BR102022001614A2 - Composto de nanoquitosana, óleo vegetal e/ou fosfatos de cálcio e processo de obtenção de composto de nanoquitosana, óleo vegetal e/ou fosfatos de cálcio - Google Patents

Abstract

Pertencente ao setor tecnológico da área biotecnológica, cosmética e biomédica e se refere, mais especificamente, a um composto de nanoquitosana e óleo vegetal e/ou fosfatos de cálcio com capacidade de utilização em tratamentos diversos como, por exemplo, tratamentos cutâneos, e o respectivo processo de obtenção dos ditos compostos, a partir de processo que obtém a nanopartícula de quitosana, adicionando-se posteriormente óleo vegetal ou fosfatos de cálcio.

Description

COMPOSTO DE NANOQUITOSANA, ÓLEO VEGETAL E/OU FOSFATOS DE CÁLCIO E PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTO DE NANOQUITOSANA, ÓLEO VEGETAL E/OU FOSFATOS DE CÁLCIO Setor tecnológico da invenção

[01] De uma maneira geral a presente invenção pertence ao setor tecnológico das áreas biotecnológica, cosmética e biomédica e se refere, mais especificamente, a um composto de nanoquitosana e óleo vegetal ou nanoquitosana e fosfatos de cálcio com capacidade de utilização em tratamentos diversos como, por exemplo, tratamentos cutâneos, e o respectivo processo de obtenção do dito composto.

Estado da técnica conhecido

[02] A pele é o maior órgão do corpo humano, tendo em vista que recobre toda a extensão do corpo e, sendo assim, dentre todos os nossos órgãos, a pele ocupa uma posição única, estando em contato ao mesmo tempo com o meio interno e externo. Múltiplas são as funções da pele, dentre elas, a mais importante está relacionada à formação de uma barreira de proteção às agressões externas. Outra importante função, a de revestimento, está diretamente relacionada às propriedades mecânicas da pele (elasticidade e plasticidade) e envolve vários tipos de tecidos e líquidos, pois mantém a forma do corpo, permitindo movimento sem que ocorra ruptura dos tecidos (ABDELAKDER H. et al., 2018, JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2013). Tendo isso em vista, é visível que devido à sua posição, a pele é um dos órgãos mais suscetíveis a lesões.

[03] A lesão que se caracteriza como a interrupção na continuidade da pele é conhecida como ferida, podendo ser causada por qualquer tipo de trauma físico, químico, mecânico ou provocado por uma afecção clínica, que, uma vez desencadeada, ativa as defesas orgânicas para o contra-ataque. Nesse contexto, pode-se definir que geralmente uma lesão é acompanhada do rompimento da estrutura do tecido epitelial e das funções normais do tegumento e seu processo de cicatrização, ou seja, eventos que iniciam com o trauma e terminam com o fechamento completo e organizado da ferida.

[04] O reparo tecidual, para a maioria das lesões, ocorre pela formação de um tecido fibroso, produzido principalmente por células como os fibroblastos, denominado cicatriz, processo conhecido como cicatrização. A cicatrização de feridas tem como principal objetivo cessar a hemorragia e reconstruir a barreira estrutural e funcional da pele, prevenindo o ressecamento, a invasão de microrganismos no corpo e protegendo contra diversos estímulos ambientais. Para que ocorra a regeneração da pele, essa deve apresentar uma organização tecidual com a substituição das células mortas ou lesadas por novas células, idênticas as originais, restaurando sua integridade e funcionalidade total. Esse processo pode ocorrer naturalmente ou ainda ser potencializado por fármacos e/ou compostos que tenham capacidade regenerativa.

[05] Nesse contexto, o desenvolvimento de tecnologias e soluções alternativas para finalidades terapêuticas, especialmente os polímeros, têm sido empregados como biomateriais ou biocompostos para várias finalidades, como, por exemplo, cicatrização de feridas, enxertos ósseos, desenvolvimento de lentes de contato, desenvolvimento de fármacos para emagrecimento, dentre outras aplicações. Pode-se dizer que o uso de polímeros em tratamentos terapêuticos deve cada vez mais expandir-se, tendo em vista as propriedades físico-químicas e a versatilidade estrutural desses materiais.

[06] Assim sendo, nessa tendência, um polímero que tem sido altamente pesquisado para atender a demandas terapêuticas é a quitosana, um polissacarídeo de cadeia linear, catiônico com a protonação (adição de prótons) do grupo amino (NH3 + ). Esse tipo de material destaca-se devido a sua característica de apresentar grupos aminos livres e, sendo assim, a quitosana possui a capacidade de reagir com várias moléculas, tornando o biopolímero com maior disponibilidade de grupos reagentes.

[07] A quitosana é obtida pelo processo de desacetilação da quitina, sendo a quitina um polissacarídeo muito abundante na natureza, é encontrada no exoesqueleto de diversos invertebrados, tais como crustáceos, insetos e moluscos, e na parede celular de algumas algas, fungos e leveduras. Além disso, pode ser usada como agente gelificante, excipiente para dar consistência a cremes, matrizes em adesivos, curativos tipo esponja, hidrogéis, membranas e adesivos em sistemas de liberação transdérmica (NAIR, R.S.,2019, Azuma et al. 2015).

[08] Neste contexto, é válido mencionar que em diversas regiões do Brasil pode ser observada a utilização de plantas e ervas na medicina popular para os mais diversos fins, sendo que muitas de suas espécies vegetais são largamente usadas para cicatrização de feridas. A despeito do avanço científico, ressurgiu o interesse por pesquisas na utilização de plantas medicinais para a cicatrização de feridas, visto ser um tratamento simples e de baixo custo, e muitas plantas têm demonstrado um papel importante nesse processo, estando inseridas as diversas espécies de óleos vegetais, tanto essenciais como não essenciais.

