BR112012019691B1 - Métodos in vitro para reduzir a atividade de uma proteína, ou para alterar a progressão do ciclo celular eucariótico, composto para a inibição de rpa, seus usos e uso de um composto a ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo - Google Patents

Métodos in vitro para reduzir a atividade de uma proteína, ou para alterar a progressão do ciclo celular eucariótico, composto para a inibição de rpa, seus usos e uso de um composto a ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo Download PDF

Info

Publication number
BR112012019691B1
BR112012019691B1 BR112012019691-0A BR112012019691A BR112012019691B1 BR 112012019691 B1 BR112012019691 B1 BR 112012019691B1 BR 112012019691 A BR112012019691 A BR 112012019691A BR 112012019691 B1 BR112012019691 B1 BR 112012019691B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
compound
cancer
rpa
chloro
group
Prior art date
Application number
BR112012019691-0A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112012019691A2 (pt
Inventor
John J. Turchi
Sarah Shuck
Original Assignee
Indiana University Research And Technology Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Indiana University Research And Technology Corporation filed Critical Indiana University Research And Technology Corporation
Publication of BR112012019691A2 publication Critical patent/BR112012019691A2/pt
Publication of BR112012019691B1 publication Critical patent/BR112012019691B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

métodos in vitro para reduzir a atividade de uma proteína, ou para alterar a progressão do ciclo celular eucariótico, composto para a inibição de rpa, seus usos e uso de um composto a ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. a presente invenção refere-se ao direcionamento da proliferação celular descontrolada e resistência a produtos quimioterapêuticos que danificam dna com pelo menos um reagente que tem potencial significativo em tratamento de câncer. proteína a de replicação, a proteína de ligação a (ss)dna de fita simples eucariota, é essencial para manutenção e estabilidade genômica via papéis em replicação e reparo de dna. são reportadas aqui pequenas moléculas que inibem a atividade de ligação a atividade de ligação a ssdna in vitro, in vivo e celular da rpa, desse modo, rompendo o ciclo celular eucariótico, induzindo à citotoxicidade e aumentando a eficácia de agentes quimioterapêuticos que danificam o dna e/ou rompem sua replicação e/ou função. esses resultados fornecem novos "insights" quanto ao mecanismo de interações rpa-ssdna em manutenção e estabilidade cromossômica. isso representa um inibidor de ligação a dna eucariota molecularmente direcionado e demonstra a utilidade de direcionamento de uma interação de proteína-dna como um meio de estudar o ciclo celular e fornecimento de uma estratégia terapêutica para tratamento de câncer.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] O presente pedido reivindica o benefício de Pedido de Patente Provisório U.S. Número 61/301,778, depositado em 5 de Fevereiro de 2010, que é incorporado aqui por referência na íntegra.
DECLARAÇÃO DE DIREITOS GOVERNAMENTAIS
[002] Parte do trabalho durante o desenvolvimento da presente invenção foi feita com suporte do governo pelo National Institute of Health (NIH) sob o número de concessão CA082741. O Governo U.S. tem determinados direitos na invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] Alguns aspectos da invenção se referem à identificação de moléculas que inibem, pelo menos parcialmente, a atividade da Proteína A de Replicação e essas moléculas podem ser usadas para tratar doenças hiperproliferativas, incluindo câncer.
ANTECEDENTES
[004] Proteína A de Replicação ( RPA) é uma proteína de ligação a DNA de fita simples (ssDNA) heterotrimérico composta de subunidades de 70, 34 e 14 kDa (1). A atividade de ligação ao ssDNA da RPA é requerida para diversas vias metabólicas de DNA, incluindo replicação, recombinação e reparo de DNA. Interações de alta afinidade com DNA são sustentadas pelas numerosas (OB)-dobras de ligação a oligossacarídeo/oligonucleotídeo presentes sobre cada uma das três subunidades (2; 3). A bolsa de ligação a DNA de uma única OB-dobra acomoda 3-4 bases de ssDNA (4; 5). As principais OB- dobras, domínios de ligação a DNA A e B (DBD-A e DBD-B) estão presentes na região central da subunidade p70 e contribuem com a maioria da energia de ligação para interações de RPA-ssDNA (2). OB- dobras individuais são domínios modulares complexos populados com aminoácidos hidrofóbicos e básicos. Essas características estruturais tornam as OB-dobras um alvo atraente para desenvolvimento de inibidores de pequena molécula (Small Molecule Inhibitors - SMIs) de atividade de ligação a DNA. Dado o papel central da RPA em crescimento celular e reparo de DNA, ela é um alvo atraente para o desenvolvimento de compostos que podem interferir com sua atividade. Alguns aspectos da presente invenção incluem compostos que interagem com a RPA e métodos de uso dos mesmos para influenciar o crescimento e a morte celular.
SUMÁRIO
[005] Vários aspectos da invenção incluem métodos e compostos para redução da atividade de Proteína A de Replicação, afetando a proliferação de células eucariotas, o ciclo celular de células eucariotas e/ou tratamento de câncer mediante contanto de Proteína A de Replicação com um composto, tal como composto A ou um metabólito do mesmo que inclui a seguinte estrutura central:
Figure img0001
[006] Em algumas modalidades, células eucariotas contatadas com um composto ou metabólito do mesmo que inclui a estrutura central são ainda contatadas com pelo menos um composto que danifica o DNA diretamente ou inibe a topoisomerase II. Tais compostos incluem, mas não estão limitados a, Cisplatina, Etoposídeo, Busulfan, Bendamustina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucila, Cisplatina, Ciclofosfamida, Dacarbazina, Daunorrubicina, Decitabina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposídeo, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Lomustina, Mecloretamina, Melfalan, Mitomicina C, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Temozolomida, Topotecano e similares.
[007] Alguns aspectos da invenção incluem métodos de redução da atividade de uma Proteína A de Replicação compreendendo as etapas de: fornecimento de um composto A, em que o composto A se liga à Proteína A de Replicação ou é metabolizado em um produto químico que se liga à Proteína A de Replicação, o composto tendo a seguinte fórmula:
Figure img0002
[008] em que, R1 é selecionado do grupo consistindo em: quinolinas, tiofenos e fenilas substituídos, incluindo 5-(7-cloro-2,3-di- hidro-[1,4]dioxino[2,3-g]quinolin-8-ila); 5-(quinoxalin-6-ila); e 6-cloro- [1,3]dioxolo[4,5-g]quinolin-7-ila; R2 é selecionado do grupo consistindo em: hidrogênio, halogênios, grupos metila, grupos nitro; em que o composto A ou um metabólito do composto A se liga à Proteína A de Replicação; e R3 é selecionado do grupo consistindo em: ácidos cetobutíricos e
Figure img0003
[009] em que n = 1, 2, 3,4 ou 5. Em algumas modalidades, a quinolina ou a fenila no composto A é substituída por pelo menos uma porção selecionada do grupo consistindo em: halogênios, grupos metila, grupos etila, grupos amino e pirazola. Em algumas modalidades, R1 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro-7-etoxiquinolina, 5-(quinoxalin-6-ila), 2-cloro-6,7- dimetoxiquinolina, 2-cloro-6-etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4- fluorofenila, 4-clorofenila, 2-clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4- Dietilaminofenila, 4-dimetilaminofenila, Tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolila, 2,5-metoxifdimetoxifenila, 3,4-metoxifdimetoxifenila, 4-etilfenila; e 1- fenil-3-p-tolil-1H-pirazola; e R2 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4-cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metóxi, H, 3,4- dimetila.
[0010] Em algumas modalidades, a molécula que se liga à Proteína A de Replicação é um derivado de composto A ou um metabólito do mesmo. E, em algumas modalidades, a molécula que se liga à Proteína A de Replicação é o composto TDLR-505, o composto TDLR-506 ou um metabólito do mesmo.
[0011] Em ainda outras modalidades, a etapa de contato de composto A ou um metabólito do mesmo e a pelo menos uma isoforma de Proteína A de Replicação ocorre in vivo. Em ainda outras modalidades, a etapa de contato de composto A ou um metabólito do mesmo e a pelo menos uma isoforma de Proteína A de Replicação ocorre in vitro.
