BR102022006325A2 - Formulações biolarvicidas e biofertilizantes compreendendo biossurfactantes e óleos essenciais - Google Patents

Abstract

formulações biolarvicidas e biofertilizantes compreendendo biossurfactantes e óleos essenciais. a presente invenção se insere dentro do campo da biotecnologia ao proporcionar formulações biolarvicidas e biofertilizantes sustentáveis compreendendo biossurfactantes e óleos essenciais como componentes principais ativos, os quais apresentaram efeito sinérgico em dosagens apropriadas. as formulações são desenvolvidas, inicialmente, pela obtenção do biossurfactante, produzidos por fermentação a partir de leveduras e meio de cultivo a base de hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana-de-açúcar. ao meio fermentado livre de células liofilizado, é adicionado o óleo essencial de laranja, obtido por extração em casca de laranja em extrator soxhlet (extração a baixa pressão), utilizando diclorometano como solvente extrator. após obtenção das formulações, estas são caracterizadas para determinação da composição química, e propriedades físico-químicas, além de testes biológicos da atividade larvicida em a. aegypti e testes biológicos para avaliação da fitotoxicidade e potencial fertilizante.

Description

Campo da invenção:

[001] A presente invenção se insere dentro do campo da biotecnologia ao proporcionar formulações biolarvicidas e biofertilizantes sustentáveis compreendendo biossurfactantes e óleos essenciais como componentes principais ativos, os quais apresentaram efeito sinérgico em dosagens apropriadas.

Fundamentos da invenção: Aedes aegypti e possíveis soluções para o seu combate:

[002] Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) é vetor de várias doenças tropicais negligenciadas, comumente conhecido por ser transmissor das doenças febre amarela e dengue. Ele começou a se espalhar pelo mundo já no século XVI, sendo originário da África e indo em direção às Américas, possuindo preferência por climas tropicais e subtropicais (FIOCRUZ, 2016; PORTAL DE SAÚDE, 2016).

[003] Durante o século XV, no Brasil, foram atestados os primeiros casos de febre amarela provenientes do A. aegypti. No final do século XIX, nas regiões sul e sudeste, em Curitiba e Niterói, foram relatados os primeiros casos de dengue no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016; FIOCRUZ, 2016).

[004] Devido à intensa urbanização, ao longo dos anos, ocorreram alguns surtos de febre amarela e dengue em todo o Brasil e, a partir de meados de 1990, a dengue passou a ser uma ameaça constante à saúde da população brasileira. Ano após ano, devido aos verões quentes e chuvosos e à baixa aderência da população às campanhas governamentais de profilaxia, o número de casos da doença só vem aumentando.

[005] Além da febre amarela e da dengue, o A. aegyptié conhecido como transmissor de outras flavoviroses tropicais, tais como iguapé, ilhéus, rocio, encefalite de Saint Louis, bussuquara, cacipacoré e febre azul gravemente contagiosa (FIGUEIREDO, 2000). Recentemente, outras doenças vêm assolando a população e preocupando as autoridades. Em 2013 e 2014, o Brasil se deparou com doenças transmitidas pelo A. aegypti, tais como a febre Chikungunya e o vírus Zika.

[006] É sabido que a melhor forma de se evitar as doenças transmitidas pelo A. aegyptié pela eliminação do vetor. Diversas tentativas para a contenção deste mosquito vêm sendo implementadas. De acordo com Braga e Valle (2007), para o combate do A. aegypti, podem ser utilizados os larvicidas e inseticidas organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretroides. Atualmente, vários países no mundo têm empregado organofosforados como temephós, malathion e fenitrothion, para eliminar larvas, pupas e mosquitos do vetor (RAWLINS; WAN, 1995; WIRTH; GEORGHIOU, 1999; MACORIS et al.; 2003). Há relatos da atuação destes compostos nos canais de troca iônica celular e no sistema nervoso central das larvas e mosquitos. Entretanto, a resistência do vetor aos larvicidas e inseticidas sintéticos que vêm sendo empregados já é uma realidade. Relatam-se como mecanismos de resistência desde a diminuição da taxa de penetração pela cutícula, detoxificação metabólica aumentada, até a diminuição da sensibilidade do sítio-alvo. Esses mecanismos são inespecíficos e podem conferir resistência cruzada a outro inseticida com estrutura similar, o que dificulta a determinação do melhor método de combate ao A. aegypti (BRAGA; VALLE, 2007).

[007] O larvicida temephós (grânulos de areia a 1 %) é um dos principais produtos sintéticos utilizados no controle de A. aegypti e em programas de controle vetorial de larga escala. Esta formulação apresenta efeito larvicida eficaz que dura por semanas e possui baixo custo. No entanto, esta é constantemente rejeitada devido ao forte cheiro, leve turbidez, além de que, com seu uso intenso, as larvas podem apresentar resistência (MULLA et al., 1986).

[008] No Brasil, o principal larvicida utilizado para a contenção do A. aegyptié piriproxifeno, recomendado pela OMS e aprovado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), sendo adicionado na água potável de consumo humano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). De acordo com Pesticide Properties DataBase da Universidade de Hertfordshire, o piriproxifeno está incluído na classe III da classificação de Cramer (substâncias com estruturas químicas que podem sugerir toxicidade significativa). Durante a degradação do piriproxifeno em mamíferos, organismos aquáticos, no meio terrestre e aquático, observa-se a formação de compostos derivados de fenóis, que podem ser tóxicos aos seres vivos (ROBERTS; HUTSON, 1999).

[009] No estudo realizado por SECCACINI et al., 2008, foi avaliada a eficácia dos larvicidas piriproxifeno e diflubenzuron, contra A. aegypti. Foram preparadas formulações de areia contendo aproximadamente concentrações de 0,1 e 0,2 % de diflubenzuron ou piriproxifeno, e os dois compostos testados apresentaram boa atividade larvicida quando aplicados nos estágios imaturos do A. aegypti.

[010] Mesmo os pesticidas sintéticos apresentando eficiência no controle de pragas, seu uso apresenta muitos problemas. Eles são prejudiciais aos organismos não-alvo, como seres humanos, animais e insetos benéficos. Adicionalmente, seu uso gera resíduos que permanecem na colheita e se acumulam nos solos, água ou no ar. Outra preocupação é o desenvolvimento de resistência a pesticidas pelos organismos-alvo.