[09] Assim sendo, a espécie Mauritia flexuosa L., conhecida popularmente como buriti, será utilizada como exemplo de aplicação, sem se limitar a esse óleo somente, consiste em uma alternativa utilizada na área cosmética, uma vez que o óleo extraído da polpa dos frutos de buriti é rico em carotenoides, ácidos graxos e tocoferol, o que sugere boa perspectiva na utilização desse produto como alternativa terapêutica e cosmética. Nesse contexto, a utilização do óleo de buriti apresenta, geralmente, a função de lubrificar e regenerar a barreira hidrolipídica da pele frequentemente submetida a lesões.

[010] Além disso, é importante mencionar que o óleo de buriti pode ser utilizado como filtro solar devido a sua capacidade de absorver radiações no espectro ultravioleta, tendo em vista que se trata de um potente energético, rico em pró – vitamina A e devido ao seu alto teor de β – caroteno, pode apresentar efeito antioxidante e outros efeitos bioativos. Ademais, estudos demonstram que o uso desse óleo em queimadura da pele, provoca alívio imediato e auxilia no processo de cicatrização. Por fim, de acordo com Zanatta et al. (2010) o óleo na forma de creme também apresenta capacidade de aceleração do processo de cicatrização (SALMA M.et. al. 2017, PESSOA, 2017; SILVA, R. F. J. 2017).

[011] Levando isso em consideração, é visível que atualmente muitos estudos estão voltados para a busca de substâncias com maior efetividade e menor custo de produção/aquisição, que facilitem e acelerem o restabelecimento estrutural e funcional da pele atingida por feridas. Conforme mencionado, é sabido que substâncias obtidas a partir da quitosana e seus derivados, assim como o óleo de buriti, entre outros, apresentam bons resultados no processo de cicatrização cutânea. Dentre as características dessas substâncias que beneficiam esse processo são citados os seus efeitos antimicrobianos, a biocompatibilidade da quitosana e de seus derivados, os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios do óleo de buriti.

[012] Tendo isso em vista, tem-se algumas alternativas que representam o atual estado da técnica e que são descritas em documentos de patentes. Um exemplo pode ser observado na patente de invenção nº PI 1104669-4 A2 – “NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS DE QUITOSANA PARA LIBERAÇÃO CONTROLADA DE EXTRATOS VEGETAIS” a qual refere-se à nanopartículas poliméricas capazes de veicular extratos vegetais e suas aplicações; as formulações apresentadas podem ser produzidas a partir do polímero natural quitosana e de seus derivados, podendo ser utilizadas para veiculação tópica (pele e mucosas) controlada de extratos vegetais com atividade terapêutica. Contudo, como já descrito, está invenção aborda a incorporação de extratos complexos em formulações de liberação controlada, sem que haja perda de atividade.

[013] Ademais, cita-se o documento de patente de n° BR1020180053906 – “COMPLEXO DE NANOQUITOSANA MODIFICADA E PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPLEXO DE NANOQUITOSANA MODIFICADA”, desenvolvida por um dos inventores do presente pedido de patente. A invenção proposta nesse documento prevê o desenvolvimento de um complexo regenerativo composto de nanoquitosana modificada; onde o complexo de nanoquitosana modificada em questão é processado com nano cerâmicas de fosfatos de cálcio, sendo então formado por meio de suspensão. No entanto, o objetivo do presente invento consiste na obtenção de um complexo nano estruturado de quitosana/micro e/ou nano cerâmicas para aplicação em diversas áreas como na área da saúde, farmácia e biomedicina. Este novo projeto de pedido de patente visa a utilização de óleos essenciais diversos e /ou fosfatos de cálcio a fim de criar um biocomposto para atender a área de medicina regenerativa, farmácia, odontologia e medicina. A patente referida no paragrafo acima somente produz a nanoquitosana, não contemplando o encapsulamento dos óleos essenciais e/ou fosfatos de cálcio.

[014] Com isso, a partir das soluções atualmente utilizadas, descritas acima no estado da técnica, é visível a existência de uma lacuna na criação de um composto que forneça efeito cicatrizante da pele como alternativa disponível para tratamentos terapêuticos. Além disso, cabe destacar que não se conhece atualmente no mercado uma composição para tratamento terapêutico da pele que compreenda quantidades significativas de nanoquitosana e óleo vegetal, especialmente o óleo de buriti. Ademais, também pode-se destacar que não se conhece também um processo de obtenção de composto de nanoquitosana e óleo vegetal para a produção de um fármaco disponível para tratamentos diversos, inclusive para o tratamento da pele. Assim sendo, entende-se que é necessário o desenvolvimento de uma metodologia para obtenção do composto nanoquitosana e óleo vegetal, bem como do respectivo produto com potencial para uso na cicatrização de feridas, como o óleo de buriti, já citado.

Novidades e objetivos da invenção

[015] Com o objetivo de sanar as falhas do estado atual da técnica destacadas acima e fornecer uma alternativa aos tratamentos terapêuticos da pele, a presente patente de invenção visa propor uma solução em processo e produto para o setor tecnológico referente às áreas biotecnológica, cosmética e biomédica, a partir do desenvolvimento de um biocomposto obtido da nanoquitosana e óleo vegetal - NQ/OV, por exemplo, obtido da nanoquitosana e óleo de buriti – NQ/B.

[016] Como mencionado anteriormente, a quitosana é um biopolímero obtido da quitina, um dos polímeros naturais mais abundantes na natureza. Sabe-se que a quitina é um polímero constituído por uma sequência linear de açúcares monoméricos β-(1-4) 2-acetamido-2-desoxi-D-glicose (N-acetilglicosamina) possuindo, assim, estrutura semelhante à das fibras de celulose. A partir da quitina, prepara-se a quitosana um polímero mais reativo. Uma vez que a quitina é extraída, ela é desacetilada até quitosana por um processo de hidrólise alcalina em alta temperatura (PIGHINELLI, et al., 2012).

