BR112012004284B1 - ácidos biliares poli-hidroxilados para tratamento de transtornos biliares - Google Patents

Abstract

ÁCIDOS BILIARES POLI-HIDROXILADOS PARA TRATAMENTO DE TRANSTORNOS BILIARES. A invenção proporciona, em parte, ácidos biliares poli-hidroxilados para tratamento de distúrbios biliares, por exemplo, distúrbios biliares resultantes de colestase ou hipertansão portal. A invenção também proporciona, em parte, ácidos biliares poli-hidroxilados para estímulo do fluxo de bílis. Novos compostos ácido 2a, 3a, 7a, 12(Alfa)-tetra-hidroxi-5(Beta)-colanóico e ácido 3(Alfa), 4a, 7a, 12 (Alfa)-tetra-hidroxi-5(Beta)-colanóico são divulgados, usos dos mesmos e síntese dos mesmos

Description

Campo da invenção

A presente invenção provê ácidos biliares poliidroxilados e derivados dos mesmos para tratar distúrbios biliares ou estimular fluxo de bile. Mais especificamente, a presente invenção provê ácidos biliares poliidroxilados e derivados dos mesmos para tratar distúrbios biliares que levam a, ou estão associados à, colestasia ou hipertensão portal, ou para estimular fluxo de bile.

Antecedentes da invenção

Bile é uma secreção complexa produzida pelo fígado. É armazenada na vesícula biliar e periodicamente liberada no intestino delgado para auxiliar na digestão. Componentes de bile incluem colesterol, fosfolipídios, pigmentos de bile, e várias toxinas que o fígado elimina através de exclusão fecal/biliar. Sais de bile são sintetizados e ativamente secretados através de membranas canaliculares fornecendo a força osmótica para acionar o fluxo de bile. Essa é a etapa limitante para formação de bile. Fluxo de bile é essencial para desintoxicação do fígado, digestão, metabolismo do colesterol e absorção de vitaminas e nutrientes solúveis em lipídeo.

Ácidos biliares são críticos como veículos para eliminação de colesterol a partir do corpo através de secreção biliar e como detergente para a ingestão de ácidos graxos e vitaminas solúveis em gordura (23). Ácidos biliares também desempenham papeis importantes em regular sobrevivência/apoptose de célula (37; 38; 39; 40; 41) e em regulacão da expressão gênica através do receptor ativado por X farnesóide (42; 43; 44; 45; 46; 47) em hepatócitos. Ácidos biliares são sintetizados em hepatócitos a partir de colesterol, secretados na bile após serem conjugados com glicina ou taurina, reabsorvidos no intestino delgado, e recirculados de volta para hepatócitos através da veia portal. Secreção canalicular de ácidos biliares a partir do fígado para a bile é um processo importante na circulação entero-hepática de ácidos biliares e seu mau funcionamento resulta em diferentes doenças hepáticas (23). Se esse processo for rompido, o acúmulo de ácidos biliares frequentemente causa dano ao fígado devido aos efeitos detergentes. Em seres humanos, o pool de ácido biliar circula 6-10 vezes a cada 24 h, resultando em secreção diária de sal de bile de 20-40 g em aproximadamente 400 ml (51; 49).

Proteína de exportação de sal biliar (BSEP, ABCB11

Irmã de glicoproteína-P (SPGP)), uma proteína de cassete de ligação ATP (ABC) canalicular de bile, foi identificada como o sistema de transporte principal para a secreção biliar de ácidos biliares (50; 13). Mutações BSEP em seres humanos levam à secreção de sal de bile prejudicada e uma doença grave do fígado, colestasia intra-hepática familiar progressiva tipo 2 (PFIC2) (1, 2). Secreção de ácido biliar em pacientes PFIC2 é normalmente menor do que 1% do normal (2). BSEP foi também envolvida como sendo alvo para drogas que causam colestasia (3-6). Mutações de BSEP também foram associadas à colestasia intera-hepática crônica, colestasia intra-hepática recorrente benigna tipo 2 (BRIC 2) (7, 8) e colestasia intra-hepática de gravidez (9, 10) . Bsep de camundongo transporta ácidos biliares na ordem de preferência: tauroquenodesoxicolato > tauroursodesoxicolato = taurocolato > glicocolato = colato (11-16). Vesículas de membrana de plasma de fígado de rato apresentam preferência similar (17) . As preferências de ácido biliar e atividade de BSEP são similares entre seres humanos, ratos e camundongo.

Camundongos nocaute (KO) bsep sofrem de uma doença colestática com mortalidade aumentada em filhotes, fertilidade diminuída em adultos, e fluxo de bile somente ^ das quantidades normais (18) . O fluxo de bile residual em camundongos KO bsep é maior do que aquele de pacientes PFIC2, e o fenótipo é menos severo, em que camundongos KO bsep podem sobreviver à infância e têm um tempo de vida normal (18). Os fígados de camundongos KO bsep expressam níveis elevados de glicoproteína-P (Mdr1a/1b) e seu conteúdo de bile contém espécies novas de ácido biliar, incluindo ácido biliar tetrahidroxilado, não normalmente presente em bile humano ou de camundongo (16, 18) . Quando alimentado em uma dieta de 0,5% de colato, os camundongos KO bsep se tornam severamente colestáticos, porém, ao mesmo tempo, secretam uma grande quantidade de sal de bile no bile. Para explicar esse resultado aparentemente contraditório, um modelo ‘rain barrel’ foi proposto, sugerindo que o nível de contenção de sal de bile em hepatócitos depende tanto da afinidade do transportador para ácidos biliares (Km) , como da taxa de saída de ácido biliar (19) . Os camundongos KO bsep apresentam colestasia severa em uma dieta enriquecida com colato, uma vez que sua taxa de fluxo de bile elevada e saída de ácido biliar é mediada por um transportador cujo Km não é baixo o suficiente para reduzir sal de bile intra-hepático acumulado abaixo de níveis tóxicos. O modelo de rain barrel prevê que o transportador de sal de bile alternativo tenha uma afinidade mais baixa para colato do que BSEP.

Quando vesículas de membrana de plasma da linhagem de célula de hamster B30, contendo um nível elevado de glicoproteína-P (Mdr1, Abcb1a) foram examinadas, o transporte de taurocolato dependente de ATP (20) com um Km de 69 μM, aproximadamente sete vezes mais elevado do que Bsep foi observado, sugeriu que a glicoproteína-P transporta taurocolato com uma afinidade relativamente baixa. A análise de composição de sal de bile biliar em camundongos KO bsep indica que a glicoproteína-P favorece os muricolatos menos hidrofóbicos e THBAs em relação aos ácidos biliares primários mais hidrofóbicos tanto em seres humanos como em camundongo (18, 21) . Isso pode explicar a gravidade diferente dos fenótipos colestáticos em camundongos KO bsep e PFIC2 em seres humanos. Nos camundongos KO bsep, a glicoproteína-P transporta muricolato intra-hepático e THBAs, através das membranas canaliculares para manter fluxo de bile quase normal, resultando em um fenótipo brando. Uma vez que seres humanos não sintetizam normalmente muricolato ou THBAs, essa opção não é disponível para MDR1 humano e resulta na colestasia severa de PFIC2 onde o fluxo de bile diminui para 1% de normal (2).

A expressão de Mdr1a/1b suprarregulada (16, 20) nos conhecida da família de glicoproteína-ABCB/P sugeriu um papel para Mdrl em mediar fluxo de bile. Entretanto, embora os camundongos nocaute bsep apresentem colestasia muito branda durante toda a vida, camundongos nocaute duplos mdr1a-/-/mdr1b-/- são saudáveis, sem fenótipo óbvio, embora tenham defeitos específicos em excreção biliar de drogas infundidas que são conhecidas como sendo substratos Mdr1 (22) .

Algumas condições colestáticas, como cirrose biliar primária, são tratadas por suplementação com um ácido biliar de toxidez baixa não normalmente encontrado em bile humana, ursodesoxicolato. A suplementação dietética com ursodesoxicolato não resultou em maior fluxo de bile em camundongos KO bsep e pode ter até mesmo sido tóxico, sugerindo que BSEP é responsável pelo volume de transporte de ursodesoxicolato natural, e assim ursodexicolato pode não ajudar os pacientes PFIC2 ou qualquer outra pessoa que sofra de uma insuficiente de BSEP, quer herdada, associada à gravidez, ou resultado de exposições adversas a dietéticas ou a drogas.

Sumário da invenção

A invenção provê, em parte, ácidos biliares poliidroxilados para tratar distúrbios biliares, por exemplo, distúrbios biliares que se originam de colestasia ou hipertensão portal, ou para estimular fluxo de bile, por exemplo, em sujeitos normais ou sujeitos não diagnosticados com um distúrbio biliar.

Em um aspecto, a invenção provê um método de tratar um 5 distúrbio biliar em um sujeito necessitando do mesmo ou de estimular fluxo de bile em um sujeito, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a fórmula I:

ou um derivado do mesmo, em que qualquer um de R1 a R9 pode ser -H ou -OH, com a condição de que pelo menos quatro de R1 a R9 são -OH; e R10 pode ser -COOH ou -CH2OH.

Em um aspecto alternativo, a invenção provê uma composição farmacêutica ou nutricional compreendendo um composto de acordo com a fórmula I:

ou um derivado do mesmo, juntamente com um veículo farmacêutica ou fisiológica ou nutricionalmente aceitável, 5 em que qualquer um de R1 a R9 pode ser -H ou -OH, com a condição de que pelo menos quatro de R1 a R9 são -OH; e R10 pode ser -COOH ou -CH2OH.

Em um aspecto alternativo, a invenção provê o uso de uma composição farmacêutica ou nutricional de acordo com a 10 invenção para a preparação de um medicamento para tratar um distúrbio biliar ou estimular fluxo de bile.

Em um aspecto alternativo, a invenção provê um artigo de fabricação compreendendo um composto de acordo com a fórmula I:

ou um derivado do mesmo, juntamente com instruções para uso no tratamento de um distúrbio biliar ou estimular fluxo de bile, em que qualquer um de R1 a R9 pode ser -H ou -OH, com 5 a condição de que pelo menos quatro de R1 a R9 são -OH; e R10 pode ser -COOH ou -CH2OH.

Em modalidades alternativas, o composto compreende uma hidrofilicidade maior do que aquela de colato.

Em modalidades alternativas, o composto é selecionado 10 do grupo que consiste de um ácido biliar tetraidroxilado, um ácido biliar pentaidroxilado ou um derivado do mesmo. O ácido biliar tetra-hidroxilado pode ser um ácido 3,6,7,12-tetraidroxicolanóico, um ácido 3,4,7,12- tetraidroxicolanóico, um ácido 1,3,7,12- 15 tetraidroxicolanóico, um ácido 2,3,7,12- tetraidroxicolanóico, um ácido 3,7,16,24- tetraidroxicolanóico ou um ácido 3,7,15,24- tetraidroxicolanóico ou um derivado do mesmo.

O ácido 3,6,7,12-tetraidroxicolanóico pode ser um ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colano-24-óico, ácido 3a,6e,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3α,6α,7β, 12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3α,6β,7β,12α- tetraidroxi-5e-colan-24-óico, um ácido 3α,6α,7α,12β- tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3α,6β,7α,12β- tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ou um ácido 3α,6β,7β,12β- tetraidroxi-5e-colan-24-óico ou um derivado do mesmo.

O ácido 3,6,7,12-tetraidroxicolanoico pode ser um ácido 3e,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3β,6β,7α,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3β,6α,7β,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3e,6e,7e,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, um ácido 3β,6α,7α,12e-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 3e,6e,7a,12e-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ou um ácido 3e,6e,7e,12e-tetraidroxi-5e-colan-24-óico ou um derivado do mesmo. O ácido 2,3,7,12-tetraidroxicolanoico pode ser um ácido 2a,3a,7a,12a-tetraidroxi-5e-ácido colanóico ou um derivado do mesmo.

O ácido 3,4,7,12-tetraidroxicolanóico pode ser ácido 3α, 4α,7α,12a-tetraidroxi-5e—ácido colanóico ou um derivado do mesmo.

Em modalidades alternativas, o composto tem uma afinidade preferencial para MDR1 quando comparado com BSEP, por exemplo, o composto tem uma afinidade elevada para MDR1.

