BR102021024802A2

BR102021024802A2 - CIRCULATING MICRORNAS PANEL FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES AND USE

Info

Publication number: BR102021024802A2
Application number: BR102021024802-5A
Authority: BR
Inventors: Daniela Scantamburlo Denadai; Juliana Regina Peiró; Alexandre Lima Andrade; Flávia De Almeida Lucas; Flávia Lombardi Lopes; Francisco Leydson Formiga Feitosa; Leonardo Aparecido Teixeira Bentin; Luiz Claudio Nogueira Mendes
Original assignee: Universidade Estadual Paulista Julio De Mesquita Filho
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2023-06-20

Abstract

A presente invenção se refere a um painel de microRNAs circulantes, que compreende cinco microRNAs: eca-miR-451 (SEQ ID NO: 01) eca-miR-191 (SEQ ID NO: 02), ecamiR-486-5p (SEQ ID NO: 03), eca-miR-106b (SEQ ID NO: 04), e eca-miR-19b (SEQ ID NO: 05), cuja expressão aumentada, detectada no sangue venoso equino, corresponde ao diagnóstico precoce de equinos com osteoartrite tibiotársica, assim, a invenção também se refere ao uso do painel de microRNAs para detecção precoce das alterações da regulação da expressão gênica em artropatias de equinos, utilizando sangue venoso do animal como amostra, antes mesmo do aparecimento de sinais radiográficos ou sinais de dor na articulação. Portanto, os cinco miRNAs identificados no sangue equino servem como biomarcadores não-invasivo sistêmico e de detecção precoce para artropatias tibiotársicas, sendo clinicamente aplicável na triagem de pacientes.

The present invention relates to a panel of circulating microRNAs, comprising five microRNAs: eca-miR-451 (SEQ ID NO: 01) eca-miR-191 (SEQ ID NO: 02), ecamiR-486-5p (SEQ ID NO: 02) NO: 03), eca-miR-106b (SEQ ID NO: 04), and eca-miR-19b (SEQ ID NO: 05), whose increased expression, detected in equine venous blood, corresponds to the early diagnosis of horses with osteoarthritis tibiotarsal, thus, the invention also refers to the use of the microRNAs panel for early detection of changes in the regulation of gene expression in equine arthropathies, using the animal's venous blood as a sample, even before the appearance of radiographic signs or signs of pain in the articulation. Therefore, the five miRNAs identified in equine blood serve as systemic non-invasive biomarkers and early detection for tibiotarsal arthropathies, being clinically applicable in patient screening.

Description

CIRCULATING MICRORNAS PANEL FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES AND USE

BRIEF DESCRIPTION

[001] Trata a presente solicitação de patente de invenção de um “PAINEL DE microRNAs CIRCULANTES PARA DETECÇÃO PRECOCE DE OSTEOARTRITE TIBIOTÁRSICA EM EQUINOS E USO”, que se refere a um painel de microRNAs circulantes, mais especificamente, eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, ecamiR-106b, e eca-miR-19b, a ser empregado para detecção precoce de osteoartrite tibiotársica em equinos de maneira não-invasiva e sistêmica, a partir de amostras de sangue venoso equino.[001] This patent application deals with a "PANEL OF CIRCULATING microRNAs FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES AND USE", which refers to a panel of circulating microRNAs, more specifically, eca-miR-451, eca -miR-191, eca-miR-486-5p, ecamiR-106b, and eca-miR-19b, to be used for early detection of tibiotarsal osteoarthritis in horses in a non-invasive and systemic manner, from venous blood samples equine.

APPLICATION FIELD

[002] A presente invenção pertence à seção de química ao campo de engenharia genética, mais especificamente, ao campo de processos de medição ou ensaio envolvendo ácidos nucleicos; bem como à seção de necessidades humanas, ao campo da veterinária, ao campo de diagnóstico e identificação, por se referir a um painel de microRNAs circulantes a ser empregado para detecção precoce de osteoartrite tibiotársica em equinos.[002] The present invention belongs to the chemistry section of the field of genetic engineering, more specifically, to the field of measurement or assay processes involving nucleic acids; as well as the human needs section, the veterinary field, the field of diagnosis and identification, as it refers to a panel of circulating microRNAs to be used for the early detection of tibiotarsal osteoarthritis in horses.

CONVINCMENT

[003] A expressão desregulada de microRNAs específicos (miRNAs) no sangue é conhecida como biomarcadores diagnósticos promissores para diagnóstico de algumas enfermidades. Evidências recentes demonstram que miRNAs na circulação podem refletir o estado de enfermidades presentes, podendo ser considerados como biomarcadores diagnósticos promissores e fontes potenciais para analisar o papel dos miRNAs em distúrbios articulares.[003] The dysregulated expression of specific microRNAs (miRNAs) in the blood is known as promising diagnostic biomarkers for the diagnosis of some diseases. Recent evidence demonstrates that circulating miRNAs can reflect the status of present diseases, and can be considered as promising diagnostic biomarkers and potential sources to analyze the role of miRNAs in joint disorders.

[004] Novos métodos para obtenção de amostras de tecido sinovial estão se tornando mais amplamente disponíveis e, consequentemente, gerando resultados que avançaram no desenvolvimento de alvos terapêuticos e identificação de biomarcadores de resposta a terapias.[004] New methods for obtaining synovial tissue samples are becoming more widely available and, consequently, generating results that advance the development of therapeutic targets and identification of biomarkers of response to therapies.

[005] A partir da identificação de miRNAs em artropatias de equinos, pôde-se criar modelos para estudar as vias de sinalização comuns a enfermidades articulares em humanos, as quais, a longo prazo, podem acelerar o desenvolvimento de medidas terapêuticas para estas em ambas as espécies. Concentrações de miRNAs presentes em plasma e líquido sinovial de pacientes demonstram indícios de que há correlação entre os miRNAs de fluidos sinoviais e do plasma, evidências recentes demonstram que miRNAs na circulação podem refletir o estado de enfermidades presentes, podendo ser considerados como biomarcadores diagnósticos promissores e fontes potenciais para analisar o papel dos miRNAs em distúrbios articulares.[005] From the identification of miRNAs in equine arthropathies, it was possible to create models to study the signaling pathways common to joint diseases in humans, which, in the long term, can accelerate the development of therapeutic measures for these in both the species. Concentrations of miRNAs present in plasma and synovial fluid of patients indicate that there is a correlation between miRNAs in synovial fluids and plasma, recent evidence demonstrates that miRNAs in the circulation can reflect the state of present diseases, and can be considered as promising diagnostic biomarkers and potential sources to analyze the role of miRNAs in joint disorders.

