BR112013008701B1 - Método de detecção da presença de doença cardíaca valvular de origem reumática em um indivíduo - Google Patents

Abstract

biomarcador para doença cardíaca valvular a presente invenção refere-se à detecção de uma proteína associada com a doença cardíaca valvular de origem remática. o mecanismo de suprarregulação da proteína no plasma humano em pacientes que sofrem de doença valvular com origem reumática é demostrado. o nível aumentando de proteína em amostras de urina dos pacientes com doença de válvula reumática também é demostrado. a estimativa desta proteína marcadora pode ser útil para fins de diagnóstico para os pacientes sem evidências clínicas de doença valvular. esta proteína marcadora pode ser usada para fins de prognóstico após intervenção cirúrgica da doença valvular de origem reumática. esta proteína também pode ser usada para a triagem de fármacos antifibróticos para o tratamento da doença cardíaca valvular.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção pertence ao campo da medicina e, mais especificamente, refere-se ao biomarcador útil para a detecção, caracterização, tratamento e prognóstico de doenças cardíacas valvulares de origem reumática.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO E DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

A doença valvular cardíaca é um problema cardíaco grave em todo o mundo e é responsável por cerca de 20.000 mortes anualmente apenas nos Estados Unidos, com um número estimado de 99.000 procedimentos de válvula realizados em pacientes internados anualmente (Rosamond et al. 2007, Circulation, 115:el69-el71; Yoshioka et al. 2008, Circulation, 118: 1694-1696). Doenças cardíacas valvulares na população dos Estados Unidos são na maior parte degenerativas, enquanto que a doença cardíaca reumática responde pela maioria das patologias valvulares nos países em desenvolvimento. No entanto, espera-se que pacientes com doença valvular reumática aumentem nos EUA devido à contínua imigração dos países em desenvolvimento (Dandara et al. 2010, Mayo Clin Proc.85:483-500). A febre reumática aguda é um problema de saúde comum nos países em desenvolvimento (Nordet, 1993, J. Int. Soc . Fed. Cardiol, 3: 4-5). Estima-se que cerca de 12milhões de pessoas, principalmente crianças, sofrem da doença em todo o mundo (Steer et al. 2002, J. Paediatr, Child Health,38 : 229 -234; Report of a WHO Expert Consultation, Geneva, 29e outubro a 1° de novembro de 2001, WHO Technical Report Series 923). Na Índia, a doença relacionada com a febre reumática é responsável por de 30 a 40% das doenças cardiovasculares relacionadas com internações hospitalares e uma indicação comum para cirurgia cardíaca (Kadir et. al. 2004, Annals of Thoracic surgery, 78:699-701). A febre reumática é uma condição extremamente comum que afeta as válvulas cardíacas entre pessoas com baixo status socioeconômico e está relacionada com superpopulação, nutrição e higiene ruim. Além do fator ambiental, o baixo status socioeconômico e o acesso ruim aos cuidados de saúde têm sido associados com o aumento da prevalência e incidência de doença reumática (World health organization. 2001 Report of a WHO Expert Consultation. Geneva, 2004:13-19). Ela é primariamente uma reação de hipersensibilidade às proteínas estreptocócicas (adquirido por meio de infecções de garganta que podem ser clinicamente evidentes ou não) e afeta as válvulas cardíacas, dando origem a uma fase aguda onde ocorre febre, dor nas articulações e características de insuficiência cardíaca evidente, como falta de ar, palpitações e fadiga. A fase aguda da doença desaparece dando origem a sequelas clínicas sob a forma de estenose/regurgitação valvular com consequências hemodinâmicas e clínicas.

A doença cardíaca reumática, uma sequela da febre reumática, é a doença cardíaca adquirida mais comum em todo o mundo (Eisenberg et al. 1993, Eur. Heart J, 14: 122 - 128). Ela está associada com a fibrose, calcificação e fusão das junções, espessamento do folheto e fusão de corda, resultando em estenose mitral (MS). MS também pode estar associada à regurgitação mitral (RM). Em MR, a anormalidade pode estar relacionada à válvula ou às estruturas de suporte vizinhas. Ela é a segunda forma mais comum de doença de válvula em todo o mundo. Doença reumática é a principal causa de regurgitação mitral (MR) dos países em desenvolvimento. A doença cardíaca reumática também é responsável pela regurgitação aórtica grave (AR). Anormalidades da folha aórtica e suas estruturas desuporte geralmente levam à AR (Maganti et al 2010, Mayo Clin.Proc. 85:482-510).

Em geral, a morfologia bruta e histopatologia revelam que válvulas reumáticas apresentam fibrose com ou sem calcificação. A corda tendinosa é geralmente grossa e encurtada. As seções Valvulares apresentam neovascularização, inflamação crônica e fibrose com alteração da arquitetura valvular subjacente (Yoshioka et al. 2008, Circulation, 118: 1694-1696). Sabe-se que a fibrose é característica da remodelagem estrutural. Em geral, a fibrose é caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular que pode ocorrer como resultado da sobrecarga mecânica do tecido combinado com a ação de outros fatores profibróticos ou dano tecidual.

A inspeção da doença cardíaca valvular representa uma proporção significativa dos atendimentos ambulatoriais em cardiologia. O controle do paciente geralmente envolve a monitorização dos sintomas clínicos ou deterioração funcional geralmente avaliada por estudos imagem, dos quais a ecocardiografia transtorácica é a principal. Biomarcadores circulantes incorporados com sucesso na prática da cardiologia enquadram-se na categoria de biomarcadores de diagnóstico: troponina I e troponina t para enfarte do miocárdio (Jaffe 2001, Cardiol Rev, 9, 318-322) e peptídeo natriurético cerebral (BNP) para insuficiência cardíaca (Cowie et al. 1997, Lancet. 8:1349-1353 Kazanegra 2001, J Card Fail. 1, 21-29). Estesbiomarcadores também parecem ter valor de prognóstico em pacientes com enfarte do miocárdio agudo ou insuficiência cardíaca.

O colágeno I e o colágeno III são os principais componentes da matriz do miocárdio. O colágeno I é sintetizado nos fibroblastos e liberado no espaço intersticial, que responde por 80% do conteúdo de colágeno cardíaco total. Nas válvulas mitral e tricúspide, a corda tendínea é na maior parte composta de tecido colagenoso, 80% dos quais contém colágenos, e os 20% restantes é composto de fibras elásticas e camadas de células de endotélio sobre a lâmina basal (Millington-Sanders et al, 1998, J Anat, 192:573-581; Yoshioka et al. 2008, Circulation, 118: 1694-1696). Embora se saiba que a válvula reumática sofre fibrose extensa com alteração da arquitetura tecidual, o mecanismo detalhado pelo qual a remodelagem decorre não é claramente conhecido. Acredita-se que a fibrose do miocárdio ocorra principalmente devido ao desacoplamento entre a síntese aumentada e inalterada ou a degradação diminuída das fibras de colágeno tipo I (Querejeta et al. 2004, Circulation, 110: 1263-1268 ; Herpel et al, Histopathology 2006, 48:736-747).

O colágeno tipo 1 é a forma mais comum de colágenos em vertebrados. Ela compreende até 90% dos esqueletos dos mamíferos e também é difundida em todo o corpo. A importância do colágeno tipo I para pesquisa médica é que ele está envolvido em muitas doenças humanas e de animais, incluindo fibrose, osteoporose, câncer, aterosclerose, etc. Apesar de, ou devido ao fato de que ela é amplamente distribuída no corpo, as diferentes partes (produtos de degradação) da molécula de colágeno tipo I são frequentemente utilizadas para monitorar as alterações fisiológicas em tecidos, em como ser usadas como ferramentas de diagnóstico em várias condições patológicas.