[011] Devido aos problemas causados por esses compostos sintéticos, a busca por produtos sustentáveis, tais como os biolarvicidas, biopesticidas e bioinseticidas, se tornaram alternativas aos análogos sintéticos para o combate aos vetores (RABINOVITCH; SILVA; ALVES, 2000). Entre os métodos de controle biológicos disponíveis, estão o uso de formulações a base de microrganismos tais como Bacillus thuringiensis sorovar israelensis e Bacillus sphaericus (MULLA et al., 2004). Formulações a base de óleos essenciais, tal como óleo essencial Citrus sinensis L. Osbeck (ASSUNÇÃO, 2013) e, nos últimos anos, moléculas de biossurfactantes de origem microbiana, vêm recebendo grande destaque devido aos efeitos larvicida, mosquitocida e repelente contra o A. aegypti.

Formulações biolarvicidas:

[012] A busca por soluções sustentáveis contra pragas agrícolas e vetores de doenças humanas tem sido intensa nos últimos anos. Formulações sintéticas são comumente utilizadas como inseticidas e larvicidas e, devido ao uso excessivo desses compostos, os vetores se tornam resistentes à ação larvicida e inseticida desses produtos. Dessa forma, têm surgido pesquisas para o desenvolvimento de formulações sustentáveis que atuem como biolarvicidas, bioinseticidas, e sejam alternativas para as formulações sintéticas.

[013] Em 2005, o Ministério da Agricultura e a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) lançaram o Bt- Horus, primeira formulação brasileira baseada em Bacillus thuringiensis. Em fevereiro de 2016, os Ministérios da Agricultura e da Saúde, em meio a um surto de dengue, Chikungunya e Zika no Brasil, incentivaram a utilização da chamada nova geração de bioinseticidas a base de B. thuringiensis - o Inova Bti - resultante de pesquisas da EMBRAPA e da empresa Bthek Biotecnologia (AGÊNCIA CTI, 2016). Atualmente, estes produtos vêm sendo largamente utilizados para o controle de vetores em muitos países tropicais, assim como contra mosquitos incômodos e borrachudos, na Europa e na América do Norte. As vantagens da utilização dessas bactérias no controle de pragas se devem à especificidade e à inocuidade aos animais e plantas, o que ocasionou a aprovação e recomendação de uso pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (WHITELEY; SCHNEPF, 1986). Na Tabela 1, observam- se os diferentes tipos de formulações comerciais produzidas por diversas companhias do mundo (BECKER, 1990; BECKER; MARGALIT, 1993; RABINOVITCH; SILVA; ALVES, 2000). Tabela 1: Alguns produtos comercialmente disponíveis à base de Bacillus thuringiensis sorovar israelensis e Bacillus sphaericus Fonte: Adaptado de RABINOVITCH; SILVA; ALVES, 2000.

[014] Ao longo dos anos, estudos têm sido realizados para mostrar ação dos biolarvicidas, cuja formulação seja à base de bactérias Bacillus thuringiensis var. israelenses. MULLA et al., 2004 compararam a ação contra A. aegypti de três diferentes larvicidas, entre eles, o VectoBac (larvicida comercial, composto por Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) 5%), formulação granular de zeólito de temephós(1 %) e formulação com grânulos de areia de temephós (1%). Neste estudo, foi observado que 1 comprimido do composto VectoBac (0,37 g por 50 litros de água) apresentou controle larvicida por cerca de 112 dias em potes cheios de água, enquanto as 2 formulações de temephós(5g por 50 litros de água) apresentaram a mesma eficácia, gerando quase 100% de controle por mais de 6 meses. Ao contrário do temephósem grânulos de areia, o temephósZG não apresentou odor desagradável e, assim como VectoBac, aumentaram a clareza da água, potencializando seu uso.

[015] RITCHIE et al. (2010) examinaram o uso de megadoses do VectoBAC WD (grânulo dispersivo em água - WD) para controle de A. aegypti. Foram avaliadas quantidades 10, 20 e 50 vezes a dose recomendada (8,0 mg/L), e estas foram capazes de controlar o desenvolvimento mais de 90% das larvas por 8,8 e 23 semanas, respectivamente. As formulações de WD suspendem facilmente na coluna de água (CLARK et al., 2007) e se depositam gradualmente na base do recipiente, onde são ingeridas pelas larvas (SU; MULLA, 1999).

[016] ARMENGOL et al. (2006) descobriram que um comprimido de Bti com 4,8% de pó técnico proporcionou 12 semanas de redução > 80% na produção de pupas em recipientes de 70 L expostos à luz solar. O uso do VectoBac DT (comprimido dispersivo) reduziu significativamente o número de pupas em grandes recipientes de cimento por até 3 meses (SETHA et al., 2007). BENJAMIN et al., 2005 obtiveram > 90% de controle de A. aegypti em potes de barro por até 5,5 meses usando o VectoBac DT. As formulações granulares de Bti foram usadas para controlar A. aegypti em pneus por até 33 dias (NOVAK et al., 1985), e as formulações molhadas de Bti em pó e comprimido forneceram controle de 80% por até 6 meses (DE MELO-SANTOS et al., 2009)

[017] Apesar dos biolarvicidas e bioinseticidas a base de B. thuringiensis e B. sphaericus serem considerados produtos eficazes no combate ao A. aegypti e outros vetores, a sua utilização não permite reciclo no ambiente, e, em algumas doses, requer a aplicação semanal na maioria dos habitats, tornando alto o custo final no processo (MITTAL et al., 2003). Além disso, outras limitações são associadas ao uso desses agentes biológicos por técnicas convencionais, além de que alguns dos agentes de controle biológico são patógenos oportunistas contra seres humanos ou animais. Logo, a prospecção de novas substâncias naturais faz-se necessária, uma vez que os insetos criam mecanismos de resistência com o decorrer do tempo. Assim, nos últimos anos, diversos óleos essenciais passaram a ser considerados novas alternativas de biolarvicidas, bioinseticidas e repelentes contra o A. aegypti.