[006] Distúrbios articulares em equinos, especialmente em equinos atletas, causam grande sofrimento aos animais, além de representarem grandes perdas econômicas e implicarem na retirada precoce dos animais das atividades atléticas (Sotelo, 2019: Avaliação dos efeitos in vitro do Dimetilsulfóxido em células sinoviais de equinos e de sua utilização intra-articular como tratamento para sinovite aguda). O diagnóstico precoce de distúrbios dessa natureza promove melhoria na qualidade de vida do animal e aumenta as chances de sucesso nos tratamentos empregados.[006] Joint disorders in horses, especially in athletic horses, cause great suffering to animals, in addition to representing great economic losses and implying the early withdrawal of animals from athletic activities (Sotelo, 2019: Evaluation of the in vitro effects of Dimethylsulfoxide on synovial cells of horses and its intra-articular use as a treatment for acute synovitis). Early diagnosis of disorders of this nature promotes improvement in the animal's quality of life and increases the chances of success in the treatments employed.

[007] Convencionalmente, segundo Delchiaro e colaboradores (2020: Condromalácia na articulação tíbio társica das trócleas em equino – Relato de caso), o diagnóstico de distúrbios articulares são baseados principalmente em achados clínicos, radiográficos e ultrassonográficos, podendo, eventualmente serem realizados exames complementares, tais como artroscopia e a artrocentese, os quais, através de análises químicas, citológicas e de cultura do líquido sinovial, podem contribuir para o diagnóstico das enfermidades articulares, sendo elas sépticas ou inflamatórias (KaserHotz e Veltschi, 2006: Diagnostic Medical Imaging. In: Auer and Stick).[007] Conventionally, according to Delchiaro and collaborators (2020: Chondromalacia in the tibiotarsal joint of the trochleas in an equine - Case report), the diagnosis of joint disorders is based mainly on clinical, radiographic and ultrasound findings, and complementary exams may eventually be performed , such as arthroscopy and arthrocentesis, which, through chemical, cytological and culture analyzes of the synovial fluid, can contribute to the diagnosis of joint diseases, whether septic or inflammatory (KaserHotz and Veltschi, 2006: Diagnostic Medical Imaging. In : Auer and Stick).

[008] Nesse contexto, a presente invenção disponibiliza um painel com identificação de cinco miRNAs (eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, eca-miR-106b, e eca-miR19b) no sangue venoso equino, cuja expressão aumentada corresponde ao diagnóstico precoce de equinos com osteoartrite tibiotársica. O painel com os cinco miRNAs identificados no sangue equino serve como biomarcador não-invasivo sistêmico e de detecção precoce para artropatias tibiotársicas, podendo ser clinicamente aplicável na triagem de pacientes.[008] In this context, the present invention provides a panel with the identification of five miRNAs (eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, eca-miR-106b, and eca-miR19b) in the equine venous blood, whose increased expression corresponds to the early diagnosis of horses with tibiotarsal osteoarthritis. The panel with the five miRNAs identified in equine blood serves as a non-invasive systemic biomarker and for early detection of tibiotarsal arthropathies, and may be clinically applicable in the screening of patients.

[009] A principal aplicação da presente invenção é o diagnóstico precoce de artropatias tibiotársicas em equinos, tendo em vista que o desenvolvimento de terapias direcionadas aos miRNAs relacionados a doenças, usando inibidores de miRNA para destruir miRNAs sobre-expressos em sua forma madura ou precursora é uma abordagem bastante promissora.[009] The main application of the present invention is the early diagnosis of tibiotarsal arthropathies in horses, considering that the development of therapies directed at disease-related miRNAs, using miRNA inhibitors to destroy overexpressed miRNAs in their mature or precursor form It is a very promising approach.

[010] Estudos baseados na terapia “anti-miRNA” já demonstram resultados positivos no tratamento de doenças articulares humanas, impedindo a destruição das articulações e atenuando a progressão da enfermidade. Atletas humanos e equinos poderão vir a se beneficiar de novos tratamentos, assim, o desenvolvimento de modelos experimentais seguros na espécie equina pode ser útil para testar novas terapias, pois ambas as espécies desenvolvem atividades esportivas e enfermidades semelhantes. Portanto, a presente invenção contribui de maneira positiva para o desenvolvimento e aperfeiçoamento do campo técnico, corroborando com sua inventividade.[010] Studies based on “anti-miRNA” therapy have already shown positive results in the treatment of human joint diseases, preventing joint destruction and attenuating the progression of the disease. Human and equine athletes may benefit from new treatments, thus, the development of safe experimental models in the equine species can be useful to test new therapies, since both species develop sports activities and similar illnesses. Therefore, the present invention makes a positive contribution to the development and improvement of the technical field, corroborating its inventiveness.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[011] Atualmente, estão disponíveis no estado da técnica algumas anterioridades que se referem ao uso de miRNA como biomarcadores que auxiliam no diagnóstico de algumas patologias. No entanto, nenhuma delas, associadas ou não, resolvem o problema técnico do campo da utilidade, relacionado à detecção de micro RNAs circulantes e seu emprego para diagnóstico in vitro de distúrbios articulares em equinos, o que é possibilitado pelo painel de microRNAs pleiteado na presente invenção, conforme observado a seguir.[011] Currently, are available in the state of the art some prior art that refer to the use of miRNA as biomarkers that help in the diagnosis of some pathologies. However, none of them, associated or not, solve the technical problem in the field of utility, related to the detection of circulating microRNAs and their use for in vitro diagnosis of joint disorders in horses, which is made possible by the panel of microRNAs claimed in this present invention, as noted below.