O colágeno tipo I é sintetizado e secretado por fibroblastos como precursor do procolágeno tipo I, que contém sequências adicionais de aminoácidos no aminoterminal (N) e nos carboxiterminais (C). Durante o processo de maturação, os propeptídeos N terminais e C terminais são clivados para produzir os monômeros helicoidais triplos (Prockop et al. 1995, Ann Rev Biochem, 64:403-34; Lopez et al. 2007, J Am Coll Cardiol, 50:859 -67). De modo importante, o pró-peptídeocarboxiterminal do procolágeno tipo I (PICP) é liberado na corrente sanguínea durante a síntese do colágeno tipo I. Por outro lado, o telopeptídeo carboxiterminal (ICTP) é eliminado durante a degradação do colágeno I (Prockop et al. 1998, Matrix Biol, 16:399-408). Portanto, PICP pode ser um marcador da síntese de colágeno.

Foi demonstrado que a concentração de PICP no soro é aumentada em pacientes com doença cardíaca hipertensiva (HHD) em comparação com indivíduos normotensos (Querejeta et al. 2000, Circulation 101: 1729-1735; Lo pez et al.2001, Circulation, 104:286-291; Querejeta et al. 2004, Circulation, 110:1263-8). Além disso, o nível mais elevado de PICP também foi relatado no soro de pacientes com insuficiência cardíaca (Lo'pez et al. 2004, J Am Coll Cardiol, 43: 2028-2035; Martoset al.2007 Circulation, 115:888-895; Gonzalez et al 2009 Cardiovasc Res. 15:509-518). Estes resultados indicaram que PICP pode ser útil para avaliar a gravidade da fibrose domiocárdio na doença cardíaca hipertensiva. No entanto, não há nenhum relato sobre PICP em pacientes com doença cardíacavalvular.

Referência pode ser feita a Carolyn, Y.H. et al. N Engl J Med. 5 de agosto de 2010; 363(6): 552-563, onde é relatado que níveis elevados de PICP no soro indicaram aumento da síntese de colágeno do miocárdio em portadores de mutação no sarcômero sem doença evidente. Este estado profibrótico precedeu o desenvolvimento da hipertrofia ventricular esquerda ou fibrose visível em MRI. No entanto, este artigo refere-se à cardiomiopatia hipertrófica, que é geneticamente definida de acordo com a mutação dos genes relevantes. O estudo envolveu 38 indivíduos com mutações sarcoméricas patogênicas e cardiomiopatia hipertrófica evidente, 39 indivíduos com mutações, mas nenhuma hipertrofia ventricular esquerda.

Nesse sentido, pode ser resumido que a doença cardíaca valvular geralmente implica a doença da válvula degenerativa, que são basicamente relacionadas com a idade. No entanto, até o momento não há dados ou demonstração da correlação de PICP mesmo com a doença da válvula degenerativa. Apesar do que a doença cardíaca reumática [RHD] é um subconjunto especial de doenças cardíacas com etiologia reumática, em que especificamente a válvula mitral é afetada. Os inventores pela primeira vez demonstraram o aumento de PICP com fibrose do tecido extensiva. Não há pacientes com RHD na população ocidental; portanto, não há dados de PICP disponíveis para RHD. Portanto, a simples menção (ou observações) em alguma literatura sobre a possibilidade de PICP como um marcador para doença valvular não deve conflitar com o uso de PICP para o marcador de RHD, especificamente. Em resumo, a literatura disponível mostra PICP como um marcador para doenças cardíacas, que é bastante inespecífica. A presente invenção descreve que PICP é específico para RHD porque a remoção da válvula defeituosa reduz o seu nível até quase o normal. O objetivo deste estudo foi analisar se o PICP é alterado no plasma de pacientes com doença valvular reumática que representa uma importante causa de internação hospitalar com problemas cardíacos nos países em desenvolvimento.

A presente invenção divulga um biomarcador para doenças cardíacas valvulares de origem reumática útil para a detecção, caracterização e tratamento das mesmas.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

O objetivo da presente invenção é fornecer um biomarcador útil para a detecção de doenças cardíacas valvulares de origem reumática, a caracterização e o tratamento das mesmas.

Um objeto adicional da invenção é desenvolver um kit para detectar as doenças cardíacas valvulares de origem reumática.

Outro objeto da presente invenção é desenvolver um protocolo para rastrear o fármaco antifibrótico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um biomarcador e seu uso para o diagnóstico da doença cardíaca valvular de origem reumática. Em particular, a presente invenção fornece um biomarcador que é pró-peptídeo carboxiterminal do procolágeno tipo I (PICP) para o diagnóstico da doença cardíaca valvular útil para a detecção, caracterização e tratamento da mesma. Além disso, a presente invenção é direcionada para a caracterização da fibrose e remodelagem da válvula cardíaca humana em pacientes que sofrem de doenças cardíacas valvulares.

Além disso, a presente invenção fornece métodos para determinar o risco de progressão da doença valvular em um indivíduo, compreendendo a análise da amostra biológica de um indivíduo necessitado disto, estimativa do valor de corte de PICP na dita amostra e determinação de que o indivíduo está em maior risco de progressão da doença valvular, se o nível de PICP excede o valor limite predeterminado.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para detecção da presença de PICP no sangue, compreendendo fornecer sangue de um indivíduo e entrar em contato com reagentes relacionados para detecção de PICP com amostra de sangue em condições tais que os reagentes detectam a ausência ou presença de PICP no sangue.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para detectar PICP na urina que compreende fornecer urina de um indivíduo e colocar o reagente em contato necessário para a detecção de PICP com urina em condições tais que os reagentes detectam a ausência ou presença de PICP na urina.

O presente método é útil para o controle da doença valvular em um indivíduo por monitoramento constante da amostra de sangue ou urina do indivíduo. No presente método, a presença de PICP durante a síntese de colágeno é indicativa do prognóstico da doença valvular no dito indivíduo.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção descreve o mecanismo de PICP aumentado em pacientes com doença cardíaca valvular, que é principalmente devido à remodelagem alterada do tecido da válvula.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção caracteriza a remodelagem do tecido valvular em pacientes que sofrem de defeitos da válvula cardíaca.

Em mais um aspecto, a presente invenção fornece métodos para a triagem de fármacos contra a fibrose, particularmente pelo monitoramento do nível de PICP em um indivíduo.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para verificar a eficiência dos fármacos antifibróticos não limitada aos pacientes com doença valvular, pelo monitoramento do nível e PICP no plasma em um indivíduo.

Em outra modalidade, a presente invenção investiga se o marcador da biossíntese de colágeno é aumentado em pacientes com doença valvular de origem reumática, que poderia ser usado como biomarcador.

A presente invenção fornece um método em que o nível de PICP é usado para prever a gravidade da doença cardíaca valvular de origem reumática.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método em que o diagnóstico da doença valvular de origem reumática é realizado usando o dito nível de PICP no sangue ou urina no dito indivíduo.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método em que o prognóstico é realizado usando o dito PICP no referido sangue ou urina no dito indivíduo.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um kit de diagnóstico para caracterização da doença valvular em um indivíduo, compreendendo o reagente de diagnóstico que compreende PICP como uma sonda.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método para kit de diagnóstico para caracterização da doença valvular em um indivíduo, compreendendo um reagente de diagnóstico que compreende qualquer/quaisquer componente(s) durante a biossíntese de colágeno como uma sonda.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a triagem de fármacos antifibróticos para pacientes com doença valvular usando PICP como um marcador da fibrose.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece um método em que qualquer/quaisquer componente(s)/etapa(s) da biossíntese de colágeno é utilizada como um marcador para a triagem de fármacos antifibróticos para pacientes com doença valvular.