Em modalidades alternativas, o composto pode ser um composto conjugado, por exemplo, um conjugado de taurina ou glicina, por exemplo, conjugado de taurila ou glicila, de um ácido 3a,6e,7a,12e-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, um conjugado de taurila ou glicila de um ácido 3α,6β,7β,12β- tetraidroxi-5e-colan-24-óico, um conjugado de taurila de um ácido 3a,6e,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico ou conjugado de taurila de um ácido 3α,6β,7β,12α-tetraidroxi- 5e-colan-24-óico.

Em modalidades alternativas, o método pode compreender administrar pelo menos outro agente terapêutico ou profilático, por exemplo, um agente tendo afinidade preferencial para BSEP, ou pelo menos outro suplemento nutricional. O agente terapêut ico ou profilático ou suplemento nutricional pode ser ursodesoxicolato ou uma variante ou derivado do mesmo.

Em modalidades alternativas, o distúrbio biliar pode ser estenose biliar benigna, cistos de doença pancreática benigna, diverticulite, fibrose hepática, dano hepático, pedras de duto de bile comum, pancreatite, câncer pancreático ou pseudocisto, câncer periampolar, carcinoma de duto biliar, colangite esclerosante primária, colangite autoimune, compressão de duto extrínseco (por exemplo, compressão devido a uma massa ou tumor em um órgão próximo), hepatite viral, sepse, abscesso bacteriano, uso de drogas, por exemplo, hepatotoxicidade idiossincrática induzida por droga, linfoma, tuberculose, carcinoma metastático, sarcoidose, amiloidose, alimentação intravenosa, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hepatite alcoólica com ou sem cirrose, esteatoepatite não alcoólica, doença não alcoólica de fígado graxo, hepatite crônica com ou sem cirrose, colestasia intra-hepática de gravidez, calculose biliar, discinesia biliar, síndrome de Sjogren, doença de Wilson, isquemia, toxinas, álcool, falência aguda hepática, deficiência de α1-anti-tripsina, PFIC2, colestasia intra- hepática recorrente benigna, carcinoma hepatocelular, hipertensão portal, doença veno-oclusiva, ou trombose de veia hepática. O distúrbio biliar pode se originar de, ou potencialmente se originar de colestasia.

Em modalidades alternativas, o sujeito pode ser um ser humano.

Esse sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 mostra o fenótipo colestático dos camundongos nocaute (ko) triplos (mdr1 1/mdrl 1a-/-/ 1b-/-) : a) uma visão de abdomens que mostram aumento do fígado de um camundongo TKO em comparação com b) um camundongo do tipo selvagem; c) fibrose periportal nos fígados de um camundongo TKO macho com dois meses de idade (coloração de Masson trichrome), 40x; d) alterações ultraestruturais em hepatócitos, mostrando lúmen canalicular dilatado, perda de microvilosidade (setas), e material biliar retido na forma de lamelas. A figura 2 mostra a taxa de sobrevivência (a) e alterações em peso corporal (b) dos camundongos “triplo nocaute” (bsep /mdrla /1b) após serem alimentados com 0,5% de ácido cólico (CA). A figura 3 mostra a geração de camundongos “triplo nocaute” (TKO) (bsep-/-/mdrla-/-/mdr1b-/-): a) Esquema de cruzamento para gerar camundongos TKO. Os camundongos duplo nocaute mdrla-/-/mdr1b-/- e bsep-/- foram utilizados para gerar os camundongos triplamente heterozigóticos bsep' /mdrla+/-/mdr1b+/- (100% da progênie são triplos heterozigotos). Os triplos heterozigotos foram utilizados para produzir camundongos bsep+/-/mdrla-/-/mdr1b-/- (aproximadamente 1/8 da progênie, uma vez que os genes mdrla e mdrlb em camundongos são estreitamente ligados), que foram então utilizados para gerar os homozigotos TKO (bsep-/-/mdrla-/-/mdr1b-/-) . b) Um resultado de seleção de PCR para os camundongos TKO. As raias de 1, 5 e 6 são camundongos triplo nocaute, em que somente baixas de alelos mutantes foram amplificados. A figura 4 mostra as alterações ultraestruturais em hepatócitos de um camundongo TKO (bsep-/-/mdrla-/-/mdrlb-/-) e um controle mdr1a-/-/1b-/- que não mostra anormalidade ultraestrutural no fígado . a) À esquerda, mostrando mitocôndria anormal de tamanho variável com cristas que são empurrados para um lado com pequenos ressaltos não cruzando a linha média. Sua matriz mitocondrial é homogênea e grânulos estão ausentes. À direita, essa imagem mostra grandes números de vesículas Golgi hipertrofiadas cheias de material denso (seta). b) O fígado de um camundongo mdrla-/- /1b-/- mostrando nenhuma anormalidade ultraestrutural. A seta aponta para um canalículo normal. A figura 5 mostra: a) expressão relativa de mRNA de alguns dos principais genes expressos no fígado, em camundongos TKO, bsep-/- e do tipo selvagem como determinada por PCR em tempo real semi-quantitativo. Os níveis de mRNA foram normalizados contra aqueles de proteína ribossomal S15. O nível de mRNA do tipo selvagem fêmea foi ajustado em 1. Todos os números são expressos como uma razão de mRNA do tipo selvagem fêmea, média ± desvio padrão (n=4) (16). b) O maior transcrito Mdr1 (Abcb1b) alternativamente processado nos camundongos TKO. Esse transcrito tem uma deleção de exon 4 e resulta na tradução de 38 aminoácidos originais seguido por um deslocamento de quadro (frame-shift), 6 novos aminoácidos e um códon de parada prematuro. c) O menor transcrito Mdr1 (Abcb1b) em camundongos TKO. Esse transcrito tem uma deleção de exons 4, 5 e 6 que resulta na tradução de 38 aminoácidos originais seguido por um deslocamento de quadro, 12 novos aminoácidos e um códon de parada prematuro. A figura 6 mostra imagens de microscopia confocal histoquímica para MDR1 ou BSEP. A expressão MDR1 apresenta uma distribuição fortemente canalicular. Os painéis à esquerda são os controles, uma biópsia de fígado de uma criança com acidemia orgânica que não teve icterícia ou colestasia. Os painéis à direita são de uma amostra de biópsia de fígado de um paciente PFIC2. As figuras 7A-B mostram que ácido 3α,6α,7α,12α- tetraidroxi-5β-colan-24-0ico estimula a taxa de fluxo de bile (BFR) em camundongos do tipo selvagem. (A) BFR como uma função de peso corporal em camundongos após infusão de ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico (6α,7α THBA). (B) BFR como uma função de peso corporal em camundongos após infusão de ácido cólico (CA) (ácido 3α,7α,12a-triidroxi-5B—colan-24-óico). As figuras 8A-B mostram perfis de HPLC (Cromatografia líquida de alta performance) de sal de bile na bile de um camundongo do tipo selvagem macho antes (A) e após (B) infusão de ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico (6α,7α THBA, 100 μmol/kg como uma função de peso corporal) . (C) mostra perfis HPLC de frações de bile coletadas de um camundongo do tipo selvagem antes (traço superior) e 2-4 minutos após (traço inferior), infusão (100 μmol/kg) de ácido cólico (ácido 3α,7α,12α-triidroxi-5B— colan-24-óico). As amostras de bile foram coletadas de um camundongo do tipo selvagem por canulação de duto biliar. Volumes iguais de bile foram carregados. A figura 9 mostra etapas sintéticas para a produção de ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colanóico (6α,7α THBA) de ácido cólico. A figura 10 mostra etapas sintéticas para a produção de ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5B—colanóico conjugado com taurina. A figura 11 mostra espectro 1H-RMN de ácido 3α,6α,7α, 12a-tetraidroxi-5B—colanóico conjugado com taurina (18), produzido pelo método mostrado na figura 10. A figura 12 A-C mostra indução de taxa de fluxo de bile (BFR) por THBA em camundongos do tipo selvagem. (A) BFR como uma função de peso corporal (BW) antes e após a infusão de ácido 3α,6β,7α,12α-tetraidroxi-5β-colan-24- óico. Ácido 3a,6e,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico (6β, 7α THBA) de 65 (o, círculo aberto). 250 (*, estrela), 350 (▲, triângulo sólido) e 400 (■, quadrado sólido) μmol/kg BW. (B) BFR como uma função de peso corporal antes e após a infusão de ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico (6α,7α THBA) de 65 (o, círculo aberto) e 200 (■, quadrado sólido) μmol/kg BW. (C) BFR como uma função de peso corporal antes e após a infusão de 65 μmol/kg de peso corporal de 6β, 7α THBA (■, quadrado sólido), 6α,7β THBA (▲, triângulo sólido) e ácido ursodesoxicólico (UDC) (o, círculo aberto). Os resultados são representados como a média ± desvio padrão de três camundongos. UDC em 65 μmol/kg de peso corporal é a dose tolerada máxima (MTD) nos camundongos .

Descrição detalhada

A presente invenção provê, em parte, ácidos biliares poliidroxilados como agentes de terapia de sal de bile para promover ou aperfeiçoar a secreção biliar em sujeitos com distúrbios biliares. Os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados em combinação com os compostos existentes, como ursodesoxicolato ou uma variante ou derivado do mesmo, para melhorar a função hepática e/ou melhorar um distúrbio de bile. Os ácidos biliares poliidroxilados da invenção são coleréticos (possuem propriedades de estimular fluxo de bile) quando administrados a um sujeito, por exemplo, uma criança esperando transplante de fígado. Em modalidades alternativas, a invenção provê ácidos de bile poliidroxilado para estimular fluxo de bile em qualquer sujeito, por exemplo, um sujeito não diagnosticado com um distúrbio biliar. Por “estimular fluxo de bile” quer se dizer aumentar o fluxo de bile em um sujeito relativo a um padrão (por exemplo, níveis padrão de ácido biliar em um organismo), ou relativo ao nível de bile medido no sujeito antes da administração de um ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção. O aumento pode ser uma alteração de qualquer valor inteiro entre 5% e 95%, ou entre 10% e 90%, ou entre 30% e 60%, ou pode ser acima de 100%. Como utilizado aqui, um sujeito pode ser um ser humano, primata não humano, rato, camundongo, vaca, cavalo, porco, carneiro, cabra, cão, gato, etc. o sujeito pode ser um paciente clínico, um voluntário de experimento clínico, um animal experimental, etc. o sujeito pode ser suspeito de ter ou estar em risco de ter um distúrbio biliar, ser diagnosticado com um distúrbio biliar, ou ser confirmado não ter um distúrbio biliar. Métodos de diagnóstico para distúrbios biliares e métodos para medição de fluxo de bile, bem como a delineação clínica de diagnósticos de distúrbio biliar, são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Distúrbios biliares

Distúrbios biliares incluem qualquer distúrbio ou condição que pode ser melhorada, tratada ou evitada pela administração de um ácido biliar poliidroxilado. Distúrbios biliares exemplares podem incluir, sem limitação, deficiência de bile, toxicidade de bile, distúrbios digestivos, função hepática prejudicada, colestasia, hipertensão portal, etc.

Colestasia se refere a uma condição na qual o fluxo de bile a partir do fígado é reduzido ou bloqueado, ou na qual haja falha em fluxo de bile. Falhas de fluxo de bile podem originar em qualquer lugar no sistema biliar e hepático. Em geral, colestasia pode ser colestasia extra-hepática, que ocorre fora das células de fígado, ou pode ser colestasia intra-hepática que ocorre dentro das células de fígado.

Colestasia extra-hepática pode resultar de estenose biliar benigna, cistos de doença pancreática benigna, diverticulite, dano hepático, pedras de duto biliar comum, pancreatite, câncer pancreático ou pseudocisto, câncer periampolar, colangite esclerosante primária de carcinoma de duto biliar, compressão de duto extrínseco, por exemplo, compressão devido a uma massa ou tumor em um órgão próximo.

