BR102021020613A2 - Método de investigação proteômica em amostra para diagnóstico da rabdomiólise e kits para realização do mesmo - Google Patents

Abstract

A presente descrição apresenta métodos e kits utilizados no diagnóstico da disposição para desenvolvimento de rabdomiólise. Para realização da invenção, uma amostra biológica é retirada de um indivíduo investigado, como uma amostra de sangue ou urina, sendo preferencialmente urina. A investigação é conduzida a partir da detecção e quantificação proteínas na referida amostra, proteínas essas selecionadas de um painel que compreende: catepsina H (CTSH); cadeia de colágeno alfa-1 (I) (CO1A1); proteína 1 de interação a fosfatidilinositol-3-quinase (PIK3IP1); beta-defensina 1 (DEFB1); integrina beta-1 (ITGB1); proteína central de Brevican (BCAN); um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10C (TNFRSF10C); gama-glutamilciclotransferase (GGCT); Glutaredoxina (GLRX), Flavina redutase (NADPFI) (BLVRB); Desmocollin-2 (DSC2); Cadeia de colágeno alfa-1 (l)(COL1A1); Cotransportador de sódio / nucleosídeo 1 (S28A1); Uteroglobina (UTER); Subunidade alfa de hemoglobina (HBA); Hemicentina-1 (HMCN1); Membro da família CCN 3 (CCN3); Proteína 7 da doença de Parkinson (PARK7); Molécula de adesão intercelular 2 (ICAM2); Proteína 1 relacionada a Ly-6 / uPAR secretada (SLURP1); N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (PGRP2);Catepsina Z (CATZ); Proteína 5 de ligação a ácidos graxos (FABP5); Atractin (ATRN); Peptidil-prolil cis-trans isomerase A (PPIA) e proteína de ligação de ácidos graxos do coração (FABP3).

Description

MÉTODO DE INVESTIGAÇÃO PROTEÔMICA EM AMOSTRA PARA DIAGNÓSTICO DA RABDOMIÓLISE E KITS PARA REALIZAÇÃO DO MESMO CAMPO DA DESCRIÇÃO

[0001] A presente descrição é do campo de investigação ou análise de materiais por métodos específicos dirigida à material biológico, envolvendo proteínas, peptídeos ou aminoácidos.

FUNDAMENTOS DA DESCRIÇÃO

[0002] Na área da medicina a investigação e diagnóstico de doenças é etapa crucial na escolha do tratamento adequado e mitigação da patologia. Por consequência, o uso de métodos de análise bioquímica não invasivos, sensíveis e eficazes tornam-se excelentes instrumentos de identificação.

[0003] A rabdomiólise por esforço físico (RE) pode ser observada em atletas de alto desempenho e em militares, submetidos a exercícios intensos, repetitivos e prolongados. A RE é caracterizada por envolver danos aos músculos estriados com liberação de componentes celulares para o fluido extracelular e corrente sanguínea causando desequilíbrio à homeostase do organismo.

[0004] Em razão do extravasamento celular, proteínas, eletrólitos e enzimas mostram-se aumentados na circulação sanguínea. Dessa forma, é possível investigar biomarcadores envolvidos na fisiopatologia da doença. Na clínica, a investigação de níveis sanguíneos de creatina cinase (CK do inglês creatine kinase), detecção de mioglobinúria e avaliação da função renal são empregados para o diagnóstico da rabdomiólise.

[0005] A fim de identificar e quantificar a progressão da rabdomiólise sob uma perspectiva atual, o estudo da proteômica, metabolômica e genômica surgem como estratégias na investigação de marcadores específicos, na avaliação da extensão do dano tecidual causado e, também, na detecção de pré-disposições genéticas.

ESTADO DA TÉCNICA

[0006] O trabalho de Mohan e colaboradores (2019, Pharmacognosy Magazine, 15, S359-S365.) avaliou o potencial de intoxicação muscular causado pelo Chata edulis, que é uma planta capaz de induzir à Rabdomiólise. A detecção da proteína HFABP nas amostras de sangue de ratos foi associada aos danos cardíacos decorrentes da Rabdomiólise induzida. Não é prevista a utilização dessa proteína HFABP como marcador em amostras de sangue ou urina humana.

[0007] Sampson e colaboradores (2013, Expert review of proteomics, 11, 91-106.) investigaram a literatura a fim de evidenciar a proteômica e metabolômica da urina, correlacionando à realização de atividade física em diferentes graus de intensidade. Dentre as diversas substâncias citadas destacaram-se a proteína HFABP e fragmentos de colágeno tipo 1, entretanto sem oferecer interpretação relacionada à Rabdomiólise.

[0008] Balfoussia e colaboradores (2013, Journal of Proteomics, 98, 1-14) reportaram um estudo proteômico no plasma de atletas, a fim de avaliar as alterações metabólicas ocasionadas pelo estresse físico extremo. Trinta proteínas foram apontadas como indicativo de inflamação. Concluiu-se que o estresse físico prolongado altera a composição de proteínas circulantes no organismo e que, por sua vez, podem atuar como biomarcadores de doenças relacionadas à alta carga de esforço físico. As proteínas alvo do estudo não estão incluídas no escopo do presente pedido.

[0009] A publicação de Pereira e colaboradores (2019, Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 113, 294-298.) relataram um caso de Rabdomiólise após treinamento militar em indivíduo do sexo masculino. Para a metodologia avaliativa das alterações plasmáticas foram explorados biomarcadores tradicionalmente associados ao desenvolvimento de Rabdomiólise, sendo estes CK e interleucinas (IL). Foi discutida a associação destes marcadores com quadros clínicos de disfunção microvascular e Rabdomiólise.

[0010] Um estudo proteômico a fim de identificar marcadores de distrofia muscular foi realizado por Gargan e colaboradores (2020, Molecular omics, 16, 268-278). A investigação foi conduzida em urina de camundongos modelo de distrofia e comparada ao seu perfil proteômico (perfil disponibilizado na plataforma Open Science Framework- OSF, em https://osf.io/). É notória alguma similaridade entre as distrofias musculares e a Rabdomiólise em função do quadro clínico desencadeado e a presença de alguns marcadores. Não obstante, são doenças que possuem causa e perfil bioquímico distintos.

[0011] Bacha e colaboradores (2016, Dissertação Mestrado em Ciências Farmacêuticas, UFAM) estudaram polimorfismos genéticos e alterações bioquímicas associados à Rabdomiólise em militares. As alterações nos níveis séricos de CK e eletrólitos superiores aos limites basais ratificaram a presença de polimorfismo nos genes de interesse, indicando que estes poderiam influenciar nos danos causados ao tecido muscular.

[0012] Quintas e colaboradores (2020, Metabolomics, 16, art. 45) analisaram a metabolômica da urina de jogadores profissionais de futebol. O trabalho evidenciou a relação entre as alterações no perfil metabólico e o desenvolvimento de lesões musculares.

[0013] No documento de patente EP2761289B1 é revelado um método de detecção de biomarcadores em amostra biológica (podendo ser uma amostra de sangue, urina, soro ou plasma), e avaliação do risco de um Evento Cardiovascular (CV). A Catepsina H é exibida no painel de marcadores proposto na anterioridade como preditiva à Evento Cardiovascular. O método revelado não é referente ao diagnóstico de Rabdomiólise ou danos musculoesqueléticos decorrentes de exercício físico.