[0012] Outros aspectos da invenção incluem métodos de inibição de proliferação celular via alteração da progressão de ciclo celular eucariótico, compreendendo as etapas de: fornecimento de um composto A que interfere com a progressão de ciclo celular eucariótico ou que é metabolizado em um produto químico que interfere com a progressão de ciclo celular eucariótico, em que o composto A tem a seguinte fórmula:
Figure img0004
[0013] em que, R1 é selecionado do grupo consistindo em: quinolinas, tiofenos e fenilas substituídos; incluindo 5-(7-cloro-2,3-di- hidro-[1,4]dioxino[2,3-g]quinolin-8-ila); 5-(quinoxalin-6-ila); e 6-cloro- [1,3]dioxolo[4,5-g]quinolin-7-ila; R2 é selecionado do grupo consistindo em: hidrogênio, halogênios, grupos metila, grupos nitro; em que o composto A ou um metabólito do composto A se liga à Proteína A de Replicação; e R3 é selecionado do grupo consistindo em: ácido cetobutírico e
Figure img0005
[0014] em que n = 1, 2, 3,4 ou 5. Em algumas modalidades, a quinolina ou a fenila no composto A é substituída por pelo menos uma porção selecionada do grupo consistindo em: halogênios, grupos metila, grupos etila, grupos amino e pirazola. Em algumas modalidades, R1 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro-7-etoxiquinolina, 5-(quinoxalin-6-ila), 2-cloro-6,7- dimetoxiquinolina, 2-cloro-6-etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4- fluorofenila, 4-clorofenila, 2-clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4- Dietilaminofenila, 4-dimetilaminofenila, Tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolila, 2,5-metoxifdimetoxifenila, 3,4-metoxifdimetoxifenila, 4-etilfenila; e 1- fenil-3-p-tolil-1H- pirazola; e R2 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4-cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metóxi, H, 3,4- dimetila.
[0015] Em algumas modalidades, o composto que interfere, pelo menos parcialmente, com a progressão de ciclo celular eucariótico é o composto A ou um metabólito do mesmo. Em ainda outras modalidades, o composto que interfere com a progressão de ciclo celular eucariótico é o composto TDLR-505, TDLR-506 ou metabólito dos mesmos. Em algumas modalidades, a etapa de contato entre composto A ou um metabólito do mesmo e a Proteína A de Replicação ocorre in vivo.
[0016] Ainda outras modalidades incluem métodos para tratamento de pacientes humanos ou animais compreendendo a etapa de distribuição ou fornecimento de pelo menos uma quantidade terapeuticamente ativa de pelo menos um composto que inibe a atividade de RPA ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Algumas modalidades incluem a etapa de administração de uma dose do composto a um paciente, em que a dose é cerca de 50 mg do referido composto por kg-1 do peso corporal do paciente ou cerca de 100 mg do referido composto por kg-1 do peso corporal do paciente ou cerca de 200 mg do referido composto por kg-1 do peso corporal do paciente.
[0017] Em ainda outras modalidades, a etapa de contato entre o referido composto A ou um metabólito do mesmo e a Proteína A de Replicação ocorre in vitro. Ainda outros aspectos da invenção incluem um método para tratamento de câncer compreendendo as etapas de: fornecimento de um composto, em que o composto interfere com o ciclo celular de uma célula cancerígena ou é metabolizado em um produto químico que interfere com o ciclo celular de uma célula cancerígena e o composto tem a seguinte fórmula:
Figure img0006
[0018] no qual R1 é selecionado do grupo consistindo em: quinolinas, tiofenos e fenilas substituídos e R2 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: halogênios, grupos metila, grupos nitro; em que o composto A se liga à Proteína A de Replicação; e contato do referido composto A com pelo menos uma célula cancerígena. Em algumas modalidades, a quinolina ou a fenila no composto A é substituída por pelo menos uma porção selecionada do grupo consistindo em: halogênios, grupos metila, grupos etila, grupos amino e pirazola. Em algumas modalidades, R1 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro-7-etoxiquinolina, 5- (quinoxalin-6-ila), 2-cloro-6,7-dimetoxiquinolina, 2-cloro-6- etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4-fluorofenila, 4-clorofenila, 2-clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4-Dietilaminofenila, 4-dimetilaminofenila, Tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolila, 2,5-metoxifdimetoxifenila, 3,4- metoxifdimetoxifenila, 4-etilfenila; e 1-fenil-3-p-tolil-1H- pirazola; e R2 no composto A é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4- cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metóxi, H, 3,4-dimetila. Em algumas modalidades, o composto que é contatado com a célula cancerígena é composto A ou um metabólito do mesmo e, em algumas modalidades, o composto que é contatado com a célula cancerígena é o composto TDLR-505, TDLR-506 ou metabólito dos mesmos. Em algumas modalidades, a etapa de contato entre o referido composto ou um metabólito do mesmo e a célula cancerígena ocorre in vivo e, em ainda outras modalidades, a etapa de contato entre o referido composto A ou um metabólito do mesmo e a célula cancerígena ocorre in vitro. Em algumas modalidades, a célula cancerígena é encontrada em um tumor sólido selecionado do grupo consistindo em: câncer de pulmão de células não pequenas e células pequenas, câncer ovariano epitelial, câncer cervical, câncer de cólon e câncer de mama. Algumas modalidades da invenção ainda incluem a etapa de contato da célula cancerígena com pelo menos um reagente quimioterapêutico que se liga à ou danifica o DNA diretamente ou reduz a atividade de topoisomerase II. Em algumas modalidades, o reagente quimioterapêutico é selecionado do grupo consistindo em, mas não limitado a: Cisplatina e Etoposídeo. Tais compostos incluem, mas não estão limitados a, Busulfan, Bendamustina, Carboplatina, Carmustina, Cisplatina, Ciclofosfamida, Dacarbazina, Daunorubicina, Decitabina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposídeo, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Lomustina, Mecloretamina, Melphalan, Mitomicina C, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Temozolomida, Topotecano e similares.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FiguraS
[0019] Figura 1A. Composto 3.
[0020] Figura 1B. EMSA de inibição de ligação de RPA ao DNA pelo composto 3.
[0021] Figura 1C. Plotagem de dados de EMSA de inibição de ligação de RPA ao DNA pelo composto 3.
[0022] Figura 2A. Um derivado de ácido cetobutírico de composto A.
[0023] Figura 2B. Composto TDLR-505.
[0024] Figura 2C. EMSA de inibição de ligação de RPA ao DNA pelo composto TDLR-505.
[0025] Figura 2D. Plotagem de dados de EMSA de inibição de ligação de RPA ao DNA pelo TDRL-505.
[0026] Figura 3. EMSA de inibição de ligação de RPA ao DNA pelo composto TDLR-506.
[0027] Figura 4A. Dot plots de células H460 coradas com Anexina V/PI que mede a morte celular induzida por TDRL-505.
[0028] Figura 4B. Plotagem de dados de morte celular medidos em diferentes concentrações de composto TDLR-505.
[0029] Figura 4C. Imunofluorescência de localização celular de RPA hibridizada com um anticorpo anti-RPA e visualizado com um anticorpo AlexaFluor.
[0030] Figura 4D. Western blots da subunidade p34 de RPA como uma função de tratamento com composto TDRL-505.
[0031] Figura 5A. Distribuição de ciclo celular de células de NSCLC H460 tratadas com composto TDLR-505.
[0032] Figura 5B. Distribuição de ciclo celular de células H460 tratadas com Nocodazola e, então, composto TDLR-505 durante 4, 8 ou 12 horas.
[0033] Figura 6. Análise de sinergia em células H460 cotratadas com composto TDLR-505 e Cisplatina (círculos abertos) ou Etoposídeo (círculos fechados).
[0034] Figura 7A. Atividade anticâncer in vivo de TDRL-505 versus câncer de pulmão de células não pequenas em um modelo de xenoenxerto com camundongos. O volume do tumor foi medido e plotado versus o tempo. Os dados são apresentados como a média ± S.E (n = 5).
[0035] Figura 7B. Atividade anti-câncer in vivo de TDRL-505 versus câncer de pulmão de células não pequenas em camundongos individuais ensaiados em um modelo de xenoenxerto.
DESCRIÇÃO
[0036] Para fins de promoção de um entendimento dos princípios da nova tecnologia, referência será feita agora às modalidades preferidas da mesma e linguagem específica será usada para descrever a mesma. Todavia, será entendido que nenhuma limitação do escopo da nova tecnologia é, desse modo, pretendida, tais alterações, modificações e outras aplicações dos princípios da nova tecnologia sendo consideradas, conforme normalmente ocorrerá para aqueles versados no campo ao qual a nova tecnologia se refere.
[0037] A menos que específica ou implicitamente afirmado de outro modo, o termo "cerca de", conforme usado aqui, significa mais ou menos 10 por cento. Por exemplo, "cerca de 1,0" abrange a faixa de 0,9 a 1,1.
