BR102022014349A2 - DI-RAMNOLIPIDS CONTAINING ANALGESIC ACTION IN INFLAMMATORY PAIN - Google Patents
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Abstract
di-ramnolipídeos contendo ação analgésica na dor inflamatória. a presente invenção refere-se à utilização de di-ramnolipídeos como princípio ativo com ação analgésica na dor inflamatória. o invento avaliou os efeitos do composto ramnolipídico em modelos murinos no contexto da dor inflamatória, com resultados positivos. os di-rl são seguros para uso em mamíferos, possuem baixa toxicidade, ausência de efeito mutagênico e podem desempenhar importante eficácia terapêutica no contexto da dor inflamatória. adicionalmente, levando em consideração que os medicamentos utilizados clinicamente para este fim possuem diversos efeitos colaterais, e que os di-rl são aprovados pela food and drug administration (fda), a invenção apresenta potencial para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.di-rhamnolipids containing analgesic action in inflammatory pain. The present invention refers to the use of di-rhamnolipids as an active ingredient with analgesic action in inflammatory pain. the invention evaluated the effects of the rhamnolipid compound in murine models in the context of inflammatory pain, with positive results. di-rl are safe for use in mammals, have low toxicity, lack of mutagenic effect and can have important therapeutic efficacy in the context of inflammatory pain. additionally, taking into consideration that the medicines used clinically for this purpose have several side effects, and that di-rl are approved by the food and drug administration (fda), the invention presents potential for the development of new therapeutic approaches.
Description
[01] O processo inflamatório ocorre em resposta a um agente lesivo como por exemplo microrganismos, agentes físicos (radiação, trauma, queimaduras), substâncias químicas, dano tecidual e/ou reações imunológicas (LIMA, RAFAEL RODRIGUES; COSTA, ANA MARIA RABELO; DE SOUZA, RENATA DUARTE; GOMES-LEAL, WALACE. Inflammation in neurodegenerative disease. Revista Paraense de Medicina, v. 21, n. 2, p. 29-32, 2007). A reação inflamatória tem como objetivo combater o agente nocivo e posteriormente restaurar a homeostase tecidual. A inflamação tem como sinais cardinais: rubor, aumento da temperatura local ou sistêmica (febre), edema, dor e quando exacerbada pode levar a perda da função do tecido acometido (ROBBINS, STANLEY L. Patologia Estrutural e Funcional. 6a ed.; Rio de Janeiro; Editora Guanabara Koogan S.A., 2000).[01] The inflammatory process occurs in response to a harmful agent such as microorganisms, physical agents (radiation, trauma, burns), chemical substances, tissue damage and/or immunological reactions (LIMA, RAFAEL RODRIGUES; COSTA, ANA MARIA RABELO; DE SOUZA, RENATA DUARTE; GOMES-LEAL, WALACE. Inflammation in neurodegenerative disease. Revista Paraense de Medicina, v. 21, n. 2, p. 29-32, 2007). The inflammatory reaction aims to combat the harmful agent and subsequently restore tissue homeostasis. The cardinal signs of inflammation are: flushing, increased local or systemic temperature (fever), edema, pain and, when exacerbated, can lead to loss of function of the affected tissue (ROBBINS, STANLEY L. Patologia Estrutural e Functional. 6a ed.; Rio de Janeiro; Editora Guanabara Koogan S.A., 2000).
[02] Clinicamente, a dor de origem inflamatória é um sintoma comum a diversas patologias de cunho inflamatório como por exemplo uveíte (SMITH, J. A.; THOMPSON, D. J.; WHITCUP, S. M.; SUHLER, E.;CLARKE, G.; SMITH, S. et al. A randomized, placebo-controlled, double-masked clinical trialof etanercept for the treatment of uveitis associated with juvenile idiopathicarthritis. Arthritis Rheum, 53(1), 18-23, 2005), manifestações cutâneas e articulares da psoríase (TOBIN, A. M.; KIRBY, B. TNF alpha inhibitors in the treatment of psoriasis and psoriatic arthritis. BioDrugs, 19(1), 47-57, 2005) e principalmente na artrite reumatóide (HARAOUI, B. The anti-tumor necrosis factor agents are a major advance in the treatment of rheumatoid arthritis. J Rheumatol Suppl, 72,46-47, 2005).[02] Clinically, pain of inflammatory origin is a common symptom of several inflammatory pathologies such as uveitis (SMITH, J. A.; THOMPSON, D. J.; WHITCUP, S. M.; SUHLER, E.; CLARKE, G.; SMITH, S . et al. A randomized, placebo-controlled, double-masked clinical trial of etanercept for the treatment of uveitis associated with juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum, 53(1), 18-23, 2005), cutaneous and joint manifestations of psoriasis (TOBIN , A. M.; KIRBY, B. TNF alpha inhibitors in the treatment of psoriasis and psoriatic arthritis. BioDrugs, 19(1), 47-57, 2005) and mainly in rheumatoid arthritis (HARAOUI, B. The anti-tumor necrosis factor agents are a major advance in the treatment of rheumatoid arthritis. J Rheumatol Suppl, 72,46-47, 2005).
[03] O controle farmacológico da dor inflamatória é baseado em duas estratégias principais: fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), visando a inibição da produção de prostaglandinas por ciclo-oxigenases e prevenindo a sensibilização de nociceptores em humanos e animais; e opióides e dipirona que bloqueiam diretamente a sensibilização do nociceptor através da ativação da via de sinalização do NO (F. GOMES, F. I., CUNHA, F. Q., CUNHA, T. M. Peripheral nitric oxide signaling directly blocks inflammatory pain. Biochemical Pharmacology, 113862, 2020). Entretanto, o uso de ambos os medicamentos causa preocupação devido aos riscos de seus efeitos adversos. Há evidências de que o uso de AINEs exercem importantes efeitos cardiovasculares adversos, que incluem aumento do risco de infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, insuficiência renal e hipertensão arterial (BATLOUNI, MICHEL. Anti-inflamatórios não esteroides: Efeitos cardiovasculares, cérebro-vasculares e renais. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 94(4), 556-563, 2010). Já o uso contínuo dos opióides pode levar à depressão respiratória e dependência física e psicológica (RIBEIRO, SADY; SCHMIDT, ANDRÉ PRATO; SCHMIDT, SÉRGIO RENATO GUIMARÃES. O uso de opióides no tratamento da dor crônica não oncológica: o papel da metadona. Revista Brasileira de Anestesiologia, 52(5), 644-651, 2002). Dentro deste contexto, é de grande importância o desenvolvimento de novas drogas que reduzem a inflamação e que não causem tantos efeitos colaterais.[03] The pharmacological control of inflammatory pain is based on two main strategies: non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), aiming to inhibit the production of prostaglandins by cyclooxygenases and preventing the sensitization of nociceptors in humans and animals; and opioids and dipyrone that directly block nociceptor sensitization through activation of the NO signaling pathway (F. GOMES, F. I., CUNHA, F. Q., CUNHA, T. M. Peripheral nitric oxide signaling directly blocks inflammatory pain. Biochemical Pharmacology, 113862, 2020) . However, the use of both medications causes concern due to the risks of their adverse effects. There is evidence that the use of NSAIDs has important adverse cardiovascular effects, which include an increased risk of myocardial infarction, stroke, heart failure, renal failure and high blood pressure (BATLOUNI, MICHEL. Non-steroidal anti-inflammatory drugs: Cardiovascular effects, cerebrovascular and renal diseases. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 94(4), 556-563, 2010). Continuous use of opioids can lead to respiratory depression and physical and psychological dependence (RIBEIRO, SADY; SCHMIDT, ANDRÉ PRATO; SCHMIDT, SÉRGIO RENATO GUIMARÃES. The use of opioids in the treatment of chronic non-cancer pain: the role of methadone. Revista Brazilian Anesthesiology, 52(5), 644-651, 2002). Within this context, the development of new drugs that reduce inflammation and do not cause as many side effects is of great importance.
