BR112012025462B1 - Agente alvo compreendendo um domínio de ligação capaz de ligar pelo menos um sítio de ligação em uma superfície de planta, seu uso e composição que a compreende - Google Patents

Abstract

DOMÍNIO DE LIGAÇÃO, AGENTE ALVO E SEU USO PARA LIBERAR E RETER AGROQUÍMICO EM PLANTA, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA LIBERAR AGROQUÍMICO EM PLANTA, PROTEGER UMA PLANTA, MODULAR A EXPRESSÃO GÊNICA, VIABILIDADE, CRESCIMENTO OU RENDIMENTO DE PLANTA OU FABRICAR UM VEÍCULO AGROQUÍMICO ALVO ESPECÍFICO, BEM COMO PROCESSO DE LIGAÇÃO DE AGENTE ALVO A VEÍCULO E VEÍCULO AGROQUÍMICO. A presente invenção refere-se à liberação específica de agroquímicos às plantas. Mais especificamente, refere- se a uma composição, consistindo essencialmente em um agente de alvejamento que compreende pelo menos um domínio de ligação que especificamente liga-se a um sítio de ligação em uma planta viva intacta e um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos. A presente invenção refere-se também a um domínio de ligação, que especificamente liga-se ao referido sítio de ligação em uma planta viva intacta. Mais especificamente, refere-se a domínios de ligação que compreendem uma sequência de aminoácido que compreende 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas, por meio de que, os referidos domínios de ligação são capazes de ligar ou manter um veículo sobre uma planta. Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a domínios de ligação que especificamente (...).

Description

[0001] A presente invenção refere-se à liberação específica de agroquímicos às plantas. Mais especificamente, refere-se a uma composição, consistindo essencialmente em um agente de alvejamento que compreende pelo menos um domínio de ligação que especificamente liga-se a um sítio de ligação em uma planta viva intacta e um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos. A presente invenção refere-se também a um domínio de ligação, que especificamente liga-se ao referido sítio de ligação em uma planta viva intacta. Mais especificamente, refere-se a domínios de ligação que compreendem uma sequência de aminoácido que compreende 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas, por meio de que, os referidos domínios de ligação são capazes de ligar ou manter um veículo sobre uma planta. Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a domínios de ligação que especificamente ligam tricomas, estomas, cutícula, lenticelas, espinhos, espinhas, pelos de raiz ou camada cerosa. A invenção refere-se também a um método para liberação de agroquímicos a uma planta, para melhorar a deposição de agroquímicos em uma planta, e para manter os referidos agroquímicos em uma planta, usando agentes de alvejamento compreendendo os referidos domínios de ligação, e a um método para proteger uma planta contra estresse biótico ou abiótico ou controlar o crescimento da planta usando o mesmo. Da mesma forma, a invenção refere-se a um método para fabricar um veículo agroquímico de alvejamento específico.

[0002] Por muitos anos, horticultor e agrônomo aplicaram substâncias químicas para controle de erva daninha, proteção de planta e regulação de crescimento de planta, por pulverização dos campos. Para composições que precisam ser aplicadas na planta, por exemplo, na folhagem, apenas uma pequena parte da composição é ligada a e retida por parte da planta, onde pode mostrar sua atividade biológica, quando grandes quantidades não estão aderindo à superfície da planta e são perdidas por gotejamento ou lavadas pela chuva. Além de dar origem a eficácia reduzida da substância química, perdas de substâncias químicas no solo devido ao gotejamento da planta durante a pulverização ou devido a lavagem durante chuva, podem resultar em contaminação de lençol, dano ambiental, perda de biodiversidade e consequências à saúde humana e animal.

[0003] Vários investigadores tentaram resolver este problema aplicando partículas de liberação lenta à planta que adere às folhas e libera seu conteúdo durante um certo período de tempo. US 6180141 descreve micropartículas de gel de composto que podem ser usadas para liberar os princípios ativos de proteção de planta. WO 2005102045 descreve composições compreendendo pelo menos um composto fitoativo e um adjuvante de encapsulação, em que o adjuvante compreende uma célula fúngica ou um fragmento da mesma. US 20070280981 descreve grânulos de veículo, revestidos com um aderente lipofílico sobre a superfície, por meio do qual o grânulo de veículo adere à superfície das plantas, gramas e ervas daninhas.

[0004] Aquelas micropartículas, pretendidas para a liberação de agroquímicos, são caracterizadas pelo fato e que elas aderem à planta por interações bastante fracas, não específicas, tal como uma interação lipofílica. Embora isto possa ter vantagens comparadas com a pulverização normal, a eficácia de tal método de liberação está limitada, e as partículas podem ser distribuídas não idealmente sobre a folha, ou lavadas sob condições climatológicas naturalmente variáveis, antes que a liberação do composto seja concluída. Para uma distribuição específica e retenção eficiente das micropartículas, uma molécula específica, de ligação forte é necessária, a qual pode assegurar que o veículo adere à planta até que seu conteúdo seja completamente liberado.

[0005] Domínios de ligação de celulose (CBDs) foram descritos como agentes úteis para ligação de espécies moleculares à celulose (US 5.738.984 e US 6.124.117). Realmente, quando o algodão é composto de 90% de celulose, CBDs provaram ser úteis para liberação dos assim chamados "agentes de benefício" sobre tecidos de algodão, como é descrito em WO9800500 onde as fusões diretas entre um CBD e uma enzima foram usadas utilizando a afinidade do CBD para ligar-se ao tecido de algodão. O uso de proteínas de fusão multifuncionais similares para liberação de agentes de benefício encapsulados foi reivindicado em WO03031477, em que as referidas proteínas de fusão multifuncionais consistem em um primeiro domínio de ligação que é um domínio de ligação de carboidrato e um segundo domínio de ligação, em que o primeiro domínio de ligação ou o segundo domínio de ligação pode ligar-se a um micropartícula. WO03031477 é exemplificada usando uma proteína de fusão bifuncional consistindo em um CBD e um fragmento de anticorpo anti- RR6 ligando-se a um micropartícula, cujo complexo é depositado sobre bandas de algodão ou gramas cortadas. Entretanto, o uso de tais proteínas de fusão multifuncionais para liberação de agentes de benefício encapsulados sofre de várias desvantagens sérias: Primeiramente, embora a celulose seja um componente principal das paredes da célula da planta e cerca de 33% de toda a matéria da planta consista em celulose, a celulose é, em plantas vivas intactas, protegidas do ambiente externo pela cutícula da planta, formada por cutina e ceras que são uma barreira impermeável com que as paredes da célula da planta são cobertas, tornando a celulose pobremente acessível para ligação por CBDs. Secundariamente, a liberação eficaz de um agente de benefício encapsulado à planta requer a ligação simultânea do primeiro domínio de ligação à planta e do segundo domínio de ligação à micropartícula. Como a probabilidade de ambos eventos de ligação que ocorrem ser determinados por um equilíbrio delicado entre as concentrações molares dos domínios de ligação e suas moléculas alvo e a concentração molar do complexo ligado, é altamente improvável que as proteínas de fusão multifuncionais suficientes estejam presentes na solução para permitir tal ligação simultânea. Além disso, o equilíbrio de um evento de ligação é influenciado fortemente pelos parâmetros ambientais tais como temperatura e pH, para que as condições ideais possam ser consideravelmente diferentes para cada dentre os domínios de ligação. Portanto, é altamente improvável que tal ligação simultânea de dois domínios de ligação de tal proteína de fusão multifuncional resultaria em uma ligação suficientemente forte que manteria um agente de benefício encapsulado a uma planta. Em terceiro lugar, embora a ligação de um CBD seja até certo ponto específica para celulose, o uso de uma proteína de fusão multifuncional em que CBD deveria ligar-se à planta deve ser considerado como um método de ligação genérico, visto que todas as plantas contêm celulose, e é portanto similar à aderência não específica com aderentes ou adesivos. Um método alvejado em que a ligação específica de um domínio de ligação permitiria a discriminação entre a ligação a uma espécie de planta versus outra seria de valor consideravelmente mais alto. WO03031477 também sugere, sem outra exemplificação, que outros aglutinantes para carboidratos ou polissacarídeos podem ser usados para gerar proteínas de fusão para depositar as micropartículas sobre organismos vivos. Entretanto, nenhum domínio de ligação diferente dos CBDs, nem domínios de ligação que ligam-se às plantas vivas intactas foram descritos em WO03031477.

[0006] Moléculas que são bem conhecidas por sua especificidade e alta afinidade para alvos particulares são anticorpos. Anticorpos podem ser gerados em relação a uma ampla variedade de alvos, e anticorpos que foram gerados para estudar a arquitetura da parede da célula da planta e dinâmicas foram descritos para especificamente ligarem-se aos constituintes de planta particulares, predominantemente constituintes da parede da célula da planta (Penell e outro, 1989; Jones e outro, 1997; Willats e outra, 1998; Willats e Knox, 1999; Willats e outro, 2001). Entretanto, não está claro se quaisquer dos constituintes da parede da célula da planta aos quais os referidos anticorpos foram gerados, seriam diretamente acessíveis para um anticorpo do ambiente externo. Além disso, os anticorpos são por sua mesma natureza componentes do sistema imune adaptável interpretado tal que eles ligam seus alvos sob condições fisiológicas, incluindo pH firmemente regulado, temperatura, e a faixa de osmolaridade normal do sangue. Alguém deveria considerar usar anticorpos para liberação alvejada de agroquímicos, os referidos anticorpos não só deveriam ser capazes de ligar seus alvos em uma planta viva intacta em uma formulação agroquímica, para a qual características fisicoquímicas divergem substancialmente de condições fisiológicas, eles deveriam ser da mesma forma capazes de ligar fortemente o suficiente para manter um veículo sobre uma planta. Para nenhum dos anticorpos de ligação de planta mais cedo descritos, foi demonstrado qualquer uma destas duas características cruciais.

[0007] Os domínios variáveis de anticorpos de cadeia pesada de camelídeo (VHH) são um tipo particularmente interessante de fragmentos de anticorpo, visto que eles são pequenos, proteínas de cadeia única de 15kDa, que podem ser selecionadas por exibir alta afinidade por seus alvos. Da mesma forma, por sua natureza como moléculas de cadeia única pequenas, VHH são fáceis de produzir e têm características de estabilidade superiores em anticorpos convencionais. Entretanto, até agora, nenhum VHH de ligação de planta foi descrito. Além disso, ainda que VHH que são covalentemente ligados a uma partícula de resina sólida tenham mostrado manter a funcionalidade no sentido que eles podem capturar antígeno de uma solução (WO 0144301), não foi mostrado, nem pode ser esperado, que a afinidade de VHH por seu alvo seja suficiente para manter um veículo sobre uma superfície de planta sólida.

[0008] Ainda há uma necessidade não atendida por um método de liberação específico para agroquímicos, no qual o agroquímico é liberado ou depositado em ou próximo a seu sítio de ação em uma planta viva intacta, que utiliza um domínio de ligação, que pode ligar- se especificamente e fortemente à planta viva intacta, e é capaz de manter um agroquímico ou um veículo contendo o referido agroquímico sobre a planta.

[0009] Nós isolamos domínios de ligação, mais especificamente domínios de ligação que compreendem uma sequência de aminoácido, que compreende 4 regiões de estrutura (FR) e 3 regiões de determinação complementares (CDR) (definições de FR e CDR de acordo com Kabat), por meio de que, os referidos domínios de ligação são capazes de ligar um sítio de ligação em uma planta viva intacta e, surpreendentemente, fazendo assim, é capaz de manter um agroquímico ou um veículo contendo um agroquímico à referida planta. Preferivelmente, os referidos domínios de ligação permanecem estáveis e mantêm sua capacidade de ligação sob condições severas, tal como temperatura variável, pH, concentração de sal, disponibilidade de água ou umidade; mais preferivelmente, os referidos domínios de ligação permanecem estáveis e mantêm sua capacidade de ligação em uma formulação agroquímica. Domínios de ligação que compreendem 4 FRs e 3 CDRs, preferivelmente em uma sequência FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, são conhecidos por pessoas versadas na técnica e foram descritos, como um exemplo não limitante em Wesolowski e outro (2009). Preferivelmente, os referidos domínios de ligação são derivados de anticorpos de camelídeo, preferivelmente de anticorpos de camelídeo de cadeia pesada, destituídos de cadeias leves, tais como domínios variáveis de anticorpos de camelídeo de cadeia pesada (VHH). Agentes de alvejamento que compreendem estes domínios de ligação, especificamente podem manter agroquímicos em sítios de ligação na planta ou partes de planta, e podem ser usados para liberar e manter agroquímicos à planta, preferivelmente à planta viva intacta, por meio da qual os domínios de ligação compreendidos em tais agentes de alvejamento especificamente ligam-se aos sítios de ligação na planta, onde os agroquímicos podem exercer sua atividade. Composições agroquímicas que compreendem pelo menos um agente de alvejamento e um agroquímico, preferivelmente ligados em ou compreendidos em um veículo, podem ser adequadas para permitir o uso de uma dose reduzida do agroquímico e/ou redução da frequência de aplicação do agroquímico, compreendido em tal composição, ainda mantendo sua eficácia total. Além disso, quando compreendido em uma composição de acordo com a invenção, o agroquímico pode exercer sua atividade durante um período mais longo de tempo, enquanto resultando eventualmente em menos agroquímico estando perdido e contaminando o ambiente; da mesma forma, aplicando-se um agroquímico em uma composição de acordo com a invenção, é possível introduzir especificidade na atividade do agroquímico, que normalmente não está presente.

[00010] Um primeiro aspecto da invenção é um domínio de ligação capaz de ligar pelo menos um sítio de ligação em uma planta viva intacta.

[00011] Uma "planta viva intacta", quando aqui usada, significa uma planta quando cresce, se cresce em solo, em água ou em substrato artificial, e se cresce no campo, em uma estufa, em um quintal, em um jardim, em um pote ou em sistemas de cultura hidropônica. Uma planta viva intacta compreende preferivelmente todas as partes da planta (raízes, caule, ramos, folhas, agulhas, espinhos, flores, sementes...) que normalmente estão presentes em tal planta por natureza, embora algumas partes de planta, tais como por exemplo flores, possam estar ausentes durante certos períodos no ciclo de vida da planta. Uma planta viva intacta exclui partes de planta que foram removidas da planta, tais como folhas e flores que foram cortadas e separadas da planta. Entretanto, deveria estar claro que uma planta viva intacta inclui plantas que foram danificadas por eventos naturais normais tal como dano por condições metereológicas (tal como, porém não limitado a, vento, chuva ou granizo), por animais (no caso de por animais que se alimentam nas plantas ou por animais que pisam nas plantas), por pestes de planta (tais como, porém não limitados a, insetos, nematódeos e fungos) ou dano causado por prática agrícola tal como, porém não limitada a, poda, colheita de fruta ou colheita de flores. Plantas incluem gimnospermas e angiospermas, monocotilédones e dicotilédones, árvores, fruteiras, culturas campestres e vegetais e espécies ornamentais. Como um exemplo não limitante, as referidas plantas podem ser cedros, ciprestes, abetos, juníperos, lariços, pinheiros, sequoias canadenses, abetos vermelhos, teixos, gingko, dendezeiro, seringueira, carvalho, faia, milho, algodão, soja, trigo, arroz, cevada, centeio, sorgo, milheto, semente de colza, feijões, ervilhas, amendoins, girassol, batata, tomate, cana-de-açúcar, beterraba, mandioca, tabaco, banana, maçã, laranja, limão, azeitona, abacaxi, abacate, videiras, alface, repolho, cenoura, berinjela, pimenta, melão, rosa, lírios, crisântemo, ervas daninhas tipo grama ou ervas daninhas de folhas largas.

[00012] Um "sítio de ligação", quando aqui usado, significa uma estrutura molecular ou composto, tal como uma proteína, um (poli)peptídeo, um (poli)sacarídeo, um glicoproteína, uma lipoproteína, um ácido graxo, um lipídio ou um ácido nucléico, ou uma região particular em tal estrutura molecular ou composto ou uma conformação particular de tal estrutura molecular ou composto, ou uma combinação ou complexo de tais estruturas moleculares ou compostos. Preferivelmente, o referido sítio de ligação compreende pelo menos um antígeno. "Antígeno", quando aqui usado, significa uma molécula capaz de extrair uma resposta imune em um animal. Preferivelmente, o referido sítio de ligação está compreendido em uma estrutura de planta tais como um tricoma, estomas, lenticelas, espinhos, espinhas, pelos de raiz, cutícula ou camada cerosa. Até mesmo mais preferivelmente, o referido sítio de ligação está compreendido em uma estrutura de planta tal como um tricoma, estoma ou cutícula. O referido sítio de ligação pode ser único, para uma estrutura de planta particular, ou pode estar compreendido mais geralmente em mais de uma estrutura de planta. Preferivelmente, o referido sítio de ligação está presente em uma parte particular da planta, tal como as folhas, caules, raízes, frutas, estróbilos, flores, bulbos ou tubérculos. Até mesmo mais preferivelmente, o referido sítio de ligação está presente na superfície de tal parte particular da planta, significando que o sítio de ligação está presente por exemplo na superfície da folha, na superfície de caule, na superfície de raiz, na superfície de fruta, na superfície do estróbilo, na superfície da flor, na superfície do bulbo ou na superfície do tubérculo. O referido sítio de ligação pode ser único, para uma parte da planta particular, ou pode estar geralmente mais presente em mais de uma parte da planta.

[00013] Um "domínio de ligação", quando aqui usado, significa o todo ou parte de uma molécula proteinácea (proteína, semelhante à proteína ou contendo proteína) que é capaz de ligação, usando interações intermoleculares específicas a uma molécula alvo. Um domínio de ligação pode ser uma molécula de ocorrência natural, por exemplo fibronectina, pode ser derivado de uma molécula de ocorrência natural, por exemplo, de componentes do sistema imune inato ou adaptável, ou pode ser projetado completamente artificialmente. Um domínio de ligação pode ser com base em imunoglobulina ou pode ser baseado em domínios presentes em proteínas, incluindo porém não limitados a, proteínas microbianas, inibidores de protease, toxinas, fibronectina, lipocalinas, proteínas de anel espiralado antiparalelo de cadeia única ou proteínas de motivo de repetição. Exemplos não limitantes de tais domínios de ligação são domínios de ligação de carboidrato (CBD) (Blake e outro, 2006), anticorpos de cadeia pesada (hcAb), anticorpos de domínio único (sdAb), minicorpos (Tramontano e outro, 1994), o domínio variável de anticorpos de cadeia pesada de camelídeo (VHH), o domínio variável dos novos receptores de antígeno (VNAR), aficorpos (Nygren e outro, 2008), alfacorpos (WO2010066740), domínios de repetição de ancirina projetados (DARPins) (Stumpp e outro, 2008), anticalinas (Skerra e outro, 2008), knottins (Kolmar e outro, 2008) e domínios de CH2 construídos (nanoanticorpos; Dimitrov, 2009). Preferivelmente, o referido domínio de ligação consiste em uma cadeia de polipeptídeo única e não é pós-translacionalmente modificado. Mais preferivelmente, o referido domínio de ligação não é um CBD. Até mesmo mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é derivado de um sistema imune inato ou adaptável, preferivelmente de uma proteína de um sistema imune inato ou adaptável. Ainda mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é derivado de uma imunoglobulina. Preferivelmente, o referido domínio de ligação compreende 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterá em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares). Preferivelmente, um domínio de ligação é fácil de produzir em alto rendimento, preferivelmente em um sistema de expressão recombinante microbiano, e conveniente de isolar e/ou purificar subsequentemente. Da mesma forma preferivelmente, um domínio de ligação é estável, igualmente durante o armazenamento e durante a utilização, significando que a integridade do domínio de ligação é mantida sob condições de armazenamento e/ou utilização, que podem incluir temperaturas elevadas, ciclos de congelamento- descongelamento, mudanças no pH ou na força iônica, irradiação de UV, presença de substâncias químicas prejudiciais e similares. Mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é estável em uma formulação agroquímica. Uma "formulação agroquímica" quando aqui usada, significa uma composição para uso agroquímico, como também definido, compreendendo pelo menos uma substância ativa, opcionalmente com um ou mais aditivos que favorecem dispersão ideal, atomização, deposição, umectação de folha, distribuição, retenção e/ou captação de agroquímicos. Como um exemplo não limitante, tais aditivos são diluentes, solventes, adjuvantes, tensoativos, agentes umectantes, agentes de propagação, óleos, adesivos, espessantes, penetrantes, agentes de tamponamento, acidificantes, agentes antissedimentação, agentes anticongelamento, fotoprotetores, agentes desespumantes, biocidas e/ou agentes de controle de flutuação. Preferivelmente, o referido domínio de ligação permanece estável em uma formulação agroquímica, quando armazenado em temperatura ambiente durante um período de dois anos, ou quando armazenado a 54°C durante um período de duas semanas. Preferivelmente, o referido domínio de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em DARPins, knottins, alfacorpos e VHH. Mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em alfacorpos e VHH. Preferivelmente, o referido domínio de ligação é um VHH.