Portanto, a presente invenção fornece um biomarcador para doenças cardíacas valvulares de origem reumática úteis para a detecção, caracterização, tratamento e prognóstico das mesmas em um assunto, em que o dito biomarcador é o peptídeo procolágeno tipo 1C (PICP), representado pela SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID No. 2.

A invenção também fornece um kit de diagnóstico para caracterizar a doença cardíaca valvular de origem reumática em um indivíduo, que compreende reagentes de diagnóstico e o biomarcador PICP como uma sonda.

A invenção fornece ainda um método de detecção da presença da doença cardíaca valvular de origem reumática em um indivíduo que compreende:detectar o nível de PICPs em uma amostra biológica do indivíduo, as ditas PICPs sendo selecionadas do peptídeo procolágeno tipo 1C representado pela SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID No. 2, em que a presença de PICPs em um nível maior do que 585,7 ng/mL é indicativa de doença cardíaca valvular de origem reumática.

Peptídeo procolágeno tipo 1C (PICP) representado pela SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID No. 2 útil na detecção, caracterização, tratamento e prognóstico das doenças cardíacas valvulares de origem reumática. A SEQ ID NO. 1 compreende 246 aminoácidos representando os aminoácidos 1219 a 1464 do pró-peptídeo carboxiterminal da cadeia alfa-1(1) do colágeno. Além disso, a SEQ ID No. 2 compreende 264 aminoácidos representando os aminoácidos 1103 a 1366 do pró-peptídeo carboxiterminal da cadeia alpf-2(I) do colágeno. O peptídeo procolágeno tipo 1C é útil na triagem de fármacos antifibróticos. Em outro aspecto, a presente invenção pode ser usada para detectar a presença de doença valvular cardíaca de origem reumática em um indivíduo, o dito método compreendendo as etapas de:detectar o nível de PICPs em uma amostra biológica do indivíduo, as ditas PICPs sendo selecionadas do peptídeo procolágeno tipo 1C representado pela SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID No. 2, em que a presença de PICPs em um nível maior do que 585,7 ng/mL é indicativa de doença cardíaca valvular de origem reumática.

A amostra biológica é coletada de um grupo que compreende tecido, sangue e urina.O método é usado para prever a gravidade da doença cardíaca valvular de origem reumática.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS ASSOCIADAS

A figura 1A mostra o nível de PICP no plasma de seres humanos normais (controle) e pacientes com doença cardíaca valvular (VHD) antes (VHD Pre Op) ou após a substituição da válvula doente (VHD Post Op) com um dispositivo de prótese.A figura 1B mostra a curva característica de operação do receptor (ROC) de PICP em seres humanos.

A figura 1C mostra o nível de PICP no plasma de pacientes com doença cardíaca valvular predominantemente com lesões estenóticas mitrais (MS), regurgitação mitral (MR) ou tipo misto de lesões (M).

A figura 2 mostra a detecção de PICP na amostra de sangue de seres humanos com doença valvular por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

A figura 3 mostra uma correlação direta do nível de PICP com a gravidade da doença cardíaca valvular (área da válvula reduzida) em pacientes estenóticos mitrais (MS).A figura 4 ilustra o nível de concentração de PICP na urina de pacientes com doença valvular.

A figura 5 ilustra a histologia mostrando a arquitetura da válvula dos pacientes humanos.As figuras 5A e 5B retratam as seções coradas com hematoxilina e eosina da válvula mitral.

A figura 5C mostra seções coradas do tricroma de Massoncom deposição excessiva de colágeno no tecido da válvula.A figura 5D mostra o aumento nas fibrilas de colágeno 1na válvula doente dos seres humanos.

Marcador para doença da válvula cardíaca: A presente invenção demonstra o nível aumentado de peptídeo procolágeno tipo 1C (PICP) no plasma de pacientes com doença cardíaca valvular de origem reumática. O colágeno I é sintetizado a partir de uma molécula precursora conhecida como procolágeno I. Os pró-peptídeos carboxiterminais e aminoterminais são clivados para produzir os monômeros helicoidais triplos que são, por fim, convertidos em fibrilas de colágeno maduras. Os pró-peptídeos livres são liberados na corrente sanguínea após remoção por clivagem dos monômeros helicoidais triplos. A liberação do pró-peptídeo carboxiterminal do pró-colágeno I (PICP) no sangue é aumentada conforme a síntese de colágeno I é aumentada (Prockop et al 1998. Matrix Biol, 16:399-408; Trackman 2005. J Cell Biochem, 96:927-937; Lopez et al 2007. J Am Coll Cardiol, 50:859-867). No entanto, não se sabe se a síntese de colágeno I é aumentada na válvula cardíaca durante a doença valvular. Não se sabe também se a deposição de colágeno é maior na válvula mitral durante doenças cardíacas valvulares. Assim, na presente invenção, o nível aumentado de PICP foi examinado em 80 pacientes humanos sofrendo de doença cardíaca valvular, diagnosticados por análise de imagem(ecocardiograma) por médicos experientes, e indivíduos de controle com idade de 20 anos corresponderam ao controle, livres de quaisquer doenças.

A concentração total do pró-peptídeo carboxiterminal do pró-colágeno I (PICP) em amostras de sangue e/ou urina de um indivíduo humano é contribuída por 2 formas de PICP, do que um é parte da cadeia de colágeno alfa-1 (I) representado pela SEQ ID No. 1 [P02452 (COIAI_HUMAN) Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot] e o outro é parte da cadeia de colágeno alfa-2(I) representada pela SEQ ID No. 2 [P08123 (C01A2_HUMAN) Reviewed,UniProtKB/Swiss-Prot]. As respectivas sequências são descritas abaixo:SEQ ID No. 1: P02452 (CO1A1_HUMAN) Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot 1220DD 1230ANVVRDRDLE 1240VDTTLKSLSQ 1250QIENIRSPEG 1260SRKNPARTCR 11270 1280 1290 1300 1310 1320DLKMCHSDWK SGEYWIDPNQ GCNLDAIKVF CNMETGETCV YPTQPSVAQK NWYISKNPKD1333 1340 1350 1360 1370 1380KRHVWFGESM TDGFQFEYGG QGSDPADVAI QLTFLRLMST EASQNITYHC KNSVAYMDQQ1390 1400 1410 1420 1430 1440TGNLKKALLL QGSNEIEIRA EGNSRFTYSV TVDGCTSHTG AWGKTVIEYK TTKTSRLPII1450 1460DVAPLDVGAP DQ∑FGFDVGP VCFL1219-1464 ^ Pró-peptídeo C-terminal. 246 aminoácidos. Parte da cadeia de colágeno SEQID No. 2: P08123 (C01A2_HUMAN) Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot 1110 1120 1130 1140VSGGGYDF GYDGDFYRAD QPRSAPSLRP KDYEVDATLK1150 1160 1170 . 1180 1190 1200SLNNQIETLL TPEGSRKNPA RTCRDLRLSH PEWSSGYYWI DPNQGCTMDA IKVYCDFSTG1210 1220 ' 1230 1240 . ■ 1250 1260ETCIRAQPEN IPAKNWYRSS KDKKHVWLGE TINAGSQFEY NVEGVTSKEM ATQLAFMRLL1270 1280 1290 1300' 1310 1320ANYASQNITY HCKNSIAYMD EETGNLKKAV ILQGSNDVEL VAEGNSRFTY TVLVDGCSKK1330 1340 1350 1360TNEWGKTIIE YKTNKPSRLP FLDIAPLDIG GADQEFFVDI GPVCFK1103-1366 ^ Peptídeo C-terminal, 264 aminoácidos. Parte da cadeia de colágeno alfa-2(I).

