BR102022013583A2 - Sistemas micro e nanoparticulados a base de papaína para entregar de drogas e/ou radionuclídeos utilizados em diagnóstico e terapia - Google Patents
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Abstract
sistemas micro e nanoparticulados a base de papaína para entrega de drogas e/ou radionuclídeos utilizados em diagnóstico e terapia. a presente invenção descreve sistemas baseados em micropartículas e nanopartículas de papaína, uma protease vegetal de origem natural isolada do látex de carica papaya, e seu uso em sistemas de entrega de drogas para seres humanos e/ou animais da mesma forma na entrega de radionuclídeos diagnósticos e terapêuticos utilizados em medicina nuclear. essa patente relata micro e nanopartículas de papaína radiomarcadas e estudo in vitro e in vivo que demonstram o potencial em ser utilizada como carreadores.
Description
[001] A presente invenção, intitulada “SISTEMAS NANOPARTÍCULADOS A BASE DE PAPAÍNA PARA ENTREGA DE DROGAS E/OU RADIONUCLÍDEOS UTILIZADOS EM DIAGNÓSTICO E TERAPIA”, refere-se ao processo de obtenção de nanopartículas de papaína sintetizadas por radiação ionizante, rotas químicas ou físicas com atividade biológica preservada, direcionadas à entrega de radionuclídeos emissores alfa (a), beta(-ß), pósitron (+ß) ou gama (y) assim como drogas (quimioterápicos, antibióticos e outras drogas) para tecidos tumorais, sistema linfático e medula óssea. Esse documento detalha odesenvolvimento de estudos in vitro e in vivo de nanopartículas de papaína obtidas por rota de síntese inovadora que se fundamenta em obter, em etapa única, a formação da nanopartícula proteica e esterilização simultânea através do emprego da radiação ionizante em condições específicas de processo. Especificamente, a invenção ainda prevê que as nanopartículas desenvolvidas possam ser incorporadas às diferentes formas farmacêuticas disponíveis para fins radiofarmacêuticos (diagnóstico e terapia) e entrega de drogas (drug delivery).
[002] Os seres humanos usam plantas para tratar doenças e condições adversas desde antiguidade e, consequentemente, empregam empiricamente proteases vegetais e seus derivados (PETROVSKA, 2012). Atualmente, no campo comercial, as proteases representam 60% total de enzimas produzidas pela indústria mundial, principalmente nas áreas de alimentação e de detergentes. Além disso, a identificação e caraterização de proteases vegetais fazem parte de um grande esforço da comunidade científica na busca de compostos com propriedades farmacológicas provenientes de biomassa (SILVA-LÓPEZ et. al.,2019).
[003] As proteases catalisam a clivagem de ligações peptídicas de proteínas, principalmente por hidrólise ou eliminação de amônia, resultando em peptídeos de tamanhos variados e resíduos de aminoácidos livres (RAWLINGS et. al., 2016). Sua importância em conduzir as funções metabólicas e regulatórias essenciais é evidente, o que pode ser confirmado pela sua ocorrência em todas as formas de organismos vivos. Assim, medeiam e/ou participam de vários processos fisiológicos, como o catabolismo de proteínas, a coagulação sanguínea, o crescimento e a migração celulares, a formação de tecidos, a morfogênese em desenvolvimento, inflamações e crescimento de tumores, a ativação de zimogênios, a liberação de hormônios e de peptídeos farmacologicamente ativos de proteínas precursoras e, também, o transporte de proteínas através das membranas (TREMACOLDI, 2009).
[004] A característica mais notável dessas enzimas é a alta capacidade de hidrolisar proteínas em temperaturas mais altas do que as enzimas animais. Devido à expressiva estabilidade térmica associada à boa atividade da protease, as proteases vegetais têm sido investigadas para fins terapêuticos (SILVA-LÓPEZ et. al., 2019).
[005] A administração de extratos vegetais com enzimas proteolíticas teve origem na América do Sul e Central (LEIPNER, 2000; VANHOOF, 1997). Atualmente, este tipo de terapia vem sendo estudada para diversas indicações em oncologia, doenças infecciosas, trauma e inflamação (BEUTH, 2008; SILVALÓPEZ et. al., 2019).