[04] Os ramnolipídeos (RL) são biossurfactantes constituídos por uma ou duas moléculas de ramnose polar, respectivamente mono e di-ramnolipídeo, ligada a ácidos graxos β-hidroxilados e apolares (VARJANI, S. J.; UPASANI, V. N. Critical review on biosurfactant analysis, purification and characterization using rhamnolipid as a model biosurfactant. Bioresource Technology, v. 232, p. 389-397, 2017). Essa classe de biomoléculas é produzida principalmente pela bactéria Pseudomonas aeruginosanuma mistura heterogênea contendo diversos congêneres de mono e di-ramnolipídeos (Di-RL) (WADEKAR S, D.; KALE, S. B.; LALI, A. M.; BHOWMICK, D. N; PRATAP, A. P. Microbial synthesis of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) on waste frying oil as low cost carbono source. Preparative biochemistry & biotechnology, v. 42, p. 249-266, 2012).[04] Rhamnolipids (RL) are biosurfactants consisting of one or two polar rhamnose molecules, respectively mono- and di-rhamnolipid, linked to β-hydroxylated and nonpolar fatty acids (VARJANI, S. J.; UPASANI, V. N. Critical review on biosurfactant analysis, purification and characterization using rhamnolipid as a model biosurfactant. Bioresource Technology, v. 232, p. 389-397, 2017). This class of biomolecules is produced mainly by the bacterium Pseudomonas aeruginosan, a heterogeneous mixture containing several congeners of mono- and di-rhamnolipids (Di-RL) (WADEKAR S, D.; KALE, S. B.; LALI, A. M.; BHOWMICK, D. N; PRATAP, A. P. Microbial synthesis of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) on waste frying oil as low cost carbon source. Preparative biochemistry & biotechnology, v. 42, p. 249-266, 2012).
[05] O principal congênere produzido, Di-RL (L-ramnosil-L-ramnosil-β- hidroxidecanoil-β-hidroxi-decanoato), apresenta ação antimicrobiana, citotoxicidade contra células cancerígenas, ação cicatrizante (STIPCEVIC, T.; PILJAC, A.; PILJAC, C. Enhanced healing of full-thickness burn wounds using di rhamnolipid. Burns, v. 32, p. 24-34, 2006) e possível efeito anti-inflamatório, uma vez que houve redução do nível de TNF-α no grupo de ratos wistar com feridas por excisão e que foram tratados com Di-RL, o que pode levar à redução da inflamação e formação de colágeno (SANA, S.; DATTA, S.; BISWAS, D.; AUDDY, B.; GUPTA, M.; CHATTOPADHYAY, H. Excision wound healing activity of a common biosurfactant produced by Pseudomonas sp. Wound Medicine, 2018). Além disso, esta molécula possui baixa toxicidade em mamíferos, tanto em aplicação externa, como também, na administração oral (ED50> 5000 mg/kg) (REILLY, S. K.; HOLLIS, L.; JONES, R. S.; GREENWAY, D. Biopesticides registration action document-Rhamnolipid biosurfactant (PC Code 110029). US Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs, 2009) e injeção subcutânea (120 mg/kg por dia) (STIPCEVIC, T.; PILJAC, A.; PILJAC, C. Enhanced healing of full-thickness burn wounds using di-rhamnolipid. Burns, v. 32, p. 24-34, 2006), e ainda, a ausência de efeito mutagênico, sendo este composto aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para uso em culturas de frutas, vegetais e leguminosas por sua baixa toxicidade e não-mutagenicidade em mamíferos (NITSCHKE, M.; COSTA, S. G. V. A. O. Biosurfactants in food industry. Trends in Food Science & Technology, v.18, p. 252-259, 2009).[05] The main congener produced, Di-RL (L-rhamnosyl-L-rhamnosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxy-decanoate), has antimicrobial action, cytotoxicity against cancer cells, and healing action (STIPCEVIC, T.; PILJAC, A.; PILJAC, C. Enhanced healing of full-thickness burn wounds using di rhamnolipid. Burns, v. 32, p. 24-34, 2006) and possible anti-inflammatory effect, since there was a reduction in the level of TNF- α in the group of Wistar rats with excision wounds and who were treated with Di-RL, which can lead to reduced inflammation and collagen formation (SANA, S.; DATTA, S.; BISWAS, D.; AUDDY, B .; GUPTA, M.; CHATTOPADHYAY, H. Excision wound healing activity of a common biosurfactant produced by Pseudomonas sp. Wound Medicine, 2018). Furthermore, this molecule has low toxicity in mammals, both in external application and also in oral administration (ED50> 5000 mg/kg) (REILLY, S. K.; HOLLIS, L.; JONES, R. S.; GREENWAY, D. Biopesticides registration action document-Rhamnolipid biosurfactant (PC Code 110029). US Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs, 2009) and subcutaneous injection (120 mg/kg per day) (STIPCEVIC, T.; PILJAC, A.; PILJAC, C. Enhanced healing of full-thickness burn wounds using di-rhamnolipid. Burns, v. 32, p. 24-34, 2006), and also, the absence of mutagenic effect, this compound being approved by the Food and Drug Administration (FDA) for use in fruit, vegetable and legume crops for their low toxicity and non-mutagenicity in mammals (NITSCHKE, M.; COSTA, S. G. V. A. O. Biosurfactants in food industry. Trends in Food Science & Technology, v.18, p. 252-259, 2009) .
[06] A invenção CN102337226A se refere a uma aplicação de alto teor de di- ramnolipídeo de Pseudomonas aeruginosa na biorremediação. Este composto foi produzido por processo fermentativo de Pseudomonas aeruginosa para principal aplicação no campo de biorremediação de solos poluídos ou corpos d'água. As vantagens da presente invenção são: teor de 90 % de di-ramnolipídeos presentes na mistura; a tensão superficial da água pode ser reduzida de 71,4 mN/m para 30,5 mN/m com o uso do di-ramnolipídeo de alto teor; concentração micelar crítica é de 48 mg/L; o di-ramnolipídeo de alto teor tem alta atividade superficial; sob condições extremas de alta temperatura, alto teor de sal e pH alto e semelhantes, o di-ramnolipídeo de alto teor ainda pode manter alta atividade superficial e capacidade emulsificante, além de promover notavelmente a biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos apresentando grande potencial na biorremediação.[06] The invention CN102337226A refers to an application of high diramnolipid content from Pseudomonas aeruginosa in bioremediation. This compound was produced by the fermentative process of Pseudomonas aeruginosa for main application in the field of bioremediation of polluted soils or bodies of water. The advantages of the present invention are: 90% content of di-rhamnolipids present in the mixture; the surface tension of water can be reduced from 71.4 mN/m to 30.5 mN/m with the use of high-content di-rhamnolipid; critical micellar concentration is 48 mg/L; high-content di-rhamnolipid has high surface activity; Under extreme conditions of high temperature, high salt and high pH and the like, high-content di-rhamnolipid can still maintain high surface activity and emulsifying capacity, and remarkably promote the biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons, showing great potential in bioremediation.