[012] Castanheira e coloboradores (2021), em "Equine synovial fluid small non-coding RNA signatures in early osteoarthritis”, preconizam que estágios iniciais da osteoartrite seriam capazes de alterar a expressão de sncRNAs, facilitando a compreensão da patogênese subjacente e potencialmente fornecer biomarcadores precoces. Para testar sua hipótese, o grupo realizou o sequenciamento do RNA, a partir de amostra do líquido sinovial das articulações metacarpofalângicas dos cavalos controle e com osteoartrite inicial. Um grupo de sncRNAs expressos diferencialmente foi selecionado para validação adicional por qRT-PCR, em seguida, foi promovida uma análise de bioinformática, a fim de identificar alvos putativos dos microRNAs diferencialmente expressos e para explorar associações potenciais com processos biológicos específicos. Após a análise, o grupo concluiu que, os sncRNAs do líquido sinovial podem ser usados como biomarcadores moleculares para doenças precoces em articulações osteoartríticas equinas e que a caracterização dessas mudanças moleculares dinâmicas pode fornecer novos insights sobre o processo e mecanismo de desenvolvimento de osteoartrite precoce, o que é fundamental para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.[012] Castanheira et al. (2021), in "Equine synovial fluid small non-coding RNA signatures in early osteoarthritis", advocate that early stages of osteoarthritis would be able to alter the expression of sncRNAs, facilitating the understanding of the underlying pathogenesis and potentially providing early biomarkers. To test their hypothesis, the group performed RNA sequencing from a sample of synovial fluid from the metacarpophalangeal joints of control and early osteoarthritis horses. A group of differentially expressed sncRNAs was selected for further validation by qRT-PCR, then, a bioinformatics analysis was performed in order to identify putative targets of the differentially expressed microRNAs and to explore potential associations with specific biological processes.After the analysis, the group concluded that synovial fluid sncRNAs can be used as molecular biomarkers for early disease in equine osteoarthritic joints and that the characterization of these dynamic molecular changes may provide new insights into the process and mechanism of development of early osteoarthritis, which is critical for the development of new therapeutic approaches.

[013] Antunes e colaboradores (2019), em “On the road to biomarkers: developing a robust system for miRNA evaluation in equine blood and synovial fluid”, tiveram como objetivo desenvolver um método robusto e reprodutível para o isolamento de miRNA do fluido sinovial equino e plasma sanguíneo para, posteriormente, ser utilizado no sequenciamento de RNA de cavalos com doença articular. Para tanto, o líquido sinovial e o sangue foram coletados de cavalos submetidos à artroscopia articular de cavalos com OA ou OC. O fluido sinovial foi centrifugado para sedimentar quaisquer células ou fragmentos. O sobrenadante foi congelado rapidamente e armazenado a -80oC. O sangue equino foi centrifugado em vacutainers revestidos com EDTA. O sobrenadante foi então congelado rapidamente e armazenado a -80oC. O miRNA foi extraído do plasma sanguíneo e do fluido sinovial usando o kit avançado Qiagen Serum / Plasma de acordo com as instruções do fabricante. O RNA spike-in da Qiagen foi adicionado ao tampão de lise durante cada extração. O líquido sinovial foi isolado no estado puro ou diluído (1:1). O miRNA foi revertido transcrito usando Qiagen LNA RT kit com outro conjunto de Qiagen spike-in RNAs utilizados. A análise de qPCR foi realizada no cDNA resultante para avaliar os controles de pico utilizados (UniSp2, UniSp4, UniSp6, celmiR-39) e miR-132, miR-146a, miR-16, miR-223. O miRNA isolado foi usado para preparar bibliotecas de miRNA para sequenciamento de RNA usando o Qiagen QIAseq miRNA Library Kit de acordo com as instruções do fabricante. As bibliotecas resultantes foram submetidas à análise de bioanalisador usando um chip de DNA de alta sensibilidade em um bioanalisador Agilent 2100. A partir dos resultados prelimares e da avaliação de qualidade, o grupo acredita ter estabelecido um método robusto de isolamento de RNA tanto no líquido sinovial equino quanto no plasma, possibilitando a preparação de bibliotecas para realizar o sequenciamento de miRNA em cavalos OA e OC versus controles saudáveis para estabelecer uma coorte de miRNAs diferencialmente expressos em cavalos com doença articular.[013] Antunes et al. (2019), in “On the road to biomarkers: developing a robust system for miRNA evaluation in equine blood and synovial fluid”, aimed to develop a robust and reproducible method for the isolation of miRNA from synovial fluid and blood plasma to subsequently be used in the RNA sequencing of horses with joint disease. For this purpose, synovial fluid and blood were collected from horses submitted to joint arthroscopy of horses with OA or OC. The synovial fluid was centrifuged to pellet any cells or debris. The supernatant was quickly frozen and stored at -80oC. Equine blood was centrifuged in EDTA-coated vacutainers. The supernatant was then quickly frozen and stored at -80oC. miRNA was extracted from blood plasma and synovial fluid using the Qiagen Serum/Plasma Advanced Kit according to the manufacturer's instructions. Qiagen spike-in RNA was added to the lysis buffer during each extraction. Synovial fluid was isolated in pure or diluted state (1:1). The miRNA was reverse transcribed using Qiagen LNA RT kit with another set of Qiagen spike-in RNAs used. qPCR analysis was performed on the resulting cDNA to evaluate the peak controls used (UniSp2, UniSp4, UniSp6, celmiR-39) and miR-132, miR-146a, miR-16, miR-223. The isolated miRNA was used to prepare miRNA libraries for RNA sequencing using the Qiagen QIAseq miRNA Library Kit according to the manufacturer's instructions. The resulting libraries were subjected to bioanalyzer analysis using a high sensitivity DNA chip in an Agilent 2100 bioanalyzer. equine and plasma, enabling the preparation of libraries to perform miRNA sequencing in OA and OC horses versus healthy controls to establish a cohort of differentially expressed miRNAs in horses with joint disease.

[014] Zhang e colaboradores (2017), em "Role of MicroRNA in Osteoarthritis", fizeram uma revisão bibliográfica com o objetivo de destacar o papel do miRNA na regulação da expressão gênica em condrócitos articulares e sua importância na patogênese da osteoartrite, com uma discussão sobre o potencial do miRNA como um novo biomarcador e alvo terapêutico para osteoartrite.[014] Zhang et al. (2017), in "Role of MicroRNA in Osteoarthritis", conducted a literature review with the aim of highlighting the role of miRNA in regulating gene expression in joint chondrocytes and its importance in the pathogenesis of osteoarthritis, with a discussion on the potential of miRNA as a new biomarker and therapeutic target for osteoarthritis.

[015] Hollis e Starkey (2018), em “MicroRNAs in equine veterinary science”, também fizeram uma revisão, na qual resumiram como os microRNAs modulam a expressão gênica e explicaram a nomenclatura dos microRNAs. Além disso, discutiram as aplicações potenciais de microRNAs no diagnóstico e tratamento de doenças em equinos no contexto da soma do conhecimento atual sobre a expressão de microRNAs em tecidos de equinos normais e doentes.[015] Hollis and Starkey (2018), in “MicroRNAs in equine veterinary science”, also reviewed, in which they summarized how microRNAs modulate gene expression and explained the nomenclature of microRNAs. In addition, they discussed the potential applications of microRNAs in the diagnosis and treatment of equine diseases in the context of summing up current knowledge on microRNA expression in normal and diseased equine tissues.

