BR102022018545A2 - Nanofibras uniaxiais e coaxiais eletrofiadas com nanopartículas de prata e método de obtenção das mesmas - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um método de obtenção de nanofibras eletrofiadas uniaxiais e coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs), em que as AgNPs são incorporadas às nanofibras em etapa única (“in situ”) durante a eletrofiação das mesmas, às referidas nanofibras obtidas pelo mesmo e a seus usos para produção de materiais com aplicação no âmbito biomédico/hospitalar.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um método de obtenção de nanofibras eletrofiadas uniaxiais e coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs), com potencial atividade antimicrobiana, e a sua utilização para produção de materiais com aplicação no âmbito biomédico/hospitalar. A invenção está relacionada aos campos da nanotecnologia e engenharia de tecidos.

[002] A área de aplicação da presente invenção é a de nanomateriais, particularmente no desenvolvimento de nanofibras uniaxiais e coaxiais para produção de tecidos inteligentes para fabricação de equipamentos de proteção individual (EPIs).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] De um modo geral, um dos grandes desafios enfrentados no combate das infecções microbianas relaciona- se ao controle da disseminação dos microrganismos. Nesse cenário, equipamentos de proteção individual, tais como luvas, máscaras, aventais e jalecos são os principais itens de proteção. Contudo, os materiais disponíveis no mercado apenas atuam na proteção, mas não são capazes de inibir o crescimento ou levar à morte dos microrganismos. Dessa forma, por mais que o EPI seja suficiente na proteção durante a sua utilização, a contaminação pode ser realizada durante a retirada ou descarte do mesmo. Vale destacar que essa situação se agravou amplamente nos últimos anos, tendo em vista a pandemia associada ao coronavírus. Tendo em vista os aspectos supracitados, a comunidade científica vem se empenhando no desenvolvimento de EPIs que sejam capazes não somente de proteger, mas também de inibir os microrganismos.

[004] Diante disso, as nanofibras eletrofiadas incorporadas com nanopartículas de prata são alternativas promissoras dado o baixo custo de produção, a fácil obtenção e a possibilidade de serem aplicadas não somente na fabricação de EPIs, mas também no revestimento de tecidos hospitalares, tais como lençóis e cortinas, controlando a disseminação de microrganismos, principalmente aqueles resistentes a múltiplas drogas. Desse modo, a presente invenção traz o desenvolvimento de fibras em escala nanométrica, obtidas a partir da técnica de eletrofiação, com grande potencial para a produção de tecidos com propriedades antimicrobianas.

[005] Estruturalmente, as nanofibras são filamentos poliméricos com diâmetros inferiores a 1 μm. Estes materiais ultrafinos apresentam características únicas, tais como a elevada área superficial por unidade de volume, elevada porosidade e elevada flexibilidade. Assim, são nanomateriais com potencial aplicação no campo biomédico, na engenharia de tecidos e na liberação controlada de fármacos. Além disso, podem ser utilizadas em processos industriais, em meios filtrantes de alta eficiência, vestuários de proteção, dentre outras aplicações tecnológicas.

[006] As nanofibras obtidas na presente invenção são incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs), cuja ação antimicrobiana tem sido relatada na literatura. De fato, as nanofibras incorporadas com AgNPs da presente invenção apresentaram excelente potencial na morte do vírus Sars- cov2. Além disso, o processo de obtenção das mesmas, desenvolvido pela presente invenção, permite que as nanofibras sejam obtidas e as AgNPs sejam formadas em uma única etapa (também denominado como “in situ”).

[007] De um modo geral, o estado da técnica apresenta uma série de combinações de polímeros (blendas poliméricas) capazes de formar nanofibras com diâmetros e propriedades mecânicas adequadas. No entanto, quando buscamos a incorporação de nanopartículas de prata, mesmo os métodos mais modernos ainda empregam o pós-carregamento. Nesses métodos, as nanopartículas são preparadas separadamente das nanofibras e na sequência são adsorvidas ao “tecido”. Em tais métodos de obtenção tradicionais, as nanofibras com incorporação de nanopartículas de prata são obtidas pelo uso de agentes redutores tóxicos, tais como, o ácido tânico e o borohidreto de sódio. Outra metodologia amplamente empregada na obtenção de AgNPs em tecidos é o método de pós-tratamentos das nanofibras, como, por exemplo, empregando-se o tratamento térmico com elevadas temperaturas, a radiação micro-ondas ou a ultravioleta. Sendo assim, tais métodos/processos tradicionais de obtenção das referidas nanofibras são mais trabalhosos e demorados, pois compreendem um número maior de etapas, reagentes e instrumentações, sendo, portanto, contrários aos princípios da química verde.

[008] Ademais, embora alguns trabalhos do estado da técnica mais modernos citem o termo “in situ” na descrição do processo de obtenção das nanofibras incorporadas por prata, de modo geral, tais trabalhos, empregam o referido pós-carregamento, em que as nanopartículas são preparadas separadamente das nanofibras e, na sequência, são adsorvidas ao “tecido”. Ou seja, nesses processos de obtenção, ao menos um agente redutor ou pós-tratamento são utilizados, não sendo, portanto, uma obtenção “in situ” verdadeira, tal como a desenvolvida pela presente invenção. Dentre as limitações de tais trabalhos, pode-se ainda destacar a capacidade reduzida de incorporação de nanopartículas, bem como a autoagregação das nanopartículas de prata, que leva à inibição a atividade antimicrobiana do material obtido.

[009] O estado da técnica reporta alguns avanços no campo de nanomateriais, especialmente sobre a técnica de eletrofiação, tal como apresentado no artigo de revisão de MINGHUAN LIU et al., 2017 (“Electrospun Nanofibers for Wound Healing”), que cita diversos trabalhos relacionados da área. No entanto, em todos os trabalhos citados, são adicionados ao menos agentes redutores (muitas vezes tóxicos, como o ácido tânico, por exemplo) ou é realizado algum tipo de pós- tratamento (como radiação microondas). De um modo geral, apesar dos trabalhos mencionarem o termo in situ, na prática, todos empregaram uma das seguintes opções: agentes redutores adicionais, tratamento térmico pós obtenção das nanofibras ou irradiação ultravioleta. Diferentemente, a presente invenção possibilita a obtenção de nanofibras reprodutíveis, contendo AgNPs sem a necessidade da adição de agentes redutores tóxicos ou a realização de pós-tratamento. Assim, o presente método envolve uma quantidade menor de etapas, reagentes e instrumentação. Vale destacar que na presente invenção, o próprio polímero constituinte das nanofibras, poli álcool vinílico (PVA), atuará na redução e estabilização da prata.

[010] O trabalho de HUSSEIN, M. A. M.; et al., 2021 (“Dual-Drug Delivery of Ag-Chitosan Nanoparticles and Phenytoin Via Core-Shell Pva/Pcl Electrospun Nanofibers”) descreve a aplicação de nanofibras eletrofiadas, de estrutura coaxial do tipo núcleo-envoltório (“core-shell”), na produção de membranas com atividade antimicrobiana e de propriedades de proliferação celular. As nanofibras obtidas são compostas pelos polímeros poli-caprolactona (PCL) e poli álcool vinílico (PVA), além de serem incorporadas por nanopartículas de prata-quitosana (AgNPs-CHT) no núcleo da fibra. A metodologia, no entanto, é apresentada de forma incompleta, com falta de informações sobre o agente redutor, bem como sobre o período de contato com o agente redutor para a redução da prata. Outra diferença é o fato de os autores utilizarem apenas PVA/PCL na confecção das nanofibras coaxiais, em que a quitosana (CHT) é apenas empregada na obtenção das AgNPs. Contrariamente, na presente invenção o produto final é obtido com um número reduzido de etapas, sem a necessidade de adição de agentes redutores adicionais. Além disso, as AgNPs obtidas pelos autores apresentam tamanhos superiores aos obtidos na presente invenção, fato que limita a sua atividade antimicrobiana.

