BR112013003725B1

BR112013003725B1 - Método para obtenção de enzima lacase a partir de arthrographis sp

Info

Publication number: BR112013003725B1
Application number: BR112013003725-3A
Authority: BR
Inventors: Vijay Chintaman Sonawane
Original assignee: Council Of Scintific & Industrial Research
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2020-05-26
Also published as: DE112011102717T5; CN103270154A; WO2012023021A1; CN103270154B; MY173024A; BR112013003725A2

Abstract

método para obtenção de enzima lacase a partir de arthrographis sp. esta invenção refere-se a um método de produção de enzimas lacase de uma nova cepa fúngica atrhrographis sp.mtcc5479 útil para várias aplicações, tais como a degradação de corante têxteis presentes no efluente ou branqueamento do corante índi incorporado no tecido denim e biorremediação, em geral, taís como degradação de alguns poluentes e xenobióticos. as aplicações da lacase também existem na indústria de panificação, cerveja e vinícola, síntese de prodtos químicos, fabricação do cátodo para células de combustível.

Description

MÉTODO PAHA OBTENÇÃO DE ENZIMA LACASE A PARTIR DE ARTHROGRAPHIS SP.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a um método para a obtenção da enzima lacase a partir de Arthrographis sp.MTCC5479 e aplicações das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A Lacase (benzenodiol: oxigênio oxidorredutase EC 1.10.3.2) é uma oxidase de polifenol e pertence a um grupo de enzimas conhecidas como de multicobre oxidases. As Lacases possuem um átomo de cobre do tipo 1, que mostra a absorvância a 600 nm e confere cor azul para a enzima. Além de um átomo de cobre do tipo 1, a lacase tem um átomo de cpbre tipo-2 e dois átomos de cobre do tipo-3 por molécula de enzima. A Lacase catalisa as quatro reduções de elétrons de oxigênio molecular para a água, acompanhada por oxidação de um substrato de [1].

A enzima Lacase foi primeiramente relatada como ocorrendo na árvore de laca Japonesa, Rhus vernicifera em 1883. A enzima foi mais tarde verificada como ocorrendo em fungos conhecidos como fungos da podridão branca pertencentes às classes de Basidiomycetes. Este inclui gêneros Agaricus, Cyathus, Lentinus, Phlebia, Panus, Pleurotus e Trametes. Alguns fungos pertencentes à classe de Ascomycetes, como Curvularia, Gaeumannomyces, Mauginella e Melanocarpus, também produzem lacase [2].

A Lacase é uma enzima importante economicamente devido à sua capacidade para oxidar uma variedade de compostos xenobióticos. A Lacase apresenta ampla especificidade de substrato e pode catalisar a oxidação dos polifenóis,

2/21 fenóis metóxi-substituidos, aminofenol e seus derivados [3] . A Lacase catalisa reações de oxidação diferentes, as quais são úteis na indústria de papel e polpa de papel [4], na indústria alimentar e de bebidas [5], na biorremediação [6], biosensores [7,8] e de células biocombustiveis [9]. A disponibilidade econômica de lacase purificada é um fator importante para o uso da Lacase na indústria [5]. Os fungos da podridão branca, pertencentes às classes de Basidiomycetes são a principal fonte de enzima Lacase. No entanto, o nivel extracelular de enzima Lacase produzida por estes fungos é baixo [10]. A clonagem e expressão de Lacase de Basidiomycetes em um hospedeiro recombinante é cheia de problemas, tais como o uso de códons diferentes, falta de chaperone e modificações pós-translacionais [11]. A atividade especifica da enzima lacase é dependente do potencial redox da enzima Lacase. A Lacase produzida em um hospedeiro recombinante tende a ter um menor potencial redox do que os seus homólogos produzidos pela cepa selvagem [12] . Por isso, é importante explorar a diversidade microbiana para produzir novas cepas de lacase com o maior rendimento de lacase e enzima lacase com maior atividade especifica e maior potencial redox. Se, por exemplo, um produtor de lacase é da classe de Ascomycetes de fungos, os genes de Lacase de tal fungo podem também preferencialmente ser clonados e expressos de forma eficiente em hospedeiros fúngicos, tais como Pichia ou Aspergillus para a sua produção em grande escala.