[016] As quatro anterioridades inicialmente apresentadas compreendem publicações científicas que relatam a importância e o uso de microRNAs específicos como biomarcadores para diversas finalidades, especialmente, relacionadas à osteoartrite e com o uso desses em equinos. No entanto, nenhuma das anterioridades menciona os miRNAs que compreendem a presente invenção, nem o uso desses cinco miRNAs para obtenção de um painel para detecção de distúrbios articulares, o qual é empregado para detecção precoce de osteoartrite tibiotársica em equinos de maneira não-invasiva e sistêmica, a partir de amostras de sangue venoso equino.[016] The four prior art initially presented comprise scientific publications that report the importance and use of specific microRNAs as biomarkers for various purposes, especially related to osteoarthritis and their use in horses. However, none of the foregoing mentions the miRNAs that comprise the present invention, nor the use of these five miRNAs to obtain a panel for the detection of joint disorders, which is used for the early detection of tibiotarsal osteoarthritis in horses in a non-invasive way and system, from samples of equine venous blood.

[017] Unger e colaboradores (2021), em “Diagnostic potential of three serum microRNAs as biomarkers for equine sarcoid disease in horses and donkeys”, avaliaram eca-miR-331, eca-miR-100 e eca-miR-1 como biomarcadores séricos para doença sarcóide equina (SE). Para tanto, a expressão de eca-miR-331, eca-miR-100 e eca-miR-1 séricos em equídeos afetados por SE foi comparada ao controle pareado por idade, sexo e raça livre de tumor cavalos e burros com outros tumores de pele usando PCR quantitativo de transcrição reversa (reação em cadeia da polimerase) para quantificação relativa de miRNA. Influências de variáveis biológicas, pré-analíticas e clínicas na expressão de miRNA foram examinadas. As análises da curva de características do operador receptor (ROC) foram usadas para determinar as diferenças na expressão de miRNA entre os grupos. Os resultados das análises demonstraram que a expressão de eca-miR-100 foi afetada pela idade (P = 0,003) e a expressão de eca-miR-100 e eca-miR-1 foi afetada pela hemólise (ambos P <0,001). Eca-miR-331 não foi afetado por variação biológica, hemólise, tipo de ES e gravidade da doença. As concentrações de Eca-miR-331 foram maiores nos afetados por SE em comparação com os controles sem tumor (P = 0,002). A análise da curva ROC indicou uma área sob a curva de 0,65 (P = 0,002) com uma sensibilidade de 60%, especificidade de 71% e razões de verossimilhança positivas e negativas de 2,1 e 0,56, respectivamente, para diagnosticar ES. A expressão de Eca-miR-331 não discriminou entre cavalos com SE e outros tumores de pele. A expressão de eca-miR-100 e ecamiR-1 não foi diferente entre os grupos. Assim, os pesquisadores concluíram que, a expressão sérica de eca-miR-331 não é sensível nem específica o suficiente como um único biomarcador SE. Se combinado com outros miRNAs, pode ser útil para o diagnóstico de SE. Ainda que a anterioridade faça referência ao eca-miR-451, ele foi descrito como biomarcador para sarcoidose equina, portanto, tendo em vista se tratar de uma aplicação diferente da descrita na presente invenção, a anterioridade não antecipa o uso do biomarcador nem seu emprego no painel de microRNAs circulantes.[017] Unger et al. (2021), in “Diagnostic potential of three serum microRNAs as biomarkers for equine sarcoid disease in horses and donkeys”, evaluated eca-miR-331, eca-miR-100 and eca-miR-1 as biomarkers serum tests for equine sarcoid disease (SE). For this purpose, the expression of serum eca-miR-331, eca-miR-100 and eca-miR-1 in horses affected by SE was compared to controls matched by age, sex and tumor-free breed horses and donkeys with other tumors of skin using quantitative reverse transcription PCR (polymerase chain reaction) for relative miRNA quantitation. Influences of biological, preanalytical, and clinical variables on miRNA expression were examined. Receptor operator characteristic (ROC) curve analyzes were used to determine differences in miRNA expression between groups. The results of the analyzes demonstrated that the expression of eca-miR-100 was affected by age (P = 0.003) and the expression of eca-miR-100 and eca-miR-1 was affected by hemolysis (both P < 0.001). Eca-miR-331 was not affected by biological variation, hemolysis, type of ES and disease severity. Eca-miR-331 concentrations were higher in those affected by SE compared with tumor-free controls (P = 0.002). ROC curve analysis indicated an area under the curve of 0.65 (P = 0.002) with a sensitivity of 60%, specificity of 71%, and positive and negative likelihood ratios of 2.1 and 0.56, respectively, for diagnose ES. Eca-miR-331 expression did not discriminate between horses with SE and other skin tumors. Expression of eca-miR-100 and ecamiR-1 was not different between groups. Thus, the researchers concluded that, serum expression of eca-miR-331 is neither sensitive nor specific enough as a single SE biomarker. If combined with other miRNAs, it could be useful for the diagnosis of SE. Although the foregoing makes reference to eca-miR-451, it was described as a biomarker for equine sarcoidosis, therefore, considering that it is a different application from that described in the present invention, the foregoing does not anticipate the use of the biomarker nor its employment in the panel of circulating microRNAs.