[011] O documento WO 2021/055939 descreve fibras coaxiais de estrutura núcleo-envoltório com capacidade condutora elétrica, que podem compreender nanopartículas de prata no envoltório das fibras, obtidas por eletrofiação. É descrito, ainda, o uso de PCL como polímeros candidatos na composição das nanofibras, bem como o uso das mesmas para a elaboração de tecidos. O documento traz uma abordagem geral e simplista acerca da obtenção de fibras eletrofiadas coaxiais constituídas por um material interno (“core”) eletricamente condutivo e um segundo polímero de envoltório. Além disso, são utilizadas blendas poliméricas na constituição das nanofibras coaxiais, em que o uso de PVA não foi descrito. De modo distinto, o diferencial da presente invenção é a maneira como as nanopartículas de prata são obtidas e as combinações poliméricas (blendas) usadas, fato não observado no WO 2021/055939.

[012] O documento IN 2021/41030688 descreve nanofibras de estrutura núcleo-envoltório obtidas por eletrofiação coaxial, que compreendem agentes antimicrobianos no envoltório, tais como extratos de plantas e antibióticos, e processo para obtenção das mesmas. São descritos ainda usos médicos, tais como na produção de tecidos curativos. O documento traz uma abordagem geral acerca da eletrofiação coaxial, principalmente, em termos constitucionais, mas deixa a desejar no quesito operacional, já que faz menção à proteção do processo. De modo distinto, o foco da presente invenção é o produto final obtido. A técnica de eletrofiação em si já é amplamente estabelecida no estado da técnica, e foi empregada no presente contexto apenas como um meio para a obtenção dos produtos.

[013] O trabalho de KHODKAR, F. & EBRAHIMI, N. G.; 2017 (“Preparation and Properties of Antibacterial, Biocompatible Core-shell Fibers Produced by Coaxial Electrospinning ””), descreve fibras de estrutura núcleo-envoltório com propriedades antimicrobianas pela incorporação de nanopartículas de prata. O documento descreve ainda o uso de dimetilformamida (DMF) como agente redutor na obtenção das AgNPs do tipo Ag-PCL e o uso de blendas de PVA/PCL. Diferentemente, na presente invenção são utilizadas blendas poliméricas de PVA/CHT, bem como não são usados agentes redutores adicionais ou tratamento térmico após a obtenção das nanofibras. Ademais, as fibras obtidas por KHODKAR, F. & EBRAHIMI apresentam diâmetros superiores aos obtidos na presente invenção, que, em alguns casos, nem mesmo podem ser consideradas como nanofibras.

[014] O documento CN 2013/10664371 descreve nanofibras de metal/polímero de estrutura núcleo-envoltório, com nanopartículas de prata ou cobre no envoltório da fibra, obtidas pela técnica de eletrofiação. O documento descreve ainda os métodos de obtenção das mesmas e os possíveis usos na engenharia médica e biológica. Diferentemente, na presente invenção, as nanopartículas metálicas são revestidas com polímeros, em que tais polímeros atuam como o agente redutor e estabilizador que irá suportar as nanopartículas metálicas em sua matriz nanofibrosa. Ademais, o documento CN 2013/10664371 não faz uso da técnica de eletrofiação, ou qualquer outro método para a obtenção de matrizes fibrosas, de modo que o material obtido não poderia ser empregado na obtenção de curativos ou na confecção de equipamentos de proteção individual. Por outro lado, na presente invenção, o uso da eletrofiação permite que os materiais obtidos possam ser aplicados na obtenção de materiais de proteção individual, sem a necessidade de processamentos sequenciais.

[015] O documento WO 2020/159946 descreve nanofibras eletrofiadas coaxiais com propriedades antimicrobianas, de estrutura núcleo-envoltório. O documento descreve ainda o uso de nanopartículas de prata como agente antimicrobiano presente no núcleo da fibra. O WO 2020/159946 reivindica ainda estruturas nanofibrosas compreendendo um copolímero em bloco anfifílico, um polímero hidrofóbico e um agente antimicrobiano. O documento divulga a obtenção de nanofibras, cuja aplicação limita-se à obtenção de curativos no tratamento de infecções. Na presente invenção não são utilizados copolímeros em bloco, mas sim biopolímeros, e o agente antimicrobiano é obtido durante o processo. Ademais, na presente invenção, as nanofibras obtidas podem ser empregadas tanto na obtenção de curativos (como no tratamento de feridas, por exemplo), como na obtenção de equipamentos de proteção individual. Além disso, são utilizados biopolímeros e condições de processamento condizentes com os princípios da química verde.

[016] O documento US 11,124,897 faz uso da eletrofiação coaxial para o carreamento e entrega controlada de antibióticos e/ou outros agentes bioativos carregados no núcleo e/ou camada de casca da plataforma fibrosa, liberadas de forma controlada. No entanto, o US 11,124,897 limita-se à obtenção de curativos no tratamento de infecções. Diferentemente, a presente invenção utiliza biopolímeros e condições de processamento condizentes com os princípios da química verde.

[017] O documento US 2017/0042822 refere-se a uma membrana nanofibrosa e mais particularmente a um processo de produção a partir de PCL e ácido hialurônico (HA), sendo a matriz capaz de inibir o crescimento de microrganismos. É utilizada radiação ultravioleta para induzir a formação de AgNPs. No entanto, na presente invenção as AgNPs são obtidas sem a necessidade de qualquer pós-tratamento das nanofibras ou soluções, possuindo, assim, a vantagem de ser um procedimento mais simples e acessível.

[018] O documento CN105332163 relaciona-se à preparação de nanofibras eletrofiadas contento nanopartículas de prata adsorvidas. Para alcançar esse objetivo, é proposta a realização do processo em quatro etapas, sendo elas: (1) preparação de uma solução mista de óxido de polietileno (PEO) e carboximetilcelulose (CMC); (2) preparação de nanofibras compostas PEO/CMC por eletrofiação; (3) adsorção dos íons parta a partir de uma solução de nitrato de prata; (4) obtenção das nanopartículas de prata por redução empregando luz ultravioleta. A principal desvantagem a ser destacada é a quantidade de etapas necessárias para a obtenção da amostra final, aumentando as chances de contaminações, reduzindo a reprodutibilidade e elevando os custos energéticos e de produção. Ademais, as nanopartículas de prata são obtidas por fotoindução, fazendo-se necessária a utilização de fontes de iluminação UV. Nesse cenário, pode-se ainda destacar a dependência de distribuição dos íons prata pela matriz, algo que é dificilmente controlado e/ou reprodutível. Diferentemente, a presente invenção faz o uso de uma técnica que envolve apenas duas etapas, sendo uma delas a preparação das soluções de trabalho e a seguinte, a eletrofiação em etapa única. Dessa forma, o tempo de serviço, bem como os custos de produção são reduzidos e o método apresenta alta reprodutibilidade.

[019] O documento EP 3 165 511 revela a formação de filmes por secagem, em que a formação de nanopartículas de prata é alcançada empregando-se agentes redutores orgânicos. No entanto, o método empregado na obtenção dos filmes não confere ao material o caráter nanofibroso obtido pela eletrofiação. Além disso, as nanopartículas dependem da utilização de agentes redutores que, na maioria dos casos, são tóxicos ao organismo humano. Diferentemente, a presente invenção faz uso de uma técnica que possibilita a obtenção de um material nanofibroso, cujas principais características envolvem a elevada área superficial, porosidade e uniformidade, essenciais para o campo de aplicação biomédico. Ademais, as nanopartículas de prata são obtidas sem a utilização de quaisquer agentes tóxicos redutores.