[018] LUCIA et al. (2020) estudaram atividade larvicida de formulações compostas por emulsão formada por água e óleo essencial (timol e carvacrol). Os resultados mostraram que as emulsões que contêm compostos puros de óleo essencial como fase oleosa não apresentam diferença significativa em sua atividade contra as larvas de mosquitos. Já o uso de misturas contendo diferentes frações de timol e carvacrol como fase oleosa resultam em formulações com uma atividade larvicida aditiva.

[019] PANDIYAN et al. (2019) e SARMA et al. (2019) também estudaram o efeito de óleos essenciais como larvicida e avaliaram a combinação dos óleos na atividade larvicida. Quando se combinam dois ou mais óleos essenciais em uma formulação, espera-se que ocorra um dos efeitos: efeito aditivo, sinergismo ou antagonismo (NELSON; KURSAR, 1999), sendo que o ideal é a obtenção de combinações as quais promovam efeito sinérgico, de modo a ser efetivo contra um maior número de larvas. PANDIYAN et al. observaram efeito sinérgico na atividade larvicida pela combinação dos óleos nas formulações. SARMA et al. (2019) observaram efeito sinérgico, mostrando melhor desempenho em ação larvicida nas formulações compostas por limoneno e dialildissulfeto, observando a melhor ação adulticida com a mistura de carvona e limoneno.

[020] Devido à grande diversidade de vegetais existentes na flora brasileira, estudos a partir de extratos vegetais surgem com a expectativa de se encontrarem substâncias com propriedades larvicidas, inseticidas e simultaneamente seletivas para serem usadas em futuras formulações de um produto comercial contra o A. aegypti (SANDES; BLASI, 2000; MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2016). Furtado e colaboradores (2005) observaram que o óleo essencial de Citrus limon L. (limão) apresentou efeito ovicida, larvicida, mosquitocida e repelente em A. aegypti. Assunção (2013) também demonstrou o potencial efeito larvicida e inseticida do óleo essencial de Citrus sinensis L. Osbeck (laranja doce). Deve-se salientar que, para o Brasil, a utilização do óleo essencial de laranja doce como ferramenta larvicida/inseticida é uma excelente estratégia de agregação de valor aos subprodutos da indústria cítrica, uma vez que o país é um dos maiores produtores da fruta no mundo e estes subprodutos industriais são poucos utilizados, sendo principalmente destinados à elaboração de rações animais, porém, a maioria ainda é descartada no meio ambiente (ALEXANDRINO et al., 2007).

[021] Outras substâncias que vêm recebendo grande destaque devido aos efeitos larvicida, mosquitocida e repelente contra o A. aegyptisão os biossurfactantes de origem microbiana. Recentemente, trabalhos relataram a ação individual de surfactinas e ramnolipídeos produzidos, respectivamente, por Bacillus e Pseudomonas, como potenciais ferramentas na mitigação ou eliminação de larvas e mosquitos de A. aegypti (GEETHA; MANONMANI, 2010; GEETHA; ARUNA; MANONMANI, 2014; SILVA et al., 2015). Adicionalmente, visando à utilização de ramnolipídeos no controle biológico de vetores de doenças tropicais, estudos como o de Fernandes (2011) mostraram a inocuidade deste composto a animais e plantas. Diante disso, os biossurfactantes podem ser considerados novas armas sustentáveis para a “guerra” que o Brasil vem travando para o controle do A. aegypti e as doenças tropicais transmitidas por ele que assolam a população.

Biossurfactantes e suas aplicações:

[022] Os biossurfactantes são metabólitos microbianos, com estruturas anfipáticas que apresentam propriedades tensoativas, emulsificantes e antimicrobianas, vastamente aplicados na sociedade moderna. Devido à sua estrutura dual, estas biomoléculas são consideradas compostos versáteis com inúmeras funções (Tabela 2). Tabela 2: Principais aplicações industriais dos Biossurfactantes Fonte: Adaptado de (BANAT, 2000); (BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000); (NITSCHKE; PASTORE, 2002); (VATSA et al., 2010); (GANESH et al., 2010); (SAIKIA; BHARALI; KONWAR, 2013); (DWIVED et al., 2015); (SILVA et al., 2015).

[023] Os biossurfactantes podem ser produzidos por bactérias, actinomicetos, fungos filamentosos e leveduras. As bactérias isoladas do solo, da água do mar, de sedimentos marinhos e de áreas contaminadas por óleos, tais como as do gênero Pseudomonas sp. e Bacillus sp., são as principais produtoras desses compostos (BARROS et al., 2007). No entanto, tem aumentado a busca por organismos não- patogênicos para obtenção dessas biomoléculas. Dessa forma, o uso de microrganismo que apresente o status GRAS (Generally Recognized As Safe), como as leveduras, tem aumentado. Os gêneros Candida sp. e Pseudozyma sp. são os principais produtores citados na literatura, porém, pode-se também encontrar trabalhos com as leveduras pertencentes aos gêneros Yarrowia sp., Rhodotorula sp., Pichia sp., Debaromyces sp., Aureobasidium sp., Starmerella sp., e Kluyveromyces sp. (SMYTH et al., 2010).

[024] Apesar dos biossurfactantes terem um maior destaque na indústria petrolífera, devido aos seus efeitos nos procedimentos de biorremediação de áreas contaminadas em derramamentos de petróleo, outros segmentos, tais como as indústrias farmacêutica e de alimentos, também vêm estudando e utilizando os biossurfactantes extensamente. De acordo com a Gharaei-Fathabad (2011), os biossurfactantes podem ser aplicados na indústria farmacêutica como gene delivery, drug delivery, adjuvantes imunológicos, antiaderentes de microrganismos patogênicos em superfícies sólidas, recuperação de produtos intracelulares, antimicrobianos e em formulações cosméticas. Já na indústria de alimentos, estes podem ser aplicados como emulsionantes e estabilizantes (NITSCHKE; COSTA, 2007). Os biossurfactantes também podem ser utilizados na agricultura no controle biológico de pragas e fitopatógenos (SACHDEV; CAMEOTRA, 2013). Formulações a base de biossurfactantes:

[025] No setor agrícola, devido às suas propriedades, os surfactantes podem atuar como fungicida, inseticida, larvicida, herbicidas e pesticidas (Sachdev; Cameotra, 2013). Têm a capacidade de eliminar patógenos vegetais, e promovem crescimento das plantas. Estudos demonstram o papel dos surfactantes na melhoria das atividades inseticidas de outros compostos sintéticos (Jazzar; Hammad, 2003).