[017] Sabe-se que a quitosana pode ser utilizada para um número expressivo de aplicações, já que existe a possibilidade de ser quimicamente modificada, ser processada em diferentes formas (soluções, esponjas, nano e micro fibras, fibras multifilamentos, filmes, membranas, gel, entre outros) e ainda pelo fato de ser um polieletrólito em meio ácido.

[018] Pode-se afirmar que as propriedades da quitosana são afetadas pelas condições de processamento do material que controlam a quantidade resultante de desacetilação, que é o processo chave para a determinação das suas características físicas, químicas e biológicas. A desacetilação é determinada pela quantidade de grupos amino livres na cadeia polimérica, e este confere uma carga positiva a quitosana. A funcionalidade da quitosana está assim, diretamente ligada aos grupos amino livres e a hidroxila. A carga positiva permite muitas interações eletrostáticas da quitosana com moléculas carregadas negativamente (PIGHINELLI, et al. 2012). Ademais, no pH biológico a quitosana apresenta-se como um policátion. Em meio ácido os grupos amino da quitosana captam íons hidrogênio do meio, resultando em uma carga global positiva no polímero. Esta característica permite a sua interação com moléculas carregadas negativamente tais como: gorduras, tecidos animais ou vegetais, membrana celular, entre outras formas.

[019] Por fim, cabe destacar ainda que a quitosana é polímero atóxico, biodegradável, biocompatível e produzido por fontes naturais renováveis e, nesse caso, é totalmente disponível para utilização em tratamentos de enfermidades da pele.

[020] Assim sendo, para que o composto atinja os objetivos propostos e, consequentemente, seja uma alternativa viável para aplicação na área cosmética e terapêutica, entende-se que as partículas de quitosana utilizadas devem ser nanopartículas poliméricas, com o intuito de oferecer melhores propriedades físico-químicas e biofarmacêuticas. Sendo que nanopartículas poliméricas (NPs) podem ser definidas como sistemas coloidais que variam entre 1 a 10000 nanômetros que geralmente promovem liberação controlada e prolongada do fármaco veiculado e obtido pelo método de agregação da glucosamina proveniente da quitosana caracterizando um polímero mais amorfo e menos estrutural.

[021] Algumas vantagens do uso de NPs nas áreas farmacêutica e cosmética são: maior estabilidade do fármaco no sangue, menor toxicidade, maior adesividade, resistência a dissolução em pH ácido e alcalino, suscetível a degradação enzimática e hidrolítica, características não-trombogênicas, propicia a formação de colágeno natural, não-imunogênicas, não-inflamatórias, melhores características de solubilidade aquosa ou lipofílica e melhoria da biodisponibilidade do fármaco. Sendo assim, são compatíveis com a maioria das vias de administração, podendo resolver problemas ligados à adesão a terapia. Nesse contexto, as nanopartículas de quitosana e suas aplicações, vêm recebendo muita atenção de pesquisadores nos últimos anos devido a esta mudança estrutural do polímero caracterizando uma estrutura amorfa do polímero, isso se deve às suas propriedades vantajosas, tais como, biocompatibilidade e biodegradabilidade e, além disso o fato de não ser tóxica, ser hemostática, bacteriostática, fungistática, anticancerígena, anticolesterolêmica, antibacteriana, seletiva e capaz de adsorver metais de alta resistência mecânica. Por fim, por apresentarem baixo custo de produção e serem sensíveis a modificações químicas, esse tipo de material tem inúmeras vantagens sobre outros substratos e fármacos.

[022] Ademais, com o intuito de potencializar as características cicatrizantes do composto proposto na presente invenção, é prevista a adição de quantidades terapêuticas de óleo vegetal, no presente exemplo, do óleo de buriti. Pode-se constatar que o óleo do buriti é composto de tocoferóis, carotenoides e em maiores quantidades de ácidos graxos de cadeia longa, sendo 18% de ácido palmítico e 75% de ácidos insaturados. Sendo que o teor de carotenoides é uma importante característica do óleo de buriti, que o torna uma das maiores fontes de provitamina A já encontradas na biodiversidade brasileira. Além disso, pesquisas mostram que esses ácidos graxos têm ações antitrombóticas e anti-inflamatórias, atuando como precursores de prostaglandinas e leucotrienos.

[023] Cabe, ainda, destacar que o óleo do buriti atua como potencializador da proteção solar e como fonte de carotenoides (previne doenças cardiovasculares), provitamina A e vitamina E (tocoferóis), antioxidantes naturais em produtos cosméticos, capilares e farmacêuticos. Além disso, uma importante aplicação do óleo de buriti está relacionada ao seu poder antioxidante, em função da concentração de carotenoides, polifenóis totais e ácido ascórbico. Os tocoferóis, genericamente chamados de vitamina E, são componentes com forte ação antioxidante presentes no óleo. Por fim, baseado na alta concentração de ácido oleico e pela presença de carotenoides e vitamina E na forma de α-tocoferol, pesquisas demonstram que esse óleo vegetal ajuda no processo de reparação tecidual pela ligação aos radicais livres produzidos em feridas da pele.

[024] Nesse contexto, a presente invenção visa propor uma alternativa com capacidade terapêutica para ser utilizada no tratamento e cicatrização de feridas na pele. De forma mais específica, a solução proposta no presente relatório descritivo prevê um processo de obtenção de composto que compreende quantidades suficientes de nanoquitosana e óleo vegetal (buriti, por exemplo) e respectivo produto para ser aplicado na cicatrização de feridas da pele.

[025] A partir da obtenção de referido composto, é realizada a identificação, utilizando a espectroscopia de absorção no infravermelho – com Transformada de Fourier - FTIR – ATR, da presença de grupos funcionais característicos da nanoquitosana e do óleo de buriti no complexo formado pela junção dos mesmos; identificação através de Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV da nanoquitosana e do óleo de buriti no composto formado pela junção dessas substâncias. Comprovação do tamanho da partícula através de análises dos compostos nanoquitosana e óleo de buriti e analise de caracterização e composição do óleo de buriti por cromatografia coluna gel (GPC).