A Patente dos Estados Unidos n°. 7.927.849 B2 descreveu um método para a produção de enzima Lacase de espécies Thielavia [13]. A atividade mais elevada obtida

3/21 relatada no documento de patente é de 20 nkatal ml^-1 dentro de seis dias. A atividade específica da enzima utilizando ABTS como substrato é 1020 nkatl/mg.

Este pedido pretende divulgar um método para a produção de enzima Lacase com uma atividade específica e rendimento elevado. A enzima lacase é produzida por uma cepa de fungo pertencente à classe Ascomycetes. A lacase produzida pelo fungo de acordo com o novo método aqui descrito pode ser aplicada por várias reações bioquímicas catalisadas por lacase em diversas áreas de aplicação, tais como a degradação de corantes têxteis no efluente, tratamento do denim para o branqueamento e remoção de manchas e biorremediação em geral, tais como a degradação de alguns poluentes como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH) e xenobióticos. As aplicações da lacase também existem na indústria de panificação. cerveja, e de vinho, na síntese de produtos químicos, fabricação de cátodo para células combustíveis.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

O objetivo da presente invenção é fornecer um método para a obtenção da enzima lacase de Arthrographis sp.MTCC5479.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, a presente invenção fornece um método para a obtenção da enzima Lacase de Arthrographis sp. MTCC5479 (Figura 1 e 2) . A nova enzima lacase é secretada para o meio pela cepa produtora pertencente ao gênero, Arthrographis. O rendimento da enzima, sob as condições aqui descritas é 9-14 UI ml'¹ ou 150-250 nktal ml^-1, quando ensaiado usando 1 mM de ABTS, em 50 mM de tampão de

4/21

Mcllvain, pH 4,0 a 30°C. (Figura 3). A lacase extracelular produzida por Arthrographis sp. pode ser isolada e purificada facilmente a partir do filtrado da cultura. A enzima é ativa na faixa de pH larga de 3-8. No entanto, o pH ótimo encontra-se na faixa de 3 a 6, para vários substratos comuns, tais como 2,2'azinobis-3-etilbenztiazol6-sulfonato (ABTS), guaiacol, 2-metoxifenol (guaiacol), 2,6 dimetoxifenol (DMP), siringaldazina e índigo. A enzima é ativa na faixa de 25°C a 70°C, No entanto, a temperatura ótima do enzima está na faixa de 40°C a 50°C para vários substratos. O peso molecular da enzima é de cerca de 63 kDa, como determinado por SDS-PAGE (Figura 4 e 5) . O peso molecular da enzima por MALDI-ToF é 58,33 kDa (Figura 6). O ponto isoelétrico da enzima (pi) é cerca de 3,5, tal como determinado por focagem isoelétrica (Figura 7). A sequência de aminoácidos N-terminal de da enzima é Gly-Ile-Gly-ProVal-Thr-Asp-Leu-Thr-Ile-Ser-Asn-Ala-Glu-Val. A atividade específica da lacase de Arthrographis é 347 UI mg^-1 (5784 nkatal mg^-1) contra lmM de ABTS em 50 mM de tampão de Mcllvain, pH 4,0 a 30°C. A atividade específica de lacase de Arthrographis medida pelo método cinético utilizando 0,02 mM de sirigaldazina como substrato, em 50 mM de tampão de Mcllvain, pH 5,5 a 30°C é 6380 UI mg ¹ (10635 nkatal mg ^x). A enzima pode degradar eficientemente os corantes têxteis diferentes pertencentes ao grupo de antraquinona, grupo azo, grupo triarilmetano, grupo eurodin, e os corantes reativos. A presença de mediadores específicos, tais como 1-hidroxibenzotriol, ácido violúrico, metilsiringato e acetossiringona, a taxa de degradação de corantes é significativamente melhorada. A degradação de

5/21 indigo (Vat Blue) requer acetossiringona ou 2,2’azinobis-3etilbenztiazol-6-sulfonato (ABTS) como mediador redox. A enzima pode também ser utilizada em aplicações que existem na indústria alimentar, na indústria cervejeira e vinho, na na indústria do papel e polpa de papel, na síntese de produtos químicos, e para a fabricação do cátodo para células combustíveis e em que, a enzima lacase é conhecida por ter sido utilizada.