[018] Oliveira Jr. e colaboradores (2021), em “Effects of endurance racing on horse plasma extracellular particle miRNA”, avaliaram os efeitos de corrida de resistência de 160 km sobre as partículas extracelulares de plasma de cavalos e sua população de miRNA. Para tanto, o plasma de cinco cavalos árabes durante cinco momentos de uma prova de resistência foi analisado. Partículas extracelulares foram purificadas do plasma e caracterizadas por microscopia eletrônica, sensor de pulso resistivo (qNano) e Western blotting. RNAs pequenos foram purificados a partir de plasma de cavalo e o sequenciamento foi realizado. As corridas de resistência aumentaram a concentração e o diâmetro médio das partículas extracelulares, em comparação com antes da corrida. O Western blotting mostrou uma alta concentração de proteínas das vesículas extracelulares duas horas após a corrida, que retornou à linha de base quinze horas após a corrida. A análise de expressão diferencial de microRNA revelou níveis crescentes de eca-miR-486-5p durante e após a corrida, e níveis decrescentes de ecamiR-9083 após o final. Assim, o estudo adicionou novos dados sobre a variação nas concentrações plasmáticas de partículas extracelulares após exercícios de longa distância e trouxe novos insights sobre os papéis dos miRNAs derivados do exercício, durante exercícios de resistência e de baixa intensidade. Apesar de a anterioridade mencionar que o eca-miR-486-5p é observado com maior expressão em equinos de competições de resistência, não é citado seu uso para detecção precoce de distúrbios articulares, como observado na presente invenção, portanto, a anterioridade não antecipa a matéria pleiteada.[018] Oliveira Jr. and collaborators (2021), in “Effects of endurance racing on horse plasma extracellular particle miRNA”, evaluated the effects of 160 km endurance racing on extracellular plasma particles of horses and their miRNA population. For that, the plasma of five Arabian horses during five moments of an endurance test was analyzed. Extracellular particles were purified from plasma and characterized by electron microscopy, resistive pulse sensor (qNano) and Western blotting. Small RNAs were purified from horse plasma and sequencing was performed. Endurance runs increased the concentration and mean diameter of extracellular particles compared to before the run. Western blotting showed a high concentration of extracellular vesicle proteins two hours after the run, which returned to baseline fifteen hours after the run. Differential microRNA expression analysis revealed increasing levels of eca-miR-486-5p during and after the run, and decreasing levels of ecamiR-9083 after the end. Thus, the study added new data on the variation in plasma concentrations of extracellular particles after long-distance exercise and brought new insights into the roles of exercise-derived miRNAs during endurance and low-intensity exercise. Despite the prior art mentioning that eca-miR-486-5p is observed with greater expression in endurance competition horses, its use for early detection of joint disorders is not mentioned, as observed in the present invention, therefore, the prior art does not anticipate the matter claimed.

[019] Niwane e colaboradores (2021), em “miR-486-5p: A Prognostic Biomarker for Chronic Myeloid Leukemia”, analisou alterações na expressão de miR-486-5p em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Os resultados indicaram que a expressão do miR-486-5p foi significativamente regulada positivamente nas células K562 após a exposição ao imatinibe, em comparação com as células K562 não tratadas (valor p = 0,047). As do grupo suportam o papel supressor de tumor de miR486-5p na LMC. A regulação negativa da expressão do miR-486-5p pode ser criticamente importante na progressão da doença em pacientes com LMC. A regulação positiva da expressão de miR-486-5p em células K562 de exposição pós-imatinibe e pacientes com LMC após 12 meses de tratamento com imatinibe sugere um papel efetor onco-supressor de miR-486-5p na via de sinalização BCR-ABL a jusante. Assim, o miR-486-5p pode ser explorado como um novo biomarcador para a detecção precoce de LMC. Embora a anterioridade faça referências ao eca-miR-486-5p, ele é citado como biomarcador para prognóstico de neoplasias malignas, como leucemia mieloide crônica, não sendo relatado seu uso veterinário, portanto, a anterioridade não antecipa a matéria pleiteada.[019] Niwane et al. (2021), in “miR-486-5p: A Prognostic Biomarker for Chronic Myeloid Leukemia”, analyzed changes in miR-486-5p expression in patients with Chronic Myeloid Leukemia (CML). Results indicated that miR-486-5p expression was significantly up-regulated in K562 cells after exposure to imatinib compared to untreated K562 cells (p-value = 0.047). Those in the group support the tumor suppressor role of miR486-5p in CML. Down-regulation of miR-486-5p expression may be critically important in disease progression in patients with CML. Up-regulation of miR-486-5p expression in K562 cells from post-imatinib exposure and CML patients after 12 months of imatinib treatment suggests an onco-suppressive effector role of miR-486-5p in the BCR-ABL signaling pathway downstream. Thus, miR-486-5p can be exploited as a new biomarker for early detection of CML. Although the article makes references to eca-miR-486-5p, it is cited as a biomarker for the prognosis of malignant neoplasms, such as chronic myeloid leukemia, and its veterinary use is not reported, therefore, the article does not anticipate the matter claimed.

[020] Também estão presentes no atual estado da técnica as anterioridades JP2016025853, intitulada “Micro RNA-based methods and compositions for diagnosing and treating solid cancers” e a EP1937845B1, intitulada “Micro-RNA-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer”, as quais compreendem invenções na área de microRNAs e procedimentos e métodos de diagnóstico, prognóstico e tratamentos de neoplasias malignas, como câncer de mama, sem no entanto mencionar o uso veterinário de microRNAs ou ainda para o diagnóstico prematuro de distúrbios articulares e que, portanto, não antecipam a presente invenção[020] Also present in the current state of the art are the prior art JP2016025853, entitled “Micro RNA-based methods and compositions for diagnosing and treating solid cancers” and EP1937845B1, entitled “Micro-RNA-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer”, which include inventions in the area of microRNAs and procedures and methods for diagnosis, prognosis and treatment of malignant neoplasms, such as breast cancer, without, however, mentioning the veterinary use of microRNAs or even for the premature diagnosis of joint disorders and which, therefore, do not anticipate the present invention

[021] A anterioridade BRPI0920582A2, intitulada "Biomarcadores e métodos de detecção e tratamento da dor espinhal e de articulação", descreve biomarcadores, incluindo complexos de fibronectina-agrecano isolados que se correlacionam com dor e inflamação de espinha ou articulação e métodos para sua detecção. São também fornecidos métodos para identificar locais de tratamento na espinha ou articulação para tratamento de dor e inflamação por detectar a presença de, ou níveis aumentados de, complexo de fibronectina-agrecano, além de métodos para tratar dor e inflação de espinha ou articulação. Ainda que a anterioridade se refira a biomarcadores para detecção e tratamento na espinha ou articulação, ela não menciona os cinco biomarcadores empregados na presente invenção, portanto, não antecipa a matéria pleiteada.[021] Priority BRPI0920582A2, entitled "Biomarkers and methods of detection and treatment of spinal and joint pain", describes biomarkers, including isolated fibronectin-aggrecan complexes that correlate with pain and inflammation of the spine or joint and methods for their detection . Also provided are methods for identifying treatment sites in the spine or joint for treating pain and inflammation by detecting the presence of, or increased levels of, fibronectin-aggrecan complex, in addition to methods for treating spine or joint pain and inflation. Although the prior art refers to biomarkers for detection and treatment in the spine or joint, it does not mention the five biomarkers used in the present invention, therefore, it does not anticipate the matter claimed.