[0038] Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de um composto biologicamente ativo que tem um único ou efeito benéfico cumulativo sobre a saúde ou bem-estar de um paciente. Em replicação de DNA, inibição de RPA pode ser usada para explorar a natureza altamente proliferativa de células cancerígenas, a qual é caracterizada por uma grande população de células na fase S. RPA é também essencial para diversas vias de reparo de DNA na célula, incluindo reparo por excisão de nucleotídeo (Nucleotide Excision Repair - NER). Cisplatina, um produto quimioterapêutico comum usado no tratamento de vários cânceres, induz seu efeito citotóxico mediante formação de adutos de DNA covalentes intra-fita que são reparados primariamente pela via NER (6). Consequentemente, seria esperado que tratamento com Cisplatina, em conjunto com atividade de ligação de RPA ao ssDNA diminuída, resulte em eficiência reduzida de reparo celular de adutos de Cisplatina-DNA e citotoxicidade aumentada. Assim, objetivação de RPA tem o potencial não apenas por atividade de um único agente, mas também de sensibilizar células cancerígenas a terapias que induzem a dano ao DNA e instabilidade genética, tais como Cisplatina, Etoposídeo e radiação ionizante (Ionizing Radiation - IR). Busulfan, Bendamustina, Carboplatina, Carmustina, Cisplatina, Ciclofosfamida, Dacarbazina, Daunorrubicina, Decitabina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposídeo, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Lomustina, Mecloretamina, Melphalan, Mitomicina C, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Temozolomida, Topotecano e similares.
[0039] Conforme divulgado aqui, pequenas moléculas que inibem a atividade de ligação de RPA ao ssDNA foram identificadas. Inibição de RPA celular resulta na incapacidade de entrar na fase S, indução de morte celular e atividade sinergística com os reagentes quimioterapêuticos Cisplatina e Etoposídeo. Essas pequenas moléculas, as quais são capazes de inibir a atividade de ligação de RPA ao ssDNA, são ativas como agentes únicos e em conjunto com produtos quimioterapêuticos comumente usados para matar células cancerígenas. In vivo, os compostos podem ser administrados com segurança até 200 mg/mg em camundongos IP e via ingestão oral forçada sem sinais de toxicidade excessiva e possuem atividade anti- câncer versus câncer de pulmão de células não pequenas humano no modelo de xenoenxerto com camundongos.
Materiais e Métodos Síntese de Derivados de TDRL 505
[0040] Fazendo referência agora ao Esquema 1. Cetonas comercialmente disponíveis, tal como 1 e aldeídos, tal como 2, são submetidos a uma condensação de Claisen-Schmidt para criar enonas, tal como 3, que podem ser ciclizadas usando reagentes, tal como hidrazina, para gerar H1 pirazolas, tal como 4. A química de ligação de amida é usada com vários ácidos, tal como 5, de forma a modificar a posição N1 da pirazola para formar compostos, tal como o composto exemplificativo TDRL-505 6.
Figure img0007
Esquema 1 Síntese de Derivados de TDRL 506
[0041] Fazendo referência agora ao Esquema 2. TDRL-506 foi preparado a partir de TDRL-505 e 3-morfolinopropan-1-amina (2) via acoplamento com EDC.
Figure img0008
Esquema 2 Análise in vitro
[0042] Inibidores de pequena molécula foram obtidos da ChemDiv e resuspensos em DMSO. Composto TDLR-505 foi independentemente sintetizado e a estrutura confirmada por meio de análise de espectrometria de massa. RPA humana é purificada usando um sistema de superexpressão em E. coli, conforme previamente descrito (7). EMSAs foram realizados em reações de 20 μL contendo RPA a 25 nM, DNA de 34 pares de base rotulado com 5’[32P] a 25 nM, conforme previamente descrito (7). A concentração final de DMSO foi de 1%.
Citometria de Fluxo
[0043] Células H460 foram analisadas com relação à apoptose usando um kit de ensaio com Anexina V-FITC/Iodeto de Propídio (Propidium Iodide - PI) Vybrant Apoptosis Assay (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colocadas em lâminas em uma densidade de 1 x 104 células por cm2 e deixadas aderir durante 24 horas e, então, tratadas com composto TDLR-505 durante 48 horas. Após colocação em lâmina e tratamento das células H460 conforme descrito acima, células aderentes e não aderentes foram coletadas, processadas e analisadas sobre um citômetro de fluxo BD FACScan. Os dados foram analisados usando o software WinMDI (http://facs.scripps.edu/software.html). Análise do ciclo celular foi realizado por meio de coloração com PI. Resumidamente, as células foram colocadas em lâminas e tratadas com composto, coletadas e, então, lavadas duas vezes com PBS-EDTA suplementado com BSA a 1%. As células foram fixadas em EtOH a 70% a -20 °C, enquanto submetidas a turbilhonamento, seguido por incubação sobre gelo durante 30 minutos. As células foram, então, coletadas e coradas com solução de PI (10 μg/mL de PI e 25 μg/mL de RNaseA em PBS- EDTA suplementado com BSA a 1%). As células foram analisadas sobre um citômetro de fluxo Becton Dickinson FACScan. As células foram ativadas e analisadas sobre um histograma com eventos plotados contra o parâmetro FL2-A. Distribuição de ciclo celular foi analisada usando o software ModFit. Interrupção em G2 foi induzida por meio de tratamento com 0,8 μg/mL de nocodazola durante 12 horas (10). As células foram, então, lavadas com PBS e tratadas com veículo ou composto TDLR-505 (100 μM). As células foram coletadas e analisadas com relação à distribuição de ciclo celular, conforme descrito acima.
Imunofluorescência Indireta
[0044] Células H460 foram colocadas sobre lâminas de câmara (LabTek), conforme descrito acima. As células foram, então, tratadas durante 3 horas com composto TDLR-505 a 50 μM ou veículo conforme indicado e, após tratamento, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% a 25 °C durante 3 minutos, seguido por lavagem em Triton X-100 a 0,2% durante 2 minutos a 4 °C. As lâminas foram, então, bloqueadas em FBS a 15% em PBS durante 1 hora a 25 °C e, então, incubadas com anticorpo primário anti-RPA 34 (Neomarkers) em uma diluição de 1:500 em FBS a 15% durante 1 hora. As lâminas foram, então, lavadas 3 x 10 minutos com FBS a 15% e, então, incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-camundongo Alexa Fluor-594 (Invitrogen) em uma diluição de 1:300 durante 1 hora. As lâminas foram novamente lavadas e coradas com DAPI a 300 nM diluído em PBS-EDTA durante cinco minutos. As lâminas foram, então, montadas e imagens capturadas usando um microscópio fluorescente Zeiss e imagens foram capturadas usando filtros para Texas Red para visualização de coloração de RPA e DAPI para visualização de DNA. As lâminas foram visualizadas e as imagens analisadas e quantificadas usando o software ImageJ.
Análise Western Blot
[0045] Células H460 foram colocadas em lâminas e tratadas com veículo ou composto TDLR-505 a 100 μM na presença ou ausência de Etoposídeo a 25 μM durante 6 horas e, então, processadas para análise Western Blot usando um procedimento de lise e extração RIPA. RPA foi detectada com um anticorpo anti-RPA p34 (Neomarkers) e anticorpo secundário de cabra anti-camundongo-HRP (Santa Cruz). As bandas foram visualizadas usando detecção por quimioluminescência.
Análise In Vivo
[0046] A camundongos NOD/SCID (8 semanas de idade) foram administradas injeções IP de composto TDLR-505 2x por semana durante 2 semanas a 200 mg/kg. Os camundongos foram monitorados quanto aos sinais de toxicidade excessiva e os pesos corporais medidos três vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados e necropsia macroscópica realizada para avaliar os pesos dos órgãos e inspecionar com relação a sinais de toxicidade. Não houve indicação de que o TDLR-505 era tóxico quando ele foi oralmente administrado aos camundongos em um nível de dosagem de cerca de 200 mg/mg. Camundongos NOD/SCID foram, então, implantados com 5 x 106 células H460 em 0,2 mL de Matrigel a 50% subcutaneamente. Os tumores foram deixados desenvolver durante 7 dias e TDRL-505 foi administrado via ingestão oral forçada 2 x por semana durante uma semana. Os volumes do tumor foram calculados medindo-se a largura e o comprimento dos tumores e usando essas medições na equação: vol. = l x w2/2.
[0047] Análise Farmacocinética. TDRL-505 foi administrado aos camundongos a 200 mg/kg ip ou po e sangue colhido a 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas pós-tratamento. A concentração sérica de TDRL-505 foi medida usando um protocolo de HPLC MS/MS e análise dos parâmetros PK usando análise compartimental.
Resultados Identificação de um Inibidor de Pequena Molécula de RPA
[0048] Trabalho anterior levou à identificação de uma série de pequenas moléculas a partir da biblioteca do NCI que inibiam a atividade de ligação ao DNA de RPA, mas não mostravam atividade celular (8). Um outro estudo empreendeu triagem de uma biblioteca ChemDiv usando uma modificação de polarização por fluorescência (Fluorescence Polarization - FP) no ensaio original (11). Fazendo referência agora às Figuras 1A, B e C, composto 3 foi identificado a partir da triagem de alto rendimento e analisado em um ensaio secundário usando ensaios de desvio de mobilidade eletroforéticos (Electrophoretic Mobility Shift Assays - EMSAs) para confirmar a inibição. Conforme ilustrado pelas Figuras 1B e 1C, inibição significativa de ligação de RPA ao DNA foi observada via análise por EMSA e quantificação dos dados corroboram essa inibição.