[07] A invenção WO2007095259A2 fornece composições antimicóticas e seus métodos de preparação e uso. As composições da presente invenção compreendem um componente antimicótico, em combinação com um surfactante ramnolipídico, que exibem atividade contra um amplo espectro de leveduras e fungos.[07] The invention WO2007095259A2 provides antimycotic compositions and their methods of preparation and use. The compositions of the present invention comprise an antimycotic component, in combination with a rhamnolipid surfactant, which exhibit activity against a broad spectrum of yeasts and fungi.
[08] A patente GB2544384A diz respeito a esfoliantes, que são produtos de limpeza cosméticos que contêm um componente abrasivo. De acordo com a invenção, os biossurfactantes estão contidos como tensoativos nos esfoliantes. O componente abrasivo, os biossurfactantes e outros constituintes dos esfoliantes são baseados em matérias-primas naturais e renováveis.[08] Patent GB2544384A concerns exfoliants, which are cosmetic cleaning products that contain an abrasive component. According to the invention, biosurfactants are contained as surfactants in exfoliants. The abrasive component, biosurfactants and other constituents of the exfoliants are based on natural and renewable raw materials.
[09] A invenção JP2011001373A divulga utilização de ramnolipídeos na re- epitelização da pele, particularmente na cicatrização de traumas com limitação de fibrose. A invenção também se refere ao uso de ramnolipídeo na prevenção e tratamento de choque por queimadura, tratamento e prevenção de aterosclerose (doença cardiovascular), tratamento de rejeição de transplante e tratamento de depressão e esquizofrenia. Além disso, a presente invenção atribui ainda o uso dos ramnolipídeos em preparações cosméticas.[09] The invention JP2011001373A discloses the use of rhamnolipids in skin re-epithelialization, particularly in the healing of trauma with limited fibrosis. The invention also relates to the use of rhamnolipid in the prevention and treatment of burn shock, treatment and prevention of atherosclerosis (cardiovascular disease), treatment of transplant rejection and treatment of depression and schizophrenia. Furthermore, the present invention also provides for the use of rhamnolipids in cosmetic preparations.
[010] A patente US2014294925A1 descreve usos farmacêuticos e biomédicos de ramnolipídeos, bem como métodos de uso de ramnolipídeos para o aprimoramento sinérgico das propriedades antibióticas de vários compostos quando usados para tratar infecções por superbactérias.[010] Patent US2014294925A1 describes pharmaceutical and biomedical uses of rhamnolipids, as well as methods of using rhamnolipids for synergistic enhancement of the antibiotic properties of various compounds when used to treat superbug infections.
[011] O processo BR112020023123A2 descreve uma composição de limpeza que consiste em: 1 - 20 % de um tensoativo aniônico ramnolipídico e de 0,1 - 20 % de um tensoativo de ácido carboxílico de éter de alquila da seguinte estrutura R2-(OCH2CH2)n-OCH2-COOH, em que R2 refere-se a cadeias alquila lineares C12, C14, C16 e C18, n varia de 5 a 30 e a fração de ácido carboxílico de éter de alquila é de 0,05 - 10. Assim, esta solução aquosa de composição de limpeza é um método doméstico para tratar tecido.[011] Process BR112020023123A2 describes a cleaning composition consisting of: 1 - 20% of an anionic rhamnolipid surfactant and 0.1 - 20% of an alkyl ether carboxylic acid surfactant of the following structure R2-(OCH2CH2) n-OCH2-COOH, where R2 refers to linear alkyl chains C12, C14, C16 and C18, n ranges from 5 to 30, and the carboxylic acid fraction of alkyl ether is 0.05 - 10. Thus, This aqueous solution of cleaning composition is a household method for treating fabric.
[012] A invenção BR112020023083A2 se refere a uma composição de limpeza fluida que consiste em: 1) 5 - 70% de um sistema tensoativo com a seguinte composição: pelo menos um tensoativo aniônico e/ou não iônico; um biotensoativo ramnolipídico presente num nível de 1 - 95% em peso do tensoativo total no dito sistema tensoativo; e 0,5 - 10% de um tensoativo zwitteriônico; 2) água; e 3) 0,1 - 15% de um polímero selecionado do grupo consistindo de uma poliamina alcoxilada, um polímero de liberação de sujeira de poliéster e misturas dos mesmos; em que a composição tem um pH de a partir de 3 a 6. A invenção também compreende o uso de uma combinação de tensoativos sendo um biotensoativo ramnolipídeo e um tensoativo zwitteriônico para aumentar a viscosidade de uma composição de limpeza fluida em um pH de 3 a 6.[012] The invention BR112020023083A2 refers to a fluid cleaning composition consisting of: 1) 5 - 70% of a surfactant system with the following composition: at least one anionic and/or non-ionic surfactant; a rhamnolipid biosurfactant present at a level of 1 - 95% by weight of the total surfactant in said surfactant system; and 0.5 - 10% of a zwitterionic surfactant; 2) water; and 3) 0.1 - 15% of a polymer selected from the group consisting of an alkoxylated polyamine, a polyester soil release polymer and mixtures thereof; wherein the composition has a pH of from 3 to 6. The invention also comprises the use of a combination of surfactants being a rhamnolipid biosurfactant and a zwitterionic surfactant to increase the viscosity of a fluid cleaning composition at a pH of 3 to 6.
[013] A invenção US2012322751A1 está relacionada ao uso de ramnolipídeos no tratamento de doenças e lesões combinadas após a explosão de bomba atômica, dispositivos atômicos ou usinas nucleares. As doenças ou lesões combinadas podem ser: doenças de radiação, lesões por queimaduras da pele e membranas mucosas, lesões mecânicas, infecções do sistema respiratório e digestivo, lesões do sistema hematológico cardiovascular e nervoso.[013] The invention US2012322751A1 is related to the use of rhamnolipids in the treatment of combined diseases and injuries after the explosion of an atomic bomb, atomic devices or nuclear power plants. Combined diseases or injuries can be: radiation diseases, burn injuries of the skin and mucous membranes, mechanical injuries, infections of the respiratory and digestive system, injuries of the cardiovascular and nervous hematological system.
[014] A invenção CN105326848A descreve o uso de ramnolipídeos na preparação de preparações farmacêuticas antifibróticas. A preparação farmacêutica anti-fibrótica é preparada misturando uniformemente o ramnolipídeo e o agente auxiliar em uma preparação farmacêutica em que a concentração do ramnolipídeo é de 10 - 2000 mg/kg e o agente auxiliar é estéril. Água, petrolato e amido são compostos em qualquer proporção. A forma de preparação é um spray, uma pomada de aplicação externa, uma injeção intravenosa ou uma cápsula oral; a preparação pode atuar em um órgão fibrótico, incluindo pele, fígado, pulmão, coração, rim e córnea; e a concentração de ramnolipídeo pode ser 10 - 2000 mg/kg, ou seja, 10 - 2000 mg de ramnolipídeo por quilograma de corpo humano ou animal, o número de vezes de ação é 1 - 100 vezes, e o intervalo de ação é 2 - 24 horas.[014] The invention CN105326848A describes the use of rhamnolipids in the preparation of antifibrotic pharmaceutical preparations. The anti-fibrotic pharmaceutical preparation is prepared by uniformly mixing the rhamnolipid and the auxiliary agent in a pharmaceutical preparation in which the concentration of the rhamnolipid is 10 - 2000 mg/kg and the auxiliary agent is sterile. Water, petrolatum and starch are compounds in any proportion. The preparation form is a spray, an ointment for external application, an intravenous injection or an oral capsule; the preparation can act on a fibrotic organ, including skin, liver, lung, heart, kidney and cornea; and the concentration of rhamnolipid can be 10 - 2000 mg/kg, that is, 10 - 2000 mg of rhamnolipid per kilogram of human or animal body, the number of times of action is 1 - 100 times, and the range of action is 2 - 24 hours.