[0014] O estado da técnica aponta diversos documentos que podem ser relacionados ao diagnóstico da Rabdomiólise, quadro clínico de lesões musculares, bem como os biomarcadores envolvidos nas investigações de material biológico. Isto posto, nota-se que não é revelado no estado da técnica um método que seja capaz de prever o diagnóstico precoce da RE, compreendendo pelo menos dois biomarcadores do painel de biomarcadores apresentado no presente pedido, sendo estes: catepsina H (CTSH); cadeia de colágeno alfa-1 (I) (CO1A1); proteína 1 de interação a fosfatidilinositol-3-quinase (PIK3IP1); beta-defensina 1 (DEFB1); integrina beta-1 (ITGB1); proteína central de Brevican (BCAN); membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10C (TNFRSF10C); gama-glutamilciclotransferase (GGCT); Glutaredoxina (GLRX1); Flavina redutase (NADPH) (BLVRB); Desmocollin-2 (DSC2); Cotransportador de sódio / nucleosídeo 1 (S28A1); Uteroglobina (LITER); Subunidade alfa de hemoglobina (HBA); Hemicentina-1 (HMCN1); Membro da família CCN 3 (CCN3); Proteína 7 da doença de Parkinson (PARK7); Molécula de adesão intercelular 2 (ICAM2); Proteína 1 relacionada a Ly-6 / uPAR secretada (SLURP1); N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (PGRP2); Catepsina Z (CATZ); Proteína 5 de ligação a ácidos graxos (FABP5); Atractin (ATRN); Peptidil-prolil cis-trans isomerase A (PPIA) e proteína de ligação de ácidos graxos do coração (FABP3).

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0015] É um dos objetivos da presente descrição revelar um método de investigação proteômica para avaliação de disposição para desenvolvimento da RE, uma síndrome clínica que carece tanto de métodos de diagnóstico específicos quanto de marcadores proteicos que evidenciem a antecipação e progressão da doença e que permitam intervenções anteriores aos estágios críticos da doença.

[0016] Os objetivos da presente descrição são alcançados pela revelação de um painel de biomarcadores proteicos, que compreende: catepsina H (CTSH); cadeia de colágeno alfa-1 (I) (CO1A1); proteína 1 de interação a fosfatidilinositol-3-quinase (PIK3IP1); beta-defensina 1 (DEFB1); integrina beta-1 (ITGB1); proteína central de Brevican (BCAN); um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10C (TNFRSF10C); gama-glutamilciclotransferase (GGCT); Glutaredoxina (GLRX), Flavina redutase (NADPH) (BLVRB); Desmocollin-2 (DSC2); Cadeia de colágeno alfa-1 (l)(COL1A1); Cotransportador de sódio / nucleosídeo 1 (S28A1); Uteroglobina (UTER); Subunidade alfa de hemoglobina (HBA); Hemicentina-1 (HMCN1); Membro da família CCN 3 (CCN3); Proteína 7 da doença de Parkinson (PARK7); Molécula de adesão intercelular 2 (ICAM2); Proteína 1 relacionada a Ly-6 / uPAR secretada (SLURP1); N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (PGRP2); Catepsina Z (CATZ); Proteína 5 de ligação a ácidos graxos (FABP5); Atractin (ATRN); Peptidil-prolil cis-trans isomerase A (PPIA) e proteína de ligação de ácidos graxos do coração (FABPH ou FABP3); em que, dada uma amostra biológica retirada de um indivíduo, a detecção de diferenças significativas na abundância relativa de pelo menos dois dos biomarcadores da referida amostra em relação a um conjunto de valores de referência (e.g., valor-p < 0.05 em relação a valores de amostras de referência) indica a disposição para desenvolvimento da RE.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017] A presente invenção encontra-se ilustrada nas modalidades representadas em figuras, conforme brevemente descritas a seguir.

[0018] A figura 1 é um fluxograma esquemático de uma modalidade do presente método, para acompanhamento de progressão de risco da RE a partir da análise de uma amostra biológica.

[0019] As figuras 2A a 2H, 3A a 3H e 4A a 4I são uma série de gráficos com as curvas características de operação do receptor (ROC) para avaliação da performance do sistema de classificação binário proposto para os biomarcadores identificados, de acordo com o método da presente descrição, em amostras biológicas de um grupo de indivíduos antes de após serem submetidos a atividades físicas extenuantes.

[0020] A figura 5 é um histograma com resultados de um ensaio proteômico em amostras biológicas de um grupo de indivíduos antes de após serem submetidos a atividades físicas extenuantes, identificando graficamente proteínas reguladas diferencialmente, superexpressas e subexpressas.

[0021] A figura 6 mostra a análise dos componentes principais (PCA) do total de proteínas identificadas e quantificadas em amostras biológicas de um grupo de indivíduos antes de após serem submetidos a atividades físicas extenuantes.

[0022] As figuras 7A a 7D são uma série de gráficos que quantificam os níveis dos marcadores clássicos de rabdomiólise do estado da técnica (LDH, AST, CKMB e CK) em amostras biológicas de um grupo de indivíduos antes de após serem submetidos a atividades físicas extenuantes.

[0023] A figura 8 é um gráfico de dispersão Volcano Plot mostrando proteínas reguladas diferencialmente em amostras biológicas de um grupo de indivíduos antes de após serem submetidos a atividades físicas extenuantes.

[0024] As figuras 9 e 10 são gráficos de evolução do proteoma urinário de um paciente internado em decorrência de RE, após realizar treinamento militar, apresentando dados desde a coleta pré-treinamento, do período de internação e do momento da alta hospitalar.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0025] O objeto aqui revelado trata-se de um método de investigação proteômica em amostra para diagnosticar disposição para desenvolvimento de rabdomiólise em indivíduos submetidos a exercícios físicos extenuantes, tais como aqueles praticados em ambiente militar, em treinamentos de alto rendimento de modalidades esportivas e em condições de competição. O método consiste na detecção de variações significativas na abundância relativa de um painel de biomarcadores na referida amostra.

[0026] Para o escopo da presente descrição, entende-se por painel de biomarcadores um conjunto de pelo menos dois biomarcadores. Um método diagnóstico que investigue pelo menos dois biomarcadores utilizará um painel de marcadores.

[0027] De acordo com o método da presente invenção, é revelado um painel de biomarcadores que compreende: catepsina H (CTSH); cadeia de colágeno alfa-1 (I) (CO1A1); proteína 1 de interação a fosfatidilinositol-3-quinase (PIK3IP1); beta-defensina 1 (DEFB1); integrina beta-1 (ITGB1); proteína central de Brevican (BCAN); um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10C (TNFRSF10C); gama-glutamilciclotransferase (GGCT); Glutaredoxina (GLRX1); Flavina redutase (NADPH) (BLVRB); Desmocollin-2 (DSC2); Cotransportador de sódio / nucleosídeo 1 (S28A1); Uteroglobina (UTER); Subunidade alfa de hemoglobina (HBA); Hemicentina-1 (HMCN1); Membro da família CCN 3 (CCN3); Proteína 7 da doença de Parkinson (PARK7); Molécula de adesão intercelular 2 (ICAM2); Proteína 1 relacionada a Ly-6 / uPAR secretada (SLURP1); N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (PGRP2); Catepsina Z (CATZ); Proteína 5 de ligação a ácidos graxos (FABP5); Atractin (ATRN); Peptidil-prolil cis-trans isomerase A (PPIA) e proteína de ligação de ácidos graxos do coração (FABP3).

[0028] Em uma modalidade, a presente invenção contempla um perfil de expressão de assinatura compreendendo um painel de biomarcadores de proteína urinária, em que o referido perfil é usado para diagnosticar RE. Em uma modalidade, o painel de biomarcadores compreende uma pluralidade de proteínas urinárias superexpressas. Em uma modalidade, o painel de biomarcadores compreende uma pluralidade de proteínas urinárias subexpressas. Em uma modalidade, a pluralidade de proteínas urinárias superexpressas é selecionada a partir do grupo que consiste em CTSH, GGCT, PGRP2, HBA, PARK7, CATZ, FABP5 e PPIA. Em uma modalidade, a pluralidade de proteínas urinárias subexpressas é selecionada a partir do grupo que consiste em PIK3IP1, DEFB1, ITGB1, BCAN, TNFRSF10C, GLRX1, NADPH, BLVRB, DSC2, C01A1, S28A1, UTER, HMCN1, CCN3, ICAM2, SLURP1 e ATRN.

[0029] Em uma modalidade do presente método para avaliação do risco de progressão para rabdomiólise em um indivíduo, é necessário que pelo menos dois marcadores do referido painel, independentemente do número de marcadores avaliados, apresentem variações significativas na abundância relativa quando comparados a valores de referência. Logo, em uma avaliação que investiga dois, três, quatro, cinco, seis, ou mais proteínas do painel descrito de marcadores deve-se apresentar pelo menos duas alterações significativas para que seja considerado um quadro de saúde de risco para progressão ou desenvolvimento de RE.