[0049] Fazendo referência agora às Figuras 2A e B. Em vista do alto nível de inibição in vitro de RPA observada usando compostos tendo a estrutura central do composto A, a estrutura central foi substituída por di-hidropirazola com um ácido 4-oxo-butanoico na posição N1 e um substituinte fenila em C3 para iniciar análise das relações de atividade estrutural (Structure Activity Relationships - SAR) e pesquisa por outros compostos com atividade celular. Oitenta e um análogos foram identificados e obtidos a partir da biblioteca ChemDiv com diferentes substituições do anel de fenila (R2) e substituintes variados na posição C5 sobre o anel de di-hidropirazola (R1) (dados não mostrados). Dentre os compostos analisados, o composto TDRL- 505 (Figura 2B) foi o inibidor de RPA mais potente testado, tendo um valor de IC50 de 13 μM (TABELA 1). Uma série de compostos, incluindo TDRL 518 e TDRL 520-523, foi também identificada na triagem secundária como tendo atividade inibitória de RPA in vitro ou como tendo propriedades químicas similares às pequenas moléculas que se verificou inibir a atividade de RPA. Fazendo referência ainda à TABELA 1, cada composto na Tabela 1 foi titulado contra RPA in vivo ou em célula, in vitro para determinar seus valores de IC50. Conforme ilustrado na Tabela 1, esses compostos mostraram capacidades variadas quanto à inibição de interações RPA-ssDNA (TABELA 1). De forma a determinar a atividade celular de cada um dos compostos, a indução de morte celular foi medida em uma linhagem de células de NSCLC H460 e os valores de IC50 para cada composto, após uma exposição de 48 horas, foram determinados. Esses dados são também apresentados na TABELA 1 e revelam uma correlação entre atividade in vitro e celular, consistente com inibição celular de RPA e indicando especificidade para inibição de RPA. Contudo, o composto 523, o qual mostrou inibição mínima de interações RPA-ssDNA in vitro, também mostrou atividade celular modesta. Isto pode ser o resultado da célula metabolizando o composto para gerar um inibidor de RPA mais eficaz. Análise da atividade inibitória celular e in vitro de análogos do composto 3 mostrou que o composto TDLR-505 mostra o menor valor de IC50 in vitro e era o composto mais potente daqueles examinados nas células. Consequentemente, o composto foi selecionado para investigação adicional, incluindo estudo de seu mecanismo de ação e dos efeitos celulares que resultam de inibição de interações RPA- ssDNA usando uma série compreensiva de ensaios in vitro, baseados em célula e in vivo.
[0050] Fazendo referência agora à TABELA 1, a IC50 in vitro foi determinada por meio de análise EMSA, conforme descrito na Figura 1A. O valor de IC50 celular foi determinado mediante tratamento de células H460 com os compostos indicados e analisando a coloração com anexina V/PI, conforme descrito em Métodos. Os dados in vitro e celulares foram analisados usando uma curva logística com 4 parâmetros padrão. Os valores de IC50 e erro padrão da adaptação foram determinados a partir desta análise.
[0051] Fazendo referência agora à Tabela 2. Os compostos na Tabela 2 estão comercialmente disponíveis e também foi mostrado que inibem a atividade de ligação RPA-DNA in vitro. Resumidamente, “m’ tem modificação de ácido oxo-pentanoico e uma substituição por dioxinol da quinolina; “n” tem modificação de ácido oxo-pentanoico e quinoxalinila substituindo a quinolina; “r” tem ácido butanoico e uma substituição dioxolo da quinolina.
[0052] Derivados de compostos m e n, os quais incluem um ácido butírico e os derivados de morfolino são feitos. A p-metila é substituída por um p-bromo sobre o anel de fenila. Derivados de ‘r” com o grupo Br-fenila e o grupo morfolino são feitos também. Os dados de SAR descritos aqui mostram que tornar o ácido butírico mais longo (por exemplo, pentanoico) parece ser um pouco prejudicial para a atividade, mas remoção de toda a cadeia lateral resulta em perda substancial de atividade inibitória de RPA. Consequentemente, derivados mais curtos do morfolino com menos espaçadores de carbono são desejáveis.
Inibição in vitro de atividade de ligação de RPA ao DNA objetivando DBD-A e B na subunidade de 70 kDa de RPA.
[0053] Fazendo referência agora às Figuras 2C, D e E, análise por EMSA de composto TDLR-505, resumidamente, concentrações crescentes de composto TDRL-505 foram pré-incubadas com RPA e a atividade de ligação ao DNA foi ensaiada via EMSA usando um substrato de ssDNA de 34 bases. Fazendo referência agora à Figura 2D, quantificação do gel apresentado na Figura 2C. Fazendo referência agora à Figura 2D, a média e desvio padrão de cada ponto são apresentados. Os dados foram adaptados a uma curva logística com 4 parâmetros com N = 4. TABELA 1
[0054] Relações de atividade estrutural de inibidores de RPA de pequena molécula
Figure img0009
Figure img0010
*Inibição na maior concentração testada (100 μM) foi de 9%;**Inibição na maior concentração testada (100 μM) foi de 36%; ***Citotoxicidade máxima observada foi de 80% do controle. TABELA 2.
Figure img0011
Figure img0012
Modificação de TDRL-505; análise de TDRL-506
[0055] Fazendo referência agora ao Esquema 2. TDRL-506 foi sintetizado e purificado e ensaiado com relação à atividade inibitória de RPA in vitro. Fazendo referência à Figura 3, TDRL-506 foi ensaiado com relação à atividade inibitória de RPA contra o heterotrímero de RPA de comprimento total (fileiras 1-7) e o construto DBD-A/B (fileiras 8-12). As concentrações usadas foram TDRL-506 a 25, 50, 75 e 100 μM. Os dados demonstram que o composto TDRL-506, contendo a modificação morfolino, retém atividade inibitória de RPA total.
Indução de morte de célula cancerígena pelo TDRL-505.
[0056] Fazendo referência agora às Figuras 4A, 4B, 4C e 4D, os efeitos do composto TDRL-505 sobre a indução de morte celular e progressão do ciclo celular em uma linhagem de célula de NSCLC H460 foram medidos. Resumidamente, células H460 foram tratadas com composto TDRL-505 durante 48 horas e analisadas com relação à viabilidade celular através de coloração com Anexina V/PI e apresentadas como dot plots (vide Figura 3A). Fazendo referência agora à Figura 4B, os dados da Figura 4A foram quantificados e o percentual de células Anexina-/PI- (quadrante inferior à esquerda), que indicam células vivas, foi calculado. A média ± SD (N = 4) é apresentada e os dados foram adaptados a uma curva logística com 4 parâmetros. Estes dados demonstram que TDRL-505 é capaz de induzir à morte celular em células NSCLC. Como uma medida independente do efeito do composto TDLR-505 sobre a viabilidade celular, um ensaio de coloração com violeta cristal foi usado e proporcionou um valor de IC50 de 64 μM (dados não mostrados). Um resultado similar foi também observado no tratamento da linhagem de célula de NSCLC A549 com composto TDLR-505, enquanto que análise usando células mononucleares de sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) recentemente isoladas revelou atividade citotóxica mínima (dados não mostrados). Nestes experimentos, composto TDLR-505 mostra efeitos citotóxicos significativos em linhagens de células de NSCLC e apenas atividade modesta em células não cancerígenas, indicando que há uma janela de tratamento terapêutico para essas moléculas.
[0057] Estes efeitos celulares observados após tratamento com composto TDLR-505 se correlacionam com uma incapacidade da RPA de interagir com o DNA o qual, então, poderia resultar em numerosas possibilidades, incluindo degradação ou redistribuição de RPA dentro da célula. Imunofluorescência indireta foi usada para avaliar como inibição de ligação de RPA influencia a localização celular. Fazendo referência agora à Figura 4C, células H460 foram tratadas com composto TDLR-505 a 50 μM ou veículo durante 3 horas quanto à expressão e localização de RPA por meio de imunofluorescência indireta usando um anticorpo secundário Alexa Fluor594 (vermelho). As lâminas foram contra-coradas com DAPI (azul) e imagens surgiram. Ampliação das células em destaque é apresentada abaixo das imagens em baixa ampliação. Resumidamente, após 3 horas de tratamento com composto TDLR-505, as células mostraram uma diminuição na intensidade de coloração com RPA comparado com o controle tratado com veículo sem uma alteração na localização subcelular global (Figura 4C). Quantificação da intensidade de coloração revelou que, das células tratadas com veículo, 23% mostram intensidade >70% do máximo, enquanto que células tratadas com composto mostraram apenas 15% acima deste valor. Estes dados demonstram que tratamento de células com TDRL-505 reduz a quantidade de RPA ligada ao DNA em células. Fazendo referência agora à Figura 4D, células H460 foram tratadas com veículo ou composto TDLR-505 a 100 μM sem ou com Etoposídeo (25 μM), conforme indicado na figura. Expressão de RPA foi avaliada via análise Western Blot hibridizando a subunidade p34. A fileira 1 é um controle positivo com RPA purificada a partir de um sistema de expressão de E. coli. A posição da RPA p34 não fosforilada e RPA p34 hiper-fosforilada são indicadas pelas setas. Estes dados demonstram que a RPA não tem a expressão degradada ou reduzida em função de tratamento com TDRL-505.