[026] Essas moléculas, quando usadas em formulações pesticidas, atuam como agentes emulsificante, dispersante, espalhador e umectante e potencializando a ação dos pesticidas (Sachdev; Cameotra, 2013). No entanto, o uso em excesso de surfactantes sintéticos na composição das formulações pesticidas, resulta em seu acúmulo no solo, influenciando no crescimento das plantas. Esses pesticidas nocivos também se tornam lixiviados do solo para as águas subterrâneas (Blackwell, 2000). Considerando os efeitos adversos dos pesticidas e dos surfactantes sintéticos, é necessário o uso de biossurfactantes ambientalmente seguros como substituintes desses compostos nas indústrias de pesticidas.

[027] Sendo assim, a presente invenção consiste em formulações que são larvicidas e fertilizantes sustentáveis ao mesmo tempo, cujos ingredientes ativos compreendem biossurfactantes e óleo essencial de laranja, os quais em uma dosagem adequada, apresentam efeito sinérgico.

[028] Para o desenvolvimento das referidas formulações, foi necessário o estabelecimento e otimização das dosagens e toxicidade, uma vez que dosagens elevadas, podem levar a prejuízos ambientais e à saúde dos organismos vivos.

[029] Como poderá ser verificado mais adiante por meio dos testes e resultados apresentados, ditas formulações atuam como larvicidas e estão envolvidas no combate de larvas responsáveis por doenças negligenciadas, tais como a Dengue, Zika e Chikungunya, e por larvas de pragas agrícolas tais como aquelas do inseto Chrysodeixis includens, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera e Myzus persicae.

[030] Em adição, as referidas formulações também favorecem a germinação e o desenvolvimento das sementes, atuando como fertilizante biológico para plantas.

Estado da técnica:

[031] O documento BR102014031965-4, cujo título é “Processo de produção de biossurfactantes a partir de uma biomassa”, trata de um processo de produção de biossurfactantes, utilizando a biomassa lignocelulósica como matéria-prima. Apesar de a presente invenção utilizar biossurfactante produzido a partir da biomassa lignocelulósica, difere-se deste por utilizar o biossurfactante em formulações larvicidas. O foco da presente invenção não é o processo de produção do biossurfactante e sim a formulação, a combinação dos componentes, em determinadas proporções, visando um expressivo efeito larvicida. Também, em nenhum momento, há menção ao potencial fertilizante dos referidos biossurfactantes.

[032] O documento US2005/0266036, cujo título é “Microbial biosurfactans as agentes for controlling pests”, relata o efeito larvicida do biossurfactante produzido por um determinado microrganismo contra uma gama de pragas agrícolas. Diferencia-se da presente invenção por não apresentar uma formulação com dosagem otimizada e definida. Igualmente, em nenhum momento, é mencionado no referido documento o potencial fertilizante dos referidos biossurfactantes.

[033] O documento intitulado “Produção de biossurfactante por levedura” de 2008, trata de uma revisão sobre os parâmetros relevantes que influenciam a produção de biossurfactantes por leveduras. Apesar de os biossurfactantes utilizados na presente invenção serem de origem leveduriforme, o objetivo da presente invenção é a utilização dos biossurfactantes no desenvolvimento de formulações larvicidas e biofertilizantes. Igualmente, em nenhum momento, no referido documento, hà menção ao potencial fertilizante dos referidos biossurfactantes.

[034] O documento intitulado “Produção de biossurfactante por levedura utilizando fermentação em estado sólido em bagaço de cana-de-açúcar” de 2017, teve por objetivo selecionar uma levedura capaz de produzir biossurfactante por FES (fermentação em estado sólido) em bagaço de cana-de-açúcar, caracterizar bioquimicamente o biossurfactante e testar sua aplicação para biorremediação. Como pode ser visto nesse documento, é descrito um processo de produção, porém, não há menção à formulação a base de biossurfactantes com efeito larvicida.

[035] Já o documento intitulado ”Produção de biossurfactantes de segunda geração por leveduras em hidrolisado hemicelulósico de bagaço da cana-de-açúcar” de 2016, refere-se à seleção de leveduras capazes de produzir biossurfactantes em meios de cultivo suplementados com hidrolisado hemicelulósico do bagaço da cana-de-açúcar, estudando a produção, a caracterização física, química e biológica do composto produzida pela levedura. Ressalta-se que, em nenhum momento, é citado o uso dos biossurfactantes nas composições de formulações larvicidas, diferenciando-se assim da presente invenção.

[036] O documento intitulado “Caracterização química e avaliação da atividade larvicida frente ao Aedes aegypti do óleo essencial da espécie Citrus sinensis L. Osbeck (laranja doce)” de 2013 relata o potencial larvicida do óleo essencial de laranja. No entanto, o referido documento se diferencia da presente invenção pelo fato de o óleo essencial não se apresentar em uma formulação, combinando-se com outros princípios ativos, como por exemplo, os biossurfactantes.

[037] O documento intitulado “Teste do óleo de laranja (Citrus sinensis) encapsulado em leveduras para controle da população de Aedes aegypti em Belo Horizonte - MG” de 2019 relata o efeito larvicida do óleo essencial de laranja encapsulado/imobilizado em leveduras. Igualmente, ressalta- se que documento relata o potencial larvicida do óleo essencial solo. Em nenhum momento, é relatado que o composto mencionado faz parte de uma formulação, combinando-se com outras substâncias e com uma dosagem otimizada.

[038] Como se depreende do estado da técnica, não existem formulações biolarvicidas e biofertilizantes semelhantes àquelas na presente invenção, as quais compreendem biossurfactantes obtidos por leveduras não-patogênicas em um processo sustentável utilizando uma biomassa vegetal como matéria-prima como componentes principais/ativos de formulações larvicidas para o combate do mosquito A. aegypti e pragas agrícolas e também como fertilizantes para plantas.

Breve descrição da invenção:

[039] A presente invenção consiste no desenvolvimento de formulações larvicidas e fertilizantes sustentáveis, cujos ingredientes ativos são a base de biossurfactantes e óleo essencial de laranja que, em uma dosagem otimizada, apresentam efeito sinérgico.