[026] Assim sendo, o novo produto obtido através de processo também inovador, devido às propriedades químicas e atividade antibacteriana apresentam resultados favoráveis para serem aplicados na área da medicina e cosmética. Ou seja, o emprego dessa composição específica é promissor na área da saúde relacionada, mais especificamente, ao tratamento de problemas de feridas de pele, na atividade de medicina regenerativa e engenharia de tecidos, da mesma forma que a utilização de outros óleos vegetais amplia o espectro de utilização para a área cosmética.

Descrição dos desenhos anexos

[027] A fim de que a presente invenção seja plenamente compreendida e levada à prática por qualquer técnico deste setor tecnológico, a mesma será descrita de forma clara, concisa e suficiente, tendo como base os desenhos anexos, que a ilustram e subsidiam abaixo listados:

[028] Figura 1: representa o diagrama de blocos referente as etapas da produção de filmes de acetato de quitosana.

[029] Figura 2: representa o diagrama de blocos referente ao método de obtenção da quitosana nanocristalina, com adição do óleo de buriti, para formação do composto nanoquitosana e óleo de buriti.

[030] Figura 3: representa o composto nanoquitosana e óleo de buriti - NQ/B com concentração 1:1 na forma líquida para gel.

[031] Figura 4: que representa o composto nanoquitosana e óleo de buriti - NQ/B com concentração 1:1 na forma de filme.

[032] Figura 5: representa o espectro no infravermelho da quitosana nanocristalina - QNC.

[033] Figura 6: representa a espectroscopia de infravermelho do óleo de buriti.

[034] Figura 7: representa a espectroscopia do composto nanoquitosana e óleo de buriti.

[035] Figura 8: representa a microscopia eletrônica de varredura – MEV da nanoquitosana.

[036] Figura 9: representa a microscopia eletrônica de varredura – MEV da nanoquitosana e óleo de buriti - NQ/B ampliadas 500X e 1000X.

Descrição detalhada da invenção

[037] A presente invenção visa propor uma alternativa inovadora a ser destinada aos tratamentos das áreas biomédica e cosmética. É proposto um processo de obtenção de composto que compreende quitosana e óleo vegetal, a partir da obtenção do sal de quitosana e da nanoquitosana. Nesse contexto, o composto obtido tem características que visa fornecer um biomaterial para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos e cosmética através de um processo de obtenção de baixo custo e com relativa facilidade de obtenção.

[038] Usam-se os seguintes materiais: quitosana com grau de desacetilação de 75 a 98,5%, peso molecular de 100 a 1000000 KDa, na forma de pó e com aparência de cor amarelo a creme; ácido acético p.a. ou qualquer ácido orgânico como lático, cítrico ou inorgânico como clorídrico, sulfúrico, fosfórico etc., e hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, cálcio etc.; qualquer óleo de origem vegetal, essencial ou não, como os óleos de lavanda, citronela, eucalipto, buriti, entre outros. Neste exemplo, utiliza-se o óleo virgem de buriti, extraído da polpa do fruto da Mauritia flexuosa, pelo método de prensagem a frio e filtração, além de apresentar as seguintes concentrações de ácidos graxos conforme a tabela 1:

[039] Para obtenção do sal de quitosana, a mesma com faixa de 75 - 98,5% de grau de desacetilação é dissolvida pelos seguintes procedimentos: primeiramente prepara-se uma solução com quitosana com faixa de 1% a 10% de teor do polímero, água destilada e deionizada e ácido acético ou qualquer ácido orgânico ou inorgânico na faixa de 0,1 a 10,0 % vol. O ácido é utilizado para dissolver a quitosana na água e formar a solução protonando a quitosana, sendo acrescido de forma gradual e com agitação por misturador em velocidade constante à temperatura ambiente durante um período de 1 a 4 horas a uma velocidade de 600 a 1000 RPM, até a obtenção de uma solução transparente. Logo após, a solução final do acetato de quitosana passa pelo processo de filtração, para remoção de particulados insolúveis.

[040] Após a dissolução e filtração, o material pode ser armazenado em refrigerador na faixa entre 1ºC a 10 ºC durante 10 a 24 horas. O pH da solução final de acetato de quitosana é em torno de 1,0 a 5,0, de acordo com o ácido utilizado para protonar a quitosana, preferencialmente 4,5. A figura 1 demonstra as etapas básicas do processo para a obtenção dos filmes de acetato de quitosana.

[041] Para a obtenção do composto NQ/B, usa-se uma metodologia baseada no método de aglutinação da glucosamina para sintetizar a nanoquitosana. Utilizando o acetato de quitosana de acordo com a metodologia descrita anteriormente, adiciona-se gradualmente uma solução de hidróxido de sódio ou outro hidróxido como, por exemplo, de potássio ou cálcio, na mesma concentração do ácido utilizado para completa neutralização do ácido utilizado (NaOH 0,1 a 40%), sob agitação constante de 100 a 1000 RPM e temperatura ambiente até atingir a faixa de pH 2,5 a 5.8 da solução de acetato de quitosana, onde é iniciada a adição do óleo de buriti, que é a mesma faixa do óleo utilizado para preservar sua integridade. A faixa de pH 4.4 a 5.0 é a escolhida pela preservação da integridade dos componentes do óleo de buriti que tem pH entre 3,0 - 5,5. Depois de adicionado todo óleo de Buriti, na mesma concentração em massa de polímero, procede-se com a neutralização da solução ácida até a faixa de pH 5,5 a 8.5. O pH final depende da aplicação e exigência do produto final.

[042] A concentração do hidróxido de sódio corresponde a mesma concentração de ácido acético ou qualquer outro ácido orgânico ou inorgânico utilizado na solução anteriormente descrita, o NaOH tem a função de neutralizar a solução ácida e provocar a aglomeração do grupo glucosamina proveniente da quitosana. A medida que a macromolécula de glucosamina inicia a sua aglutinação começa a ser adicionado e encapsulado dentro da nano partícula de quitosana o óleo de Buriti até o pH final 7,4, sob constante agitação, em torno de 100 - 1000 RPM, por 0,5 – 4,0 horas. Não se observando separação de fases (óleo/quitosana) mesmo em meio aquoso.