A Lacase de Arthrographis é capaz de oxidar o corante índigo (Vat Blue), na presença de mediadores, tais como acetossiringona (4'-hidroxi-3',5'-dimetoxiacetofenona), e 2,2'azinobis-3-etilbenztiazol-6-sulfonato (ABTS). Esta propriedade de lacase de Arthrographis pode ser explorada para o tratamento do denim para a obtenção de efeitos de desvanecimento em denim ou remoção de migração da coloração de denim causada pelo processo de estonagem de jeans. Uso de mediadores diferentes no processo pode trazer diferentes graus de efeitos de branqueamento. O branqueamento do denim com lacase é uma alternativa ao método de hipoclorito desejado porque oferece benefícios ecológicos, assim como não enfraquece a resistência do tecido.

Em uma modalidade a presente invenção fornece um método para a obtenção da enzima lacase de cepa Arthrographis sp.MTCC5479 compreendendo:

a. cultivar a cepa Arthrographis sp.MTCC5479 em meio de cultura líquido estéril, tal como aqui descrito,

b. inocular o meio de produção contendo frascos com a cepa obtida na etapa a,

c. incubar o meio obtido na etapa b, a 30 °C em agitadora centrífuga a uma velocidade de cerca de 180 rpm

6/21 durante cerca de 72 horas.

d. induzir a cultura obtida na etapa c, após 72 horas com Xilidino 0, 00001 a 0,0001% (v/v) , CUSO4.5H2O, 0,0025 a 0,025% (p/v) e 100 μΜ a 1000 μΜ

e. incubar a cultura obtida na etapa d a cerca de 30°C durante cerca de 12-15 dias.

f. retirar a cultura obtida na etapa e, e separar a enzima Lacase excretada no meio a partir da massa de células por centrifugação a aproximadamente 8000 X g durante cerca de 10 minutos.

g. concentrar e purificar a enzima obtida na etapa f pelos métodos aqui descritos.

Em outra modalidade da presente invenção em que o rendimento de enzima Lacase varia de 9-14 Ul/ml.

Em outra modalidade da presente invenção, em que a enzima lacase é caracterizada por ter:

I. Peso molecular de aproximadamente 63 kDa por SDSPAGE, ou 58,33 pelo Método MALDI-ToF.

II. pi de cerca de 3,5,

III. Atividade específica é aproximadamente 347 IU mg” ¹ ou 5784 nkatal mg^-1 contra lmM de ABTS em 50 mM de tampão de Mcllvain, pH 4,0 a 30°C, atividade específica de 6380 UI mg^-1 ou 10635 nkatal mg^-1 utilizando 0,02 mM de sirigaldazina como substrato, em 50 mM de tampão de Mcllvain, pH 5,5 a 30°C.

IV. A sequência de aminoácidos N-terminal tendo SEQ ID. No. 1.

Em uma outra modalidade da presente invenção, em que a enzima funciona de pH 2,5 a 8,5, preferencialmente, a um pH de 3 a 5,5.

7/21

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a enzima é eficaz no tratamento da degradação do corante a temperaturas 30 a 70°C, preferencialmente, à temperatura de 35 a 50°C.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a preparação de enzima está na forma de líquido, pó ou granulado, após combinação ou mistura com as substâncias inertes ou sais, a fim de aumentar a sua vida de prateleira.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a enzima é útil para a degradação de corantes têxteis incluindo grupos azo, antraquinona, trifenilmetano, indigóide, triazina e eurodin de corantes individualmente ou em uma forma de mistura destes corantes.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a enzima lacase é isolada a partir de Arthrographis sp._f e é útil para a remoção de manchas, para o branqueamento de polpa de papel, para o tratamento de fibras de branqueamento, para a coloração de pêlos de animais, incluindo lã para tratamento de corante ou corantes têxteis em efluentes, para a fabricação de cátodo de uma célula de combustível, para formulações de revestimentos e adesivos com base em polimerização de monômeros fenólicos etc.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E TABELAS:

FIGURA 1. Colônia de Arthrographis sp.MTCC5479 em ágar YPD,

Figura 2. Morfologia microscópica do Arthrographis sp.MTCC5479 (1000X)

Figura 3 perfil de atividade enzimática para Arthrographis sp.