[00014] A ligação do domínio de ligação ao sítio de ligação ou a um antígeno compreendido no sítio de ligação acontece com alta afinidade. A constante de dissociação é geralmente usada para descrever a afinidade entre um domínio de ligação e sua molécula alvo. Preferivelmente, a dissociação constante da ligação entre o domínio de ligação e a molécula alvo compreendida no sítio de ligação, é mais baixa do que 10-5 M, mais preferivelmente, a constante de dissociação é mais baixa do que 10-6 M, até mesmo mais preferivelmente, a constante de dissociação é mais baixa do que 10-7 M, preferivelmente, a constante de dissociação é mais baixa do que 10-8 M. Preferivelmente, a ligação do domínio de ligação ao sítio de ligação é específica, significando que o domínio de ligação liga-se ao sítio de ligação, apenas se a molécula alvo está presente no sítio de ligação, e que o domínio de ligação não liga-se, ou liga-se com afinidade muita mais baixa, a um sítio de ligação sem a molécula alvo. A especificidade de ligação de um domínio de ligação pode ser analisada por métodos tal como ELISA, como descrito no exemplo 2, no qual a ligação do domínio de ligação a sua molécula alvo é comparada com a ligação do domínio de ligação a uma molécula não relacionada e com aderência não específica do domínio de ligação ao vaso de reação. A especificidade pode ser expressa da mesma forma como a diferença em afinidade de um domínio de ligação por sua molécula alvo contra a afinidade a uma molécula não relacionada. Preferivelmente, a relação da afinidade do domínio de ligação a sua molécula alvo contra sua afinidade a uma molécula não relacionada é maior do que 10, mais preferivelmente a referida relação é maior do que 20, preferivelmente a referida relação é maior do que 100. A ligação do domínio de ligação pode ser específica para uma estrutura de planta particular, significando que o sítio de ligação, compreendido em tal estrutura de planta, não está ou a uma presente extensão muito menor em outras estruturas de planta; ou a ligação pode estar mais geral a mais de uma estrutura de planta, se o sítio de ligação está presente em mais de uma estrutura de planta. A ligação do domínio de ligação pode ser específica para uma parte da planta particular, significando que o sítio de ligação, presente dentro ou sobre tal parte da planta, possivelmente compreendido em uma estrutura de planta em tal parte da planta, não está ou a uma presente extensão muito menor em outras partes de planta; ou a ligação pode estar mais geral a mais de uma parte da planta, se o sítio de ligação está presente em mais de uma parte da planta. A ligação do domínio de ligação pode ser específica para uma espécie de planta particular, significando que o sítio de ligação, presente dentro ou sobre tais espécies de planta, não está ou a uma presente extensão muito menor em outras espécies de planta; ou a ligação pode estar mais geral a mais de uma espécie de planta, se o sítio de ligação está presente em mais de uma espécie de planta. A ligação do domínio de ligação pode ser específica para um gênero de planta particular, significando que o sítio de ligação, presente dentro ou sobre tal gênero de planta, não está ou a uma presente extensão muito menor em outros gêneros de planta; ou a ligação pode estar mais geral a mais de um gênero de planta, se o sítio de ligação está presente em mais de um gênero de planta. A ligação do domínio de ligação pode ser específica para um estágio de crescimento particular da planta, significando que o sítio de ligação, presente dentro ou sobre tal planta em um estágio de crescimento particular, não está ou a uma presente extensão muito menor na planta em outro estágio de crescimento; ou a ligação pode estar mais geral a mais de um estágio de crescimento de planta, se o sítio de ligação está presente em mais de um estágio de crescimento de planta. Todos os tipos de especificidade de ligação dos domínios de ligação podem ter seu uso específico, como será explicado abaixo.

[00015] Preferivelmente, a ligação do domínio de ligação ao sítio de ligação ainda é funcional sob condições severas, tal como baixa ou alta temperatura, baixo ou alto pH, baixa ou alta força iônica, irradiação de UV, baixa disponibilidade de água, presença de substâncias químicas de desnaturação ou similares. Em uma modalidade preferida, as referidas condições severas são definidas por uma faixa de pH de 4 a 9, mais preferivelmente por uma faixa de pH de 3 a 10, até mesmo mais preferivelmente por uma faixa de pH de 2 a 10, mais preferivelmente por uma faixa de pH de 1 a 11. Em outra modalidade preferida, as referidas condições severas são definidas por uma faixa de temperatura de 4-50°C, mais preferivelmente uma faixa de temperatura de 0-55°C, até mesmo mais preferivelmente uma faixa de temperatura de 0-60°C. Em outra modalidade preferida, as referidas condições severas são definidas pela presença de uma formulação agroquímica como definido acima.

[00016] Preferivelmente, a ligação do domínio de ligação ao sítio de ligação é forte p bastante para ligar, mais preferivelmente reter, um veículo ao referido sítio de ligação; dependendo do tamanho do veículo e da afinidade do domínio de ligação, um ou mais domínios de ligação podem ligar-se a um ou mais sítios de ligação e podem cooperar, tal que a avidez resultante dos domínios de ligação para o(s) sítio(s) de ligação assegura a forte ligação do veículo, preferivelmente retendo o veículo, sobre a planta. Um "veículo", quando aqui usado, significa qualquer veículo sólido, semissólido ou líquido dentro ou sobre o qual, uma substância ativa pode ser adequadamente incorporada, incluída, imobilizada, adsorvida, absorvida, ligada, encapsulada, incrustado, unido ou compreendido. Exemplos não limitantes de tais veículos incluem nanocápsulas, microcápsulas, nanosferas, microsferas, nanopartículas, micropartículas, lipossomas, vesículas, contas, um gel, partículas de resina iônica fracas, lipossomas, veículos de liberação cocleados, pequenos grânulos, granulados, nanotubos, bucky-balls, gotículas de água que fazem parte de uma emulsão de água-em-óleo, gotículas de óleo que fazem parte de uma emulsão de óleo-em-água, materiais orgânicos tais como cortiça, madeira ou outros materiais derivados de planta (por exemplo, na forma de cascas de semente, lascas de madeira, polpa, esferas, contas, folhas ou qualquer forma adequada), papel ou papelão, materiais inorgânicos, tais como, talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina, silicatos e zeólitos, ou ainda células microbianas (tal como, células de levedura) ou fragmentos ou frações adequadas dos mesmos (também como aqui descrito). "Reter" quando aqui usado, significa que a força de ligação que é o resultado da afinidade ou avidez de um domínio de ligação simples ou uma combinação de dois ou mais domínios de ligação para seu sítio de ligação é maior do que a força e torque combinados impostos pela gravidade do veículo, a força e torque, se existir, causados pelo fluxo ou gotejamento de uma solução agroquímica pulverizada, e a força e torque, se existir, imposto por forças de cisalhamento causadas por um ou mais fatores externos. Em uma modalidade preferida, o referido fator externo é chuva, irrigação, neve, granizo ou vento. Uma vantagem particular de ligar um veículo por ligação específica em ligação não específica, é que a ligação específica é mais resistente a forças de cisalhamento externas aplicadas ao veículo (Cozens-Roberts e outro, 1990).

[00017] Preferivelmente, um domínio de ligação de acordo com a invenção, liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, presente dentro ou sobre uma ou mais partes particulares da planta viva intacta. Preferivelmente, as referidas partes da planta viva intacta são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule, raízes, frutas, estróbilos, flores, bulbos ou tubérculos. Mais preferivelmente, as referidas partes da planta viva intacta são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule ou raízes. Preferivelmente, um domínio de ligação de acordo com a invenção liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, sobre a superfície da planta viva intacta. Uma "superfície", quando aqui usada, pode ser qualquer superfície quando ocorre sobre a planta viva intacta; ou sobre uma ou mais partes da planta viva intacta, entretanto, exclui preparações de planta histológicas. Preferivelmente, a referida superfície da planta viva intacta é a superfície de uma parte da planta viva intacta, selecionada a partir do grupo que consiste em superfície de folha, superfície de caule, superfície de raiz, superfície da fruta, superfície do estróbilo, superfície da flor, superfície do bulbo ou superfície do tubérculo; ainda mais preferivelmente, a referida superfície da planta viva intacta é a superfície de uma parte da planta viva intacta, selecionada a partir do grupo que consiste em superfície da raiz, superfície do caule e superfície da folha.

[00018] Preferivelmente, um domínio de ligação de acordo com a invenção liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre uma estrutura particular da planta viva intacta ou em ou sobre uma estrutura particular de uma parte particular da planta viva intacta; mais preferivelmente em ou sobre uma estrutura particular envolvida ou implicada por estar envolvida em transporte de nutrientes, agroquímicos ou outras substâncias químicas na planta e/ou envolvida ou implicada por estar envolvida na defesa da planta. Preferivelmente, a referida estrutura particular é selecionada a partir do grupo que consiste em tricomas, estomas, lenticelas, espinhos, espinhas, pelos de raiz, cutícula e camada cerosa, ainda mais preferivelmente a referida estrutura particular é selecionada a partir do grupo que consiste em tricomas, estomas e cutícula. Em uma modalidade preferida, o referido domínio de ligação é a ligação a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou em tricomas de planta. Tricomas de planta são conhecidos pela pessoa versada na técnica, e incluem, porém não são limitados a, tricomas glandulares e pelos de folha. Tricomas de planta são ativos na defesa da planta (Lai e outro, 2000), porém especialmente tricomas não glandulares são citados da mesma forma como possíveis alvos para infecção (Calo e outro, 2006). Tricomas, incluindo tricomas glandulares, são da mesma forma implicado no transporte de compostos polares por cutículas de planta na planta (Schreiber, 2005). Isto torna tricomas um alvo ideal para liberação de agroquímicos, realçando a defesa natural ou concentrando agroquímicos no sítio de ataque ou por liberação melhorada de agroquímicos (polares) na planta. Em outra modalidade preferida, o referido domínio de ligação liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre estomas. Estomas são essenciais para permitir CO2 difundir na planta e minimizar perda de água. Estomas são da mesma forma usados como um sítio de entrada principal para patógenos, especialmente micróbios (Underwood e outro 2007). "Micróbios", quando aqui usados, significam bactérias, vírus, fungos e similares. Além disso, eles estão envolvidos diretamente na defesa da planta por meio de trilhas de sinalização específicas, que permitem a planta fechar os estomas na infecção microbiana (Melotto e outro, 2006). Em ainda outra modalidade preferida, o referido domínio de ligação liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre pelos de raiz. Pelos de raiz são conhecidos por ser importantes para ligação microbiana a, e colonização de plantas (Cage, 2004; Laus e outro, 2005), e são portanto um importante alvo para a liberação de agroquímicos. Em outra modalidade preferida, o referido domínio de ligação liga-se a um sítio de ligação, ou um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre a cutícula da planta. Cutículas da planta são conhecidas por ser importantes para ligação microbiana a, e colonização de plantas e desempenham um importante papel na liberação e deposição de agroquímicos lipofílicos na planta (Schreiber, 2005), e são portanto um importante alvo para a liberação e deposição de agroquímicos.

[00019] Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de acordo com a invenção é goma arábica de ligação. Em outra modalidade preferida, o referido domínio de ligação é lectinas e ligação, domínios tipo lectina, extensinas, ou domínios tipo extensina; mais preferivelmente o referido domínio de ligação é lectina de batata de ligação. Preferivelmente, o referido domínio de ligação compreende 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterá em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares); mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é derivado de um anticorpo de camelídeo de cadeia pesada, até mesmo mais preferivelmente o referido domínio de ligação compreende uma sequência de VHH. Anticorpos de camelídeo de cadeia pesada, e as sequências derivadas de VHH são conhecidas por pessoas versadas na técnica. Anticorpos de camelídeo foram descritos, entre outros em WO9404678 e em WO2007118670, aqui incorporado por referência. Ainda até mais preferivelmente, o referido VHH compreende duas pontes de dissulfeto. A maior parte das moléculas de VHH tem apenas uma ponte de dissulfeto; a presença de uma ponte de dissulfeto adicional produzirá estabilidade extra ao domínio de anticorpo, que é uma característica vantajosa para um domínio de ligação que precisa ser estável sob condições severas. Preferivelmente, o referido VHH compreende, preferivelmente consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 1 - SEQ ID N°42 (3A2, 3B4, 3B7, 3D10, 3D2, 3D8, 3E6, 3F5, 3F7, 3F9, 3G2, 3G4, 3H10, 3H8, 4A1, 5B5, 5B6, 5C4, 5C5, 5D4, 5E5, 5F5, 5G2, 5G5, 5H5, 7A2, 7C2, 7D2, 7E1_1, 7F1, 8B10, 8B12, 9A1, 9B5, 9C4, 9D5, 9E1, 9E4, 9F4, 9H1, 9H2 e 12H4), ou qualquer fragmento adequado da mesma (que conterá em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido, que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares) ou homólogos dos mesmos. Homólogos, quando aqui usados, são sequências em que cada ou qualquer região de estrutura e cada ou qualquer região de determinação complementar mostra pelo menos 80% de identidade, preferivelmente pelo menos 85% de identidade, mais preferivelmente 90% de identidade, até mesmo mais preferivelmente 95% de identidade com a região correspondente na sequência de referência (isto é, FR1_homólogo versus FR1_referência, CDR1_homólogo versus CDR1_referência, FR2_homólogo versus FR2_referência, CDR2_homólogo versus CDR2_referência, FR3_homólogo versus FR3_referência, CDR3_homólogo versus CDR3_referência e FR4_homólogo versus FR4_referência) quando medido em um alinhamento de BLASTp (Altschul e outro, 1997; definições de FR e CDR de acordo com Kabat).

[00020] Um segundo aspecto da invenção é um agente de alvejamento, capaz de reter um agroquímico em uma planta e/ou uma parte da planta.

[00021] Um "agente de alvejamento", quando aqui usado, é uma estrutura molecular, preferivelmente com um esqueleto de polipeptídeo, compreendendo pelo menos um domínio de ligação. Um agente de alvejamento em sua forma mais simples consiste somente em um domínio de ligação simples; entretanto, um agente de alvejamento pode compreender mais de um domínio de ligação e pode ser monovalente ou multivalente e monoespecífico ou multiespecífico, como também definido. Além de um domínio de ligação simples ou múltiplo, um agente de alvejamento pode compreender outras porções que podem ser quimicamente acopladas ou fundidas, no caso de N- terminalmente ou C-terminalmente ou ainda internamente fundidas, ao domínio de ligação. As referidas outras porções incluem, sem limitação, um ou mais aminoácidos, incluindo aminoácidos rotulados (por exemplo, fluorescentemente ou radioativamente rotulados) ou aminoácidos rotulados (por exemplo, detectável por um anticorpo), um ou mais monossacarídeos, um ou mais oligossacarídeos, um ou mais polissacarídeos, um ou mais lipídios, um ou mais ácidos graxos, uma ou mais moléculas pequenas ou qualquer combinação do anteriormente mencionado. Em uma modalidade preferida, as referidas outras porções funcionam como espaçadores ou ligadores no referido agente de alvejamento.

[00022] "Agroquímico", quando aqui usado, significa qualquer substância ativa ou princípio que pode ser usado na indústria agroquímica (inclusive agricultura, horticultura, floricultura e usos domésticos e em jardim, porém da mesma forma produtos pretendidos para usos não relacionados à cultura tais como usos de operador de controle de peste/saúde pública para controlar insetos indesejáveis e roedores, usos domésticos, tais como fungicidas domésticos e inseticidas e agentes, para proteger plantas ou partes de plantas, culturas, bulbos, tubérculos, frutas (por exemplo de organismos nocivos, doenças ou pestes); para controlar, preferivelmente promover ou aumentar, o crescimento de plantas; e/ou para promover a produção de plantas, colheitas ou as partes das plantas que são colhidas (por exemplo, suas frutas, flores, sementes etc.). Exemplos de tais substâncias estarão claros para a pessoa versada e podem por exemplo incluir compostos que são ativos como inseticidas (por exemplo, inseticidas de contato ou inseticidas sistêmicos, incluindo inseticidas para uso doméstico), herbicidas (por exemplo, herbicidas de contato ou herbicidas sistêmicos, inclusive herbicidas para uso doméstico), fungicidas (por exemplo, fungicidas de contato ou fungicidas sistêmicos, inclusive fungicidas para uso doméstico), nematicidas (por exemplo, nematicidas de contato ou nematicidas sistêmicos, inclusive nematicidas para uso doméstico) e outros pesticidas ou biocidas (por exemplo, agentes para matar insetos ou caracóis); bem como fertilizantes; reguladores de crescimento tais como hormônios de planta; micronutrientes, protetores, feromônios; repelentes; iscas de inseto; e/ou princípios ativos que são usados para modular (isto é, aumentar, diminuir, inibir, realçar e/ou ativar) expressão de gene (e/ou outros processos biológicos ou bioquímicos) em ou pela planta alvejada (por exemplo, a planta a ser protegida ou a planta a ser controlada), tais como ácidos nucleicos (por exemplo, RNA de filamento único ou de filamento duplo, quando por exemplo usado no contexto de tecnologia de RNAi) e outros fatores, proteínas, substâncias químicas, etc. conhecidos de per si para este propósito, etc. Exemplos de tais agroquímicos estarão claros para a pessoa versada; e por exemplo incluem, sem limitação: glifosato, paraquate, metolaclor, acetoclor, mesotriona, 2,4-D,atrazina, glufosinato, sulfosato, fenoxaprope, pendimetalina, picloram, trifluralina, bromoxinila, clodinafope, fluroxipir, nicossulfurona, bensulfurona, imazetapir, dicamba, imidaclopride, tiametoxam, fipronila, clorpirifos, deltametrina, lambda-cialotrina, endossulfano, metamidofos, carbofurano, clotianidina, cipermetrina, abamectina, diflufenicano, espinosade, indoxacarbe, bifentrina, teflutrina, azoxistrobina, tiametoxam, tebuconazol, mancozebe, ciazofamida, fluazinam, piraclostrobina, epoxiconazol, clorotalonila, fungicidas de cobre, trifloxistrobina, protioconazol, difenoconazol, carbendazim, propiconazol, tiofanato, enxofre, boscalide e outros agroquímicos conhecidos ou quaisquer combinação(ões) adequada(as) dos mesmos. Outros agroquímicos adequados estarão claros para a pessoa versada com base na descrição aqui, e podem ser, por exemplo, qualquer agroquímico comercialmente disponível, e por exemplo incluem cada um dos compostos listados em Phillips McDougall, AgriService Novembro de 2007 V4.0, Seção de Produtos - 2006 Market, Índice de Produto pp. 10-20. O referido agroquímico pode ocorrer em formas diferentes, incluindo porém não limitadas a, como cristais, como microcristais, como nanocristais, como cocristais, como um pó, como grânulos, como um pó, como comprimidos, como um gel, como um concentrado solúvel, como uma emulsão, como concentrado emulsificável, como uma suspensão, como um concentrado de suspensão, como uma suspoemulsão, como uma dispersão, como uma concentrado de dispersão, como uma suspensão de microcápsula ou como qualquer outra forma ou tipo de formulação agroquímica clara para aqueles versados na técnica. Agroquímicos não apenas incluem substâncias ativas ou princípios que estão pronto o uso, porém da mesma forma precursores em uma forma inativa, que podem ser ativados por fatores externos. Como um exemplo não limitante, o precursor pode ser ativado por alterações de pH, causadas por feridas de planta do dano causado por inseto, por ação enzimática causada por ataque fúngico ou por alterações de temperatura ou alterações na umidade.