Composto TDLR-505 induz a uma interrupção em G1 em linhagens de célula H460.
[0058] O composto TDLR-505 foi testado para avaliar seu efeito sobre a progressão do ciclo celular. Foi demonstrado que knockdown de RPA por siRNA induz a uma interrupção do ciclo celular em G1, consistente com o papel essencial de RPA no início de replicação de DNA na fase S (19). De forma a determinar se este é o mesmo mecanismo de ação mostrado pelo composto TDLR-505, seu efeito sobre a progressão do ciclo celular de H460 foi medido. Conforme ilustrado pelos dados apresentados na Figura 5, células H460 sincronizadas mostram uma incapacidade de re-entrar na fase S quando tratadas com TDRL-505.
[0059] Fazendo referência agora à Figura 5A. Células de NSCLC H460 foram tratadas com composto TDLR-505 a 0 e 75 μM durante 48 horas e, então, analisadas quanto à distribuição do ciclo celular usando citometria de fluxo. A Figura 5B, células H460 foram tratadas com 0,8 μg/mL de nocodazola durante 12 horas, lavadas, então, tratadas com veículo TDLR-505 a 100 μM durante 4, 8 e 12 horas. As células foram, então, coletadas e analisadas quanto à distribuição de ciclo celular usando citometria de fluxo.
[0060] A análise do composto TDRL-505 sobre uma cultura não síncrona foi testada e um aumento na proporção de células em fase G1 foi observada em resposta ao tratamento com TDRL-505 (Figura 5A). Para determinar se entrada na fase S é inibida em células tratadas com composto TDLR-505, as células foram sincronizadas em G2/M com nocodazola e, então, liberadas de interrupção em G2 e realimentadas com meio completo suplementado com veículo ou composto TDLR-505. Fazendo referência agora à Figura 5B, o controle e células tratadas progrediram rapidamente através de mitose para G1 após remoção de nocodazola. Células que foram tratadas com veículo apenas entraram em G1, conforme observado no ponto de tempo de 4 horas e progressão para a fase S é evidente no ponto de tempo de 8 horas, com progressão para G2 evidente no ponto de tempo de 12 horas. Células que foram tratadas com composto TDLR- 505, após liberação de nocodazola, progrediram para a fase G1 do ciclo celular, mas não entram na fase S, mesmo após 12 horas pós- liberação. Estes dados demonstram que TDRL-505 induziu a uma interrupção do ciclo celular em G1 em células de câncer de pulmão.
Inibição do papel de RPA em reparo e replicação de DNA.
[0061] Além de seu papel essencial em replicação de DNA, RPA é requerida para o reparo de adutos de DNA densos, bem como rupturas de DNA induzidas por vários tipos de agentes exógenos e endógenos. A associação de RPA com ssDNA é uma característica crítica de todas estas vias, indicando que inibição desta atividade aumentaria os efeitos citotóxicos induzidos por dano ao DNA. De forma a determinar o efeito de inibição de RPA sobre a sensibilidade celular à Cisplatina, o índice de combinação (Combination Index - CI) (20) foi medido. Fazendo referência agora à Figura 6. Conforme ilustrado neste experimento, composto TDLR-505 atua sinergisticamente com Cisplatina e Etoposídeo em células H460. Células H460 foram tratadas com frações crescentes da concentração IC50 de Cisplatina ou Etoposídeo com composto TDLR-505 durante 48 horas. Após tratamento, as células foram coletadas e analisadas por meio de citometria de fluxo com anexina V/PI. Os círculos abertos indicam análise CI de Cisplatina com TDLR-505 e os círculos fechados representam Etoposídeo com TDLR-505. A análise do índice de combinação foi realizada conforme previamente descrito (20). Os dados são apresentados como a média ± SD a partir de (N = 3). Quando Cisplatina e composto TDLR-505 foram usados em combinação, a viabilidade celular foi diminuída para um nível que era maior do que aquele induzido por qualquer agente isoladamente, resultando em uma sinergia entre os dois compostos e CI de 0,4 na maior fração de células afetada. A interação se torna aditiva e, então, antagonística (revelada a partir de valores de CI maiores do que um) em menores frações de células afetadas. Estes resultados demonstram que o composto TDLR-505 é capaz de potencializar o efeito da Cisplatina em células H460 e é consistente com inibição da atividade celular de RPA em NER. A capacidade do composto TDLR- 505 de mostrar sinergia com Etoposídeo foi também examinada. Etoposídeo induz à interrupção da forquilha de replicação e resposta de dano ao DNA, ambos processos celulares que requerem RPA (21). Usando a mesma análise conforme descrito acima para Cisplatina, composto TDLR-505 mostrou atividade sinergística com Etoposídeo em todas as frações de células afetadas (Figura 6). Foi mostrado que RPA p34 é hiper-fosforilada em resposta ao tratamento com Etoposídeo em uma variedade de sistemas celulares (21; 22). De modo interessante, análise hiper-fosforilação de RPA p34 por meio de Western Blot não foi alterada por tratamento concorrente com TDLR- 505 e nenhuma alteração dramática na expressão global de RPA foi evidente (Figura 4D). Estes dados demonstram que tratamento com TDLR-505 não tem um impacto dramático sobre a resposta de sinalização a dano ao DNA dependente de Etoposídeo e que sinergia é observada na presença de hiperfosforilação de RPA.
Análise in vivo do composto TDLR-505.
[0062] Fazendo referência agora à Tabela 3. TDRL-505, que demonstra valores de IC50 razoáveis contra NSCLC, prosseguiram para avaliação in vivo do efeito de inibição de RPA sobre o crescimento do tumor câncer de pulmão. A segurança de administração de TDRL-505 em camundongos "naive" foi determinada. Dados adicionais demonstraram que administração IP de composto TDLR-505 em uma formulação de DMSO a 25% em Tween 80 a 0,75% a camundongos NOD/SCID é bem tolerada, até 400 mg/kg. Dosagem oral em Tween 80 a 0,01%/metil celulose também foi bem tolerada, até 800 mg/kg.
[0063] Camundongos que tinham sido implantados com células de tumor NSCLC humano foram submetidos a um regime de dosagem oral. Os tumores foram deixados crescer até 100 mm3, após o qual tratamento com TDRL-505 ou veículo foi iniciado. Os resultados apresentados na (Figura 7) demonstram uma redução no crescimento de tumor em camundongos tratados com TDRL-505 comparado com o controle de veículo. Fazendo referência à Figura 7B, análise de camundongos individuais revela redução significativa no crescimento de tumor comparado com controles tratados com veículo.
[0064] Baseado na atividade anticâncer in vivo do TRL-505, uma comparação dos parâmetros farmacocinéticos com regimes de dosagem ip e po foi feita. A camundongos "naive" foi fornecida uma única dose e, conforme descrito na Tabela 3, sangue foi coletado em vários intervalos de tempo e a concentração de TRDL-505 determinada via um protocolo de HPLC-MS/MS desenvolvido para este composto. Os dados demonstram parâmetros PK significativamente melhores em quase todos os parâmetros para dosagem ip comparado com po. Estes dados sugerem que a dosagem ip produzirá biodisponibilidade significativamente maior e levará à eficácia intensificada, levando a uma atividade anticâncer ainda maior. Além disso, a modificação morfolino empregada em TDRL-506 aumentaria a biodisponibilidade oral, desse modo, tornando regimes de dosagem oral para TDRL-506 mais eficazes. Tabela 3. Farmacocinética de TDRL-505: análise não compartamental
Figure img0013
Cmax: Concentração máxima. tmax: tempo de concentração máxima. AUC0-t: área sob a curva de concentração plasmática-tempo até o tempo t. Cl/F: eliminação/disponibilidade; se dosagem é IV, então, F = 1. Vdss: volume aparente de distribuição em estado constante; Vdss = t1/2: meia-vida.