[040] As formulações são desenvolvidas, inicialmente, pela obtenção do biossurfactante, produzidos por fermentação a partir de leveduras e meio de cultivo a base de hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana-de-açúcar. Ao meio fermentado livre de células liofilizado, é adicionado o óleo essencial de laranja, obtido por extração em casca de laranja em extrator Soxhlet (extração à baixa pressão), utilizando diclorometano como solvente extrator.

[041] Após obtenção das formulações, estas são caracterizadas para determinação da composição química, e propriedades físico-químicas, além de testes biológicos da atividade larvicida em A. aegypti e testes biológicos para avaliação da fitotoxicidade e potencial fertilizante.

Breve descrição das figuras:

[042] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[043] Figura 1. pH das formulações larvicidas obtidas em diferentes concentrações.

[044] Figura 2. Condutividade das formulações larvicidas obtidas em difrentes concentrações.

[045] Figura 3. Tensão superficial das formulações larvicidas obtidas em diferentes concentrações.

[046] Figura 4. Espectros de FTIR das formulações larvicidas.

[047] Figura 5. Micrografias das larvas de A. aegypti, em que (A) sem a aplicação de extrato rico em biossurfactante - magnificação de 400X e (B) 12h após a aplicação do biossurfactante produzido pela levedura Scheffersomyces stiptis na concentração de 800 mg/L - magnificação de 400X e (C) 12h após a aplicação do biossurfactante produzido pela levedura SSS28 na concentração de 800 mg/L - magnificação de 1000X.

[048] Figura 6. Lagartas de C. includens mortas pelo biossurfactante presente nas formulações larvicidas, em que (A) são larvas que ingeriram dieta sem biossurfactante, não apresentando mortalidade e escurecimento abdominal e (B) são larvas que ingeriram dieta com 1000 mg/L de biossurfactante, apresentando mortalidade em até 8 dias após o tratamento e escurecimento abdominal.

[049] Figura 7. Micrografias das raízes das plântulas de alface (L.sattiva) expostas à formulação 2, em que (A) controle em água mineral e (B) 775 mg/L da formulação (aumento de 40X).

Descrição Detalhada da Invenção:

[050] A presente invenção se refere à formulações biolarvicidas e biofertilizantes compreendendo a associação de biossurfactantes e óleo de laranja como componentes principais/ativos.

[051] Mais particularmente, ditas formulações compreendem de 10 a 1500 mg/L de biossurfactantes e de 0,1 a 1 mg/L de óleo essencial de laranja.

[052] Mais preferivelmente, nas formulações com concentrações a partir de 240 mg/L de biossurfactante e 0,7 mg/L de óleo essencial de laranja, observou-se uma mortalidade de ao menos 50% das larvas no estágio 3 de desenvolvimento, representando uma diminuição da CL50 em aproximadamente em 15 vezes, evidenciando o sinergismo entre os biossurfactantes e o óleo essencial e o potencial promissor destas formulações.

[053] Ditas formulações atuam como biolarvicidas e inseticidas contra larvas de A. aegyptiresponsáveis por doenças negligenciadas selecionadas do grupo que compreende dengue, Zika e Chikungunya, e por larvas de pragas agrícolas selecionadas do grupo que compreende Chrysodeixis includens, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera e Myzus persicae. Adicionalmente, as formulações também favorecem a germinação e o desenvolvimento das sementes, atuando como fertilizante biológico. Ditas formulações revelaram ser atóxicas às sementes selecionadas preferivelmente de alface, porém, não somente se restringindo a esta, como, por exemplo, sementes de milho, soja, girassol, arroz, entre outras.

[054] Adicionalmente, ditas formulações da presente invenção compreendem uma composição base de 0,8 a 1% de biossurfactantes glicolipídicos, 2 a 11% de carboidratos totais, 0,068 a 0,551% de aminoácidos totais, 6 a 9% de proteínas totais, 0,09 a 1,5% de lipídeos totais, 0,131 a 0,212% de fenólicos totais, 57 a 60% de sais minerais e 2,432 a 15,921% de outros compostos tais como ácidos orgânicos, compostos voláteis como ésteres e aminas.

[055] Adicionalmente, ditas formulações compreendem um pH que varia de 7,1 a 7,9, uma tensão superficial mínima de 55,98 mN/m e solubilidade em solventes tais como água e óleo vegetal.

[056] Como será demonstrado mais adiante por meio dos testes realizados, as formulações mostram eficiência como formulações larvicidas obtidas no combate ao A. aegypti, eliminando as larvas em até 48 horas de aplicação.

[057] As concentrações letais médias (CL50) das formulações obtidas em concentrações que variam 3548 a 4265 mg/L mostraram-se elevadas, porém, com a adição do óleo essencial de casca de laranja, em uma concentração de 0,7 mg/L, diminuiu a CL50 para 240 mg/L, o que representa uma diminuição de aproximadamente em 15 vezes, evidenciando o sinergismo entre os biossurfactantes e o óleo essencial e o potencial promissor destas formulações.

[058] Já em larvas de Chrysodeixis includens, quando aplicadas concentrações que variam de 1 a 5 g/L (1000 a 5000 mg/L), observou-se a morte de 30% a 70% das larvas, após o tempo variando de 5 a 8 dias de aplicação.

[059] Quanto à fitotoxicidade, as formulações larvicidas obtidas mostram-se atóxicas às sementes, por exemplo, de alface (organismo modelo para testes de fitotoxicidade),com índices de germinação (IG) próximos de 90%, enquanto os índices de porcentagem de germinação normalizado (IGN) e os índices de porcentagem de alongamento radicular residual normalizado (IER) apresentaram valores próximos de zero, isto é, variando de -0,1 a +0,1, sendo considerados de baixa ou nula toxicidade. Somente para concentrações acima de 5000 mg/L, observaram-se efeitos de toxicidade crônica, que podem ocasionar prejuízos ao desenvolvimento das plantas. Ainda, nos testes somente com o óleo essencial de laranja, a mortalidade foi em torno de 30%. Sendo assim, pode-se afirmar que concentrações de larvicida aplicadas em concentrações abaixo de 5000 mg/L, exibiram efeitos benéficos com o efeito larvicida maior que 50%, indicando também seu potencial biofertilizante.