Colestasia intra-hepática pode ser causada por hepatite viral incluindo, porém não limitado a: hepatite B e C, sepse, abscesso bacteriano, drogas, por exemplo, hepatotoxicidade idiossincrática induzida por droga, linfoma, tuberculose, carcinoma metastático, sarcoidose, amiloidose, alimentação intravenosa, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hepatite alcoólica com ou sem cirrose, hepatite crônica com ou sem cirrose, gravidez, síndrome de Sjogren, etc. colestasia induzida por droga é o bloqueio do fluxo de bile a partir do fígado causado por medicação e pode ser causada por: sais de ouro, nitrofurantoína, estereóides anabólicos, contraceptivos orais, clorpromazina, proclorperazina, sulindac, cimetidina, eritromicina, tobutamida, imipramina, ampicilina e outros antibióticos à base de penicilina, etc.. Colestasia induzida por droga e hepatotoxicidade são obstáculos comuns à terapia com droga na clínica e são o principal problema para desenvolvimento de drogas e para novas aplicações de drogas aprovadas. Colestasia induzida por droga também responde por 2-5% dos pacientes hospitalizados com icterícia, ~10% de todos os casos de hepatite aguda, e mais de 50% de insuficiência hepática aguda.

Colestasia também pode resultar de doença hepática colestática hereditária, de colestasia induzida por droga que se origina da atividade inibidora de BSEP de certas drogas, e reações hepatotóxicas agudas ocasionada por drogas e condições inflamatórias que impactam a função de fígado.

Hipertensão portal se refere a um distúrbio que se manifesta como pressão aumentada na veia portal, que é a veia que conduz sangue do intestino para o fígado. A pressão aumentada na veia portal pode ser devido a uma variedade de causas, incluindo inflamação, fibrose, fistula arteriovenosa esplênica, trombose de veia portal ou esplênica, esplenomegalia maciça, sarcoidose, esquistossomose, hiperplasia regenerativa nodular, cirrose biliar primária, hepatite, doença auto-imune, etc.

Um distúrbio biliar de acordo com a invenção é qualquer distúrbio que se origina ou potencialmente se origina de colestasia, hipertensão portal, ou qualquer distúrbio beneficiado pela administração de um ácido biliar poliidroxilado como descrito aqui. Distúrbios biliares incluem, sem limitação, estenose biliar benigna, cistos de doença pancreática benigna, diverticulite, fibrose hepática, dano hepático, pedras de duto biliar comum, pancreatite, câncer pancreático ou pseudocisto, câncer periampolar, carcinoma de duto de bile, colangite esclerosante primária, colangite auto-imune, compressão de duto extrínseco (por exemplo, compressão devido a uma massa ou tumor em um órgão próximo, hepatite viral (por exemplo, hepatite A, B, C, D, E, herpes simplex, citomegalovirus, Epstein-Barr, adenovírus), sepse, abscesso bacteriano, uso de drogas, por exemplo, hepatotoxicidade idiossincrática induzida por droga, linfoma, tuberculose, carcinoma metastático, sarcoidose, amiloidose, alimentação intravenosa, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hepatite alcoólica com ou sem cirrose, esteato-hepatite não alcoólica, doença de fígado graxo não alcoólico, hepatite crônica com ou sem cirrose, colestasia intra-hepática de gravidez, calculose biliar, discinesia biliar, síndrome de Sjogren, doença de Wilson, isquemia, toxinas, álcool, insuficiência hepática aguda, deficiência de α1-antitripsina, PFIC2, colestasia intra- hepática recorrente benigna (BRIC), carcinoma hepatocelular (HCC), hipertensão portal, doença veno-oclusiva, trombose de veia hepática, etc.

Ácidos biliares poliidroxilados e derivados dos mesmos

Ácidos biliares são compostos anfipáticos derivados de colesterol e são uma subclasse de esteróides. Ácidos biliares e alcoóis de bile são esteróides cuja estrutura é relacionada à colano ou colestano; por conseguinte, ácidos biliares e alcoóis de bile podem ser denominados colanóides (51) . O termo “ácido biliar” é um termo genérico para moléculas de colanóide tendo um grupo carboxila e não indica um estado de ionização.

O termo “sal de bile” pode ser utilizado para um sal no qual o anion é um ácido biliar conjugado, um ácido biliar não conjugado, ou um conjugado de um álcool de bile, ou pode ser utilizado como um termo genérico para incluir tanto ácidos biliares conjugados como conjugados de álcool de bile que ocorrem na natureza como anions solúveis em água (51) . Por exemplo, os sais de bile podem ser ácidos biliares conjugados com glicina ou taurina como sais de sódio.

O sistema de numeração para os átomos de carbono do esqueleto de ácido biliar, como utilizado aqui, é como a

Ácidos biliares C24 são denominados ácidos colanóicos ou colanoatos, enquanto ácidos biliares C27 são denominados ácidos colestânicos ou colestanoatos. Em geral, a configuração da cadeia lateral é 17β, com um hidrogênio 5β (junção de anel A/B em configuração cis) . Ácidos biliares “Alo” são ácidos biliares com um hidrogênio 5α (51).

Ácidos biliares podem ser poliidroxilados. Um composto de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção inclui sem limitação ácidos biliares tetraidroxilados, ácidos biliares pentaidroxilados, ácidos biliares 15 hexaidroxilados, etc., até o nível máximo de hidroxilação possível.

Em algumas modalidades, um ácido biliar poliidroxilado pode ser um composto como representado na fórmula I:

ou um derivado do mesmo, no qual qualquer um de R1 a R9 5 pode ser -H ou -OH, com a condição de que pelo menos quatro de R1 a R9 são -OH; e R10 pode ser -COOH ou -CH2OH.

Em algumas modalidades qualquer um de R1 a R9 pode ser -H, -OH, -F, -Cl, -Br, alquila (por exemplo, -CH3, -CH2- CH3) , -SO4, ou glicose com a condição de que pelo menos 10 quatro de R1 a R9 são -OH; e R10 pode ser -COOH ou -CH2OH.

Em algumas modalidades, ácidos biliares de acordo com a invenção são pelo menos tetraidroxilados, isto é, têm quatro ou mais do que quatro grupos hidroxila. Em algumas modalidades, os grupos hidroxila estão presentes no núcleo 15 esteróide. Em algumas modalidades, os grupos hidroxila podem estar presentes também na cadeia lateral de alquila.

Um ácido biliar tetraidroxilado de acordo com a invenção inclui, sem limitação, um ácido 3,6,7,12- tetraidroxicolanóico; um ácido 3,4,7, 12- tetraidroxicolanóico; um ácido 1,2,7, 12- tetraidroxicolanóico; um ácido 1,3,7,12- tetraidroxicolanóico; um ácido 2,3,7,12- tetraidroxicolanóico; um ácido 3,7,16,24- tetraidroxicolanóico; ou um 3,7, 15,24-ácido tetraidroxicolanóico, ou derivados dos mesmos.

Um ácido 3,6,7,12-tetraidroxicolanóico de acordo com a invenção inclui, sem limitação, um ácido 3α,6α,7α,12α- tetrahidroxi-5β-colan-24-oic; um ácido 3α,6β,7α,12α- tetrahidroxi-5β-colan-24-oic; um ácido 3α,6α,7β,12α- tetrahidroxi-5β-colan-24-oic; um ácido 3α,6β,7β,12α- tetrahidroxi-5β-colan-24-oic; um ácido 3α,6α,7α,12β- tetrahidroxi-5β-colan-24- oic; um ácido 3α,6β,7α,12β- tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, ou um ácido 3α,6β,7β,12β- tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, ou derivados dos mesmos.

Um ácido 3,4,7,12-tetraidroxicolanóico de acordo com a invenção inclui, sem limitação, um ácido 3α,4β,7α,12α- tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, um ácido 3α,4α,7α,12α- tetrahidroxi-5β-colan0ico, ou derivados dos mesmos.

Um ácido 1,3,7,12-tetraidroxicolanóico de acordo com a invenção inclui, sem limitação, um ácido 1β,3α,7α,12α- tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, ou derivados dos mesmos.

Um ácido 2,3,7,12-tetraidroxicolanóico de acordo com a invenção inclui, sem limitação, um ácido 2β,3α,7α,12α- tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, um ácido 2α,3α,7α,12α- tetrahidroxi-5e-colanóico, ou derivados dos mesmos.

Um ácido 3,7,16,24-tetraidroxicolanóico de acordo com a invenção inclui, sem limitação, um 3α,7α,16α,24 tetrahidroxi-5β-colane ou derivados dos mesmos.

Um ácido 3,7,15,24-tetraidroxicolanóico, de acordo com a invenção inclui sem limitação, um 3α,7β,15α,24 tetrahidroxi-5β-colano ou derivados dos mesmos.

Em modalidades alternativas, compostos de ácido biliar poliidroxilados de acordo com a invenção incluem, sem limitação, um ácido 3α,7α,12α,24 tetrahidroxi-5β-26-oic; um 3α,7α,12α,24 tetrahidroxi-5β-Colest-25-ene; um 3α,7α,24,26 tetraidroxi-5β-colestane; ou um 3α,7α,12α,24,26 pentaidroxi-5β-colestane ou derivados dos mesmos.

Em modalidades alternativas, compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção excluem especificamente ácidos biliares beta-muricolato e triidróxi. Em modalidades alternativas, compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção são mais hidrofílicos do que colato (23, 24) como medido, por exemplo, pela distribuição e configurações de resíduos polares [OH-] e apolares [H+] ao longo do anel esteróide, ou por tempos de retenção em HPLC de fase inversa (60). Em algumas modalidades, compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção têm uma hidrofobicidade menor do que 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25, 0,20, 0,15, 0,10, ou 0,05 em relação à taurocolato (que é atribuído um valor de 1,0; vide, por exemplo, Asamoto e cols. (21)).

Em algumas modalidades, compostos de acido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção têm uma afinidade preferencial para MDR1 quando comparado com BSEP. Em algumas modalidades, compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção tem uma afinidade elevada para MDR1, por exemplo, um Km mais baixo do que 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 100 μM ou mais.

O termo “ácido biliar conjugado” pode ser utilizado para indicar um ácido biliar conjugado com um grupo que fornece hidrofilicidade adicional ou carga à molécula. Em modalidades alternativas, os compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção incluem conjugados de taurina e/ou glicina. Em modalidades alternativas, os compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção incluem conjugados com quaisquer outros aminoácidos apropriados. Em modalidades alternativas, os compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção incluem conjugados com sulfato, fosfato, coenzima A, glucuronato, glicose, xilose, e outros açucares, N- acetil glucosamina, etc.. Por exemplo, compostos poliidroxilados conjugados de acordo com a invenção incluem, sem limitação, conjugados de taurila ou glicila de ácidos 3α, 6β,7α,12e-tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, conjugados de taurila ou glicila de ácidos 3α,6β,7β,12β- tetraidroxi-5p-colan-24-óico, conjugados de taurila de ácidos 3α,6β,7α,12a-tetrahidroxi-5e-colan-24-óico, conjugados de taurila de ácidos 3α,6β,7β,12α-tetrahidroxi- 5e-colan-24-óico, ácido etano-sulfônico, 2-[(3,6,7,12- tetrahidroxi-24-oxocolan-24-il)amino], por exemplo, ácido etanosulfônico, 2-[[(3α,5β,6α,7α,12α)-3,6,7,12- (3,6,7,12-tetrahidroxi-24-oxocolan-24-il) por exemplo, Glicina, N-[(3α,5β,6β,7β,12α)-3,6,7,12-tetrahidroxi-24- oxocolan-24-il], Glicina, N-[(3α,5β,6β,7α,12α)-3,6,7,l2- tetrahidroxi-24-oxocolan-24-il], Glicina, N- [(3a,5β,6a,7β,12a)-3,6,7,12-tetrahidroxi-24-oxocolan-24- il], Glicina, N-[(3α,5β,6α,7α,12α)-3,6,7,12-tetrahidroxi- 24-oxocolan-24-il], etc.

Os compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção incluem isômeros, por exemplo, estereoisômeros. Por exemplo, ácido tetraidroxicolanóico hidroxi 5α e 3β são incluídos, como são quaisquer configurações estereoisoméricas e combinações das mesmas.