A presente invenção demonstra um nível reduzido do biomarcador presente nos pacientes com doença cardíaca valvular de origem reumática após a substituição da válvula cardíaca defeituosa pela prostética.

A presente invenção descreve ainda o método de prognóstico da doença cardíaca valvular de origem reumática pela medição quantitativa do presente biomarcador PICP na amostra de sangue e/ou urina. Quando a válvula é substituída, a fonte do biomarcador é removida do corpo e, deste modo, o nível do biomarcador é reduzido. Isto é principalmente devido à válvula defeituosa, que é a principal fonte de alto nível do presente biomarcador no sangue dos pacientes com doença valvular.

A presente invenção também descreve métodos estatísticos para a qualificação deste biomarcador para o diagnóstico de doença valvular. A análise estatística, como a curva ROC, revela o valor de corte deste biomarcador para prever a doença valvular em um indivíduo. Verificou-se que a concentração de corte deste biomarcador encontra-se acima do limite normal de indivíduos de controle.

Além disso, a presente invenção demonstra a correlação do presente biomarcador PICP com a gravidade da doença cardíaca valvular de origem reumática. A doença cardíaca da válvula mitral é caracterizada por uma diminuição na área da válvula. Portanto, a área valvular é diminuída com o aumento da gravidade da doença cardíaca valvular. A concentração plasmática de PICP é aumentada com a redução da área valvular.

Em outro aspecto, a presente invenção descreve o marcador de síntese de colágeno e/ou fibrose como um biomarcador para defeitos valvulares no coração. O nível de deposição de colágeno é aumentado na válvula cardíaca, levando à fibrose. Consequentemente, um maior nível de PICP é liberado na circulação com a maior síntese de colágeno na válvula cardíaca.

A presente invenção também ilustra a ocorrência de extensa fibrose na válvula mitral de pacientes com doença cardíaca valvular. É demonstrado que a deposição de colágeno I é aumentada significativamente na válvula mitral dos pacientes com doença valvular.

Além disso, a presente invenção descreve também o método de detecção da doença cardíaca valvular de origem reumática usando amostras de urina. A possibilidade de defeitos na válvula cardíaca também pode ser prevista com base no nível de PICP nas amostras de urina dos pacientes. O nível aumentado de PICP na amostra de urina foi registrado em 10 pacientes humanos que sofrem de defeitos cardíacos valvulares, confirmado por ecocardiografia. A presente invenção descreve também a correlação positiva de PICP no plasma com as amostras de urina de pacientes que sofrem de defeitos da válvula cardíaca. Embora

PICP seja diluída até 500 vezes na urina em comparação com o plasma, no entanto, ele foi detectado pelo método de ensaio. A detecção do presente biomarcador na urina é útil para fins práticos.

DEFINIÇÕES

Biomarcador: Um biomarcador pode ser definido como uma característica física específica utilizada para medir ou indicar os efeitos ou a progressão de uma doença ou condição. De uma perspectiva clínica, os biomarcadores têm uma variedade de funções, que correspondem a diferentes estágios no desenvolvimento de uma doença. Os biomarcadores podem auxiliar no cuidado de pacientes sem doença aparente (biomarcadores de triagem), em pessoas com suspeita de ter a doença (biomarcadores de diagnóstico) e aqueles com doenças evidentes (biomarcadores de prognóstico (Gerszten e Wang, 2008, Nature 451, 949-952)).

O termo “válvula cardíaca” refere-se à válvula no coração que normalmente permite que o sangue flua através dele em apenas uma direção. Há quatro em um coração e elas determinam o caminho do fluxo de sangue pelo coração.

"Doença cardíaca valvular" é qualquer processo de doença envolvendo uma ou mais das válvulas do coração (as válvulas aórtica e mitral, do lado esquerdo, e as válvulas pulmonar e tricúspide, à direita). Assim, o termo "doença valvular", conforme usado neste documento, refere-se a indivíduos humanos com doença cardíaca valvular.

"Febre reumática" é uma doença inflamatória que ocorre após uma infecção com estreptococos do grupo A, (como infecção na garganta ou escarlatina). Acredita-se que seja causada por reatividade cruzada de anticorpo que pode envolver o coração, articulações, pele e cérebro.

Para uso na presente invenção, o termo "indivíduo" se refere aos seres humanos que foram incluídos neste estudo ou qualquer ser humano que deve ser o receptor de um tratamento particular. Tipicamente, os termos "indivíduo" e "paciente" são usados de forma intercambiável neste documento em referência a um indivíduo humano.Para uso na presente invenção, "sangue" refere-se ao sangue de seres humanos utilizado para este estudo.

Para uso na presente invenção, "plasma" refere-se a "plasma sanguíneo de seres humanos", que é o componente líquido amarelo de sangue em que as células sanguíneas no sangue total são normalmente suspensas. Ele compõe cerca de 55% do volume de sangue total. Ele é a parte de fluido intravascular do fluido extracelular. Ele é composto principalmente de água (90% em volume) e contém proteínas dissolvidas, glicose, fatores de coagulação, íons minerais, hormônios e dióxido de carbono (plasma sendo o principal meio para o transporte de produto excretor). O plasma sanguíneo é preparado pela rotação de um tubo de sangue fresco contendo um anticoagulante em uma centrífuga até que as células do sangue se depositem no fundo do tubo. O plasma sanguíneo é a seguir derramado ou retirado.

"Fibrose" é a formação ou desenvolvimento de excesso de tecido conjuntivo fibroso em um órgão ou tecido como processo reparativo ou reativo, ao contrário da formação de tecido fibroso como um constituinte normal de um órgão ou tecido. Fibrose, conforme usado neste documento, refere-se à formação de tecido fibroso dentro da válvula cardíaca de seres humanos.

Colágeno é um grupo de proteínas de ocorrência natural. Na natureza, ele é encontrado exclusivamente em animais, especialmente na carne e tecidos conjuntivos de mamíferos. Ele é o principal componente do tecido conjuntivo e é a proteína mais abundante nos mamíferos, compondo até cerca de 25% a 35% do conteúdo de proteína de todo o corpo. Colágeno, sob a forma de fibrilas alongadas, encontra-se principalmente nos tecidos fibrosos, como tendões, ligamentos e pele, e também é abundante na córnea, cartilagem, osso, vasos sanguíneos, intestino e disco intervertebral.

A ecocardiografia refere-se ao eletrocardiograma, criando uma imagem bidimensional do sistema cardiovascular. "Ecocardiografia", usado neste documento, refere-se à captura de imagem do coração de seres humanos por ultrassom cardíaco.

Curva ROC: na teoria da detecção de sinal, um receptor das características dos operadores (ROC) ou simplesmente curva ROC, é uma representação gráfica da sensibilidade, ou verdadeiros positivos, vs. (1-especificidade), ou falsos positivos, para um sistema classificador binário, uma vez que o seu limiar de discriminação é variado. A ROC também pode ser representada equivalentemente pela representação gráfica da fração de verdadeiros positivos (TPR = verdadeira taxa positiva) vs. a fração de falsos positivos (FPR = falsa taxa positiva). A análise ROC fornece ferramentas para selecionar modelos possivelmente ideais e descartar aqueles subótimos independentemente do (e antes de especificar) o contexto de custo ou a distribuição de classe. A análise ROC está relacionada de forma direta e natural com a análise de custo/benefício da tomada de decisão de diagnóstico (Zou, et al, 2007. Circulation, 6:654-657; Lasko, et al 2005. J Biomed Informatics, 38:404-415).