8/21

Figura 4. Análise das etaps de purificação de Lacase.

Figura 5. Estimativa do peso molecular de lacase de

Arthrographis por SDS-PAGE

Marcadores de pesos moleculares utilizados foram

fosforilase b	(97kDa), Albumina de Soro	Bovino (67KDa),
Ovalbumina (45	kDa) e Anidrase	carbônica.	(30 kDa).
Figura 6	Análise de	MALDI-ToF	de	lacase	de
Arthrographis
Figura 7	Focagem isoelétrica	de	lacase	de
Arthrographis
Figura 8.	Branqueamento	de denim	para	efeito	de
desvanecimento	leve
Figura 9.	Branqueamento	de denim	para	efeito	de
desvanecimento	pesado
Figura 10.	. Tratamento de	lacase de	Arthrographis	de

Denim para a remoção de migrações de manchas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os exemplos seguintes são dados a título de ilustração da presente invenção e, portanto, não devem ser

interpretados	de	forma a	limitar o	escopo da	presente
invenção
			EXEMPLOS
Exemplo 1
Produção	de	lacase	a partir	da cepa	fúngica

Arthrographis sp.MTCC5479.

A enzima lacase foi produzida pelo cultivo da cepa

Arthrographis em meio de cultura líquido estéril compreendendo:

Peptona 0,1 a 2%, (p/v),

Extrato de levedura 0,25 a 0,5% (p/v)

9/21

KH₂PO4 0,01% para 0,25%

MgCl₂ 0,0001% a 0,05 (p/v)

Glicose separadamente autoclavada 1 a 5% (p/v).

A cepa fúngica Arthrographis sp.MTCC5479 foi cultivada em placas de agar de levedura, peptona e dextrose (YPD) e incubadas durante 6-7 dias. A massa micelial e esporos foram colhidos a partir da placa por demolição da superfície de placa de agar com um loop estéril e inoculadas no frasco de 500 ml contendo 100 ml de meio YPD e foi incubada a 30 °C durante 3 dias. A massa celular obtida foi utilizada como inóculo para inocular 10 frascos contendo 500 ml de meio de produção. Os frascos contendo meio produção inoculado foram incubados a 30°C em agitadora centrífuga à velocidade de 180 rpm durante 72 horas. Após 72 horas, xilidina, 0,00001 a 0,0001% (v/v), CuSO₄.5H₂0, 0,0025 a 0,025% (p/v) ou 100 μΜ e 1000 μΜ foram adicionados como indutores para produção de lacase. Os frascos de produção foram incubados ainda sob condição estacionária a 30°C. O início e o progresso da síntese da enzima foi monitorado pela retirada da cultura e do ensaio do sobrenadante de cultura de cada intervalo de 24 horas, como descrito no exemplo 3.

A enzima Lacase excretada para o meio foi separada da massa de células, após o pico de atividade enzimática ser atingido após cerca de 12-15 dias de incubação a 30°C. A atividade enzimática extracelular obtida está na faixa de 9-14 UI ml^-1 do caldo de cultura (Figura 3).

Embora a produção da lacase de lacase de Arthrographis ter sido demonstrada em frascos de agitação, outros recipientes adequados para a produção da lacase tal como

10/21 bandejas ou fermentadores podem ser utilizados para este fim pelos especialistas na técnica de fermentação microbiana.

Exemplo 2

Isolamento e purificação de lacase de sobrenadante de cultura Arthrographis sp.

Massa micelial fúngica foi separada do caldo de cultura por centrifugação a 8000 X g durante 10 minutos. 0 sobrenadante obtido (4,1 L) foi concentrado cerca de 20 vezes utilizando ultrafiltração de membrana de tamanho de 30 kD de MWCO.