[00023] "Parte da planta", quando aqui usada, significa qualquer parte da planta, ou parte de uma planta viva intacta ou isolada ou separada de uma planta viva intacta, e até mesmo material de planta morto pode ser considerado. Preferivelmente, as referidas partes de planta são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule, raízes, frutas, estróbilos, flores, bulbos e tubérculos. Mais preferivelmente, as referidas partes de planta são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule e raízes. Até mesmo mais preferivelmente, a referida planta é uma planta viva intacta e/ou as referidas partes de planta são partes de planta de uma planta viva intacta.

[00024] A fim de ser capaz de manter um agroquímico em uma planta ou uma parte da planta, qualquer um dos agentes de alvejamento simples ou múltiplos é fundido com ou ligado ao agroquímico, ou por uma ligação covalente, por ligações de hidrogênio, por interações de dipólo-dipólo, por forças de Van der Waals fracas ou por qualquer combinação do anteriormente mencionado. "Ligado", quando aqui usado, significa acoplado a, conectado a, ancorado em, misturado com ou revestindo.

[00025] Em uma modalidade preferida, o referido agroquímico é ligado em ou compreendido em um veículo, como definido acima, por meio do qual o agente de alvejamento é acoplado ao veículo ou ao agroquímico. Preferivelmente, o domínio de ligação é acoplado ao veículo. "Acoplado", quando aqui usado, pode ser qualquer acoplamento que permite a retenção do agroquímico ou veículo que contêm o agroquímico pelo agente de alvejamento; pode ser um covalente bem como uma ligação não covalente. Preferivelmente, o referido acoplamento é uma ligação covalente. Está claro para a pessoa versada na técnica como os domínios de ligação e/ou agentes de alvejamento podem ser acoplados a qualquer tipo de grupos funcionais presente à superfície externa de um veículo. "Grupo funcional", quando aqui usado, significa qualquer grupo químico, ao qual uma proteína pode ser covalentemente ligada, incluindo porém não limitada a, grupo carboxila, amina, hidroxila, sulfidrila ou alcina. Como um exemplo não limitante, acoplamento por formação de uma ligação de carbodiimida entre grupos carboxila na superfície externa do veículo e os grupos amina do domínio de ligação e/ou agente de alvejamento pode ser aplicado. Domínios de ligação e/ou agentes de alvejamento podem ser acoplados com ou sem agentes de ligação ao veículo. No caso de um fago ou célula microbiana, o agente de alvejamento de acordo com a invenção pode ser codificado pela célula microbiana ou genoma de fago, considerando que o agroquímico está contido em ou acoplado ao fago ou célula microbiana, como proteína de fusão ou ligação química. Um "agente de ligação", quando aqui usado, pode ser qualquer agente de ligação conhecido por pessoas versadas na técnica; preferivelmente o agente de ligação está aumentando a flexibilidade do agente de alvejamento ligado no veículo, desse modo facilitando a ligação do domínio de ligação compreendida no agente de alvejamento ao sítio de ligação na planta. Exemplos de tais agentes de ligação podem ser constatados em WO0024884 e WO0140310.

[00026] Preferivelmente, o referido veículo é um microveículo. Um "microveículo", quando aqui usado, é um veículo de particulado, onde as partículas são menores do que 500 μm em diâmetro, preferivelmente menores do que 250 μm, até mesmo mais preferivelmente menores do que 100 μm, preferivelmente menores do que 50 μm. Microveículos para liberação de agroquímicos são conhecidos por pessoas versadas na técnica, e incluem, porém não são limitados a nanocápsulas, microcápsulas, nanosferas, microsferas, partículas de resina iônicas fracas, partículas de polímero, partículas de gel compostas, partículas feitas de celulose artificialmente lignificada, lipossomas, vesículas e veículos de liberação de cocleado. É da mesma forma possível que um ou mais agroquímicos estão presentes em ou dentro de uma célula microbiana (por exemplo, uma célula de levedura) ou um fago (por exemplo, porque os um ou mais agroquímicos podem ser carregados em (ou sobre) tais células ou são biológicos que foram produzidos/expressos na referida célula microbiana) ou que os um ou mais agroquímicos estão associados (por exemplo, ligados a ou incrustados em) com fragmentos de célula (por exemplo fragmentos de paredes de células ou membranas celulares), frações celulares ou outros resíduos celulares (por exemplo, obtidos por fracionamento ou lise das células microbianas em (ou sobre) que um ou mais agroquímicos foram carregados, produzidos ou expressos) e que portanto as referidas células microbianas ou fagos são usados como microveículos. Quando aqui usados, microveículo, micropartícula, microsfera, microcápsula, nanopartícula, nanocápsula e nanosfera podem ser usados alternadamente. Tais microveículos foram descritos, entre outros, em US6180141, WO2004004453, WO2005102045 e US7494526, aqui incorporados por referência. Preferivelmente, o referido microveículo é uma micropartícula composta de um polímero natural. As características de microveículos podem ser, tal que elas permitam a liberação lenta do agroquímico, liberação retardada do agroquímico ou liberação imediata do agroquímico, todos os tipos de microveículos têm seu uso específico. Os microveículos podem compreender naturalmente resíduos reticuláveis adequados para ligação covalente, ou os microveículos podem ser derivados para introduzir grupos reticuláveis adequados para métodos bem conhecidos na técnica. Tal derivação pode ocorrer antes da fabricação do microveículo, isto é, ao nível das matérias-primas que serão usadas no referido processo industrial, pode ocorrer durante o processo industrial do microveículo ou pode ocorrer subsequente à fabricação do microveículo. Em uma modalidade específica, grupos funcionais no microveículo podem ser ligados a um espaçador ou agente de ligação, que está por sua vez, ligado a um agente de alvejamento como definido acima.

[00027] Em outra modalidade preferida, um ou mais domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se a um sítio de ligação ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, presente dentro ou em uma ou mais partes particulares da planta, preferivelmente a planta viva intacta. Preferivelmente, as referidas partes da planta, mais preferivelmente da planta viva intacta, são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule, raízes, frutas, estróbilos, flores, bulbos ou tubérculos. Mais preferivelmente, as referidas partes da planta, preferivelmente da planta viva intacta, são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule ou raízes. Mais preferivelmente, um ou mais domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se a um sítio de ligação ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, na superfície da planta, preferivelmente na planta viva intacta. Preferivelmente, a referida superfície da planta, preferivelmente a planta viva intacta, é a superfície de uma parte da planta, preferivelmente a planta viva intacta, selecionada a partir do grupo que consiste em superfície da folha, superfície do caule, superfície da raiz, superfície da fruta, superfície do estróbilo, superfície da flor, superfície do bulbo ou superfície do tubérculo; ainda mais preferivelmente a referida superfície da planta, preferivelmente a planta viva intacta, é a superfície de uma parte da planta, preferivelmente a planta viva intacta, selecionada a partir do grupo que consiste em superfície da raiz, superfície do caule e superfície da folha.

[00028] Em outra modalidade preferida, um ou mais domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se ao sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre uma estrutura particular da planta, preferivelmente a planta viva intacta, ou em ou sobre uma estrutura particular de uma parte particular da planta, preferivelmente a planta viva intacta; mais preferivelmente em ou sobre uma estrutura particular envolvida ou implicada por estar envolvida em transporte de nutrientes, agroquímicos ou outras substâncias químicas na planta e/ou envolvidas ou implicadas por estar envolvidas na defesa da planta. Preferivelmente a referida estrutura particular é selecionada a partir do grupo que consiste em tricomas, estomas, lenticelas, espinhos, espinhas, pelos da raiz, cutícula e camada cerosa, ainda mais preferivelmente a referida estrutura particular é selecionada a partir do grupo que consiste em tricomas, estomas e cutícula. Em uma modalidade preferida, os referidos um ou mais domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se ao sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre tricomas de planta. Em outra modalidade preferida, os referidos um ou mais domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se ao sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre estomas. Em ainda outra modalidade preferida, os referidos um ou mais domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se ao sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre a cutícula da planta.

[00029] Em ainda outra modalidade preferida, um ou mais domínios de ligação de acordo com a invenção e compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se a goma arábica. Em outra modalidade preferida, um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento, ligam-se a lectinas, domínios tipo lectina, extensinas ou domínios tipo extensina; mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é lectina de batata de ligação. Preferivelmente, um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento compreendem 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterão em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares); mais preferivelmente, um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento são derivados de um anticorpo de camelídeo de cadeia pesada, até mesmo mais preferivelmente um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento compreendem uma sequência de VHH. Ainda até mais preferivelmente, o referido VHH compreende duas pontes de dissulfeto. Preferivelmente, o referido VHH compreende, preferivelmente consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 1 - SEQ ID N°42 (3A2, 3B4, 3B7, 3D10, 3D2, 3D8, 3E6, 3F5, 3F7, 3F9, 3G2, 3G4, 3H10, 3H8, 4A1, 5B5, 5B6, 5C4, 5C5, 5D4, 5E5, 5F5, 5G2, 5G5, 5H5, 7A2, 7C2, 7D2, 7E1_1, 7F1, 8B10, 8B12, 9A1, 9B5, 9C4, 9D5, 9E1, 9E4, 9F4, 9H1, 9H2 e 12H4), ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterão em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares) ou homólogos dos mesmos.

[00030] Um terceiro aspecto da invenção é o uso de um agente de alvejamento de acordo com a invenção para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos a uma planta ou parte da planta.

[00031] Qualquer parte da planta, se parte de uma planta viva intacta ou se isolada ou separada de uma planta viva intacta, e até mesmo material da planta morta pode ser considerado como um alvo para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos usando um agente de alvejamento de acordo com a invenção. Preferivelmente, as referidas partes da planta são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule, raízes, frutas, estróbilos, flores, bulbos e tubérculos. Mais preferivelmente, as referidas partes da planta são selecionadas a partir do grupo que consiste em folhas, caule e raízes. Até mesmo mais preferivelmente, a referida planta é uma planta viva intacta e/ou as referidas partes da planta são partes da planta de uma planta viva intacta. A referida liberação é realizada usando qualquer técnica manual ou mecânica adequada ou desejada para aplicação de um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos, incluindo porém não limitada a, pulverização, escovação, adubação, gotejamento, cobertura, imersão, dispersão, aplicação como pequenas gotículas, uma névoa ou um aerossol. Como exemplos não limitantes, um agente de alvejamento de acordo com a invenção pode ser usado para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos à folhagem de um cultura cultivada no campo, pode ser usado para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos nas raízes de uma cultura propagada por hidrocultura, pode ser usado para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos nas partes da planta colhidas (por exemplo frutas, flores ou sementes) como um tratamento pós-colheita, pode ser usado para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos no material de planta viva ou morta presente no solo, na preparação de terra cultivável, que é particularmente útil na combinação sem práticas agrícolas de cultivo, ou pode ser usado para liberar ou reter um agroquímico a um substrato colocado nos arredores de uma rizosfera para obter a distribuição e retenção prolongada de agroquímicos por toda a rizosfera. Um aspecto particularmente vantajoso da invenção, é que permite, adequadamente escolher a combinação de agente de alvejamento e agroquímico, ou combinação de agroquímicos para formular a mesma substância ativa para uma variedade de usos diferentes, por exemplo em espécies de planta diferentes ou partes de plantas, para condições ambientais diferentes (tipo de solo, quantidade de chuva e outras condições de tempo, ou até mesmo condições sazonais diferentes) e diferente usos finais (por exemplo no campo, em estufas, em jardins, em sistemas cultura hidropônica, para uso de liberação rápida, retardado ou lenta dependente possivelmente ambiental, para uso doméstico e para uso por operadores de controle de peste). Desse modo, pelo uso do agente de alvejamento para liberar e reter o agroquímico, é possível, a partir de substâncias agroquímicas ativas ou formulações agroquímicas com eficácia comprovada, que são ambientalmente aceitáveis, fornecer uma faixa de agentes ou produtos de proteção da planta diferentes e melhorados ou outros produtos agroquímicos adaptados para uso final desejado ou pretendido. Como um exemplo não limitante, um herbicida de amplo espectro pode ser feito de espécies de planta específicas, liberando-o usando um agente de alvejamento que compreende um domínio de ligação específico da espécie de planta; por outro lado, a liberação do mesmo herbicida usando um agente de alvejamento que compreende um domínio de ligação que tem uma especificidade de amplo espectro, pode ajudar reduzir as quantidades de herbicida necessárias para exercer sua ação desejada. Da mesma forma, a atividade de fora de alvo indesejada de um agroquímico, por exemplo versus insetos benéficos, pode ser evitada por liberação do agroquímico usando um agente de alvejamento que compreende um domínio de ligação que é altamente específico para cultura alvejada ou para partes específicas da cultura alvejada.

[00032] Preferivelmente, o referido agroquímico ou combinação de agroquímicos é selecionado a partir dos grupos que consistem em herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, protetores, micronutrientes e compostos reguladores de crescimento da planta.

[00033] Preferivelmente, o referido método de liberação e retenção de um agroquímico ou combinação de agroquímicos resulta em deposição melhorada do referido agroquímico ou combinação de agroquímicos na planta ou parte da planta. "Deposição melhorada", quando aqui usada, significa que a quantidade do agroquímico ou combinação de agroquímicos que é ligado à planta ou parte da planta é aumentada e/ou que a distribuição do agroquímico ou combinação de agroquímicos é dividida sobre a planta ou parte da planta mais igualmente ou mais concentrado em função da especificidade do domínio de ligação compreendido no agente de alvejamento, quando comparado ao mesmo agroquímico ou combinação de agroquímicos aplicado sem o uso de qualquer agente de alvejamento.

[00034] Em uma modalidade preferida, o referido agroquímico ou combinação de agroquímicos é ligado em ou compreendido em um veículo, preferivelmente um microveículo como definido mais cedo. Isto pode ser por exemplo particularmente vantajoso para um agroquímico ou combinação de agroquímicos que é volátil ou rapidamente degradável por fatores ambientais, tal como a presença de umidade ou irradiação de UV, ou que possui um perigo de toxicidade considerável para a pessoa que manuseia o agroquímico ou combinação de agroquímicos. Em uma modalidade específica, grupos funcionais no veículo podem ser ligados a um espaçador ou agente de ligação, que são por sua vez ligados a um agente de alvejamento como definido acima.

[00035] Um quarto aspecto da invenção é uma composição, compreendendo pelo menos (i) um agente de alvejamento que compreende pelo menos um domínio de ligação de acordo com a invenção e (ii) um agroquímico ou combinação de agroquímicos.

[00036] O(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição pode(m) ser um agente de alvejamento "monoespecífico" ou um "agente de alvejamento multiespecífico". Por um "agente de alvejamento monoespecífico" entende-se um agente de alvejamento que compreende um domínio de ligação simples, ou que compreende dois ou mais domínios de ligação diferentes, que cada qual é direcionado contra o mesmo presente de antígeno ou no mesmo sítio de ligação ou que forma o referido sítio de ligação. Desse modo, um agente de alvejamento monoespecífico é capaz de ligação a um sítio de ligação simples, ou por um domínio de ligação simples ou por domínios de ligação múltiplos. Por um "agente de alvejamento multiespecífico" entende-se um agente de alvejamento que compreende dois ou mais domínios de ligação, que são cada qual direcionados contra antígenos diferentes presentes a ou em um sítio de ligação, ou que formam o referido sítio de ligação. Desse modo, um "agente de alvejamento biespecífico" é capaz de ligação a dois sítios de ligação diferentes ou antígenos presentes a ou em um sítio de ligação, ou que formam o referido sítio de ligação; um "agente de alvejamento triespecífico" é capaz de ligação a três antígenos diferentes presentes a ou em um sítio de ligação ou que formam o referido sítio de ligação; e assim por diante para "agentes de alvejamento multiespecíficos". Da mesma forma, em relação aos agentes de alvejamento aqui descritos, o termo "monovalente" é usado para indicar que o agente de alvejamento compreende um domínio de ligação simples; o termo "bivalente" é usado para indicar que o agente de alvejamento compreende um total de dois domínios de ligação simples; o termo "trivalente" é usado para indicar que o agente de alvejamento compreende um total de três domínios de ligação simples; e assim por diante para agentes de alvejamento "multivalentes". Consequentemente, em um aspecto, a composição anterior da invenção compreende dois ou mais agentes de alvejamento idênticos ou diferentes, pelos quais entende-se dois ou mais agentes de alvejamento que, para agentes de alvejamento idênticos, cada qual liga-se a antígenos idênticos ou diferentes presentes a ou no mesmo sítio de ligação, considerando que pelo menos para os agentes de alvejamento diferentes, a pelo menos um liga-se aos antígenos diferentes presentes em ou no mesmo sítio de ligação ou em sítios de ligação diferentes.

[00037] Preferivelmente, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se a um sítio de ligação ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, presente em ou sobre uma ou mais partes particulares de uma planta, preferivelmente de uma planta viva intacta. Preferivelmente, as referidas partes da planta, mais preferivelmente da planta viva intacta, são selecionadas a partir do grupo consistindo em folhas, caules, raízes, frutas, estróbilos, flores, bulbos ou tubérculos. Mais preferivelmente, as referidas partes da planta viva intacta são selecionadas a partir do grupo consistindo em folhas, caules ou raízes. Mais preferivelmente, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se a um sítio de ligação ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, na superfície da planta viva intacta. Preferivelmente, a referida superfície da planta viva intacta é a superfície de uma parte da planta viva intacta, selecionada a partir do grupo consistindo na superfície da folha, superfície do caule, superfície da raiz, superfície da fruta, superfície do estróbilo, superfície da flor, superfície do bulbo ou superfície do tubérculo; ainda mais preferivelmente a referida superfície da planta viva intacta é a superfície de uma parte da planta viva intacta, selecionada a partir do grupo consistindo na superfície da raiz, superfície do caule e superfície da folha.

[00038] Preferivelmente, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre uma estrutura particular da planta, preferivelmente a planta viva intacta ou em ou sobre uma estrutura particular de uma parte particular da planta, preferivelmente a planta viva intacta; mais preferivelmente em ou sobre uma estrutura particular envolvida ou implicada por estar envolvida em transporte de nutrientes, agroquímicos ou outras substâncias químicas na planta e/ou envolvida ou implicada por estar envolvida na defesa de planta. Preferivelmente, a referida estrutura particular é selecionada a partir do grupo consistindo em tricomas, estomas, lenticelas, espinhos, espinhas, pelos com raiz, cutícula e camada cerosa, ainda mais preferivelmente a referida estrutura particular é selecionada a partir do grupo consistindo em tricomas, estomas e cutícula. Em uma modalidade preferida, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre tricomas de planta. Em outra modalidade preferida, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre os estomas. Em ainda outra modalidade preferida, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se a um sítio de ligação, ou a um antígeno compreendido em tal sítio de ligação, em ou sobre a cutícula da planta.