Exemplos, Testes e Resultados:

[060] A seguir são apresentados exemplos, testes e resultados de desenvolvimento e aplicação da presente invenção, não se limitando, entretanto, a estes.

[061] A presente invenção se refere à formulações biolarvicidas e biofertilizantes compreendendo a associação de biossurfactantes e óleo de laranja como componentes principais/ativos.

[062] Mais particularmente, os referidos biossurfactantes são produzidos por leveduras em meio de cultivo suplementado com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Especificamente, os biossurfactantes foram produzidos a partir de fermentação submersa pelas leveduras Scheffersomyces stipitis NRRL-Y7124 e Cutaneotrichosporon mucoides UFMG-CM-Y6149, em meios de cultura propostos por KITAMOTO (1990) e ZHOU e KOSARIC (1990), cuja principal fonte de carbono é a xilose presente no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar (Tabela 3) . Os processos fermentativos ocorreram em meio KITAMOTO (1990) com modificações (g/L: 40 xilose, 2 fosfato monobásico de potássio, 11 nitrato de amônio, 2 sulfato de magnésio heptahidratado e 40 g/L de xilose oriunda do hidrolisado hemicelulósico destoxificado de bagaço de cana- de-açúcar) e em meio proposto por ZHOU e KOSARIC (1995) com modificações (g/L: 1 dihidrogenofosfato de potássio, 5 sulfato de magnésio heptahidratado, 0,1 cloreto férrico, 0,1 cloreto de sódio, 4 extrato de levedura, 40 de xilose oriunda do hidrolisado hemicelulósico destoxificado) e 10 % (V/V) de óleo de soja. As fermentações ocorreram em biorreator de bancada e o processo ocorreu em modo descontínuo a 200 rpm, 0,1 vvm por 120 h.

[063] Após as fermentações, as células foram separadas dos sobrenadantes por centrifugação e liofilizadas. Tabela 3. Composição das formulações larvicidas

[064] Já o óleo essencial, foi obtido por extração de casca de laranja doce, realizada por Soxhlet (método contínuo) utilizando o diclorometano como solvente. Em um primeiro momento, as cascas de laranja foram cortadas em pedaços menores e secas em estufa com circulação de ar, em uma temperatura de 40°C por 48 h, até adquirir um teor de umidade de aproximadamente 12 % (m/V). Em seguida, a casca foi moída em um moinho de facas para reduzir ainda mais a sua granulometria e tornar o processo de extração ainda mais eficiente. Após isso, foram confeccionados cartuchos de papel de filtro com 5 g de massa seca e inseridos num extrator Soxhlet (extração a baixa pressão). Para a extração, utilizou-se diclorometano como solvente extrator devido ao seu índice de polaridade 3,1, considerado intermediário, favorecendo uma extração eficiente de compostos polares e apolares presentes na casca de laranja. O processo de extração foi realizado a 40°C durante 12 h. Após a extração, o extrato foi rota-evaporado a 4°C para retirar o excesso de solvente e determinou-se o rendimento global do processo.

[065] A composição química do óleo essencial da casca da laranja consiste majoritariamente de D-limoneno (90%), ácido hexadecanoico (ácido palmítico), ácido oleico, butil benzenesulfonamida, N-(2-ciano-etil)-benzenesulfonamida e β-sitosterol. Em menores concentrações, são encontrados no óleo essencial: m-xileno, p-xileno, decano, α-aromadendreno, esqualeno, campesterol, sabineno, α-pineno, β-mirceno, linalol, α-sinensal, Z,E-α-farneseno, aromadendreno, L- limoneno (BENELLI, 2010).

[066] Após as fermentações, os extratos produzidos pelas leveduras foram secos por liofilização e utilizados nas formulações larvicidas, conforme as composições descritas na Tabela 3. As formulações foram liofilizadas e mantidas em frascos plásticos e temperatura ambiente até o momento do uso.

[067] Nas formulações com óleo essencial, foram adicionados 40 μL ou 0,02 g do óleo essencial encapsulado em matrizes sólidas diversas em 25 mL de sobrenadante. O processo de secagem pode ser realizado nas condições descritas ou nas variações desta, por exemplo, utilizando “spray dryer” com temperaturas e vazões variadas.

[068] Após obtidas as formulações, procedeu-se com a caracterização físico-química e com os testes de atividade larvicida contra Aedes aegypti.

[069] Análises de pH e condutividade foram realizadas nas formulações obtidas. Estes são parâmetros físico- químicos de extrema importância para o desenvolvimento de formulações biopesticidas, uma vez que podem interferir na estabilidade dos ingredientes ativos dos produtos, insolubilizando-os, degradando-os e inativando algumas de suas propriedades. Conforme mostrado na Figura 1, os valores de pH das formulações mantiveram-se próximos à neutralidade (de 7,10 a 7,93). Já a condutividade das presentes formulações, como pode ser observada na Figura 2, são proporcionais às concentrações, variando de 0,0002 a 0,004 S/cm, com exceção da formulação 4, em que a condutividade permaneceu praticamente constante nas diversas concentrações testadas, em torno de 0,0002 S/cm. A condutividade elétrica de um biopesticida está relacionada à presença de íons componentes, sua concentração e valência.

[070] Já a tensão superficial das formulações deve ter valores menores que a da água pura, que é de 72 mN/m. Essa característica é desejável, especialmente em biopesticidas, pois confere à calda de aplicação maior poder de molhabilidade, espalhamento e, consequentemente, melhor recobrimento das superfícies (ALVES; FARIAS, 2010). Assim como a condutividade, a tensão superficial influencia diretamente a forma da gotícula da formulação ao entrar em contato com uma superfície. Na presente invenção, apenas a formulação 2, nas concentrações de 2500 e 5000 mg/L, apresentou valores de tensão superficial menores (65,31 e 55,98 mN/m) que o da água. As demais formulações (1, 3 e 4) apresentaram valores de tensão superficial similares aos da água, como pode ser observado na Figura 3. Destaca-se que, além de adjuvante, os biossurfactantes presentes nas formulações agiram também como ingredientes ativos, uma vez que causam efeitos desestruturantes nas cutículas cerosas de larvas de A. aegypti, matando-as (FRANCO MARCELINO et al., 2017).