[0030] Entendem-se os termos “atividade física extenuante”, “exercício físico intenso”, "treinamento físico extenuante" e suas variantes óbvias, como sendo quaisquer atividades físicas classificadas, seja através de definições técnicas ou de percepções individuais do executante da atividade, como aquelas que provocam desconforto físico e respiratório, devido a atividades motora desgastantes.

[0031] Em conformidade com definição anterior, as atividades físicas consideradas neste documento referem-se a treinamentos físicos de alto rendimento, sejam eles esportivos ou militares, participações em competições esportivas e/ou militares, incluindo todas as modalidades de maratonas, treinamentos físicos baseados em exercícios de muita intensidade, tal como CrossFit e semelhantes.

[0032] Em decorrência do caráter, por vezes individual e subjetivo, dessa interpretação, também são consideradas as atividades tais como subida de escadas, pular, jogar recreativamente, banhar-se/nadar recreativamente, uma vez que podem configurar exercício intenso ou excessivo dentro do escopo aplicado.

[0033] Atividades físicas praticadas em condições climáticas adversas, tais como em altas ou baixas temperaturas, junto à inadequada reposição hidroeletrolítica e longos períodos, também provocam efeitos similares aos de atividade física extenuante, sendo, portanto, incluídas nesta definição.

[0034] O conceito de limiares de diagnóstico adequados pode ser abordado de várias maneiras, dependendo do estudo em questão. Por exemplo, um limiar de diagnóstico recomendado para o diagnóstico de infarto agudo do miocárdio usando troponina cardíaca é o percentil 97,5 da concentração observada em uma população normal. Outro método pode ser olhar para amostras em série do mesmo paciente, onde um resultado de "linha de base" anterior é usado para monitorar as mudanças temporais em um nível de biomarcador.

[0035] Estudos populacionais também podem ser usados para selecionar um limite de decisão. O uso de curvas características de operação do receptor (do anglicanismo Receiver Operating Characteristic, "ROC") surgiu do campo de teoria de detecção de sinal desenvolvido durante a Segunda Guerra Mundial para a análise de imagens de radar, e a análise de ROC são frequentemente usadas para selecionar um limiar capaz de distinguir melhor uma subpopulação "doente" de uma "subpopulação sem doença”. Um falso positivo, nesse caso, ocorre quando o teste da pessoa é positivo, mas na verdade não tem a doença. Um falso negativo, por outro lado, ocorre quando a pessoa dá negativo, sugerindo que ela é saudável, quando na verdade ela tem a doença. Para desenhar uma curva ROC, a taxa de verdadeiro positivo (TVP) e a taxa de falso positivo (TVP) são determinadas conforme o limite de decisão é variado continuamente. Uma vez que TVP é equivalente à sensibilidade e TFP é igual a 1-especificidade, o gráfico ROC é algumas vezes chamado de gráfico de sensibilidade vs (1-especificidade). Um teste perfeito terá uma área sob a curva ROC de 1,0; um teste aleatório terá uma área de 0,5. Um limite é selecionado para fornecer um nível aceitável de especificidade e sensibilidade.

[0036] Neste contexto, "doente" se refere a uma população com uma característica (a presença de uma doença ou condição ou a ocorrência de algum resultado) e "não doente" se destina a se referir a uma população sem a característica. Embora um único limite de decisão seja a aplicação mais simples de tal método, vários limites de decisão podem ser usados. Por exemplo, abaixo de um primeiro limiar, a ausência de doença pode ser atribuída com uma confiança relativamente alta e, acima de um segundo limiar, a presença de doença também pode ser atribuída com uma confiança relativamente alta. Entre os dois limites pode ser considerado indeterminado. Isso foi feito para ser exemplar apenas na natureza.

[0037] Além das comparações de limiares, outros métodos para correlacionar os resultados do ensaio a uma classificação de paciente (ocorrência ou não ocorrência de doença, probabilidade de um resultado, etc) incluem árvores de decisão, conjuntos de regras, métodos bayesianos e métodos de rede neural. Esses métodos podem produzir valores de probabilidade que representam o grau em que um sujeito pertence a uma classificação de uma pluralidade de classificações.

[0038] As medidas de precisão do teste podem ser obtidas conforme descrito em Fischer et al., Intensive Care Med. 29: 1043-51, 2003, e usadas para determinar a eficácia de um determinado biomarcador. Essas medidas incluem sensibilidade e especificidade, valores preditivos, razões de verossimilhança, odds ratios de diagnóstico e áreas da curva ROC. A área sob a curva ("AUC") de um gráfico ROC é igual á probabilidade de que um classificador classifique uma instância positiva escolhida aleatoriamente mais alta do que uma negativa escolhida aleatoriamente. A área sob a curva ROC pode ser considerada equivalente ao teste U de Mann-Whitney, que testa a diferença mediana entre os escores obtidos nos dois grupos considerados se os grupos são de dados contínuos, ou ao teste de Wilcoxon de postos.

[0039] Como discutido acima, os testes adequados podem exibir um ou mais dos seguintes resultados nessas várias medidas: uma especificidade maior do que 0,5, de preferência pelo menos 0,6, mais preferencialmente pelo menos 0,7, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,8, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,9 e mais preferencialmente pelo menos 0,95, com uma sensibilidade correspondente maior que 0,2, preferencialmente maior que 0,3, mais preferencialmente maior que 0,4, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,5, ainda mais preferencialmente 0,6, ainda mais preferencialmente maior que 0,7, ainda mais preferencialmente maior do que 0,8, mais preferencialmente maior do que 0,9, e mais preferencialmente maior do que 0,95; uma sensibilidade superior a 0,5, de preferência pelo menos 0,6, mais preferencialmente pelo menos 0,7, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,8, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,9 e mais preferencialmente pelo menos 0,95, com uma especificidade correspondente maior do que 0,2, de preferência maior do que 0,3, mais preferencialmente maior do que 0,4, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,5, ainda mais preferencialmente 0,6, ainda mais preferencialmente maior do que 0,7, ainda mais preferencialmente maior do que 0,8, mais preferencialmente maior do que 0,9, e mais preferencialmente maior do que 0,95; sensibilidade de pelo menos 75%, combinada com especificidade de pelo menos 75%; uma área de curva ROC maior do que 0,5, de preferência pelo menos 0,6, mais preferencialmente 0,7, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,8, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,9, e mais preferencialmente pelo menos 0,95; uma razão de probabilidade diferente de 1, de preferência pelo menos cerca de 2 ou mais ou cerca de 0,5 ou menos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 3 ou mais ou cerca de 0,33 ou menos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 4 ou mais ou cerca de 0,25 ou menos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 5 ou mais ou cerca de 0,2 ou menos, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 10 ou mais ou cerca de 0,1 ou menos; uma razão de verossimilhança positiva (calculada como sensibilidade / (1-especificidade)) maior que 1, pelo menos 2, mais preferencialmente pelo menos 3, ainda mais preferencialmente pelo menos 5, e mais preferencialmente pelo menos 10; e/ou uma razão de verossimilhança negativa (calculada como (1-sensibilidade) / especificidade) menor que 1, menor ou igual a 0,5, mais preferencialmente menor ou igual a 0,3, e mais preferencialmente menor ou igual a 0,1 uma razão de verossimilhança positiva (calculada como sensibilidade / (1-especificidade)) maior que 1, pelo menos 2, mais preferencialmente pelo menos 3, ainda mais preferencialmente pelo menos 5, e mais preferencialmente pelo menos 10; e ou uma razão de verossimilhança negativa (calculada como (1-sensibilidade) / especificidade) menor que 1, menor ou igual a 0,5, mais preferencialmente menor ou igual a 0,3, e mais preferencialmente menor ou igual a 0,1 uma razão de verossimilhança positiva (calculada como sensibilidade / (1-especificidade)) maior que 1, pelo menos 2, mais preferencialmente pelo menos 3, ainda mais preferencialmente pelo menos 5, e mais preferencialmente pelo menos 10; e/ou uma razão de verossimilhança negativa (calculada como (1-sensibilidade) / especificidade) menor que 1, menor ou igual a 0,5, mais preferencialmente menor ou igual a 0,3, e mais preferencialmente menor ou igual a 0,1.