O ultrafiltrado (180 mL) foi carregado sobre a coluna de Q-Sepharose (40 mL) equilibrada a pH 5,5, utilizando 50 mM de tampão de acetato de sódio e fluido utilizando 0-50% de gradiente linear de cloreto de sódio 500 mM no mesmo tampão. As frações ativas foram reunidas e precipitadas por 100% de saturação de sulfato de amônio. O precipitado foi colocado em coluna Sephacryl S-200 (200 ml) e eluiu-se com 0,15 M de NaCl em 50 mM de tampão de acetato de sódio. As frações ativas foram reunidas e analisadas para a determinação de peso molecular, ponto isoelétrico, a atividade específica e outras propriedades da enzima.

Exemplo 3

Ensaio de atividade de lacase usando 2,2' azinobis-3etilbenztiazol-6-sulfonato___(ABTS)___como o substrato cromogênico [10]

A atividade de lacase foi medida pelo método espectrofotométrico de ponto final. As condições de ensaio foram as indicadas a seguir. O ensaio foi conduzido na câmara de cubeta de temperatura controlada de

11/21 espectrofotômetro (Analytics Jena SPECORD 600).

Tampão de incubação 975 pL de tampão de Mcllvaine 50 mM a pH 4,0,

Substrato cromogênico 2,2'azinobis-3-etilbenztiazol-6sulfonato (ABTS), - 1 mM

Solução Lacase - 25 pL (diluido)

Tempo de incubação - 5 min

Temperatura de incubação - 30°C

Comprimento de onda - 420 nm

Cálculo - Com base no coeficiente de extinção de cátion oxidado de ABTS mM^-1 cm^-1. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que oxida 1 pM de ABTS por minuto sob estas condições.

Exemplo 4

Ensaio de atividade de lacase usando siringaldazina de substrato cromogênico.

A atividade de lacase foi medida pelo método espectrofotométrico cinético. As condições de ensaio foram as indicadas a seguir. 0 ensaio foi conduzido na câmara de cubeta de temperatura controlada do espectrofotômetro (Analytica Jena SPECORD 600).

Tampão de incubação - 27 45 pL de tampão de Mcllvaine 25 mM, pH 5,5, contendo 48% de etanol

Substrato cromogênico - Siringaldazina, solução Stock, 0,28 mM em 48% de etanol

Solução de siringaldazina - 225 pL

Solução de Lacase - 30 pL diluído

Tempo de incubação - 5 min

Temperatura de incubação - 30°C

12/21

Comprimento de onda - 530 nm

Cálculo - Com base em Δ A (t4-t3), coeficiente de extinção 8530 nm de oxidado

Sirigaldazina, 65 mM-Ι cm^-1. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que oxida 1 μΜ de siringaldazina por minuto sob estas condições.

Exemplo 5

Estimativa de proteína na preparação de enzima.

O teor de proteínas das preparações de enzima foi estimado de acordo com o método de Bradford utilizando o reagente de Bradford (B-6916, Sigma Chemicals, EUA) e solução de concentração conhecida de albumina de soro bovino como o padrão de proteína.

Exemplo 6

Estimativa da atividade específica da lacase purificada a partir de lacase de Arthrographis.

A atividade específica da preparação enzimática purificada foi determinada em termos de unidades internacionais por miligrama de proteína de atividade IU mg^-1 A atividade da enzima foi medida como indicado no exemplo 3 e 4. O teor de proteína foi estimado como dado no exemplo 5. A atividade específica em termos de unidades nkatal do SI derivadas pode ser calculada multiplicando-se as unidades internacionais pelo fator de 16,67.

Exemplo 7

Aplicação da enzima de degradação de corante.

Os seguintes corantes foram dissolvidos em tampão de Mcllvaine 50 mM (Citrato-Fosfato) a uma concentração de 50 mg/L. Estes corantes incluem corantes pertencentes ao grupo

13/21 azo, grupo antraquinona, grupo dacridina, grupo eurodin, e corante reativo. 20 ml de solução de corante foram tomados em um balão de 100 ml de volume.