[020] O documento US 7,410,650 B2 utiliza uma metodologia que envolve pelo menos quatro etapas, sendo elas: preparação da solução em um solvente orgânico, em seguida, um sal de prata e um redutor são adicionados à solução dispersante, a solução dispersante é então agitada para formar nanopartículas de prata e ao reagir o sal de prata com o redutor e distribuir as nanopartículas de prata na solução orgânica uniformemente; na sequência, uma resina de polímero para fiação é adicionada à solução orgânica. Por fim, um processo de fiação úmida é usado para obtenção das fibras de nano-prata. Dentre as principais desvantagens da patente, tem-se as várias etapas envolvidas no processo de obtenção do material final e a formação de nanopartículas de prata com diâmetros de aproximadamente 100 nm. Contudo, para a inibição de microrganismos, vários estudos têm mostrado que o ideal são nanopartículas com diâmetros inferiores a 30 nm. Por esse lado, a presente invenção divulga um método reprodutível, em que as nanopartículas de prata obtidas apresentam tamanhos inferiores a 30 nm, sendo ideais para o controle de microrganismos.

[021] O documento US 9,505,027 B2 tem como foco a imobilização de nanopartículas de prata em substratos sólidos com diferentes propriedades da superfície. O método envolve duas etapas, sendo a primeira, a modificação covalente do polímero empregado. Ademais, as nanopartículas encontram-se imobilizadas na estrutura. Dentre as principais desvantagens do documento, o primeiro ponto a ser destacado é a modificação covalente do polímero, fato que encarece a produção e dificulta a obtenção do produto final, visto que o êxito da modificação inicial torna-se uma etapa limitante para a obtenção do produto final. Além disso, as nanopartículas encontram-se imobilizadas em um substrato sólido, fato que delimita a sua área de ação. Contrariamente, a presente invenção não envolve nenhum tipo de modificação polimérica. Além disso, as nanopartículas são formadas em uma matriz nanofibrosa que não impede a sua movimentação/liberação a partir do material, elevando a sua área de ação.

[022] O documento US 2009/0130186 fornece conjuntos de curativos para feridas, sistemas e métodos que utilizam nanomateriais, como prata nanopartículas incorporadas em um material esponjoso de polímero hidrofílico, como a quitosana. Dentre as principais desvantagens do referido documento temos o uso de uma série de etapas e cada etapa sendo realizada por diferentes vias, e a utilização de agentes redutores adicionais. Diferentemente, a presente invenção propõe um método de obtenção do material final de maneira simples e com ausência da adição de agentes redutores tóxicos adicionais.

[023] Ademais, outros do estado da técnica, tais como WEI, X., et al., 2021, “Controlled Release of Monodisperse Silver Nanoparticles via in Situ Cross-Linked Polyvinyl Alcohol as Benign and Antibacterial Electrospun Nanofibers” (Colloids Surfaces B Biointerfaces); WILEY BLOSI, M., et al, 2021, “Polyvinyl Alcohol/Silver Electrospun Nanofibers: Biocidal Filter Media Capturing Virus-Size Particles” (J. Appl. Polym. Sci); YANG, Y., et al. 2020, “A Facile Method for the Fabrication of Silver Nanoparticles Surface Decorated Polyvinyl Alcohol Electrospun Nanofibers and Controllable Antibacterial Activities” (Polymers); KOWSALYA, E.; et al., 2019, “Electrospun Nanofibers for Potential Antimicrobial Food Packaging Applications” (Food Packag. Shelf Life); e AUGUSTINE, R.; et al., 2018, “Incorporated with Green Synthesized Silver Nanoparticles for Wound Dressing Applications” (J. Mater. Sci. Mater. Med) também descrevem a obtenção de nanofibras incorporadas com nanopartículas, mas não apresentam a vantagem da presente invenção da obtenção em etapa única pela redução no próprio polímero componente das nanofibras.

[024] Tendo vista o estado da técnica, a presente invenção traz como inovação a obtenção de nanofibras uniaxiais e coaxiais capazes de incorporar nanopartículas de prata “in situ”, ou seja, as AgNPs participam da etapa de formação das nanofibras e sem empregar qualquer agente redutor adicional (que geralmente são tóxicos), pós- tratamento térmico ou irradiação UV, algo inédito na literatura até então, imprescindível no desenvolvimento de EPIs que atuem na proteção e controle de microrganismos, ou seja, na produção de “EPIs inteligentes”. Na presente invenção, o próprio polímero é utilizado como agente redutor e estabilizador que suporta as nanopartículas metálicas em sua matriz nanofibrosa. Desse modo, é fornecido um método simplificado, barato e eficiente de obtenção de nanofibras eletrofiadas uniformes com nanopartículas de prata em etapa única, em que um número reduzido de etapas é empregado, e que apresenta condições de processamento condizentes com os princípios da química verde.

[025] Em resumo, a presente invenção apresenta um método de obtenção de nanofibras, formadas ao mesmo tempo que as nanopartículas pré-nucleadas na solução polimérica, e incorporadas ao tecido durante a eletrofiação, ou seja, um método de obtenção “in situ”, de etapa única. Tal método não emprega o pós-carregamento, tradicionalmente utilizado no estado da técnica, e por isso, não emprega tratamentos e/ou compostos considerados tóxicos. Além disso, as nanopartículas de prata são incorporadas no núcleo das nanofibras coaxiais, e não no envoltório das mesmas, o que proporciona baixa polidispersão e excelente distribuição no tecido produzido, além de serem apresentadas na forma coloidal e usadas em combinações poliméricas. Desse modo, é obtido um material em escala nanométrica com elevada reprodutibilidade, elevada área superficial, elevada porosidade e elevada flexibilidade, em comparação aos materiais obtidos pelos métodos amplamente conhecidos do estado da técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[026] Em resumo, a presente invenção se refere a um método de obtenção de nanofibras eletrofiadas uniaxiais e coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs), de atividade antimicrobiana, às referidas nanofibras obtidas pelo mesmo e a seus usos destinados à produção de materiais com aplicação no âmbito biomédico/hospitalar. A invenção está relacionada aos campos da nanotecnologia e engenharia de tecidos.

[027] O método de obtenção da presente invenção compreende as etapas de (a) produzir uma combinação dos polímeros (PVA e CHT) para a formação da blenda polimérica do núcleo da fibra, em que as nanopartículas de prata pré- nucleadas são formadas na blenda polimérica; e (b) obter por eletrofiação nanofibras uniaxiais ou coaxiais, de tamanho médio na ordem de 20-25 nm, constituídas pelas blendas do núcleo (PVA/CHT/AgNPs) e do envoltório (PCL), em que as nanopartículas de prata (AgNPs) são incorporadas ao tecido durante a eletrofiação, ou seja, “in situ”.

[028] Adicionalmente, a presente invenção se refere às nanofibras eletrofiadas uniaxiais e coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs) obtidas pelo referido método, de atividade antimicrobiana, de tamanho médio na ordem de 20-25 nm, constituídas pelas blendas do núcleo (PVA/CHT/AgNPs) e do envoltório (PCL).

[029] Por fim, a presente invenção se refere ao uso das referidas nanofibras para produção de materiais com aplicação no âmbito biomédico/hospitalar.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[030] A Figura 1 apresenta em (A-B) nanofibras de PCL 10% (m/V); (C) Distribuição de diâmetros das nanofibras de PCL.

[031] A figura 2 apresenta em (A-B) nanofibras de PCL 10% (m/V) e AgNPs pelo método de pós-carregamento; (C) Distribuição de diâmetros das nanofibras de PCL; (D) espectroscopia de dispersão de energia de raios X (EDS) das nanofibras.

[032] A figura 3 apresenta em (A-B) nanofibras de PVA 12% (m/V) e AgNPs in situ; (C) Distribuição de diâmetros das nanofibras de PCL; (D) EDS das nanofibras.

