade de desidroge- nase de butiraldeído e de-hidrogenase de butanol é conferida por uma de- hidrogenase de butiraldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional. Estas diversas enzimas são mostradas na via de biossíntese de butanol ilustrada na Figura 1. Em alguns micro-organismos, de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol, fosfotransbutirilase, quinase de butirato e/ou óxi- do-redutase de aldeído: ferredoxina são naturalmente expressas pelo micro- organismo e, portanto, catalisam a conversão de butiril-CoA em 1-butanol.
Consequentemente, em uma modalidade, o construto de ex- pressão compreende ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de fosfo- transbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina, de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol e uma de-hidrogenase de butiraldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional, além de ou alternativamente a uma ou mais de tiolase, de-hidrogenase de 3- hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril-CoA e uma proteína de transferência de elétrons.
Exemplos de enzimas e aminoácidos apropriados e informação de sequência de ácido nucleico que incluem, porém sem limitações: de- hidrogenase de butiraldeído, tal como Aid de C. beijerinckii (ABR35947, Gl: 149905114), C. saccharobutylicum (CAQ57983, Gl: 189310620) ou Clostri- dium saccharoperbutylacetoniucm (AAP42563, Gl: 31075383); de- hidrogenase de butanol, tai como BdhB de C. acetobutylicum (NP_349891, Gl: 15896542); enzima bufuncional de-hidrogenase de butiraldeido/butanol, tai como AdhE1 de C. acetobutylicum (NP_149325, Gl: 15004865) ou AdhE2 de C. acetobutylicum (NP_149199, Gl: 15004739), C. beijerinckii (YP_001307449, Gl: 150015195); uma fosfotransbutirilase, tai como Ptb de C. acetobutylicum (NP_348368); quinase de butirato, tai como Buk de C. acetobutylicum (AAK81015.1); óxido-redutase de aldeído:ferredoxina AOR de C. acetobutylicum (NP_348637). Aqueles versados na técnica à qual a invenção se refere podem prontamente apreciar exemplos alternativos de enzimas adequadas para uso na invenção. Os inventores também identifica- ram uma série de novas enzimas e genes que podem ser usados na inven- ção, cujos detalhes são fornecidos aqui depois na seção Exemplos (em par- ticular, vide Tabelas 7 e 10). A invenção também abrange variantes funcio- nalmente equivalentes destas enzimas e genes e seu uso em métodos da invenção.
A inclusão de um ou mais deste genes pode ajudar a evitar a co- produção de butirato completamente, aumentando a eficiência de produção de 1-butanol. A invenção também proporciona micro-organismos recombi- nantes compreendendo um ou mais ácidos nucleicos adaptados para ex- pressar ou aumentar a expressão de uma ou mais destas enzimas.
Em uma modalidade, o(s) ácido(s) nucleico(s) codifica(m) uma enzima escolhida do grupo de enzimas listadas nas Tabelas 7 a 10 aqui de- pois e equivalentes funcionais de qualquer um ou mais dos mesmos. Em uma modalidade particular, os ácidos nucleicos são escolhidos do grupo de ácidos nucleicos nas Tabelas 7 a 10 aqui depois e equivalentes funcionais de qualquer um ou mais dos mesmos.
Em uma modalidade, o construto de expressão codifica pelo menos duas enzimas na via de biossíntese de butanol, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 das enzimas.
De preferência, o construto de expressão compreende ainda um promotor adequado, conforme descrito aqui anteriormente. Em uma modali- dade, o promotor é um promotor de butiril/acetil transferase de fosfato. De preferência, o promotor corresponde à SEQ ID NO. 7 ou uma variante fun- cionalmente equivalente da mesma.
Em uma modalidade preferida, o construto de expressão com- preende um ácido nucleico que codifica todas as referidas enzimas. Será apreciado por aqueles versados na técnica que o construto de expressão pode compreender ácidos nucleicos que codificam proteínas de transferên- cia de elétrons alternativas.
Os genes a serem expressos no micro-organismo recombinante podem ser montados no construto de expressão sob o controle de qualquer promotor adequado. Em uma modalidade particular, o promotor permite ex- pressão substancialmente constitutiva dos genes sob seu controle. Em uma modalidade particular, o promotor é um promotor de butiril/acetil transferase de fosfato (SEQ ID NO. 7). Outros promotores que podem encontrar uso na presente invenção incluem aqueles de C. autoethanogenum (ou C. Ijungda- hlii). Os inventores também identificaram uma série de outros promotores que estão operativamente ligados a genes que foram altamente expressos sob condições típicas de fermentação em Clostridium autoethanogenum (Fi- gura 8). Análise de expressão gênica sob mais de 200 condições de fermen- tação típicas usando PCR em tempo real identificou uma série de promoto- res apropriados. Estes incluem óxido-redutase de piruvatoíerredoxina (SEQ ID NO. 48), o agrupamento gênico de Wood-Ljungdahl (SEQ ID NO. 47), óperon Rnf (SEQ ID NO. 49) e óperon de sintase de ATP (SEQ ID NO. 50). Será apreciado por aqueles versados na técnica que outros promotores os quais podem dirigir a expressão, de preferência um alto nível de expressão sob condições apropriadas de fermentação, serão eficazes como alternati- vas às modalidades presentemente preferidas.
Em uma modalidade, a invenção compreende um construto, mi- cro-organismo recombinante ou uma sequência de ácido nucleico que com- preende ácido nucleico SEQ ID NOs. 1 a 6 na ordem mostrada na Figura 2. No entanto, será apreciado por aqueles versados na técnica que a invenção pode ainda ter a utilidade desejada quando as sequências de ácidos nuclei- cos são apresentadas em qualquer ordem e com uma ou mais das sequên- cias ausentes.
Em outra modalidade, a invenção compreende um ácido nuclei- co que compreende a sequência promotora representada por SEQ ID NO. 7 ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma, o construto compre- endendo o referido promotor e micro-organismos recombinantes compreen- dendo as mesmas.