[043] Após permanecer por 24 horas acondicionada sob refrigeração a temperatura constante de 1 a 10 °C, esta solução é filtrada e lavada com água destilada e deionizada para minimizar a concentração de sal de acetato de sódio residual que é formado na reação de neutralização do ácido acético com hidróxido de sódio.

[044] Essa metodologia pode ser realizada utilizando diferentes concentrações de óleo de buriti para a obtenção do biocomposto: 0,05% - 30%, dependendo da concentração de polímero, a quantidade de óleo de buriti pode ser aumentada se for aumentado a concentração de polímero guardando as devidas proporções, isto é 2% de polímero: tem-se 1%; 2% e 4% de óleo de Buriti e assim sucessivamente. No entanto, os compostos com concentrações de 1% tanto da quitosana, como do óleo de buriti, são favoritos devido ao fato de ter alta concentração de óleo de buriti e não apresentar separação de fases. O método de obtenção do composto de nanoquitosana e óleo de buriti está exemplificado conforme o fluxograma da Figura 2.

[045] Exemplo: o sal de quitosana é obtido a partir da dissolução da quitosana com ácido e posterior processo de filtração. O composto de nanoquitosana e óleo de buriti, é obtido a partir do método de aglutinação para sintetizar a nanoquitosana. Utilizando o acetato de quitosana é adicionada gradualmente uma solução de hidróxido de sódio (NaOH a 0,4%), sob agitação constante de 1000 RPM e temperatura ambiente até o pH 5.0 da solução de acetato de quitosana, onde foi iniciada a adição o óleo de buriti. O pH 5.0 foi escolhido para preservação da integridade dos componentes do óleo de Buriti que tem o pH 4,5, depois de adicionado todo óleo de Buriti, na mesma concentração em massa de polímero, procedeu-se a neutralização da solução acida até o pH de 7.4.

[046] A concentração do hidróxido de sódio corresponde a mesma concentração de ácido acético da solução anteriormente descrita, o NaOH tem a função de neutralizar a solução ácida e provocar a aglomeração do grupo glucosamina proveniente da quitosana. A medida que a macromolécula de glucosamina inicia a sua aglutinação começa a ser adicionado o óleo de Buriti até o pH final 7,4, sob constante agitação, em torno de 700 RPM, por 3 horas. Após permanecer, por vinte quatro horas acondicionada sob refrigeração a temperatura constante de 5ºC, esta solução foi filtrada e lavada com o funil de Büchner, com água destilada e deionizada para minimizar a concentração de sal de acetato de sódio residual que foi formado na reação de neutralização do ácido acético com hidróxido de sódio. Não foi observado no filtrado nenhum resquício de óleo livre somente a água usada na lavagem. Logo após, 10 amostras de 25 mL do composto foram colocadas para secar em placas de vidro na temperatura ambiente, para posterior analise de FTIR, MEV e tamanho de partícula, e o restante do material foi armazenado em geladeira a 5ºC.

[047] Para caracterização utiliza-se a espectroscopia de absorção no infravermelho, onde são caracterizados o óleo de buriti, a nanoquitosana sintetizada e o composto NQ/B. Além do infravermelho, realiza-se a análise de microscopia eletrônica por varredura - MEV e determinado o tamanho de partícula da nanoquitosana e do composto NQ/B.

[048] A Espectroscopia de absorção no infravermelho – FTIR – ATR é utilizada para investigar a composição química estrutural e verificar a presença de grupos funcionais característicos do polímero e dos grupos funcionais da nanoquitosana, do óleo de buriti e do composto formado pela nanoquitosana e óleo de buriti. Os espectros na região do infravermelho (IV) podem ser registrados em um espectrofotômetro na região da faixa espectral de 4000 a 650 cm-1 , número de scans 8 e resolução de 4 cm-1 . As amostras são analisadas por infravermelho com o auxílio do acessório ATR (Reflectância Total Atenuada).

[049] O estudo da morfologia, porosidade e dispersão de partículas e óleo de buriti na matriz polimérica é realizada através da técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV. A imagem eletrônica de varredura é formada pela incidência de um feixe de elétrons na amostra; a incidência do feixe de elétrons na amostra promove a emissão de elétrons secundários, retroespalhados, auger e absorvidos, assim como de raios X característicos e de catodoluminescência.

[050] A morfologia das substâncias é analisada em um microscópio eletrônico de varredura; para a realização da análise de Microscopia Eletrônica de Varredura MEV – EDS, uma parte da amostra é colada no suporte (stub) com uma fita de carbono e estas são recobertas com carbono através de evaporação, para tornálas condutivas.

[051] O objetivo da análise por dispersão de luz dinâmica (DLS) é determinar o tamanho das partículas do composto NQ/B em comparação ao tamanho de partícula da quitosana nanocristalina.

[052] O tamanho das partículas é o diâmetro da esfera que se difunde na mesma velocidade da partícula a ser medida, sendo medido em um instrumento de dispersão de luz dinâmica (DLS). O sistema determina o tamanho pela primeira medição do movimento browniano das partículas numa amostra usando DLS e, em seguida, a interpretação de um tamanho a partir deste utilizando teorias estabelecidas. As partículas em um movimento líquido ao acaso e a sua velocidade de movimento são usadas para determinar o tamanho da partícula.

[053] Para determinar a Concentração Bactericida Mínima (CBM), pode-se utilizar em testes biológicos quantidades crescentes de cada uma das amostras analisadas; para esse teste são utilizadas amostras apenas com óleo de buriti, outras com nanoquitosana e outra com o composto NQ/B. Todas essas amostras para os ensaios são previamente esterilizadas em autoclave a 121°C por 15 minutos, assim como todos os materiais utilizados e os meios de cultura, para evitar interferências de outras bactérias do meio ambiente. Os procedimentos técnicos são realizados seguindo os critérios de qualidade para análises microbiológicas.