A curva ROC neste documento refere-se ao gráfico da sensibilidade e especificidade do presente biomarcador entre os indivíduos de controle e com a doença cardíaca valvular.SBP refere-se a pressão sanguínea sistólica. DBP refere-se a pressão sanguínea diastólica. A maior pressão na corrente sanguínea ocorre durante cada batimento cardíaco, por causa da sístole. A pressão sistólica é a pressão de pico nas artérias, que ocorre próximo do final do ciclo cardíaco quando os ventrículos estão se contraindo. A pressão diastólica é a pressão mínima nas artérias, que ocorre próximo do início do ciclo cardíaco quando os ventrículos estão se enchendo com sangue. Um exemplo de valores medidos normais para um ser humano adulto saudável em repouso é de 120 mm Hg sistólica e 80 mm Hg diastólica (escrito como 120/80 mm Hg). As pressões sanguíneas arteriais sistólicas e diastólicas não são estáticas, mas sofrem variações naturais de um batimento cardíaco para o outro e ao longo de todo o dia (em um ritmo circadiano). Eles também mudam em resposta ao estresse, fatores nutricionais, fármacos, doenças, exercício e momentaneamente ao ficar de pé. Às vezes, as variações são grandes.LA refere-se ao átrio esquerdo do coração. O átrio esquerdo é uma das quatro câmaras no coração humano. Ele recebe o sangue oxigenado das veias pulmonares e o bombeia para dentro do ventrículo esquerdo, através da válvula atrioventricular.

A fibrilação atrial (AF ou A-fib) é a arritmia cardíaca mais comum (ritmo cardíaco anormal) e envolve as duas câmaras superiores (átrios) do coração. Seu nome provém de fibrilação (ou seja, tremulação) dos músculos cardíacos dos átrios, em vez de uma contração coordenada. Muitas vezes ela pode ser identificada medindo um pulso e observando que os batimentos cardíacos não ocorrem em intervalos regulares. No entanto, um indicador mais forte de AF é a ausência de ondas P em um eletrocardiograma (ECG), que estão normalmente presentes quando há uma contração atrial coordenada no início de cada batimento cardíaco. O risco aumenta com a idade, com 8% de pessoas com mais de 80 possuindo AF. em AF, os impulsos elétricos normais que são gerados pelo nó sinoatrial são sobrecarregados por impulsos elétricos desorganizados que se originam nos átrios e veias pulmonares, levando à condução dos impulsos irregulares para os ventrículos que geram o batimento cardíaco. O resultado é um batimento cardíaco irregular que pode ocorrer em episódios que duram de minutos a semanas, ou poderia ocorrer a todo o momento durante anos. A tendência natural de AF é uma condição crônica. AF crônica leva a um pequeno aumento do risco de morte (Benjamin et al 1998, Circulation 98: 946-52; Wattigney et al. 2002, Am. J. Epidemiol. 155: 819-826).LVIDd refere-se ao diâmetro diastólico interno do ventrículo esquerdo. Ele é um parâmetro ecocardiográfico para monitoramento da dilatação do ventrículo. LVIDd é útil para avaliar a hipertrofia ventricular esquerda.LVIDs refere-se ao diâmetro interno ventricular esquerdo na sístole. Ele é um parâmetro ecocardiográfico para monitoramento da hipertrofia ventricular esquerda.LVPW refere-se à parede posterior ventricular esquerda. O ventrículo esquerdo apresenta forma cônica. Embora os limites sejam imprecisos, ela pode ser dividida, exceto no ápice, em quatro paredes, classicamente denominadas septal, anterior, lateral e inferoposterior. A parte basal da parede inferoposterior normalmente se ramifica para cima e, em seguida, torna-se realmente posterior e, por essa razão, foi chamada de parede posterior. Fornecimento de sangue da parede posterior: artérias coronárias-circunflexas (Cx), obtusa marginal (OM), posterolateral (PL).

Durante mais de 60 anos, os termos enfarte posterior, injúria e isquemia foram aplicados quando considerou-se que a parte basal da parede inferoposterior foi afetada. A oclusão da artéria coronária direita também pode produzir enfarte posterior — com ou sem enfarte inferior. O verdadeiro enfarte posterior é difícil de diagnosticar.

O verdadeiro enfarte posterior pode produzir mudanças apenas na direção de V1 e V2. As alterações do ECG do enfarte posterior são alterações "recíprocas", ou seja, elas são vistas "para trás" da frente do coração na direção VI. QS tornam-se grandes Rs, a elevação de ST é vista como uma depressão, inversão de T é vista como um T na posição vertical. As direções V1 e V2 têm grandes ondas R, que são "ondas Q refletidas" na parte de trás do coração. A depressão de segmento ST é a elevação ST "recíproca ou refletida”, da parte de trás do coração. As ondas T se tornarão verticais. No enfarte posterior verdadeiro, nenhuma anormalidade é vista nas origens do membro. No entanto, o enfarte posterior é geralmente acompanhado pelo enfarte de outra área, uma vez que a parede inferiorIVSD refere-se à espessura do septo interventricular na diástole. Ele é um parâmetro ecocardiográfico para avaliação da hipertrofia ventricular esquerda.EF refere-se à fração do sangue bombeado para fora dos ventrículos com cada batimento cardíaco. O termo fração de ejeção se aplica a ambos os ventrículos direito e esquerdo; pode-se falar igualmente da fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF) e da fração de ejeção ventricular direita (RVEF). RVEF e FEVE podem variar amplamente de um outro incumbente por meio do estado fisiológico. Por definição, o volume de sangue dentro de um ventrículo imediatamente antes de uma contração é conhecido como o volume final diastólico. Semelhantemente, o volume de sangue deixado em um ventrículo no final da contração é o volume sistólico final. A diferença entre os volumes diastólico final e sistólico final é o volume de derrame, o volume de sangue ejetado com cada batida. A fração de ejeção (EF) é a fração do volume final diastólico que é ejetada com cada batida; ou seja, é o volume de bombeamento (SV) dividido pelo volume final diastólico (EDV). A fração de ejeção é comumente medida por ecocardiografia, em que os volumes das câmaras cardíacas são medidos durante o ciclo cardíaco. A fração de ejeção pode, a seguir, ser obtida dividindo-se o volume de bombeamento pelo volume final diastólico conforme descrito acima. Indivíduos saudáveis têm tipicamente frações de ejeção entre 50% e 65%.PASP refere-se à pressão sistólica da artéria pulmonar. Ela é uma medida da pressão sanguínea encontrada na artéria pulmonar. Ela é um parâmetro ecocardiográfico.

Inibidores da ECA refere-se à enzima conversora da angiotensina. Inibidores da ECA bloqueiam a conversão da angiotensina I em angiotensina II. Com o uso do inibidor da ECA, os efeitos da angiotensina II são evitados, levando à diminuição da pressão sanguínea. Eles, portanto, reduzem a resistência arteriolar e aumentam a capacidade venosa; aumentam o débito cardíaco e o índice cardíaco, trabalho e volume sistólico, reduzem a resistência renovascular e levam à natriurese aumentada (excreção de sódio na urina). Os inibidores da ECA demonstraram ser eficazes para indicações diferentes da hipertensão, mesmo em pacientes com pressão sanguínea normal. O uso de uma dose máxima de inibidores da ECA em tais pacientes (inclusive para prevenção de nefropatia diabética, insuficiência cardíaca congestiva, profilaxia de eventos cardiovasculares) é justificado porque melhora os resultados clínicos, independentemente do efeito de redução da pressão sanguínea dos inibidores da ECA. Tal terapia, naturalmente, exige a titulação cuidadosa e gradual da dose para evitar os efeitos de rápida redução da pressão sanguínea (tontura, desmaio, etc.).