[006] A lógica científica da terapia enzimática sistêmica baseou-se na observação da alta incidência de câncer na população idosa concomitante à redução de enzimas pancreáticas nestes indivíduos. Isso levou Max Wolf e Helene Benitez (1950), administrarem uma combinação otimizada de proteinases vegetais e animais em pacientes oncológicos na tentativa de restaurar a atividade citotóxica já reduzida nos soros dos pacientes. Como resultado, observou-se uma melhora da atividade oncolítica pela administração oral dessas enzimas (LEIPNER, et. al. 2000; ZAENKER, et. al. 2001; LAUER et. al., 2001).
[007] Em geral, as proteases terapêuticas de origem vegetal não são heterólogas, e são obtidas diretamente das plantas ou do seu látex, sendo possível extrair a proteína a baixo custo, sem afetar a viabilidade da planta. Algumas dessas enzimas têm sido importantes no planejamento racionalde fármacos com aplicações diagnósticas e terapêuticas e, devido a alguns aspectos químicos, biológicos e farmacológicos, as proteases vegetais mais estudadas são a papaína, bromelina, ficina e cumisina.
[008] A papaína (EC 3.4.22.2) é uma enzima proteolítica com peso molecular de 23,4 kDa extraída do látex do fruto verde da Carica papaya. Sua estrutura é composta por 212 aminoácidos, entre eles a cisteína (Cis25), a histidina (His159) e a asparagina (Asn175) que compõe o sítio ativo da enzima (SZABÓ et. al., 2006). Pertence à família das proteases de cisteína, classificadas como família C1, cruciais em vários processos biológicos em diversos organismos vivos. Destaca-se por sua especificidade relativa a proteínas e a substratos de baixa massa molecular, clivando ligações peptídicas de aminoácidos básicos como arginina, lisina e resíduos de fenilalanina. Apresenta estabilidade a altas temperaturas, em concentrações de solventes orgânicos elevadas e de agentes desnaturantes em uma ampla faixa de pH (3,0-9,0) e possui atividade máxima em pH 6,0-7,0 e 60°C (AMRI e MAMBOYA, 2012).
[009] É usada principalmente na indústria farmacêutica, na formulação de detergentes, tratamento de couro, amaciantes de carne e clarificação decervejas (AZARKAN et. al., 2003).
[010] Na medicina, é amplamente utilizada para tratamento de edemas, sinusite alérgica, síndrome do intestino permeável, intolerância ao glúten, hipocloridria e outros distúrbios digestivos, bem como na remoção de cáries (ZHANG et. al., 2006). Produtos à base de papaína com aplicação em curativos já estão disponíveis comercialmente devido a sua propriedade debridante que estimula o processo de cicatrização de feridas. São utilizados em tratamentos de ulcerações cutâneas em lesões diabéticas, quimioterápicas, hanseníase, síndrome de Fournier dentre outras lesões (LEITE et. al., 2012).
[011] Possui outras propriedades farmacológicas muito valiosas para aplicações médicas como propriedades antibacterianas, antifúngicas e antioxidantes (BUDAMA-KILINC et. al., 2018), além de atividade anticancerígena, antiproliferativa e antimetastática observadas e validadas por estudos experimentais in vitro, in vivo e estudos clínicos em pacientes com câncer de mama, colorretal e plasmocitoma (BEUTH, 2008). Da mesma forma, em estudos em modelo de carcinoma pulmonar de Lewis e melanoma, foi comprovada sua eficácia na inibição do crescimento do tumor primário e disseminação sistêmica, com aumento de sobrevida dos animais tratados (WALD et. al., 2001). Outros estudos em diferentes linhagens celulares corroboram com o fato de que a papaína pode modular vias de sinalização celular envolvidas no sistema imunológico, apoptose e desenvolvimento do câncer (CHANDRAN e NACHIMUTHU, 2018).