[00039] Em ainda outra modalidade preferida, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se à goma arábica. Em outra modalidade preferida, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que liga-se às lectinas, domínios tipo lectina, extensinas, ou domínios tipo extensina; mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é lectina de batata de ligação. Preferivelmente, o(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que compreende 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterá em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares); mais preferivelmente, um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento é derivado de um anticorpo de camelídeo de cadeia pesada, ainda mais preferivelmente um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento compreende uma sequência de VHH. Contudo ainda mais preferivelmente, o referido VHH compreende duas pontes de dissulfeto. Preferivelmente, o referido VHH compreende, preferivelmente consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N° 1. SEQ ID N°42 (3A2, 3B4, 3B7, 3D10, 3D2, 3D8, 3E6, 3F5, 3F7, 3F9, 3G2, 3G4, 3H10, 3H8, 4A1, 5B5, 5B6, 5C4, 5C5, 5D4, 5E5, 5F5, 5G2, 5G5, 5H5, 7A2, 7C2, 7D2, 7E1_1, 7F1, 8B10, 8B12, 9A1, 9B5, 9C4, 9D5, 9E1, 9E4, 9F4, 9H1, 9H2 e 12H4), ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterá em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares) ou homólogos dos mesmos.

[00040] Na composição de acordo com a invenção, o referido agroquímico ou combinação de agroquímicos é selecionado preferivelmente a partir do grupo consistindo em herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, protetores, micronutrientes ou compostos reguladores de crescimento de planta.

[00041] Na composição de acordo com a invenção, o agroquímico ou combinação de agroquímicos pode estar em uma forma líquida, semissólido ou sólida e por exemplo ser mantido como um aerossol, pó fluível, pó umectável, grânulo umectável, concentrado emulsificável, concentrado de suspensão, microemulsão, suspensão de cápsula, microcápsula seca, comprimido ou gel ou ser suspenso, disperso, emulsificado ou de outra maneira levado em um meio líquido adequado (tal como água ou outro meio aquoso, orgânico ou oleoso adequado) para armazenamento ou aplicação sobre uma planta. Opcionalmente, a composição também compreende um ou mais componentes adicionais tal como, porém não limitado a diluentes, solventes, adjuvantes, tensoativos, agentes de umectação, agentes de dispersão, óleos, aderentes, espessantes, penetrantes, agentes de tamponamento, acidificantes, agentes antissedimentação, agentes anticongelamento, fotoprotetores, agentes desespumantes, biocidas e/ou agentes de controle de impulso ou similares, adequados para uso na composição de acordo com a invenção.

[00042] Em uma modalidade preferida, o agroquímico ou combinação de agroquímicos é ligado em ou de outra maneira compreendido em um veículo. No caso de uma combinação de agroquímicos, cada agroquímico individual pode ser ligado em ou de outra maneira pode ser compreendido em um veículo individual, ou uma combinação adequada de agroquímicos pode ser ligada juntamente em ou de outra maneira compreendida em um veículo. Como uma alternativa para o uso de veículo, o agroquímico ou combinação de agroquímicos pode ser fornecido da mesma forma na forma de (pequenas) partículas que são proporcionadas com um revestimento adequado ou (externa) camada a qual o agente de alvejamento é acoplado ou pode ligar-se e que pode da mesma forma servir para estabilizar ou melhorar a integridade física ou estabilidade das partículas. Como outra alternativa, o agroquímico ou combinação de agroquímicos pode ser misturado adequadamente com um excipiente ou aglutinante ao qual o agente de alvejamento é acoplado ou pode ligar-se, e que pode também servir novamente para estabilizar ou melhorar a integridade física ou estabilidade das partículas. Tais partículas revestidas ou de composto estão preferivelmente na forma de uma suspensão, massa úmida ou pó fluível livre, comprimido, cápsula ou concentrado líquido (tal como uma emulsão, suspensão ou dispersão).

[00043] Em uma modalidade preferida, a composição de acordo com a invenção é para uso agroquímico. "Uso agroquímico", quando aqui usado, não só inclui o uso de agroquímicos como definido acima (por exemplo, pesticidas, reguladores de crescimento, nutrientes/fertilizantes, repelentes, desfolhantes etc.) que são adequados e/ou pretendidos para uso em culturas cultivadas no campo (por exemplo, agricultura), mas também inclui o uso de agroquímicos como definido acima (por exemplo, pesticidas, reguladores de crescimento, nutrientes/fertilizantes, repelentes, desfolhantes etc.) que são pretendidos para uso em culturas cultivadas em estufa (por exemplo, horticultura/floricultura) ou sistemas de cultura hidropônicos e ainda o uso de agroquímicos como definido acima que são adequados e/ou pretendidos para usos de não cultura tais como usos em jardins privados, usos domésticos (por exemplo, herbicidas ou inseticidas para uso doméstico), ou usos por operadores de controle de peste (por exemplo, controle de erva-daninha etc.).

[00044] Com base no ensinamento apresentado na presente especificação, e por exemplo, dependendo do(s) agroquímico(s) a ser(em) liberado(s), na(s) parte(s) à planta a qual o(s) agroquímico(s) deve(m) ser liberado(s), e a ação agroquímica pretendida da composição da invenção (e/ou o(s) agroquímico(s) incluído(s) nesta), a pessoa versada será capaz de adequadamente selecionar os domínios de ligação/agente de alvejamento específicos que podem/devem estar presentes na composição da invenção (bem como os outros componentes da composição, tal como o veículo, o agroquímico e a forma/formulação do agroquímico) para alcançar a ação agroquímica desejada/pretendida. Desse modo, com vantagem, com base na descrição aqui, a invenção torna possível para a pessoa versada adequadamente selecionar uma combinação adequada de domínio(s) de ligação/agente(s) de alvejamento, agroquímico(s), veículo, componentes adicionais da composição e a forma/formulação agroquímica da composição para alcançar a ação agroquímica pretendida /desejada. Neste respeito, deve ser notado que, na invenção como atualmente contemplada, e embora seja previsto que algumas tais combinações serão mais eficazes e/ou mais preferidas que outras, haverá provavelmente múltiplas tais combinações possíveis que darão a ação agroquímica pretendida/desejada a mais ou menos o mesmo grau. Isto também permite a pessoa versada para levar em conta outro(s) fatores (secundário) ao selecionar a combinação a ser usada, tal(ais) como a cultura(s) específica(s) a ser protegida(s), o campo prevalecente, solo, tempo e/ou outras condições ambientais, o modo que a composição é preferivelmente aplicada, o ambiente no qual é aplicado (campo, estufa, etc.), a persistência desejada e/ou outros fatores que podem influenciar a escolha de uma composição agroquímico para uma aplicação específica.

[00045] Por exemplo, e sem limitação, quando a composição da invenção é pretendida ligar-se a uma ou mais partes específicas da planta, o agente de alvejamento (isto é, o um ou mais domínios de ligação presentes nesta) é direcionado preferivelmente para um ou mais sítios de ligação (como definido aqui) que estão presentes (isto é, em uma quantidade suficiente) em/sobre a(s) referida(s) parte(s) da planta (da mesma forma sendo possível que tal(ais) sito(s) de ligação esteja(m) presentes em/sobre a(s) referida(s) parte(s) da planta em uma quantidade maior/a um grau maior do que sobre outra(s) parte(s) da planta, isto é, para fornecer um domínio de ligação/agente de alvejamento/composição da invenção que pode ligar-se preferencialmente à(s) parte(s) pretendia(s)/desejada(s) da planta em comparação a uma ou mais outras partes da planta); e composições da invenção compreendendo tais domínios de ligação/agentes de alvejamento (isto é, tal que as composições são direcionadas aos sítios de ligação presentes na(s) parte(s) desejada(s) da planta e preferivelmente tal que eles podem ligarem-se preferencialmente à(s) parte(s) desejada(s) da planta) formam alguns aspectos específico, porém, não limitantes da invenção. Por exemplo, e sem limitação: - para uma composição da invenção que é pretendida ligar- se às folhas de uma planta, os domínios de ligação e/ou agente de alvejamento podem ser direcionados contra um ou mais dos seguintes sítios de ligação em (as folhas de) uma planta: cutina, ceras cuticulares, arabinogalactana-proteínas ou proteínas de transferência de lipídio; - para uma composição da invenção que é pretendida ligase às raízes de uma planta, os domínios de ligação e/ou agente de alvejamento podem ser direcionados contra um ou mais dos seguintes sítios de ligação em (as raízes de) uma planta: extensinas ou pectinas; - para uma composição da invenção que é pretendida ligar- se ao talo de uma planta, os domínios de ligação e/ou agente de alvejamento podem ser direcionados contra um ou mais dos seguintes sítios de ligação em (o talo de) uma planta: ligninas, extensinas ou produtos de excreção; e cada tal composição da invenção forma um aspecto específico, porém, não limitante da invenção.

[00046] Um quinto aspecto da invenção é uma composição, compreendendo pelo menos (i) um agente de alvejamento compreendendo pelo menos um domínio de ligação de acordo com a invenção e (ii) veículo.

[00047] O(s) agente(s) de alvejamento compreendido na referida composição pode(m) ser agentes de alvejamento monoespecíficos ou agentes de alvejamento multiespecíficos e pode(m) ser agentes de alvejamento monovalentes ou agentes de alvejamento multivalentes. Consequentemente, em um aspecto, a composição anterior da invenção compreende dois ou mais agentes de alvejamento idênticos ou diferentes, pelos quais é significado dois ou mais agentes de alvejamento que, para agentes de alvejamento idênticos, cada qual liga-se a antígenos idênticos ou diferentes presentes em ou no mesmo sítio de ligação, considerando que para agentes de alvejamento diferentes, pelo menos um liga-se a antígenos diferentes presentes em ou no mesmo sítio de ligação ou em sítios de ligação diferentes.

[00048] Em uma modalidade específica, que é preferido porém não limitante, o veículo é tal que permite aplicar a composição da invenção adequadamente ao sítio pretendido de ação, e/ou tal que permite a composição da invenção ser formulada tal que pode ser aplicada adequadamente ao sítio pretendido de ação; usando qualquer manual ou técnica mecânica adequado ou desejado tais como pulverização, escovação, gotejamento, imersão, cobertura, dispersão, aplicação como pequenas gotículas, uma névoa ou um aerossol, etc. Exemplos de tais técnicas, de composições da invenção que são adequadas para uso em tais técnicas, e de métodos para preparar e formular tais composições da invenção ficarão claro para a pessoa versada com base na descrição aqui. Preferivelmente, o veículo é tal que uma ou mais substâncias ativas podem ser incorporadas, encapsuladas ou incluídas no veículo, por exemplo, como uma nanocápsula, microcápsula, nanosfera, microsfera, lipossoma ou vesícula. Ainda mais preferivelmente, o veículo é tal que em tal incorporação, encapsulação, combinação ou inclusão, o complexo desse modo obtido pode ser suspenso, disperso, emulsificado ou de outra maneira levado em um meio líquido adequado (tal como água ou outro meio aquoso, orgânico ou oleoso adequado) para fornecer uma (concentrada) composição líquida da invenção que tem uma estabilidade que permite a composição da invenção ser armazenada adequadamente ou (onde necessário depois da diluição adicional) aplicada ao sítio pretendido de ação. Ainda mais preferivelmente, o veículo é tal que a composição da invenção pode ser transportada e/ou armazenada antes do uso final, opcionalmente (e normalmente preferivelmente) como um concentrado líquido adequado, pó seco, comprimido, cápsula, suspensão ou "massa úmida", que podem ser adequadamente diluídos, dispersos, suspensos, emulsificados ou de outra maneira adequadamente reconstituídos pelo usuário final antes do uso final (e tais concentrados formam um aspecto adicional da invenção). Veículos, preferivelmente microveículos, adequados para este propósito (e métodos para absorver, encapsular, combinar etc. os princípios ativos nestes) ficarão claro para a pessoa versada com base na descrição aqui e/ou podem estar comercialmente disponíveis. Alguns exemplos não limitantes incluem microsferas sólidas ou semissólido ou granulados em que os ingredientes ativos são combinados ou absorvidos em um material matriz adequado ou microcápsulas compreendendo um material de casca que cerca um núcleo que contém o ingrediente ativo (isto é, encapsulado dentro da microcápsula).

[00049] Preferivelmente, os veículos são tais que eles têm características de liberação imediata, atrasado, gradual, ativada ou lenta, por exemplo, durante vários minutos, várias horas, vários dias ou várias semanas. Da mesma forma, os veículos podem ser feitos de materiais (por exemplo, polímeros) que rompem ou lentamente degradam (por exemplo, devido à exposição prolongada à temperatura alta ou baixa, pH alto ou baixo, luz solar, umidade alta ou baixa ou outras condições ou fatores ambientais) ao longo do tempo (por exemplo, durante minutos, horas, dias ou semanas) ou que rompem ou degradam quando ativados por fatores externos particulares (tal como temperatura alta ou baixa, pH alto ou baixo, umidade alta ou baixa ou outros fatores ou condições ambientais) e desse modo liberam o agente ativo da microcápsula. O veículo é da mesma forma preferivelmente tal que os agroquímicos são liberados do veículo quando a composição da invenção é aplicada ao sítio pretendido de ação, isto é, a uma taxa que é suficiente para fornecer a ação desejada dos agroquímicos durante o período desejado de tempo (por exemplo, o tempo entre duas aplicações da composição da invenção).

[00050] Em uma modalidade particular, o veículo, preferivelmente o microveículo, pode ser composto de materiais de polímero, tal como por exemplo poliuretano, poliureia, poliamida, polietileno, polietileno- glicol, alcoóis polivinílicos, melamina, ureia/formaldeído, polímeros acrílicos, fibra sintética, acetato de vinila ou polímeros de siloxano ou - opcionalmente (e normalmente preferivelmente) para propósitos agroquímicos - polímeros biodegradáveis (tal como por exemplo ágar, gelatina, alginatos, gomas, pectinas, polialcoóis tal como álcool cetílico, substâncias oleosas tal como óleo de palma hidrogenado ou óleo de soja, amidos, ceras etc. Alternativamente, e embora isto seja normalmente menos preferido, materiais menos não biodegradáveis podem ser usados tais como polimetilacrilatos, polietersulfonas, óxidos de metal, estruturas de carbono etc..

[00051] Preferivelmente, o referido veículo é selecionado a partir do grupo consistindo em nanocápsulas, nanosferas, microcápsulas, microsferas, partículas de polímero, partículas feitas de celulose artificialmente lignificadas, partículas de gel de celulose, partículas de resina iônica fracas, células microbianas ou fragmentos dos mesmos. Mais preferivelmente, o referido veículo é selecionado a partir do grupo consistindo em microcápsulas, microsferas ou partículas de polímero. Preferivelmente, o referido veículo é um microcápsula.

[00052] Em uma modalidade preferida, o(s) agente(s) de alvejamento) compreendido(s) na referida composição, compreende(m) pelo menos um domínio de ligação que compreende 4 regiões de estrutura e 3 regiões de determinação complementares, ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que em seguida normalmente conterá pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam PElo menos uma das regiões de determinação complementares); mais preferivelmente, um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento é derivado de um anticorpo de camelídeo de cadeia pesada, ainda mais preferivelmente um ou mais dos referidos domínios de ligação compreendidos no agente de alvejamento compreende uma sequência de VHH. Ainda mais preferivelmente, o referido VHH compreende duas pontes de dissulfeto. Ainda mais preferivelmente, o referido VHH compreende, preferivelmente consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N° 1. SEQ ID N°42 (3A2, 3B4, 3B7, 3D10, 3D2, 3D8, 3E6, 3F5, 3F7, 3F9, 3G2, 3G4, 3H10, 3H8, 4A1, 5B5, 5B6, 5C4, 5C5, 5D4, 5E5, 5F5, 5G2, 5G5, 5H5, 7A2, 7C2, 7D2, 7E1_1, 7F1, 8B10, 8B12, 9A1, 9B5, 9C4, 9D5, 9E1, 9E4, 9F4, 9H1, 9H2 e 12H4), ou qualquer fragmento adequado das mesmas (que conterá em seguida normalmente pelo menos alguns dos resíduos de aminoácido que formam pelo menos uma das regiões de determinação complementares) ou homólogos dos mesmos.

[00053] Em outra modalidade preferida, o agente de alvejamento e o veículo compreendidos na composição de acordo com a invenção são acoplados entre si. Preferivelmente, o referido um agente de alvejamento simples ou agentes de alvejamento múltiplos são acoplados ao referido veículo por afinidade de ligação ou por ligação covalente. Mais preferivelmente, o referido um agente de alvejamento simples ou agentes de alvejamento múltiplos, são acoplados ao veículo por ligação covalente. Preferivelmente, o referido um agente de alvejamento simples ou agentes de alvejamento múltiplos são acoplados, preferivelmente covalentemente acoplados, ao veículo pelo uso de um grupo funcional presente na superfície externa do veículo. Preferivelmente, o domínio de ligação compreendido no(s) referido(s) agente(s) de alvejamento é acoplado, preferivelmente covalentemente acoplado, ao veículo. Alternativamente, o referido um agente de alvejamento simples ou agentes de alvejamento múltiplos são acoplados, preferivelmente covalentemente acoplados, ao veículo por uma porção que não é o domínio de ligação compreendido no agente de alvejamento.

[00054] Em ainda outra modalidade preferida, o referido veículo é acoplado a e/ou compreende pelo menos um agroquímico como definido acima. Preferivelmente, o referido agroquímico é selecionado a partir do grupo consistindo em herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, micronutrientes, protetores ou compostos reguladores de crescimento de planta. Nesta modalidade preferida, a referida composição é para uso agroquímico.

[00055] O veículo com o um ou mais agentes de alvejamento ligados, acoplados ou de outra maneira de outra maneira ligados a este ou associados com este pode ser dissolvido, emulsificado, suspenso ou disperso ou de outra maneira incluído em um meio líquido adequado (tal como água ou outro meio aquoso, orgânico ou oleoso) para fornecer um (concentrado) solução, suspensão, dispersão ou emulsão que é adequado para armazenamento.

[00056] Por exemplo, quando a composição da invenção é pretendida para uso agroquímico, a composição da invenção pode estar em uma forma líquida, semissólida ou sólida que é adequada para pulverização, tal como uma solução, emulsão, suspensão, dispersão, aerossol, pó fluível ou qualquer outra forma adequada. Em particular, uma tal composição da invenção para uso agroquímico pode compreender uma microcápsula, microsfera, nanocápsula, nanosfera, lipossomas ou vesículas etc. em que o um ou mais agroquímicos são adequadamente encapsulados, inclusos, incrustados, incorporados ou de outra maneira incluídos; e um ou mais agentes de alvejamento que cada qual compreende um ou mais domínios de ligação para ligar-se a um ou mais antígenos presentes em ou no referido sítio de ligação ou que formam o referido um ou mais sítios de ligação em uma planta ou partes de uma planta, tal como uma folha, talo, flor, fruta, bulbo ou tubérculo de uma planta).

[00057] Um sexto aspecto da invenção é um método para liberação de um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos a uma planta, o referido método compreendendo pelo menos uma aplicação de uma composição de acordo com a invenção à planta.