[015] A invenção US2014364381A1 refere-se amplamente a um curativo para feridas com pelo menos uma camada de um substrato de curativo para feridas com uma ou mais vesículas de gás, ramnolipídeos e soforolipídeos. Os curativos da presente invenção podem consistir em qualquer número de camadas desde que pelo menos uma camada inclua um tal substrato para feridas. Em outras modalidades, diferentes camadas podem ter diferentes componentes selecionados de vesículas de gás, ramnolipídios e soforolipídeos. Algumas modalidades podem ter camadas adicionais, como uma camada de barreira para evitar que o gás escape para a atmosfera ambiente das vesículas de gás. Outras modalidades podem incluir uma camada de difusão de gás controlada para permitir um melhor controle da taxa de gás para o local da ferida. Outras modalidades podem incluir uma camada de vesícula de gás concentrado para fornecer um nível mais alto de um gás carregado para o local da ferida.[015] The invention US2014364381A1 broadly relates to a wound dressing with at least one layer of a wound dressing substrate with one or more gas vesicles, rhamnolipids and sophorolipids. The dressings of the present invention may consist of any number of layers as long as at least one layer includes such a wound substrate. In other embodiments, different layers may have different components selected from gas vesicles, rhamnolipids, and sophorolipids. Some embodiments may have additional layers, such as a barrier layer to prevent gas from escaping into the ambient atmosphere from the gas vesicles. Other embodiments may include a controlled gas diffusion layer to allow better control of the rate of gas to the wound site. Other embodiments may include a concentrated gas vesicle layer to deliver a higher level of a charged gas to the wound site.
[016] A patente JP2007308514A divulga o uso de ramnolipídeos como ingrediente ativo de um agente terapêutico de doenças autoimunes, tais como doenças autoimunes específicas de órgãos e não específicas de órgãos, AIDS, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica. A presente invenção refere-se a um método para o tratamento de várias doenças autoimunes pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um ou mais ramnolipídios de fórmula (I) como ingrediente ativo a um paciente em necessidade. A dose depende do peso corporal do paciente a ser tratado e a faixa de dosagem dos ramnolipídios da presente invenção é de 4,0 mg/kg a 13,0 mg/kg, preferencialmente 4,5 mg/kg a 12,5 mg/kg, mais preferencialmente 6,5 mg/kg a 11,5 mg/kg. kg. A dose terapêutica para adultos é de cerca de 100 mg/dia a 1000 mg/dia. Esta composição farmacêutica pode ser uma suspensão aquosa, creme ou loção, e está na forma de um sólido em um comprimido ou cápsula usando uma solução aquosa de injeção ou um excipiente de comprimido ou cápsula.[016] Patent JP2007308514A discloses the use of rhamnolipids as an active ingredient of a therapeutic agent for autoimmune diseases, such as organ-specific and non-organ-specific autoimmune diseases, AIDS, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. The present invention relates to a method for treating various autoimmune diseases by administering a therapeutically effective amount of a composition containing one or more rhamnolipids of formula (I) as an active ingredient to a patient in need. The dose depends on the body weight of the patient to be treated and the dosage range of the rhamnolipids of the present invention is 4.0 mg/kg to 13.0 mg/kg, preferably 4.5 mg/kg to 12.5 mg/kg kg, more preferably 6.5 mg/kg to 11.5 mg/kg. kg. The therapeutic dose for adults is about 100 mg/day to 1000 mg/day. This pharmaceutical composition may be an aqueous suspension, cream or lotion, and is in the form of a solid in a tablet or capsule using an aqueous injection solution or a tablet or capsule excipient.
[017] A patente US2013310330A1 descreve que os ramnolipídeos são eficazes na redução do peso corporal excessivo, além de tratar condições relacionadas à obesidade, como síndrome metabólica, hipertensão, diabetes tipo 2, doença hepática gordurosa não alcoólica ou doença renal relacionada à obesidade, removendo depósitos de gordura localizados indesejados, e tratar áreas de celulite. Ao administrar ramnolipídeos em um indivíduo há melhora nas condições ou distúrbios relacionados à obesidade.[017] Patent US2013310330A1 describes that rhamnolipids are effective in reducing excessive body weight, in addition to treating obesity-related conditions such as metabolic syndrome, hypertension, type 2 diabetes, non-alcoholic fatty liver disease or obesity-related kidney disease, removing unwanted localized fat deposits, and treat areas of cellulite. By administering rhamnolipids to an individual there is improvement in conditions or disorders related to obesity.
[018] As patentes encontradas descrevem: 1) composto com 90 % de di- ramnolipídeos para aplicação na biorremediação de solos poluídos; 2) composições antimicóticas contra amplo espectro de leveduras e fungos; 3) esfoliante com biossurfactantes; 4) uso de ramnolipídeo na cicatrização de feridas, tratamento de queimadura, aterosclerose, transplante de órgãos, depressão, esquizofrenia e preparações cosméticas; 5) ramnolipídeos para tratar infecções bacterianas; 6) solução aquosa de composição de limpeza como método doméstico para tratar tecido; 7) composição de limpeza fluida para lavanderia; 8) utilização de ramnolipídeos como droga de escolha no caso de desastres nucleares no tratamento da combinação de lesões e doenças por radiação em humanos e animais; 9) aplicação de ramnolipídeo na preparação de medicamento antifibrose; 10) um curativo para feridas com uma ou mais vesículas de gás, ramnolipídeos e soforolipídeos com propriedades benéficas; 11) uso de ramnolipídeos como ingrediente ativo de um agente terapêutico para o tratamento de várias doenças autoimunes; 12) ramnolipídeos para tratar a obesidade e outras condições relacionadas à obesidade.[018] The patents found describe: 1) compound with 90% diramnolipids for application in the bioremediation of polluted soils; 2) antimycotic compositions against a broad spectrum of yeasts and fungi; 3) exfoliant with biosurfactants; 4) use of rhamnolipid in wound healing, burn treatment, atherosclerosis, organ transplantation, depression, schizophrenia and cosmetic preparations; 5) rhamnolipids to treat bacterial infections; 6) aqueous solution of cleaning composition as a household method for treating fabric; 7) fluid cleaning composition for laundry; 8) use of rhamnolipids as the drug of choice in the case of nuclear disasters in the treatment of combined radiation injuries and diseases in humans and animals; 9) application of rhamnolipid in the preparation of antifibrosis medication; 10) a wound dressing with one or more gas vesicles, rhamnolipids and sophorolipids with beneficial properties; 11) use of rhamnolipids as an active ingredient of a therapeutic agent for the treatment of various autoimmune diseases; 12) rhamnolipids to treat obesity and other obesity-related conditions.