Será apreciado que um construto de expressão da presente in- venção pode conter qualquer número de elementos reguladores, além do promotor, bem como genes adicionais adequados para expressão de outras proteínas, se desejado. Em uma modalidade, o construto compreende um promotor. Em outra modalidade, o construto compreende dois ou mais pro- motores. Em uma modalidade particular, o construto inclui um promotor para com cada gene a ser expresso. Em uma modalidade, o construto compreen- de um ou mais sítios de ligação ribossômica, de preferência, um sítio de li- gação ribossômica para cada gene a ser expresso.
Será apreciado por aqueles versados na técnica que as sequên- cias de ácidos nucleicos e sequências de construto definidas aqui podem conter nucleotideos ligantes convencionais, tais como aqueles requeridos para sítios de ligação ribossômica e/ou sítios de restrição. Tais sequências ligantes não devem ser interpretadas como sendo necessárias e não consti- tuem uma limitação nas sequências definidas.
Quando o construto de expressão da presente invenção é ex- presso em um micro-organismo acetogênico, o micro-organismo produz 1- butanol ou um precursor do mesmo como o principal produto de fermenta- ção. Considera-se que outros genes que codificam enzimas que catalisam diversas etapas das vias de biossíntese de butanol ou Wood-Ljungdahl tam- bém podem ser incorporados no construto de expressão de modo a produzir 1-butanol como principal produto de fermentação.
Considera-se que o construto de expressão e o construto de me- tilação, conforme definido acima, podem ser combinados para proporcionar uma composição de matéria. Tal composição tem utilidade particular ao con- tornar mecanismos de barreira de restrição em uma ampla variedade de mi- cro-organismos mas, em uma modalidade preferida, o micro-organismo re- combinante produzido usando a composição produz 1-butanol ou um pre- cursor do mesmo como o principal produto de fermentação.
Ácidos nucleicos e construtos de ácido nucleico, incluindo cons- trutos de expressão, da presente invenção podem ser construídos usando qualquer número de métodos padrões na técnica. Por exemplo, podem ser usadas técnicas de síntese química ou recombinantes. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al. (1989). Outras técnicas exempli- ficativas são descritas na seção Exemplos aqui depois. Essencialmente, os genes individuais e elementos reguladores serão operativamente ligados uns aos outros, de modo que os genes possam ser expressos para formar as proteínas desejadas. Vetores adequados para uso na presente invenção serão apreciados por aqueles versados na técnica. No entanto, a título de exemplo, os vetores a seguir podem ser adequados: vetores de transporte pMTL80000, plMP1 e pJIR750 e os plasmídeos exemplificados na seção Exemplos aqui depois.
Até o ponto em que a invenção proporciona novos ácidos nuclei- cos e vetores de ácidos nucleicos, ela também proporciona ácidos nucleicos os quais são capazes de hibridizar com pelo menos uma porção de um ácido nucleico descrito aqui, um ácido nucleico complementar a qualquer um dos mesmos ou uma variante funcionalmente equivalente de qualquer um dos mesmos. Tais ácidos nucleicos, de preferência, se hibridizarão com tais áci- dos nucleicos, um ácido nucleico complementar a qualquer um dos mesmos ou uma variante funcionalmente equivalente de qualquer um dos mesmos sob condições de hibridização estringentes. "Condições de hibridização es- tringentes" significa que o ácido nucleico é capaz de hibridizar a um modelo- alvo sob condições de hibridização convencionais, tais como aquelas descri- tos em Sambrook et al. (1989). Será apreciado que o tamanho mínimo de tais ácidos nucleicos é um tamanho o qual é capaz de formar um híbrido es- tável entre um determinado ácido nucleico e a sequência complementar à qual se deseja que ele hibridize. Consequentemente, o tamanho é depen- dente da composição de ácido nucleico e homologia percentual entre o ácido nucleico e sua sequência complementar, bem como das condições de hibri- dização que são usadas (por exemplo, temperatura e concentração de sal). Em uma modalidade, o ácido nucleico tem pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento, pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento, pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento, pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento ou pelo menos 30 nucleotídeos de comprimento.
Deverá ser notado que os ácidos nucleicos da invenção podem estar em qualquer forma adequada, incluindo RNA, DNA ou cDNA, incluindo ácidos nucleicos fita dupla e fita simples.
A invenção também proporciona organismos hospedeiros, parti- cularmente micro-organismos, incluindo vírus e bactérias e leveduras, com- preendendo qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos descritos aqui.
A invenção proporciona um método de produção de 1-butanol e/ou um precursor do mesmo por meio de fermentação microbiana que compreende fermentação de um substrato gasoso compreendendo CO u- sando um micro-organismo recombinante. Em determinadas modalidades, 1- butanol ou um precursor do mesmo é co-produzido com outro produto de fermentação (por exemplo, etanol). Em uma modalidade, 1-butanol ou um precursor do mesmo é o principal produto de fermentação. Em uma modali- dade, o micro-organismo recombinante é conforme aqui anteriormente des- crito.
Em uma modalidade, 1-butanol e/ou um precursor do mesmo é produzido em um rendimento de aproximadamente de 0,075 g por litro de caldo de fermentação ( g/l) a aproximadamente 20 g/l. Em uma modalidade, o rendimento é aproximadamente 0,15 g/l a aproximadamente 1,54 g/l. Em outras modalidades, o rendimento é aproximadamente 10 g/l, aproximada- mente 5 g/l ou aproximadamente 2 g/l. De preferência, o rendimento de 1- butanol é até o limite no qual o butanol se torna tóxico para as bactérias.
De preferência, a fermentação compreende as etapas de fer- mentação anaeróbia de um substrato em um biorreator para a produção de 1-butanol e/ou um precursor do mesmo usando micro-organismos recombi- nantes, conforme descrito aqui.
Onde o precursor de 1-butanol é referido aqui, considera-se que ele pode ser opcionalmente convertido em 1-butanol na presença de de- hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol, uma de- hidrogenase de butiraldeído /de-hidrogenase de butanol bifuncional, fosfo- transbutirilase, quinase de butirato e/ou óxido-redutase de aldeído depen- dente de ferrodoxina. De preferência, o micro-organismo produz uma ou mais destas enzimas, tanto antes quanto após introdução de um ácido nu- cleico recombinante.