[0040] Embora alguns marcadores apresentados no painel do presente método, quando considerados isoladamente, tenham associação conhecida com eventos cardiovasculares ou condições genéticas relativas à condução muscular, o painel de biomarcadores descrito neste documento, e também o agrupamento em subconjuntos de pelo menos dois biomarcadores, é indicado especificamente como painel de marcadores para predição da RE.

[0041] O presente método, além de fornecer prognóstico de risco de desenvolvimento de RE com base nas medições de proteínas que constituem o referido painel, também permite um mapeamento dos efeitos de diferentes graus de exercício físico na saúde do indivíduo avaliado durante prática de atividade física, permitindo a criação de programas de treinamento físico que previnam o desenvolvimento da RE, bem como de programas de treinamento físico personalizado. Logo, o presente método diagnóstico contribui para o desenvolvimento de estratégias de treinamento que contemplem a prevenção da RE e de seus desfechos graves tais como o prejuízo permanente das funções renais ou o óbito.

[0042] Em uma modalidade do método, uma amostra biológica é incubada com um anticorpo ou um fragmento específico de proteína que se liga especificamente a uma proteína ou fragmento peptídico de uma proteína do referido painel para diagnóstico, sob condições que permitem que o anticorpo ou fragmento específico de proteína forme um complexo com (a) um fragmento peptídico de uma proteína do referido painel; ou (b) o complexo covalente ou não covalente de pelo menos uma molécula selecionada do grupo que compreende: fragmentos peptídicos de uma proteína do referido painel; e, proteínas intacta do referido painel. Segue-se a etapa de detecção e medição do complexo formado. De acordo com esta modalidade do método diagnóstico, a presença e o nível de produtos de modificação das proteínas do painel em uma amostra biológica são detectados e quantificados por meio de métodos conhecidos, sejam métodos colorimétricos ou métodos fluorimétricos ou quimioluminescentes, por exemplo, por um kit/ensaio de imunoadsorção enzimática tipo ELISA.

[0043] O estado da técnica compreende uma variedade de configurações de espectrômetros de massa, que pode ser usada para detectar valores de biomarcadores. Em geral, um espectrômetro de massa tem os seguintes componentes principais: uma entrada de amostra, uma fonte de íons, um analisador de massa, um detector, um sistema de vácuo e um sistema de controle de instrumento e um sistema de dados. A diferença na entrada da amostra, na fonte de íons e no analisador de massa geralmente define o tipo de instrumento e suas capacidades. Por exemplo, uma entrada pode ser uma fonte de cromatografia líquida de coluna capilar ou pode ser uma sonda direta ou indireta, tal como usado na dessorção a laser assistida por matriz. Fontes de íons comuns são, por exemplo, electrospray, incluindo nanospray e microspray ou dessorção a laser assistida por matriz. Analisadores de massa comuns incluem um filtro de massa quadrupolo, analisador de massa de armadilha de íons e analisador de massa de tempo de voo.

[0044] Em uma modalidade, biomarcadores proteicos e valores de biomarcadores podem ser detectados e medidos por: Espectrometria de Massa com Ionização por Electrospray (ESl-MS), ESl-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, Espectrometria de Massa por Ionização com Dessorção a Laser Assistida por Matriz e analisador de Tempo de Voo (MALDI-TOF-MS), Espectrometria de Massa de Dessorção/lonização a Laser Aprimorada por Superfície e Analisador de Tempo de Voo (SELDI-TOF-MS), Dessorção/lonização em Silício (DIOS), Espectrometria de Massa de íon Secundário (SIMS), Quadrupolo-tempo de Voo (Q-TOF), Tempo de Voo em Tandem (TOF/TOF), tecnologia Ultraflex III TOF/TOF, Espectrometria de Massa de Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI- (MS)n, Espectrometria de Massa de Fotoionização à Pressão Atmosférica (APPI-MS), APPI-MS/MS e APPI-(MS)n, Espectrometria de Massa por Transformada de Fourier (FTMS), Espectrometria de Massa Quantitativa, e Espectrometria de Massa com Analisador de Armadilha de íons.

[0045] Em uma modalidade, qualquer combinação dos biomarcadores revelados pode ser detectada usando um kit adequado, para uso na realização do método aqui revelado. Além disso, qualquer kit pode conter dois ou mais marcadores detectáveis, por exemplo, por emissão de fluorescência, quimioluminescência, turbidimetria e nefelometria.

[0046] Em uma modalidade, um kit inclui um ou mais reagentes de captura (como, por exemplo, um anticorpo) para detectar dois ou mais biomarcadores em uma amostra biológica, em que os biomarcadores incluem quaisquer dois dos biomarcadores revelados no painel deste documento, e opcionalmente (b) um ou mais softwares para classificar o indivíduo de quem a amostra biológica foi obtida como tendo ou não risco de progressão para um quadro de Rabdomiólise, conforme descrito neste documento. Uma ou mais instruções para executar manualmente as etapas acima por um humano podem ser fornecidas como alternativa aos softwares ou programas de computador.

[0047] Um kit significa um dispositivo de detecção que combina um suporte sólido com um reagente de captura correspondente tendo um material gerador de sinal. O kit também pode incluir instruções para uso dos sistemas e reagentes, manuseio de amostras e análise dos dados. Além disso, o kit pode ser usado com um sistema de computador ou software para analisar e relatar o resultado da análise da amostra biológica. Os kits também podem conter um ou mais reagentes (por exemplo, tampões de solubilização, detergentes, lavagens ou tampões, agentes de bloqueio, materiais formadores de matrizes de espectrometria de massa, agentes de captura de anticorpos, amostras de controle positivo, amostras de controle negativo, softwares e informações, como protocolos, orientação e dados de referência) para o processamento de uma amostra biológica.

[0048] Em geral, os imunoensaios envolvem o contato de uma amostra contendo ou suspeita de conter um biomarcador de interesse com pelo menos um anticorpo que se liga especificamente ao biomarcador. Um sinal é então gerado indicativo da presença ou quantidade de complexos formados pela ligação de polipeptídeos na amostra ao anticorpo. O sinal é então relacionado à presença ou quantidade do biomarcador na amostra. Numerosos métodos e dispositivos são bem conhecidos dos versados na técnica para a detecção e análise de biomarcadores. Veja, por exemplo, documentos de patente US6,143,576; US6.113.855; US6.019.944; US5.985.579; US5.947.124; US5.939.272; US5.922.615; US5.885.527; US5.851.776; US5.824.799; US5.679.526; US5.525.524; e US5480792 e a publicação The Immunoassay Handbook, de David Wild (ed. Stockton Press, Nova York, 1994).

[0049] Os dispositivos e métodos de ensaio conhecidos na técnica podem utilizar moléculas marcadas em vários formatos de ensaio sanduíche, competitivos ou não competitivos, para gerar um sinal que está relacionado à presença ou quantidade do biomarcador de interesse. Os formatos de ensaio adequados também incluem métodos cromatográficos, espectrometria de massas e de "blotting" de proteínas. Além disso, certos métodos e dispositivos, como biossensores e imunoensaios ópticos, podem ser empregados para determinar a presença ou quantidade de analitos sem a necessidade de uma molécula marcada. Veja, por exemplo, os documentos de patente US5.631.171 e US5.955.377, cada um dos quais é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade, incluindo todas as tabelas, figuras e reivindicações. Um especialista na técnica também reconhece que a instrumentação robótica incluindo, mas não se limitando a, os sistemas Beckman ACCESS®, Abbott AXSYM®, Roche ELECSYS®, Dade Behring STRATUS® estão entre os analisadores de imunoensaio que são capazes de realizar imunoensaios. Mas qualquer imunoensaio adequado pode ser utilizado, por exemplo, imunoensaios ligados à enzima (ELISA), radioimunoensaios (RIAs), ensaios de ligação competitiva e semelhantes. Tais instrumentos podem, em geral, ser concebidos para analisar a totalidade ou parte de uma amostra introduzida no instrumento para o (s) analito (s) de interesse, por exemplo, fazendo com que toda ou uma parte de uma amostra seja contatada com uma ligação agente específica para cada analito de interesse e detecção de complexos ligados do analito com seu agente de ligação correspondente.