Os compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção incluem derivados fisiológica ou farmaceuticamente aceitáveis, como sais, ésteres, éteres de enol, ésteres de enol, solvatos, hidratos e pró- medicamentos dos compostos descritos aqui. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a, sais de amina, tais como, porém não limitados a, N,N’-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, amônia, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodiamina, N-metilglucamina, procaína, N- benzilfenetilamina, 1-para-clorobenzil-2-pirrolidin-1’-il metilbenzimidazol, dietilamina e outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroxi metil)aminometano; sais de metal alcalino, tais como, porém não limitados a, lítio, potássio e sódio; sais de metal alcalino terroso, tais como, porém não limitados a, bário, cálcio e magnésio; sais de metal de transição, tais como, porém não limitados a, zinco, alumínio, e outros sais de metal, tais como, porém não limitados a, fosfato de hidrogênio de sódio e fosfato de dissódio; e, também incluindo, porém não limitados a, sais de ácidos minerais, tais como porém não limitados a, cloretos e sulfatos; e sais de ácidos orgânicos, tais como porém não limitados a, acetatos, lactatos, malatos, tartratos, citratos, ascorbatos, succinatos, butiratos, valeratos e fumaratos.

Os compostos e sais dos mesmos da presente invenção e para uso nessa invenção são genericamente fornecidos em forma substancialmente purificada. Um composto ou sal (se de ocorrência natural) é “substancialmente puro” ou “isolado” quando é separado dos componentes que naturalmente acompanham o mesmo (por exemplo, células de um organismo fonte ou tecido). Um composto pode ser substancialmente puro ou isolado quando é substancialmente livre de contaminantes celulares, isto é, que está presente ex vivo e em uma concentração maior do que aquela do composto em um organismo fonte, tecido ou outra fonte natural. Tipicamente, um composto é substancialmente puro ou isolado quando é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60%, mais genericamente 70%, 75%, 80%, ou 85%, ou acima de 90%, 95%, ou 99% em peso, do material total em uma amostra. Desse modo, por exemplo, um composto que é quimicamente sintetizado será genericamente substancialmente isento de seus componentes naturalmente associados. Um composto substancialmente puro pode ser obtido, por exemplo, por extração de uma fonte natural ou por síntese química. Um composto substancialmente puro pode incluir estereoisômeros ou misturas hidroxiladas diferencialmente. Pureza pode ser medida utilizando qualquer método apropriado como espectrometria de massa ou cromatografia de coluna, gás ou líquida.

Em uma modalidade alternativa da invenção, uma composição compreendendo uma mistura racêmica de um ácido biliar tetraidroxilado é fornecida. A mistura racêmica pode ser produzida como um resultado da síntese química do ácido biliar tetraidroxilado; alternativamente, dois ou mais enantiômeros estereoquimicamente puros podem ser combinados. Em outra modalidade, a composição pode compreender dois ou mais ácidos biliares tetraidroxilados.

Preparação de ácidos biliares poliidroxilados

Os compostos de acordo com a invenção ou para uso de acordo com a invenção, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis ou derivados dos mesmos, podem ser obtidos por síntese fazendo uso de procedimentos comuns como exemplificado aqui ou conhecido na técnica. Alguns compostos que podem ser utilizados de acordo com a invenção podem ser obtidos de fontes naturais. Por exemplo, compostos de ácido biliar poliidroxilado podem ser preparados em parte ou totalmente de fontes naturais, por exemplo, por fracionar extratos biológicos (por exemplo, de camundongos KO bsep). Ácidos biliares podem ser obtidos de camundongos KO bsep, por exemplo, utilizando canulação de duto biliar para coletar aproximadamente 10-20 ml de bile de 50-100 camundongos KO bsep. HPLC pode ser utilizado para isolar aproximadamente 10-20 μmol (5-10 mg) de ácido biliar tetraidroxilado. Em algumas modalidades, compostos de ácido biliar poliidroxilado de acordo com a invenção podem ser preparados por síntese total. Tais compostos sintéticos podem, opcionalmente, ser marcados ou derivatizados para fins analíticos ou de desenvolvimento de droga.

Os compostos podem ser sintetizados utilizando técnicas padrão como aquelas descritas em Tohma e cols., 1985 (52); lida e cols., 1991a (53); lida e cols., 1991b (54); Aggarwal e cols., 1992 (55); lida e cols., 1993 (56);

Kurosawa e cols., 1995 (57); Kurosawa e cols., 1996 (58); Iida e cols., 2002 (59); Tserng KY and Klein PD (1977), Leppik RA (1983), ou Iida T. e cols. (1990) etc., todas as quais são especificamente incorporados a título de referência. Por exemplo, ácidos biliares tetraidroxi podem ser preparados como indicado em Tohma e cols., 1985 (52); Iida e cols., 1991b (54); Aggarwal e cols., 1992 (55); Iida e cols., 1993 (56); Kurosawa e cols., 1996 (58); Iida e cols., 2002 (59); ácidos biliares pentaidroxi podem ser preparados como indicado em Kurosawa e cols., 1996 (58).

Composições de suplemento farmacêutico ou nutricional, dosagens e administração de ácidos biliares poli- hidroxilados

Os compostos de ácido biliar poliidroxilado da invenção podem ser fornecidos individualmente ou em combinação com outros compostos (por exemplo, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, peptídeos ou análogos de peptídeo), na presença de um lipossoma, um adjuvante, ou qualquer veículo farmacêutica ou fisiologicamente aceitável, em uma forma apropriada para administração a seres humanos ou animais. Se desejado, tratamento com um composto de acordo com a invenção pode ser combinado com terapias existentes e mais tradicionais para distúrbios biliares ou distúrbios resultando em, ou potencialmente resultando em, hepatotoxicidade, ou com suplementos nutricionais existentes para estimular fluxo de bile. Em algumas modalidades, ácidos biliares poliidroxilados de acordo com a invenção são administrados a sujeitos não diagnosticados com um distúrbio biliar (por exemplo, um sujeito normal) para estimular fluxo de bile. Em algumas modalidades, ácidos biliares poliidroxilados de acordo com a invenção são administrados sob condições onde BSEP é inibido e onde o agente terapêutico aprovado para colestasia, ursodesoxicolato, é ineficaz. Em algumas modalidades, ácidos biliares poliidroxilados de acordo com a invenção são administrados juntamente com ursodesoxicolato ou uma variante ou derivado da mesma (por exemplo, ursodesoxicolato sulfatado, nitrodesoxicolato, taurodesoxicolato, etc.), rifampicina, ou qualquer composto útil para tratar colestasia ou hipertensão portal ou para estimular fluxo de bile.

A prática de formulação de suplemento nutricional ou farmacêutico convencional pode ser empregada para fornecer formulações ou composições apropriadas para administrar os compostos a pacientes que sofrem de ou pré-sintomáticos para colestasia, ou a sujeitos normais para estimular fluxo de bile. Qualquer via de administração adequada pode ser intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracraniana, intra-orbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intra-espinhal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerossol ou oral. Formulações terapêuticas podem estar na forma de soluções ou suspensões líquidas; para administração oral, formulações podem estar na forma de comprimidos ou cápsulas; e para formulações intranasais, na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis.

Métodos bem conhecidos na técnica para fazer formulações são encontrados, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (19a edição), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Formulações para administração parenteral podem, por exemplo, conter excipientes, água estéril, ou solução salina, polialquileno glicóis como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, ou naftalenos hidrogenados. Polímero de lactide biodegradável, biocompatível, copolímero de glicolide/lactide, ou copolímeros de polioxipropileno- polioxietileno podem ser utilizados para controlar a liberação dos compostos. Outros sistemas de distribuição parenteral potencialmente úteis para compostos moduladores incluem partículas de copolímero de acetato de vinila- etileno, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, e lipossomas. Formulações para inalação podem conter excipientes, por exemplo, lactose, ou podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo, éter de polioxietileno-9-laurila, glicocolato e desoxicolato, ou podem ser soluções oleosas para administração na forma de gotas nasais ou como gel.

Para composições terapêuticas ou profiláticas, os compostos são administrados a um sujeito em uma quantidade suficiente para parar ou diminuir colestasia ou manter ou aumentar fluxo de bile ou para melhorar hipertensão portal. Para suplementos nutricionais, os compostos são administrados a um sujeito em uma quantidade suficiente para estimular fluxo de bile.

Como discutido aqui, uma suprarregulação significativa de expressão de MDR1 foi encontrada em fígados de pacientes PFIC, indicando que MDRl pode ser alvejado em terapia de droga para doenças colestáticas tais como PFIC2 e outros distúrbios biliares indicados aqui. BSEP e MDRl são locais de polimorfismo significativos em populações humanas, e algumas variantes BSEP estão associadas à suscetibilidade a doenças de fígado. Por exemplo, o polimorfismo V444A em BSEP está presente em aproximadamente metade da população e é associado a um risco aumentado em ~60% de colestasia intra-hepática de gravidez. Outras formas de distúrbios biliares manifestando expressão elevada de MDRl também podem ser tratadas utilizando os compostos de acordo com a invenção. Os compostos de acordo com a invenção também podem fornecer benefício terapêutico a pacientes que sofrem de doença de fígado colestático herdado, de colestasia induzida por droga que se origina da atividade inibidora de BSEP de certas drogas, ou de outros distúrbios biliares, e pode ajudar a aliviar reações hepatotóxicas agudas ocasionadas por drogas e condições inflamatórias que impactam a função biliar.

Uma “quantidade eficaz” de um composto de acordo com a invenção inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz ou uma quantidade nutricionalmente eficaz. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado, como fluxo aumentado de bile, alívio de icterícia, ou função hepática melhorada como indicado por normalização de indicadores bioquímicos de fígado de soro, como os níveis de bilirrubinas, ALP (fosfatase alcalina), ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), Y-GT (gama glutamil transpeptidase), etc. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do composto eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ótima. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do composto são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático desejado, como fluxo biliar aumentado ou funções hepáticas melhoradas como indicado por indicadores bioquímicos de fígado, fluxo biliar aumentado, alívio de icterícia, ou funções hepáticas melhoradas como indicado por normalização de indicadores bioquímicos de fígado de soro, como os níveis de bilirrubinas, ALP (fosfatase alcalina), ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), Y-GT (gama glutamil transpeptidase), etc. Tipicamente, uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes de ou em um estágio inicial da doença, de modo que uma quantidade profilaticamente eficaz possa ser menor do que uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma faixa exemplar para quantidades terapêutica ou profilaticamente eficazes de um composto pode ser 5-50 mg/dia/kg de peso corporal do sujeito,por exemplo, um ser humano. Uma “quantidade nutricionalmente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários para obter o resultado desejado, como fluxo biliar aumentado ou funções hepáticas melhoradas como indicado por indicadores bioquímicos de fígado.

Deve ser observado que valores de dosagem podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Para qualquer sujeito específico, regimes de dosagem específicos podem ser ajustados com o passar do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições. Faixas de dosagem expostas aqui são exemplares somente e não limitam as faixas de dosagem que podem ser selecionadas por médicos. A quantidade de composto ativo na composição pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ótima. Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Pode ser vantajoso formular composições parentais em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.

No caso de formulações de vacina, uma quantidade imunogenicamente eficaz de um composto da invenção pode ser fornecida, individualmente ou em combinação com outros compostos, com um adjuvante, por exemplo, adjuvante incompleto de Freund ou hidróxido de alumínio. O composto pode ser também ligado a uma molécula portadora, como albumina de soro bovino ou hemocianina de lapa californiana para aumentar a imunogenicidade.