[019] O presente invento, por sua vez, refere-se à utilização de Di-Ramnolipídeos como princípio ativo com ação analgésica na dor inflamatória. A avaliação do efeito analgésico de Di-RL apresentada é de modelo murino de dor inflamatória. Este processo permitiu avaliar os efeitos analgésico e anti-inflamatório de Di-RL sobre diferentes modelos de dor inflamatória induzidas pela carragenina, formalina e ácido acético. A partir das metodologias empregadas foi possível ilustrar os mecanismos parciais de ação do Di-RL na dor, e assim seu potencial analgésico.[019] The present invention, in turn, refers to the use of Di-Rhamnolipids as an active ingredient with analgesic action in inflammatory pain. The evaluation of the analgesic effect of Di-RL presented is from a murine model of inflammatory pain. This process made it possible to evaluate the analgesic and anti-inflammatory effects of Di-RL on different models of inflammatory pain induced by carrageenan, formalin and acetic acid. Using the methodologies used, it was possible to illustrate the partial mechanisms of action of Di-RL on pain, and thus its analgesic potential.
[020] O presente invento trata do efeito analgésico de Di-RL em modelos de dor inflamatória. O invento avalia, por diferentes modelos murinos, os efeitos do composto ramnolipídico na hiperalgesia mecânica, nos comportamentos nociceptivos de contorções abdominais e sacudida de pata, na migração leucocitária e produção de ânion superóxido na cavidade peritoneal, e sobre a histopatologia. Deste modo, este processo possibilitará estabelecer os mecanismos de ação do Di-RL, o que poderá facilitar a aplicação deste composto como um agente terapêutico na dor.[020] The present invention deals with the analgesic effect of Di-RL in inflammatory pain models. The invention evaluates, using different murine models, the effects of the rhamnolipid compound on mechanical hyperalgesia, on the nociceptive behaviors of abdominal contortions and paw shaking, on leukocyte migration and production of superoxide anion in the peritoneal cavity, and on histopathology. In this way, this process will make it possible to establish the mechanisms of action of Di-RL, which may facilitate the application of this compound as a therapeutic agent in pain.
[021] Neste processo foi utilizada a molécula de di-ramnonolipídeo (Di-RL) produzido por fermentação submersa de Pseudomonas aeruginosa e purificada segundo Mello (2019) com 95% de pureza (MELLO, A. P. Q. Produção direcionada de Di-Ramnolipídeo por cultivos de Pseudomonas aeruginosa PAO 1 e desenvolvimento de processo de purificação para obtenção de um único congênere. 65 p. Dissertação - Mestrado em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2019).[021] In this process, the di-rhamnonolipid molecule (Di-RL) was used, produced by submerged fermentation of Pseudomonas aeruginosa and purified according to Mello (2019) with 95% purity (MELLO, A. P. Q. Directed production of Di-Rhamnolipid by cultivations of Pseudomonas aeruginosa PAO 1 and development of a purification process to obtain a single congener. 65 p. Dissertation - Master's in Pharmaceutical Sciences - Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2019).
[022] Foram utilizados camundongos Swiss, machos ou fêmeas, adultos, pesando em média 20 - 30 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina. Os camundongos foram mantidos em caixas plásticas com livre acesso a água e ração, em ciclo de claro/escuro (12/12 h) e temperatura controlada de 21 °C. Os experimentos comportamentais foram realizados entre 9 horas da manhã e 5 horas da tarde em sala com temperatura controlada. Para coleta das amostras, nos tempos apropriados, os animais foram eutanasiados por inalação de isofluorano 5 %. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UEL (CEUA-UEL) sob o número do processo: 037.2020. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número e o sofrimento dos animais.[022] Adult male or female Swiss mice, weighing an average of 20 - 30 g, from the Central Animal Facility of the State University of Londrina were used. The mice were kept in plastic boxes with free access to water and food, under a light/dark cycle (12/12 h) and a controlled temperature of 21 °C. The behavioral experiments were carried out between 9 am and 5 pm in a temperature-controlled room. To collect the samples, at the appropriate times, the animals were euthanized by inhalation of 5% isoflurane. This study was approved by the Ethics Committee on the Use of Animals at UEL (CEUA-UEL) under process number: 037.2020. Every effort was made to minimize the number and suffering of animals.
[023] Os camundongos foram tratados, por via subcutânea, com Di-RL (s.c.; 0,3; 3 e 30 mg/kg) ou veículo (salina) 30 - 60 minutos antes da administração da carragenina por via intraperitoneal (i.p.; 0,5 - 2 mg/cavidade) ou intraplantar (i.pl.; 100 - 500 μg/pata). A hiperalgesia mecânica foi avaliada nos tempos de 1,3 e 5 h após o estímulo (i.pl., 100 - 500 μg, 10 - 20 μL). A migração leucocitária (número de leucócitos totais, células polimorfonucleares e mononucleares) e produção de ânion superóxido (células positivas para NBT) na cavidade peritoneal foram avaliadas após 4 - 6 h após injeção do estímulo. O número de sacudidas da pata (flinches) foi avaliado durante 30 minutos após a administração de formalina 0,5 - 5,0 % (i.pl., 10 - 20 μL). O número de contorções abdominais foi determinado durante 20 minutos após a injeção de ácido acético 0,5 - 5,0 % (i.p., 50 - 300 μL/cavidade). Para análise histopatológica foi coletado material plantar após 4 - 6 h após indução com carragenina.[023] The mice were treated, subcutaneously, with Di-RL (s.c.; 0.3, 3 and 30 mg/kg) or vehicle (saline) 30 - 60 minutes before administration of carrageenan intraperitoneally (i.p.; 0.5 - 2 mg/well) or intraplantar (i.pl.; 100 - 500 μg/paw). Mechanical hyperalgesia was evaluated at 1, 3 and 5 h after the stimulus (i.pl., 100 - 500 μg, 10 - 20 μL). Leukocyte migration (number of total leukocytes, polymorphonuclear and mononuclear cells) and superoxide anion production (NBT-positive cells) in the peritoneal cavity were evaluated 4 - 6 h after stimulus injection. The number of paw shakes (flinches) was evaluated during 30 minutes after administration of 0.5 - 5.0% formalin (i.pl., 10 - 20 μL). The number of abdominal contortions was determined during 20 minutes after injection of 0.5 - 5.0% acetic acid (i.p., 50 - 300 μL/well). For histopathological analysis, plantar material was collected 4 - 6 h after induction with carrageenan.
[024] A hiperalgesia mecânica foi medida pelo método eletrônico de von Frey (CUNHA, T. M.; VERRI, W. A.; VIVANCOS, G. G.; MOREIRA, I. F.; REIS, S.; PARADA, C. A.; CUNHA, F. Q.; FERREIRA, S. H. An electronic pressure-meter nociception paw test for mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 37, n. 3, 2004). Este teste consiste na aplicação de estímulo mecânico na pata traseira dos animais, com uma ponteira de 0,5 mm2 de diâmetro. Dessa forma, foi aplicada uma pressão crescente na pata direita traseira até ser registrado a pressão necessária à resposta de retirada da pata, e a força (g) necessária para induzir esta resposta nociceptiva foi quantificada por um analgesímetro digital (Insight®). Os resultados da dose-resposta foram expressos pelo valor de delta (Δ), calculado a partir da diferença entre a média das medidas nos intervalos de 1, 3 e 5 h após o estímulo e a média das medidas antes do estímulo (basal). Após o teste de dose-resposta na hiperalgesia mecânica foi definida a dose de Di-RL para ser usada nos tratamentos dos demais experimentos.[024] Mechanical hyperalgesia was measured using the von Frey electronic method (CUNHA, T. M.; VERRI, W. A.; VIVANCOS, G. G.; MOREIRA, I. F.; REIS, S.; PARADA, C. A.; CUNHA, F. Q.; FERREIRA, S. H. An electronic pressure -meter nociception paw test for mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 37, n. 3, 2004). This test consists of applying a mechanical stimulus to the animals' hind paw, with a 0.5 mm2 diameter tip. In this way, increasing pressure was applied to the right hind paw until the pressure necessary for the paw withdrawal response was recorded, and the force (g) necessary to induce this nociceptive response was quantified by a digital analgesimeter (Insight®). The dose-response results were expressed by the delta value (Δ), calculated from the difference between the mean of measurements at intervals of 1, 3 and 5 h after the stimulus and the mean of measurements before the stimulus (baseline). After the dose-response test on mechanical hyperalgesia, the dose of Di-RL was defined to be used in the treatments of the remaining experiments.