Os beta bloqueadores (algumas vezes escritos como β-bloqueador) é uma classe de fármacos usada para várias indicações, mas particularmente para o controle de arritmias cardíacas, cardioproteção após enfarte do miocárdio (ataque cardíaco) e hipertensão. Como antagonistas dos receptores beta adrenérgicos, eles diminuem os efeitos da epinefrina (adrenalina) e outros hormônios de estresse. Inventado pelo Sr. James W. Black no final da década de 1950, o propranolol foi o primeiro beta bloqueador clinicamente útil; ele revolucionou o controle médico da angina de peito e é considerado uma das contribuições mais importantes para a medicina clínica e farmacologia do século XX (Pritchett e Redfield, 2002. Mayo Clin. Proc. 77: 839-845). Os beta bloqueadores também podem ser referidos como agentes de bloqueio beta adrenérgicos, antagonistas beta adrenérgicos ou beta antagonistas. Inibidores da ECA referem-se, neste documento, aos inibidores da enzima conversora da angiotensina, que são utilizados 24/39 principalmente no tratamento da hipertensão e insuficiência cardíaca congestiva.Digoxina, também conhecida como digitalis, é um glicosídeo cardíaco purificado extraído da planta dedaleira, Digitalis lanata (Hollman 1985 Br. Heart J, 54: 258-261). Suaaglicona correspondente é a digoxigenina, e seu derivado acetila é acetildigoxina. A digoxina é amplamente utilizada no tratamento de várias doenças cardíacas, a saber, fibrilação atrial, agitação atrial e, às vezes, insuficiência cardíaca, que não podem ser controladas por outros medicamentos.

Os principais efeitos farmacológicos da digoxina estão no coração. Os efeitos extracardíacos são responsáveis por muitos dos efeitos adversos. Ele tem efeitos mecânicos, uma vez que aumenta a contratilidade miocárdica; no entanto, a duração da resposta contrátil é ligeiramente aumentada. Em geral, a frequência cardíaca é reduzida, enquanto que a pressão sanguínea aumenta conforme o volume de bombeamento é aumentado, levando a uma maior perfusão tecidual. A eficiência do miocárdio melhora devido à melhor hemodinâmica, e a curva da função ventricular é melhorada.

Diurético refere-se a qualquer fármaco que eleva a taxa de micção e, portanto, fornece um meio de diurese forçada. Existem várias categorias de diuréticos. Todos os diuréticos aumentam a excreção de água dos corpos, embora cada classe faça isso de forma distinta. Diuréticos de teto alto são diuréticos que podem causar uma diurese substancial - até 20%[1] da carga filtrada de NaCl e água. Isso é muito quando comparado com a reabsorção de sódio renal normal, que deixa passar apenas - 0,4% do sódio filtrado na urina. Diuréticos de alça têm essa capacidade e, portanto, são muitas vezes sinônimos de diuréticos teto alto. Diuréticos de alça, como furosemida, inibem a capacidade do corpo para reabsorver sódio na alça ascendente no rim, que leva a uma retenção de água na urina, uma vez que a água normalmente acompanha o sódio de volta para5 o líquido extracelular (ECF). Outros exemplos de diuréticos de alça teto alto incluem o ácido etacrínico, torsemida e bumetanida. Na medicina, diuréticos são usados para tratar a insuficiência cardíaca, cirrose hepática, hipertensão e certas doenças renais. Diuréticos são usados neste documento para10 tratar a insuficiência cardíaca em pacientes com VHD.

A classe NYHA refere-se à Classificação Funcional da Associação do Coração de Nova Iorque (NYHA). Ela fornece uma maneira simples de classificar a extensão da insuficiência cardíaca. Ela enquadra pacientes em uma das quatro categorias15 com base no quanto eles são limitados durante a atividade física; as limitações/sintomas são em relação à respiração normal e diferentes graus de falta de ar e/ou dor de anginar:

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são dados a título de ilustração e, portanto, não devem ser interpretados para limitar o escopo da presente invenção.Exemplo 1 Detecção de PICP no plasma sanguíneo Indivíduos

As amostras de sangue e a amostra da válvula cardíaca foram obtidas de pacientes que frequentam a clínica de cardiologia e o departamento de cirurgia cardiotorácica do Instituto de Pós-Graduação de Educação e Pesquisa de Ciências Médicas (IPGME&R), Seth Sukhlal Kanoria Memorial Hospital (SSKM), Calcutá, Índia, entre Janeiro e Agosto de 2010, com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional. Obteve-se consentimento informado de todos os indivíduos antes da participação no estudo. Amostras de tecido da válvula cardíaca foram derivadas de pacientes submetidos à substituição das válvulas cardíacas doentes com dispositivo de prótese depois de receber o consentimento do dador. A população do estudo consistiu em 80 pacientes de várias idades (15-65 anos), encaminhadas para avaliação cardiotorácica do serviço de cardiologia. Os pacientes com evidências clínicas e ecocardiográficas de doença cardíaca valvular foram selecionados para o estudo. Os dados foram registrados em um formulário estruturado, e o exame clínico foi feito por médicos treinados e as informações inseridas em um banco de dados.

Os pacientes com diabetes, hipertensão, qualquer doença cardíaca orgânica, exceto doença cardíaca valvular e características clínicas de insuficiência cardíaca evidente foram excluídos do estudo. Aqueles pacientes com condições clínicas associadas com maior renovação de PICP do soro (como insuficiência renal, doença óssea metabólica e disfunção hepática) também foram excluídos do estudo após cuidadoso histórico, exame clínico e investigações relevantes.

Indivíduos normais: vinte pessoas saudáveis sem evidência de morbidez cardíaca ou qualquer outra conhecida por alterar os níveis de PICP foram selecionadas como controles e passaram pelos mesmos exames clínicos e protocolos de investigação.

Pacientes após a substituição da válvula: o sangue também foi coletado de 7 indivíduos a cerca de um mês após a substituição cirúrgica da válvula cardíaca por uma prótese.

Características da linha de base

Exame clínico: os sintomas do paciente foram registrados de acordo com a classe funcional da Associação do Coração de Nova Iorque (NYHA). A pressão sanguínea sistólica (SBP) e a pressão sanguínea diastólica (DBP) foram monitoradas na posição sentada, pelo uso de equipamento de braçadeira padrão na clínica. A frequência de pulso, incluindo qualquer irregularidade, foi anotada.

Eletrocardiograma (ECG) : Os ECGs mais recentes foram revistos para notar verificar qualquer ritmo anormal. Radiografia de tórax. A razão cardiotorácica foi medida a partir da radiografia de tórax realizada em cada paciente.

Ecocardiografia: Ecocardiografia bidimensional com modo M direcionado e medições de ultrassom Doppler foram realizadas nos pacientes por cardiologistas experientes do hospital SSKM, Calcutá, Índia. Todas as medições foram feitas por observadores cegos. As dimensões do átrio esquerdo e a dimensão do ventrículo esquerdo, tanto na sístole quanto na diástole, foram registradas. As áreas da válvula mitral (MVA) foram medidas por planimetria, bem como o método de meio tempo de pressão (PHT) e a média destas duas leituras foram tomadas em pacientes com doença da válvula mitral. A pressão sistólica da artéria pulmonar (PASP) também foi medida nos pacientes. A fração de ejeção ventricular esquerda (EF) foi calculada pelo método de Teichholz. Nenhum dos pacientes estudados tinham disfunção sistólica ventricular conforme avaliado por uma fração de ejeção < 50%. Medições de ultrassom Doppler foram estudadaspara registrar os gradientes de pressão pelas válvulas e para avaliar a gravidade hemodinâmica das lesões. As lesões daválvula foram classificadas como leve, moderada ou severa, naimpressão final.