[0050] Os anticorpos ou outros polipeptídeos podem ser imobilizados em uma variedade de suportes sólidos para uso em ensaios. As fases sólidas que podem ser usadas para imobilizar membros de ligação específica incluem aquelas desenvolvidas e / ou usadas como fases sólidas em ensaios de ligação de fase sólida. Exemplos de fases sólidas adequadas incluem filtros de membrana, papéis à base de celulose, grânulos (incluindo partículas poliméricas, de látex e paramagnéticas), vidro, bolachas de silício, micropartículas, nanopartículas, TentaGéis, AgroGéis, géis PEGA, géis SPOCC e placas de múltiplos poços. Uma tira de ensaio pode ser preparada revestindo o anticorpo ou uma pluralidade de anticorpos em uma matriz em suporte sólido. Esta tira pode então ser mergulhada na amostra de teste e, em seguida, processada rapidamente por meio de lavagens e etapas de detecção para gerar um sinal mensurável, como uma mancha colorida. Os anticorpos ou outros polipeptídeos podem ser ligados a zonas específicas de dispositivos de ensaio por conjugação direta a uma superfície de dispositivo de ensaio ou por ligação indireta. Em um exemplo do último caso, anticorpos ou outros polipeptídeos podem ser imobilizados em partículas ou outros suportes sólidos, e esse suporte sólido imobilizado na superfície do dispositivo.

[0051] Os ensaios biológicos requerem métodos de detecção e um dos métodos mais comuns para quantificação dos resultados é conjugar um marcador detectável a uma proteína ou ácido nucleico que tem afinidade para um dos componentes do sistema biológico em estudo. Marcadores detectáveis podem incluir moléculas que são detectáveis (por exemplo, porções fluorescentes, marcadores eletroquímicos, quelatos de metal, etc.), bem como moléculas que podem ser detectadas indiretamente pela produção de um produto de reação detectável (por exemplo, enzimas como peroxidase de rábano, alcalino fosfatase, etc.) ou por uma molécula de ligação específica que pode ser detectável (por exemplo, biotina, digoxigenina, maltose, oligohistidina, 2,4-dintrobenzeno, fenilarsenato, ssDNA, dsDNA, etc.).

[0052] Em certos aspectos, a presente invenção fornece kits para a análise dos marcadores de rabdomiólise por esforço descritos. O kit compreende reagentes para a análise de pelo menos uma amostra de teste que compreende pelo menos um anticorpo que é um marcador de rabdomiólise por esforço. O kit também pode incluir dispositivos e instruções para realizar uma ou mais das correlações de diagnóstico e/ou prognóstico aqui descritas. Os kits preferidos compreenderão um par de anticorpos para realizar um ensaio em sanduíche, ou uma espécie marcada para realizar um ensaio competitivo, para o analito. De preferência, um par de anticorpos compreende um primeiro anticorpo conjugado a uma fase sólida e um segundo anticorpo conjugado a um marcador detectável, em que cada um dos primeiro e segundo anticorpos que se ligam a um marcador de lesão renal. Mais preferencialmente, cada um dos anticorpos são anticorpos monoclonais. As instruções de uso do kit e realização das correlações podem ser na forma de rotulagem, que se refere a qualquer material escrito ou gravado que esteja anexado ou de outra forma acompanhe um kit a qualquer momento durante sua fabricação, transporte, venda ou uso. Por exemplo, o termo rotulagem abrange folhetos e brochuras publicitárias, materiais de embalagem, instruções, cassetes de áudio ou vídeo, discos de computador, bem como escritos impressos diretamente nos kits. transporte, venda ou uso.

[0053] Em uma modalidade, a amostra biológica pode ser obtida de qualquer indivíduo, seja um indivíduo saudável, exibindo, suspeito de ter, ou sendo tratado para RE.

[0054] Em uma modalidade, as amostras a serem analisadas são preparadas a partir da urina coletada de um indivíduo.

[0055] Em uma modalidade, considerando que a identificação destas moléculas marcadoras também pode ser obtida de amostras de sangue, o método também pode ser aplicado em amostras de sangue, quando estas forem analisadas por qualquer metodologia de ensaio que seja capaz de medir diferenças nos níveis do(s) marcador(s) selecionado(s) em uma amostra.

[0056] Em uma modalidade, um indivíduo submetido a exercícios físicos extenuantes tem amostras de urina e/ou sangue coletadas periodicamente, antes, durante e após o término de cada prática de exercício físico, para avaliação da propensão ao desenvolvimento de rabdomiólise.

[0057] Em uma modalidade, o biomarcador de uma amostra é pelo menos 2,5 vezes maior em comparação com um nível esperado em um grupo em repouso. Em uma modalidade, o biomarcador de uma amostra é pelo menos 2,0 vezes maior em comparação com um nível esperado em um grupo em repouso. Em uma modalidade, o biomarcador de uma amostra é pelo menos 1,5 vezes maior em comparação com um nível esperado em um grupo em repouso. Em uma modalidade, o biomarcador de uma amostra é pelo menos 1,25 vezes maior em comparação com um nível esperado em um grupo em repouso. Em uma modalidade, o biomarcador de uma amostra é pelo menos 2,5 vezes menor em comparação com um nível esperado em um grupo em repouso.

[0058] Em outra modalidade, um indivíduo pode ter amostras de sangue e/ou urina coletadas antes, durante ou após exercício físico extenuante seja ela qual for e o propósito dela tal como em uma academia, missões militares, uma competição esportiva ou trabalho na agricultura, consideradas as particularidades de cada modalidade esportiva quanto à intensidade, à duração e à possibilidade de coleta de amostras biológicas, para monitorar sua saúde e avaliar o possível desenvolvimento de rabdomiólise em tempo real.

[0059] Uma modalidade, a aplicação do presente método diagnóstico é indicada para investigação de rabdomiólise em indivíduo com atividade de CK sérica maior do que 5 vezes o limite superior de normalidade (de 174 lU/L), associado ou não ao relato anamnésico que indique atividades físicas extenuantes ou condições subjetivas associadas à compreensão do termo “atividade física extenuante”.

[0060] Em uma modalidade, na condição de ausência dos resultados dos exames laboratoriais, tal qual, o nível sérico de CK, em razão da gravidade do quadro de um indivíduo, a equipe médica pode optar por utilizar a investigação com o painel de marcadores para prosseguir e agilizar a escolha das condutas terapêuticas.

[0061] Em uma modalidade, um indivíduo em atendimento médico apresenta mioglobinúria e também relata prática prévia de exercícios físicos extenuantes, como atividades esportivas, militares ou de agricultura, sendo indicada a aplicação do presente método diagnóstico enquanto os exames laboratoriais estão sendo realizados.

[0062] Em uma modalidade, um indivíduo adentra a emergência hospitalar com quadro de infarto agudo do miocárdio, precedido por relato de atividade física extenuante, como atividades esportivas, militares ou de agricultura, sendo indicada a aplicação do presente método diagnóstico enquanto outros exames estão sendo realizados.

[0063] Em uma modalidade, um indivíduo adentra a emergência hospitalar com quadro de insuficiência renal aguda, precedido por relato de atividade física extenuante, como atividades esportivas, militares ou de agricultura, sendo indicada a aplicação do presente método diagnóstico enquanto outros exames estão sendo realizados.

[0064] Em uma modalidade, um indivíduo adentra a emergência hospitalar com quadro de RE, precedido por relato de atividade física extenuante e uso de anabolizantes e/ou drogas de abuso, sendo indicada a aplicação do presente método diagnóstico enquanto outros exames estão sendo realizados.

[0065] Em uma modalidade, um indivíduo adentra a emergência hospitalar com quadro de RE, precedido por relato de consumo de alimentos possivelmente contaminados, sendo indicada a aplicação do presente método diagnóstico enquanto outros exames estão sendo realizados.

[0066] Em outra modalidade, ο presente método diagnóstico pode ser usado em associação com a investigação de outros marcadores não pertencentes ao referido painel de proteínas, para elucidar os diagnósticos complementares de condições associadas.