[012] Embora nanopartículas representem um fenômeno relativamente novo na pesquisa médica e, particularmente, na rotina clínica, produtos similares foram aplicados por décadas na medicina nuclear. Esses compostos são conhecidos como radiofármacos à base de colóides ou simplesmente radiocolóides, e da mesma forma que sistemas nanopartículados modernos, suas captações nos tecidos de interesse também se baseiam nos tamanhos das partículas, nas propriedades físico- químicas e mecanismos de direcionamento passivo (POLYAK e ROSS, 2018).
[013] Esses radiotraçadores, como agregados a base de albumina, fitato, enxofre e estanho coloidal, são utilizados desde a década de 1960 para investigações de perfusão de órgãos do sistema reticuloendotelial (SRE) como fígado e baço. Quando injetados por via intravenosa, células do SRE identificam esses compostos como material estranho e os fagocitam, acumulando a radioatividade nos órgãos que compõem o sistema. As funções hepática e esplênica podem ser avaliadas através da taxa de perfusão que é estimada a partir da depuração do radiocolóide através de imagens SPECT. Também são aplicados em estudos de perfusão pulmonar, cintilografia pulmonar, e na detecção de linfonodo sentinela (ZOLLE, 2007).
[014] Mais recentemente, métodos de imagem molecular foram importantes ferramentas no desenvolvimento de diversos nanocarreadores para veicular e entregar seletivamente compostos terapêuticos. E através de imagens PET e SPECT foi possível avaliar propriedades farmacocinéticas e de biodistribuição, permitindo a análise do comportamento, integridade e estabilidade desses sistemas in vivo. Ao mesmo tempo, essas investigações também oportunizaram a identificação de novos compostos candidatos a radiofármacos (LAMMERS et. al., 2010; MITRA et. al., 2006).
[015] Esses sistemas de imagem podem ser combinados com a tomografia computadorizada (CT) ou ressonância magnética (RM) caracterizando técnicas de imagens híbridas (SPECT/CT, PET/CT, SPECT/RM ou PET/RM), que aumentam o poder diagnóstico com a fusão de imagens funcionais e anatômicas. O desenvolvimento desses sistemas híbridos de imagem, também oportunizou o surgimento de novas nanopartículas como as magnéticas radiomarcadas com 18F ou 99mTc.
[016] Da mesma forma, verifica-se o desenvolvimento de nanopartículas teranósticas (que combinam funções terapêuticas e de diagnóstico), como a utilização de nanopartículas metálicas para visualização de tumores em ressonância magnética e que são projetadas para converter luz em calor e eliminar seletivamente células malignas através da hipertermia. Também pode-se citar nanopartículas de ouro-198, emissor de partículas ß utilizadas em endorradioterapia e raios Y que podem formar imagens SPECT (ROMARODRIGUES et. al., 2019).
[017] Para fins diagnósticos, são utilizados dois tipos de radioisótopos: emissores gama (Y) para SPECT e emissores pósitrons (+ß) para PET. Para escolha do radioisótopo na marcação de nanopartículas, deve-se considerar dois fatores, a meia-vida física (T7) do radionuclídeo e o tempo que o nanomaterial leva para acumular-se no tecido de interesse.
[018] Os radioisótopos PET utilizados com maior frequência são o 18F e 68Ga que possuem meia-vida relativamente curta, 109 e 68 minutos, respectivamente, e o tempo médio para início da imagem dependerá da atividade administrada. Por outro lado, os isótopos SPECT mais utilizados (99mTc, T7= 6,01h; 123I, T17 = 13,22 h e 111In, T7= 67,32 h) podem fornecer 24 horas ou até vários dias para seu rastreamento biológico, que também dependerá da atividade (LEE et. al., 2015).
[019] Diversas rotas podem ser utilizadas para marcar nanopartículas com esses radioisótopos, visto que possuem propriedades químicas distintas podendo ser classificados como halogênios e metais. Essas rotas incluem a marcação direta através da formação de ligações covalentes com superfície das nanopartículas ou indireta através da complexação desses átomos por agentes quelantes bifuncionais (Ramenda et. al., 2009; Hjelstuen, 1995).
[020] Os agentes quelantes bifuncionais formam núcleos permanentes onde o íon metálico é envolvido por ligações covalentes que posteriormente são complexados na superfície das nanopartículas ou incorporados em seus núcleos. Para radiometais os quelantes mais utilizados são 1,4,7,10-tetra-azaciclodo - ácido decano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7- triacético (NOTA), quelantes acíclicos desferoxamina (DFO) e ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) (JEON, 2019; LIU, 2008).