[033] A figura 4 apresenta os espectros de absorção eletrônica da AgNPs liberadas a partir das nanofibras de PVA-AgNPs obtidas in situ; (B) Cinética de Liberação.

[034] A figura 5 apresenta a distribuição de tamanhos por número das AgNPs liberadas partir das nanofibras de PVA- AgNPs in situ. A figura 6 em (A-B) apresenta a microscopia eletrônica de varredura das nanofibras de PVA/CHT (70/30); (C) Distribuição de diâmetros das nanofibras.

[035] A figura 7 em (A-B) apresenta a microscopia eletrônica de varredura das nanofibras de PVA/CHT/AgNPs in situ (70/30); (C) Distribuição de diâmetros das nanofibras.

[036] A figura 8 apresenta os espectros de espectroscopia no infravermelho (ATR) das nanofibras de PVA, PVA/CHT e PVA/CHT/AgNPs (in situ).

[037] A figura 9 apresenta a (A) microscopia eletrônica de varredura das nanofibras coaxiais incorporadas com AgNPs in situ e a (B) distribuição de diâmetros de nanofibras coaxiais incorporadas com AgNPs in situ.

[038] A figura 10 em (A-B) apresenta os difratogramas de Raios-X em (A) polímeros constituintes das nanofibras e (B) das nanofibras uniaxiais e coaxiais.

[039] A figura 11 em (A e B) apresenta as curvas de análises termogravimétricas (TGA) para os polímeros precursores e nanofibras; (B e D) as curvas de termogravimetria derivada (DTG) para os polímeros precursores e nanofibras.

[040] A figura 12 apresenta a atividade antibactericida das nanofibras de PVA e PVA/CHT incorporadas com AgNPs no controle de bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus) e gram-negativas (Escherichia coli).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[041] A presente invenção se refere a um método de obtenção de nanofibras eletrofiadas uniaxiais e coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs), de atividade antimicrobiana, às referidas nanofibras obtidas pelo mesmo e a seus usos para produção de materiais com aplicação no âmbito biomédico/hospitalar. A invenção está relacionada aos campos da nanotecnologia e engenharia de tecidos.

[042] O referido método de obtenção da presente invenção compreende as etapas de: (a) produzir uma combinação dos polímeros (PVA e CHT) para a formação da blenda polimérica do núcleo da fibra, em que as nanopartículas de prata pré-nucleadas são formadas na blenda polimérica; e (b) obter por eletrofiação nanofibras uniaxiais ou coaxiais, de tamanho médio na ordem de 20-25 nm, constituídas pelas blendas do núcleo (PVA/CHT/AgNPs) e do envoltório (PCL), em que as nanopartículas de prata (AgNPs) são incorporadas ao tecido durante a eletrofiação, ou seja, “in situ”.

[043] Para demonstrar o potencial do referido método de obtenção das nanofibras, as referidas etapas serão mais bem detalhadas sob aspecto dos procedimentos/concretizações realizados, assim como dos resultados obtidos. Cabe ressaltar que a descrição a seguir tem apenas a finalidade de elucidar o entendimento da invenção proposta e revelar, de forma mais detalhada, a concretização da invenção sem limitá-la ao mesmo. Dessa forma, variáveis similares ao exemplo também estão dentro do escopo da invenção.

[044] Na presente invenção, são empregados os seguintes polímeros: quitosana 85% desacetilada apresentando massa molar viscométrica (Mv) de 87 kDa adquirida da Golden- Shell Biochemical (China), poli-ε-caprolactona (PCL - Sigma Aldrich) com massa molar 80.000 gmol-1 e poli álcool vinílico (PVA - Neon) com massa molar 104.500 gmol-1. Além disso, é empregado nitrato de prata (AgNO3), dimetilformamida, diclorometano e ácido acético, todos obtidos pela Sigma Aldrich. A água utilizada em todas as etapas é do tipo ultrapura.

[045] As nanofibras eletrofiadas também foram testadas quanto ao processo de reticulação do poli álcool vinílico (PVA) e da quitosana. Em geral, diferentes ácidos carboxílicos têm sido relatados como agentes de reticulação para o PVA. Na presente invenção, o agente de reticulação de ácido tricarboxílico mais favorável foi o ácido cítrico. Contudo, outros agentes de reticulação podem ser selecionados de ácidos carboxílicos de diferentes tipos, tais como ácidos mono, di, tri e policarboxílicos e também por seus derivados como anidridos ácidos e cloretos ácidos, dentre os quais pode-se destacar: ácido fórmico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido málico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido subérico, ácido tereftálico, ácido 4- sulfoftálico, ácido sulfossuccínico, ácido furanodicarboxílico, ácido butano-1,2,3,4-tetracarboxílico, anidrido maleico, dianidrido etilenodiaminotetracético, dianidrido 3,3', 4,4' benzofenona tetracarboxílico, anidrido 4,4-oxidiftálico e dianidrido piromelítico. A reticulação envolvendo ácido cítrico foi realizada empregando-se 20% em massa do ácido cítrico em relação à massa total dos polímeros (PVA e CHT) e a temperatura de 110°C. Vale destacar que a realização do processo envolve a adição de ácido cítrico (20% em massa em relação aos demais polímeros) no momento da preparação das soluções para eletrofiação. Após a obtenção da matriz nanofibrosa, o processo de reticulação é realizado. Para tanto, as nanofibras são deixadas em estufa por um período de 16 horas.

[046] São obtidas nanofibras constituídas por blendas poliméricas de PVA e CHT (PVA/CHT e PVA/CHT/AgNPs; tabelas 2, 3 e 4) através de eletrofiação uniaxial. Além disso, também são obtidas nanofibras com injeção coaxial [PCL(PVA/CHT)] e [PCL(PVA/CHT/AgNPs)] com estrutura núcleo- envoltório, estas últimas a partir do arranjo experimental, tal como apresentado na Tabela 1. Tabela 1: Preparo das soluções para a eletrofiação.* Refluxo

Triagem inicial: obtenção das Nanofibras Uniaxiais

[047] As nanofibras de PCL, CHT e PVA são primeiramente avaliadas de forma isolada. Todas as condições experimentais empregadas são apresentadas na Tabela 1.

[048] Após a obtenção das soluções poliméricas, conforme Tabela 1, cada uma é submetida ao processo de eletrofiação separadamente para a obtenção das nanofibras de “polímeros isolados”. Para isso, cada solução é cuidadosamente transferida para uma seringa convencional de 10 mL (diâmetro interno igual a 14 mm). Além disso, as seringas são acopladas a um capilar metálico (agulha) cuja extremidade é previamente cortada (diâmetro interno entre 0,10 e 2,00 mm). A mistura é mantida na seringa sob pressão constante (fluxo variando entre 0,25 mL h-1 e 2,00 mL h-1). Para a obtenção das fibras, aplica-se uma diferença de potencial elétrico (ddp) (variando entre 10 e 25 kV) entre a ponta da agulha e o aparador metálico plano esférico (diâmetro = 25 cm) separados por uma distância (variando entre 5 e 30 cm).

[049] O AgNO3 é empregado como precursor para a obtenção das nanopartículas de prata (AgNPs), principal agente antimicrobiano da formulação.

[050] Após a obtenção das nanofibras contendo “polímeros únicos” (triagem inicial) é realizada a etapa de combinação dos polímeros (PVA e CHT), isto é, a formação de blendas poliméricas, de modo a obter propriedades melhoradas em relação às espécies isoladas. As informações referentes a cada blenda polimérica são apresentadas na Tabela 2. Tabela 2: Incorporação dos fármacos e obtenção das blendas *Refluxo

[051] Para a obtenção das blendas, as soluções (70% PVA e 30% CHT v/v) são misturadas, sempre adicionando-se a solução de quitosana à solução de PVA. A amostra é mantida em agitação por quinze minutos para garantir a homogeneidade da blenda polimérica.