Em uma modalidade da invenção, o substrato gasoso fermenta- do pelo micro-organismo é um substrato gasoso contendo CO. O substrato gasoso pode ser um gás residual contendo CO obtido como um subproduto de um processo industrial ou de outra fonte, tais como de gases de escapa- mento de automóveis. Em determinadas modalidades, o processo industrial é selecionado do grupo que consiste em fabricação de produtos de metal ferroso, tal como usinagem de aço, fabricação de produtos não-ferrosos, processos de refino de petróleo, gaseificação de carvão, produção de ener- gia elétrica, produção de negro de carbono, produção de amónia, produção de metanol e fabricação de coque. Nestas modalidades, o gás contendo CO pode ser capturado do processo industrial antes de ser emitido para a at- mosfera usando qualquer método conveniente. O CO pode ser um compo- nente de syngas (gás compreendendo monóxido de carbono e hidrogênio). O CO produzido a partir de processos industriais é normalmente queimado para produzir CO2 e, portanto, a invenção tem utilidade particular na redução da emissão de gases de efeito de estufa CO2 e produção de butanol paro uso como biocombustível. Dependendo da composição do substrato gasoso contendo CO, pode também ser desejável tratá-lo para remover quaisquer impurezas indesejadas, tais como partículas de poeira, antes de introdução do mesmo na fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtra- do ou purificado usando métodos conhecidos.
Será apreciado que, para que crescimento das bactérias e fer- mentação de CO em 1-butanol ocorram, além do substrato gasoso contendo CO, em um meio nutriente líquido adequado deverá ser alimentado ao bior- reator. Um meio nutriente conterá vitaminas e minerais suficientes para per- mitir o crescimento do micro-organismo usado. Meios adequados para fer- mentação anaeróbia para produção de butanol usando CO são conhecidos na técnica. Por exemplo, meios adequados são descritos em Biebel (2001). Em uma modalidade da invenção, o meio é conforme descrito na seção E- xemplos aqui depois.
A fermentação deverá, desejavelmente, ser realizada sob condi- ções adequadas para que fermentação de CO em butanol ocorra. Condições de reação que devem ser consideradas incluem pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo de líquido, o pH do meio, potencial redox do meio, taxa de agitação (se usando um reator de tanque agitado contínuo), nível de inóculo, concentrações máximas de substrato gasoso para assegu- rar que o CO na fase líquida não se torne limitativo e concentrações máxi- mas de produto para evitar inibição de produto.
Além disso, é muitas vezes desejável aumentar a concentração de CO de uma corrente de substrato (ou pressão parcial de CO em um subs- trato gasoso) e, assim, aumentar a eficiência de reações de fermentação onde CO é um substrato. Operação em maiores pressões permite um au- mento significativo na taxa de transferência de CO da fase gasosa para a fase líquida, onde ele pode ser captado pelo micro-organismo como fonte de carbono para a produção de butanol. Isto, por sua vez, significa que o tempo de retenção (definido como o volume de líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo de gás de entrada) pode ser reduzido quando biorreatores são mantidos em uma pressão elevada, ao invés de em pressão atmosférica. As condições de reação ótimas dependerão, em parte, do micro-organismo da invenção usado em particular. No entanto, em geral, é preferido que a fer- mentação seja realizada em uma pressão maior do que a pressão ambiente. Além disso, uma vez que uma determinada taxa de conversão de CO em butanol é, em parte, uma função do tempo de retenção do substrato e ob- tenção de um tempo de retenção desejado, por sua vez, determina o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir consideravelmente o volume do biorreator necessário e, consequentemente, o custo do capital com equipamento de fermentação. De acordo com os e- xemplos fornecidos na Patente US N° 5.593.886, volume do reator pode ser reduzido em proporção linear a aumentos na pressão de operação do reator, isto é, biorreatores operados a 10 atmosferas de pressão precisam apenas de um décimo do volume daqueles operados a 1 atmosfera de pressão.
Os benefícios de conduzir uma fermentação de gás em etanol em pressões elevadas foi descrito em outro lugar. Por exemplo, o documen- to WO 02/08438 descreve fermentações de gás em etanol realizadas sob pressões de 30 psi e 75 psi, proporcionando produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia, respectivamente. No entanto, descobriu-se que fermen- tações exemplificativas realizadas usando meios e composições de gás de entrada similares em pressão atmosférica produzem entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.
A composição das correntes gasosas usados para alimentar uma reação de fermentação pode ter um impacto significativo sobre a eficá- cia e/ou custos desta reação. Por exemplo, O2 pode diminuir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbia. Processamento de gases indeseja- dos ou desnecessários em estágios de um processo de fermentação antes ou após fermentação pode aumentar a carga sobre tais estágios (por exem- plo, onde a corrente gasosa é comprimida antes de entrar em um biorreator, energia desnecessária pode ser usada para comprimir gases que não são necessários na fermentação). Consequentemente, pode ser desejável tratar as correntes de substrato, particularmente correntes de substrato derivadas de fontes industriais, para remover componentes indesejáveis e aumentar a concentração de componentes desejáveis.
Em determinadas modalidades, uma cultura de uma bactéria da invenção é mantida em um meio de cultura aquoso. De preferência, o meio de cultura aquoso é um meio mínimo de crescimento microbiano anaeróbio.
Meios adequados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos 5.173.429 e 5.593.886 e documento WO 02/08438 e como descrito na seção Exemplos aqui depois.
Butanol ou uma corrente mista de álcool contendo butanol e um ou mais de outros álcoois podem ser recuperados do caldo de fermentação por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como destilação fracionada ou evaporação, pervaporação e fermentação extrativa incluindo, por exem- plo, extração de líquido-líquido. Subprodutos, tais como ácidos, incluindo butirato, podem também ser recuperados do caldo de fermentação usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, pode ser usado um sistema de adsorção que envolve um filtro de carvão ativado ou eletrodiálise. Alterna- tivamente, o extração contínua de gás também pode ser usada.