Para suplementos nutricionais, pelo menos um aditivo incluindo um listado abaixo, pode ser incluído para consumo com o suplemento nutricional da invenção e pode ter, por exemplo, propriedades antioxidantes, dispersantes, antimicrobianas ou de solubilização. Um antioxidante apropriado é, por exemplo, vitamina C, vitamina E ou extrato de alecrim. Um dispersante apropriado é, por exemplo, lecitina, um poliglicosídeo de alquila, polisorbato 80 ou lauril sulfato de sódio. Um antimicrobiano apropriado é, por exemplo, sulfito de sódio ou benzoato de sódio. Um agente de solubilização apropriado é, por exemplo, um óleo vegetal como óleo de girassol, óleo de coco, e similar ou mono-, di- ou tri-glicerídeos. Aditivos incluem vitaminas como vitamina A (retinol, palmitato de retinila ou acetato de retinol), vitamina B1 (tiamina, cloridrato de tiamina ou mononitrato de tiamina), vitamina B2 (roboflavina), vitamina B3 (niacina, ácido nicotínico ou niacinamida), vitamina B5 (ácido pantotênico, pantotenado de cálcio, d-pantenol ou d-pantotenato de cálcio), vitamina B6 (piridoxina, piridoxal, piridoxamina ou cloridrato de piridoxina), vitamina B12 (cobalamina ou cianocobalamina), ácido fólico, folato, folacina, vitamina H (biotina), vitamina C (ácido ascórbico, ascorbato de sódio, ascorbato de cálcio ou palmitato de ascorbila), vitamina D (colecalciferol, calciferol ou ergocalciferol), vitamina E (d-alfa-tocoferol, d-beta-tocoferol, d-gama- tocoferol, d-delta-tocoferol ou acetato de d-alfa- tocoferila) e vitamina K (filoquinona ou fitonadiona). Outros aditivos incluem minerais, tais como boro (decahidrato de tetraborato de sódio), cálcio (carbonato de cálcio, caseinato de cálcio, citrato de cálcio, gluconato de cálcio, lactato de cálcio, fosfato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico ou fosfato de cálcio tribásico), cromo (cromo GTF de levedura, acetato de cromo, cloreto de cromo, tricloreto de cromo e picolinato de cromo) cobre (sulfato de cobre ou gluconato de cobre), flúor (fluoreto e fluoreto de cálcio), iodo (iodeto de potássio), ferro (fumarato ferroso, gluconato ferroso ou sulfato ferroso), magnésio (carbonato de magnésio, gluconato de magnésio, hidróxido de magnésio ou oxido de magnésio), manganês (gluconato de manganês e sulfato de manganês), molibdênio (molibdato de sódio), fósforo (fosfato de cálcio dibásico, fosfato de sódio), potássio (aspartato de potássio, citrato de potássio, cloreto de potássio ou gluconato de potássio), selênio (selenita de sódio ou selênio de levedura), silício (metassilicato de sódio), sódio (cloreto de sódio), estrôncio, vanádio (sulfato de vanádio) e zinco (acetato de zinco, citrato de zinco, gluconato de zinco ou sulfato de zinco). Outros aditivos incluem aminoácidos, peptídeos e moléculas relacionadas como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, carnitina, citrulina, cisteína, cistina, dimetilglicina, ácido gama-aminobutírico, ácido glutâmico, glutamina, glutationa, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, taurina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Outros aditivos incluem extratos de animal como óleo de fígado de bacalhau, lipídeos marinhos, cartilagem de tubarão, concha de ostra, pólen de abelha e sulfato d- glucosamina. Outros aditivos incluem ácidos graxos livres insaturados como ácido linoléico, araquidônico e linolênico, que pode estar em uma forma de éster (por exemplo, éster de etila ou triglicerídeo). Outros aditivos incluem ervas e extratos de plantas como alga marinha, pectina, espirulina, fibra, lecitina, óleo de germe de trigo, óleo de semente de açafrão, semente de cânhamo, prímula noturna, óleo de borragem, groselha preta, óleo de semente de abobora, extrato de uva, extrato de semente de uva, extrato de casca, extrato de casca de pinheiro, estrato de casca de pinheiro marítimo francês, extrato de muira puama, extrato de semente de erva-doce, extrato de dong quai, extrato de baga de árvore simples, alfafa, extrato de baga de palmetto saw, extratos de chá verde, angélica, erva de gato, pimenta de Caiena, confrei, alho, gengibre, ginseng, goldenseal, bagas de junípero, alcaçuz, azeite, salsa, hortelã-pimenta, extrato de alecrim, valeriana, salgueiro branco, labaçol amarelo e erva mate. Outros aditivos incluem enzimas como amilase, protease, lípase e papaína bem como substâncias diversas como menaquinona, colina (bitartrato de colina), inositol, carotenóides (beta-caroteno, alfa-caroteno, zeaxantina, criptoxantina ou luteína), ácido para-aminobenzóico, betaína HCl, ácido graxo livre de ômega-3 e seus ésteres, ácido tiótico (ácido alfa-lipóico), ácido 1,2-ditiolano-3- pentanóico, ácido 1,2-ditiolano-3-valérico, alquil poliglicosideos, polisorbato 80, lauril sulfato de sódio, flavonóides, flavanonas, flavonas, flavonóis, isoflavonas, proantocianidinas, proantocianidinas oligoméricos, aldeído de vitamina A, uma mistura dos componentes de vitamina A2, as vitaminas D (D1, D2, D3 e D4) que podem ser tratados como uma mistura, ascorbil palmitato e vitamina K2. O suplemento nutricional da invenção é tipicamente um óleo viscoso e pode ser adicionado a uma composição de gênero alimentício durante processamento do gênero alimentício. Tal composição de gênero alimentício é frequentemente mencionada como um alimento funcional, e pode ser qualquer alimento que tolerará as propriedades físico-químicas do suplemento nutricional, por exemplo, margarina, óleo de cozinha, manteiga ou maionese. Pode ser também embalado para consumo em softgel, cápsula, comprimido ou forma líquida. Pode ser fornecido em gomas de polissacarídeo cosmetíveis, por exemplo, carragenana, goma de alfarroba, guar, tragacanto, celulose e carboxi metil celulose. Em geral, compostos da invenção devem ser utilizados sem causar toxicidade substancial. Toxicidade dos compostos da invenção pode ser determinada utilizando técnicas padrão, por exemplo, por teste em culturas de células ou animais experimentais e determinar o índice terapêutico, isto é, a razão entre o LD50 (a dose letal para 50% da população) e o LD100 (a dose letal para 100% da população). Outros métodos que podem ser utilizados para determinar toxicidade dos compostos da invenção incluem, porém não estão limitados a, anormalidade histológica por coloração H&E, coloração de tricromo ou similar; alterações em taxa de fluxo de bile, e/ou depuração de outras substâncias de bile (por exemplo, como determinado por canulação de duto de bile); análise de HPLC, ensaios enzimáticos ou similares; alterações em perfis de indicador de fígado, por exemplo,nível de bilirrubinas, nível de ALP (fosfatase alcalina), nível de ALT (alanina aminotransferase), nível de ASTP (aspartato aminotransferase), nível de Y-GT (gama glutamil transpeptidase) ou similar. A dose tolerada máxima (MTD) é a dose regularmente administrada mais elevada de um composto ou composição que não causa toxicidade em excesso (por exemplo, não causa efeitos colaterais inaceitáveis) em um sujeito testado durante um período de tempo. O sujeito pode ser um ser humano, ou um animal, como um camundongo ou rato, por exemplo. A dose regularmente administrada pode ser uma dose diária, administrada como um bolus único; alternativamente a dose diária pode ser dividida em duas ou mais doses parciais de modo que o sujeito recebe a dose diária total com o passar do tempo. O período de tempo do estudo pode variar de alguns dias até alguns meses, por exemplo, 10, 20, 30, 60, 90 ou 120 dias, ou qualquer período entre os mesmos. Exemplos de toxicidade em excesso podem incluir, porém não são limitados a, morte apreciável de células ou disfunção de órgão, manifestações tóxicas que são previstas materialmente como reduzindo o tempo de vida do sujeito, ou 10% ou mais de retardação de ganho de peso corporal.

Em algumas circunstâncias, entretanto, como em condições de doença grave, pode ser necessário administrar excessos substanciais das composições. Em algumas modalidades, ácido 3α,6α,7α,12α-tetraidroxi-5β-colan-24- óico ou ácido 3a,6e,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico pode ter toxicidade mais baixa do que outros ácidos biliares, por exemplo ursodesoxicolato. Quando utilizado como um suplemento nutricional, a dose apropriada não deve resultar em toxicidade significativa.

Produtos industriais

Produtos industriais (ou artigos de fabricação) contendo material de embalagem, um composto ou composição de ácido biliar poliidroxilado, ou derivado farmacêutica ou fisiologicamente aceitável do mesmo, fornecido aqui, que é eficaz para estimular fluxo de bile ou para modular a atividade de MDR1, ou para tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas de colestasia ou distúrbios biliares nos quais MDR1 está envolvido, no material de embalagem, e um rótulo que indica que o composto ou composição, ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, é utilizado para estimular o fluxo de bile ou para modular a atividade de MDR1, ou para tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas de colestasia ou distúrbios biliares nos quais MDR1 esteja envolvido, são fornecidos.

Kits

Um kit compreendendo um composto de ácido biliar poliidroxilado, ou composição compreendendo um composto de ácido biliar poliidroxilado, ou derivados farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis dos mesmos fornecidos aqui, que é eficaz para estimular fluxo de bile ou para modular a atividade de MDR1, ou para tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas de colestasia ou distúrbios biliares nos quais MDR1 esteja envolvido, juntamente com instruções para uso do composto ou composição, é fornecido. O kit pode ser útil para tratar um distúrbio biliar em um sujeito, e as instruções podem incluir, por exemplo, concentrações de dose, intervalos de dose, métodos de administração preferidos ou similares.

Em outra modalidade, o kit pode ser útil para a preparação de um medicamento e as instruções podem compreender instruções para a preparação do medicamento. O kit pode compreender ainda instruções para uso do medicamento no tratamento para tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas de colestasia ou distúrbios biliares nos quais MDR1 esteja envolvido, e incluem, por exemplo, concentrações de dose, intervalos de dose, métodos de administração preferidos ou similares.

Em outra modalidade, o kit pode ser útil para a preparação de uma composição farmacêutica ou nutricional, e as instruções podem compreender instruções para a preparação da composição farmacêutica ou nutricional. O kit pode compreender ainda instruções para uso de composição farmacêutica ou nutricional para tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas de colestasia ou distúrbios biliares nos quais MDR1 esteja envolvido, e incluem, por exemplo, concentrações de dose, intervalos de dose, métodos de administração preferidos ou similares.

A presente invenção será adicionalmente ilustrada nos seguintes exemplos. Exemplo 1: modelo de animal para colestasia.

Métodos. Animais.

Como descrito anteriormente, os camundongos KO bsep em um background genético FVB/NJ (16) foram mantidos nesse laboratório e camundongos KO mdr1a/1b (22) eram de Taconic (Hudson, NY 12534). Os camundongos foram mantidos em um ciclo de claro e escuro de 12 horas, a 22°c, com acesso livre a alimento e água. Os camundongos foram alimentados com uma dieta normal exceto onde especificado de outro modo nos resultados. Os experimentos foram realizados utilizando protocolos aprovados pelo comitê de cuidados animais (Committee on Animal Care) da Universidade da Columbia Britânica (University of British Columbia), de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.

Microscopia eletrônica de transmissão e ótica.

Para microscopia ótica, os camundongos foram mortos com CO2 após 2-4 horas de jejum. Os fígados foram imediatamente removidos e transferidos para 10% de formalina tamponada neutra, seguido por seccionamento de parafinas e coloração de hematoxilina-eosina ou coloração de tricromo Masson (Wax-it Histology Services Inc., Vancouver). Para microscopia eletrônica de transmissão, os fígados foram fixos por perfusão in situ utilizando glutaraldeído gelado a 2,5% e mantidos em glutaraldeído a 2,5%. Desidratação, embebimento de plástico e seccionamento foram realizados como descrito anteriormente (25). Seções embebidas de plástico com um mícron de espessura foram também obtidas e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão Philips EM400T. (Eindhoven, Holanda).

Amostras de fígado humano. idade foram obtidas. Dois pacientes PFIC-2 eram pares de irmãos com uma mutação V284L heterozigota e uma deleção de 1bp na posição de nucleotídeo 1273. O outro paciente PFIC-2 tinha uma mutação de sentido errôneo G1004D. Três pacientes PFIC-3 foram incluídos em virtude de ter PFIC elevado em y- GT, incluindo uma mutação de deleção confirmada no gene MDR3 (73) . Outros 6 controles casados em idade (0,5 a 1,5 ano) de pacientes com hepatite ou doença de fígado metabólica não colestática, sem icterícia. As amostras foram coletadas sob consentimento informado.

PCR de transcrição reversa quantitativa.