1. Azul Brilhante

2. Azul Cibacron

3. Violeta de cristal

4. Rosa Bengala

5. Eritrosina

6. Laranja de acridina

7. Verde malaquita

8. Vermelho neutro

9. Azul Brilhante Remazol

10. Azul de bromofenol

11. Vermelho Congo

12. Vermelho de metila

13. Azul Algodão (Ácido Azul)

14. Rodamina B

De enzima em bruto em forma de ultrafiltrado foi adicionada à solução de corante para tornar a atividade enzimática final de cerca de 100 unidades/ml. Mais um conjunto de solução de corante também foi definido. No segundo conjunto hidroxibenzotriazol (HOBT), uma molécula mediadora foi adicionada à concentração de 5,0 mM.

Os frascos foram incubados a 30 °C. Os teores de corante residual foram estimados após 12 horas e 24 horas de incubação.

Os frascos	contendo	o	mediador	1-HOBT mostraram
descoloração de	mais de	90%	de Acridina laranja, Azul
brilhante, Azul	Cibacron,	Rosa	Bengala,	Eritrosina, Verde
malaquite, Vermelho neutro,	Azul de	bromofenol, Azul

14/21 brilhante Remazol, Violeta de cristal, Vermelho Congo Rodamina B e Azul Algodão dentro de 12 horas.

Dentro de 24 horas, 90% de degradação de Acridina laranja, Azul brilhante, Azul Cibacron, Rosa Bengala,

Eritrosina, Verde malaquita, Vermelho neutro, Azul brilhante Remazol, Vermelho Congo foi observado em frascos em que, o mediador (HOBT) não foi adicionado.

A aplicação de lacase de Arthrographis sp. para a degradação de corantes têxteis não se limita apenas à 10 quantidade de corantes listados acima. O experimento acima só demonstra a versatilidade da lacase de Arthrographis para degradar corantes têxteis pertencentes a grupos diferentes. A enzima de Arthrographis sp pode ser aplicada à degradação de corantes diferentes dos aqui mencionados, 15 por um versado na técnica do uso de enzima lacase e mediadores diferentes para a reação realizada pela enzima. A enzima pode também ser aplicada para fins de degradação de corantes em um reator adequado em que o contato dos corantes e enzimas pode ocorrer.

Exemplo 8

O tratamento do denim por lacase de Arthrographis para branqueamento a fim de obter aparência desbotada.

Um pedaço de pano de denim sem dimensão foi obtido a partir Rossari Biotech India Pvt. Ltd, Mumbai, índia. Ο 25 pano foi enxaguado com água da torneira e cortado em quadrados de aproximadamente 1 polegada (peso seco de cerca de 800-900 mg). As amostras de tecifo Denim foram submersas em 25 ml de tampão de Mcllvaine a pH 3,0 contido no frasco cônico de 100 ml. Acetossiringona mediadora redox (4'30 hidroxi-3',5'-dimetoxiacetofenona), e 2-2'azinobis-3

15/21 etilbenztiazol-6-sulfonato (ABTS) foram adicionados separadamente em dois frascos a uma concentração de 1-5 mg ml^-1. ABTS foi adicionada como um pó seco, ao passo que acetossiringona foi adicionada como solução em etanol (50 mg/ml). As amostras de tecido de denim em frascos foram deixadas para absorver o tampão e o mediador durante 5 minutos. 25 UI de Arthrographis de lacase foram adicionados a cada frasco, a fim de iniciar a reação. Os frascos foram incubados em um agitador rotativo a 45°C, velocidade de 180 rpm. Após 60 min as amostras de tecido de denim foram removidas dos frascos, lavadas com água da torneira e imersas em frascos contendo tampão fresco, e mediador na mesma quantidade como referido antes. A adição da enzima (25 U) , foi realizada e a incubação a 45°C velocidade de 180 rpm foi realizada por mais 90 min. Ao fim de 90 minutos, as amostras de tecido de denim foram removidas do frasco, enxaguadas com água de blot, secas utilizando papel de filtro passada a ferro. Os resultados foram fotografados (Figura 8, 9).

Exemplo 9

Tratamento de denim estonado por lacase de Arthrographis para a remoção de manchas de migração.