As características de linha de base dos pacientes são demonstradas na Tabela 1. Dos 80 pacientes com doença valvular, as lesões estenóticas (estenose mitral), regurgitante (regurgitante mitral) e lesões mistas estavam presentes em 32, 23 e 25 indivíduos, respectivamente. Cerca de 51% dos pacientes (41 de 80 pacientes) eram do sexo feminino. 52,5% dos pacientes apresentavam histórico definido de febre reumática, como documentado em seus prontuários médicos ou conforme sugerido pelo histórico de artrite da articulação grande, cardite, febre e histórico de profilaxia com penicilina documentado. As principais variáveis clínicas e demográficas foram comparáveis entre os três subgrupos de pacientes, conforme avaliado pela ANOVA unicaudal. 61% dos pacientes eram sintomáticos de classe I de NYHA. 28% dos pacientes não tinham histórico de uso demedicação, 68% estavam sob diuréticos (furosemida, torsemida) e 38% usavam espironolactona, 55% digoxina e 10% usavam betabloqueadores, 15% tinham histórico de ingestão de inibidores da ECA.Tabela 1 Características do Paciente de Linha de Base

Ns, não significativo; S, significativoDeterminações bioquímicas

Amostras de sangue venoso periférico foram tomadas durante a avaliação clínica e imediatamente submetidas ao5 isolamento de plasma. Cada amostra foi centrifugada durante 10 minutos a 4°C. O plasma foi, a seguir, separado em alíquotas e armazenado a -80°C, antes da análise. As medições duplicadas foram realizadas e ponderadas.

Protocolo para a Estimativa de PICP

A concentração plasmática de PICP foi determinada porimunoensaio enzimático (EIA) com um anticorpo anti-PICP monoclonal usando sistema de ensaio comercial (Takara Bio Inc).

As variações de um ensaio e entre ensaios para determinar as concentrações de PICP foram 6% e 5%, respectivamente.

O plasma foi isolado do sangue e diluído 10 vezes com a solução diluente fornecida com o kit de ensaio PICP. As determinações duplicadas de todas as amostras e padrões foram realizadas.

Reação imunológica: 100 μL de solução de conjugado marcado com anticorpo-peroxidase foi transferido para cada poço, e posteriormente 20 μL de amostra (plasma) ou solução de proteína PICP padrão foi adicionado. A placa de microtitulação foi vedada e bem misturada e, em seguida, mantida sob repouso durante 3 horas a 37 °C.

Lavagem e desenvolvimento: os conteúdos foram removidos por sucção e os poços foram lavados 4 vezes com 400 μL de PBS. Em seguida, 100 μL de solução de substrato foi adicionado em cada poço e incubado em temperatura ambiente durante 15 minutos. No final da incubação, 100 μL de solução de parada foi adicionado em cada poço na mesma ordem que para o substrato. A absorvância foi medida a 450 nm com um leitor de placa.

Cálculo: Uma curva padrão foi representada graficamente com absorvância (OD) de concentração de PICP conhecida. A concentração de PICP nas amostras de plasma dos indivíduos foi calculada a partir da curva padrão gerada com as concentrações conhecidas de PICP fornecidas com o sistema de ensaio.

Estatística

Os dados são expressos como a média ± SEM para variáveis contínuas, enquanto que as frequências resumem variáveis discretas. A distribuição normal de todas as variáveis contínuas foi testada usando o teste de Kolmogorov-Smirnov de 1 amostra. A análise de variância unicaudal (ANOVA) foi utilizada para avaliar diferenças de variáveis contínuas entre os três grupos de pacientes com doença de válvula. De outro modo, um teste não paramétrico (teste de Kruskal Wallis) foi usado. As comparações entre as variáveis categóricas foram feitas por X 2 o teste exato de Fisher, quando necessário. As diferenças no grupo de pacientes foram testadas por um teste t de Student para dados pareados uma vez demonstrada a normalidade. As diferenças entre os grupos de controle e de pacientes foram testadas por um teste t de Student para dados não pareados, uma vez demonstrada a normalidade. A correlação entre variáveis continuamente distribuídas foi testada usando o coeficiente de correlação de Pearson r. Os coeficientes de correlação parciais, ajustados para idade, foram calculados para avaliar a relação entre parâmetros ecocardiográficos e marcadores bioquímicos. As curvas ROC foram representadas graficamente para avaliar a utilidade de alterações nos níveis de PICP na previsão da doença cardíaca valvular. Um valor de probabilidade < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados: A figura 1A demonstrou que o nível de PICP plasmático foi aumentado em pacientes com doença cardíaca valvular (VHP Pre Op) de origem reumática (1404 ± 81 ng/mL) em comparação com o controle (352 ± 19). A análise do teste T de Student revela p < 0,0001. O nível de PICP foi significativamente reduzido um mês após a válvula defeituosa ser substituída (VHD Post Op) com uma prótese (580 ± 118 ng/mL). Para testar a especificidade e a sensibilidade do biomarcador para predizer a doença valvular, a análise da curva ROC foi realizada. A análise ROC é uma ferramenta útil para avaliar o desempenho de testes diagnósticos e, mais geralmente, para avaliar a precisão de um modelo estatístico que classifica os indivíduos em 1 das 2 categorias, doentes ou não doentes (Lloyd 1998. J Am Stat Assoc. 93: 1356-1364; Pepe 2003. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. Oxford, UK: Oxford University Press; Zou 2007, Circulation 6:654-657).

Os resultados da análise de curva ROC são mostrados na figura 1B, que revela que a especificidade deste biomarcador PICP para prever as doenças cardíacas valvulares é de 95% e asensibilidade é 96,25 %. O valor de corte de PICP é > 585,7ng/mL. Em todos os subgrupos da doença valvular, como os pacientes com estenose predominantemente mitral (MS) ou regurgitação predominantemente mitral (MR) ou de tipo misturado (M), o PICP plasmático aumentou significativamente (< 0,0001) em comparação com o controle. O PICP plasmático emMR foi máximo entre todos os subgrupos, conforme apresentadona figura 1C.Exemplo 2: Determinação por HPLC da presença de PICP no sangue humano.

A presença de PICP no plasma foi validada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando o padrão PICP.

Protocolo para HPLC para detecção de PICP no plasma humano Preparação da amostra: o plasma sanguíneo humano foi esgotado das 14 proteínas mais abundantes usando a coluna Spin de Remoção por Afinidade Múltipla da Agilent Hu-14 (Agilent Technology, Santa Clara, CA, EUA).

Produtos químicos: Padrão de PICP, acetonitrila grau HPLC, água grau HPLC e 0,5% de ácido trifluoracético (TFA).Coluna: Coluna C4 analítica.

Eluente A: Água contendo 0,5% de TFA. Eluente B: acetonitrila contendo 0,5% de TFA; Volume de injeção: 5 μL. Tempo: 55 min. Detecção: 280 nm.

O perfil HPLC de PICP é apresentado na Figura 2. O pico do padrão PICP foi detectado no tempo de análise de 22,91 min e, da mesma forma, um pico também foi detectado no plasma de doença cardíaca valvular no tempo de análise de 22,65.