[025] A dor manifesta foi avaliada pelo teste da formalina e pelo teste de contorções abdominais com ácido acético. Os camundongos foram injetados com 10 - 20 μL de solução de formalina 0,5 - 5,0 % (% de formaldeído) por via intraplantar, em seguida cada animal foi colocado individualmente em um cilindro de vidro e o número de sacudidas da pata foi avaliado num período de 30 minutos. O período foi dividido em intervalos de 5 minutos, sendo demonstrada a primeira fase (0 - 5 minutos) que corresponde à dor neurogênica bem como a segunda fase (10 - 30 minutos), que representa a etapa de origem inflamatória. Os resultados foram indicados pelo número de flinches (sacudidas da pata) em ambas as fases (DUBUISSON, D.; DENNIS, S. G. The formalin test: A quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats. Pain, v. 4, n. C, 1977). Já para o teste de contorções abdominais foi administrado ácido acético 0,5 - 5,0 % (v/v) na cavidade peritoneal dos animais, e cada camundongo foi colocado individualmente em um cilindro de vidro. A intensidade nociceptiva foi quantificada pela contagem das contorções num período de 20 minutos (VERRI, W. A.; CUNHA, T. M.; MAGRO, D. A.; DOMINGUES, A. C.; VIEIRA, S. M.; SOUZA, G. R.; LIEW, F. Y.; FERREIRA, S. H.; CUNHA, F. Q. Role of IL-18 in overt pain-like behaviour in mice. European Journal of Pharmacology, v. 588, n. 2-3, p. 207-212, 2008).[025] Manifest pain was assessed by the formalin test and the abdominal contortion test with acetic acid. Mice were injected with 10 - 20 μL of 0.5 - 5.0% formalin solution (% formaldehyde) intraplantarly, then each animal was placed individually in a glass cylinder and the number of paw shakes was evaluated over a period of 30 minutes. The period was divided into 5-minute intervals, demonstrating the first phase (0 - 5 minutes) which corresponds to neurogenic pain, as well as the second phase (10 - 30 minutes), which represents the stage of inflammatory origin. The results were indicated by the number of flinches (paw shakes) in both phases (DUBUISSON, D.; DENNIS, S. G. The formalin test: A quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats . Pain, v. 4, n. C, 1977). For the abdominal contortion test, 0.5 - 5.0% (v/v) acetic acid was administered to the peritoneal cavity of the animals, and each mouse was placed individually in a glass cylinder. Nociceptive intensity was quantified by counting contortions over a period of 20 minutes (VERRI, W. A.; CUNHA, T. M.; MAGRO, D. A.; DOMINGUES, A. C.; VIEIRA, S. M.; SOUZA, G. R.; LIEW, F. Y.; FERREIRA, S. H.; CUNHA, F. Q. Role of IL-18 in overt pain-like behavior in mice. European Journal of Pharmacology, v. 588, n. 2-3, p. 207-212, 2008).
[026] Após 4 - 6 h da administração do estímulo na cavidade peritoneal os animais foram eutanasiados e as células do lavado peritoneal foram coletadas com 1 - 3 mL de tampão FACS, e o número de leucócitos totais, células polimorfonucleares e mononucleares e células positivas para NBT recrutadas na cavidade peritoneal foram avaliadas. Foi realizada a contagem do número total de células em câmara de Neubauer utilizando solução de Turk. Já a contagem diferencial foi realizada pelo preparo de esfregaços, corados pela técnica de Panótico rápido. Os resultados foram o número de leucócitos totais, células polimorfonucleares e mononucleares x 106 (MIZOKAMI, S. S.; HOHMANN, M. S. N.; STAURENGO-FERRARI, L.; CARVALHO, T. T.; ZARPELON, A. C.; POSSEBON, M. I.; DE SOUZA, A. R.; VENEZIANI, R. C. S.; ARAKAWA, N. S.; CASAGRANDE, R.; VERRI, W. A. Pimaradienoic acid inhibits carrageenan- induced inflammatory leukocyte recruitment and edema in mice: Inhibition of oxidative stress, nitric oxide and cytokine production. PLoS ONE, v. 11, n. 2, 2016). Para avaliação da produção de ânion superóxido, incubou-se 20 - 50 μL do lavado peritoneal com 20 - 50 μL de NBT (1 - 3 mg/mL), após homogeneizar transferiu- se 10 - 20 μL para lâmina, que posteriormente foi corada pela técnica de Panótico rápido. Os resultados foram o número de células NBT positivas x 106 (HYUNG, S. C.; JUN, W. K.; CHA, Y. N.; KIM, C. A quantitative nitroblue tetrazolium assay for determining intracellular superoxide anion production in phagocytic cells. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, v. 27, n. 1, p. 31-44, 2006).[026] After 4 - 6 h of administration of the stimulus in the peritoneal cavity, the animals were euthanized and the peritoneal lavage cells were collected with 1 - 3 mL of FACS buffer, and the number of total leukocytes, polymorphonuclear and mononuclear cells and positive cells for NBT recruited into the peritoneal cavity were evaluated. The total number of cells was counted in a Neubauer chamber using Turk's solution. The differential count was performed by preparing smears, stained using the rapid Panotic technique. The results were the number of total leukocytes, polymorphonuclear and mononuclear cells x 106 (MIZOKAMI, S. S.; HOHMANN, M. S. N.; STAURENGO-FERRARI, L.; CARVALHO, T. T.; ZARPELON, A. C.; POSSEBON, M. I.; DE SOUZA, A. R.; VENEZIANI, R. C. S.; ARAKAWA, N. S.; CASAGRANDE, R.; VERRI, W. A. Pimaradienoic acid inhibits carrageenan- induced inflammatory leukocyte recruitment and edema in mice: Inhibition of oxidative stress, nitric oxide and cytokine production. PLoS ONE, v. 11, n. 2, 2016). To evaluate the production of superoxide anion, 20 - 50 μL of peritoneal lavage was incubated with 20 - 50 μL of NBT (1 - 3 mg/mL), after homogenization, 10 - 20 μL was transferred to a slide, which was subsequently stained using the rapid Panotic technique. The results were the number of NBT positive cells x 106 (HYUNG, S. C.; JUN, W. K.; CHA, Y. N.; KIM, C. A quantitative nitroblue tetrazolium assay for determining intracellular superoxide anion production in phagocytic cells. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, v 27, n. 1, p. 31-44, 2006).