[052] Após as triagens iniciais e definição dos parâmetros de eletrofiação para todas as amostras, são obtidas as nanofibras. De modo geral, as soluções são transferidas para uma seringa convencional de 10 mL e diâmetro do capilar metálico (agulha) de 0,7 mm. A mistura é mantida na seringa sob pressão constante com um fluxo característico de 0,50 mL h-1. Para a obtenção das fibras, aplica-se uma diferença de potencial elétrico (ddp) da ordem de 23 kV entre a ponta da agulha e o aparador metálico plano esférico (diâmetro = 25 cm) separados por uma distância de 10 cm. Os mesmos parâmetros de eletrofiação são empregados na obtenção nas nanofibras constituídas pelas blendas apresentadas na Tabela 2.

Obtenção das Nanofibras Coaxiais

[053] Na sequência, é realizada a obtenção das nanofibras coaxiais, ou seja, aquelas com estrutura núcleo- envoltório. Para tal, são seguidos os mesmos parâmetros acima descritos. Em todos os casos, o núcleo foi constituído pelas blendas poliméricas apresentadas na Tabela 2 (PVA/CHT e PVA/CHT/AgNPs) e demais soluções/blendas empregadas são apresentadas na Tabela 3. O envoltório foi composto pela solução de PCL (ver Tabela 3). Para a eletrofiação coaxial faz-se necessária a utilização de duas seringas, uma para a solução interna (núcleo) e outra para a solução externa (envoltório). Dessa forma, para a combinação das soluções é utilizada uma agulha coaxial. Tabela 3: Composição das nanofibras coaxiais.

[054] De modo geral, as soluções interna (núcleo) e externa (envoltório) são transferidas para duas seringas convencionais de 10 mL com a agulha coaxial acoplada, com diâmetro do capilar metálico (agulha) de 0,7 mm. A mistura é mantida nas seringas sob pressão constante com um fluxo característico de 0,50 mL h-1. Para a obtenção das fibras, aplica-se uma diferença de potencial elétrico (ddp) da ordem de 23 kV entre a ponta da agulha e o aparador metálico plano esférico (diâmetro = 25 cm) separados por uma distância de 10 cm.

[055] Em resumo, as nanofibras assim obtidas, apresentam elevada área superficial, elevada porosidade e alta flexibilidade. Adicionalmente, o material obtido de nanofibras eletrofiadas com nanopartículas de prata apresenta grande potencial para ser empregado na confecção de “tecidos inteligentes” com potencial aplicação no âmbito biomédico/hospitalar. Nos ensaios realizados, os tecidos apresentaram excelente potencial de inibição no crescimento de bactérias gram-positivas, gram-negativas, além de terem apresentado excelente potencial na morte do Sars-cov2.

Caracterização das Nanofibras

[056] Todas as nanofibras obtidas (uniaxiais e coaxiais) foram avaliadas por microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia no infravermelho (ATR). Além disso, as nanofibras contendo AgNPs também foram avaliadas por espectroscopia de dispersão de energia de raios X (EDS), análises termogravimétricas (TGA), difração de raios X (DRX) e propriedades mecânicas (texturômetro).

Estudo de liberação in vitrodas AgNPs a partir das nanofibras

[057] Para a realização dos estudos de liberação in vitro do fármaco, amostras das nanofibras com as dimensões 5x5 cm2 foram colocadas em contato com 10 ml do meio de liberação (tampão fosfato salino; pH 7,4). A temperatura e a agitação do sistema foram fixadas em 37°C e a 50 rpm, respectivamente. Uma alíquota da amostra foi retirada, em intervalos de tempo específicos. Cada alíquota foi analisada por absorção eletrônica medindo-se a absorbância à 430 nm a partir da construção prévia de uma curva de calibração.

Atividade antibactericida das nanofibras em S. Aureuse. coli - Método do Crescimento

[058] O método de crescimento é realizado a partir de três a cinco colônias, bem isoladas, do mesmo tipo morfológico selecionadas da placa de ágar. A superfície de cada colônia é tocada com uma alça, e os microrganismos são transferidos para um tubo contendo entre 4 e 5 mL de um meio de cultura adequado, como caldo de soja tríptica. Em seguida, a cultura é incubada em caldo à 35°C, até alcançar ou exceder a turbidez de uma solução padrão de McFarland 0,5 (em geral, de duas a seis horas). Na sequência, a turbidez da cultura em crescimento é ajustada com solução salina estéril ou caldo, de modo a obter uma turbidez óptica comparável à da solução padrão de McFarland a 0,5. Isso resulta em uma suspensão contendo aproximadamente de 1 a 2x108 UFC/mL de E. coli ATCC® 25922. Para realizar esta etapa, faz-se uso de um espectrofotômetro.

- Inoculação das Placas de Teste

[059] Em condições ideais, um swab de algodão estéril é mergulhado na suspensão ajustada, até 15 minutos após o ajuste da turbidez da suspensão de inóculo. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente contra a parede interna do tubo, acima do nível do líquido. Isso ajudará a retirar qualquer excesso de inóculo no swab. A superfície seca da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o swab em toda a superfície estéril do ágar. O procedimento é repetido esfregando outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60° a cada vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Como passo final, um swab é passado na margem da placa de ágar.

[060] A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos, embora nunca mais de 15 minutos, de maneira a permitir que qualquer excesso de umidade seja absorvido antes que os discos impregnados de droga sejam aplicados.

- Leitura das Placas e Interpretação dos Resultados

[061] Após 16 a 18 horas de incubação, cada placa é examinada. Se a placa foi satisfatoriamente semeada, e o inóculo está correto, os halos de inibição resultantes serão uniformemente circulares e haverá um tapete confluente de crescimento. Se colônias individuais forem aparentes, o inóculo foi demasiado leve e o teste deverá ser repetido. Os diâmetros dos halos de inibição total (julgadas a olho nu) são mensurados, incluindo o diâmetro do disco. Os halos foram medidos em milímetros usando um paquímetro que é encostado na parte de trás da placa de petri invertida. A placa de petri foi posicionada poucas polegadas acima de um fundo não refletor e iluminada com luz refletida. Ensaio Virucida Tabela 4: Célula e Vírus testados: Coronavírus cepa MHV gênero Betacoronavirus (mesmo gênero das espécies SARS-CoV- 1, SARS-CoV-2, MERS e outros).

[062] Os ensaios foram realizados em laboratório NB-2 (Biosafety Level 2) seguindo as Recomendações da ANVISA Art. 1 e Art. 3 da IN 04/13 e IN 12/16 e metodologias descritas nas normas (BS ISO 21702:2019 “Measurement of antiviral activity on plastics and other non-porous surfaces”, BS EN 14476:2013+A2:2019 e do Instituto Robert Koch - RKI) e obedecendo as Boas Práticas de Laboratório (BPL). Os testes foram realizados em quadruplicata (quatro repetições) biológica: Meio de cultura para vírus e linhagem celular foi utilizado meio essencial mínimo Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal.

[063] A titulação dos Coronavírus (Cepa MHV-3) foi realizada de acordo com o método DICT50 (Doses Infectantes de Cultivos Tecidos 50%), onde diluições sequenciais do vírus na base 10 foram realizadas em quadruplicata, em microplacas 96 orifícios estéreis. A seguir foram adicionadas as células L929 com uma concentração de 2 x 105células/orifício. Após 48 horas o efeito citopático (ECP) da infecção viral é verificado, em comparação com controle celular e controle viral.