[0067] Em uma modalidade do presente método, representada esquematicamente na figura 1, são ilustradas etapas em que:

[0068] (1) um indivíduo é indicado com suspeita clínica de rabdomiólise por esforço extenuante;

[0069] (2) é realizada uma anamnese deste indivíduo, observando particularmente sintomas como náuseas, dores nos membros inferiores e urina escura, cor de "coca-cola";

[0070] (3) coleta-se amostras de urina e sangue do indivíduo para análise, sendo as amostra de urina centrifugadas e o sobrenadante analisado;

[0071] (4) é feita a dosagem de CK, LDH, TGO e, opcionalmente de mioglobina (MB), análise hematológica e dosagem de duas ou mais proteínas do painel de biomarcadores na amostra urinária;

[0072] (5) é diagnosticada rabdomiólise caso se observe: leucometria elevada, CK menor que 1000 Ul/L e pelo menos duas das proteínas do painel de biomarcadores forem reguladas diferencialmente, ou seja, se apresentarem superexpressas e subexpressas.

EXEMPLOS DE CONCRETIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0073] No que segue, são apresentadas realizações exemplares do objeto aqui descrito, de modo não restritivo, ilustrando métodos e resultados alcançadas pelo mesmo.

EXEMPLO 1: Identificação de proteínas diferentemente reguladas relacionadas ao exercício extenuante na atividade militar

[0074] Este exemplo descreve o delineamento experimental, os ensaios usados para analisar amostras e controles para a identificação dos biomarcadores, e apresenta métodos estatísticos para confirmar a significância dos resultados e suas correlações com outros biomarcadores, usados na técnica atual para diagnosticar RE. Os ensaios foram realizados em um grupo de indivíduos antes de praticar atividade física extenuante (M1) e após praticar atividade física extenuante (M2), dos quais são retiradas amostras biológicas para acompanhamento de progressão de risco de RE a partir da análise de tais amostras biológicas, de acordo com o presente método. As etapas para análise das amostras incluem: retirada de amostra do indivíduo, filtração da amostra, quebra das proteínas (e.g., com adição de tripsina), separação dos marcadores (e.g., por cromatografia), análise dos marcadores (e.g., por espectrometria de massa), e análise estatística dos resultados.

[0075] 1. DESENHO DO ESTUDO E O PROGRAMA DE TREINAMENTO DE EXERCÍCIOS

[0076] Um estudo longitudinal / prospectivo foi realizado com soldados da Marinha do Brasil matriculados em um programa de treinamento especial de nove meses envolvendo quatro fases. Na primeira fase (com duração de 8 semanas), que consistiu em um treinamento físico, foram medidos os parâmetros clínicos e demográficos de 31 militares, todos homens e assintomáticos.

[0077] Os parâmetros clínicos e demográficos, definidos com base neste grupo, foram: idade (anos): 29,0 ± 2,7; massa corporal total (kg): 79,9 ± 7,1; altura (cm): 177,2 ± 6,3; índice de massa corporal (kg.m2): 25,3 ± 1,8; Porcentagem de gordura corporal (%): 10,4 ± 2,9: Massa corporal magra (kg): 71,6 ± 5,8; VO2 máximo (mL.kg-1.min-1): 52,3 ± 2,0.

[0078] A segunda e a terceira fases consistiram em treinar os soldados com instruções básicas de combate e desenvolvimento de atividades de planejamento. A quarta fase teve como objetivo praticar as atividades aprendidas nas fases anteriores. Esta fase foi executada ao longo de seis missões realizadas em diferentes ambientes do Brasil. Quatorze militares finalizaram esta última fase, sendo 10 deles selecionados para este estudo.

[0079] As amostras dos 10 indivíduos foram coletadas em dois momentos distintos da fase quatro para cada soldado, sendo em um momento antes dos indivíduos serem submetidos as atividades físicas extenuantes (M1) e um momento após os indivíduos serem submetidos a atividades físicas extenuantes (M2), que foram definidos, respectivamente, como momentos de missões de baixo e de alto estresse físico. Todos os participantes receberam e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido de acordo com a Resolução 466, de 12/12/2012, do Conselho Nacional de Saúde (Diretrizes e Normas para a Realização de Experimentos com Seres Humanos), sob Parecer Consubstanciado do Hospital Naval Marcílio Dias número 2.219.303.

[0080] 2. COLETA DE FLUIDOS CORPORAIS

[0081] A coleta de amostras de sangue e urina foi realizada durante momentos das missões de esforço físico leve (M1) e esforço físico extenuante (M2), transportadas em caixa térmica fria (4 °C) até o local de análise e posteriormente congeladas e armazenadas a -80 °C. Três amostras de sangue por participante foram coletadas do braço antecubital usando uma agulha descartável de calibre 20 equipada com um suporte de tubo Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos) ou similar. Duas amostras de soro foram coletadas (somando 16 mL de soro) e mantidas em tubos Vacutainer contendo SST-Gel e em tubos Vacutainer contendo anticoagulante EDTA. As amostras de urina foram coletadas em frasco plástico esterilizado, numerado e lacrado.

[0082] 3. ANÁLISES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS

[0083] Como biomarcador hematológico foram analisados os leucócitos, utilizando um equipamento de citometria de fluxo fluorescente da Sysmex, modelo XT-2000i, ou equipamentos similares. Como biomarcadores bioquímicos foram analisados: creatina quinase (CK) e sua isoforma (CKMB), fósforo (P), aspartato transaminase (AST) e lactato desidrogenase (LDH), utilizando um equipamento multianalisador para análises clínicas da Johnson & Johnson, modelo Vitros 4600 Chemical System (Ortho-Clinical Diagnostics, Johnson e Johnson, Rochester, NY, Estados Unidos), ou equipamentos similares.

[0084] 4. PREPARAÇÃO DE AMOSTRA PARA ANÁLISE PROTEÔMICA

[0085] Amostras de urina (10 mL) foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000xg e 4 °C. Em seguida, foram filtradas com filtro de seringa estéril (0,22 μΜ) e concentradas com Millipore Amicon Ultra-15 10K (Merck Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. 0 material retido foi recolhido e ο filtro foi lavado com 200 μL de solução de uréia 4 M, sendo a solução da lavagem misturada com o material retido para formar uma solução de materiais retidos. A quantidade de proteínas desta solução de materiais retidos foi quantificada usando kit que realiza um ensaio quantitativo baseado em fluorescência, chamado Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen). Um volume correspondente a 100 μg foi coletado de cada amostra e bicarbonato de trietilamônio 50mM (concentração final) foi adicionado. As proteínas foram reduzidas com ditiotreitol (DTT) 10 mM por 40 minutos a 30 °C e alquiladas com iodoacetamida (lAA) 40 mM por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Antes da digestão, as amostras foram diluídas até 0,8 Μ de uréia (concentração final) e digeridas com tripsina (Promega) (1:50 m/m) por 16 h a 30 °C. Após a digestão, todas as reações foram acidificadas com ácido trifluoroacético a 1 % (v/v) e os peptídeos trípticos foram purificados por método cromatográfico com um cartucho para extração em fase sólida (SPE) contendo solvente polimérico de equilíbrio hidrofílico-lipofílico e fase reversa para todos os componentes. O sistema usado foi o OASIS HLB-SPE (Waters). Em seguida, as amostras foram secas e solubilizadas em 0,1% de ácido fórmico (AF).