[021] Para determinação da pureza radioquímica de nanopartículas radiomarcadas, comumente utiliza-se cromatografia em camada delgada ascendente com fases móvel e estacionária adequadas ao tipo de material utilizado na síntese das nanopartículas e ao radioisótopo selecionado. Para purificação geralmente são utilizados procedimentos como filtração, cromatografia de exclusão de tamanho ou até mesmo precipitação. É fortemente recomendado estudos de possíveis alterações na distribuição de tamanho das nanopartículas pós-radiomarcação (VARENNE et. al., 2016).
[022] A Figura 1 apresenta a Distribuição de tamanho por número de partículas para as nanopartículas de papaína [10 mg.mL-1 e 20% EtOH (v/v)] irradiada a 10 kGy (5 kGy.h-1) em banho de gelo. Diâmetro médio foi igual a 9,3 ±1.9 nm com índice de polidispersão de 52,2% (n=3).
[023] A Figura 2 ilustra o Potencial Zeta medido para as nanopartículas de papaína diluídas em água. Z= -11,1 ± 5,5 mV (n=3).
[024] A Figura 3 apresenta micrografia eletrônica de varredura das nanopartículas de papaína (10 µg.mL-1). Magnificação de 10 000 vezes.
[025] A Figura 4 apresenta micrografia eletrônica de varredura das nanopartículas de papaína (10 µg.mL-1). Magnificação de 15 000 vezes.
[026] A Figura 5 apresenta Micrografia eletrônica de transmissão das nanopartículas de papaína (10 µg.mL-1).
[027] A Figura 6 apresenta o perfil do cromatograma (UV=280 nm) dos complexos não radiomarcardos: (1) Nanopapaína, (2) Papaína irradiada e (3) Papaína Nativa. Fluxo de 2 mL/min.
[028] A Figura 7 apresenta o perfil do radiocromatograma do (1) 99mTc- Nanopapaína, (2) 99mTc-Papaína irradiada e (3) 99mTc-Papaína Nativa. Fluxo de 2 mL/min.
[029] A Figura 8 apresenta a estabilidade radioquímica em solução de histidina e soro humano das nanopartículas de papaína radiomarcadas com tecnécio- 99m.
[030] A Figura 9 apresenta (A) Curva do clareamento sanguíneo e (B) Captação nos órgãos de excreção do 99mTc-P-NPs em camundongos balb/C (n=3) com remoção do conteúdo lumial.
[031] A Figura 10 apresenta tabela de biodistribuição de nanopartículas de papaína radiomarcadas (99mTc-P-NPs) em camundongos balb/C após administração endovenosa caudal (n=3 animais/tempo) (% Dose Injetada/grama - %DI/g). *(%DI)
[032] A Figura 11 apresenta a viabilidade celular e cálculo do IC50 em linhagem de câncer de mama humano (MDA-MB231). Tratadas com (A) e (B) papaína nativa por 24h e 48h, respectivamente e (C) e (D) Nanopartículas de papaína por 24h e 48h, respectivamente.
[033] A Figura 12 apresenta a viabilidade celular e cálculo do IC50 em linhagem de câncer de mama humano (MCF-7). Tratadas com (A) e (B) papaína nativa por 24h e 48h, respectivamente e (C) e (D) Nanopartículas de papaína por 24h e 48h, respectivamente.
[034] A Figura 13 apresenta o ensaio in vitro de ligação às células tumorais. (A) Captação celular e internalização total de 99mTc-P-NPs em células MDA- MB231; (B) Captação celular e internalização total de 99mTc-P- NPs em células 4T1 e (C) Captação celular e internalização total de 99mTc- BSA-NPs em células MDA-MB231.
[035] A Figura 14 apresenta Imagem SPECT/CT em modelo ortotópico de câncer de mama murino 4T1 em camundongo balb/C adquirida 2h pós- administração endovenosa de 99mTc-Nanopapaína. Planos (a) coronal; (b) sagital e (c) axial.