[064] A primeira etapa dos ensaios foi realizar a “Determinação da Concentração Máxima não tóxica (CMNT)” nas diferentes células testadas, para determinar a concentração que não causa toxicidade para as células, pois a substância teste deve ser ativa somente contra o vírus e não às células.

[065] Amostras testes “PVA/AgNPs (uniaxial), PVA/CHT - AgNPs (uniaxial), PCL[PVA/CHT] e PCL[PVA-CHT-AgNPs] (coaxial), foram tratadas individualmente. Os materiais foram cortados em cinco pedaços iguais e adicionadas ao Coronavírus, em meio de Cultivo DMEM, previamente titulado e submetidas a diferentes tempos de contato (30 minutos, 1, 8, 24 e 64 horas), sob agitação leve.

[066] Os sobrenadantes de cada material e após cada tempo de ação foram adicionados às microplacas de 96 orifícios com 100 μL de cada amostra teste, 100 μL de vírus que foram tituladas (101 a 1010). Todo o sistema foi adicionado às células L929 (2x105 células/mL) previamente cultivadas em placas de 96 orifícios e incubadas à 37°C em estufa com 5% de CO2 durante 48 horas.

[067] Após 48 horas de incubação as placas foram lidas através de Microscópio Invertido na busca do efeito citopático característico do vírus, e os títulos foram calculados com base no método de REED and MUENCH, 1938. Os resultados são expressos em percentual de inativação viral (Tabela 5) em comparação com o controle viral (título do vírus) não tratado.

[068] Os controles utilizados foram: • Negativo: controle celular (2x105células/mL) em meio DMEM, sem vírus e sem amostra teste; • Controle de vírus: Titulação de vírus (101 a 1012) e cultura de células em meio DMEM; • Teste positivo: presença de vírus, cada amostra teste e linhagem celular em meio DMEM. Tabela 5: Os resultados são expressos em percentual de inativação viral em comparação com o controle viral não tratado. https://microchemlab.com/information/log-and-percent-reductions-microbiology—and—antimicrobial—testing

RESULTADOS Otimização e caracterização das nanofibras uniaxiais e coaxiais

[069] As soluções internas e externas da nanofibras coaxiais foram primeiramente avaliadas independentemente. A microscopia eletrônica de varredura das fibras de PCL é apresentada na Figura 1.

[070] De maneira geral, as fibras de PCL na ausência de CUR foram obtidas com elevado grau de uniformidade (Figuras 1A e 1B) e diâmetro médio de 800 nanômetros

[071] A interação do PCL também foi avaliada após os pós carregamento com AgNPs preparadas pelos métodos de ultrassom. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 2.

[072] As Figuras 2A e 2B mostram claramente que apesar da formação das fibras, elas apresentaram elevada heterogeneidade acerca de suas espessuras. Nota-se ainda, a presença de aglomerados de prata na estrutura das fibras (Figura 2B), com tamanhos muito maiores do que o esperado, sendo, portanto, um fator desfavorável. Além disso, a Figura 2C mostra um diâmetro médio de cerca de 1000 nanômetros. Por fim, a Figura 2D mostra o pico em 2,98 eV referente à prata metálica incorporada nas nanofibras. Apesar da presença da prata, a heterogeneidade das fibras associada ao tamanho das AgNPs obtidas, deixa claro que a via de incorporação por pós-carregamento, tradicionalmente utilizada no estado da técnica, não é útil. Ademais, verifica-se que a espessura das fibras de PCL varia significativamente com a incorporação das AgNPs.

[073] Tendo em vista essas informações, foi avaliada a interação das nanofibras de PVA com a AgNPs. Os resultados obtidos para os ensaios envolvendo a síntese in situ das AgNPs são apresentados na Figura 3.

[074] As nanofibras de PVA apresentaram elevado grau de uniformidade com relação à sua espessura, ausência de beads e espessura média de 400 nanômetros. Além disso, o espectro de EDS demostra claramente a existência de AgNPs na fibra (sinal em 2,98eV). Além disso, a coloração amarelada das fibras obtidas remete ao sucesso na obtenção das AgNPs in situ. Neste caso, as fibras foram obtidas com maior homogeneidade e menor espessura.

[075] Nessas condições, avaliou-se a cinética de liberação das AgNPs a partir das nanofibras de PVA, conforme a Figura 4.

[076] De modo geral, as AgNPs foram rapidamente liberadas a partir das nanofibras de PVA. Nota-se na Figura 4A o surgimento de um pico de absorção com máximo em 430 nanômetros. Além disso, observa-se o contínuo aumento na intensidade de absorção até 500 segundos. Os dados cinéticos, Figura 4B, mostram um aumento praticamente linear na absorbância das AgNPs até 500 segundos. Abaixo da Figura 4 são representados os estágios da liberação com o decorrer do tempo. Nota-se o surgimento de uma coloração amarelada, característica de AgNPs esféricas.

[077] A solução de liberação foi posteriormente avaliada por espalhamento de luz dinâmico, para a determinação do diâmetro hidrodinâmico (DH), índice de polidispersividade e potencial Zeta das AgNPs liberadas. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 5. Ademais, as análises de potencial Zeta (em triplicata) podem ser observadas na Tabela 6. Tabela 6: Análises de potencial Zeta

[078] As AgNPs liberadas das nanofibras de PVA-AgNPs in situ apresentaram DH médios de aproximadamente 20 nanômetros e índice de polidispersividade de 0,5. De acordo com a literatura, as AgNPs com as características obtidas são ideais para a obtenção de efeitos antimicrobianos. Ademais, o potencial de superfície obtido foi de aproximadamente -5,12 ± 0,62 mV, estando próximo à neutralidade, como esperado (Tabela 6).

[079] Apesar das ótimas características apresentadas pelas AgNPs obtidas pela metodologia in situ, a cinética de liberação ocorreu em um intervalo de tempo muito curto. Portanto, para melhorar esse perfil de liberação, foram produzidas nanofibras de PVA/CHT (70/30). A CHT é um polímero natural e biocompatível, extensivamente estudada na reconstrução da matriz extracelular, além de apresentar efeitos antimicrobianos intrínsecos. Nesse sentido, seu caráter hidrofóbico tenderá a diminuir a taxa de liberação dos fármacos incorporados. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 6.

[080] As nanofibras de PVA/CHT apresentadas na Figura 6 foram obtidas com grau de uniformidade em relação à espessura, apesar da presença de beads. Além disso, nota-se que as fibras obtidas apresentaram diâmetros muito finos, da ordem de 150 nanômetros, sendo ideais para a aplicação no tratamento de feridas, reconstrução da MEC, incorporação e liberação de fármacos.

[081] Tendo em vista a obtenção de fibras ultrafinas a partir da blenda de PVA/CHT (70:30), na sequência foram obtidas as nanofibras do mesmo tipo, mas na presença do AgNO3 para a obtenção de AgNPs in situ, da mesma maneira que foram preparadas as nanofibras apresentadas na Figura 6. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 7.

[082] As microscopias apresentadas na Figura 7 mostram que a presença do sal de prata não afetou a obtenção das nanofibras, sendo obtidas fibras homogêneas, com menor quantidade de defeitos do que as obtidas na ausência do AgNO3 (Figura 6). Apesar disso, o diâmetro das fibras praticamente dobrou devido à presença do sal e consequente formação das AgNPs. Vale destacar que a formação das AgNPs pode ser atribuída à coloração amarela apresentada pela fibra obtida. Os espectros de infravermelho das nanofibras de PVA, PVA/CHT e PVA/CHT/AgNPs são apresentadas na Figura 8.