[027] Após 4 - 6 h da administração de carragenina o tecido cutâneo plantar foi coletado para análise histopatológica. As amostras foram armazenadas em formalina 10 % por 48 h e após lavagem em água corrente foram armazenadas em álcool 70 %. Posteriormente, foram desidratadas em banhos de soluções de etanol com concentrações crescentes (70 %, 80 %, 95% e 100%), e na sequência passaram pelo processo de diafanização com xilol para inclusão em parafina. Após serem cortadas em 6 cortes, as amostras foram coradas com hematoxilina- eosina (H&E), e observadas por microscopia óptica com aumento de 40x e fotografadas. Por fim, as fotos foram analisadas pelo software Image J® para análise do infiltrado leucocitário por meio dos pixels.[027] After 4 - 6 hours of carrageenan administration, the plantar skin tissue was collected for histopathological analysis. The samples were stored in 10% formalin for 48 h and after washing in running water, they were stored in 70% alcohol. Subsequently, they were dehydrated in baths of ethanol solutions with increasing concentrations (70%, 80%, 95% and 100%), and then went through the diaphanization process with xylene for inclusion in paraffin. After being cut into 6 sections, the samples were stained with hematoxylin-eosin (H&E), and observed by optical microscopy at 40x magnification and photographed. Finally, the photos were analyzed using Image J® software to analyze the leukocyte infiltrate through pixels.
[028] As análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism® versão 9.0.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graphpad.com). Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão da média das medidas. Para hiperalgesia mecânica foi utilizado ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Tukey a fim de comparar todos os grupos em todos os tempos. ANOVA de uma via foi utilizada para os demais testes, seguida pelo pós-teste de Tukey, exceto para as análises histológicas, as quais empregou-se o teste de Kruskal-Wallis. Houve diferenças significativas quando p < 0,05.[028] Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism® software version 9.0.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graphpad.com). The results were presented as mean ± standard deviation of the mean measurements. For mechanical hyperalgesia, two-way ANOVA followed by Tukey's post-test was used to compare all groups at all times. One-way ANOVA was used for the other tests, followed by the Tukey post-test, except for histological analyses, for which the Kruskal-Wallis test was used. There were significant differences when p < 0.05.
[029] O Di-RL utilizado no presente invento foi purificado por um cartucho de sílica, em um método simples e eficiente (MELLO, A. P. Q. Produção direcionada de Di-Ramnolipídeo por cultivos de Pseudomonas aeruginosa PAO 1 e desenvolvimento de processo de purificação para obtenção de um único congênere. 65 p. Dissertação - Mestrado em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2019). A Tabela 1 apresenta a análise da composição de congêneres de mono- e di- ramnolipídeos por espectrometria de massas da mistura ramnolipídica produzida por Pseudomonas aeruginosa PAO1. A mistura de congêneres purificada (99,0% de pureza) apresentou 97,5 % de congêneres Di-RL sendo o congênere Rha2C10C10 o mais abundante, com aproximadamente 80%.[029] The Di-RL used in the present invention was purified by a silica cartridge, in a simple and efficient method (MELLO, A. P. Q. Targeted production of Di-Rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa PAO 1 cultures and development of a purification process to obtain from a single congener. 65 p. Dissertation - Master's degree in Pharmaceutical Sciences - State University of Londrina, Londrina, 2019). Table 1 presents the analysis of the composition of mono- and di-rhamnolipid congeners by mass spectrometry of the rhamnolipid mixture produced by Pseudomonas aeruginosa PAO1. The purified mixture of congeners (99.0% purity) presented 97.5% of Di-RL congeners, with the Rha2C10C10 congener being the most abundant, with approximately 80%.
[030] Tabela 1. Composição química e abundância relativa da mistura ramnolipídica purificada produzida por Pseudomonas aeruginosa [030] Table 1. Chemical composition and relative abundance of the purified rhamnolipid mixture produced by Pseudomonas aeruginosa
[031] A figura 1 apresenta um esquema geral que representa todas as etapas do processo de avaliação do efeito analgésico do Di-RL purificado. Neste esquema, os números indicam os processos e as letras correspondem aos respectivos produtos. O primeiro processo é o preparo das doses de 0,3; 3 e 30 mg/kg de Di- RL (produto B) a partir da molécula purificada (produto A) dissolvida em PBS. Estas doses serão utilizadas no segundo processo como tratamentos nos modelos murinos testados. Os animais tratados por via subcutânea (produto C) aguardam 30 - 60 minutos para receberem os estímulos de acordo com cada experimento, realizados com diferentes grupos. O processo 3 é a aplicação de carragenina na pata direita traseira do camundongo para posterior medida dose- resposta da hiperalgesia mecânica pelo método eletrônico de von Frey (produto D), nos tempos já estipulados. No processo 4, injeta-se formalina na pata direita traseira e coloca-se o animal em um cilindro de vidro para contagem imediata do número de sacudidas da pata num período de 30 minutos após o estímulo (produto E). No processo 5 é administrado ácido acético no peritônio do animal e avalia-se o número de contorções num período de 20 minutos após o estímulo (produto F). O processo 6 consiste na injeção de carragenina no peritônio do animal para posteriormente, no tempo apropriado, ser feita a coleta do lavado peritoneal (produto G) para avaliação do recrutamento leucocitário (leucócitos totais, células polimorfonucleares e mononucleares) e da produção de ânion superóxido. Por fim, o processo 6 é a administração de carragenina na pata traseira para coleta do tecido plantar submetido à análise histológica (produto H).[031] Figure 1 presents a general scheme that represents all stages of the process of evaluating the analgesic effect of purified Di-RL. In this scheme, the numbers indicate the processes and the letters correspond to the respective products. The first process is the preparation of doses of 0.3; 3 and 30 mg/kg of Di-RL (product B) from the purified molecule (product A) dissolved in PBS. These doses will be used in the second process as treatments in the tested murine models. The animals treated subcutaneously (product C) wait 30 - 60 minutes to receive the stimuli according to each experiment, carried out with different groups. Process 3 is the application of carrageenan to the right hind paw of the mouse for subsequent dose-response measurement of mechanical hyperalgesia using the von Frey electronic method (product D), within the times already stipulated. In process 4, formalin is injected into the right hind paw and the animal is placed in a glass cylinder to immediately count the number of paw shakes within a period of 30 minutes after the stimulus (product E). In process 5, acetic acid is administered to the animal's peritoneum and the number of contortions is evaluated within a period of 20 minutes after the stimulus (product F). Process 6 consists of injecting carrageenan into the animal's peritoneum and then, at the appropriate time, collecting peritoneal lavage (product G) to evaluate leukocyte recruitment (total leukocytes, polymorphonuclear and mononuclear cells) and superoxide anion production. . Finally, process 6 is the administration of carrageenan into the hind paw to collect the plantar tissue subjected to histological analysis (product H).
[032] A Figura 2 mostra o processo de avaliação do efeito analgésico na hiperalgesia mecânica determinado por von Frey eletrônico. Primeiramente, os animais foram tratados com diferentes doses de Di-RL (0,3; 3 e 30 mg/kg, s.c.) antes de receberem o estímulo. O estímulo com carragenina foi injetado na pata direita traseira e a hiperalgesia mecânica foi medida nos tempos 1, 3 e 5 h após o estímulo. Os resultados estão apresentados na Tabela 2, como observado houve hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina nos tempos analisados. Todas as doses de Di-RL testadas reduziram a hiperalgesia mecânica a partir de3 h após injeção da carragenina, com destaque para a dose de 3 mg/kg, que apresentou uma significativa inibição em todos os tempos. Dessa forma, foi definida a dose de 3 mg/kg de Di-RL como tratamento nos próximos experimentos.[032] Figure 2 shows the process of evaluating the analgesic effect in mechanical hyperalgesia determined by electronic von Frey. Firstly, the animals were treated with different doses of Di-RL (0.3, 3 and 30 mg/kg, s.c.) before receiving the stimulus. The carrageenan stimulus was injected into the right hind paw and mechanical hyperalgesia was measured at 1, 3 and 5 h after the stimulus. The results are presented in Table 2, as observed, there was mechanical hyperalgesia induced by carrageenan at the times analyzed. All doses of Di-RL tested reduced mechanical hyperalgesia from 3 h after injection of carrageenan, with emphasis on the dose of 3 mg/kg, which showed significant inhibition at all times. Therefore, a dose of 3 mg/kg of Di-RL was defined as treatment in the next experiments.