[036] A Figura 15 apresenta - Imagem SPECT/CT em modelo ortotópico de câncer de mama murino 4T1 em camundongo balb/C adquirida 6h pós- administração endovenosa de 99mTc-Nanopapaína. Planos (a) coronal; (b) sagital e (c) axial.
[037] A Figura 16 apresenta tabela de biodistribuição de nanopartículas de papaína radiomarcadas (99mTc-P-NPs) em modelo de tumor de mama ortotópico 4T1 e espontâneo (MMTV-PyMT) após administração endovenosa caudal. (n=3 animais/tempo) (%DI/g). *(%DI)
[038] A Figura 17 apresenta análise autorradiográfica ex vivo e imuno- histoquímica 2h pós administração em secções tumorais sequenciais de 10 µm de camundongo que foi administrado 99mTc-Nanopapaína. (A) controle negativo (B) seções tumorais do camundongo injetado.
[039] A Figura 18 apresenta análise autorradiográfica ex vivo e imuno- histoquímica 6h e 24h pós-administração em secções tumorais sequenciais de 10 µm de camundongo que foi administrado 99mTc- Nanopapaína. Objeto da invenção
[040] A presente invenção se refere a nanoestruturas proteicas a base de papaína para utilização como carreadores de radionuclídeos e medicamentos. Mais especificamente na utilização como agente diagnóstico, terapêutico ou teranóstico em medicina nuclear e como drug delivery através de encapsulamento de fármacos como quimioterápicos e outros visando melhorar a eficácia do tratamento e diminuir os efeitos adversos das terapias convencionais.
[041] Os resultados obtidos demonstram que a morfologia e a distribuição de tamanho das partículas são bastante uniformes e que a atividade biológica da papaína foi preservada. Além disso, a produção do sistema nanoparticulado através da via radiolítica demonstrou parâmetros, como composição qualitativa e quantitativa, relevantes e comparáveis a produtos baseados em nanopartículas de albumina presentes no mercado internacional, o que deve contribuir para a eficácia na distribuição e absorção das nanopartículas nos gânglios linfáticos e tecidos tumorais.
[042] A invenção proposta constitui um produto nanotecnológico a partir de tecnologia 100% nacional, consolidada e de baixo custo, que além de assegurar propriedades especificas, não requer o uso de agentes tóxicos ou reticulantes químico, comumente empregados em sínteses proteicas.
[043] O objeto da presente invenção refere-se a nanopartículas de papaína, bem como seu método de produção, cujas partículas produzidas apresentam distribuição de tamanho entre 10 e 100 nm menores ou superiores, com bioatividade preservada e estáveis em diversos meios biológicos. A distribuição do tamanho bem como seu respectivo tamanho médio podem ser controlados em função da concentração dos reagentes utilizados e, no caso da via radiolítica, da dose de radiação aplicada (Figuras 1, 2, 3, 4 e 5).
[044] O processo de obtenção das partículas por radiólise é estruturado em etapas, correspondendo a: solubilização da proteína sob concentração adequada em meio tamponado com parâmetros pré-definidos - pH, temperatura e concentração de sais; adição do cossolvente na concentração determinada e irradiação.
[045] O processo de radiomarcação dos complexos de papaína (Papaína nativa, Papaína irradiada e Nanopapaína) foi realizado com o isótopo tecnécio-99m, eluido de geradores de 99Mo/99mTc em solução salina na forma de pertecnetato de sódio utilizando como agente redutor cloreto de estanho II (SnCl2). Parâmetros como quantidade de nanopartícula, agente redutor, atividade do radioisótopo, pH, temperatura e tempo de reação foram otimizados para se obter altas pureza radioquímica (>90%). Para avaliação radioquímica também foi otimizado sistema cromatográfico para detecção das possíveis impurezas relacionadas ao processo de radiomarcação com tecnécio-99m.