[083] Na Figura 8 são apresentados os espectros de espectroscopia no infravermelho (ATR) das nanofibras de PVA, PVA/CHT e PVA/CHT/AgNPs. Os sinais referentes ao PVA estão destacados na Figura 8, os sinais referentes à CHT (em menor intensidade), aparecem em 895 e 1150 cm-1 estando associados com a vibração do grupo -COC- dos sacarídeos. Os picos em 1030 e 1080 cm-1 foram atribuídos à vibração de alongamento -CO, enquanto os de 1652, 1587 e 1318 cm-1 foram atribuídos à flexão -NH das aminas grupos I, II e III, respectivamente. O modo de deformação simétrica do grupo -CH3 aparece em 1374 cm-1 e o de alongamento para a ligação -CH em 2922 cm-1. Por último, a banda larga em aproximadamente 3430 cm-1 corresponde à vibração de alongamento -OH do CHT.

[084] Tendo em vista o conjunto de resultados obtidos, verifica-se que tanto as nanofibras de PCL como as nanofibras de PVA/CHT foram devidamente obtidas pelo método de eletrofiação coaxial. Além disso, com base na espessura das fibras obtidas, conclui-se que o PCL deve ser utilizado no envoltório, ou seja, no “shell” das nanofibras coaxiais. Por outro lado, as nanofibras ultrafinas de PVA/CHT/AgNPs in situ, são condizentes com as características necessárias para a composição do “core” das nanofibras coaxiais.

[085] Com base nos resultados obtidos no item anterior (Otimização das nanofibras uniaxiais) foram obtidas nanofibras do tipo “core-shell” contendo um núcleo constituído por PVA/CHT/AgNPs (70:30 m/m) e um envoltório constituído por PCL, nomeadas PCL[PVA/CHT/AgNPs]. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 9.

[086] As nanofibras de PCL[PVA/CHT/AgNPs] (Figura 9) apresentaram grau de uniformidade em relação à espessura (diâmetro médio igual a 300 nm), apesar da presença de beads. Além disso, nota-se que as fibras obtidas apresentaram diâmetros intermediários entre as nanofibras uniaxiais referentes ao núcleo e ao envoltório, sendo convenientes para a aplicação no tratamento de feridas, reconstrução da matriz extracelular, incorporação e liberação de fármacos, ou ainda na obtenção de equipamentos de proteção individual. Os difratogramas de Raios-X obtidos são apresentados na Figura 10.

[087] Primeiramente, os polímeros precursores das nanofibras foram avaliados para DRX (Figura 10A). O difratograma de CHT, Figura 10A, revela a presença de um pico em 11,8° e outro em 20,2°, representando as regiões simétricas intrínsecas de CHT. O DRX do PVA também foi avaliado, observa-se a existência de um sinal em torno de 20° correspondendo à natureza semicristalina do PVA puro. Por fim, o homopolímero PCL cristaliza facilmente e o padrão de difração revela a presença de cristalinidade significativa com picos em 21,9° e 24,2° correspondentes aos planos (110) e (200) da estrutura cristalina ortorrômbica.

[088] As nanofibras uniaxiais PVA/CHT, PVA/AgNPs, PVA/CHT/AgNPs Figura 10B, apresentaram sinal ampliado entre 15° e 30°. Além disso, os sinais das regiões cristalinas CHT aparecem discretamente. Assim, as interações entre as cadeias poliméricas rompem os arranjos cristalinos presentes nos polímeros. Ademais, verifica-se que a presença/formação das AgNPs reduz ainda mais a intensidade da banda alargada, indicando a sua interação com as cadeias poliméricas. Por outro lado, o DRX das nanofibras coaxiais (PCL- PVA/CHT/AgNPs) apresenta, além da banda alargada entre 15° e 30°, referente aos polímeros constituintes do núcleo, os principais sinais em 21,9° e 24,2° que são atribuídos à cristalinidade intrínseca do PCL. Dessa maneira, a presença da cristalinidade do PCL indica a eficiente formação da nanofibra coaxial, denotando a ausência de interações entre as cadeias do núcleo e envoltório, fato desejado.

[089] A estabilidade térmica das nanofibras e de seus polímeros precursores foi avaliada por TGA, Figura 11A e C, e suas respectivas curvas DTG na Figura 11B e D. O primeiro estágio de perda de peso na faixa de 30 a 120°C em todos os perfis de TGA foi atribuído à perda de água cristalina. Eventos relacionados à degradação dos polímeros foram observados na faixa de 150 - 500°C. A curva de análises termogravimétricas (TGA) para o PVA puro apresenta três regiões de perda de massa. Como supracitado, a primeira região entre 50 e 200°C pode ser atribuída à perda das moléculas de água absorvidas, enquanto a segunda entre 200 e 340°C está relacionada com a perda de água ligada à matriz polimérica. A terceira região entre 340 e 450°C está associado à decomposição e carbonização do polímero. Para CHT a degradação ocorre acima de 250°C com Tmax em 280°C. Para o PCL, pode-se observar uma etapa de degradação na faixa de 350 a 450°C, estando de acordo com a literatura. Os resultados obtidos para as nanofibras uniaxiais (Figura 11A e B), confirmam a presença de ambos os polímeros na estrutura nanofibrosa. No caso das nanofibras coaxiais, também se verifica os picos referentes a todos os polímeros constituintes, de acordo com as proporções empregadas. Os resultados confirmam a composição das nanofibras. As propriedades mecânicas das nanofibras obtidas são apresentadas na Tabela 7. Tabela 7: Propriedades mecânicas das nanofibras: módulo de Young, resistência à tração e alongamento na ruptura.

[090] De um modo geral, observa-se que a inclusão da quitosana às nanofibras de PVA leva a uma diminuição em seu desempenho mecânico. Contudo, a incorporação das AgNPs eleva o módulo de Young e o alongamento na ruptura nas nanofibras de PVA e PVA/CHT. Resultados semelhantes são verificados para as nanofibras coaxiais, indicando que a incorporação das AgNPs exerce um melhoramento na interação entre os materiais poliméricos da blenda, possivelmente devido à sua interação, redução, alocação e “link” com ambos.

Atividade antibactericida das nanofibras

[091] As nanofibras de PVA e PVA/CHT na ausência e na presença das AgNPs foram avaliadas quanto à sua atividade antibactericida. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 12.

[092] De um modo geral, observa-se que as nanofibras “brancas”, ou seja, que não contêm as AgNPs, não apresentaram atividade antibactericida, dada a ausência de halo de inibição. Assim, a quantidade de CHT (30% m/m), conhecida por sua atividade antimicrobiana, não foi suficiente para exercer atividade inibitória no crescimento dos microrganismos. Por outro lado, todas as amostras contendo AgNPs, apresentaram considerável atividade antibactericida.

[093] De uma maneira geral, a análise por espalhamento de luz dinâmico das AgNPs obtidas a partir das nanofibras nos estudos liberação in vitro, apontam para a existência de nanopartículas com tamanhos na faixa entre 20 e 25 nanômetros. Nesse cenário, estudos anteriores têm demonstrado que AgNPs que apresentam elevada área superficial tem maior facilidade de acesso às células bacterianas, conduzindo a uma maior interação. Além disso, a análise das AgNPs por absorção eletrônica mostrou um comprimento de máxima absorção 435 nanômetros e com coloração nitidamente amarela, característica de AgNPs com formato esférico. Assim, a forma das nanopartículas tem um efeito significativo em sua eficácia antimicrobiana. Estudos anteriores demonstraram que AgNPs com formato esférico necessitam de uma quantidade total de 12,5 μg de prata para atingir a zona de inibição bacteriana. Por outro lado, as nanopartículas em forma de bastão precisam de 50 a 100 μg de prata para atingirem o mesmo resultado. Assim, a obtenção de AgNPs esféricas com tamanhos na ordem de 20 a 25 nanômetros envolvendo uma metodologia de formação/deposição direta das AgNPs nas nanofibras, revela um processo promissor para a obtenção de materiais voltados ao tratamento de feridas.