[0065] Avanços em triagem de alto rendimento e bibliotecas químicas têm resultado em uma explosao de alvos putativos para o câncer e seus inibidores. Até o momento, a maioria dessa atividade enzimática alvo tem estado associada a uma proteína específica. Conforme ilustrado aqui, objetivação da atividade de ligação de RPA ao DNA não enzimatica abre uma classe totalmente nova de interações putativas. O composto TDLR-505 bloqueia a entrada da célula na fase S e resulta em uma resposta citotóxica/citostática, o resultado sendo consistente com inibição do papel de RPA no início de replicação de DNA e esse processo provavelmente envolve uma série complexa de interações, uma das quais é o carregamento de RPA em origens de replicação em um processo dependente de CDK em fase S (19; 23). Embora esses dados não demonstrem síntese apreciável de DNA, resta ser determinado se RPA é capaz de carregar em origens em células tratadas com composto TDLR-505. A saída das células da fase S em G2 na presença de TDLR-505 sugere que interações DBD- A e -B/DNA podem ser menos importantes em alongamento, no qual RPA participa predominantemente em retardo da síntese da fita de DNA (24). O papel de RPA nos estágios iniciais de replicação de DNA preveria uma interrupção em G1 em oposição a uma interrupção intrafase S, a qual nós observamos. Contudo, o potencial que células na fase S tratadas com composto TDLR-505 têm reduziu a ligação de RPA e, consequentemente, bloqueou o alongamento e disparo de forquilhas de replicação tardias não pode ser excluído. Isto representa a possibilidade de que células mortas pelo composto TDLR-505 são aquelas que replicam ativamente seu DNA e a interrupção disto causa citotoxicidade. Contudo, a continuação de interrupção de G1 também pode induzir à morte celular após períodos prolongados de tempo, explicando porque o grau de morte celular após 48 horas de tratamento é maior do que o número de células que estão em fase S. Isto ilustra a existência de uma janela terapêutica para objetivar especificamente células ativamente em divisão no contexto de tratamento de câncer usando SMIs para bloquear a atividade celular de RPA.
[0066] O papel de RPA em reparo de DNA também permite inibição de sua atividade para aumentar a eficácia de produtos quimioterapêuticos atuais que induzem a dano ao DNA no contexto de terapia combinada. É previsto que inibição de reparo de DNA resulte em dano persistente ao DNA, o qual aumentaria a citotoxicidade. O papel indispensável de RPA no reconhecimento e verificação de etapas de NER é bem caracterizado e, além disso, a RPA participa na etapa de ressíntese após excisão do oligonucleotídeo danificado (25). Estudos anteriores mostraram que células com níveis diminuídos de proteínas NER demonstram sensibilidade aumentada ao tratamento com Cisplatina (26). Consistente com isto, nossos dados revelam uma interação sinergística entre o composto TDLR-505 e Cisplatina em altas frações de células afetadas. De modo interessante, em baixas frações de células afetadas, uma interação antagonística é observada com índices de combinação maiores do que um. Isso é provavelmente o resultado de interações não ao nível de reparo, mas ao nível de sinalização. Uma vez que a Cisplatina leva à ativação de um ponto de verificação de G2 e induz à apoptose a partir de uma interrupção em G2 prolongada, a constatação de que o composto TDLR-505 bloqueia as células em G1 indica que menos células estariam sujeitas à interrupção em G2 induzida por Cisplatina. Da mesma forma, se toxicidade pelo composto TDLR-505 se origina de uma interrupção em G1 prolongada, o ponto de verificação de G2 induzido por Cisplatina resultaria em menos morte celular como um resultado de tratamento. Em altas concentrações, este efeito é aliviado pela interação ao nível de reparo de DNA com inibição de RPA aumentando a toxicidade pela Cisplatina e superando a interação de sinalização antagonística.
[0067] O papel de RPA em reinício de replicação de DNA e processamento de forquilhas de replicação em colapso também apresenta oportunidades para terapia combinada (27; 28). De modo interessante, análise pelo índice de combinação da atividade de Etoposídeo com composto TDLR-505 mostrou atividade sinergística em todas as frações de células afetadas. Etoposídeo inibe a atividade enzimática de topoisomerase II (topo II), resultando em complexos de clivagem covalente persistentes sobre o DNA, os quais levam à interrupção da forquilha de replicação e rupturas em fita simples e dupla (29). Foi demonstrado que RPA responde a e repara estes tipos de lesões e intermediários de DNA e seria esperado que inibição desta atividade potencializasse os efeitos observados mediante inibição de topo II, a qual é observada nas análises (21). Em segundo, em virtude da natureza não síncrona destas células, em qualquer dado tempo, seria esperado que uma célula que está sofrendo replicação esteja em diversos estágios de disparo de replicação. RPA é requerida em disparo precoce de replicação, enquanto que foi mostrado que topo II é requerida para eventos de replicação em estágios posteriores (30). Portanto, seria esperado que inibição de ambos os estágios de progressão de replicação mostrasse um maior efeito do que inibição de qualquer uma das etapas individualmente, o que implicaria em relação sinergística entre o composto TDLR-505 e Etoposídeo. Inibição de atividade de RPA e eliminação de função da via tem o potencial de utilidade disseminada em tratamento de câncer. O papel de RPA em diversas outras vias de reparo abre outras oportunidades para terapia combinada usando inibidor de RPA. Por exemplo, combinação de inibição de RPA molecularmente direcionada com terapia de radiação levaria à citotoxicidade aumentada em células tumorais via inibição de reparo de ruptura de DNA fita dupla através de união de extremidade de DNA não homóloga ou recombinação homóloga, ambas as quais tendo sido mostrado que requerem RPA (31-33).
[0068] Embora objetivação da atividade enzimática de proteínas com pequenas moléculas seja bem aceita, os resultados apresentados aqui demonstram a viabilidade e utilidade de objetivação de uma interação de proteína-DNA não enzimática. Esses compostos são Inibidores de Pequena Molécula (Small Molecule Inhibitor - SMIs) de RPA os quais mostram atividade in vitro e celular. A abordagem de objetivação de RPA para quimioterapia de câncer tem diversas vantagens únicas, incluindo a falta de redundância resultante da ausência de sistemas de backup eficientes necessários para contra-atuar a perda de atividade de RPA. Inibição de RPA terá utilidade de amplo espectro, uma vez que a dependência de RPA para proliferação celular aumentada e reparo de agentes quimioterapêuticos que danificam o DNA não é única a qualquer único câncer. Objetivação da atividade de ligação de RPA ao DNA com pequenas moléculas similares a fármaco, conforme divulgado aqui, ilustra que essa classe de proteínas pode ser direcionada para produzir compostos terapêuticos.