O tecido de denim estonado foi obtido a partir do mercado local. Denim foi cortado em cerca de 1 polegada quadrada. As amostras de tecido de Denim estonadas (peso seco de cerca de 800-900 mg) foram submersas em 25 ml de tampão Mcllvaine, pH 3,0 contidas no frasco cônico de 100 ml. A acetossiringona mediadora redox (4'-hidróxi-3',5'dimetoxiacetofenona) e 2,2'azinobis-3-etilbenztiazol-6sulfonato (ABTS) foram adicionados em dois frascos

16/21 separados, na concentração de 1-5 mg ml^-1. ABTS foi adicionado como um pó seco que, acetossiringona foi adicionada como solução em etanol (50 mg/ml). As amostras de tecido de denim em frascos foram deixadas absorver o tampão e mediador durante 5 minutos. 25 UI de lacase de Arthrographis foram adicionados a cada frasco, a fim de iniciar a reação. Os frascos foram incubados em um agitador rotativo a 45°C, velocidade de 180 rpm. Após 90 min as amostras de tecido de denim foram removidas dos frascos, lavadas com água de blot, secas utilizando papel de filtro passados a ferro. Os resultados foram fotografados (Figura 10) .

Os exemplos apresentados em 8 e 9 demonstram a eficácia de lacase de Arthrographis no branqueamento em denim para a obtenção de efeito de aparência desbotada ou reforço de contraste no denim estonado. No entanto, a lacase a partir de lacase de Arthrographis também pode ser aplicada para o tratamento de artigos de vestuário feitos a partir de tecidos de denin por uma pessoa versada na técnica do uso de enzimas para o branqueamento da lacase.

Exemplo 10

Imobilização de lacase em O-Sepharose.

As enzimas parcialmente purificadas pelo método de cromatografia de troca iônica tal como descrito no exemplo 2, foram dialisadas contra 50 mM de fosfato de citrato de pH 6,0. A solução de enzima foi concentrada para reduzir o seu volume utilizando dispositivos de ultrafiltração centrífuga Amicon. A solução de enzima concentrada tinha uma atividade de 1200 UI por ml. Q-Sepharose foi empacotada em uma coluna e equilibrada a pH 6,0 e, em seguida,

17/21 transferida para um frasco de 25 ml. 20 ml de solução concentrada de lacase contendo 1220 Uml^-1 foram adicionados a 2 ml de Q-Sepharose equilibrada a pH 6,0 e deixou-se ligar durante 30 min. A enzima não ligada foi removida a partir de Q-Sepharose por filtragem e foi passada através de papel de filtro Whatman número 1. A Sepharose com enzima adsorvida na mesma foi suspensa em tampão de pH 6,0 contendo 1,3-propilenodiamina 1 mM e foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. Após 1 hora, Éter 1,4butanodiol diglicidilico (BDDGE) foi adicionado à suspensão e misturado por inversão do tubo várias vezes. A quantidade de éter 1,4-butanodiol diglicidilico (BDDGE) pode variar entre 0,05 mM a 10 mM. A suspensão foi, em seguida, mantida no ambiente durante a noite e depois foi lavada com tampão de citrato/fosfato pH 4,0. A Sepharose foi então suspensa em tampão fosfato de pH 6,0 contendo glicil-glicina 1 mM e incubada durante 6 horas à temperatura ambiente. Após este tratamento para bloquear os grupos oxiranos livres, a suspensão foi novamente lavada com tampão de citrato/fosfato 50 mM a pH 4,0, A atividade final da preparação de lacase imobilizada foi de 10000 lugm^-1.

Exemplo 11

Uso de lacase imobilizada para remoção de fenólicos de mosto e vinho.