[00058] "Uma aplicação", quando aqui usado, significa um único tratamento de uma planta ou parte de planta. De acordo com este método, a composição de acordo com a invenção é aplicada como tal para à planta ou parte de planta, ou a referida composição é primeiro dissolvida, suspensa e/ou diluída em uma solução adequada antes de ser aplicada à planta. A aplicação à planta é realizada usando qualquer manual adequado ou desejado ou técnica mecânica para aplicação de um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos, incluindo porém não limitada a pulverização, escovação, adubação, gotejamento, imersão, cobertura, dispersão, aplicando como gotículas pequenas, uma névoa ou um aerossol. Em tal aplicação a uma planta ou parte de uma planta, a composição pode ligar-se a ou ao sítio de ligação (ou a um ou mais antígenos presentes em ou no referido sítio de ligação ou que formem os referidos sítios de ligação) por um ou mais domínios de ligação que formam parte do(s) agente(s) de alvejamento compreendido(s) na composição, preferivelmente de uma maneira alvejada. Logo após, os agroquímicos são liberados do veículo (por exemplo, devido à degradação do veículo ou transporte passivo através da parede do veículo) de uma tal maneira que eles pode fornecer a(s) ação(ões) agroquímica(s) desejada(s). Uma vantagem particular da liberar um agroquímico ou combinação de agroquímicos a uma planta usando uma composição de acordo com a invenção é que pode levar a uma deposição melhorado (como definido anteriormente) do agroquímico ou combinação de agroquímicos na planta ou parte de planta e/ou uma resistência aumentada do agroquímico ou combinação de agroquímicos em relação à perda devido a fatores externos tal como chuva, irrigação, neve, granizo ou vento.

[00059] Em uma modalidade preferida, a liberação de um agroquímico ou combinação de agroquímicos a uma planta usando uma composição de acordo com a invenção resulta na resistência à chuva melhorada do agroquímico ou combinação de agroquímicos. A "resistência à chuva melhorada", quando aqui usada, significa que a perda da porcentagem do agroquímico ou combinação de agroquímicos, calculada antes e depois de chuva, é menor quando o agroquímico ou combinação de agroquímicos é aplicado em uma composição de acordo com a invenção, em comparação com o mesmo agroquímico ou combinação de agroquímicos compreendido em uma composição comparável, sem qualquer agente de alvejamento. Uma "composição comparável", quando aqui usada, significa que a composição é idêntica à composição de acordo com a invenção, aparte da ausência do agente de alvejamento usado na composição de acordo com a invenção.

[00060] Em uma modalidade preferida, uma dose adequada do referido agroquímico ou combinação de agroquímicos compreendida em uma composição de acordo com a invenção é aplicada à planta ou parte de planta. Uma "dose adequada", quando aqui usada, significa que uma quantidade eficaz de substância ativa do agroquímico compreendeu na referida composição.

[00061] Preferivelmente, o referido método compreende a aplicação de uma dose significativamente reduzida de um agroquímico ou combinação de agroquímicos à planta, para obter os efeitos benéficos similares ao referido agroquímico ou combinação dos referidos agroquímicos, em comparação com a aplicação do mesmo agroquímico ou combinação de agroquímicos compreendido em uma composição comparável, como definido acima, sem qualquer agente de alvejamento. A referida redução significante é obtida direcionando- se o referido agroquímico à planta usando os agentes de alvejamento de acordo com a invenção. Alternativamente, o referido método compreende uma aplicação de uma dose adequada, por meio da qual a frequência de aplicação é significativamente reduzida, para obter os efeitos benéficos similares ao referido agroquímico, em comparação com a frequência de aplicação da mesma dose de uma composição encapsulada do agroquímico que necessita da presença de um agente de alvejamento de acordo com a invenção. Ainda mais preferivelmente, o referido método compreende uma aplicação por meio da qual a dose adequada bem como a frequência de aplicação são ambas significativamente reduzidas para obter os efeitos benéficos similares ao referido agroquímico, em comparação com a dose adequada e frequência de aplicação de um uma composição encapsulada do agroquímico que necessita da presença de um agente de alvejamento de acordo com a invenção.

[00062] Um sétimo aspecto da invenção é um método para proteger uma planta contra o estresse externo (biótico ou abiótico) e/ou para modular a viabilidade, crescimento ou rendimento de uma planta ou partes de planta e/ou para modular a expressão de gene em uma planta ou parte de planta que resulta na alteração de (níveis de) componentes de planta (tais como proteínas, óleos, carboidrato, metabólitos, etc.), o referido método compreendendo pelo menos uma aplicação de uma composição de acordo com a invenção. Se necessário, a referida composição é dissolvida, suspensa e/ou diluída em uma solução adequada. "Protegendo uma planta", quando aqui usado, é a proteção da planta contra qualquer estresse; o referido estresse pode ser estresse biótico, tal como porém não limitado a estresse causado por ervas daninhas, insetos, roedores, nematódeos, ácaros, fungos, vírus ou bactérias, ou podem ser estresse abiótico, tal como porém não limitado a estresse devido à secura, estresse devido ao sal, estresse devido à temperatura ou estresse oxidativo.

[00063] Preferivelmente, o referido método compreende a aplicação de uma dose significativamente reduzida de um agroquímico ou combinação de agroquímicos à planta, para obter efeitos benéficos similares ao referido agroquímico ou referida combinação de agroquímicos, em comparação com a aplicação do mesmo agroquímico ou combinação de agroquímicos compreendido em uma composição comparável, como definido anteriormente, sem qualquer agente de alvejamento. A referida redução significante é obtida direcionando-se o referido agroquímico à planta usando os agentes de alvejamento de acordo com a invenção. Alternativamente, o referido método compreende uma aplicação de uma dose adequada, por meio da qual a frequência de aplicação é significativamente reduzida, para obter os efeitos benéficos similares ao referido agroquímico, em comparação com a frequência de aplicação da mesma dose de uma composição encapsulada do agroquímico que necessita da presença de um agente de alvejamento de acordo com a invenção. Ainda mais preferivelmente, o referido método compreende uma aplicação por meio da qual a dose adequada bem como a frequência de aplicação são ambas significativamente reduzidas para obter os efeitos benéficos similares ao referido agroquímico, em comparação com a dose adequada e frequência de aplicação de um agroquímico encapsulado que necessita da presença de um agente de alvejamento de acordo com a invenção.

[00064] Um oitavo aspecto da invenção é um método para fabricar um veículo agroquímico de alvejamento específico, o referido método compreendendo (a) acondicionar um agroquímico em ou sobre um veículo e (b) ligar pelo menos um agente de alvejamento de acordo com a invenção ao veículo.

[00065] "Acondicionar", quando aqui usado, significa incorporar, incluir, imobilizar, adsorver, absorver, ligar, encapsular, combinar, unir, misturar, ancorar ou compreender. Métodos para acondicionar um agroquímico, como definido acima, em ou sobre um veículo são conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem, sem limitação, moldagem por gotejamento, granulação por extrusão, granulação em leito de fluido, co-extrusão, secagem por spray, resfriamento por spray, atomização, adição ou polimerização por condensação, polimerização interfacial, polimerização in situ, co-acervação, encapsulação por spray, dispersões fundidas por resfriamento, evaporação de solvente, separação de fase, extração de solvente, polimerização de solução- gel, misturação em alto ou baixo cisalhamento, revestimento de leito de fluido, revestimento por pan, fusão, absorção ou adsorção passiva ou ativa. Em uma modalidade preferida, porém não limitante, um agroquímico é acumulado em um microveículo usando técnicas de microencapsulação adequadas, tal como polimerização interfacial, polimerização in situ, co-acervação, encapsulação por spray, dispersões fundidas por resfriamento, evaporação de solvente, separação de fase, extração de solvente ou polimerização de solução- gel. Exemplos preferidos, porém não limitantes de materiais adequados para produzir tais microveículos são materiais tais como alginatos, ágar, gelatina, pectinas, gomas, óleos hidrogenados, gomas, ceras, polialcoóis, poliureia, poliuretano, poliamida, melamina, ureia/formaldeídeo, fibra sintética e outros polímeros (opcionalmente e normalmente preferidos biodegradáveis ou inertes). Mais preferivelmente, pelo menos um grupo funcional está presente na superfície externa do microveículo.

[00066] Pelo menos um agente de alvejamento de acordo com a invenção é unido ao veículo, ou por uma ligação covalente, por ligações de hidrogênio, por interações de dipólo-dipólo, por forças de Van der Waals fracas ou por uma combinação de quaisquer dos antecedentes. A ligação do agente de alvejamento ao veículo pode ser realizada enquanto acondicionando o agroquímico em ou sobre o veículo, pode ser realizada subsequente ao acondicionamento do agroquímico em ou sobre o veículo ou pode ser realizada apenas no momento que o agroquímico contém o veículo é dissolvido em uma solução adequada para aplicação. Processos adequados para unir o referido agente de alvejamento a um veículo ficará claro para a pessoa versada na técnica. Em uma modalidade preferida, o agente de alvejamento e o veículo são acoplados entre si. Preferivelmente, o(s) referido(s) agente(s) de alvejamento é(são) acoplado(s) ao referido veículo dito ligando-se por afinidade ou por ligação covalente. Mais preferivelmente, o(s) referido agente(s) de alvejamento é(são) acoplado(s) ao veículo por ligação covalente. Preferivelmente, os referidos agente(s) de alvejamento é/são acoplado(s), preferivelmente covalentemente acoplado(s), ao veículo pelo uso de um grupo funcional presente na superfície externa do veículo. Preferivelmente, o domínio de ligação compreendido no(s) referido(s) agente(s) de alvejamento é acoplado, preferivelmente covalentemente acoplado, ao veículo. Alternativamente, o(s) referido(s) agente(s) de alvejamento é/são acoplado(s), preferivelmente covalentemente acoplado(s), ao veículo por uma porção que não é o domínio de ligação compreendido no agente de alvejamento. Em uma modalidade preferida, o referido processo para unir o(s) referido(s) agente(s) de alvejamento a um veículo compreende (a) reagir um agente de ligação com um veículo, e (b) reagir pelo menos um agente de alvejamento com o referido agente de ligação.

[00067] Um nono aspecto da invenção é um processo para unir um agente de alvejamento de acordo com a invenção a um veículo, compreendendo (a) reagir um agente de ligação com um veículo, e (b) reagir o referido agente de alvejamento com o referido agente de ligação. "Reagindo", quando aqui usado, significa que o agente de ligação é colocado em condições que permitem a ligação do agente de ligação ao veículo e/ou ao agente de alvejamento.

[00068] Um décimo aspecto da invenção é um veículo agroquímico de alvejamento específico, obtido pelo método descrito acima. "Alvejamento específico", quando aqui usado, significa que o veículo pode especificamente ligar-se a um sítio de ligação em uma planta ou preferivelmente em uma parte de planta, por pelo menos um agente de alvejamento de acordo com a invenção que é unido, preferivelmente acoplado, ainda mais preferivelmente covalentemente ligado, ao veículo.

[00069] Um último aspecto da invenção é o uso de qualquer domínio de ligação de acordo com a invenção para isolar sequências de aminoácido que são responsáveis pela ligação específico ao sítio de ligação ou a um antígeno compreendido no referido sítio de ligação e para construir domínios de ligação artificiais com base nas referidas sequências de aminoácido. De fato, nos domínios de ligação de acordo com a invenção, as regiões de estrutura e as regiões de determinação complementares são conhecidas, e o estudo dos derivados do domínio de ligação, ligação ao mesmo sítio de ligação ou antígeno compreendido no referido sítio de ligação, permitirá deduzir os aminoácidos essenciais envolvidos na ligação do antígeno ou sítio de ligação compreendido no referido sítio de ligação. Este conhecimento pode ser usado para construir um domínio de ligação mínimo e criar os derivados do mesmo. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Domínios de ligação (VHH) ligando-se à superfície da folha

[00070] Figura 1A: VHH3E6 5μg/ml em PBS ligando-se à superfície da folha de batata nativa. Detecção com os anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. VHH 3E6 está ligando a superfície de folha, estomas, tricomas glandulares, e pelos da folha.

[00071] Figura 1B: VHH3E6 5μg/ml em PBS ligando-se à superfície da folha de batata nativa. Detecção com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488; o imageamento com um sistema de microscópio confocal Leica SP5. VHH 3E6 está ligando a superfície da folha, estomas, tricomas glandulares, e pelos da folha.

[00072] Figura 1C: VHH5D4 5μg/ml em PBS ligando-se à superfície da folha de batata nativa. Detecção com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. VHH 5D4 está ligando a superfície da folha, estomas, tricomas glandulares, e pelos da folha.

[00073] Figura 1D: CBM3a 5μg/ml em PBS ligando-se ao tecido da planta ferido na extremidade de um disco de folha de batata. Detecção com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. CBM3a não está ligando a superfície de folha, estomas, tricomas glandulares, ou pelos da folha, porém, apenas ligando-se ao tecido de planta ferido na extremidade de um disco de folha de batata que está exposto a partir da preparação da amostra puncionando-se a folha.

[00074] Figura 1E: Sem anticorpo primário (PBS plano) sobre a superfície da folha de batata nativa. Incubação com anticorpos anti- histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488.

[00075] Figura 1F: VHH3E6 5μg/ml em PBS ligando-se à superfície da folha de erva-moura preta nativa. Detecção com anticorpos anti- histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. VHH 3E6 está ligando a superfície da folha, tricomas glandulares, e pelos da folha.

[00076] Figura 1G: VHH3E6 5μg/ml em PBS ligando-se à superfície de folha de grama nativa. Detecção com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. VHH 3E6 está ligando à superfície da folha e tecido de planta ferido na extremidade de um disco de folha de batata que está exposto a partir da preparação da amostra puncionando-se a folha. Figura 2: Ligação de domínios de ligação (VHH) à planta viva intacta

[00077] Figura 2A: VHH3E6 5μg/ml em PBS ligando-se a uma planta viva intacta. Folhas unidas a uma planta de pote de batata foram submersas em uma solução de VHH 3E6. As folhas foram testadas. A detecção com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. VHH 3E6 está ligando a superfície da folha, estomas, tricomas glandulares, e pelos da folha.

[00078] Figura 2B: VHH3E6 5μg/ml em PBS ligando-se a uma planta viva intacta. Folhas unidas a uma planta de pote de batata foram submersas em uma solução de VHH 3E6. As folhas foram testadas. A detecção com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. Extrato da rotulagem da folha inteira. VHH 3E6 está ligando a superfície da folha, estomas, tricomas glandular, e pelos da folha. Figura 3: Acoplamento de domínios de ligação às microcápsulas

[00079] Figura 3A: Microcápsulas com VHH3E6 acoplado através da química de acoplamento de EDC de 1 etapa. As microcápsulas acopladas foram rotuladas com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. Imageamento com um sistema de microscópio confocal Leica SP5. VHH 3E6 é acoplado à superfície da microcápsula através da química de acoplamento de 1 etapa.

[00080] Figura 3B: Microcápsulas com VHH3E6 acoplado através da química de acoplamento de EDC/NHS de 2 etapas. As microcápsulas acopladas foram rotuladas com anticorpos de anti- histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. Imageamento com um sistema de microscópio confocal Leica SP5. VHH 3E6 é acoplado à superfície da microcápsula através da química de acoplamento de EDC/NHS de 2 etapas.

[00081] Figura 3C: Microcápsulas incubadas com VHH3E6 sem acoplamento covalente. VHH passivamente absorvido foi rotulado com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. O imageamento com um sistema de microscópio confocal Leica SP5. Uma fração menor de VHH 3E6 é passivamente absorvida à superfície de microcápsula.

[00082] Figura 3D: Controle condição com microcápsulas não incubadas com VHH, porém, apenas com anticorpos anti-histidina diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488. O imageamento com um sistema de microscópio confocal Leica SP5. Uma fração menor de VHH 3E6 é passivamente absorvida à superfície de microcápsula. Figura 4: Ligação e retenção de microcápsulas à superfície da folha

[00083] O ensaio de ligação de disco de folha em discos de folha de batata nativos com microcápsulas contendo uma molécula traçadora fluorescente. A ligação e retenção de microcápsulas acopladas com VHH de ligação de planta específico, acoplado com VHH de controle não relatado, ou microcápsulas brancas são comparadas. 9 Vezes mais microcápsulas acopladas com VHH específico são ligadas e mantidas em discos de folha de batata em comparação as microcápsulas brancas. Figura 5: Redução de dose usando microcápsulas acopladas com agentes de alvejamento

[00084] O ensaio de ligação de disco de folha em discos de folha de batata nativos com microcápsulas contendo uma molécula traçadora fluorescente. A ligação e retenção de microcápsulas em concentrações diferentes e acopladas com VHH de ligação de planta específico, acoplado com VHH de controle não relatado, ou microcápsulas brancas são comparadas. Até 8 vezes mais microcápsulas acopladas com VHH específico são ligadas e mantidas em discos de folha de batata em comparação às microcápsulas brancas. EXEMPLOS Exemplo 1: geração e seleção de VHH Imunização de lhamas com goma arábica, homogenado de folha de batata, ou homogenado de folha de trigo

[00085] Uma solução de goma arábica foi preparada pesando 5 g de goma arábica de árvore de acácia (Sigma) e dissolvendo em 50 mL de água. Ensaio de proteína de Bradford foi usado para determinar a concentração de proteína total. Alíquotas foram feitas, armazenadas a -80oC, e usadas para imunização. Folhas homogeneizadas de plantas de batata (Solanum tuberosum variedade Désirée) ou trigo planta (Triticum aestivum variedade Boldus) foram preparadas congelando-se as folhas em nitrogênio líquido e homogeneizando-se as referidas folhas com almofariz e pilão até que um pó fino fosse obtido. Ensaio de proteína de Bradford foi usado para determinar a concentração de proteína total. As alíquotas foram feitas, armazenadas a -80oC, e as suspensões foram usadas para imunização.

[00086] As lhamas foram imunizadas em intervalos semanais com 6 injeções intramusculares de goma arábica, folhas de batata homogeneizadas, ou folhas de trigo homogeneizadas, de acordo com os procedimentos padrão. 2 Lhamas, "404334" e "Lahaiana", foram imunizadas com goma arábica. 3 Lhamas, "407928" "Chilean Autumn" e "Niagara", foram imunizadas com folhas de batata homogeneizadas e outras 2 lhamas, "33733" e "Organza", foram imunizadas com folhas de trigo homogeneizadas. Lhamas "404334", "407928" e "33733" foram imunizadas usando Adjuvante LQ (Gerbu), e lhamas "Lahaiana", "Chilean Autumn", "Niagara" e "Organza" foram imunizadas usando o Adjuvante Incompleto de Freund (FIA). As doses para imunização da lhama "404334" foram 350μg durante cada dia 0, 7, 14, 21, 28, 35, e linfócitos de sangue periférico (PBL) foram coletados no 40o dia. As doses para imunizações das lhamas "407928" e "33733" foram 1mg para cada dia dia 0, 7, 14, 21, 28, 36, e PBL foram coletados no dia 40. No momento da coleta de PBL no dia 40, os soros das lhamas "404334", "407928" e "33733" foram coletados. As doses para imunizações das lhamas "Lahaiana", "Chilean Autumn", "Niagara" e "Organza" foram 100μg durante o dia 0, e 50μg para os dias 7, 14, 21, 28, e 35. No dia 0, dia 25, e no momento da coleta de PBL no dia 38, os soros das lhamas "Lahaiana", "Chilean Autumn", "Niagara" e "Organza" foram coletados.