[022] A anterioridade KR102070969B1, intitulada "A marker for the identification of pain”, descreve um microRNA como um marcador para determinar objetivamente o grau de dor que pode ser negligenciado pela sensação subjetiva e para determinar ou prever sua gravidade. Assim, a anterioridade se refere a um marcador para predizer a dor, um kit e/ou a uma composição de predição que compreende um agente para medir o nível de expressão de hsa-mir-1285-3p. Ainda que a anterioridade empregue a tecnologia de microRNA, ela não descreve os mesmo miRNA utilizados na presente invenção para detecção de distúrbios articulares em equinos, assim como não antecipa a associação de cinco miRNA para a obtenção de um painel de microRNA circulantes para detecção precoce osteoartrite tibiotársica em equinos.[022] Priority KR102070969B1, entitled "A marker for the identification of pain", describes a microRNA as a marker to objectively determine the degree of pain that can be overlooked by subjective sensation and to determine or predict its severity. refers to a marker for predicting pain, a kit and/or a predictive composition comprising an agent for measuring the expression level of hsa-mir-1285-3p. Although the prior art employs microRNA technology, it does not describe the same miRNAs used in the present invention for the detection of joint disorders in horses, nor does it anticipate the association of five miRNAs to obtain a panel of circulating microRNAs for early detection of tibiotarsal osteoarthritis in horses.

[023] A anterioridade US6589755B1, intitulada "Assay for quantifying arthritic conditions", se refere a fragmentos de proteína de baixo peso molecular que são produtos de degradação de COMP e têm um peso molecular de cerca de 14-33 quilodaltons e anticorpos policlonais e monoclonais para o novo fragmento de COMP e outros fragmentos de COMP conhecidos de molecular peso 67-80 kDa e 150-250 kDa, e fragmentos de trombospondina (coletivamente referidos como "ADP"), bem como um ensaio para medir o nível de ADP que compreende: (1) incubar uma amostra de fluido corporal, que foi obtida a partir de um paciente com artrite, em condições redutoras ou não redutoras; (2) incubar a amostra de fluido corporal com um anticorpo anti-ADP; e (3) medir o nível de anticorpo anti-ADP ligado na amostra de fluido corporal. Também é divulgado um ensaio para medir a proporção de ADP para KS como uma medida de diagnóstico de doença artrítica. Tendo em vista que a anterioridade não menciona o emprego dos cinco miRNA utilizados na presente invenção, a anterioridade não antecipa a matéria pleiteada.[023] Priority US6589755B1, entitled "Assay for quantifying arthritic conditions", refers to low molecular weight protein fragments that are degradation products of COMP and have a molecular weight of about 14-33 kilodaltons and polyclonal and monoclonal antibodies for the novel COMP fragment and other known COMP fragments of molecular weight 67-80 kDa and 150-250 kDa, and thrombospondin fragments (collectively referred to as "ADP"), as well as an assay to measure the level of ADP comprising : (1) incubate a sample of body fluid, which has been obtained from a patient with arthritis, under reducing or non-reducing conditions; (2) incubating the body fluid sample with an anti-ADP antibody; and (3) measuring the level of bound anti-ADP antibody in the body fluid sample. Also disclosed is an assay for measuring the ratio of ADP to KS as a diagnostic measure of arthritic disease. Considering that the prior art does not mention the use of the five miRNAs used in the present invention, the prior art does not anticipate the claimed matter.

[024] Ainda que estejam presentes no atual estado da técnica diversas anterioridades que se referem ao emprego de microRNAs como biomarcadores, especialmente para osteoartrite e de uso veterinário, nenhuma delas resolve o problema técnico resolvido pela presente invenção: a detecção de microRNAs circulantes e consequente diagnóstico in vitro de distúrbios articulares em equinos; o que corrobora com sua inventividade e contribuição ao campo técnico, uma vez que, em nenhuma das anterioridades são mencionados os miRNAs descritos na presente invenção como marcadores da doença.[024] Although several prior art are present in the current state of the art that refer to the use of microRNAs as biomarkers, especially for osteoarthritis and for veterinary use, none of them solves the technical problem solved by the present invention: the detection of circulating microRNAs and consequent in vitro diagnosis of joint disorders in horses; which corroborates his inventiveness and contribution to the technical field, since none of the previous articles mentions the miRNAs described in the present invention as markers of the disease.

OBJECTIVE OF THE INVENTION

[025] A presente invenção tem como objetivo disponibilizar um painel de miRNA a ser utilizado para detecção precoce de artropatias tibiotársicas em equinos, a partir da identificação de cinco miRNAs no sangue venoso equino.[025] The present invention aims to provide a miRNA panel to be used for early detection of tibiotarsal arthropathies in horses, based on the identification of five miRNAs in equine venous blood.

INVENTION

[026] A presente invenção descreve um painel com identificação de cinco miRNAs (eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, eca-miR-106b, e eca-miR-19b) no sangue venoso equino, cuja expressão aumentada corresponde ao diagnóstico precoce de equinos com osteoartrite tibiotársica. O painel com os cinco miRNAs identificados no sangue equino serve como biomarcador não-invasivo sistêmico e de detecção precoce para artropatias tibiotársicas, podendo ser clinicamente aplicável na triagem de pacientes.[026] The present invention describes a panel with the identification of five miRNAs (eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, eca-miR-106b, and eca-miR-19b) in the blood equine venous, whose increased expression corresponds to the early diagnosis of horses with tibiotarsal osteoarthritis. The panel with the five miRNAs identified in equine blood serves as a non-invasive systemic biomarker and for early detection of tibiotarsal arthropathies, and may be clinically applicable in the screening of patients.

ADVANTAGES OF THE INVENTION

[027] A presente invenção apresenta como principais vantagens:
 Disponibilizar uma solução alternativa e superior às existentes para diagnósticos por detecção de biomarcadores de distúrbios articulares em equinos, com processo mais rápido e de custo reduzido;
 Disponibilizar um painel de miRNA que possibilita a identificação de cinco miRNAs no sangue venoso equino, cuja expressão aumentada corresponde ao diagnóstico precoce de equinos com osteoartrite tibiotársica;
 Disponibilizar um painel de miRNA que possibilita a detecção dos biomarcadores para artropatias tibiotársicas de maneira não-invasiva, sistêmica e precocemente;
 Disponibilizar uma painel de miRNA que possibilita a detecção precoce das alterações da regulação da expressão gênica em artropatias de equinos, utilizando sangue venoso, antes mesmo do aparecimento de sinais radiográficos ou sinais de dor na articulação.[027] The present invention has the following main advantages:
 Provide an alternative and superior solution to the existing ones for diagnosis by detecting biomarkers of joint disorders in horses, with a faster process and reduced cost;
 Provide a miRNA panel that allows the identification of five miRNAs in equine venous blood, whose increased expression corresponds to the early diagnosis of horses with tibiotarsal osteoarthritis;
 Provide a miRNA panel that enables the detection of biomarkers for tibiotarsal arthropathies in a non-invasive, systemic and early manner;
 Provide a miRNA panel that enables the early detection of alterations in the regulation of gene expression in equine arthropathies, using venous blood, even before the appearance of radiographic signs or signs of pain in the joint.