Uso de lacase imobilizada de cepa de Arthrographis para clarificação do mosto e do vinho mosto foi preparado por maceração das uvas disponíveis localmente. Cerca de 100 ml de mosto clarificado foi obtido por centrifugação a 10000 Xg durante 10 minutos. O pH do mosto foi cerca de 3,5. 2000 unidades

18/21 de enzima lacase imobilizadas em Q-sepharose de acordo com o método dado no exemplo 10 foram adicionadas a 30 ml de mosto e foram mantidas a 15°C durante 48 horas. O mosto foi, em seguida, centrifigado a 1000 Xg durante 2 minutos para recuperar a enzima imobilizada e, em seguida, a 10.000 rpm durante 10 min para a precipitação de compostos fenólicos formados. Os fenólicos residuais e iniciais no mosto foram estimados pelo método de Denis, utilizando ácido tânico como padrão. 0 tratamento com lacase resultou em 5,8 vezes de redução no teor de fenólicos. 0 mosto de uvas de uvas disponíveis localmente foi deixado fermentar usando sua flora própria. O vinho fermentado foi clareado por centrifugação em a 1000Xg. 2000 unidades de lacase imobilizada foram adicionadas ao vinho e foram deixadas em repouso a 15°C durante 48 horas.

O vinho foi então primeiro filtrado através de papel de filtro Whatman Número 1 e, em seguida, através de filtro de 0,5 micron. Os fenólicos Iniciais e residuais foram determinados pelo método de Denis, utilizando ácido tânico como composto fenólico de modelo. A redução no teor de fenólicos por tratamento com lacase foi de 3 vezes.

VANTAGENS DA INVENÇÃO

1. A Lacase produzida utilizando a cepa Arthrographis não é reprimível por glicose ou suficiência de nitrogênio.

2. A Produção de lacase é em fermentação submersa, bem
como em	estado sólido de cultura.
3.	A Lacase produzida é	extracelular,	com	um
rendimento elevado de 10.000 a	20.000 UI por	litro	de

sobrenadante de cultura, e pode ser facilmente purificada a partir do sobrenadante da cultura.

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4. A Lacase produzida oferece uma especificidade ampla na degradação do corante. A enzima livre de células é suscetível de degradação de corantes pertencentes a diversos grupos de corantes tais como corantes de azo, corantes de trifenilmetano, corantes reativos, corantes de antraquinona, corantes eurhodin e corantes de acridina.

5. A Degradação de tais diversos grupos de corantes por uma lacase extracelular única não foi relatada até agora.

6. O tratamento com lacase de Arthrographis de Denim é capaz de criar uma aparência desbotada pesada em denim, quando, ABTS é usado como um mediador para branqueamento de denim. Isto proporciona uma alternativa para o uso de tratamento com hipoclorito para a criação de aparência desbotada pesada em denim.

Referências:

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14.

Raunio,

Phlebia

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para isolar a enzima lacase de cepa Arthrographis sp.MTCC5479, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. cultivar a cepa Arthrographis sp.MTCC5479 em meio de cultura YPD compreendendo levedura, peptona e dextrose a 30 ° C durante 3 dias para obter uma massa celular,

b. inocular a massa celular obtida na etapa (a) em um balão contendo um meio de produção compreendendo peptona, extrato de levedura, glicose, KH2PO4 e MgCl2;

c. incubar o meio de produção obtido na etapa (b), a 30°C em agitadora centrífuga a uma velocidade de 180 rpm durante 72 horas para obter uma cultura;

d. induzir a cultura obtida na etapa (c) com Xilidino, na faixa de 0,00001 a 0,0001% (v/v), CuSO4.5H2O, na faixa de 0,0025 a 0,025% (p/v) e 100 μΜ a 1000 μΜ para obter uma cultura induzida;

e. incubar a cultura induzida obtida na etapa (d) a 30°C durante 12-15 dias.

f. retirar a cultura obtida na etapa e, e separar a enzima Lacase excretada no meio de produção a partir da massa de células por centrifugação a 8000 X g por 10 minutos.

g. concentrar a enzima usando membrana de ultrafiltração e precipitação por 100% de saturação de sulfato de amônio; e

h. purificação da enzima obtida na etapa (g) por cromatografia em coluna usando a coluna Sephacryl S-200 para obter a enzima lacase.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,

Petição 870200015024, de 31/01/2020, pág. 11/13

2/2 caracterizado pelo fato de que o rendimento da enzima lacase varia de 9-14 lU/ml.