[054] No preparo dos inóculos, as cepas bacterianas referências são utilizadas de Staphylococcus aureus (ATCC 25922) e Escherichia coli (ATCC 25923). As bactérias liofilizadas são preparadas conforme recomendação do fabricante. Logo após são semeadas em placa de petri contendo Agar TSA e então são incubadas a 35°C por 24h.

[055] O método da diluição utiliza duas séries de dado número de frascos de erlenmeyer com meio de cultura BHI a critério do usuário (Infuso cérebro e coração) para cada uma das 3 amostras (óleo de buriti, nanoquitosana e composto NQ/B) contendo de 1,0mL; 2,0mL; 3,0mL; 4,0 mL; 5,0mL ao número em mL de amostras em cada um dos frascos da respectiva sequência. No primeiro erlenmeyer, pipeta-se 1mL de amostra, 18mL de caldo BHI. No erlenmeyer número 2 é pipetado 2 mL de amostra e 17mL de BHI. No nº 3 é pipetado 3 mL de amostra e 16mL de caldo, assim sucessivamente, sempre aumentando 1mL de amostra a cada novo frasco e dimuindo 1mL no caldo.

[056] Após, adiciona-se ao primeiro frasco 1mL da suspensão bacteriana. Homogeneíza-se bem o frasco nº 1 e retira-se deste 1mL para transferir ao frasco nº 2. Depois de homogeneizar bem o frasco nº 2, transfere-se 1mL ao frasco nº 3 e assim sucessivamente até o último frasco experimentado. Este procedimento é realizado para cada uma das amostras (N/B, em duas séries, sendo que uma é inoculada com 1mL de Escherichia coli referência e a outra sequência de frascos com Staphylococcus aureus).

[057] Ainda são preparados os controles positivos e outros frascos para os controles negativos. Os controles positivos contêm apenas as bactérias testes e o meio de cultura. Os negativos apenas as amostras e o meio de cultura. Todos os frascos são incubados a 35°C por 24h. A observação visual do crescimento após a incubação pode ser prejudicada pela turvação própria de algumas amostras, sendo assim todas amostras são semeadas em placa de PCA. As placas são incubadas em estufa bacteriológica a 35°C por 24h e após analisadas com presença ou ausência de crescimento bacteriano a concentração bactericida é determinada pela ausência de crescimento na cultura em placa.

[058] Os compostos NQ/Bs que são obtidos seguindo a metodologia descrita, apresenta-se visualmente com uma coloração alaranjada que varia de tonalidade de acordo com a concentração do óleo de buriti; sendo que a tonalidade mais clara é observada na concentração de 0,5% e a mais escura na concentração de 2% e observa-se consistência de líquido para gel (Figura 3). Os compostos de 0,5% e 1% não apresentam na visualização a olho nu, precipitado de óleo de buriti, já na concentração de 2%, com o dobro de óleo em comparação à concentração de polímero, identifica-se precipitado de óleo, que sugere a não ligação a nanoquitosana e a formação de fases entre a parte ligada e o óleo precipitado (saturação de óleo de buriti). No composto formado com 0,5% de óleo de buriti, visualiza-se aglomerados de nanoquitosana sem ligação ao óleo, devido a sua pequena concentração.

[059] Para elaboração desse composto recomenda-se a que possuí concentrações de 1% quitosana e 1% de óleo de buriti conforme a figura 3, devido ao fato de sua visualização se apresentar mais homogênea, não apresentando separação de fases, nem a migração de óleo de buriti para superfície do filme (Figura 4) e a alta concentração de óleo de buriti, se comparado ao composto com 0,5%.

[060] A obtenção deste composto segue a mesma regra de complexos formados de quitosana e fostatos de Cálcio, já amplamente relatado na literatura, onde o íon fosfato se liga de forma iônica com a grupo amina, este íon fosfato é o promotor da formação de um complexo de quitosana e fosfato de Cálcio usado para regeneração óssea. No caso do composto de nanoquitosana e o óleo de Buriti, há indícios que sugerem a formação de um composto destas duas substâncias.

[061] A síntese do composto de NQ/B não se caracteriza a uma simples mistura de nanoquitosana e óleo de buriti, mas sim em um novo método de se obter o composto estudado. Devido ao fato deste composto ter sido obtido em meio aquoso e a diferença de polaridade, composição das substâncias, diferentes densidades e estruturas distintas, ajudam a explicar a possível formação de um complexo, mas que contribuem no encapsulamento deste óleo de buriti, na formação da nano partícula de quitosana, que pode ser observado pelo aumento do tamanho de partícula do composto, na formação da macromolécula de glucosamina proveniente da quitosana.

[062] Observa-se pelas imagens de MEV e FTIR a presença de nanoquitosana e óleo de buriti, mesmo depois do processo de purificação. A purificação do composto se refere a lavagem com água destilada e deionizada do produto final para redução do acetato de sódio formado na neutralização do sal de quitosana/óleo de buriti com hidróxido de sódio, não sendo observado óleo residual no filtrado final e tão pouco separação de fases e/ou migração de óleo para superfície devido a diferença de densidade das duas substâncias no produto final.

[063] Devido ao fato que o óleo de buriti ter em sua composição vários ácidos graxos contendo vários íons compatíveis com o grupo amina proveniente da quitosana a formação deste composto sugere um complexo entre o grupo amina da quitosana e um ou mais ácidos graxos provenientes do óleo de buriti.