[033] Tabela 2. Efeito de dose-resposta na hiperalgesia mecânica medida por von Frey eletrônico. [033] Table 2. Dose-response effect on mechanical hyperalgesia measured by electronic von Frey.
[034] No teste da formalina (Figura 3), os animais foram tratados com a dose de 3 mg/kg e após foram estimulados com formalina na pata direita traseira e colocados em um cilindro de vidro. E avaliou-se o efeito analgésico pelo número de sacudidas da pata (flinches) num tempo de 30 minutos. A Tabela 3 mostra que o Di-RL na dose de 3 mg/kg reduziu os flinches na pata induzidos pela formalina, tanto na primeira fase (0 - 5 minutos) quanto na segunda fase (10 - 30 minutos).[034] In the formalin test (Figure 3), the animals were treated with a dose of 3 mg/kg and then stimulated with formalin in the right hind paw and placed in a glass cylinder. And the analgesic effect was evaluated by the number of paw shakes (flinches) in a period of 30 minutes. Table 3 shows that Di-RL at a dose of 3 mg/kg reduced formalin-induced paw flinches, both in the first phase (0 - 5 minutes) and in the second phase (10 - 30 minutes).
[035] Tabela 3. Efeito do Di-RL no número de sacudidas da pata induzidas por formalina. [035] Table 3. Effect of Di-RL on the number of formalin-induced paw shakes.
[036] A figura 4 mostra a avaliação do efeito analgésico nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os animais foram tratados com o Di-RL 3 mg/kg antes de serem administrados com ácido acético por via intraperitoneal. Após estimulados foi feita a contagem das contorções abdominais num período de 20 minutos. Na dose de 3 mg/kg, o Di-RL reduziu a resposta de contorção induzida pelo ácido acético (Tabela 4).[036] Figure 4 shows the evaluation of the analgesic effect on abdominal contortions induced by acetic acid. The animals were treated with Di-RL 3 mg/kg before being administered with acetic acid intraperitoneally. After being stimulated, abdominal contortions were counted over a period of 20 minutes. At a dose of 3 mg/kg, Di-RL reduced the writhing response induced by acetic acid (Table 4).
[037] Tabela 4. Efeito do Di-RL no número de contorções abdominais induzidas por ácido acético. [037] Table 4. Effect of Di-RL on the number of abdominal contortions induced by acetic acid.
[038] Para avaliar o efeito do Di-RL na migração leucocitária e na produção de ânion superóxido (Figura 5), primeiramente os animais foram tratados, injetados com carragenina via intraperitoneal, e após o tempo adequado foram eutanasiados para coleta do lavado peritoneal. O material coletado foi utilizado para avaliar o recrutamento dos leucócitos totais, células polimorfonucleares e mononucleares. De acordo com os dados presentes na Tabela 5, o estímulo causou aumento significativo no recrutamento dos três tipos celulares, e o tratamento com o Di-RL reduziu o recrutamento dos leucócitos totais, células polimorfonucleares e mononucleares induzidos pela carragenina. Foi observado que a redução de células mononucleares foi menor comparada com a redução dos leucócitos totais e polimorfonucleares. Além disso, o lavado peritoneal coletado também foi utilizado para analisar a produção de ânion superóxido produzido. Assim sendo, o Di-RL na dose de 3 mg/kg reduziu o número de células NBT positivas dentro da cavidade peritoneal, ou seja, houve redução na produção de ânion superóxido pelas células.[038] To evaluate the effect of Di-RL on leukocyte migration and superoxide anion production (Figure 5), the animals were first treated, injected with carrageenan intraperitoneally, and after the appropriate time they were euthanized to collect the peritoneal lavage. The collected material was used to evaluate the recruitment of total leukocytes, polymorphonuclear and mononuclear cells. According to the data in Table 5, the stimulus caused a significant increase in the recruitment of the three cell types, and treatment with Di-RL reduced the recruitment of total leukocytes, polymorphonuclear and mononuclear cells induced by carrageenan. It was observed that the reduction in mononuclear cells was smaller compared to the reduction in total and polymorphonuclear leukocytes. Furthermore, the collected peritoneal lavage was also used to analyze the production of superoxide anion produced. Therefore, Di-RL at a dose of 3 mg/kg reduced the number of NBT positive cells within the peritoneal cavity, that is, there was a reduction in the production of superoxide anion by the cells.
[039] Tabela 5. Efeito de Di-RL na migração leucocitária e produção de ânion superóxido induzidos pela carragenina na cavidade peritoneal. [039] Table 5. Effect of Di-RL on leukocyte migration and superoxide anion production induced by carrageenan in the peritoneal cavity.
[040] A Figura 6 apresenta o processo para avaliação do infiltrado leucocitário no tecido cutâneo plantar após técnica histológica. A Tabela 6 apresenta os dados da análise histológica realizada através do software Image J®. Cada foto tirada após técnica histológica foi analisada pelo programa, que calculou o infiltrado leucocitário, dado em porcentagem de células por área dérmica. Pode-se observar que o Di-RL reverteu o infiltrado causado pela administração de carragenina, uma vez que não houve diferença significativa entre os grupos salina e tratado.[040] Figure 6 shows the process for evaluating the leukocyte infiltrate in the plantar skin tissue after histological technique. Table 6 presents data from the histological analysis performed using Image J® software. Each photo taken after the histological technique was analyzed by the program, which calculated the leukocyte infiltrate, given as a percentage of cells per dermal area. It can be observed that Di-RL reversed the infiltrate caused by the administration of carrageenan, since there was no significant difference between the saline and treated groups.
[041] Tabela 6. Efeito de Di-RL no infiltrado leucocitário por área. [041] Table 6. Effect of Di-RL on leukocyte infiltrate by area.
[042] Figura 1 Modelo esquemático do processo de avaliação do efeito analgésico de Di-RL em modelos murinos de dor. Em destaque (canto direito superior) encontra-se a estrutura do principal congênere de Di-RL (Rha2C10C10).[042] Figure 1 Schematic model of the evaluation process of the analgesic effect of Di-RL in murine models of pain. Highlighted (top right corner) is the structure of the main Di-RL congener (Rha2C10C10).
[043] Figura 2 Avaliação do efeito de Di-RL na hiperalgesia mecânica.[043] Figure 2 Evaluation of the effect of Di-RL on mechanical hyperalgesia.
[044] Figura 3 Avaliação do efeito de Di-RL no número de sacudidas da pata.[044] Figure 3 Evaluation of the effect of Di-RL on the number of paw shakes.
[045] Figura 4 Avaliação do efeito de Di-RL nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.[045] Figure 4 Evaluation of the effect of Di-RL on abdominal contortions induced by acetic acid.
[046] Figura 5 Avaliação do efeito de Di-RL na migração leucocitária e produção de ânion superóxido na cavidade peritoneal.[046] Figure 5 Evaluation of the effect of Di-RL on leukocyte migration and superoxide anion production in the peritoneal cavity.
[047] Figura 6 Avaliação do infiltrado leucocitário no tecido cutâneo plantar após técnica histológica.[047] Figure 6 Assessment of leukocyte infiltrate in plantar skin tissue after histological technique.
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Legal Events
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| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] |