DESCRIPTION OF THE BIOLOGICAL SEQUENCES

[028] A fim de possibilitar melhor o entendimento da presente invenção, serão feitas referências às sequências biológicas descritas a seguir:
 SEQ ID NO: 1 - eca-miR-451 compreendido pela sequência de nucleotídeos AAACCGUUACCAUUACUGUGUU
 SEQ ID NO: 2 - eca-miR-191 compreendido pela sequência de nucleotídeos CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG
 SEQ ID NO: 3 - eca-miR-486-5p compreendido pela sequência de nucleotídeos UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG  SEQ ID NO: 4 - eca-miR-106b compreendido pela sequência de nucleotídeos UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU
 SEQ ID NO: 5 - eca-miR-19b compreendido pela sequência de nucleotídeos UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA[028] In order to enable a better understanding of the present invention, references will be made to the biological sequences described below:
 SEQ ID NO: 1 - eca-miR-451 comprised by the nucleotide sequence AAACCGUUACCAUUACUGUGUU
 SEQ ID NO: 2 - eca-miR-191 comprised by the nucleotide sequence CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG
 SEQ ID NO: 3 - eca-miR-486-5p comprised of the nucleotide sequence UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG  SEQ ID NO: 4 - eca-miR-106b comprised of the nucleotide sequence UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU
 SEQ ID NO: 5 - eca-miR-19b comprised of the nucleotide sequence UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA

DESCRIPTION OF FIGURES

[029] A fim de possibilitar melhor o entendimento da presente invenção, serão feitas referências à figura descrita a seguir:
 FIG. 1: Média da expressão (log2) de cada miRNA, de acordo com o grupo (osteoartrite e controle) e amostra (sangue venoso e líquido sinovial).[029] In order to enable a better understanding of the present invention, references will be made to the figure described below:
 FIG. 1: Mean expression (log2) of each miRNA, according to the group (osteoarthritis and control) and sample (venous blood and synovial fluid).

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[030] A presente invenção refere-se a um painel com identificação de cinco miRNAs no sangue venoso equino, cuja expressão aumentada corresponde ao diagnóstico precoce de equinos com osteoartrite tibiotársica, e que se constitui de:
 eca-miR-451 compreendido pela SEQ ID NO: 1, ID 20513943, MIMAT0013041, Cromossomo de origem chr11 (42750442 até 42750463, -);
 eca-miR-191 compreendido pela SEQ ID NO: 2, ID 20513981, MIMAT0013079, Cromossomo de origem chr16 (38001165 até 38001187, +);
 eca-miR-486-5p compreendido pela SEQ ID NO: 3, ID 20514089, MIMAT0013186, Cromossomo de origem chr27 (3709572 até 3709593, +);
 eca-miR-106b compreendido pela SEQ ID NO: 4, ID 20513956, MIMAT0013054, Cromossomo de origem chr13 (8034729 até 8034749, -);
 eca-miR-19b compreendido pela SEQ ID NO: 5, ID 20513989, MIMAT0013087, Cromossomo de origem chr17 (61793043 até 61793065, +).[030] The present invention refers to a panel with the identification of five miRNAs in equine venous blood, whose increased expression corresponds to the early diagnosis of horses with tibiotarsal osteoarthritis, and which consists of:
 eca-miR-451 comprised by SEQ ID NO: 1, ID 20513943, MIMAT0013041, Origin chromosome chr11 (42750442 to 42750463, -);
 eca-miR-191 comprised of SEQ ID NO: 2, ID 20513981, MIMAT0013079, Origin chromosome chr16 (38001165 to 38001187, +);
 eca-miR-486-5p comprised of SEQ ID NO: 3, ID 20514089, MIMAT0013186, Origin chromosome chr27 (3709572 to 3709593, +);
 eca-miR-106b comprised of SEQ ID NO: 4, ID 20513956, MIMAT0013054, Origin chromosome chr13 (8034729 to 8034749, -);
 eca-miR-19b comprised of SEQ ID NO: 5, ID 20513989, MIMAT0013087, Origin chromosome chr17 (61793043 to 61793065, +).

[031] A seguir, são descritas as etapas do desenvolvimento do painel de microRNAs circulantes pleiteado.[031] Next, the stages of development of the panel of circulating microRNAs claimed are described.

[032] Para o ensaio, foram utilizados seis equinos atletas da raça Quarto de Milha. Os animais foram divididos em dois grupos: Grupo controle (GC) - composto por animais sem qualquer enfermidade ósteo-articular, e Grupo osteoartrite (OA) - composto por animais diagnosticados com osteoartrite társica traumática não experimental. Para a seleção, os equinos foram submetidos a exame clínico consistindo em exame visual para detectar a presença de claudicação, trauma, anormalidades de pele e efusão articular. Exames complementares como termografia, radiografia, e ultrassonografia das articulações tibiotársicas foram realizados para avaliar a integridade articular e óssea, ou presença de sinais de osteoartrite.[032] For the test, six quarter horse athletes were used. The animals were divided into two groups: Control Group (CG) - composed of animals without any osteo-articular disease, and Osteoarthritis Group (OA) - composed of animals diagnosed with non-experimental traumatic tarsal osteoarthritis. For selection, the horses underwent a clinical examination consisting of a visual examination to detect the presence of lameness, trauma, skin abnormalities and joint effusion. Complementary tests such as thermography, radiography, and ultrasonography of the tibiotarsal joints were performed to assess joint and bone integrity, or the presence of signs of osteoarthritis.