Amostras de fígado de camundongos e pacientes foram utilizadas para preparar RNA como anteriormente descrito (16) . Em resumo, RNAs totais foram extraídos de fígado congelado pelo kit RNAeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). 1-10 μg de RNA total foi transcrito reversamente com 200 pmol de hexâmero aleatório (Promega Corp., Madison, WI) e transcriptase reversa (Superscript II, Invitrogen Life Technologies, Breda, Holanda) a 42°C por 50 min e inativado a 72°C por 15 min. Com o DNA complementar (cDNA) obtido, para amostras de camundongo, as reações de PCR foram feitas com a mistura SYBR Green PCRMaster Mix (Foster City, CA) em um sistema de detecção de sequencia PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando o “Método de curva padrão” (ABI PRISM User Bulletin 2). Iniciadores utilizados foram como reportado anteriormente (16). Para cada amostra, alíquotas (5-10 ng) de RNA total foram utilizadas para cada reação RT-PCR, e os resultados foram normalizados contra o nível de expressão da proteína ribossomal S15 (Rps15). Para amostras de pacientes, reações de PCR foram realizadas utilizando o sistema Taqman. Alíquotas (5 ng) de RNA total foram utilizadas para cada reação RT-PCR. Os níveis de expressão de MDR em relação à proteína de ligação de caixa TATA (TBP) foram calculados utilizando o método dCT (ABI PRISM User Bulletin 2). Os iniciadores e sondas foram: MDR (Hs00184500_ml, ABI) e TBP (senso: 5'-CACGAACCACGGCACTGTT- 3' (SEQ ID NO: 1); anti-senso: 5'-TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC-3‘ (SEQ ID NO: 2); sonda 5'-JOE TGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGA-3' (SEQ ID NO: 3)).

Coloração de imunofluorescência.

Amostras de tecido de fígado fresco foram embebidas em composto O.C.T. (Tissue-Tek; Sakura) imediatamente. Seções de tecido congeladas (~5-7 μm) foram cortadas com um criostato e colocadas em lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina, a seguir fixadas em acetona esfriada por 10 minutos. Um anticorpo policlonal de coelho contra BSEP humano (1:500) foi utilizado como anteriormente reportado (26). Anticorpos monoclonais contra MDR humano com diluição 1:500 (Sigma, Saint Louis Missouri) foram utilizados. Após enxaguar com PBS, as seções de tecido foram incubadas com anticorpo secundário fluorescente conjugado para IgG de camundongo ou coelho (Alexa Flúor 594 and Alexa Flúor 488, Life Technologies) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por lavagem com PBS. As seções foram montadas com VectaShield (Life Technologies). Imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal Nikon C1 e processadas utilizando software Photoimpact 8.0 (Ulead).

Resultados.

Camundongos triplo nocaute (TKO) carregando mutações nulas de genes mdrla e mdrlb (co-ortólogos de MDR1 humano) e bsep por cruzamento em multi-etapas de camundongos bsep (18) com camundongos duplo nocaute mdr1a-/-/mdr1b-/- (22) foram gerados na figura 3a. A expressão nula dos três genes mutantes nos camundongos TKO foi confirmada por PCR genômico (figura 3b), RT-PCR em tempo real (figura 5) e Western blotting.

Os camundongos TKO exibiram colestasia mais severa do que qualquer cepa parental, manifestando como icterícia severa, por exemplo, na parede do corpo e patas, durante toda a vida, aumento do fígado (figura 1a), canalículos rompido (figura 1d), dutos de bile bloqueados, retardamento de crescimento e mortalidade muito elevada. Sob cuidado estreito, alguns camundongos TKO, a maioria fêmea, vivem até a vida adulta enquanto aproximadamente 80% dos machos TKO sofrem morte súbita em 2-6 meses. Os machos adultos são férteis e podem ser utilizados para produzir progênie TKO. Os requerentes demonstraram ainda que os camundongos TKO têm uma tolerância reduzida para estresse colestático por alimentar camundongos TKO fêmeas com uma dieta de ácido cólico a 0,5%, uma condição que pode ser bem tolerada por fêmeas bsep-/- e camundongos duplo KO mdrla /1b . Os camundongos TKO fêmeas sob uma dieta CA a 0,5% se tornaram terminalmente doentes ou morreram após 3-7 dias de alimentação (figura 2) . Isso está em contraste acentuado com os camundongos bsep-/-, cujas fêmeas poderiam manter 105 dias das mesmas condições de alimentação sem mostrar nenhuma doença terminal (16).

A apresentação histológica dos camundongos TKO também indica uma colestasia muito mais severa em camundongos TKO do que em camundongos bsep-/-. Sob um microscópio, os hepatócitos de camundongos TKO mostram fibrose periportal prontamente visível (figura 1c) e escassez de dutos biliares (17 dutos biliares por 91 veias portal em camundongos TKO vs. 68 por 165 contados em camundongos do tipo selvagem). Utilizando microscopia eletrônica, dano hepático profundo foi adicionalmente observado tanto em membrana plasmática como citoplasma (figura 1d) . Os camundongos TKO apresentaram defeitos mais severos como manifestado por canalículo severamente prejudicado que perderam quase todas as microvilosidades, e espaços canaliculares dilatados cheios de substâncias de bile densa. Os hepatócitos de camundongos TKO também apresentam anormalidades citoplásmicas típicas de toxicidade hepática com mitocôndria distorcida, aparato de Golgi hipertrofiado, retículo endoplásmico liso aumentado, gotículas de lipídeo em excesso, e números aumentados de peroxissomas (figura 4) .

Para determinar se Mdr1 é ou não também um transportador de sal biliar canalicular fisiologicamente relevante que ajuda a aliviar um fenótipo colestático de outro modo mais severo, os requerentes seletivamente bloquearam Mdr1 (glicoproteína-P) com o bloqueador de glicoproteína-P ciclosporina A (CsA) em camundongos bsep-/-, nos quais o principal transportador de sal biliar canalicular Bsep é inativado. Injeção peritoneal de 25 mg/kg/dia de CsA induziu um fenótipo colestático mais severo, incluindo icterícia, perda rápida de peso e um perfil bioquímico de fígado tipicamente colestático de indicadores de fígado similar a PFIC2 (tabela 1) . Essa observação de colestasia induzida por CsA em camundongos nocaute (KO) bsep-/- indica que Mdr1 é realmente um transportador de sal de bile fisiologicamente relevante. Entretanto, a possibilidade permaneceu que os efeitos colestáticos de CsA em camundongos bsep-/- são devido à toxicidade não específica do composto em vez de inibição específica de transporte de sal de bile mediado por Mdr1. Camundongos do tipo selvagem tratados com CSA não foram perceptivelmente afetados pelo tratamento.

O perfil bioquímico de soro para função de fígado dos camundongos TKO lembra PFIC2, e difere daquele de camundongos bsep-/- em que nenhuma tal anormalidade foi vista (18). O exame do perfil de indicador de fígado de plasma de camundongos TKO mostrou baixo Y-GT, fosfatase alcalina aproximadamente 2 vezes mais elevada (Tabela 1) e colestasia severa comparável com a apresentação de PFIC2 humano. Os camundongos TKO tinham níveis de bilirrubina de soro em média aproximadamente 13 vezes aquele dos controles de tipo selvagem. As alterações em ALT e AST foram relativamente pequenas, o que novamente concorda com o que é encontrado em pacientes PFIC2 (27, 28) que têm normalmente muito pouca secreção biliar de sal de bile com fosfatase alcalina e bilirrubina elevadas, e y-GT baixo ou normal em soro. Os camundongos TKO são, portanto, um bom modelo para as consequências fisiológicas de secreção de sal de bile totalmente abolida como aquela encontrada em PFIC2 humano.

Tabela 1. Indicadores bioquímicos de fígado em bsep-/-, e camundongos fêmeas do tipo selvagem tratados com 5 ciclosporina A por duas semanas, camundongos triplo nocaute bspe-/- mrdla/b-/-, camundongos fêmeas bspe-/-, mrdla/b-/- e do tipo selvagem alimentados com uma dieta normal ou alimentados com uma dieta suplementada com 0,5% CA (n = 4).

ALP - fosfatase alcalina YGT - Y—glutamil transpeptidase ALT - alanina aminotransferase AST - aspartato aminotransferase 5 CA - ácido cólico CsA - ciclosporina A

Todos os números são expressos como uma média ± desvio padrão (valor P) (n = 3-6) . Asteriscos indicam importância estatística determinada por teste t de Student bicaudal 10 entre os camundongos nocaute e tipo selvagem no mesmo grupo.

Para avaliar a extensão de alterações moleculares nos hepatócitos dos camundongos TKO, os requerentes mediram seus perfis de expressão gênica utilizando PCR em tempo 15 real semi-quantitativo. Camundongos TKO exibiram uma resposta colestática típica, similares à que foi encontrada nos camundongos KO bsep (figura 5). Os requerentes verificaram que Mrp3 e Mrp4, os principais transportadores de sal de bile basolateral para depuração de sal de bile de hepatócitos na circulação de sangue sinusoidal, são grandemente suprarreguladas, como é o gene o mais provável de funcionar como a principal hidroxilase de sal de bile, Cyp3a11. A regulação descendente de Cyp3a41 e Cyp3a44 foram também observada. Surpreendentemente, PCR em tempo real também detectou transcrição mdrl elevada. Os requerentes sequenciaram os transcritos mdrl residual e eles consistem em duas isoformas alternativamente processadas, a principal com uma deleção de exon 4 (SEQ ID NO: 4), direcionando a tradução do fragmento N-terminal de 38 aminoácidos, seguido por um deslocamento de quadro, codificando uma sequência para 7 aminoácidos novos e um códon de parada prematuro (SEQ ID NO: 5); o transcrito menos abundante tem uma deleção dos exons 4, 5 e 6 (SEQ ID NO: 6), resultando na tradução dos 38 aminoácidos originais seguido por um deslocamento de quadro, 12 aminoácidos novos e um códon de parada prematuro (SEQ ID NO: 7).

Os requerentes também examinaram a expressão de MDR1, juntamente com alguns outros transportadores ABC, em pacientes PFIC de todos os subtipos. Os requerentes fundamentaram que se MDR1 fosse realmente um transportador de sal de bile fisiologicamente relevante em seres humanos, acúmulo de sal de bile intra-hepático em pacientes PFIC deveria resultar em suprarregulação de MDR1. Se esse fosse o caso, poder-se-ia estimular a atividade de transporte de sal de bile mediada por MDR1 clinicamente, para aliviar colestasia. Os requerentes compararam biópsias de fígado de pacientes PFIC pediátricos de seis controles casados por idade com doenças de fígado não colestáticas, incluindo doença de armazenagem de glicogênio, distúrbios de ciclo da ureia, hepatite, e uma amostra de fígado não tumoral de um paciente com hepatoblastoma. Os controles não foram esperados ter anormalidades de secreção biliar. O ensaio por PCR em tempo real quantitativo das amostras de biópsia revelou um aumento significativo de expressão de MDR1 em pacientes PFIC para aproximadamente quatro vezes mais do que a medida do controle (tabela 2). Essa expressão aumentada de MDR1 foi adicionalmente confirmada por coloração imunofluorescente onde um aumento significativo de proteína BSEP humana foi detectada na membrana canalicular dos pacientes PFIC (figura 6) . Os resultados indicam a presença de um sistema fisiologicamente redundante para secreção de sal de bile biliar tanto em camundongo como em homem. canaliculares em pacientes PFIC em comparação com controles casados por idade.

*pacientes PFIC-3 diagnosticados por sua apresentação 5 patológica e bioquímica. Níveis de mRNA relativos de transportadores são esperados como alteração em relação ao dobro de níveis mRNA TBP em cada amostra (média ± DP para controles).

As propriedades de camundongos mutantes foram 10 comparadas com pacientes PFIC (tabela 3). TABELA 3

Uma suprarregulação significativa da expressão BSEP foi encontrada em fígados de pacientes com PFIC.