[00087] Construção de biblioteca - De cada lhama imunizada, uma biblioteca de VHH separada foi feita. RNA foi isolado de linfócitos de sangue periférico, seguido por síntese de cDNA usando reversoes de hexâmero aleatório e Superscript III de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Uma primeira PCR foi realizada para amplificar VHH e VH usando uma mistura de reverso dianteiro [relação de 1:1 de call001 (5'-gtcctggctgctcttctacaagg-3') e call001b (5'- cctggctgctcttctacaaggtg-3')] e reverso reverso call002 (5'- ggtacgtgctgttgaactgttcc-3'). Depois do isolamento dos fragmentos de VHH, uma segunda PCR foi realizada usando o reverso dianteiro A6E (5'-gatgtgcagctgcaggagtctggrggagg-3') e reverso 38 (5'- ggactagtgcggccgctggagacggtgacctgggt-3'). Os fragmentos de PCR foram digeridos usando enzimas de restrição PstI e Eco91I (Fermentas), e ligados a montante do gene pIII no vetor pMES4 (GenBank: GQ907248.1). Os produtos de ligação foram precipitados com etanol de acordo com os protocolos padrão, ressuspenso em água, e eletroporados em células TG1. Os tamanhos da biblioteca variaram de clones independentes de 1E+08 a 6E+08. PCR de colônia simples de clones randomizadamente escolhidos das bibliotecas foi realizada para avaliar as porcentagens de inserção das bibliotecas. Todas as bibliotecas tiveram porcentagens de inserção > 90% com exceção da biblioteca de lhama imunizada "Organza" que teve uma porcentagem de inserção de 80%. As bibliotecas foram numeradas 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32 para lhamas "404334", "407928", "33733" "Chilean Autumn" "Lahaiana" "Niagara" e "Organza", respectivamente. O fago de cada uma das bibliotecas foi produzido usando o fago auxiliar VCSM13 de acordo com os procedimentos padrão.

[00088] Seleções de fago em relação à goma arábica, extratos epidérmicos de planta, ou folhas inteiras. Uma solução de goma arábica foi preparada pesando 5 g de goma arábica e dissolvendo em 50 mL de água. As alíquotas foram feitas e armazenadas a -20oC até o uso. Extratos de cutícula de planta de batata e epiderme aderente foram preparados de tiras finas de talos de plantas de batata. Os extratos da cutícula de planta de trigo e epiderme aderente foram preparados de tiras finas de folhas de revestimento de trigo. Extratos enriquecidos em glicanos de parede celular e polissacarídeos não celulósicos foram sequencialmente extraídos usando CDTA e NaOH (Moller e outro, 2007), respectivamente. As tiras foram congeladas em nitrogênio líquido e moídas com almofariz e pilão até que os pós finos fossem obtidos. Os extratos enriquecidos com glicanos de parede celular foram preparados ressuspendendo-se os pós finos em CDTA a 50mM pH 6,5 usando 10ml por grama de material moído e rotação head-over-head a 4oC durante 30 min. Extrato e material insolúvel foram separados usando uma seringa adaptada com um filtro. Os extratos também foram purificados por centrifugação em uma microcentrífuga em 20.000 g durante 5 min. Extratos enriquecidos com polissacarídeo não celulósicos foram preparados do material insolúvel após extração de CDTA em NaOH a 4M e NaBH4 a 1% usando 10mL por grama de material insolúvel e rotação head-over-head a 4oC durante 30 min. O extrato e material insolúvel foram separados usando uma seringa adaptada com um filtro. Os extratos também foram purificados por centrifugação em uma microcentrífuga em 20.000 g durante 5 min. As seleções de primeiro ciclo em relação à goma arábica foram realizadas em cavidades de uma placa de 96 cavidades (Maxisorp, Nunc) revestidas com 1mg/ml ou 10μg/ml de goma arábica em tampão de carbonato a 0,1M pH 8,3. Os revestimentos foram realizados durante a noite a 4 oC. As cavidades foram lavadas 3 vezes com PBS/0,05%-Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS (5% de MPBS). O fago foi suspenso em 2,5% de MPBS e aproximadamente 2E+11 cfu foram usadas para cada cavidade. Após a ligação às cavidades em temperatura ambiente durante 2 horas, fago não ligado foi removido por lavagem extensa com PBS/0,05%- Tween-20 e PBS. O fago ligado foi eluído em temperatura ambiente com 0,1 mg/ml de tripsina (Sigma) em PBS durante 30 min. O fago eluído foi transferido para uma placa de 96 cavidades de polipropileno chapeie (Nunc) contendo inibidor de tripsina AEBSF em excesso (Sigma). Os títulos de fago de cavidades revestidas com alvo foram comparados aos títulos de fago de cavidades em branco para avaliar os enriquecimentos. O fago foi amplificado usando células TG1 frescas de acordo com os procedimentos padrão.

[00089] O segundo ciclo de seleção foi realizado semelhantemente ao primeiro ciclo de seleção exceto que para bibliotecas, 25 e 30 cavidades foram revestidas com 10μg/ml e 0,1μg/ml de goma arábica em vez de 1mg/ml e 10μg/ml. Nenhum enriquecimento significante foi obtido para as bibliotecas 27, 28, 29, 31, e 32 no ciclo de seleção 1. No ciclo de seleção 2, os enriquecimentos foram >1000 vezes para bibliotecas 28, 31, e 32, e 25 vezes e 250 vezes para bibliotecas 27 e 29, respectivamente. O enriquecimentos para bibliotecas 25 e 30 foram 50 vezes e >1000 vezes no ciclo de seleção 1, respectivamente. No ciclo de seleção 2, os enriquecimentos foram 1000 vezes para ambas as bibliotecas. As seleções em comparação ao extrato de CDTA epidérmico de batata foram realizadas semelhantemente às seleções em comparação à goma arábica, porém, as cavidades foram revestidas com extrato de CDTA epidérmico de batata diluídos 10 vezes e 1000 vezes igualmente para o primeiro e segundo ciclos de seleção. Os enriquecimentos no ciclo de seleção 1 foram 10, 1E+03, 20, 20, >1E+04, 15, e 5 vezes para bibliotecas 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, respectivamente e >100 vezes para todas as bibliotecas em seleção círculo 2. As seleções em comparação ao extrato de CDTA epidérmico de trigo foram realizadas semelhantemente às seleções em comparação ao extrato de CDTA epidérmico de batata, porém, as cavidades foram revrestidas com extrato de CDTA epidérmico de trigo diluído 20 vezes e 2000 vezes igualmente para o primeiro e segundo ciclos de seleção. Os enriquecimentos no ciclo de seleção 1 foram >10, >100, >10, 1, >1E+03, 10, e 5 vezes para bibliotecas 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, respectivamente. Os enriquecimentos no ciclo de seleção 2 foram >10 vezes para biblioteca 29 e >100 vezes para bibliotecas 25, 27, 28, 30, 31, e 32. As seleções em comparação às folhas de batata foram realizadas em dois ciclos de seleção consecutivos usando partículas de folha no ciclo 1 e folhas inteiras no ciclo 2. Bibliotecas 27, 28, 29, 30, 31, e 32 foram usadas para seleções em comparação às folhas. As partículas de folha para seleções de primeiro ciclo foram preparadas misturando-se as folhas de batata em PBS usando um homogeneizador Uktra-Turrax T25. As partículas de folha foram coletadas da suspensão por centrifugação. O sobrenadante, chamado aqui de "fração solúvel de folha homogeneizada", é pretensiosamente enriquecido em componentes intracelulares e foi usado na solução durante a seleção de fago para competir os aglutinantes aos epítopos intracelulares. O fago de biblioteca foi pré-incubado com a fração solúvel de folha homogeneizada em 2% de MPBS usando a rotação head-over-head em temperatura ambiente durante 30 min. As misturas foram adicionadas às partículas de folha e incubadas com a rotação head-over-head em temperatura ambiente durante 2 horas. As partículas de folha com fago ligado foram coletados por centrifugação e os sobrenadantes foram descartados. As partículas de folha com fago ligado foram lavadas extensivamente por lavagens sucessivas com PBS. As lavagens foram realizadas re- suspendendo-se as partículas de folha em PBS, girando as partículas de folha, e descartando-se os sobrenadantes. A eluição de fago e infecção de TG1 foram realizadas como anteriormente. Para o segundo ciclo de seleção, as folhas intactas inteiras foram usadas. As folhas foram incubadas flutuando de cabeça para baixo sobre as soluções de fago em 2% de MPBS e o fago foi permitido ligar-se em temperatura ambiente durante 2 horas. As folhas foram lavadas extensivamente transferindo-se as folhas para tubos frescos com PBS. A eluição do fago ligado foi realizada com TEA a 100mM em água, e as soluções com fago eluído foram neutralizadas usando a metade do volume de fago eluído de Tris a 1M pH7,5. A infecção de TG1 foi realizada como anteriormente.

[00090] Escolha de colônias simples de produções de seleção - Clones individuais foram escolhidos das seleções de primeiro e segundo ciclo junto à goma arábica com bibliotecas 25 e 30. Das seleções junto à goma arábica com bibliotecas 27, 28, 29, 31, e 32, os clones foram escolhidos depois das seleções de sgundo ciclo, porém, nenhuma seleção de primeiro ciclo. Um total de 208 clones foi escolhido das seleções de goma arábica. Das seleções junto ao extrato de CDTA epidérmico de batata, um total de 321 clones foi escolhido primeiro depois das ambas seleções de primeiro e segundo ciclo de todas as bibliotecas. Das seleções junto ao extrato de CDTA epidérmico de trigo, um total de 162 clones foi escolhido depois das seleções de segundo ciclo de todas as bibliotecas. Das seleções da folha de batata, um total de 184 clones foi escolhido depois das seleções de segundo ciclo das bibliotecas 27, 28, 29, 30, 31 e 32. Células TG1 frescas foram infectadas com fago eluído serialmente diluído e semeadas em ágar LB; 2% de glicose; 100μg/ml de ampicilina. Colônias simples foram escolhidas em placas de 96 cavidades contendo 100μl por cavidade 2xTY; 10% de glicerol; 2% de glicose; 100μg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas a 37oC e armazenadas a -80oC como placas mestre. Exemplo 2: caracterização do VHH

[00091] ELISA de ligação de ponto simples - Um ELISA de ligação de ponto simples foi usado para identificar os clones que ligam-se aos extratos de goma arábica ou de planta. Os extratos contendo VHH para ELISA foram preparados como segue. Placas de 96 cavidades com 100μl por cavidade 2xTY, 2% de glicose 100μg/ml de ampicilina foram inoculadas a partir das placas mestre e crescidas a 37oC durante a noite. 25μl por cavidade de cultura durante a noite foram usadas para inocular placas de cavidade profunda de 96 cavidades frescas contendo 1ml por cavidade 2xTY; 0,1% de glicose; 100μg/ml de ampicilina. Depois de crescer a 37oC em uma incubadora de agitação durante 3 horas, IPTG foi adicionado a 1mM de concentração final e VHH recombinante foi produzido durante uma incubação adicional durante 4 horas. As células foram centrifugadas por centrifugação em 3.000 g durante 20 min. e armazenadas durante a noite a -20oC. As péletes de célula foram descongeladas, brevemente vortexadas, e 125μl por cavidade de PBS em temperatura ambiente foram adicionados. As células foram ressuspensas em uma plataforma agitadora de ELISA em temperatura ambiente durante 15 min. As placas foram centrifugadas em 3.000 g durante 20 min e 100μl por cavidade de extrato contendo VHH foram transferidos para placas de 96 cavidades de polipropileno (Nunc) e armazenadas a -20oC até outro uso.

[00092] A ligação de clones de seleções de goma arábica foi analisada em placas de ELISA revestidas com 100μl/cavidade de goma arábica em 1mg/ml em tampão de carbonato pH 8,3. A ligação de clones de seleções de extrato de CDTA epidérmico de batata foi analisada igualmente em extrato de CDTA epidérmico de batata e extrato de CDTA epidérmico de trigo usando placas de ELISA revestidas com com 100μl por cavidade de extratos de CDTA epidérmico de batata diluídos 30 vezes e de trigo diluídos 30 vezes em carbonato a 0,1M pH 8.3. A ligação dos clones de seleções de extrato de CDTA epidérmico de trigo foi analisada usando placas de ELISA revestidas com 100μl por cavidade de extrato de CDTA epidérmico de trigo diluídos 20 vezes em carbonato a 0,1M pH 8,3. Depois do revestimento a 4oC durante a noite e o revestimento prosseguido em temperatura ambiente durante 1 hora no próximo dia, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,05% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS durante 1,5 hora. As placas foram esvaziados e preenchidas com 90μl por cavidade 1% de MPBS. 10μl de extrato contendo VHH de cada clone foram adicionados a uma(s) cavidade(s) revestidas com antígeno e uma cavidade branca. VHH foi permitida ligar em temperatura ambiente durante 1 hora e VHH não ligado foi removido lavando-se três vezes com PBS/0,05% de Tween- 20. VHH ligado foi detectado com incubações sequenciais com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais (Abd Serotec) em 1% de MPBS/0,05% de Tween-20 e anticorpos de molécula inteira de IgG anticamundongo de coelho conjugados com fosfatase alcalina (RaM/AP) (Sigma) em 1% de MPBS/0,05% de Tween-20. Anticorpos não ligados foram removidos lavando-se três vezes com PBS/0,05% de Tween-20. As placas foram lavadas mais uma duas vezes com PBS e 100μl de substrato de hexaidrato dissódico de pNPP (Sigma) foram adicionados a cada cavidade.

[00093] A absorvência em 405nm foi medida e a relação de VHH ligado a uma(s) cavidade revestida com alvo e uma cavidade revestida sem alvo foi calculada para cada clone. 23% dos clones tiveram uma relação maior que 2 e estes clones foram escolhidos primeiramente para caracterização mais detalhada. Um segundo grupo de clones com uma relação entre 1,15 e 2, e compreendendo 10% de todos os clones, foi revisitado depois. Os clones com uma relação menor que 1,15 também não foram analisados.

[00094] Para clones de seleções de folha inteira, um ELISA adaptado foi desenvolvido. Discos de folha flutuantes de cabeça para baixo foram usados em vez de revestir as cavidades com antígeno. As incubações foram similares aos extratos ELISA. Depois da incubação com o substrato, os discos de folha foram removidos das cavidades usando um fórceps e a absorvência em 405nm foi medida. Os sinais obtidos para cada clone foram comparados para sinais obtidos de cavidades com discos de folha sem incubação de anticorpo primária e as relações foram calculadas. Um anticorpo de ligação de superfície de folha foi encontrado e caracterizado das seleções de extrato epidérmico usadas como anticorpo de controle positivo. VHH com uma relação maior que 1,5 foi analisado também por sequenciamento.

[00095] Sequenciamento e PCR de colônia simples - O sequenciamento e PCR de colonia simples foram realizados em controles positivos de ELISA como segue. As culturas das cavidades de placa mestre com clones positivos de ELISA foram diluídos 10 vezes em água estéril. 5μl destes clones diluídos foram usados como modelo para PCR usando o iniciador dianteiro MP57 (5'- ttatgcttccggctcgtatg-3') e iniciador reverso GIII (5'- ccacagacagccctcatag-3'). Produtos de PCR foram sequenciados por sequenciamento de Sanger usando MP57 reverso (VIB Genetic Service Facility, University of Antwerp, Belgium).

[00096] Produção e purificação de anticorpo - Fragmentos de anticorpo de VHH foram produzidos na cepa do supressor de E.coli TG1 ou cepa de não supressor WK6 (Fritz e outro, NucleicAcidsResearch, Volume 16 Número 14 1988) de acordo com os procedimentos padrão. Brevemente, as linhas de colônia foram feitas e culturas da noite de colônias simples inoculadas em 2xTY; 2% de glicose; 100μg/ml de ampicilina. As culturas da noite foram usadas para inocular as culturas frescas 1:100 em 2xTY; 0,1% de glicose; 100μg/ml de ampicilina. Depois de crescer a 37oC em uma incubadora de agitação durante 3 horas, IPTG foi adicionado a uma concentração final de 1mM e fragmentos de anticorpo de VHH recombinantes foram produzidos durante uma incubação adicional por 4 horas. As células foram centrifugadas e ressuspensas em 1/50a do volume de cultura original de tampão de extração periplásmica (fosfato a 50mM pH 7; NaCl a 1M; EDTA a 1mM) e incubadas durante a noite com rotação head-over-head a 4oC. Spheroplasts foram centrifugados por centrifugação em 3.000 g e 4oC durante 20 min. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos e centrifugados novamente em 3.000 g e 4oC durante 20 min. Os fragmentos de anticorpo de VHH alvejados por hexaistidina foram purificados do extrato periplásmico usando 1/15a do volume de extrato da resina de afinidade de metal TALON (Clontech), de acordo com as instruções do fabricante. Fragmentos de anticorpo de VHH purificado foram concentrados e dialisados para PBS usando dispositivos de MWCO de 5kDa Vivaspin (Sartorius Stedim), de acordo com as instruções do fabricante.

[00097] Ligação de VHH à goma arábica em ELISA - A titulação dos fragmentos de anticorpo de VHH foi realizada em placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) revestidas com 100μl por cavidade 100μg/ml de goma arábica em carbonato a 50mM pH 9,6. As placas foram revestidas a 4oC durante a noite e o revestimento foi prosseguido em temperatura ambiente durante 1 hora no próximo dia. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,05% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS durante 1 hora. Diluições seriais em 4 vezes de fragmentos de anticorpo de VHH purificados foram preparados em 1% de MPBS/0,05% de Tween-20 em placas de 96 cavidades de polipropileno. As concentrações de anticorpo variaram de 3μg/ml para 12ng/ml. As diluições de anticorpo foram transferidas para as placas revestidas com goma arábica e fragmentos de anticorpo de VHH foram permitidos ligarem-se durante 1 hora em temperatura ambiente. VHH ligado foi detectado com incubações sequenciais com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais (Abd Serotec) e anticorpos de molécula inteira de IgG anticamundongo de coelho conjugados com fosfatase alcalina (RaM/AP) (Sigma) em 1% de MPBS/0,05% de Tween-20. Anticorpos não ligados foram removidos lavando-se três vezes com PBS/0,05% de Tween-20 depois de cada incubação de anticorpo. As placas foram lavadas mais umas duas vezes com PBS e 100μl de substrato de hexaidrato dissódico de pNPP (Sigma) foram adicionados a cada cavidade. A absorvência em 405nm foi medida e plotada como função da concentração de anticorpo (veja tabela 1). Tabela 1:

Ligação de VH H à lectina de batata em ELISA

[00098] Placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) revestidas com 100μl por cavidade 100μg/ml de lectina de batata (Sigma) em PBS foram revestidas durante a noite a 4oC e o revestimento foi prosseguido em temperatura ambiente durante 1 hora no próximo dia. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,05% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS durante 1 hora. VHH (3μg/ml) foi transferido para as placas revestidas com lectina de batata e fragmentos de anticorpo de VHH foram permitidos ligarem-se durante 1 hora em temperatura ambiente. VHH ligado foi detectado com incubações sequenciais com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais (Abd Serotec) e anticorpos de molécula inteira de IgG anticamundongo de coelho conjugados com fosfatase alcalina (RaM/AP) (Sigma) em 1% de MPBS/0,05% de Tween-20. Anticorpos não ligados foram removidos lavando-se três vezes com PBS/0,05% de Tween-20 depois de cada incubação de anticorpo. As placas foram lavadas mais umas duas vezes com PBS e 100μl de substrato de hexaidrato dissódico de pNPP (Sigma) foram adicionados a cada cavidade e a absorvência em 405nm foi medida (veja tabela 2). Tabela 2:

Exemplo 3: ligação de domínios de ligação em superfície de planta

[00099] Ligação de VHH aos discos de folha - A ligação de VHH aos discos de folha não fixos de batata (variedade Désirée), erva- moura preta, grama, trigo ou azaléia foi investigada. Para comparação, a ligação de CBM3a aos discos de folha não fixos de batata (variedade Désirée) foi analisada em paralelo. Discos de folha foram preparadas puncionando-se uma folha de batata fresca com uma ferramenta perfuradora de orifício de esteira de 5mm. Os discos de folha foram postos imediatamente em cavidades de uma placa de 96 cavidades contendo 200μl por cavidade 5% de MPBS ou PBS, e incubados durante 30 min. Os discos de folha foram transferidos em soluções contendo 5μg/ml de fragmento de anticorpo de VHH, respectivamente 5μg/ml de CBM3a em 2% de MPBS ou PBS e incubados durante 6090 min. Proteínas de CBM3a ou de VHH não ligado foram removidas lavando-se três vezes com 2% de MPBS ou PBS. Proteínas de CBM3a ou de VHH não ligado foram detectadas com com incubação com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488 (Abd Serotec) em 1% de MPBS durante 1 hora. Anticorpos não ligados foram removidos lavando-se três vezes com PBS. Os discos de folha foram postos em lâminas de vidro, cobertas com coberturas, e analisados por microscopia ou em um sistema de microscópio macrozoom (Nikon) ou um sistema de microscópio confocal SP5 (Leica). Por meio de um exemplo não limitante, os fragmentos de anticorpo de VHH (por exemplo, 3E6, 5D4) foram constatados estar claramente ligando-se aos tricomas, estomas e cutícula na superfície da folha das folhas de batata (Figura 1A-C). Em contraste claro, para CBM3a nenhuma ligação na superfície de folhas de batata foi detectada e apenas a ligação fraca ao tecido ferido na extremidade do corte do disco de folha de batata foi observada (Figura 1D). Algum VHH desta invenção (por exemplo, 3E6) foi também mostrado ligar-se especificamente à superfície das folhas de erva-moura preta ou folhas de gramas ou como mostrado na Figura 1F e 1G, respectivamente. Nenhuma ligação significante foi observada à superfície de folha de trigo ou azaléia.