Em determinadas modalidades preferidas da invenção, butanol e subprodutos são recuperados do caldo de fermentação por meio de remoção contínua de uma parte do caldo do biorreator, separação de células microbi- anas do caldo (convenientemente por meio de filtração) e recuperação de butanol e, opcionalmente, ácido do caldo. Álcoois podem, convenientemen- te, ser recuperados, por exemplo, por meio de destilação e ácidos podem ser recuperados, por exemplo, por meio de adsorção sobre carvão ativado. As células microbianas separadas são, de preferência, retornadas ao biorre- ator de fermentação. O permeado sem células remanescente após o(s) ál- cool(is) e ácido(s) serem removidos também é, de preferência, retornado ao biorreator e fermentação. Nutrientes adicionais (tais como vitaminas B) po- dem ser adicionado ao permeado sem células para repor o meio nutriente antes que ele seja retomado ao biorreator.
Também, se o pH do caldo foi ajustado conforme descrito acima para aumentar a adsorção de ácido acético ao carvão ativado, o pH deve ser novamente ajustado para um pH similar àquele do caldo no biorreator de fermentação antes de ser retornado ao biorreator.
Em uma modalidade da invenção, butanol é recuperado da rea- ção de fermentação usando procedimentos de fermentação extrativa nos quais butanol é recuperado em uma fase oleosa no reator. Aqueles versados na técnica apreciarão prontamente técnicas para obter isto.
EXEMPLOS
A invenção será agora descrita em maiores detalhes com refe- rência aos exemplos não limitativos a seguir.
Modificações genéticas foram realizadas usando um plasm ideo contendo um óperon sintético que consiste em um promotor forte nativo de C. autoethanogenum que controla genes de tiolase, de-hidrogenase de 3- hidroxibutiril-CoA, crotonase, de-hidrogenase de butiril-CoA e duas flavopro- teínas de transferência de elétrons de C. acetobutylicum (Fig. 1-2). Este plasmídeo foi metilado in vivo usando uma nova metiltransferase e, então, transformado em C. autoethanogenum DSM23693. Produção de 1-butanol como o principal produto da fermentação foi mostrada em diferentes corren- tes de gás industrial (efluentes gasosos de usinagem de aço, syngas).
Construto de Plasmídeo de Expressão:
Técnicas padrões de clonagem molecular e DNA recombinante foram usadas na presente invenção e são descritas por Sambrook et al., 1989 e Ausubel et al., 1987. Sequências de DNA de genes de biossíntese de butanol de Clostridium acetobutylicum ATCC824 usadas foram obtidas do NCBI (Tabela 1). O promotor do óperon de quinase de aceta- to/fosfotransacetilase de C. autoethanogenum DSM10061 foi sequenciado e usado para expressão de genes-alvo (Tabela 1). Experimentos de RT-PCR mostraram que este promotor é constitutivamente expresso em alto nível (Figura 8). Tabela 1: Fontes de Genes de Vias 1-butanol DNA genômico de Clostridium acetobutylicum ATCC824 e Clos- tridum autoethanogenum DSM10061 foi isolado usando um método modifi- cado por Bertram e Dürre (1989). Uma cultura noturna de 100 ml foi coletada (6.000 x g, 15 min, 4 °C), lavada com tampão de fosfato de potássio (10 mM, pH de 7,5) e suspensa em 1,9 ml de tampão STE (EDTA a 1 mM, Tris-HCI a 50 mM, 1, sacarose a 200 mM, pH de 8,0). 300 μl de lisozima (~ 100.000 U) foram adicionados e a mistura foi incubada a 37 °C durante 30 min, seguido pela adição de 280 μl de uma solução de SDS a 10% (peso/v) e outra incu- 10 bação durante 10 min. O RNA foi digerido em temperatura ambiente median- te a adição de 240 μl de uma solução de EDTA (0,5 M, pH de 8), 20 μl de Tris-HCI (1 M, pH de 7,5) e 10 μl de RNase A (Fermentas). Então, 100 μl de proteinase K (0,5 L) foram adicionados e proteólise foi realizada durante 1-3 horas a 37 °C. Finalmente, 600 μl de perclorato de sódio (5 M) foram adicio- nados, seguido por uma extração com fenol-clorofórmio e precipitação com isopropanol. A quantidade e qualidade do DNA foram verificadas por meio de espectrofotometria.
Genes da biossíntese de butanol e o promotor de quinase de acetato/fosfotransacetilase foram amplificados por PCR com os oligonucleo- tídeos na Tabela 2 usando DNA polimerase iProof High Fidelity (Bio-Rad Labratories) e programa a seguir: desnaturação inicial a 98°C durante 30 segundos, seguido por 32 ciclos de desnaturação (98°C durante 10 segun- dos), anelamento (50-62°C durante 30-120 segundos) e alongamento (72°C durante 45 segundos) antes de uma etapa final de extensão (72°C durante 10 minutos). Tabela 2: Oligonucleotídeos para Clonagem
A região promotora de 498 bp amplificada do óperon de quinase de acetato/fosfotransacetilase (Ppta-ack) foi clonada no vetor de transporte de E. coli-Clostrídium pMTL 85141 (SEQ ID 14; FJ797651.1; Nigel Minton, Uni- versity of Nottingham; Heap et al., 2009) usando sítios de restrição Not\ e Nde\ e a cepa DH5α-T1R (Invitrogen). O plasmídeo pMTL85145 chado e o produto de PCR de 1.194 bp do gene de tiolase foram ambos cortados com Nde\ e EcoRI. A ligação foi transformada em E. coli XL1-Blue MRF' Kan (S- tratagene), resultando no plasmídeo pMTL85145-thlA. Subsequentemente, o fragmento de 4.764 bp amplificado por PCR do óperon crt-bcd-etfB-etfA-hbd de C. acetobutylicum ATCC 824 foi clonado neste vetor usando Kpnl e Ba- mHI e E. coli ABLE K (Stratagene), criando o plasmídeo pMTL85145-thlA- crt-hbd. Finalmente, o cassete de resistência a antibióticos foi mudado de cloranfenicol para claritromicina. Portanto, um cassete ermB foi liberado do vetor pMTL82254 (SEQ ID 15; FJ797646.1; Nigel Minton, University of Not- tingham; Heap et al., 2009) usando as enzimas de restrição Pmel e Fse\ e trocado por um cassete catPde plasmídeo pMTL85145-thlA-crt-hbd. O inser- to do plasmídeo de expressão resultante, pMTL85245-thlA-crt-hbd (SEQ ID NO. 31), foi completamente sequenciado usando os oligonucleotídeos forne- cidos na Tabela 3 e os resultados confirmaram que os genes de biossíntese de butanol estavam livres de mutações (Figura 3). Tabela 3: Oligonucleotídeos para Sequenciamento