[0086] 5. ANÁLISE DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

[0087] Os peptídeos trípticos (1 μg) foram analisados com um LTQ-Orbitrap Velos ETD (Thermo Fisher Scientific) juntamente com Easy NanoLC II (Thermo Scientific). Os peptídeos foram separados em uma pré-coluna de fase reversa ReproSil-Pur C18-AQ C18 (4 cm x 100 μm de diâmetro interno, para partículas de 5 μm) e subsequentemente eluídos em uma coluna analítica de 20 cm x 75 pm de diâmetro interno para partículas de 3 pm, ReproSil-Pur C18-AQ, ao longo de 105 min, usando um gradiente linear de 2-30%, seguido por 20 min de 30-45% de fase móvel B (100% ACN; 0,1% de ácido fórmico). Para adquirir os dados de espectrometria de massa (MS), foi utilizado o modo de aquisição dependente de dados (DDA) operado pelo software XCalibur (ThermoFisher). Varreduras de levantamento (350-1.500 m/z) foram adquiridas no sistema Orbitrap com uma resolução de 60.000 em m/z. A seleção dos 20 precursores principais seguida pela fragmentação usando o método de dissociação induzida por colisão (CID) foi empregada usando energia de colisão normalizada de 35. As configurações de MS/MS incluíram: sinal mínimo necessário de 5.000, largura de isolamento de 2,00, Q de ativação de 0,250 e tempo de ativação de 10 ms. Uma duplicata técnica para cada amostra foi executada.

[0088] 6. PROCESSAMENTO DE DADOS

[0089] Os dados do espectro de massa em tandem foram pesquisados usando o algoritmo de pesquisa Andromeda e MaxQuant v.1.5.5.135 (10.1038/nprot.2016.136). O banco de dados H. Sapiens Swiss-Prot (Uniprot, 20.359 entradas, revisado) foi baixado em 20 de setembro de 2020. Os parâmetros de pesquisa foram definidos para permitir duas clivagens trípticas perdidas; a oxidação da metionina e a carbamidometilação da cisteína foram definidas como modificações variáveis e fixas, respectivamente. Outros critérios de pesquisa incluíram: tolerância de massa de 20 ppm (íons precursores) e 0,5 Da (íons de fragmento) e comprimento mínimo de peptídeo de 7 aminoácidos. Uma taxa de descoberta falsa (FDR) de 1% foi aplicada ao nível de peptídeo e proteína. A opção “match between run” foi habilitada. A quantificação de proteínas foi realizada usando quantificação livre de marcação (LFQ), integrando a área do cromatograma de íons extraídos (XIC).

[0090] 7. ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0091] Todos os conjuntos de dados foram testados para distribuição normal, a fim de aplicar testes paramétricos. Para os dados proteômicos, os dados de expressão proteica foram processados usando a plataforma computacional Perseus v.1.6.14.0 (http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:start). Os dados de LFQ foram transformados em log 2, e filtrados para remoção de contaminantes. Proteínas reguladas diferencialmente (superexpressas ou subexpressas) entre o momento de baixo estresse físico (M1) e o momento de alto estresse físico (M2) foram determinadas usando teste t pareado de valores de LFQ e correção para FDR (taxa de falsa descoberta) baseado em Benjamini-Hochberg (FDR < 0,05). A correlação entre marcadores bioquímicos e proteínas reguladas foi determinada pela aplicação do teste de correlação de Spearman. O Graphpad Prism 9.01® foi utilizado para realizar a análise estatística do teste e foi considerado significativo com p ≤ 0,05.

[0092] 8. ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA

[0093] As curvas ROC das figuras 2A a 2H, 3A a 3H e 4A a 4I foram criadas usando ο pacote pROC (2011, BMC bioinformatics, 12,77), disponível na plataforma livre Bioconductor. As análises complementares foram realizadas usando softwares comuns da técnica, como Perseus, Graphpad Prism v.9.01, software RStudio ou sumilares.

[0094] 9. RESULTADOS

[0095] A abordagem LFQ (descrita no item 6 deste exemplo) identificou e quantificou 548 proteínas urinárias. Um total de 226 proteínas foram reguladas diferencialmente entre os momentos avaliados, sendo 120 superexpressas e 106 subexpressas, conforme observado na figura 5. Um filtro prévio definiu que apenas proteínas com oito valores válidos em pelo menos um grupo nos dois momentos (M1, M2) sejam consideradas para o painel de biomarcadores.

[0096] A fim de identificar um conjunto de biomarcadores associados à ocorrência de eventos, o conjunto combinado de amostras de controle e de eventos iniciais foi verificado usando a análise dos componentes principais (PCA). O PCA exibe as amostras em relação aos eixos definidos pelas variações mais fortes entre todas as amostras, sem levar em conta o resultado do caso ou controle, mitigando assim 0 risco de sobreajuste da distinção entre caso e controle. Conforme observado na figura 6, a análise multivariada PCA mostrou uma clara separação entre os dois grupos avaliados, revelando que o perfil proteômico difere de acordo com a progressão do exercício físico.

EXEMPLO 2: Correlação entre as proteínas diferentemente reguladas após atividade física e os clássicos marcadores bioquímicos de rabdomiólise

[0097] A quantificação dos marcadores bioquímicos sanguíneos clássicos para rabdomiólise, LDH, AST, CKMB e CK, bem como a quantidade de proteínas totais da urina mostram níveis significativamente mais elevados no momento da atividade física intensa (M2) quando comparados ao momento inicial, antes da atividade física intensa (M1) (valor-p < 0,01), conforme ilustrado da figura 7A a figura 7D.

[0098] Em seguida, três destes (CK, LDH e AST), amplamente utilizados na clínica para avaliar a progressão da rabdomiólise, foram selecionados para análise de correlação para identificar possíveis biomarcadores urinários proteicos. Conforme observado na Tabela 1, as proteínas CTSH, PIK3IP1, DEFB1, ITGB1, BCAN, TNFRSF10C se correlacionam simultaneamente com os três principais biomarcadores sanguíneos de dano muscular utilizados na prática clínica para o diagnóstico de rabdomiólise (CK, LDH e AST). As proteínas GLRX1, BLVRB, DSC2, CO1A1, S28A1, PGRP2, UTER E HBA possuem correlação com pelo menos dois biomarcadores sanguíneos de dano muscular. As proteínas GLRX1, BLVRB, DSC2, COL1A1, S28A1, GGCT, UTER, HBA, HMCN1, CCN3, PARK7, ICAM2, SLURP1, PGRP2, CATZ, FABP5, ATRN e PPIA possuem correlação com pelo menos um biomarcador sanguíneo de dano muscular.

[0099] Análise de correlação entre os três marcadores bioquímicos tradicionalmente utilizados para o diagnóstico de rabdomiólise e abundância de proteína urinária:

[0100] Um teste de Spearman foi aplicado e os índices *, ** e *** indicam proteínas que têm correlação com um, dois ou três marcadores bioquímicos clássicos para rabdomiólise, respectivamente. Adicionalmente, as proteínas superexpressas são indicadas com ο índice 1. Ο valor-p para cada correlação é apresentado.

[0101] Seis proteínas que apresentaram correlação simultânea com três marcadores bioquímicos clássicos (CTSH, PIK3IP1, DEFB1, ITGB1, BCAN, TNFRSF10C foram submetidas à análise ROC (característica de operação do receptor), que considera as taxas relativa de verdadeiros e falsos positivos e negativos e gera uma curva AUC (área sob a curva ROC), cuja área retorna valor de 1,0 para uma capacidade preditiva de 100%, e o valor zero quando todas as previsões estão erradas. Todas estas proteínas apresentaram sensibilidade e especificidade superiores a 80%.

[0102] A catepsina H (CTSH), que pertence á superfamília de proteases de cisteína semelhantes a papaína e está envolvida na degradação de proteínas intracelulares e da matriz extracelular, pois é uma enzima lisossomal (2012, Journal of Neurochemistry, 122, 512-522). Outras proteínas da família das catepsinas como CTSC e CTSK, já foram relacionadas com exercícios, um estudo anterior mostrou que em ratos submetidos a exercícios extenuantes, a expressão CTSC é aumentada (1984, Acta physiologica Scandinavica, 720(1), 15-19). Além disso, outro estudo demonstrou que o CTSK desempenha um papel fundamental na perda do músculo esquelético e da fibrose, possivelmente através da redução de eventos inflamatórios (2016, PLoS One, 25;11(1), e0147198). O aumento da abundância de CTSH em condições de exercício extenuante não foi previamente descrito, sendo este o primeiro relatório que se tem conhecimento, conforme pode ser visto na figura 2H. Várias evidências têm mostrado uma relação entre catepsinas lisossomais e patologia renal, uma das complicações mais letais da rabdomiólise (2017, Frontiers in cell and developmental biology, 5,114). As catepsinas B e D regulam homeostase de matriz extracelular, autofagia, apoptose, permeabilidade glomerular, função endotelial e inflamação (2017, Frontiers in cell and developmental biology, 5,114).