[000100] Ligação de VHH às plantas vivas intactas - A ligação de VHH às plantas vivas intactas foi investigada em plantas de pote de batata (variedade Desirée). As folhas de composto de plantas vivas intactas foram submersas em soluções de VHH rotuladas com hexaistidina em PBS, ou PBS apenas para condições de controle, deixando as folhas de composto ligadas às plantas. VHH foi permitido ligar-se durante 1 hora. Em seguida, as folhas de composto ainda ligadas às plantas foram lavadas cinco vezes em PBS em frascos Erlenmeyer. Folhas diferentes e seções de pecíolo foram testadas. VHH ligado foi detectado por incubação com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais conjugados diretamente com tintura fluorescente Alexa-488 (Abd Serotec) em PBS durante 1 hora. Anticorpos anti-histidina não ligados foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS. Folhas inteiras, discos de folha ou seções de pecíolo foram analisados quanto ao VHH ligado com microscopia. VHH mostrou ligar as estruturas de folha tais como tricomas e estomas, superfície de folha, e seções de pecíolo como mostrado na Figura 2. Nenhuma ligação foi observada com VHH de controle não relacionado, provando que o VHH desta invenção é capaz de especificamente ligar- se às plantas vivas intactas.

[000101] Ligação de VHH em água - A ligação de VHH às superfícies da folha em água foi investigada nos discos de folha cortados de folhas de plantas de batata (variedade Desirée). Os discos de folha foram lavados três vezes em água ultrapura. VHH rotulado por hexaistidina foi diluído em água ultrapura, adicionado aos discos de folha, e permitido ligar-se durante 1 hora. Embora as soluções de matéria-prima de VHH estivessem em PBS, as diluições usadas aqui (200 vezes para 5 μg/ml, ou 2000 vezes para 500 ng/ml) resultam na diluição significante de PBS das matérias-primas e podem ser consideradas suficientemente diluídas para representar a ligação em água. Depois de permitir VHH ligar-se durante 1 hora, os discos de folha foram lavados cinco vezes com água ultrapura. VHH ligado foi detectado pór incubação com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa- 488 (Abd Serotec) em PBS durante 1 hora. Anticorpos anti-histidina não ligados foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS. Os discos de folha foram analisados quanto ao VHH ligado com microscopia. A ligação de VHH em PBS foi analisada como descrito anteriormente como uma condição de controle. A detecção de VHH ligado com anticorpos anti-histidina conjugados com tintura fluorescente Alexa-488, lavagem de anticorpos anti-histidina não ligados, e análise de VHH ligado com microscopia foram realizadas em relação à experiência de ligação de VHH em água. VHH mostrou ligar- se em água às estruturas da folha tais como tricomas e estomas, e superfície de folha. Nenhuma ligação foi observada com VHH de controle não relacionado. A ligação observada em água foi similar como visto para a experiência paralela realizada em PBS. O VHH desta invenção é capaz de ligar as estruturas de folha e superfície de folha em água.

[000102] Cinéticas de ligação de VHH - Para outra aplicabilidade de teste de VHH como aglutinantes para estufa ou aplicações de campo onde a ligação supostamente precisa ser alcançada rapidamente depois da aplicação, uma experiência de ligação de VHH de imersão de folha foi empregada para testar os tempos de incubação mínima de VHH para alcançar a ligação detectável. Discos de folha de batata de 0 8 mm (variedade Desirée) foram cortados usando uma ferramenta perfuradora e lavadas 3 vezes em PBS. Pré-diluições de 5 μg/ml de VHH rotulado com hexaistidina foram preparadas em PBS e incubadas durante tempos diferentes com os discos de folha. Os tempos para incubação foram 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos, 20 minutos, ou 1 hora. VHH não ligado foi removido lavando-se cinco vezes com PBS. VHH ligado foi detectado por incubação com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488 (Abd Serotec) em PBS durante 1 hora. Anticorpos anti-histidina não ligados foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS. Os discos de folha foram analisados quanto ao VHH ligado com microscopia. A ligação específica foi observada para cada amostra com VHH específico de 10 segundos de tempo de incubação para tempo de incubação de VHH de 1 hora. Nenhuma ligação foi observada com VHH de controle não relacionado. O VHH desta invenção mostra a ligação detectável às estruturas de folha, tais como tricomas e estomas e superfície de folha dentro de 10 segundos depois da aplicação.

[000103] Ligação de VHH em pH diferente - Para testar a aplicabilidade de VHH como aglutinantes para aplicações em estufa ou em campo onde a ligação supostamente pode ocorrer em valores de pH, divergindo-se fortemente das condições fisiológicas em que os anticorpos naturalmente ligam seus alvos, uma experiência de ligação de VHH de imersão de folha foi realizada em uma série de soluções com pH diferente. As seguintes soluções foram preparadas: glicina a 50 mM pH 2,0, acetato de sódio a 50 mM pH 4,0, carbonato de sódio a 50 mm pH 9,6, e hidróxido de sódio a 10 mM pH 11,0. Discos de folha de batata de 0 8 mm (variedade Desirée) foram cortados usando uma ferramenta perfuradora. Os discos de folha foram equilibrados primeiro em pH diferente lavando-se três vezes com soluções em pH diferente. VHH alvejado por hexaistidina foram diluídos em 5 μg/ml em soluções com pH diferente, adicionadas aos discos de folha equilibrados correspondentes, e a ligação de VHH foi permitida durante 1 hora. Os discos de folha foram lavados três vezes com soluções em pH diferente correspondente depois da incubação com VHH. Depois disso, todos foram lavados 2 vezes com PBS para equilibrar os discos de folha em PBS. VHH ligado foi detectado por incubação com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488 (Abd Serotec) em PBS durante 1 hora. Anticorpos anti-histidina não ligados foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS. Os discos de folha foram analisados quanto ao VHH ligado com microscopia. Algum VHH desta invenção (por exemplo, VHH 3E6) mostrou ligação detectável aos discos de folha sobre a faixa completa testada do pH 2 ao pH 11.

[000104] Ligação de VHH em temperaturas diferentes - Para testar a aplicabilidade de VHH como aglutinantes para aplicações em estufa ou em campo onde a ligação supostamente pode ocorrer em temperaturas diferente e às vezes até mesmo extremas, uma experiência de ligação de VHH de imersão de folha em temperaturas diferentes foi usada. Temperaturas usadas foram 4oC, temperatura ambiente, 37oC, 55oC, ou 70oC. Discos de folha de batata de 0 8 mm (variedade Desirée) foram cortados usando uma ferramenta perfuradora. Os discos de folha foram equilibrados em temperaturas diferentes lavando-se três vezes com PBS em temperaturas diferentes. VHH rotulado por hexahistidina foi diluído em 5 μg/ml em PBS em temperaturas diferentes, adicionado aos discos de folha equilibrados correspondentes, e a ligação de VHH foi permitida durante 1 hora em temperaturas diferentes. Discos de folha foram lavados cinco vezes com PBS em temperatura ambiente depois da incubação com VHH. VHH ligado foi detectado diretamente por incubação com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais diretamente conjugados com tintura fluorescente Alexa-488 (Abd Serotec) em PBS durante 1 hora em temperatura ambiente. Anticorpos anti-histidina não ligados foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS em temperatura ambiente. Os discos de folha foram analisados quanto ao VHH ligado com microscopia. Algum VHH desta invenção (por exemplo VHH 3E6) mostrou ligação detectável aos discos de folha sobre uma faixa de temperatura de 4°C a 55°C. Por favor note aqueles os discos de folha severamente sofrem quando submersos em PBS a 70oC durante 1 hora, porém, aquela ligação de VHH foi também detectada. Exemplo 4: Acoplamento de agentes de alvejamento às micropartículas

[000105] Construção, produção e purificação de VHH bivalente - Construções de VHH bivalente foram produzidas em bactérias clonando-se duas sequências de VHH em tandem no vetor pASF22, criando uma fusão de dois VHH com um ligador de glicina-serina 9 (GGGGSGGGS) entre o dois VHH. pASF22 é um derivado de pMES produzido no local. Os rótulos que foram usados foram c-Myc C- terminal (EQKLISEEDLN) e hexaistidina (HHHHHH). Um ligador de alanina triplo (AAA) foi colocado entre a extremidade C-terminal do VHH e o rotulo c-Myc e um ligador de glicina-alanina-alanina (GAA) foi usado entre a extremidade C-terminal do rotulo c-Myc e o rótulo de hexahistidina. A sequência completa C-terminal do VHH bivalente que foi usada: AAA-EQKLISEEDLN-GAA-HHHHHH. Culturas da noite frescas foram produzidas a partir de linhas de colônia e inoculação de meios 2xTY suplementados com 2% de glicose e 100 μg/ml de ampicilina. As culturas da noite foram usadas para inocular as culturas frescas 1:100 em meios 2xTY com 0,1% de glicose e 100 μg/ml de ampicilina. Depois do crescimento a 37oC em uma incubadora de agitação durante 3 horas, IPTG foi adicionado a uma concentração final de 1 mM e VHH bivalente recombinante foi produzido durante uma incubação adicional por 4 horas. As células foram centrifugadas e ressuspensas em 1/50o do volume de cultura original de PBS e incubadas com rotação head-over-head a 4oC durante 30 minutos. Spheroplasts foram centrifugados por centrifugação em 3.000 g e 4oC durante 20 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubos frescos e centrifugados novamente a 3.000 g e 4oC durante 20 minutos. O sobrenadante foi coletado e a concentração de cloreto de sódio foi ajustada em 500 mM e concentração de imidazol em 20 mm. VHH bivalente rotulado por hexaistidina foi purificado dos extratos usando coluna IMAC de 5 mL HisTrap FF Crude (GE Lifesciences) e coluna de filtração de gel de grau de prep. HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Lifesciences) em um sistema AKTAxpress (GE Lifesciences) seguindo os procedimentos padrão.

[000106] Acoplamento de VHH às micropartículas - Foi examinado primeiro se VHH que e covalentemente ligado às micropartículas pode ligar seu alvo e fornecer força de adesão suficiente a uma superfície contendo antígeno para alvejamento da micropartícula. Micropartículas foram acopladas com fragmentos de anticorpo de VHH específico de goma arábica e a ligação às placas de ELISA revestidas com goma arábica foi investigada.

[000107] Tipos diferentes de micropartículas foram preparados. Os fragmentos de anticorpo de VHH purificados foram (i) acoplados ao ácido carboxílico Dynabeads M-270 paramagnéticas de 0 2,8μm (Dynal, Invitrogen), usando uma química de acoplamento de 2 etapas de ativação de EDC das contas e acoplamento subsequente de fragmentos de anticorpo de VHH, e (ii) acoplados usando uma química de acoplamento de 1 etapa para microsferas fluorescentes FluoSpheres de 0 2μm (Molecular Probes, Invitrogen), ambos de acordo com as instruções dos fabricantes.

[000108] Brevemente, para acoplamento ao ácido carboxílico Dynabeads M-270: VHH foi dialisado para o tampão MES a 50mM pH 5,0 usando dispositivos de filtro de cetrifugação de 5kDa Vivaspin (Sartorius Stedim). As contas foram preparadas por 2 lavagens sequenciais com NaOH a 10mM, e 3 lavagens com água, e ativadas com EDC a 0,1M (Pierce) em temperatura ambiente durante 30 min. As contas ativadas por EDC foram lavadas por lavagens sequenciais rápidas com água fria e tampão de MES a 50mM frio pH 5,0. As contas foram distribuídas com a última lavagem. 60μg de fragmento de anticorpo de VHH em 100μl de MES a 50mM pH 5,0 foram adicionados a 3mg de contas e incubados em temperatura ambiente durante 30 min. O sobrenadante após o acoplamento foi coletado. Medindo-se a proteína A280 da fração não ligada, as quantidades de VHH acoplado e não acoplado foram calculadas. Mais que 95% de fragmento de anticorpo de VHH foram acoplados às contas. As contas foram bloqueadas com Tris a 50mM pH7,4 e lavadas três vezes com PBS/0,1%-Tween-20 e armazenadas a 4oC. Brevemente, para acoplamento às microsferas fluorescentes FluoSpheres: VHH foi dialisado em tampão MES a 50mM pH 6,0 usando dispositivos de filtro de centrifugação de 5kDa Vivaspin (Sartorius Stedim). 0,8μm de dispositivos de filtro de PES (Sartorius Stedim) foi usado ao longo do procedimento para isolar as contas da solução. As contas foram preparadas lavando-se com água ultrapura e ressuspensão em água ultrapura. 100μl de fragmentos de anticorpo de VHHm contendo 200μg de VHH foram adicionados em 100μl de contas. 0,8mg de EDC (Pierce) foi adicionado a cada mistura de contas com VHH e o pH foi ajustado a 6,5 com NaOH a 0,1M. O acoplamento foi realizado em temperatura ambiente durante 2 horas. Glicina foi adicionada a uma concentração final de 100mM e incubada em temperatura ambiente durante 30 min. para extinguir a reação. Medindo-se a proteína A280 da fração não ligada, as quantidades de VHH acoplado e não acoplado foram calculadas. Entre 14% e 33% de fragmentos de anticorpo de VHH diferentes foram acoplados às contas. As contas foram lavadas duas vezes com fosfato a 50 mM pH 7,4; NaCl a 0,9% (PBS a 50 mM) e armazenadas em 1% de BSA, azida de sódio a 2 mM em PBS a 50mM.

[000109] Acoplamento de agentes de alvejamento às microcápsulas contendo traçador fluorescente ou ingrediente ativo - Microcápsulas de poliureia foram produzidas por polimerização interfacial. Com o objetivo de gerar microcápsulas de poliureia funcionalizada, VHH foi acoplado às microcápsulas contendo o inseticida lambda cialotrina ou a molécula de traçador fluorescente Uvitex OB e uma casca com lisina incorporado aos resíduos de ácido carboxílico expostos à superfície. Lambda cialotrina foi dissolvida em benzoato de benzila em concentrações entre 30% e 66% antes da encapsulação. Alternativamente, um núcleo de 1,5% de Uvitex em benzoato de benzila foi usado para a fácil visualização fluorescente das microcápsulas. Diisocianato de tolueno (TDI) e isocianato de polimetilenopolifenileno (PMPPI) foram dissolvidos na fase oleosa em relações diferentes e concentrações na fase oleosa para produzir as características de casca desejadas. A velocidade de agitação para a emulsão foi variada para controlar o tamanho da gotícula e, por conseguinte, o diâmetro da microcápsula. As microcápsulas com diâmetros aproximados de 5 μm, 10 μm, ou 50 μm foram produzidos bem sucedidamente. Lisina bifuncional e dietileno triamina trifuncional (DETA) foram usadas em relações diferentes e/ou adicionadas consecutivamente durante a encapsulação para por um lado maximizar as quantidades de ácidos carboxílicos na superfície das microcápsulas e para por um lado obter força suficiente das cascas da cápsula. As microcápsulas foram lavadas com água depois da produção e armazenadas como suspensões de microcápsula em água. As microcápsulas foram lavadas com MÊS a 100 mM, NaCl a 500 mM, pH 6,0 imediatamente antes do acoplamento de VHH usando um frasco de filtro impermeável ao vácuo e funil de filtro P 1.6 (Duran). Alternativamente, os porta-filtros de vidro com filtros de membrana descartáveis de 0,45 μm (Millipore) ou placas de filtração de cavidade profunda de 96 cavidades de 0,45 μm (Millipore) foram usados. Os acoplamentos de VHH às microcápsulas foram realizadas usando os acoplamentos mediados por carbodiimida usando um procedimento de 1 etapa, um procedimento de 2 etapas sem N-hidroxissucinimida (NHS), ou um procedimento de 2 etapas com NHS. A diferença principal entre os procedimentos de acoplamento de 1 etapa e acoplamento de 2 etapas é a ocorrência da reticulação de VHH nos procedimentos de acoplamento de 1 etapa. Os protocolos para os três procedimentos são largamente similares e diferem-se como segue. Para os acoplamentos de 1 etapa, VHH foi adicionado às microcápsulas lavadas e Cloridrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) (Pierce) foi adicionado e a reação de acoplamento foi permitida durante 2 horas em temperatura ambiente. Para acoplamentos de 2 etapas, microcápsulas lavadas foram ativadas primeiro com EDC na presença ou ausência de NHS. EDC não reagido em excesso (e NHS) foi removido por lavagens sequenciais rápidas com tampões frios e VHH foi adicionado e permitido reagir com ácidos carboxílicos ativados em cascas de microcápsula. Para microcápsulas de 0 10 μm, 2-20 μg de VHH foram acoplados por mg de microcápsulas. Para microcápsulas com outros diâmetros, as quantidades foram consequentemente graduadas. Depois do acoplamento de VHH, as microcápsulas foram lavadas com PBS e armazenadas em PBS. O sucesso do acoplamento de VHH foi investigado usando uma combinação da análise da eficiência do acoplamento por SDS-PAGE e análise de VHH rotulado por hexaistidina ligada por microscopia ou um sistema de microscópio confocal SP5 (Leica) usando anticorpos anti-histidina conjugados diretamente com tintura fluorescente Alexa-488. Com a análise de SDS-PAGE, a formação de multímeros foi observada para reações de acoplamento de 1 etapa como esperado. Microcápsulas acopladas ao VHH foram rotuladas com anticorpos anti-histidina durante 1 hora em temperatura ambiente. Anticorpos anti-histidina não ligados foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS usando placas de filtração de cavidade profunda de 96 cavidades de 0,45 μm (Millipore). As microcápsulas com VHH acoplado, microcápsulas incubadas com VHH em que nenhum EDC foi adicionado, e as microcápsulas brancas foram comparadas. A rotulagem anti-histidina de microcápsulas foi mais intensa para as microcápsulas em que VHH foi acoplado usando o procedimento de acoplamento de 1 etapa ou 2 etapas como mostrado na Figura 3. Foi observado da mesma forma que algum VHH foi passivamente absorvido às microcápsulas. VHH foi cavidade sucedidamente acoplado às microcápsulas de tamanho diferente usando os procedimentos de acoplamento de 1 etapa ou 2 etapas. Exemplo 5: Ligação de micro-partículas acopladas ao agente de alvejamento em superfície contendo antígeno