Metilação de DNA:
Um gene híbrido de metiltransferase fundido a um promotor lac induzível foi concebido (SEQ ID 28) por meio de alinhamento de genes de metiltransferase de C. autoethanogenum (SEQ ID NO. 24), C. Ijungdahlii (SEQ ID NO. 25) e C. ragsdalei ( SEQ ID NO. 26) (Figuras 4a, 4b e 4c). Ex- pressão do gene de metiltransferase resultou na produção de uma enzima metiltransferase de acordo com SEQ ID NO. 28. Dados de alinhamento da sequência de aminoácido de metiltransferase são mostrados na Figura 4d. O gene híbrido de metiltransferase (SEQ ID NO. 27) foi sintetizado quimica- mente e clonado no vetor pGS20 (SEQ ID 29; ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen, Alemanha) usando EcoRI (Fig. 5). O plasmídeo de metilação resultante pGS20-metiltransferase foi duplamente transformado com o plas- mídeo de expressão pMTL85245-thlA-crt-hbd em E. co//XL1-Blue MRF' Kan restrição-negativa (Stratagene). Metilação in vivo foi induzida mediante a adição de IPTG a 1 mM e os plasmídeos metilados foram isolados usando o kit PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep (Invitrogen). A composição do plasmídeo metilado resultante foi usada para transformação de C. autoetha- nogenum DSM23693.
Transformação:
Durante o experimento de transformação completa, C. autoetha- nogenum DSM23693 e C. Ijundahlii (DSM 13528) foram cultivados em meio PETC (Tab. 4), com 10 g/l de frutose e gás residual de usinagem de aço a 30 (coletado da New Zealand Steel Site em Glenbrook, NZ; composição: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2 e 2% de H2) como fonte de carbono a 37 °C usando técnicas anaeróbias padrões descritas por Hungate (1969) e Wolfe (1971). Tabela 4: Meio PETC (Meio ATCC 1754; http://www.atcc.org/Attachments/2940.pdf)
Para fazer células competentes, uma cultura de 50 ml de C. au- toethanogenum DSM23693 e uma cultura de 50 ml de C. Ijundahlii 5 DSM13528 foram subcultivadas em meio fresco durante 3 dias consecutivos.
Estas células foram usadas para inocular 50 ml de meio PETC contendo DL- treonina a 40 mM em uma OD6oo nm de 0,05. Quando a cultura atingiu uma OD6OO nm de 0,4, as células foram transferidas para uma câmara anaeróbia e coletadas a 4.700 x g e 4 °C. A cultura foi lavada duas vezes com tampão de eletroporação gelado (sacarose a 270 mM, MgCfe a 1 mM, fosfato de só- dio a 7 mM, pH de 7,4) e finalmente suspensa em um volume de 600 μl de tampão de eletroporação fresco. Esta mistura foi transferida para uma cube- ta de eletroporação pré-resfriada com um vão de eletrodo de 0,4 cm conten- do 1 μg da mistura de plasmídeo metilado (e, no caso de C. Ijundahlii, 1 μl de Type 1 Restriction Inhibitor (Epicentre Biotechnologies)) e imediatamente condicionada usando sistema de eletroporação Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) com as configurações a seguir: 2,5 kV, 600 Q e 25 μF. Constantes de tempo de 3,7-4,0 ms foram obtidas. A cultura foi transferida para 5 ml de meio fres- co. Regeneração das células foi monitorada em um comprimento de onda de 600 nm usando um espectrofotômetro Spectronic Helios Epsilon (Thermo) equipado com um suporte de tubo. Após uma queda inicial na biomassa, as células começam a crescer de novo. Uma vez que a biomassa dobrou a par- tir desse ponto, as células foram coletadas, suspensas em 200 μl de meio fresco e cultivadas em placas PETC seletivas (contendo agar Bacto™ a 1,2% (BD)) com 4 μg/μl de Claritromicina. Após 4-5 dias de inoculação com gás de usinagem de aço a 30 psi a 37 °C, 15-80 colônias por placa eram claramente visíveis.
As colônias foram usadas para inocular 2 ml de meio PETC con- tendo 4 μg/mL de Claritromicina. Quando ocorreu um crescimento, a cultura foi escalonada em 5 ml e, depois, 50 ml de meio PETC contendo 4 μg/mL de Claritromicina e gás de usinagem de aço a 30 psi como única fonte de car- bono.
Confirmação de Transformação Com Sucesso:
C. autoethanogenum: Para verificar a transferência de DNA, um plasmídeo mini prep foi realizado a partir de um volume de cultura de 10 ml cultura usando o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Em virtude da atividade de exonuclease Clostridial (Burchhardt e Dürre, 1990), o DNA de plasmídeo isolado de 4 clones analisados foi parcialmente degradado e resultou apenas em uma mancha em um gel de agarose, enquanto que o isolamento de plasmídeos da cepa C. autoethanogenum DSM23693 original não resulta em um sinal em geral (Fig. 6). No entanto, a qualidade do DNA de plasmídeo isolado foi suficiente para executar uma PCR de controle usando quatro con- juntos de iniciadores, abrangendo todas as diferentes regiões relevantes do plasmídeo (Tabela 5). A PCR foi realizada com lllustra PuReTaq Ready-To- Go™ PCR Beads (GE Healthcare) usando uma condições padrões (95 °C durante 5 min; 32 ciclos de 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s e 72 °C durante 1 min; 72 °C durante 10 min.) PCR de todos os quatro transforman- tes analisados resultou nos mesmos sinais que a mistura de plasmídeo meti- lado original como modelo (Fig. 6). Como um controle adicional, 1 μl de cada um dos plasmídeos isolados parcialmente degradadas foi re-transformado em E. co//XL1-Blue MRF' Kan (Stratagene), de onde os plasmídeos pude- ram ser isolados de forma limpa e verificados através de digestões por res- trição.