[071] A Tabela 4 mostra a solubilidade das formulações biopesticidas em diferentes solventes, e revela que todas as formulações obtidas são solúveis em água e em óleo vegetal, dissolvendo-se completamente, enquanto nos outros solventes de diferentes polaridades apresentam somente uma fração solúvel, ou seja, não se dissolvem totalmente. Estes dados são importantes do ponto de vista de veiculação das formulações, pois, caso se escolha aplicá-las na forma líquida (suspensões concentradas aquosas ou oleosas, miscíveis em óleos, pós molháveis e grânulos dispersíveis em água ou em óleo) por pulverização, deve-se utilizar o solvente mais barato, que torna a mistura mais homogênea, causa baixo impacto ambiental e à saúde dos organismos vivos (ALVES; FARIA, 2010). Tabela 4. Solubilidade das formulações larvicidas obtidas em diferentes solvents *S: solúvel, **PS: parcialmente solúvel

[072] A Figura 4 apresenta a análise de FTIR, e pode ser observado que os espectros apresentam similaridade, com bandas/picos de deformação axial de médias e elevadas intensidades de 2700 a 3600 cm-1, geralmente associadas às ligações do tipo C-H, O-H e N-H de álcoois, ácidos carboxílicos, ésteres, aminas, amidas e núcleos aromáticos. Entre 1900 e 2300 cm-1, observam-se bandas/picos de deformações axiais devidos às duplas ligações de C=O (carbonila), comum em ésteres, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, anidridos, amidas e deformações angulares de N-H e NH2, de aminas e amidas. Sendo assim, pode-se afirmar que os espectros de infravermelho fornecem bandas/picos comuns aos aminoácidos, proteínas, carboidratos, compostos fenólicos e biossurfactantes presentes nas formulações. Além disso, as bandas/picos das formulações obtidas mostram que, durante a fermentação e a preparação dos larvicidas, não foram obtidos compostos com potencial tóxico, como os que contêm grupos P-O, P=S e S=O, comuns em produtos sintéticos como o Temephós.

[073] Na Tabela 5, encontram-se as CL50 de algumas formulações larvicidas já testadas e as CL50 em relação às quantidades de biossurfactantes presentes nas formulações larvicidas.

[074] De acordo com o procedimento adotado por Silva (2015) adaptado, foi preparada uma solução-mãe de 10000 mg/L através da dissolução das formulações em água destilada. A partir da solução mãe, foram preparadas soluções testes nas concentrações 5000, 2500, 1125, 725, 500, 250 e 125 mg/L. Além das soluções puras foram testadas as combinações com óleo essencial extraído de casca de laranja diluído em acetato de etila numa proporção 1:1, sendo a concentração de óleo essencial usada nos experimentos de aproximadamente 7 mg/L. Para cada concentração foram utilizadas 10 larvas de A. aegypti no 3° estágio de desenvolvimento e 20 mL de cada solução teste em frascos plásticos de 50 mL. Durante os testes, os frascos contendo as larvas foram mantidos em uma câmara climatizada a 27 ± 2 °C, com um fotoperíodo de 12 h. A cada 24 h foram realizadas contagens dos indivíduos ainda vivos. Foram feitos controles com 0,7 g/L de óleo essencial de casca de laranja com 40 μL de acetato de etila, e os cálculos das concentrações letais (CL50) foram realizados de acordo com o método de COLEGATE e MOLYNEUX, (1993). Os dados obtidos são mostrados na Tabela 5. Ressalta-se que a concentração de óleo essencial de casca de laranja empregada nos testes foi em torno de 0,7 mg/L, valor aproximadamente 5 vezes menor do que os utilizados por FURTADO et al. (2005) em testes de atividade larvicida frente aos vários óleos essenciais. Tabela 5. CL50 das formulações larvicidas e em relação aos biossurfactantes presentes em cada formulação quando aplicadas em larvas de A. aegypti no 3° estágio de desenvolvimento.

[075] As concentrações dos biossurfactantes nas formulações larvicidas se encontram em cerca de 1% (m/m).

[076] Como verificado a partir da Tabela 5, as concentrações letais médias (CL50) das formulações obtidas apresentaram concentrações que variam 3548 a 4265 mg/L, sendo bastante elevadas. No entanto, com a adição do óleo essencial de casca de laranja, em uma concentração de 0,7 mg/L, a CL50 diminuiu para 240 mg/L, representando uma diminuição de cerca de 15 vezes, evidenciando o sinergismo entre os biossurfactantes e o óleo essencial.

[077] Além dos efeitos umectante, espalhante, aderente, emulsificante, dispersante e detergente, as formulações da presente invenção compreendem biossurfactantes, os quais agem aumentando a penetração cuticular, por serem solubilizantes de compostos apolares (hidrocarbonetos e lipídeos) e também por desnaturarem e precipitarem proteínas, causando a inativação das enzimas importantes para as larvas.

[078] Ainda, a ação larvicida dos biossurfactantes ocorre devido a sua influência no sistema respiratório das larvas. Os biossurfactantes interagem com o sifão respiratório, uma região altamente hidrofóbica com umidade controlada, permitindo uma exposição maior ao meio aquoso, de modo que a água flui pela cavidade espiracular das larvas. Além disso, as bolsas de ar traqueais, que apresentam uma gravidade específica muito próxima da água, facilitando a subida até a superfície para respiração, são influenciadas pela presença das substâncias surfactantes, alterando e dificultando a hidrostática da larva, levando a um exacerbado gasto energético e morte por afogamento. Após ficarem 12 h em contato com o biossurfactante purificado nas concentrações de 1000 e 800 mg/L, as larvas começaram a sofrer uma desestruturação, sendo que tal fato ainda não tinha sido relatado na literatura (Figura 5). Os corpos das larvas apresentaram transparência e pareciam mais finos, desfazendo-se completamente após 48 h. Os mesmos resultados foram notados nas formulações 1 e 2 e na formulação 2 com adição de óleo essencial, nas quais a mortalidade nas concentrações de 2500 a 5000 mg/L variaram de 70 a 100%. Além de análise contra larvas do A. aegypti, foi testada a ação dos biossurfactantes presentes nas formulações como inseticidas contra lagartas do C. includens (Figura 6).