[000110] Ensaios de ligação com contas acopladas com VHH ou microcápsulas - A funcionalidade das micropartículas acopladas ao VHH foi investigada em placas de ELISA que foram revestidas com 100μg/ml de goma arábica em carbonato a 50 mM pH 9,6 ou PBS. O revestimento foi realizado durante a noite e as placas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,05% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS durante 1,5 hora. Contas paramagnéticas acopladas ao VHH foram diluídas 50 vezes e incubadas diretamente com anticorpos anti-histidina de camundongo monoclonais conjugados com tintura fluorescente Alexa-488 (Abd Serotec) em 1% de MPBST durante 1 hora. Diluições seriais em 2 vezes (50 - 800 vezes) de Dynabeads paramagnéticas conjugadas por VHH e contas fluorescentes FluoSpheres foram preparadas em 2% de MPBS, transferidas para placas ELISA revestidas com goma arábica, e incubadas em temperatura ambiente durante 1 hora. As contas não ligadas foram foram removidas lavando-se cinco vezes com PBS/0,05% de Tween-20. As bases das cavidades da placa de ELISA foram analisadas quanto às contas ligadas por microscopia. A contagem de contas e uso da máscara da máquina fotográfica do microscópio para cálculo da área de superfície analisada foram usados para calcular o número de contas ligadas por cavidade como mostrado em tabela 3. Alternativamente, micropartículas foram visualizadas usando um sistema de microscópio macrozoom (Nikon) e contadas usando o software de análise de imagem Volocity (PerkinElmer); o número de FluoSpheres ligadas por cavidade é mostrado na tabela 4. Tabela 3: Dynabeads de ácido carboxílico magnéticas ligadas contadas às cavidades revestidas com goma arábica à

Tabela 4: FluoSpheres ligadas contadas às cavidades revestidas com goma arábica

[000111] Uma estrutura de ensaio tipo ELISA foi usada para avaliar a interação de microcápsulas acopladas ao VHH em superfícies contendo antígeno. Placas de ELISA (Maxisorp (Thermo Scientific Nunc) ou microplacas de meia área de ligação elevadas (Greiner Bio- One)) foram revestidas com goma arábica ou lectina de batata. Revestimentos foram realizados durante a noite com 100 μg/ml de goma arábica ou lectina de batata em PBS. Cavidades de controle incluíram cavidades em branco ou cavidades revestidas com antígenos não relacionados. As placas foram lavadas três vezes com PBS com 0,05% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS durante 1 a 2 horas. Microcápsulas contendo lambda cialotrina acopladas ao VHH ou contendo Uvitex foram diluídas em densidades apropriadas em 1% de leite desnatado em PBS com 0,05% de Tween-20. As microcápsulas foram adicionadas às cavidades de controle ou revestidas com antígeno e permitidas ligarem-se durante 1 hora. As microcápsulas não ligadas foram removidas lavando-se cinco vezes com PBS com 0,05% de Tween-20. As bases das cavidades de placa de ELISA foram analisadas quanto às microcápsulas ligadas em um sistema de microscópio macrozoom (Nikon). As microcápsulas foram contadas usando software de análise de imagem Volocity (Perkin Elmer). Um filtro de DAPI foi usado para visualizar as microcápsulas Uvitex. Iluminação de LED branca e quadros de campo luminosos foram usados para microcápsulas de lambda cialotrina. Os controles para microcápsulas contendo lambda cialotrina ou contendo Uvitex incluíram microcápsulas brancas e microcápsulas para que VHH não relacionado seja acoplado. Tabela 5: Microcápsulas ligadas às cavidades revestidas com lectina de batata ou antígeno não relacionado

[000112] Em outra experiência, quantid ades d e lambda cialotrina foram da mesma forma analiticamente determinadas. 100 μl/cavidade de acetona foram adicionadas às cavidades de lavagem com microcápsulas ligadas e transferidos para frasconetes de vidro com 10 ml de hexano contendo 0,05% de trifenilfosfato como padrão interno. A quantidade de lambda cialotrina foi determinada por análise de GC/MS-MS em comparação com soluções de calibração. Os controles para microcápsulas de lambda cialotrina incluíram as microcápsulas brancas para que nenhum VHH fosse acoplado e microcápsulas para que VHH não relacionado fosse acoplado. Os controles também incluíram cavidades para que nenhuma goma arábica ou lectina de batata fossem revestidas. Com base nos resultados do ensaio tipo ELISA com microcápsulas de lambda cialotrina foi constatado que algum VHH desta invenção (por exemplo, VHH3E6) é capaz de ligar e manter as microcápsulas às superfícies revestidas com antígeno resultando em um aumento de 23 vezes de quantidades de lambda cialotrina em cavidades revrestidas com antígeno em comparação às microcápsulas brancas e um aumento de 27 vezes foi medido sobre cavidades brancas não revestidas com antígeno.

[000113] Com base nos resultados dos ensaios de ligação de microcápsula, VHH pode ser classificado como capaz ou incapaz de ligar e reter as microcápsulas a uma superfície. Algum VHH desta invenção (por exemplo, VHH3E6) mostrou ser capaz de ligar-se especificamente às superfícies revestidas com antígeno quando acopladas a uma microcápsula. Nenhuma ligação significante às superfícies com antígenos não relacionados foi observada. Além disso, a ligação específica foi forte o suficiente para manter a microcápsula à superfície revestida com antígeno, visto que a força de ligação resiste claramente às forças de cisalhamento que ocorrem durante o procedimento de lavagem. Mais do que isso é que VHH é capaz de ligar e reter microcápsulas contendo ingredientes ativos pertinentes às superfícies, como mostrado para o exemplo com microcápsulas contendo o inseticida lambda cialotrina.

[000114] Em seguida foi investigado se a ligação de microcápsulas às superfícies pode ser melhorada usando-se agentes de alvejamento compreendendo VHH multivalente. Uma série de acoplamento paralelo foi realizada com quantidades iguais de VHH monovalente, VHH bivalente, e VHH não relacionado. O sucesso do acoplamento de VHH e VHH multivalente foi analisado como descrito no exemplo 4. Um ensaio tipo ELISA foi realizado usando as microplacas de meia área de ligação elevadas (Greiner Bio-One) revestidas com 5 μg/cavidade de lectina de batata. As cavidades de controle incluíram as cavidades brancas ou cavidades revestidas com antígenos não relacionados. As placas foram lavadas três vezes com PBS com 0,05% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de leite desnatado em PBS durante 1 a 2 horas. As microcápsulas contendo Uvitex acopladas ao VHH foram diluídas em densidades apropriadas em 1% de leite desnatado em PBS com 0,05% de Tween-20. Séries de diluição consecutivas em 5 vezes foram preparadas e permitidas ligarem-se à superfície para comparar a ligação de microcápsulas acopladas com VHH monovalente ou bivalente. As microcápsulas foram adicionadas às cavidades de controle ou revestidas com antígeno e permitidas ligarem-se durante 1 hora. Microcápsulas não ligadas foram removidos lavando-se cinco vezes com PBS com 0,05% de Tween-20. As bases das cavidades da placa de ELISA foram analisadas quanto às microcápsulas ligadas em um sistema de microscópio macrozoom (Nikon). As microcápsulas foram contadas usando o software de análise de imagem Volocity (Perkin Elmer). Um filtro DAPI foi usado para visualizar as microcápsulas Uvitex. VHH bivalente mostrou ser capaz de especificamente ligar-se a uma superfície revestida por antígeno quando acoplada a uma microcápsula ou mais microcápuslas foram retidas usando VHH bivalente em comparação às microcápsulas com VHH monovalente. Com a densidade mais alta das microcápsulas aplicadas (calculadas para completamente revestir a superfície da base da cavidade) foi constatado que 17% mais microcápsulas com VHH bivalente acoplado foram retidas na cavidade em comparação à mesma quantidade de microcápsulas com VHH monovalente. Com uma aplicação de 25 vezes menos microcápsulas que foi constatado que 160% mais microcápsulas foram retidas na cavidade para microcápsulas acopladas com VHH bivalente em comparação às microcápsulas com VHH monovalente. A área de superfície das microcápsulas com VHH bivalente acoplado foi 15 vezes acima da área de superfície de microcápsulas brancas aplicadas a esta densidade de microcápsula enquanto a área de superfície das microcápsulas com VHH monovalente esteve apenas 6 vezes acima da área de superfície das microcápsulas brancas aplicadas a esta densidade de microcápsula. Esta diferença pode ser explicada por um aumento na resistência de ligação devido à avidez adicional do VHH bivalente comparado ao VHH monovalente, pode da mesma forma ser que o uso de VHH bivalente aumenta a flexibilidade e comprimento do espaçador dos agentes de alvejamento acoplados em microcápsulas, ou uma combinação de ambos. Tabela 6: As áreas de superfície de microcápsulas ligadas às cavidades revestidas com lectina de batata ou antígeno não relacionado

[000115] Um ensaio de ligação de disco de folha foi usado para avaliar a interação de microcápsulas acopladas ao VHH com batata, grama e folhas de azaléia. Discos de folhade 0 8 mm foram testados das folhas de plantas pote de batata planta (variedade Desirée), das folhas de Lollium perenne crescidas em estufa e das folhas de plantas de pote de azaléia. Os discos de folha foram lavados três vezes com PBS. As microcápsulas contendo lambda cialotrina ou Uvitex foram diluídas em densidades apropriadas em 1% de leite desnatado em PBS com 0,05% de Tween-20. As microcápsulas foram adicionadas aos discos de folha e o assentamento das microcápsulas e ligação dos agentes de alvejamento permitidos durante 1 hora. As microcápsulas não ligadas foram removidas lavando-se três a cinco vezes com PBS com 0,05% de Tween-20.

[000116] Para microcápsulas de lambda cialotrina uma análise de resíduo foi realizada para medir as quantidades de lambda cialotrina nos discos de folha de batata. Os discos de folha lavados com microcápsulas ligadas foram transferidos para frasconetes de vidro e as microcápsulas foram dissolvidas em acetona. As amostras foram diluídas por adição de hexano contendo 0,05% de trifenilfosfato como padrão interno. A quantidade de lambda cialotrina foi determinada por análise de GC/MS-MS em comparação com as soluções de calibre. Os controles para microcápsulas de lambda cialotrina incluíram as microcápsulas brancas para que nenhum VHH fosse acoplado e microcápsulas para que VHH não relacionado fosse acoplado. Com base nos resultados dos ensaios de ligação de folha com microcápsulas de lambda cialotrina foi constatado que algum dentre VHH desta invenção é capaz de ligar e manter as microcápsulas nas superfícies da folha resultando em um aumento de 3,3 vezes e 2,2 vezes das quantidades de lambda cialotrina sobre os discos de folha em comparação às microcápsulas brancas para que nenhum VHH fosse acoplado ou microcápsulas com VHH não relacionado acoplado, respectivamente.

[000117] Discos de folha com microcápsulas Uvitex foram analisados quanto às microcápsulas ligadas em um sistema de microscópio macrozoom (Nikon). As microcápsulas foram contadas usando o software de análise de imagem Volocity (Perkin Elmer). Um filtro DAPI foi usado para visualizar as microcápsulas Uvitex. Os controles para microcápsulas Uvitex incluíram as microcápsulas brancas para que nenhum VHH fosse acoplado e microcápsulas para que VHH não relacionado fosse acoplado. Com base nos resultados do ensaio de ligaço de disco de folha com microcápsulas Uvitex, foi constatado que algum VHH (por exemplo, VHH 3E6) desta invenção mostrou ser capaz de ligar e manter as microcápsulas especificamente em superfícies de folha.

[000118] Em discos de folha de batata, a ligação específica das microcápsulas acopladas com VHH 3E6, resultou em 9 vezes mais microcápsulas ligadas à superfície da folha em comparação às microcápsulas brancas e em 6 vezes mais microcápsulas ligadas à superfície da folhas em comparação às microcápsulas acopladas com VHH não relacionado, como mostrado na Figura 4. Em discos de folha de grama, a ligação específica das microcápsulas acopladas com VHH 3E6 resultou em 3 vezes mais microcápsulas ligadas à superfície da folhas em comparação às microcápsulas brancas e em 2 vezes mais microcápsulas ligadas à superfície da folha em comparação às microcápsulas acopladas com VHH não relacionado. Em discos de folha de azaleia, nenhuma ligação específica das microcápsulas acopladas com VHH 3E6, que se assemelham completamente à especificidade de ligação relacionada às espécies de planta do VHH como demonstrado no exemplo 3.

[000119] Uma experiência de titulação foi realizada para investigar qual fator de diluição de microcápsulas com VHH específico corresponde a uma aplicação de microcápsulas para que nenhum VHH fosse acoplado para obter quantidades similares de microcápsulas depois de um tratamento idêntico. Diluições seriais em 2 vezes de microcápsulas foram preparadas e a ligação do disco de folha foi analisada em discos de folha de batata para estes séries de diluição. A partir da experiência de dosagem, foi calculado que uma concentração inferior de 8 vezes de microcápsulas com VHH específico resultou em quantidades similares de microcápsulas especificamente ligadas aos discos de folha em comparação às microcápsulas não funcionalizadas como mostrado na Figura 5. A partir desta experiência, ficará claro que uma redução significante de uma dose adequada de um agroquímico pode ser obtida, acoplando- se um VHH de acordo com esta invenção, a um microveículo contendo o agroquímico. Exemplo 6: deposição e retenção de microcápsulas acopladas ao agente de alvejamento sobre a superfície de planta viva intacta

[000120] Efeitos sobre a deposição e retenção de veículos com agentes de alvejamento acoplados foram investigados em experiências com plantas de pote de batata inteiras (variedade Desirée) crescidas em estufas. As microcápsulas acopladas com VHH específico, acopladas com VHH de controle não relatado, ou microcápsulas brancas foram aplicadas às múltiplas folhas de composto inteiras de plantas diferentes. No total, 15 plantas foram usadas para tratamentos diferentes. As suspensões da microcápsula foram calculadas para aplicar 6,4% de cobertura de microcápsulas sobre as superfícies da folha. As folhas de composto foram submersas em suspensões de microcápsula da mesma maneira como para os ensaios de ligação de disco de folha (veja acima) com a modificação que o assentamento das microcápsulas e ligação de VHH foram permitidos durante apenas 15 minutos. As plantas foram permitidas secar durante 1 hora depois da aplicação das microcápsulas. Uma de cada par das folhas opostas de dentro de cada folha de composto foi testada e analisada sem qualquer tratamento adicional. Os efeitos de VHH específico acoplado às microcápsulas na deposição da microcápsula podem ser analisados com estas folhas de aplicações diferentes. As plantas inteiras que perdem apenas as folhas testadas foram tratadas também para investigar o efeito de VHH específico acoplado às microcápsulas na retenção depois de um evento de chuva e os efeitos combinados de deposição e retenção. Uma simulação de chuva com gotículas finas (bocal tipo SSCOTFVS2) de 1 L/m2 em 45 segundos foi usada para investigar os efeitos da retenção. As folhas opostas das folhas já testadas foram testadas após a simulação de chuva. As folhas inteiras com microcápsulas Uvitex foram analisadas quanto às microcápsulas ligadas em um sistema de microscópio macrozoom (Nikon). As microcápsulas foram contadas usando o software de análise de imagem Volocity (Perkin Elmer). Um filtro de DAPI foi usado para visualizar as microcápsulas Uvitex. A partir das folhas que foram testadas antes do evento de chuva, foi calculado que 2,7 vezes mais microcápsulas já foram depositadas para microcápsulas com agente de alvejamento específico em comparação às microcápsulas brancas. As folhas com microcápsulas com agente de alvejamento de controle não relacionado continham apenas fração de 0,8 de microcápsulas em comparação às microcápsulas brancas. Isto mostra que VHH específico já tem um efeito benéfico sobre a deposição das microcápsulas em plantas. Em média 69 (± 8)% de microcápsulas com VHH específico foram retidos depois do evento de chuva enquanto apenas 35 (± 17)% e 39 (± 4)% das microcápsulas foram retidos para microcápsulas acopladas com VHH de controle não relatado e microcápsulas brancas, respectivamente. A combinação dos efeitos de deposição e retenção resultou em 5 vezes e 0,9 vez na quantidade de microcápsulas sobre as folhas em plantas inteiras para microcápsulas com VHH específico ou VHH de controle não relacionado, em comparação às microcápsulas brancas, respectivamente. A partir desta experiência, ficará claro que VHH específico são agentes de alvejamento superiores que permitem a liberação e ligação específica de veículos a todas as plantas vivas intactas. Como uma consequência da deposição melhorada e agentes de alvejamento de retenção melhorados desta invenção acoplados aos veículos contendo um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos sustentam a grande promessa de liberar os referidos agroquímicos especificamente às superfícies de planta e por este meio aumentar quantidades dos referidos agroquímicos depositados sobre a superfície da planta, ou permitir as taxas de aplicação reduzidas enquanto mantendo a eficácia similar, ou permitir as frequências de aplicação reduzidas enquanto mantendo a eficácia similar ou permitir a resistência à chuva melhorada dos referidos agroquímicos ou induzir uma certa especificidade para os referidos agroquímicos ou qualquer combinação dos antecedentes. REFERÊNCIAS - Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. e Lipman, D.J. (1997). 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Claims (9)

1. Agente alvo, caracterizado pelo fato de que compreende, pelo menos, um domínio de ligação capaz de se ligar a goma arábica ou lectina de batata, em que o referido domínio de ligação é um VHH, em que o agente alvo é acoplado a pelo menos um agroquímico, ou um veículo compreendendo ou ligado a pelo menos um agroquímico ou combinação de agroquímicos, cujo agente alvo é capaz de reter o referido agroquímico ou veículo em uma planta e/ou em uma parte de planta, em que o referido agroquímico ou veículo na goma arábica ou lectina de batata.

2. Uso de um agente alvo, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para liberar e reter um agroquímico ou uma combinação de agroquímicos em uma planta e/ou em uma parte de planta.

3. Uso de um agente alvo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido agroquímico ou combinação de agroquímicos é selecionado(a) do grupo consistindo em herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, protetores, micronutrientes ou reguladores de crescimento de planta.

4. Uso de um agente alvo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido veículo é um microveículo.

5. Uso de um agente alvo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido microveículo é selecionado do grupo consistindo em microcápsulas, microsferas, nanocápsulas, nanosferas, partículas de polímero, partículas feitas de celuloses artificialmente lignificadas, partículas de gel de composto, partículas de resina iônicas fracas, células microbianas ou fragmentos dos mesmos.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um agente alvo, como definido na reivindicação 1.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, carac- terizada pelo fato de que o referido agente alvo está covalentemente acoplado ao referido veículo.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o referido agroquímico é selecionado do grupo consistindo em herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, protetores, micronutrientes ou compostos reguladores de crescimento de planta.

9. Composição de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o referido veículo é selecionado do grupo consistindo em microcápsulas, microsferas, partículas de polímero, partículas feitas de celulose artificalmente lignificadas, partículas de gel de compósito, partículas de resina iônicas fracas, células microbianas ou fragmentos dos mesmos.

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