Para confirmar a identidade dos quatro clones, o DNA genômico foi isolado (vide acima) de 40 ml de cada cultura e uma PCR foi realizada contra o gene de rRNA 16S (Tab. 5; Weisberg et al., 1991) usando lllustra PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads (GE Healthcare) e condições padrões (95 °C durante 5 min; 32 ciclos de 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s e 72 °C durante 1 min; 72 °C durante 10 min). Os respectivos produtos de PCR foram purificados e sequenciados. As sequências de todos os clones mostraram pelo menos 99,9% de identidade em relação ao gene de rRNA 16S de C. autoethanogenum (SEQ ID 30; Y18178, Gl: 7271109).
A respectiva cepa foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha) sob o número de acesso DSM24138 em 26 de Outubro de 2010. C. Ijungdahlii-. Transformantes de Clostridium Ijungdahlii foram confirmados usando o mesmo método e conjuntos de iniciadores. Sequenci- amento do gene de rRNA 16S resultou em uma combinação de 100% com o gene 16S de Clostridium Ijungdahlii (SEQ ID 119; CP001666, Gl: 300433347). Tabela 5: Oliqonucleotídeos para Confirmação por PCR de Plasmídeo e Es- Pécie
Produção de 1-butanol:
Para demonstrar a produção de 1-butanol a partir de CO como única fonte de carbono e energia, meio PETC sem extrato de levedura e fru- tose foi preparado e inoculado com as novas cepas de C. autoethanogenum e C. Ijungdahlii abrigando o plasmídeo de butanol pMTL85245-thlA-crt-hbd. Garrafas foram pressurizadas com 30 psi de uma corrente gasosa contendo CO a partir de duas fontes industriais, efluxo gasoso de usinagem de aço 10 (coletado de New Zealand Steel Site em Glenbrook, NZ, composição: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) e syngas (Range Fuels Inc., Broomfield, CO; composição: 29% de CO, 45% de H2, 13% de CH4, 12% de CO2, 1% de N2). Produção de 1-butanol pôde ser demonstrada com ambas as cepas e ambas as misturas gasosas ao longo de vários períodos de sub- cultura. Co-produção de butirato foi observado também. Nem 1-butanol nem butirato foram detectados em amostras de cepas não modificadas de C. au- toethanogenum DSM23693 e C. Ijungdahlii DSM13528 sob as mesmas con- dições.
Análise de metabólitos foi realizada por HPLC usando um siste- ma de HPLC Agilent 1100 Series equipado com um RID (Refractive Index Detector - Detector de índice de Refração) operado a 35 °C e uma coluna de ácido orgânico Alltech IOA-2000 (150 x 6,5 mm, tamanho de partícula de 5 μm) mantido a 60 °C. Foi usada água ligeiramente acidificada (H2SO4 a 0,005 M) como fase móvel com uma taxa de fluxo de 0,7 ml/min. Para elimi- nar as proteínas e outros resíduos celulares, 400 μl de amostras foram mis- turados com 100 μl de uma solução de ácido 5-sulfo-salicílico a 2% (peso/v) e centrifugado a 14.000 x g durante 3 minutos para separar os resíduos pre- cipitados. 10 μl do sobrenadante foram, então, injetados no HPLC para aná- lise.
Em experimentos com garrafa de soro foi observada a maior produção de 1-butanol em duas culturas estáticas de C. autoethanogenum abrigando o plasmídeo de butanol pMTL85245-thlA-crt-hbd. Nestas culturas, 1-butanol foi o principal produto final da fermentação observado, com 1,54 g/l (25,66 mm) (Tabela 6, FIG. 7). A produção de outros metabólitos foi redu- zida em comparação com a cepa original de C. autoethanogenum DSM23693, a qual produziu apenas etanol, acetato e 2,3-butanodiol. Embo- ra o fluxo de carbono fosse desviado para a produção de 1-butanol, a quan- tidade total de carbono incorporado nos produtos metabólicos finais perma- neceu praticamente a mesma (Tabela 6). É provável que o ligeiro aumento de 20% seja o resultado de descarga extra de equivalentes de redução para a produção de 1-butanol e butirato comparado com etanol e acetato, respec- tivamente. A produção de 2,3-butanodiol, o qual usualmente atua como dis- sipador de elétrons, foi completamente reduzida. Tabela 6: Produção de Metabólitos e Equilíbrio de Carbono de C. autoethanogenum Abrigando o Plasmídeo de Butanol pM- TL85245-thlA-crt-hbd Comparado com C. autoethanogenum DSM23693 Original
Produção de 1-butanol também foi observada em culturas de C. Ijungdahlii DSM13528 abrigando o plasmídeo de butanol pMTL85245-thlA- crt-hbd em quantidades significativas de até 0,36 g/l (6 mM), embora inferior ao C. autoethanogenum DSM23693 abrigando o mesmo plasmídeo. Isto po- de ser explicado porque C. autoethanogenum DSM23693 é uma cepa com produção aprimorada de álcool e, correspondentemente, a cepa não modifi- cada de C. autoethanogenum DSM23693 produz mais etanol e menos ace- tato do que a cepa não modificada de C. Ijungdahlii DSM13528 (ambas as cepas não produzem butanol nem butirato). C. Ijungdahlii abrigando o plasmídeo de butanol pMTL85245- thlA-CRT-hbd tive uma proporção de 1-butanol:butirato do que C. autoetha- nogenum. A proporção de 1-butanol para butirato, no entanto, pode ser alte- rada pelas condições de processo. Isto permite a produção de 1-butanol co- mo o principal produto da fermentação, mas também a produção de butirato como o principal produto da fermentação em ambas as cepas C. autoetha- nogenum e C. Ijungdahlii. Em experimentos com frasco de soro, proporções molares de 1-butanol:butirato entre 50:1 a 1:30 foram observadas com C. autoethanogenum e 20:1-1:30 com C. Ijungdahlii. Culturas as quais foram incubadas sob agitação produziram geralmente maiores níveis de butirato e menores níveis de 1-butanol comparado com culturas estáticas. Descobriu- se que a concentração de CO (e H2) no headspace tinha um efeito sobre a proporção de 1-butanol:butirato também. Em culturas com menos CO no headspace, a produção de butirato era mais favorecida e ele pôde ser pro- duzido como o principal produto de fermentação. Correspondentemente, titu- lações mais altas de 1-butanol foram observadas com o gás de usinagem de aço rico em CO (44% de CO) do que no syngas pobre em CO (29% de CO) em experimentos realizados em frasco de soro. Um máximo de 1,08 g/l (12,8 mM) de butirato foi observado com Clostridium autoethanogenum abrigando um plasmídeo pMTL85245-thlA-crt-hbd e um nível de 1,03 g/l (12,5 mM) com C. Ijungdahlii abrigando o mesmo plasmídeo. Este efeito pode ser explicado pelo carbono extra no sistema e também o poder de redução adicional gera- do a partir da oxidação de CO pela de-hidrogenase de monóxido de carbon (CODH).