[0069] Embora a nova tecnologia tenha sido ilustrada e descrita em detalhes nas figuras e descrição precedente, as mesmas devem ser consideradas como de caráter ilustrativo e não restritivo, sendo entendido que apenas as modalidades preferidas foram mostradas e descritas e pretende-se que todas as alterações e modificações que entram no espírito da nova tecnologia sejam protegidas. Também, embora a nova tecnologia tenha sido ilustrada usando exemplos específicos, argumentos teóricos, explicações e ilustrações, essas ilustrações e a discussão em anexo não deverão ser interpretadas como limitando a tecnologia. Todas as patentes, pedidos de patente e referências a textos, tratados científicos, publicações e similares mencionados no presente pedido são incorporados aqui por referência na íntegra. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (1) Wold MS. Replication Protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. [Review] [190 refs]. Annual Review of Biochemistry 1997; 66: 61-92. (2) Bochkarev A, Bochkareva E. From RPA to BRCA2: lessons from single-stranded DNA binding by the OB-fold. Current Opinion in Structural Biology, Fevereiro de 2004; 14(1): 36-42. (3) Fanning E, Klimovich V, Nager AR. A dynamic model for Replication Protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res 2006; 34(15): 4126-37. (4) Bochkarev A, Pfuetzner RA, Edwards AM, Frappier L. Structure of the single-stranded-DNA-binding domain of Replication Protein A bound to DNA. Nature 1997; 385(6612): 176-81. (5) Pfuetzner RA, Bochkarev A, Frappier L, Edwards AM. Replication Protein A. Characterization and crystallization of the DNA binding domain. J Biol Chem 1997; 272(1): 430-4. (6) Zamble DB, Mu D, Reardon JT, Sancar A, Lippard SJ. Repair of Cisplatin--DNA adducts by the mammalian excision nuclease. Biochemistry 1996; 35(31): 10004-13. (7) Patrick SM, Turchi JJ. Replication Protein A (RPA) Binding to Duplex Cisplatin-damaged DNA is Mediated through the Generation of Single-stranded DNA. J Biol Chem 1999; 274(21): 14972-8. (8) Andrews BJ, Turchi JJ. Development of a high- throughput screen for inhibitors of Replication Protein A and its role in nucleotide excision repair. Mol Cancer Ther 2004; 3(4): 385-91. (9) Goodsell DS, Morris GM, Olson AJ. Automated docking of flexible ligands: applications of AutoDock. J Mol Recognit; Janeiro de 1996; 9(1): 1-5. (10) Jin Z, Dicker DT, el-Deiry WS. Enhanced sensitivity of G1 arrested human cancer cells suggests a novel therapeutic strategy using a combination of simvastatin and TRAIL. Cell Cycle; Janeiro de 2002; 1(1): 82-9. (11) Turchi JJ, Shuck SC, Short EA, Andrews BJ. Targeting Nucleotide Excision Repair as a Mechanism to Increase Cisplatin Efficacy. Em: Bonetti A, Leone R, Muggia FM, Howell SB, editores. Platinum and Other Heavy Metal Compostos in Cancer Chemotherapy. New York: Humana Press; 2009. Páginas 177-88. (12) Dodson GE, Shi Y, Tibbetts RS. DNA replication defects, spontaneous DNA damage and ATM-dependent checkpoint activation in Replication Protein A-deficient cells. J Biol Chem; 6 de Agosto de 2004; 279(32): 34010-4. (13) Patrick SM, Oakley GG, Dixon K, Turchi JJ. DNA Damage Induced Hyperphosphorylation of Replication Protein A. 2. Characterization of DNA Binding Activity, Protein Interactions and Activity in DNA Replication and Repair. Biochemistry; 14 de Junho de 2005; 44(23): 8438-48. (14) Patrick SM, Turchi JJ. Xeroderma pigmentosum complementation grupo A protein (XPA) modulates RPA-DNA interactions via enhanced complex stability and inhibition of strand separation activity. J Biol Chem 2002; 277(18): 16096-101. (15) Patrick SM, Turchi JJ. Stopped-flow kinetic analysis of Replication Protein A-binding DNA - Damage recognition and affinity for single-stranded DNA reveal differential contributions of k(on) and k(off) rate constants. J Biol Chem 2001; 276(25): 22630-7. (16) Bochkareva E, Belegu V, Korolev S, Bochkarev A. Structure of the major single-stranded DNA-binding domain of Replication Protein A suggests a dynamic mechanism for DNA binding. EMBO J 2001; 20(3): 612-8. (17) Dispersyn G, Nuydens R, Connors R, Borgers M, Geerts H. Bcl-2 protects against FCCP-induced apoptosis and mitochondrial membrane potential depolarization in PC12 cells. Biochim Biophys Acta; 5 de Agosto de 1999; 1428(2-3): 357-71. (18) Palermo CM, Bennett CA, Winters AC, Hemenway CS. The AF4-mimetic peptide, PFWT, induces necrotic cell death in MV411 leukemia cells. Leuk Res; Abril de 2008; 32(4): 633-42. (19) Haring SJ, Mason AC, Binz SK, Wold MS. Cellular functions of human RPA1. Multiple roles of domains in replication, repair and checkpoints. J Biol Chem; 4 de Julho de 2008; 283(27): 19095-111. (20) Chou TC, Talalay P. Quantitative-analysis of doseeffect relationships - the combined effects of multiple-drugs or enzyme-inhibitors. Advances in Enzyme Regulation 1984; 22: 27-55. (21) Robison JG, Bissler JJ, Dixon K. Replication Protein A is required for Etoposide-induced assembly of MRE11/RAD50/NBS1 complex repair foci. Cell Cycle; 1 de Outubro de 2007; 6(19): 2408-16. (22) Block WD, Yu Y, Lees-Miller SP. Phosphatidyl inositol 3-kinase-like serine/threonine protein kinases (PIKKs) are required for DNA damage-induced phosphorylation of the 32 kDa subunit of Replication Protein A at threonine 21. Nucleic Acids Res 2004; 32(3): 997-1005. (23) Tanaka TU, Nasmyth K. Association of RPA with chromosomal replication origins requires an Mcm protein and is regulated by Rad53 and cyclin- e Dbf4-dependent kinases. EMBO J; 1 de Setembro de 1998; 17(17): 5182-91. (24) Hubscher U, Seo YS. Replication of the lagging strand: a concert of at least 23 polypeptides. Mol Cells; 31 de Outubro de 2001; 12(2): 149-57. (25) Hess MT, Schwitter U, Petretta M, Giese B, Naegeli H. Bipartite substrate discrimination by human nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94(13): 6664-9. (26) Welsh C, Day R, McGurk C, Masters JRW, Wood RD, Koberle B. Reduced levels of XPA, ERCC1 and XPF DNA repair proteins in testis tumor cell lines. Int J Cancer 2004; 110(3): 352-61. (27) Wang LC, Stone S, Hoatlin ME, Gautier J. Fanconi anemia proteins stabilize replication forks. DNA Repair (Amst); 1 de Dezembro de 2008; 7(12): 1973-81. (28) Manthey KC, Opiyo S, Glanzer JG, Dimitrova D, Elliott J, Oakley GG. NBS1 mediates ATR-dependent RPA hyperphosphorylation following replication-fork stall and collapse. J Cell Sci; 1 de Dezembro de 2007; 120(Pt 23): 4221-9. (29) Baldwin EL, Osheroff N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Curr Med Chem Anticancer Agents; Julho de 2005; 5(4): 363-72. (30) Ishimi Y, Sugasawa K, Hanaoka F, Eki T, Hurwitz J. Topoisomerase II plays an essential role as a swivelase in the late stage of SV40 chromosome replication in vitro. J Biol Chem 1992; 267(1): 462-6. (31) Perrault R, Cheong N, Wang HC, Wang HY, Iliakis G. RPA facilitates rejoining of DNA double-strand breaks in an in vitro assay utilizing genomic DNA as substrate. Int J Radiat Biol 2001; 77(5): 593-607. (32) Wang X, Haber JE. Role of Saccharomyces single-stranded DNA-binding protein RPA in the strand invasion step of double-strand break repair. PLoS Biol; Janeiro de 2004; 2(1): E21. (33) Stauffer ME, Chazin WJ. Physical interaction between Replication Protein A and Rad51 promotes exchange on singlestranded DNA. J Biol Chem; 11 de Junho de 2004; 279(24): 25638-45.

Claims (10)

1. Método in vitro para reduzir a atividade de uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer um composto A ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o referido composto A se liga à Proteína A de Replicação ou é metabolizado em um produto químico que se liga à Proteína A de Replicação, o referido composto A apresentando a seguinte fórmula:
Figure img0014
em que, R1 é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro- 7-etoxiquinolina, 5- (quinoxalin-6- il), 2-cloro-6,7-dimetoxiquinolina, 2- cloro-6-etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4-fluorofenila, 4-clorofenila, 2- clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4-dietilaminofenila, 4- dimetilaminofenila, tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolil, 2,5-dimetoxifenila, 3,4-dimetoxifenila, 4-etilfenila; e 1-fenil-3-p-tolil-1H- pirazol; R2 é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4- cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metoxi e 3,4-dimetila; e R3 é selecionado do grupo consistindo em: ácidos cetobutíricos e
Figure img0015
em que n = 1, 2, 3, 4 ou 5; e contatar o referido composto A com pelo menos uma isoforma de Proteína A de Replicação.
2. Método in vitro para alterar com a progressão do ciclo celular eucariótico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer um composto A que interfere com a progressão de ciclo celular eucariótico ou que é metabolizado em um produto químico que interfere com a progressão de ciclo celular eucariótico, o referido composto A apresentando a seguinte fórmula:
Figure img0016
em que: R1 é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro-7- etoxiquinolina, 5- (quinoxalin-6- il), 2-cloro-6,7-dimetoxiquinolina, 2- cloro-6-etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4-fluorofenila, 4-clorofenila, 2- clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4-dietilaminofenila, 4- dimetilaminofenila, tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolil, 2,5-dimetoxifenila, 3,4-dimetoxifenial, 4-etilfenila; e 1-fenil-3-p-tolil-1H- pirazol; R2 é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4- cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metoxi e 3,4-dimetila; e R3 é selecionado do grupo consistindo em: ácidos cetobutíricos e
Figure img0017
em que n = 1, 2, 3; e contato do referido composto A com pelo menos uma célula eucariota.
3. Uso de um composto A ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma formulação para o tratamento de câncer, em que o câncer é um tumor sólido selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer epitelial de ovário, câncer cervical, câncer de cólon e câncer de mama, em que o referido composto A interfere com o ciclo celular de uma célula cancerígena ou é metabolizado em um produto químico que interfere com o ciclo celular de uma célula cancerígena, os referidos compostos A apresentando a seguinte fórmula:
Figure img0018
em que: R1 é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro-7- etoxiquinolina, 5- (quinoxalin-6- il), 2-cloro-6,7-dimetoxiquinolina, 2- cloro-6-etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4-fluorofenila, 4-clorofenila, 2- clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4-dietilaminofenila, 4- dimetilaminofenila, tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolil, 2,5-dimetoxifenila, 3,4-dimetoxifenial, 4-etilfenila; e 1-fenil-3-p-tolil-1H- pirazol; R2 é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4- cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metoxi e 3,4-dimetila; e R3 é selecionado do grupo consistindo em: ácidos cetobutíricos e
Figure img0019
em que n = 1, 2, 3;
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto A é composto TDLR-506 apresentando a fórmula
Figure img0020
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um metabólito do mesmo, ou composto TDLR-505 apresentado a fórmula
Figure img0021
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um metabólito do mesmo.