[033] Através de venopunção da jugular, o tubo com sangue venoso foi imediatamente centrifugado, durante 10 minutos. O anel leucocitário com volume estimado de 500μL, foi coletado com micropipeta e ponteira universal 100-1000 μL com filtro e aliquotado em tubo juntamente com 1000 μL de RNAlater (Ambion® ). Posteriormente foi armazenado em freezer -80ºC até o momento da extração do miRNA. Subsequentemente, o equino foi contido em tronco de contenção para que fosse realizada a tricotomia e antissepsia na região lateral da articulação tibiotársica. O equino foi sedado através da administração de detomidina na dose de 10 μg/Kg/IV. Com o animal sedado, utilizando material estéril, a amostra de líquido sinovial foi colhida através de artrocentese utilizando agulha descartável hipodérmica 25 x 0,8 mm para acessar a bursa superior da cápsula articular, através do acesso latero-plantar entre o calcâneo e o maléolo lateral da tíbia. O líquido sinovial foi aspirado com seringa estéril de 5 mL. O líquido sinovial foi imediatamente alocado em tubo de coleta à vácuo com EDTA K3 4 ml. Posteriormente 500 μl de líquido sinovial foram aliquotados em microtubos (DNAse e RNAse free) com 1000 μl de RNAlater (Ambion® ), e foi armazenado em freezer -80ºC até o momento da extração do miRNA.[033] Through jugular venipuncture, the tube with venous blood was immediately centrifuged for 10 minutes. The leukocyte ring with an estimated volume of 500μL was collected with a micropipette and a 100-1000 μL universal tip with a filter and aliquoted in a tube along with 1000 μL of RNAlater (Ambion®). Subsequently, it was stored in a -80ºC freezer until the moment of miRNA extraction. Subsequently, the horse was contained in a containment trunk so that trichotomy and antisepsis could be performed in the lateral region of the tibiotarsal joint. The horse was sedated by administering detomidine at a dose of 10 μg/Kg/IV. With the animal sedated, using sterile material, the synovial fluid sample was collected through arthrocentesis using a 25 x 0.8 mm disposable hypodermic needle to access the superior bursa of the joint capsule, through the lateral-plantar access between the calcaneus and the malleolus side of the tibia. The synovial fluid was aspirated with a sterile 5 mL syringe. The synovial fluid was immediately placed in a vacuum collection tube with 4 ml EDTA K3. Subsequently, 500 μl of synovial fluid were aliquoted into microtubes (DNAse and RNAse free) with 1000 μl of RNAlater (Ambion® ), and stored in a freezer at -80ºC until the moment of miRNA extraction.

[034] As amostras, que permaneceram congeladas a -80ºC até o momento da extração, foram descongeladas e centrifugadas para remoção do RNA com micropipeta e ponteira universal. Os miRNAs foram extraídos das amostras utilizando uma adaptação do kit “Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK Filters Using TRI Reagent® (Thermo Fisher Scientific® )”. Em seguida as amostras de RNA foram concentradas no equipamento Eppendorf Concentrator 5301 conforme descrito em HERMANN et al. (2019).[034] The samples, which remained frozen at -80ºC until the moment of extraction, were thawed and centrifuged to remove the RNA with a micropipette and universal tip. The miRNAs were extracted from the samples using an adaptation of the kit “Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK Filters Using TRI Reagent® (Thermo Fisher Scientific® )”. Then the RNA samples were concentrated in the Eppendorf Concentrator 5301 equipment as described in HERMANN et al. (2019).

[035] O kit utilizado foi o “Affymetrix® miRNA 4.1 Array Strip”, realizado segundo as recomendações do fabricante. Resumidamente, as amostras foram marcadas com o kit “FlashTag® Biotin HSR RNA Labeling Kits”, hibridizadas com o kit “GeneAtlas® Hybridization, Wash, and Stain Kit for miRNA Arrays” e escaneadas no equipamento “GeneAtlas Affymetrix® ”.[035] The kit used was the “Affymetrix® miRNA 4.1 Array Strip”, performed according to the manufacturer's recommendations. Briefly, the samples were labeled with the “FlashTag® Biotin HSR RNA Labeling Kits” kit, hybridized with the “GeneAtlas® Hybridization, Wash, and Stain Kit for miRNA Arrays” kit and scanned in the “GeneAtlas Affymetrix®” equipment.

[036] Dentre os 360 miRNAs presentes no strip, destacaram-se cinco miRNAs diferencialmente expressos (eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, eca-miR-106b, e ecamiR-19b), os quais são compreendidos no painel pleiteado, para que possam ser utilizados na detecção precoce da osteoartrite tibiotársica em equinos, visto que a expressão desses miRNAs estão aumentadas no sangue venoso e no líquido sinovial dos equinos do grupo osteoartrite da análise, conforme observado na Figura 1 e na Tabela 1 (Fig. 1).

[036] Among the 360 miRNAs present in the strip, five differentially expressed miRNAs stood out (eca-miR-451, eca-miR-191, eca-miR-486-5p, eca-miR-106b, and ecamiR-19b) , which are included in the claimed panel, so that they can be used in the early detection of tibiotarsal osteoarthritis in horses, since the expression of these miRNAs are increased in venous blood and synovial fluid of horses in the osteoarthritis group of the analysis, as observed in Figure 1 and Table 1 (Fig. 1).

[037] Para o desenvolvimento do painel de microRNAs foi utilizado um equipamento já disponível comercialmente (microarranjo - Affymetrix), o qual viabilizou além de permitir a construção do dispositivo, viabilizou seu uso como ferramenta de diagnóstico precoce para osteoartrite tibiotársica em equinos[037] For the development of the microRNAs panel, commercially available equipment was used (microarray - Affymetrix), which enabled, in addition to allowing the construction of the device, its use as an early diagnosis tool for tibiotarsal osteoarthritis in horses

Claims

PANEL OF CIRCULATING microRNAs FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES characterized by being constituted of five microRNAs:
 eca-miR-451 comprised of SEQ ID NO: 1;
 eca-miR-191 comprised of SEQ ID NO: 2;
 eca-miR-486-5p comprised by SEQ ID NO: 3;
 eca-miR-106b comprised of SEQ ID NO: 4;
 eca-miR-19b understood by SEQ ID NO: 5.

USE OF PANEL OF CIRCULATING microRNAs FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES, as defined in claim 1, characterized in that it is for detecting marker microRNAs: eca-miR-451, comprised by SEQ ID NO: 1; ecamiR-191, comprised of SEQ ID NO: 2; eca-miR-486-5p, comprised of SEQ ID NO: 3; eca-miR-106b, comprised of SEQ ID NO: 4 and ekamiR-19b, comprised of SEQ ID NO: 5, in equine venous blood.

USE OF PANEL OF CIRCULATING microRNAs FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES, as defined in claim 1, characterized in that it is for the production of strips, kits or devices for diagnosing tibiotarsal osteoarthritis in horses.

USE OF A CIRCULATING microRNA PANEL FOR EARLY DETECTION OF TIBIOTARSAL OSTEOARTHRITIS IN EQUINES, according to claim 3, characterized by the detection of target microRNAs taking place from samples of equine venous blood.