Conversão de Butiril-CoA em Butirato e Butanol:
O plasmídeo de expressão contém apenas os genes necessá- rios para a produção de butiril-CoA a partir de acetil-CoA. Butiril-CoA pode, então, ser convertido diretamente em butanol mediante a ação de uma de- hidrogenase de butiraldeído e de-hidrogenase de butanol (Fig. 1). Uma se- gunda possibilidade é que butiril-CoA seja convertido em butirato via uma fosfotransbutirilase e quinase de butirato (fig. 1), caso no qual ATP é obtido via fosforilação a nível de substrato (Substrate Level Phosphorylation - SLP). Uma vez que operação da via de Wood-Ljungdahl requer ATP, células ace- togênicas dependem de ATP a partir de SLP, o qual também se reflete no fato de que todas as bactérias acetogênicas conhecidas produzem acetato (Drake et al., 2006). No entanto, a célula recombinante pode agora também gerar ATP via SLP também por meio da produção de butirato. Butirato pode, então, ser adicionalmente reduzido em butiraldeído via uma óxido-redutase de aldeído:ferredoxina (RPA) (Fig. 1). Esta reação pode ser disparada pela ferredoxina reduzida, fornecida pela oxidação de CO via a de-hidrogenase de monóxido de carbono (CO + Fdred -> CO2 + Fdox), a etapa inicial na via de Wood-Ljungdahl. Butiraldeído pode, então, ser convertido em butanol via uma de-hidrogenase de butanol (Fig. 1). Conversão de butirato adicionado externamente em butanol por uma cultura de C. autoethanogenum foi de- monstrada (documento W02009/113878).
Respectivos genes/enzimas com atividade de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol, fosfotransbutirilase, quinase de bu- tirato e óxido-redutase de aldeídoíerredoxina foram identificados pelos in- ventores em C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii e C. ragsdalei (Tab. 7-10). Potenciais genes e enzimas foram previstos por meio de comparação com genes e enzimas caracterizados usando os bancos de dados BLAST (Alts- chul et al., 1990), COG (Tatusov et al., 2003) e TIGRFAM (Haft et al., 2002). Varreduras de motivo foram realizadas contra os bancos de dados PROSITE (Hulo et al., 2008) e Pfam (Finn et al., 2010). Genomas de C. autoethanoge- num, C. Ijungdahlii e C. ragsdalei contêm vários genes que codificam enzi- mas com atividade de de-hidrogenase de álcool e aldeído. Conforme indica- do nas Tabelas 7 a 10, descobriu-se que alguns dos quais têm uma alta ho- mologia de mais de 70% com de-hidrogenases de butiraldeído e butanol ca- racterizadas de C. acetobutylicum, C. beijerínckii ou C. saccharobutylicum, 5 enquanto que outros têm pelo menos cerca de 40% de identidade com estas enzimas. Todos os três genomas codificam exatamente uma enzima com atividade de acetil/butirial transferase de fosfato e uma com atividade de qui- nase de acetato/butirato. C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii e C. ragsdalei possuem, cada um, 2 genes de óxido-redutase de aldeídoíerredoxina. Tabela 7: Genes de C. autoethanogenum que Conferem Potencialmente Ati- vidade de De-hidroqenase de Bui tiraldeído e Butanol Tabela 8: Genes de C. liunadahlii que Conferem Potencialmente Atividade de De-hidrogenase de Butiraldeíd o e Butanol Tabela 9: Genes de C. ragsdalei que Conferem Potencialmente Atividade de De-hidrogenase de Butiraldeído e Butanol
Estudos de Expressão Gênica
Estudos de expressão gênica foram realizados para confirmar a expressão bem-sucedida dos genes introduzidos de tiolase, de-hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, Crotonase, de-hidrogenase de butiril-CoA, Flavopro- teína A de Transferência de Elétrons e Flavoproteína B de Transferência Eletrônica em C. autoethanogenum abrigando o plasmídeo de butanol pM- TL85245-thlA-crt- hbd. Além disso, descobriu-se que uma seleção de genes putativos de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de butanol, acetil/butiril transferase de fosfato, quinase de acetato/butirato, óxido- redutase de aldeídoíerredoxina identificados no genoma de C. autoethano- genum (Tabela 7) também eram expresso sob condições de fermentação padrões (Figura 60).