Exemplo 2: síntese de ácido biliar 3α,6β,7β,12α- 5 hidroxi conjugado com taurina.  foram testados em relação a suas afinidades relativas para transporte via MDR1 in vitro, como descrito aqui. O composto mais eficaz in vitro foi isolado em quantidades maiores e utilizado como o composto líder para os testes in vivo de toxicidade e eficácia descritos aqui ou conhecidos na técnica. 1. Síntese de ácido 3α,6α,7α,12α-tetraidroxi-5β- colanóico.

Com referência à figura 10, ácido 3α,6α,7α,12α- tetraidroxi-5β-colan0ico (7) foi protegido como um acetato (16) . Sob uma atmosfera de N2, taurina foi ativada com N- hidroxisuccinimida na presença de base orgânica e acetato (16), trabalhada com 0.1 N de NaOH e lavada através de Serdolit™-1, para fornecer amida (17) . Amida (17) foi tratada com 1 N de NaOH, por 40 minutos a 80°C, seguido por 20 minutos a 50°C, e 1,5 h a 25°C; fornecendo conjugado de taurina (18) após lavagem através de Serdolit™-1. Espectro 1H-RMN de ácido 3α,6α,7α,12α-tetraidroxi-5β-colan0ico conjugado com taurina (18) é mostrado na figura 11.

Exemplo 3: Avaliação da cinética de transporte e interações.

A cinética de transporte e interações de compostos, produzidos como descrito aqui, com seu MDR1 transportador, são avaliadas em comparação com o ácido biliar terapêutico amplamente utilizado ursodesoxicolato, bem como taurocolato, o ácido biliar primário em seres humanos e camundongos, e β-muricolato, um ácido biliar tri-hidróxi não encontrado normalmente em seres humanos. Sistemas de vesícula de membrana derivados de membranas de célula CHO B30, uma linhagem de células de ovário de hamster chinês selecionadas por sua amplificação considerável do locus Mdr1 e resistência à droga correspondente são utilizados, bem como vesículas da série SKOV humana de linhagens de células, também selecionados para superexpressão de MDRl. Esse sistema experimental é bem estabelecido. Utilizando esse sistema de captação dependente de ATP de ácidos biliares marcados com 3H em vesículas, individualmente ou em combinação com compostos de interação como taurocolato ou ursodesoxicolato, é medida. Humanos e roedores não diferem significativamente nos perfis de resistência à droga mediada por suas glicoproteínas-P MDR1 respectivas, portanto, o uso de vesículas derivadas de célula tanto de roedor como de ser humano confirma que quaisquer diferenças em cinética de transporte de ácido biliar novo entre as espécies não altera significativamente sua utilidade esperada. Qualquer ácido biliar menos hidrofóbico (e, portanto, menos tóxico) do que taurocolato, porém com uma afinidade mais elevada do que taurocolato (Km inferior) para transporte por MDR1 é de benefício terapêutico potencial, por exemplo, ácidos biliares tetra-hidroxilados mostram uma mistura apropriada de baixa toxicidade e elevada capacidade para transporte por MDR1. A modulação do transportador de afinidade para sais de bile é também um mecanismo pelo qual muricolatos e ácidos biliares tetra-hidroxilados superam colestasia. Um ácido biliar de acordo com a invenção pode reduzir aloestericamente o Km de MDR1 para colato e, assim, aumentar adicionalmente seu valor como um agente colerético. Tais efeitos sobre MDR1 são examinados utilizando vesículas de membrana isoladas na presença dos vários ácidos biliares e também estimuladores em potencial, tais como rodamina 123, Hoechst 33342 ou prazosina, conhecidos por interagir com Mdr1 em locais separados (33- 35). A cinética de captação de taurocolato-C14 comercialmente disponível em vesículas de membrana B30 na presença de várias concentrações de moduladores em potencial é comparada. Modulação positiva aumenta a velocidade de captação. Drogas conhecidas como sendo substratos para Mdr1 são selecionadas. Interações de ácido biliar-ácido biliar e ácido biliar-droga são caracterizadas para determinar se o Km para transporte taurocolato foi diminuido.

Exemplo 4: determinação de dose tolerada máxima in vi vo .

A dose máxima tolerada do ácido biliar de acordo com a invenção foi determinada. Esse teste é realizado de dois modos. Primeiramente, como experimento piloto de canulação de duto biliar, um bolus de ácido biliar foi infundido em camundongos sob anestesia para medir sua toxicidade aguda em animais. As respostas dos camundongos, tais como taxa de respiração, taxa de fluxo de bile, alterações histológicas por coloração H&E e similares foram registradas. Para taurocolato os testes dos requerentes indicaram que 167 μmol/kg de peso corporal distribuído por via intravenosa, eram a dosagem máxima tolerada. Utilizando esse nível de tolerância como um ponto de referência, a toxicidade aguda do ácido biliar foi determinada. A dosagem máxima tolerada (MTD) para ursodesoxicolato administrado por via intravenosa foi verificada ser 65 μmol/kg de peso corporal. Isso é consistente com um sal de bile menos tóxico. O LD50 para ursodesoxicolato administrado por via intravenosa em camundongos foi relatado como sendo ~600 μmol/kg.

Doses terapêuticas de ursodesoxicolato em seres humanos são normalmente dados por via oral e tipicamente não excedem 40μmol/kg de peso corporal por dia. Além disso, ácido biliar administrado por via oral pode ser menos tóxico visto que entra na corrente sanguínea e desse modo no fígado em uma taxa mais lenta do que ocorreria com administração intravenosa. O LD50 oral para ursodesoxicolato em roedores é pelo menos 15 vezes maior do que quando dada por via intravenosa, dando margem de segurança considerável contra overdose. Ácidos biliares mostrando afinidade ainda maior para Mdr1 do que muricolatos ou colatos têm um efeito dose específico maior em aumentar fluxo de bile sob condições de disfunção Bsep, enquanto demonstra toxicidade mais baixa em qualquer dose dada.

Toxicidade crônica é testada por suplementar as dietas de camundongos (tipo selvagem bem como os camundongos KO bsep hipersensíveis) com 0,1% - 0,5% β-muricolato ou ácido biliar de acordo com a invenção. Experimentos de alimentação de controle utilizam colato bem como ursodesoxicolato. Camundongos do tipo selvagem podem suportar a carga extra de sal de bile de um colato a 0,5% indefinidamente, enquanto a mesma dieta fará com que os camundongos fêmea KO bsep percam peso, e mata camundongos KO bsep machos em 10 dias (16, 18) . Uma dieta de colato a 0,5% matará mesmo camundongos TKO fêmeas em uma semana (36) . Os animais são alimentados com dietas de controle e suplementadas com ácido biliar e monitorados diariamente para perda de peso e semanalmente para indicadores de soro de função de fígado para detectar sintomas de colestasia como enzimas elevadas de fígado em sangue, bem como sais biliares elevados e/ou bilirrubina (tabela 1). Canulações de duto de bile são também conduzidas nas quais um bolus de taurocolato-C14 é injetado nas veias de cauda de camundongos, individualmente ou juntamente com um ácido biliar novo, e a cinética de aparecimento de taurocolato- C14 no bile medido e o efeito in vivo de cada ácido biliar novo sobre transporte de taurocolato por Mdr1 e/ou Bsep é avaliada.

Exemplo 5: melhora de colestasia in vivo.

A eficácia de ácidos biliares de acordo com a invenção é avaliada em um sistema de animal inteiro que permite a influência de eventos moleculares e fisiológicos que afetam transporte de sal de bile e fluxo de bile. Uma combinação de linhagens de camundongo nocaute única é utilizada para testar se os sais de bile novos podem aliviar o estresse colestático por promover fluxo de bile mediado por Mdr1. Três linhagens de camundongos KO são utilizadas. Como descrito aqui, o camundongo KO bsep carrega um gene bsep inativado, porém tem expressão mdr1a/1b elevada; o camundongo KO duplo mdrla/mdrlb tem expressão bsep normal, porém genes mdrla/mdrlb inativos; e o camundongo KO triplo bsep/mdrla/mdrlb (TKO) tem todos os três genes inativados. Essas três linhagens de animais são utilizadas para verificar a função colerética in vivo do ácido biliar novo em aliviar pressão colestática.

Pequenas quantidades de THBAs marcados com 3H, de vários isômeros, preparados como descrito aqui, são injetadas nas cepas de camundongo mutante (mais controles do tipo selvagem) e radioatividade recuperada em sangue, urina, bile e hepatócitos são medidos para comparar a cinética in vivo dos THBAs novos com aquelas obtidas para os mesmos compostos in vitro, como descritos aqui. Os camundongos são desafiados com uma dose elevada de um ácido biliar de acordo com a invenção, selecionado com base nos experimentos cinéticos descritos acima. As concentrações de 0,5% - 1,5% são utilizadas na dieta, dado que a mesma quantidade de taurocolato (um substrato preferido por Bsep) pode ser tolerada indefinidamente por camundongos do tipo selvagem. Os camundongos são monitorados de acordo com seu peso corporal, morbidez, mortalidade, perfil indicador de fígado, e histologia de fígado, como relatado anteriormente (16, 18, 37) (tabela 1) . Além disso, o bile de animais sendo alimentados com o acido biliar de acordo com a invenção é coletado, e analisado por HPLC. O aumento na quantidade de fluxo de bile é uma medida direta do potencial colerético do ácido biliar de acordo com a invenção, e alterações na composição de ácido biliar de bile nas três cepas de camundongo KO indicam a extensão na qual ácido biliar de acordo com a invenção é transportado por Mdr1 versus Bsep in vivo. Alterações nas proporções de ácidos biliares diferentes do ácido biliar de acordo com a própria invenção, se observado, indicam efeitos moduladores do ácido biliar de acordo com a invenção no transporte ou síntese do pool de ácido biliar convencional.

A alimentação de dose elevada tem menos efeitos negativos do que taurocolato em camundongos KO bsep, toxicidade moderada para com camundongos mdr1a/1b e elevada toxicidade para camundongos TKO. Anteriormente, os requerentes verificaram que camundongos TKO e KO bsep são hipersensíveis a alimentação com taurocolato. Se a alimentação com o ácido biliar novo de acordo com a invenção for menos tóxica para camundongos KO bsep do que a alimentação com taurocolato, os requerentes então desafiarão o camundongo mutante deles com misturas do ácido biliar de acordo com a invenção e colato ou ursodesoxicolato para fornecer evidência in vivo direta para o valor terapêutico do ácido biliar de acordo com a invenção.

Exemplo 6: síntese de ácido 3α,6α,7α,12α-tetraidroxi- 5β-colanóico e ácido 3α,6β,7α,12α-tetraidroxi-5β-colanóico.

Três formas de ácido biliar foram sintetizadas: ácido 3α, 6α,7α,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico, ácido 5 3a,6e,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico e ácido 3a,6e,7e,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico. As seguintes sínteses são baseadas naquelas relatadas por Iida e cols. e Aggarwal e cols. (61, 62, e referências citadas nas mesmas), e Gouin e cols., Fieser e cols., Putz e cols., 10 Narasimhan e cols. e Ornatein e cols. (66-70 e referências citadas nas mesmas) . Essa química foi realizada em uma escala de multi-grama e modificações menores foram feitas nos procedimentos experimentais e de purificação para otimização dos rendimentos. Os compostos finais foram 15 purificados por cromatografia instantânea e eram mais do que 95% puras (como indicado por análise de RMN). Mostraram também ser homogêneas por métodos HPLC. Síntese de ácido 3α, 6α, 7α, 12α-tetraidroxi-5β- colanóico.

A proteção de ácido cólico (1) forneceu o éster de metila (2) que foi oxidada com N-bromosuccinimida (NBS) para a cetona correspondente (3). Esse composto foi então protegido como o diacetato (4) e convertido em intermediário-chave (5) na reação com bromo molecular. Esse brometo foi então hidrolisado com hidroxila-cetona (6). A redução subsequente e desproteção global das porções de éster de metila e acetato forneceram o composto alvo (7).

Síntese de ácido 3α, 6β, 7α, 12α-tetraidroxi-5β- colanóico.

O intermediário (5), vide acima, foi reduzido com boroidreto de zinco e a bromoidrina resultante foi reduzida adicionalmente com zinco metálico para fornecer o alqueno 5 correspondente (8). O tratamento deste último composto com ácido meta-cloroperoxibenzóico (m-CPBA) forneceu o epóxido (9). Abertura de anel mediado por ácido de Lewis desse composto forneceu o diol (10). A desproteção global subsequente forneceu o composto alvo (11).