Exemplo 3: Monitoramento do efeito dos medicamentos sobre o PICP plasmático em pacientes com doença cardíaca valvular de origem reumática.Para examinar o efeito de quaisquer medicamentos que os pacientes tenham sofrido durante o estudo, o uso de medicamentos foi registrado durante o momento da coleta de amostra pelos médicos. Desde já, não há medicamentos específicos para a doença valvular cardíaca. No entanto, alguns medicamentos são utilizados para o controle dos efeitos secundários da doença. Os pacientes em estudo são agrupados em 3 categorias emparelhadas como indivíduos com ou sem tomar quaisquer medicamentos, indivíduos com ou sem diuréticos e indivíduos com ou sem digoxina. A SEM média das concentrações de PICP plasmáticas em cada grupo foram comparados pelo teste T de Student para dados não pareados e resumidos na Tabela 2. A concentração de PICP em nenhum grupo foi significativamente diferente:

Exemplo 4 : Correlação da concentração de PICP na gravidade da doença valvular de origem reumática em pacientes estenóticos mitraus (MS)A gravidade da doença valvar em pacientes MS foi examinada pela medição da área da válvula por ecocardiografia, como descrito acima. A área da válvula mitral é expressa em cm2. Devido à fibrose e estenose extensa, a área da válvula mitral é reduzida em pacientes com doença cardíaca valvular com lesões estenóticas (MS). Portanto, ela é considerada como o marcador de gravidade da doença valvular em pacientes MS (Maganti et al 2010, Mayo Clin Proc. 85:482-510). Conforme a área da válvula é diminuída, o PICP plasmático é maior em pacientes MS. Há uma forte correlação (r = 0,4196) entre a área da válvula mitral e a concentração de PICP, como mostrado na Figura 3.

Exemplo 5: Estimativa de PICP na amostra de urinaUrina foi coletada dos pacientes admitidos no departamento cardiotorácico do hospital SSKM, Calcutá, Índia, para substituição da válvula. 100 μL de amostra de urina foi usado para a estimativa de PICP. O nível de PICP foi estimado como descrito acima. O nível de PICP no paciente com doença valvular foi maior do que o controle. O teste T de Student para dados não pareados revela p < 0,05. Os resultados estão apresentados na Figura 4.

Exemplo 6: Exame histoquímico da deposição de colágeno (fibrose) na válvula cardíaca humanaAmostras de tecido mitral da doença cardíaca valvular de pacientes submetidos à substituição de válvula por uma prótese foram coletadas secas fixadas em formalina a 10%. A válvula mitral do indivíduo controle (morto) durante a análise post mortem no hospital SSKM de Calcutá, Índia, foi também coletada e fixada em formalina a 10%. As amostras foram, a seguir, embebidas em parafina e secções de 5 μm de espessura foram preparadas de acordo com o procedimento padrão. As seções foram coradas com hematoxilina - eosina (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA) como descrito anteriormente (Ghose Roy et al 2007, Matrix Biol.26:269-279) ou submetidas à coloração de Masson Trichrome para examinar a fibrose. Para coloração com hematoxilina e eosina, as seções foram desparafinizadas por dimetilbenzeno e embebidas em uma série de concentrações de gradientes de 100 a 75% de álcool. As seções foram, em seguida, colocadas em solução de hematina, coradas durante 5 min e lavadas com água ácida duas vezes durante 30 s. Depois de serem lavadas em água destilada durante 1 h, a água foi removida delas usando álcool 70% e 90% durante 10 min. As seções foram submetidas à coloração com eosina durante 2-3 min, secas e montadas com goma neutra. As imagens representativas da histologia valvular são mostradas na Figura 5A. O exame grosseiro da válvula mitral mostrou espessamento do folheto da válvula com margem da válvula irregular. Ocorre o espessamento e encurtamento acentuado da corda tendínea. O exame microscópico mostrou o grau de fibrose e de neovascularização. A infiltração branda perivascular focal dos linfócitos e células plasmáticas foi observada (seta marcada na Figura 5A, 5B). Ao contrário, a válvula normal era composta tecido fibrocolagenoso frouxo e ausência de vasos sanguíneos e células inflamatórias (Figura 5A, 5B).Para examinar a deposição de colágeno (fibrose), algumas das seções foram coradas diretamente com coloração tricrômica de Masson. As seções de tecido foram examinadas sob um microscópio Olympus BX51 (Olympus Corporation, Tóquio, Japão) e as imagens foram capturadas com uma câmera digital conectada a ele. Os resultados são apresentados na Figura 5C mostrando a disposição paralela frouxa das fibras de colágeno, enquanto que a válvula doente mostrou fibras de colágeno densas e extensas, predominantemente dispostas em padrão aleatório.

Exemplo 7: Identificação da deposição de colágeno I na válvula cardíaca humanaA coloração com tricrômico de picrosírius do tecido valvular foi realizada para quantificar o teor de colágeno e o alinhamento e o tipo interno das fibras de colágeno (Elizabeth et al 2008, Circulation, 118: S243-S249). Quando as seções coradas com picrosírius são vistas sob luz polarizada, o colágeno I aparece vermelho e o colágeno III aparece verde (Elizabeth et al 2008, Circulation, 118:S243-S249;Whittaker et al. 1994, Basic Res. Cardiol. 89: 397-410). As amostras de tecido mitral de pacientes com doença cardíaca valvular submetidos a substituição de válvula foram seccionadas e processadas conforme descrito acima no exemplo 6, e as seções foram coradas com solução tricrômica de picrosírius (0,1% de solução vermelha sírius F3B em ácido pícrico). As seções coradas com picrosírius foram visualizadas por microscópio confocal e os resultados são apresentados na figura 5D, mostrando o aumento em linhas vermelhas das fibras de colágeno I na válvula doente, em comparação com a válvula normal.

VANTAGENS

• A principal vantagem da presente invenção é fornecer um biomarcador para pacientes com doença cardíaca valvular útil para o diagnóstico, caracterização e tratamento da doença cardíaca valvular.

• Outra vantagem da presente invenção é fornecer um método bioquímico fácil e rápido para diagnóstico, detecção e caracterização da doença cardíaca valvular usando amostra de urina ou sangue do indivíduo. O único método atual e disponível de diagnóstico da doença cardíaca valvular é a visualização da válvula cardíaca defeituosa por ecocardiografia, que requer instrumentos sofisticados e pessoais especializados treinados. O presente biomarcador é detectável pelo procedimento bioquímico fácil e simples e, portanto, acessível à população de grandes massas.

• Ainda outra vantagem da presente invenção é a demonstração de um valor de corte do dito biomarcador, que é útil para prever a doença cardíaca valvular com precisão máxima (com cerca de 99% de especificidade e sensibilidade de cerca de 99%).

• Ainda outra vantagem da presente invenção é demonstrar a relação causa e efeito entre o biomarcador aumentado e a válvula com defeito em pacientes com doença cardíaca valvular. Assim, ela descreve o método de alteração histológica da válvula cardíaca como a causa principal do aumento de biomarcador no plasma/urina de pacientes com doença cardíaca valvular.

• Outra vantagem da presente invenção é a previsão dagravidade da doença cardíaca valvular útil para o processo de tomada de decisão para intervenção cirúrgica para correção/substituição da válvula defeituosa.

• Ainda uma outra vantagem da presente invenção éfornecer um método para a triagem das substâncias terapêuticas para o tratamento da válvula cardíaca defeituosa em pacientes com doença cardíaca valvular. 1/1

Claims (3)

1. Método de detecção da presença de doença cardíaca valvular de origem reumática em um indivíduo, o dito método sendo caracterizado pelo fato de compreender a etapa de:5 detectar o nível de PICP em uma amostra biológica doindivíduo, em que o dito PICP é selecionado de peptídeo procolágeno tipo 1C representado pela SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID No. 2, e em que a presença de PICP em um nível maior do que 585,7 ng/mL é indicativa de doença cardíaca valvular de 10 origem reumática.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada de um grupo que compreende tecido, sangue ou urina.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, 15 caracterizado pelo fato de que o nível de PICP é usado para prever a gravidade da doença cardíaca valvular de origem reumática.

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