Uma amostra foi coletada por meio de centrifugação (6000 x g, 5 min, 4 °C). O RNA foi isolado através de suspensão do sedimento celular em 100 μL de solução de lisozima (50.000 U de lisozima, SDS a 10%, Tris-HCI a 10 mM, EDTA a 0,1 mM, pH de 8). Após 5 min, 350 ml_ de tampão de lise (contendo 10 μl de 2-mercaptoetanol) foram adicionados. A suspensão de células foi mecanicamente rompida por meio de passagem cinco vezes atra- vés de uma agulha de calibre 18-21. O RNA foi, então, isolado usando o kit PureLink™ RNA Mini (Invitrogen) e eluído em 100 μL de água sem RNase. O RNA foi verificado via PCR e eletroforese em gel e quantificado espectro- fotometricamente e tratado com DNase I (Roche), se necessário. A qualida- de e integridade do RNA foram verificadas usando um Bioanalyzer (Agilent Technologies). A etapa de transcrição reversa foi realizada usando o kit Su- perscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). As reações de RT-PCR fo- ram realizadas no MyiQ Single Colour Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Labratories) em urn volume de reação de 15 μl com 25 ng de mo- delo de cDNA, 67 nM de cada um dos iniciadores (Tab. 11) e 1x iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 94547, EUA). Quinase de guanilato e ligase de tetraidrofolato de formato foram usadas como gene de limpeza e controles não-modelo foram incluídos. As condições de reação foram 95 °C durante 3 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55 °C durante 15 s e 72 °C durante 30 s. Uma análise de curva de fusão foi rea- lizada imediatamente após término de RT-PCR (38 ciclos de 58 °C a 95 °C a 1 °C/s) para detecção de dimerização de iniciador ou outros defeitos de am- plificação. mRNA para todos os genes heterólogos podem ser detectados com sucesso, mostrando que os genes são expressos. O sinal para todos os genes estava em um nível similar. Tabela 10: Oligonucleotídeos para qRT-PCR
A invenção foi aqui descrita com referência à determinadas mo- dalidades preferidas para permitir que o leitor pratique a invenção sem expe- rimentação indevida. No entanto, uma pessoa com conhecimentos correntes na técnica reconhecerá facilmente que muitos dos componentes e parâme- tros podem ser alterados ou modificados ou substituídos por equivalentes conhecidos até certo ponto sem nos afastarmos do escopo da invenção. De- verá ser notado que tais modificações e equivalentes são aqui incorporados como se individualmente apresentados. Os títulos, cabeçalhos ou similares são fornecidos para melhorar a compreensão do presente documento pelo leitor e não devem ser lidos como limitativos do âmbito da presente inven- ção.
As descrições completas de todos os Pedidos, Patentes e Publi- cações citados acima e abaixo, se houver, são aqui incorporadas por refe- rência. No entanto, a referência a quaisquer Pedidos, Patentes e Publica- ções no presente relatório descritivo não é e não deve ser tomada como um reconhecimento ou qualquer outra forma de sugestão de que eles constitu- em a técnica válida anterior ou parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.
Por todo o presente relatório descritivo e nas reivindicações que seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras "compre- ende", "compreendendo" e similares devem ser entendidas em um sentido inclusivo, em oposição a um sentido exclusivo, isto é, no sentido de "incluin- do, porém sem limitações".

Claims (8)

1. Micro-organismo recombinante que produz 1-butanol, caracte- rizado pelo fato de que o micro-organismo compreende tiolase exógena, de- hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA exógena, crotonase/hidratase de croto- nil-CoA exógena, de-hidrogenase de butiril-CoA exógena e Flavoproteína A e B de Transporte de Elétrons exógenas, em que a tiolase exógena, de- hidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA exógena, crotonase/hidratase de croto- nil-CoA exógena, de-hidrogenase de butiril-CoA exógena, e Flavoproteína A e B de Transporte de Elétrons exógenas são introduzidas por transformação, e em que o micro-organismo recombinante é derivado de uma micro- organismo parental selecionado do grupo consistindo em Clostridium auto- ethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium coskatii e Clostridium ragsdalei.
2. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo compreende ainda um ou mais ácido nucleicos exógenos codificando uma ou mais enzimas seleci- onadas a partir de de-hidrogenase de butiraldeído, de-hidrogenase de buta- nol e uma de-hidrogenase de butiraldeído/de-hidrogenase de butanol bifun- cional.
3. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo compreende ainda um ou mais ácido nucleicos exógenos codificando uma ou mais enzimas seleci- onadas a partir de fosfotransbutirilase, quinase de butirato, óxido-redutase de aldeído dependente de ferredoxina e de-hidrogenase de butanol.
4. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser depositado na DSMZ sob o número de acesso DSM24138.
5. Método para a produção de 1-butanol, caracterizado pelo fato de ser por meio de fermentação microbiana de um substrato gasoso com- preendendo CO, compreendendo adicionar ao substrato o micro-organismo recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o rendimento de 1-butanol é de pelo menos de 0,075 gramas por litro de caldo de fermentação (g/l).
7. Método De Acordo Com A Reivindicação 6, Caracterizado Pelo Fato De Que O Rendimento De 1-butanol É De 0,075 G/L A 20 G/L. 5
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o substrato gasoso compreende pelo menos 20% a 100% de CO em volume.
BR112013009552-0A 2010-10-22 2011-09-29 Microorganismo recombinante que produz 1-butanol e método para a produção de 1-butanol BR112013009552B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40587110P 2010-10-22 2010-10-22
US61/405,871 2010-10-22
US13/049,263 2011-03-16
US13/049,263 US20110236941A1 (en) 2010-10-22 2011-03-16 Recombinant microorganism and methods of production thereof
PCT/NZ2011/000203 WO2012053905A1 (en) 2010-10-22 2011-09-29 Production of butanol from carbon monoxide by a recombinant microorganism

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112013009552A2 BR112013009552A2 (pt) 2016-07-19
BR112013009552B1 true BR112013009552B1 (pt) 2025-04-24

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6014042B2 (ja) 組換え微生物による一酸化炭素からのブタノールの産生
CN103502435B (zh) 重组微生物及其用途
EP2855690B1 (en) Recombinant microorganisms and their uses
US9890384B2 (en) Recombinant microorganisms and uses therefor
US9834795B2 (en) Recombinant microorganisms and uses therefor
JP2022163046A (ja) 修飾されたアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ活性を有する微生物および関連方法
JP2015512646A (ja) 代謝物活性が改変された酵素
BR112013009552B1 (pt) Microorganismo recombinante que produz 1-butanol e método para a produção de 1-butanol
NZ614459B2 (en) Recombinant microorganisms and uses therefor