Método alternado de síntese de ácido 3α,6α,7α,12α- tetraidroxi-5e-colanóico. Com referência à figura 9, a oxidação de ácido cólico (1) com NBS forneceu a cetona correspondente (12) seguida por proteção para fornecer o éster de metila correspondente (3). Esse composto foi então protegido como um acetato (4’) e subsequentemente acetato (4) e convertido em intermediário (5) por reação com bromo molecular. O brometo foi hidrolisado a hidroxila-cetona (13). A redução e desproteção subsequente forneceram o composto alvo (7).

Exemplo 7. Ácido 3α,6α,7α,12α-tetraidroxi-5β-colan-24- óico estimula taxa de fluxo de bile (BFR) em camundongos do tipo selvagem.

Para canulação de duto de bile, camundongos do tipo selvagem no background genético de FVB/NJ foram pesados e anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (112,5 mg/kg) e xilazina (11,3 mg/kg) após 2-4 horas de jejum. O abdome foi aberto, e a vesícula biliar foi canulada utilizando um cateter PE-10 após ligação de duto de bile comum distal [63, 64] . Após 20 minutos de equilíbrio de fluxo de bile, bile foi coletada em tubos pré-pesados em intervalos de 5 minutos por 10 minutos. Um bolus de ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico (6α,7α THBA, pH 7,4-7,6), ácido 3a,6e,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico (6β,7α THBA, pH 7,4-7,6), ácido ursodesoxicólico (UDC, pH 7,4-7,6) ou ácido cólico (100 μmol/kg de peso corporal) foi então infundido na veia da cauda durante um intervalo de 20 segundos. Bile foi então adicionalmente coletado através de cânula em intervalos de 2 minutos por 10 ou 20 minutos, seguido por intervalos de 10 minutos por 30 minutos. A taxa de fluxo de bile foi calculada por pesar os tubos contendo a bile coletado. A bile coletado foi utilizado para análise de HPLC.

A solução de UDC para a infusão foi feita fresca 2 horas antes dos experimentos, e foi feita como a seguir: para cada mililitro de solução 100 mM de UDC, 39,62 mg de UDC (Sigma U5127) foi misturado em vórtice em sequência com 86,6 μl de etanol a 100%, 86,6 μl de NaOH 1N, e 826 μl de solução NaCl de 0,9%. A solução de trabalho diferente é diluída a partir da solução de 100 mM. O pH da solução foi de 7,4-7,6.

A figura 7 demonstra que ácido 3α,6α,7α,12α- tetraidroxi-5β-colan-24-0ico estimula taxa de fluxo de bile (BFR) em camundongos do tipo selvagem. (A) BFR como uma função de peso corporal em camundongos após infusão de ácido 3α,6α,7α,12α-tetraidroxi-5β-colan-24-0ico (THBA). (B) BFR como uma função de peso corporal em camundongos após infusão de ácido cólico (CA) (ácido 3α,7α,12α- triidroxi-5β-colan-2 4-0ico) . Um bolus de THBA ou CA (100 μmol/kg de peso corporal) foi infundido na veia de cauda durante um intervalo de 20 segundos em 10 minutos. Os resultados são apresentados como a média (μl/100g de peso corporal) ± desvio padrão.

A taxa de fluxo de bile (BFR) foi determinada antes e após infusão de ácido 3α,6β,7α,12α-tetraidroxi-colan0ico (6β,7α THBA) em uma dose de 65, 250, 350 e 400 μmol/kg de peso corporal (BW) (figura 12A); ou infusão de 3α,6α,7α,12α THBA (6α,7α THBA) de 65 e 200 μmol/Kg BW (figura 12B) . A figura 12C ilustra BFR como uma função de peso corporal antes e após a infusão de 65 μmol/kg de peso corporal de 6β,7α THBA, 6α,7α THBA e ácido ursodesoxicólico (UDC) . Os resultados são representados como a média ± desvio padrão de três camundongos.

Durante experimentos de canulação de duto de bile, os requerentes verificaram que UDC infundido através da veia de cauda em uma concentração de 70 μmol/kg de peso corporal ou mais causaram a morte de camundongos do tipo selvagem sob anestesia (cetamina, 112,5 mg/kg e xilazina, 11,3 mg/kg). Os requerentes desse modo determinaram que UDC em 65 μmol/kg de peso corporal como administrado através de uma infusão em bolus na veia de cauda era a dose máxima tolerada (MTD) nos camundongos. Entretanto, os camundongos do tipo selvagem podem tolerar infusão de 6β,7α THBA em 500 μmol/kg de peso corporal (dosagem mais elevada testada) e infusão de 6α, 7α THBA em 400 μmol/kg de peso corporal (dosagem mais elevada testada) sem morte. As doses máximas toleradas de 6β,7α THBA (MTD> 500 μmol/kg de peso corporal) e 6α,7α THBA (MTD> 400 μmol/kg de peso corporal) foram várias vezes mais elevadas do que aquela de UDC.

UDC em 65 μmol/kg de peso corporal é a dose máxima tolerada (MTD) nos camundongos, resultando em uma taxa de fluxo de bile similar àquela observada por infusão de uma quantidade similar de 6β,7α THBA ou 6α,7α THBA. A infusão de quantidades crescentes de 6β,7α THBA ou 6α,7α THBA, resulta em um aumento correspondente em taxa de fluxo de bile (figuras 12A, B).

A figura 8 demonstra perfis de HPLC (cromatografia líquida de alta performance) de frações de bile coletadas de um camundongo do tipo selvagem antes (A), e 2-4 minutos após (B), infusão (100 μmol/kg) de ácido 3α,6α,7α,12α- tetraidroxi-5β-colan-24-0ico. A figura 8C mostra perfis de HPLC de frações de bile coletadas de um camundongo do tipo selvagem antes (traço superior) e 2-4 minutos após (traço inferior), infusão (100 mmol/kg) de ácido cólico.

HPLC foi realizado com uma bomba de Waters 600 e controlador e um detector de 486 UV. A separação foi realizada em uma coluna analítica de fase inversa Spherisorb S5 ODS2 C-18 (tamanho de partícula de 5 mm, 250mmx4 mm, Waters) e foi precedida por coluna de proteção (Nova Pack, Waters) . A integração dos picos foi realizada utilizando software Millennium 2010. Os controles de sal de bile foram separados em temperatura ambiente durante 48 minutos em uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min. e 3200 psi. A fase móvel consistiu em solvente A (MeOH) e solvente B (60:40 MeOH: 0.01 M de fosfato de potássio, 0.02 M de fosfato de sódio (pH 5,35 (modificado de Rossi e cols. 1987 J Lipid Res 28(5): 589-95 (71); Hagey e cols. 1998. J. Lipid Res 39 (11): 2119-24. (72)). Condições iniciais foram retidas a 100% B para os primeiros 25 minutos. Durante os 10 minutos seguintes, houve um gradiente linear a 30% B e condições foram mantidas por outro período de 5 minutos. As condições então diminuíram através de um gradiente linear a 100% A durante 8 minutos. o sistema foi lavado com 100% MeOH seguido por equilíbrio de volta para as condições iniciais. O efluente foi monitorado a 210 nm.

Para visualizar o 3α,6α,7α,12α-THBA, 4 μl de bile foram dissolvidos em 20 μl de metanol, e injetado em tampão a um fluxo de a 0,6 mL/minuto, e lido por absorvência em um comprimento de onda de 210 nm. O tampão era 60% de metanol, 40% de 0.1 M KH2PO4, 0,02 M NaH2PO4 pH 5,35 [65]. Para visualizar ácido cólico, o procedimento foi igual para 3α,6α,7α, 12α-THBA inicialmente, porém após 5 minutos o tampão foi escalonado linearmente para uma mistura de 20% de metanol:80% de tampão em 4 minutos, mantido constante por outro período de 10 minutos, a seguir escalonado linearmente em 2 minutos para 30% de metanol:70% de tampão pela duração da corrida.

Portanto, ácidos de tetraidroxi-5e-colan-24-óico (ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico) promovem fluxo de bile em camundongos do tipo selvagem. Como demonstrado por cromatografia líquida de alto performance (HPLC), ácido 3a,6a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colan-24-óico é metabolizado por conjugação com taurina in vivo e secretado no bile minutos após ser infundido na veia da cauda de camundongo (figura 8A, B) . Isso sugere que esse ácido biliar pode ser metabolizado e desintoxicado pelas mesmas vias que metabolizam ácidos biliares nativos e medeiam sua secreção através da membrana canalicular.

Exemplo 8: síntese de ácido 2α,3α,7α,12α-tetraidroxi- 5β-colanóico e ácido 3α, 4α, 7α, 12α-tetraidroxi-5β- colanóico.

Ácido 2a,3a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colanóico foi sintetizado de ácido cólico como a seguir:

Ácidos biliares poliidroxilados adicionais são sintetizados, utilizando métodos como descrito, por exemplo, em Tserng K.Y e Klein PD (1977) (74), Leppik RA (1983) (75), Iida T. e cols. (1990) (76) ou Iida T. e cols. (1991) (77) . O esquema de síntese é como mostrado, onde o composto A é um ácido 2α,3α,7α,12α-tetraidroxi-5β- colanóico e o composto B é um ácido 3α,4α,7α,12α- tetraidroxi-5β-colanoico: 

a. HCOOH, HC1O4, Ac2O b. NH3OH, MeOH c. reagente de Jones d. MeOH/H+, e. Ac2O, Py. f. Br2/AcOH g. KOAc/AcOH h. complexo de terc-butilamina-borano i. KOH/MeOH, temp. amb. 5 Um esquema de síntese alternativo para ácido 3a,4a,7a,12a-tetraidroxi-5e-colanóico é como a seguir: 

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Portanto, embora várias modalidades da invenção sejam reveladas aqui, muitas adaptações e modificações podem ser feitas no escopo da invenção de acordo com o conhecimento geral comum daqueles versados na técnica. Tais modificações incluem a substituição de equivalentes conhecidos para qualquer aspecto da invenção para obter o mesmo resultado substancialmente do mesmo modo. Faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa. No relatório descritivo, a palavra “compreendendo” é utilizado como um termo ilimitado, substancialmente equivalente à frase “incluindo, porém não limitado a” e a palavra “compreende” tem um significado correspondente. A citação de referências aqui não serão interpretadas como uma admissão de que tais referências são técnica anterior a presente invenção. Todas as publicações são incorporadas aqui a título de referência como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada a título de referência aqui e como se totalmente exposta aqui. A invenção inclui todas as modalidades e variações substancialmente como anteriormente descrito e com referência aos exemplos e desenhos.

Claims (7)

1. Uso de um ácido 3α,6α,7α,12α-tetra-hidroxi-5β- colan-24-óico ou ácido 3α,6β,7α,12α-tetra-hidroxi-5β-colan- 24-óico ou ácido 3α,6β,7β,12α-tetra-hidroxi-5β-colan-24- óico ou um conjugado de taurina ou glicina dos mesmos caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento para estimular o fluxo biliar em um indivíduo com essa necessidade.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) pelo menos outro agente terapêutico; (ii) pelo menos outro agente terapêutico tendo afinidade preferencial por BSEP; (iii) pelo menos outro agente terapêutico que é ursodesoxicolato.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um ser humano.

4. Composição farmacêutica ou nutricional caracterizada pelo fato de compreender um ácido 3α,6α,7α,12α-tetra-hidroxi-5β-colan-24-0ico ou ácido 3α,6β,7α,12α-tetra-hidroxi-5β-colan-24-0ico ou ácido 3α,6β,7β,12α-tetra-hidroxi-5β-colan-24-0ico ou um conjugado de taurina ou glicina dos mesmos, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente: (i) pelo menos outro agente terapêutico; (ii) pelo menos outro agente terapêutico tendo afinidade preferencial para BSEP; (iii) pelo menos outro agente terapêutico que é ursodesoxicolato.

6. Uso de uma composição conforme definida na reivindicação 4 ou 5 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o estímulo de fluxo biliar em um indivíduo em necessidade do mesmo.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é um ser humano.

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