[094] Um curativo útil deve possuir alguns componentes essenciais característicos tais como uma taxa de transmissão de vapor de água adequada para criar um ambiente úmido nas feridas, prevenindo o risco de desidratação e acúmulo de exsudatos. Além disso, o material requer permeabilidade a gases, pois o processo de reparo que requer O2. Outras características envolvem a capacidade de adsorção de fluido para remoção de exsudatos e nutrientes bacterianos excessivos das feridas, uma barreira às infecções e supressão do crescimento bacteriano, escassez de quaisquer efeitos citotóxicos ao paciente. Logo, as nanofibras eletrofiadas têm propriedades únicas, que se adequam a todos os requisitos necessários para a obtenção de um “curativo inteligente” para o tratamento de regeneração celular em feridas agudas ou crônicas. Trabalhos anteriores já reportaram a incorporação de AgNPs em nanofibras de PCL, mas não mostraram a incorporação in situ das mesmas, bem como nas blendas utilizadas na presente invenção. Além disso, estudos in vivo revelaram que a eletrofiação acelerou a taxa de cicatrização de feridas.

[095] Por fim, destaca-se a atividade bacteriana tanto em linhagem gram-positiva como gram-negativa, sendo a inibição de bactérias gram-negativas geralmente mais difícil ou envolvendo doses maiores dos fármacos ativos. Contudo, os resultados obtidos na Figura 12 deixam claro que as nanofibras incorporadas com AgNPs são ativas em ambas as linhagens e em concentrações similares de Ag0, sendo promissoras no tratamento e controle de bactérias. Atividade virucida das nanofibras

[096] Os resultados obtidos nos ensaios virucidas são apresentados na Tabela 8. Os fatores de redução encontram- se descritos na Tabela 6. Tabela 8: Ensaios com Coronavírus em diferentes tempos de contato com três produtos testados. Coronavírus (MHV): 10A8,25 DICT50/mL e a redução da infectividade viral foi > log 5 (virucida).

[097] Os produtos “PVA/AgNPs (uniaxial), PVA/CHT-AgNPs (uniaxial) e PCL[PVA/CHT-AgNPs] (coaxial)” inibiram até 99, 999% (Redução de infectividade viral de > 5 log) da contaminação viral, e, portanto, pode ser usado como agente virucida comprovado para os vírus do grupo Coronavírus em todos os tempos testados.

[098] De fato, os resultados apresentados na Tabela 8 confirmam a potencialidade da prata coloidal no controle do vírus, mas também da potencialidade das nanofibras constituídas por PVA/CHT uniaxiais e PCL[PVA/CHT-AgNPs] na obtenção de equipamentos de proteção individual e outros materiais para o controle virucida do Sars-cov-2.

Claims (14)

1. Método de obtenção de nanofibras eletrofiadas uniaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs) caracterizadopor compreender as seguintes etapas: (a) produzir uma combinação dos polímeros PVA à 70,0% v/v e CHT à 30,0% v/v (PVA/CHT) para a formação da blenda polimérica da fibra com AgNPs incorporadas, em que as AgNPs são pré-nucleadas em AgNO3 e combinadas com 70,0% v/v de PVA, de modo que são formadas e reduzidas na própria blenda polimérica (PVA/CHT/AgNPs), ao adicionar- se a solução de CHT à solução de PVA/AgNPs; e (b) obter nanofibras uniaxiais por eletrofiação, constituídas pela blenda (PVA/CHT/AgNPs), em que as AgNPs são incorporadas às nanofibras em etapa única (“in situ”), durante a eletrofiação das mesmas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) as AgNPs pré- nucleadas em AgNO3 e combinadas com PVA apresentam-se sob a forma coloidal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a CHT apresenta, opcionalmente, massa molar viscométrica (Mv) de 87 kDa, e é preparada com 2% de ácido acético em água à 60°C por 3h; e o PVA apresenta, opcionalmente, massa molar de 104.500 g mol-1.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) a condição de preparo da blenda PVA/CHT/AgNPs é realizada à 25°C por 3h.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (b) as nanofibras serem obtidas com uso de agulha de diâmetro de capilar metálico de 0,7 mm, sob pressão constante com um fluxo de 0,50 mL h-1, aplicando-se diferença de potencial elétrico (ddp) da ordem de 23 kV entre a ponta da agulha e o aparador metálico plano esférico.

6. Método de obtenção de nanofibras eletrofiadas coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs) caracterizadopor compreender as seguintes etapas: (a) produzir uma combinação dos polímeros PVA à 70,0% v/v e CHT à 30,0% v/v (PVA/CHT) para a formação da blenda polimérica do núcleo da fibra com AgNPs incorporadas, em que as AgNPs são pré-nucleadas em AgNO3 e combinadas com 70,0% v/v de PVA, de modo que são formadas e reduzidas na própria blenda polimérica (PVA/CHT/AgNPs), ao adicionar- se a solução de CHT à solução de PVA/AgNPs; (b) obter a solução de PCL à 10,0% m/v para o envoltório da fibra; e (c) obter nanofibras coaxiais de estrutura núcleo- envoltório por eletrofiação de composição PCL[PVA/CHT/AgNPs]; em que as nanopartículas de prata são incorporadas às nanofibras em etapa única (“in situ”), durante a eletrofiação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) as AgNPs pré- nucleadas em AgNO3 e combinadas com PVA apresentam-se sob a forma coloidal.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) a CHT apresenta, opcionalmente, massa molar viscométrica (Mv) de 87 kDa, e é preparada com 2% de ácido acético em água à 60°C por 3h; o PVA apresenta, opcionalmente, massa molar de 104.500 gmol-1; e a PCL apresenta, opcionalmente, massa molar de 80.000 gmol-1.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) a condição de preparo da blenda PVA/CHT/AgNPs é realizada à 25°C por 3h.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que na etapa (b) a solução de PCL é preparada em solvente DMF/DCM (1:1) à 25°C por 1h.

11. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que na etapa (c) as nanofibras são obtidas com o uso de duas seringas, uma para a solução interna (núcleo) de PVA/CHT/AgNPs da etapa (a) e outra para a solução externa (envoltório) de PCL da etapa (b) e agulha coaxial de diâmetro de capilar metálico de 0,7 mm, sob pressão constante com um fluxo de 0,50 mL h-1, aplicando-se diferença de potencial elétrico (ddp) de 23 kV entre a ponta da agulha e o aparador metálico plano esférico obtidas com uso de agulha de diâmetro de capilar metálico de 0,7 mm, sob pressão constante com um fluxo de 0,50 mL h-1, aplicando-se diferença de potencial elétrico (ddp) da ordem de 23 kV entre a ponta da agulha e o aparador metálico plano esférico.

12. Nanofibras eletrofiadas uniaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs) obtidas conforme o método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadaspelo fato de que as AgNPs são pré-nucleadas em AgNO3 e reduzidas na blenda (PVA/CHT/AgNPs), obtidas por eletrofiação uniaxial por incorporação de AgNPs em etapa única (“in situ”) e possuem tamanho médio de 20 a 25 nm, com espessura uniforme.

13. Nanofibras eletrofiadas coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs) obtidas conforme o método definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizadaspelo fato de que as AgNPs são pré-nucleadas em AgNO3 e reduzidas na blenda do núcleo (PVA/CHT/AgNPs), apresentam envoltório de PCL, com estrutura (PCL[PVA/CHT- AgNPs]) e possuem tamanho médio de 20 a 25 nm, com espessura uniforme.

14. Uso das nanofibras eletrofiadas uniaxiais ou coaxiais incorporadas com nanopartículas de prata (AgNPs), conforme definidas nas reivindicações 12 ou 13, caracterizadopelo fato de ser para confecção de tecidos antimicrobianos/antivirais para aplicação no âmbito biomédico/hospitalar.