[079] A fitotoxicidade das formulações larvicidas obtidas e das combinações com óleo essencial de casca de laranja foram determinadas de acordo com TIQUIA et al. (1996). Utilizaram-se sementes de alface (L. sativa L.) e as formulações tiveram suas concentrações ajustadas para 5000, 2500, 1125, 725, 500, 250 e 125 mg/L e combinadas com óleo essencial de casca de laranja. As sementes foram posteriormente incubadas em estufa com circulação de ar a 26 °C. A determinação da fitotoxicidade foi avaliada por meio do índice de germinação (IG) após 48 h de incubação, do comprimento radicular (CR), do comprimento cauloide (CC), do índice de porcentagem de germinação normalizado (IGN) e do índice de porcentagem de alongamento radical residual normalizado (IER) após 120 h de incubação, conforme descrito na Tabela 6. Além desses parâmetros, também foi realizada análise morfológica das plantas de alface submetidas à formulação 2, conforme mostrado Figura 7. Tabela 6. Efeito das formulações larvicidas em diferentes concentrações sobre a TG, CR, CC, IGN e IER em sementes e plantas de alface *TG: Taxa de germinação; CR: comprimento radícula; CC: comprimento cauloide; IGN: índice de porcentagem de germinação residual normalizado; IER: índice de porcentagem de comprimento radicular normalizado. Linhas com médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Turkey a 5% de probabilidade de erro.

[080] A Tabela 7 mostra os resultados de TG, CR, CC, IGN e IER obtidos nos ensaios de fitotoxicidade das formulações testadas. Pelos dados de TG e CC, não houve interferência significativa na germinação das sementes de alface pelas diferentes concentrações das formulações 1 e 2, sendo que, com valores de TG superiores a 80 %, as formulações podem ser consideradas atóxicas. Já os CR encontrados para ambas as formulações mostram que somente na concentração de 5000 mg/L, há uma diferença significativa, podendo ser um indicativo de toxicidade. Os valores encontrados para o IGN das formulações 1 e 2 mostraram-se muito baixos ou próximos de zero, podendo ser um indicativo de baixa ou ausência de toxicidade. Ao analisar os IER para a formulação 1, observou- se que as concentrações entre 125 e 2500 mg/L apresentaram valores que demonstraram toxicidade baixa, moderada ou hormese/hormesis (um efeito estimulante), e, somente em 5000 mg/L pode ser classificada como tóxica. Já a formulação 2 apresentou, para todas as concentrações testadas, valores de IER que permitem classificá-la como uma formulação com baixa toxicidade ou hormese.

[081] Além dos parâmetros de fitotoxicidade, também foi realizada uma análise morfológica das plantas de alface submetidas à formulação 2. Em algumas concentrações testadas, observou-se o favorecimento do desenvolvimento do sistema radicular pelo aparecimento de um número maior de raízes secundárias que atuam na absorção de águas e íons. Na Figura 7 fica evidente o efeito da formulação 2 em uma concentração de 775 mg/L na multiplicação das raízes secundárias (Figura 7B) quando comparadas ao controle com água destilada (Figura 7A). O favorecimento do desenvolvimento das raízes secundárias nas plantas indica que as formulações aqui apresentadas podem também atuar como biofertilizantes quando entram em contato com o solo e as plantas. Isto ocorre devido à constituição bioquímica das formulações, com a presença de compostos ricos em carboidratos, sais minerais, aminoácidos e proteínas.

[082] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

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Claims (17)

1. Formulações, caracterizadaspor compreenderem de 10 a 1500 mg/L de biossurfactantes e de 0,1 a 1 mg/L de óleo essencial de laranja.

2. Formulações, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por preferivelmente compreenderem concentrações de 240 mg/L de biossurfactante e de 0,7 mg/L de óleo essencial de laranja.

3. Formulações, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadaspelo biossurfactante ser obtido pela fermentação de leveduras e meio de cultivo a base de hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana-de-açúcar.

4. Formulações, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadaspelas leveduras serem Scheffersomyces stipitis NRRL-Y7124 e Cutaneotrichosporon mucoides UFMG-CM- Y6149.

5. Formulações, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadaspelas referidas leveduras serem secas e liofilizadas.

6. Formulações, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadaspelo óleo essencial de laranja ser obtido por extração em casca de laranja em extrator Soxhlet com diclorometano.

7. Formulações, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadaspor compreenderem uma composição base de 0,8 a 1% de biossurfactantes glicolipídicos, 2 a 11% de carboidratos totais, 0,068 a 0,551% de aminoácidos totais, 6 a 9% de proteínas totais, 0,09 a 1,5% de lipídeos totais, 0,131 a 0,212% de fenólicos totais, 57 a 60% de sais minerais e 2,432 a 15,921% de outros compostos selecionados de ácidos orgânicos, compostos voláteis como ésteres e aminas.

8. Formulações, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas por compreenderem um pH que varia de 7,1 a 7,9, uma tensão superficial mínima de 55,98 mN/m e solubilidade em água e óleo vegetal.

9. Formulações, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas por diminuírem a CL50 em 15 vezes.

10. Formulações, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas por serem atóxicas às sementes selecionadas do grupo que compreende alface, milho, soja, girassol e arroz.

11. Formulações, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadas por apresentarem atividades biolarvicida e biofertilizante.

12. Formulações, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadas pelas formulações biolarvicidas apresentarem atividade inseticida contra larvas do mosquito A. aegypti e contra larvas de pragas agrícolas selecionadas do grupo que compreende Chrysodeixis includens, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera e Myzus persicae.

13. Formulações, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadas por 30% a 70% das larvas de Chrysodeixis includens serem eliminadas, em um tempo que varia de 5 a 8 dias, em uma concentração que varia de 1 a 5 g/L (1000 a 5000 g/L).

14. Formulações, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadas pelas larvas do mosquito A. aegypti serem eliminadas em 48 horas.

15. Formulações, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadas por combaterem doenças selecionadas do grupo que compreende dengue, Zika e Chikungunya.

16. Formulações, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizadas por compreenderem a mortalidade de pelo menos 50% das larvas no estágio 3 de desenvolvimento.

17. Formulações, de acordo com reivindicação 11, caracterizadas por apresentarem atividade biofertilizante, tendo índices de germinação (IG) de 90% e índices de porcentagem de germinação normalizado (IGN) e índices de porcentagem de alongamento radicular residual normalizado (IER) com valores variando de -0,1 a +0,1.