5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de contato entre o referido composto A ou um metabólito do mesmo e a célula cancerígena ocorre in vitro, em que a célula cancerígena é encontrada em um tumor sólido selecionado dentre o grupo consistindo em: câncer de pulmão de células não pequenas e células pequenas, câncer ovariano epitelial, câncer cervical, câncer de cólon e câncer de mama.
6. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que inclui ainda a etapa de contato da célula cancerígena com cisplatina ou etoposídeo.
7. Composto para a inibição de RPA, caracterizado pelo fato de que compreende:
Figure img0022
em que: n = 1, 2 ou 3; R1 é selecionado do grupo consistindo em: 2-cloro-7- etoxiquinolina, 5- (quinoxalin-6- il), 2-cloro-6,7-dimetoxiquinolina, 2- cloro-6-etoxiquinolina, 4-Bromofenila, 4-fluorofenila, 4-clorofenila, 2- clorofenila, 2-metoxifenila, 4-etilfenila, 4-dietilaminofenila, 4- dimetilaminofenila, tiofeno, 4-metoxifenila, p-tolil, 2,5-dimetoxifenila, 3,4-dimetoxifenila, 4-etilfenila; e 1-fenil-3-p-tolil-1H- pirazol; e R2 é selecionado do grupo consistindo em: 4-bromo, 4- cloro, 4-nitro, 4-metila, 4-metoxi e 3,4-dimetila; em que o composto A ou um metabólito do composto A se liga à Proteína A de Replicação.
8. Uso de um composto como definido na reivindicação 7 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma formulação para o tratamento de câncer, em que o câncer é um tumor sólido selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer epitelial de ovário, câncer cervical, câncer de cólon e câncer de mama.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a formulação apresenta uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um reagente quimioterápico.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a formulação apresenta uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um reagente quimioterápico selecionado do grupo consistindo em: Cisplatina, Etoposídeo, Busulfan, Bendamustina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucila, Cisplatina, Ciclofosfamida, Dacarbazina, Daunorrubicina, Decitabina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposídeo, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Lomustina, Mecloretamina, Melfalan, Mitomicina C, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Temozolomida e Topotecano.
BR112012019691-0A 2010-02-05 2011-02-05 Métodos in vitro para reduzir a atividade de uma proteína, ou para alterar a progressão do ciclo celular eucariótico, composto para a inibição de rpa, seus usos e uso de um composto a ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo BR112012019691B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30177810P 2010-02-05 2010-02-05
US61/301,778 2010-02-05
PCT/US2011/023838 WO2011097545A1 (en) 2010-02-05 2011-02-05 Materials and method for inhibiting replication protein a and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112012019691A2 BR112012019691A2 (pt) 2016-08-09
BR112012019691B1 true BR112012019691B1 (pt) 2021-09-28

Family

ID=44355820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112012019691-0A BR112012019691B1 (pt) 2010-02-05 2011-02-05 Métodos in vitro para reduzir a atividade de uma proteína, ou para alterar a progressão do ciclo celular eucariótico, composto para a inibição de rpa, seus usos e uso de um composto a ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo

Country Status (6)

Country Link
US (3) US8859532B2 (pt)
EP (1) EP2531032B1 (pt)
JP (2) JP5957385B2 (pt)
BR (1) BR112012019691B1 (pt)
CA (1) CA2825680C (pt)
WO (1) WO2011097545A1 (pt)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10774063B2 (en) 2014-11-13 2020-09-15 Indiana University Research And Technology Corporation Materials and method for inhibiting replication protein A and uses thereof
US9897378B2 (en) 2015-10-08 2018-02-20 Nyc Designed Inspirations Llc Cosmetic makeup sponge/blender container
JP6485407B2 (ja) * 2016-06-01 2019-03-20 横河電機株式会社 電磁流量計および誤配線検出方法
WO2019191424A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Emory University Glun2c/d subunit selective antagonists of the n-methyl-d-aspartate receptor
WO2020061303A1 (en) * 2018-09-19 2020-03-26 The Trustees Of Indiana University Pyrazolylacylpyrazoline compounds and method for treating pain
CN112759614B (zh) * 2019-11-05 2023-03-28 天津医科大学 基于组蛋白去乙酰化酶和复制蛋白a联合靶向的铂类化合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101460634A (zh) 2006-04-13 2009-06-17 康乃尔研究基金会有限公司 用于靶向c-rel的方法和组合物
WO2008045663A2 (en) 2006-10-06 2008-04-17 Kalypsys, Inc. Aryl-substituted heterocyclic pde4 inhibitors as antiinflammatory agents
US8716283B2 (en) 2007-11-07 2014-05-06 University Of Massachusetts Type III secretion inhibitors, analogs and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA2825680A1 (en) 2011-08-11
US9730942B2 (en) 2017-08-15
WO2011097545A1 (en) 2011-08-11
US8859532B2 (en) 2014-10-14
CA2825680C (en) 2019-12-03
JP6316859B2 (ja) 2018-04-25
WO2011097545A9 (en) 2011-11-17
JP2013518906A (ja) 2013-05-23
JP2016164166A (ja) 2016-09-08
US20140370121A1 (en) 2014-12-18
EP2531032A1 (en) 2012-12-12
EP2531032A4 (en) 2013-09-04
US9533969B2 (en) 2017-01-03
US20170182055A1 (en) 2017-06-29
JP5957385B2 (ja) 2016-07-27
BR112012019691A2 (pt) 2016-08-09
EP2531032B1 (en) 2019-04-10
US20130028989A1 (en) 2013-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tomaselli et al. Epigenetic polypharmacology: A new frontier for epi‐drug discovery
US9730942B2 (en) Materials and method for inhibiting replication protein A and uses thereof
Jekimovs et al. Chemotherapeutic compounds targeting the DNA double-strand break repair pathways: the good, the bad, and the promising
JP6817287B2 (ja) キラルジアリール大環状分子及びその使用
AU2021202388A1 (en) Mechanism of resistance to BET bromodomain inhibitors
EP3202397B1 (en) Compounds for the treatment of mtor pathway related diseases
BRPI0618939A2 (pt) método para modulação de sistema de proteìna quinase ativada por estresse
JP2010527908A (ja) Ｃｎｄａｃ（２’−シアノ−２’−デオキシ−ｎ４−パルミトイル−１−ベータ−ｄ−アラビノフラノシル−シトシン）及び細胞毒性薬を含む組合せ
Zhang et al. GLI1 inhibitor SRI-38832 attenuates chemotherapeutic resistance by downregulating NBS1 transcription in BRAFV600E colorectal cancer
WO2019227040A1 (en) Substituted pyridinyl azetidinone derivatives for use in treating cancer and other diseases
US20180305330A1 (en) Materials and method for inhibiting replication protein a and uses thereof
JP2008517065A (ja) Ｂｒｃａ２−ｒａｄ５１相互作用の破壊のための組成物及び方法
Chen et al. Design, synthesis and biological evaluation of novel 9-N-substituted-13-alkylberberine derivatives from Chinese medicine as anti-hepatocellular carcinoma agents
Dou et al. Discovery of novel ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase modulators: computational simulation, biological evaluation and cancer combinational chemotherapy study
Li et al. Discovery, Synthesis, and Evaluation of Novel Dual Inhibitors of a Vascular Endothelial Growth Factor Receptor and Poly (ADP-Ribose) Polymerase for BRCA Wild-Type Breast Cancer Therapy
US20190365745A1 (en) Use of chronic treatment with atr inhibitors to sensitize cancer cells to parp inhibitors
US20230158034A1 (en) Co-treatment with cdk4/6 and cdk2 inhibitors to suppress tumor adaptation to cdk2 inhibitors
Cheng et al. Rh PDCD 5 combined with dexamethasone increases antitumor activity in multiple myeloma partially via inhibiting the Wnt signalling pathway
US20230219957A1 (en) Small molecule cb002-analoges restore the p53 pathway and target s-phase checkpoint
WO2022271676A1 (en) Indole-substituted quinolines and their combination with plk1 inhibitors for the treatment of cancer
Jacob Elucidating the Molecular Mechanisms Exploited by Glioblastoma to Evade the Tumor Suppressive Functions of Protein Phosphatase 2A
JP2018510917A (ja) 抗癌治療剤
Rocha Seeking for new p53-activating agents: effective therapies for colorectal cancer
Liu Tumor Cell Senescence in Cancer Therapy
CA3216716A1 (en) Composition comprising an inhibitor of mitochondrial transcription

Legal Events

Date Code Title Description
B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: INDIANA UNIVERSITY RESEARCH AND TECHNOLOGY CORPORA

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 05/02/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.