[046] Para esta avaliação, as nanopartículas foram radiomarcadas com 740 MBq (20 mCi) de 99mTc recém-eluído de gerador 99Mo/99mTc (IPEN, Brasil). A fim de se obter alto rendimento e pureza radioquímica nas marcações, foram utilizados eluatos com alta atividade específica, alcançada através da eluição dos geradores 24h precedentes aos ensaios. Essa estratégia reduz a quantidade do isótopo estável 99Tc, produto de decaimento da espécie radioativa 99mTc, que pode competir e comprometer o rendimento da marcação.
[047] Para radiomarcação dos complexos de papaína foi utilizada via direta empregando solução de cloreto de estanho II (SnCl2) para reduzir o estado de oxidação dos átomos de 99mTc e formar complexos do radiometal com grupos reativos presentes na superfície da proteína: carboxilas (-COOH), hidroxilas (-OH), aminos (-NH2) e tiol (-SH).
[048] As Impurezas radioquímicas decorrentes da marcação foram determinadas por cromatografia em camada delgada ascendente. E as impurezas ocasionalmente detectadas nas preparações foram tecnécio livre na forma de pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) e a forma coloidal reduzida (99mTcO2). Essas espécies radioativas foram detectadas por dois sistemas cromatográficos. Em sistema composto por Whatman n°1 e fase móvel de Piridina:Ácido Acético:H2O (3:5:1,5), houve um arraste de 99mTc- Nanopartícula e Na99mTcO4 ao longo do suporte, resultando em Rf entre 0,1 -1,0. O oposto é observado nos sistemas composto pela mesma fase estacionária em acetona, as nanopartículas radiomarcadas permanecemno ponto de aplicação da amostra (Rf = 0,0) enquanto o pertecnetato de sódio Na99mTcO4 apresentou Rf=1. 99mTc coloidal não migra em nenhum dos sistemas de cromatografia planar utilizados, permanecendo no início do suporte (Rf = 0,0). De qualquer maneira, para excluir a presença de 99mTcO2, as soluções foram filtradas em filtros de seringa 0,22.
[049] Os complexos radiomarcados tiveram seus perfis cromatográfico avaliado por SEC-HPLC. As análises foram conduzidas em modo isocrático, utilizando como fase móvel tampão fosfato 0,05 M pH 7,0, em taxa de fluxo de 2 mL/min. Utilizou-se coluna de gel-filtração Protein-Pak 300SW, composta por partículas de 10 µm e poros de 300 A. Visto que as nanopartículas possuem menores que 1 µm essa coluna torna-se adequada para análise cromatográfica das mesmas (Figuras 6 e 7).
[050] A radiomarcação dos complexos de papaína com 99mTc resultou em rendimento próximo a 90%. Esses dados estão de acordo com o recomendado pela farmacopeia americana e pela farmacopeia europeia, segundo as quais a pureza radioquímica específica para cada radiofármaco deve ser superior a 90% (BRADDOCK, 2012).
[051] Previamente aos estudos em modelos animais, é crucial determinar a estabilidade de complexos de 99mTc in vitro em condições que simulam o ambiente biológico. Avaliou-se a estabilidade das nanopartículas em soro recém-coletado de humano saudável e paralelamente foram conduzidos ensaios de desafio à histidina, um aminoácido endógeno presente em altas concentrações in vivo e que está relacionado a instabilidade de compostos radiomarcados com 99mTc devido a transquelação. As nanopartículas de papaína marcadas com 99mTc permaneceram estáveis (>90%) por 6 h durante incubação a 37 ° C em solução de histidina e soro humano recém-coletado. Em 24h, verificou-se uma média de degradação de 18,9% e 9,7%, respectivamente em solução de histidina e soro, demostrando estabilidade em relação à transquelação até 6h pós-radiomarcação. (Figura 8). Em relação aos estudos in vivo em camundongos balc/C saudáveis, verificou-se que o perfil de excreção para 99mTc-P-NPs se dá principalmente por via renal (Figura 9).
[052] Isso se deve aos tamanhos das partículas, uma vez que partículas com diâmetro igual ou menor a 10 nm tendem a ser eliminadas pelos rins, enquanto partículas maiores, pelo fígado. Da mesma forma, os dados revelaram captações relevantes em órgãos do sistema fagocitário mononuclear (SFM), como fígado e baço. Esses achados estão em consonância com a literatura, uma vez que já é amplamente descrito que nanopartículas são rapidamente opsonizadas e retiradas da circulação por macrófagos do SFM (SONG et. al., 2014).