[064] O espectro de infravermelho apesar de ser característico da molécula como um todo, gera bandas, de certos grupos de átomos, que ocorrem mais ou menos na mesma frequência, independente da estrutura da molécula. A figura 5 representa os espectros de infravermelho da quitosana nanocristalina (QNC). Analisando os espectros na região do infravermelho da quitosana nanocristalina (QNC), observa-se a presença dos grupos funcionais NH2 (1590 cm-1 ), amida I (1746 cm-1 ), amida II (1419 cm-1 ) a partir da QNC. Os picos mais intensos de energia (1026 e 938 cm-1 ) identificam o estiramento COC (glicose – β – 1 – 4) vibrações do estiramento do esqueleto da estrutura do polissacarídeo. Observase também picos de energia referentes ao N-H e O-H respectivamente em 3357 cm-1 e 3287 cm-1.

[065] A figura 6 representa a espectroscopia de infravermelho do óleo de buriti, onde observa-se uma banda formada na região próximo a 1750 cm-1 , representando a ligação C=O. Essa banda é característica marcante da espectroscopia de infravermelho de óleos. A análise da espectroscopia de infravermelho do óleo de Patuá e óleo de buriti, observou que o espectro do óleo de Buriti, apresenta uma banda muito fraca em 1711 que associamos a ligação C=O presente no ácido oleico e três outras bandas em 1740, 1745, e 1752 cm-1 referentes às ligações C=O.

[066] A figura 7 representa a espectroscopia de infravermelho do composto formado pela nanoquitosana e óleo de buriti, onde observa-se que a banda próxima a 1750 cm-1 característica do óleo de buriti, diminui consideravelmente, o que sugere a ligação do C=O com o grupo amida da nanoquitosana, sendo essas as regiões mais reativas do óleo e da nanoquitosana. Analisando os espectros na região do infravermelho da quitosana nano cristalina (QNC) com o óleo de buriti, observa-se ainda a manutenção de alguns picos importantes presentes na nanoquitosana como o grupo funcional NH2 (próximo de 1600 cm-1 ), que se apresenta diminuída, provavelmente devido a ligação com o grupo C=O do óleo de buriti.

[067] Outros picos importantes da nanoquitosana são observados com pequenos deslocamentos como (1100 e 1050 cm-1 ), identificaram o estiramento COC (glicose – β – 1 – 4), vibrações do estiramento do esqueleto da estrutura do polissacarídeo. Observa-se também picos de energia referentes ao N-H e O-H próximo a 3500 cm-1 .

[068] Importante salientar que mesmo depois do processo de purificação é possível identificar os principais picos da quitosana e do óleo de buriti, criando-se assim um composto estável.

[069] Conforme a Figura 8, a nanoquitosana pela MEV apresenta-se homogênea, com rugosidades e formação de aglomerados devido a sua natureza amorfa; já a MEV do composto NQ/B de acordo com a Figura 9 apresenta-se com áreas mais aveludadas referentes ao óleo (3), rugosidades referentes a nanoquitosana (4) além de muitos aglomerados de nanoquitosana devido à alta polidispersividade da mesma que pode ser observado na análise do tamanho de partícula.

[070] Nota-se pelas figuras 7 e 8 que as partículas de nanoquitosana permanecem intactas, envoltas por óleo de buriti que se apresentam fora das nanopartículas, mas que também pode estar presente dentro das nanopartículas, pois uma das características das nanopartículas poliméricas é o encapsulamento de substâncias para liberação controlada. Devido ao processo da destruição da macromolécula de glucosamina da quitosana para obtenção do acetato de quitosana e posteriormente a aglutinação e reconstituição da macromolécula de glucosamina, causa um aumento da parte amorfa do polímero e uma diminuição de sua cristalinidade, criando uma superfície interna de absorção, tal mudança estrutural do material se reflete na melhoria de algumas propriedades importantes como a maior absorção de água, causando maior adesividade e afinidade com substâncias de caráter negativo.

[071] As análises de tamanho de partícula são realizadas sob duas formas diferentes. As análises das amostras da quitosana base sem a presença do óleo de buriti (NQ) 1% e o composto (NQ/B) 1%:1% com a presença do óleo de buriti. Para as medidas dos tamanhos de partícula são utilizados filtros de Mesh 0,450μm com a intenção de reduzir a polidispersividade da solução a fim de reduzir a variação de tamanho molecular. Além disso, são utilizadas em torno de seis medidas, para cada amostra, depois realiza-se a média.

[072] A alta reatividade de ambas as amostras induz a aglomeração das partículas de quitosana que refletem no aumento da polidispersividade, sendo esta uma característica de polímeros de maior caráter amorfo, mais reativos e menos estruturais.

[073] O tamanho de partícula da nanoquitosana envolvendo este método de obtenção (aglomeração), compreende o tamanho de partícula entre 20 a 120nm com média de tamanho de partícula de 55,4nm. Esta metodologia pretende confirmar estes dados, utilizando o mesmo método de obtenção da nanoquitosana (aglomeração) e do novo método de obtenção do composto com óleo de Buriti utilizando também o processo de aglomeração.

[074] Os dados são ilustrados na tabela 2 para um dado número de amostras, demonstrando tamanhos de partículas para a nanoquitosana - NQ que variam de 57,91 a 123,91nm, com média de 85nm. O composto NQ/B, apresenta resultados que variam de 95,43 a 197,56nm, com média de 134nm. Uma nanopartícula é uma estrutura de um tamanho que varia de 1 a 100nm, sendo o prefixo “nano” na nano biotecnologia utilizado comumente em alguns trabalhos para partículas de até centenas de nanômetros de diâmetro, observando-se sua utilização principalmente em diâmetros entre 1 a 350nm.

[075] Observa-se na tabela 2 que no composto NQ/B, o tamanho de partícula da nanoquitosana apresenta média maior que na amostra nanoquitosana - NQ, sem o óleo de buriti, respectivamente 134 e 85nm, sugerindo a presença de óleo de buriti dentro da partícula de nanoquitosana. Também é possível observar uma diminuição da polidispersividade no composto devido a ligação da nanoquitosana com o óleo de buriti, o que torna esse composto mais estável.