[053] Pode-se observar também que os demais órgãos avaliados, principalmente estômago e tireoide, apresentaram baixa captação durante todo o experimento (Tabela 1). Esse dado é de extrema relevância, pois sugere que o teor de 99mTcO4-, uma das impurezas radioquímicas decorrente do processo de marcação, e o tecnécio em sua forma livre, decorrente de baixa estabilidade do sistema, estão dentro dos limites preconizados, uma vez que é sabido que sua captação ocorre, preferencialmente, nestes órgãos (Aguiar, 2014).
[054] Em relação à captação tumoral, observa-se que a atividade detectada no músculo é significativamente inferior à encontrada no tumor mamário. A análise dos valores médios de razão tumor/músculo para nanopartículas de papaína sugerem maior afinidade pelo tecido tumoral (Tabela 2). As imagens SPECT/CT obtidas confirmam os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição, apontando maior afinidade pelo tecido tumoral quando comparado ao músculo em todos os tempos observados (Figura 12 e 13).
[055] Os resultados alcançados nas análises qualitativas de imunohistoquímica revelaram alta densidade de nanopartículas em regiões periféricas do tecido tumoral (imunorreatividade destacada pela coloração marrom) (Figuras 15 e 16). Esses resultados corroboram com o perfil de distribuição das nanopartículas radiomarcadas evidenciados pelas análises pareadas das imagens autorradiográficas com a correspondente secção sequencial utilizada no ensaio de imunohistoquímica que também indicou uma maior concentração de radioatividade em borda. Importante observar que os resultados de imunohistoquímica foram confirmados com controle negativo (secções tumorais com ausência das nanopartículas) para os anticorpos utilizado nos ensaios.
[056] O acúmulo dessas nanopartículas no tecido tumoral se deve, em parte, pelo direcionamento passivo que ocorre devido ao efeito de permeação e retenção aumentadas (efeito EPR) presentes em tumores sólidos. Esse efeito ocorre devido ao processo de angiogênese tumoral no qual os vasos são produzidos de maneira rápida, de forma a suprir as necessidades nutricionais do tumor, e de maneira defeituosa, formando fenestrações e baixa adesão entre as células endoteliais. Dessa forma, as partículas com tamanhos reduzidos, menores que 200 nm tendem a se acumular no tecido tumoral, apresentando uma maior permeação devido ao EPR. Além dessa permeação, a inexistência de drenagem linfática eficaz faz com que as partículas permaneçam mais tempo no local (ABRIATA, 2018). Além do efeito EPR, uma das hipóteses de internalização é da própria ação proteolítica desta enzima que degrada a matriz extracelular (MEC) facilitando a difusão das nanopartículas no interstício tumoral. A utilização desta proteína para projetar um nanocarreador enzimático fundamentou-se na possibilidade da modulação do microambiente tumoral para superar obstáculos relacionados à penetração e aumentar a eficácia da administração, considerando que a MEC é altamente suscetível à ação de proteases (EIKENES et. al., 2005; GANESH et. al., 2008; GULLOTTI et. al., 2009; RAKESH et. al., 2010).
[057] As nanopartículas de albumina mostraram-se promissoras a serem utilizadas como sistema de veiculação de radionuclídeos diagnósticos para estudos de sua distribuição sistêmica, bem como de sua aplicação como traçador SPECT em tumores mamários, sistema linfático e linfonodo sentinela. Esses achados também apontam para a aplicabilidade como nanocarreadores de radionuclídeos PET, terapêuticos e/ou teranósticos, assim como em entrega seletiva de drogas (drug delivery).
Claims (18)
1. Agente de contraste radiofarmacêutico a base de nanopartículas de papaína sintetizadas por via radiolítica ou não para carreamento de radionuclídeos diagnósticos (emissores pósitron [+ß] e/ou gama [Y]), terapêuticos (emissores alfas [a] e/ou beta [-ß]), e drogas (quimioterápicos, antibióticos e outros), caracterizado por utilizar papaína de origem vegetal com atividade biológica preservada direcionadas à tecidos tumorais, estadiamento de linfonodos sentinela, sistema linfático e medula óssea, utilizando como instrumentação para aquisição de imagens a Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (do inglês Single photon emission computed tomography) ou Tomografia por emissão de pósitrons (Do inglês Positron emission tomography) acopladas ou não a Tomografia computadorizada (CT), Ressonância magnética e/ou gama câmera portátil ou fixa
2. Agente de veiculação de drogas e quimioterápicos, de acordo com reinvindicação 1, caracterizado por compreender drogas encapsulada em nanopartículas de papaína ou sistema coloidal baseado em papaína (faixa nanométrica e micrométrica)
3. Agente de contraste radiofarmacêutico ou agente de veiculação de drogas de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato da nanopartícula estar reticulada ou não, por radiação, via química ou física, utilizando monômeros ou ligantes
4. Agente de contraste radiofarmacêutico ou agente de veiculação de drogas de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato da nanopartícula de papaína estar funcionalizada para direcionamento ativo a tecidos diversos (funcionalização com peptídeos, outras proteínas, anticorpos e outras biomoléculas)
5. Agente de contraste radiofarmacêutico ou agente de veiculação de drogas de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por utilizar papaína de origem vegetal e ou proteínas globulares ou fibrosas, aminoácidos ou peptídeos
6. Agente de contraste radiofarmacêutico ou agente de veiculação de drogas, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por ser reticulado por via radiolítica (radiação ionizante - gama, elétrons, partículas aceleradas, ultravioleta ou Raio X), com ou sem a utilização de aditivos
7. Agente de contraste radiofarmacêutico ou agente de veiculação de drogas de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por ser esterilizado simultaneamente ou não a síntese do nanocarreador ou nanopartícula, pelo efeito da radiação no sistema, e/ou produzido em condições assépticas ou em etapas isoladas
8. Agente de contraste radiofarmacêutico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser esterilizado pela radiação do próprio radionuclídeo acoplado ou não nas nanopartículas de papaína
9. Agente de contraste radiofarmacêutico ou agente de veiculação de drogas, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo tamanho na escala de nanômetros ou micrômetros
10. Agente radiofarmacêutico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por consistir em nanopartícula polimérica natural; e um radionuclídeo emissor a (alfa), -1ß (beta), +1ß (pósitron) ou Y (gama) tanto para diagnóstico como terapia de tumores sólidos, ou teranóstica
11. Micro e nanopartículas de papaína, caracterizado por serem funcionalizadas com agente quelantes bifuncionais como: HYNIC, DOTA, NOTA, DTPA, DFO, DTPA, NTA, DTCBP, DOTAM, NODAGA, MAG3, DMSA e outros, para radiomarcação direta ou indireta
12. Agente de veiculação de drogas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por consistir em nanopartícula polimérica natural ou sintética, e uma droga encapsulada, por meio de ligações físicas ou químicas
13. Método para estadiamento de linfonodo sentinela em câncer de mama, próstata e melanoma, caracterizado por, mas não limitado a administração subcutânea de nanopartícula de papaína radiomarcada, previamente sintetizada pela via radiolítica ou não
14. Método para linfocintilografia de medula óssea, caracterizado por, mas não limitado a administração intravenosa de nanopartícula de papaína radiomarcada, previamente sintetizada pela via radiolítica ou não
15. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a imagem pode ser obtida através de equipamentos PET (Tomografia por emissão de pósitrons), SPECT (Tomografia computadorizada por emissão de fóton único), PET/CT (Tomografia por emissão de pósitrons e Tomografia computadorizada) ou SPECT/CT (Tomografia computadorizada por emissão de fóton único e Tomografia Computadorizada)
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico compreende a visualização do tumor/linfonodo para estadiamento da doença com micro ou nanopartículas de papaína radiomarcada
17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico compreende monitorar o câncer antes, durante e após o tratamento com micro ou nanopartículas de papaína radiomarcadas
18. Método para o direcionamento de quimioterápicos para tumores sólidos, caracterizado por utilizar micro ou nanopartículas de papaína para melhorar a eficácia de tratamento e diminuir reações adversas
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