[076] O aumento do tamanho da nanopartícula no composto, confirma a presença do óleo dentro da nanopartícula, corroborando com estes dados, onde na literatura utilizando nanopartículas de zeína e quitosana e óleos essências obtiveram partículas com tamanho próximos do presente composto, mostrando também o aumento do tamanho da partícula se comparada a nanoquitosana isolada, caracterizando o processo de encapsulamento, com a incorporação do óleo a parte interna da nanoquitosana.

[077] A nanoquitosana devido a sua alta reatividade, tem capacidade de se ligar a outras substâncias criando novos compostos que podem ser utilizadas na cicatrização tecidual. Na presente invenção é desenvolvido um método para a obtenção de um composto pela junção da nanoquitosana e de óleos vegetais, no exemplo mostrado, do óleo de buriti, com o intuito de potencializar a ação cicatrizadora já descrita na literatura separadamente do polímero e do óleo.

[078] O resultado do espectro na região do infravermelho (IV) do composto mostra a presença da estrutura química da nanoquitosana e do óleo de buriti, além de uma diminuição da banda próxima a 1750 cm-1 , característica do óleo de buriti, o que sugere a ligação do C=O do óleo com o grupo amida da nanoquitosana. Assim o espectro na região do infravermelho (IV) demonstra a presença da nanoquitosana e do óleo de buriti no composto, sem a formação de uma nova substância.

[079] A análise de Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV do composto demonstra a presença de áreas enrugadas que caracterizam a nanoquitosana e formações de aglomerados de nanoquitosana devido a característica amorfa dessa substância, além de áreas aveludadas que representam o óleo de buriti. Pela MEV observa-se o óleo externo a nanoquitosana, mas devido as características da nanoquitosana, sugere-se que o óleo também possa ter se ligado na parte interna desse aglomerado.

[080] A determinação do tamanho de partícula demonstrou a presença da nanopartícula no composto, além de se observar que o composto nanoquitosana e óleo de buriti - NQ/B apresenta a média do tamanho de partícula maior que a nanoquitosana isoladamente, respectivamente 134 e 85nm, demonstrando a presença de óleo de buriti dentro da partícula de nanoquitosana, devido ao encapsulamento do óleo pela nanopartícula, gerada pela ligação do óleo a grupos aminos reativos da nanoquitosana. Também é possível observar uma diminuição da polidispersividade no composto devido a ligação da nanoquitosana com o óleo de buriti, o que torna esse composto mais estável.

[081] A análise dos ensaios biológicos demonstra maior controle no crescimento de bactérias do composto NQ/B se comparado ao óleo e a nanoquitosana isoladamente, utilizadas para sua formulação. Ao mesmo tempo que poderá em formulações terapêuticas ser um promissor para uso na cicatrização sem agredir significativamente a microbiota normal.

[082] Por fim, salienta-se que as figuras e descrição realizadas não possuem o condão de limitar as formas de execução do conceito inventivo ora proposto, mas sim de ilustrar e tornar compreensíveis as inovações conceituais reveladas nesta solução. Desse modo, as descrições e imagens devem ser interpretadas de forma ilustrativa e não limitativa, podendo existir outras formas equivalentes ou análogas de implementação do conceito inventivo ora revelado e que não fujam do espectro de proteção delineado na solução proposta.

[083] Tratou-se no presente relatório descritivo de um aperfeiçoamento em composto de nanoquitosana e óleo vegetal (de buriti, no exemplo) e seu respectivo processo de obtenção, dotado de novidade, atividade inventiva, suficiência descritiva, aplicação industrial e, consequentemente, revestido de todos os requisitos essenciais para a concessão do privilégio pleiteado.

Claims (5)

1. COMPOSTO DE NANOQUITOSANA E ÓLEO VEGETAL caracterizado por sua composição de nanoquitosana encapsulando óleo vegetal, preferencialmente óleos derivados de palmas (buriti, babaçu, dendê, palma, etc), alternativamente óleos derivados de vegetais diversos como girassol, soja, copaíba, limoneno, etc.
2. COMPOSTO DE NANOQUITOSANA E FOSFATOS DE CÁLCIO caracterizado por sua composição de nanoquitosana encapsulando fosfatos de cálcio selecionados a partir dos seguintes grupos; apatitas e hidroxiapatita, fosfato de cálcio, fosfato dicálcico, fosfato tricálcico, fosfato tetracálcico, fosfato octacálcico e fosfato de cálcio amorfo.
3. PROCESSO DE OBTENÇÃO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a) preparação da solução de sal de quitosana, b) adicionar solução de hidróxido de sódio (NaOH 0,1 a 40%), sob agitação constante de 1000 RPM e temperatura ambiente até o pH 5.0, c) adicionar o óleo vegetal até atingir a mesma concentração em massa de polímero (quitosana), d) neutralizar a solução ácida com a solução de hidróxido até o pH de 7.4 sob agitação por até 3 horas, e) manter sob refrigeração por 24 horas a temperatura constante de 5 ºC, f) lavar e filtrar o composto formado com água destilada e deionizada.
4. PROCESSO DE OBTENÇÃO de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a) preparação da solução de sal de quitosana, b) adição de dois ou mais tipos de fosfatos de cálcio com concentração entre 0,5 a 3,5% por peso, e solução de ácido clorídrico com concentração entre de 0,5 a 3,0% por peso, c) homogeneizar a solução formada por intervalo de 10 a 30 minutos, com velocidade de rotação de 5000 a 6000rot/min, seguido por um período de 240 a 300 minutos, com velocidade de rotação de 400 a 600 rpm, d) adicionar solução de hidróxido de sódio (NaOH 0,1 a 40%), sob agitação constante de 1000 RPM e temperatura ambiente até o pH 7 - 7.8, e) manter sob refrigeração por 24 horas a temperatura constante de 5 ºC, f) lavar e filtrar o composto formado com água desmineralizada.
5. PROCESSO DE OBTENÇÃO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por, alternativamente a etapa b) utilizar solução de hidróxido de potássio ou cálcio, na mesma concentração do ácido utilizado para neutralização da solução formada.

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