[0103] PIK3IP1 é uma proteína de superfície celular envolvida na regulação da via PI3K (2019, Clinicai cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 25, 20). Aqui, foi identificada a PIK3IP1 subexpressa no grupo de amostras após atividade física extenuante (M2), conforme figura 4F, e a abundância dessa proteína foi correlacionada a danos musculares causados por atividade física extenuante. Evidências recentes no nível mRNA indicaram que a PIK3IP1 está relacionada ao regulador da proteína FOXO3 (2019, Laboratory investigation: a journal of technical methods and pathology, 99, 5). A inatívação do FOXO3, regulador positivo de autofagia no músculo esquelético (1999, Cell, 96(6), 857-868; 2006, Cell, 725(5), 987-1001), mostrou promover a regulação negativa da PIK3IP1 (10.1038/s41374-018-0184-7). Além disso, um estudo já citado demonstrou que o PIK3IP1 é um regulador imunológico que inibe a resposta das células T (2019, Clinicai cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 25, 20), que justifica a regulação dos processos biológicos relacionados ã maior atividade das células T no grupo de amostras após atividade física extenuante (M2) (citotoxicidade mediada por células T e imunidade mediada por células T).

[0104] DEFB1 pertence à família das defensinas, que são peptídeos antimicrobianos e citotóxicos (1994, Toxicology, 87(1-3), 131-149). Esta família de peptídeos está associada à defesa imunológica contra bactérias, fungos e vírus (2015, Frontiers in immunology, 6, 115). Embora os efeitos da indução de uma resposta imune sejam bem caracterizados, o envolvimento da família das defensinas em atividades anti-inflamatórias também foi documentado (2019, Seminars in cell & developmental biology, 88,163-172). Na matéria aqui descrita, DEFB1 foi observada subexpressa no grupo de amostras após atividade física extenuante (M2), conforme figura 3A, quando os participantes acumulam maior dano relacionado ao exercício físico. Um documento (2011, Journal of bioscience and bioengineering, 112(2), 107-113) apresentou evidências da relação entre DEFB1 e o estresse oxidativo. O aumento dos níveis de DEFB1 foi associado com o aumento da produção de glutationa, um tripeptídeo importante na proteção das células contra o estresse oxidativo. Esse achado indica que há um aumento nos processos relacionados ao estresse oxidativo após atividade física extenuante.

[0105] A proteína ITGB1 é membro da família das integrinas e está associada ã adesão celular. Aqui, essa proteína foi identificada como subexpressa após atividade física extenuante conforme figura 4B. Um estudo indicou que α7β1 integrina está relacionada à sensibilização do músculo esquelético em resposta ã tensão mecânica e hipertrofia (2011, Journal of applied physiology (Bethesda, Md.: 1985), 111 (4), 1134-1141). Outros estudos mostraram que o mRNA da α7β1 é positivamente regulado após contrações excêntricas, provavelmente como fonte de resistência às lesões nas sessões de exercício repetido (2019, American journal of physiology Cell physiology, 317(4), C629-C641), sugerindo que ο aumento da expressão está relacionado ã proteção muscular. Considerando que os participantes do estudo exemplar aqui apresentado foram submetidos a condições de exercício extenuante em M2, os dados sugerem que esse efeito protetor foi perdido, uma vez que os níveis dessa proteína foram reduzidos.

[0106] A proteína BCAN foi identificada subexpressa no grupo de amostras após atividade física extenuante (M2), conforme figura 2B. Essa proteína ê um proteoglicano neural que contribui para a formação da matriz extracelular e está associado a diversos processos fisiológicos e da plasticidade no cérebro (2012, The international journal of biochemistry & cell biology, 44(7), 1051 -1054). Um documento demonstrou que ο exercício intenso é capaz de promover disfunção mitocondrial cerebral e, assim, perturbar o equilíbrio oxidativo, resultando na superprodução dos radicais livres (2008, Neurochemical research, 33, 51-58), indicando alterações das funções normais realizadas pelo cérebro diante dos exercícios físicos. A matéria aqui revelada traz o primeiro relato da subexpressão dos níveis de BCAN associados à atividade física. Apresenta-se como hipótese que essa subexpressão urinária após a atividade física extenuante seria um reflexo das alterações nos processos fisiológicos cerebrais.

[0107] TNFRSF10C é uma proteína indutora de apoptose frequentemente estudada no contexto do câncer (2018, PeerJ, 6, e5336). Além disso, a superfamília do fator de necrose tumoral desempenha papéis importantes na ativação, proliferação, diferenciação e migração de células imunes para o sistema nervoso central (2018, Science signaling, 77(511), eaao4910). Um documento demonstrou que ο TNFRSF10C é uma miocina, através do sequenciamento de mRNA do músculo esquelético para estudar a expressão gênica de proteínas secretadas em exercícios agudos e de longa duração (2017, Molecular metabolism, 6, 352-365) e corrobora os ensinamentos da presente descrição, uma vez que no nível da proteína, o TNFRSF10C é subexpresso em momento de alta atividade física (M2), conforme figura 4C.

[0108] As proteínas de reconhecimento de peptidoglicanos (PGRPs ou PGLYRPs) são proteínas da imunidade inata que são conservadas de insetos a mamíferos, reconhecem o peptidoglicano bacteriano e funcionam na imunidade antibacteriana e na inflamação. Os mamíferos têm quatro PGRPs - PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3 e PGLYRP4. São proteínas secretadas expressas em leucócitos polimorfonucleares (PGLYRP1), fígado (PGLYRP2) ou em superfícies corporais, membranas mucosas e em secreções (saliva, suor) (PGLYRP3 e PGLYRP4). Todos os PGRPs reconhecem o peptidoglicano bacteriano (2014, Portuguese Society for Microbiology Magazine, 3, 1-7). Três PGRPs, PGLYRP1, PGLYRP3 e PGLYRP4 são diretamente bactericidas para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e não têm atividade enzimática, enquanto PGLYRP2 (figura 4E) é uma N-acetilmuramoil-L-alanina amidase que hidrolisa o peptidoglicano da parede celular bacteriana. As proteínas de reconhecimento do peptidoglicano influenciam as interações patógeno-hospedeiro não apenas por meio de suas propriedades antibacterianas ou peptidoglicano-hidrolíticas, mas também por meio de suas propriedades pró-inflamatórias e antiinflamatórias que são independentes de suas atividades hidrolítica e antibacteriana (2014, Janeway’s immunology, 8th edition, 97). Os PGRPs provavelmente desempenham um papel nas defesas antibacterianas e em várias doenças inflamatórias. Eles modulam as respostas inflamatórias locais em tecidos (como articulações artríticas) e há evidências de associação de PGRPs com doenças inflamatórias, como psoríase.

[0109] A gama-glutamil ciclotransferase (GGCT) é uma enzima antioxidante de defesa diretamente envolvida no metabolismo da glutationa, um endógeno antioxidante. A GGCT catalisa a formação de 5-oxoprolina a partir de dipeptídeos gamaglutamil e pode desempenhar um papel significativo na homeostase da glutationa. A GGCT induz a liberação de citocromo C da mitocôndria com a indução resultante de apoptose (2006, Biochemical and biophysical research communications, 346, 454-460). No presente exemplo de concretização da invenção, observa-se que tal marcador foi superexpresso nas amostras examinadas após a prática de exercícios extenuantes (M2), conforme figura 3E.

[0110] Estudos proteômicos revelaram o envolvimento da GGCT no metabolismo da glutationa, desempenhando um importante papel na função vascular, cardíaca e na sobrevivência celular devido a sua função antioxidante (2005, Molecular immunology, 42, 987-1014; 2007, Journal of molecular and cellular cardiology, 43, 344-353). A deficiência de glutationa está envolvida na progressão na remodelação cardíaca em modelos animais e humanos. As descobertas sobre o envolvimento de proteínas expressas diferencialmente (superexpressas ou subexpressas) ligadas ao metabolismo da glutationa neste estudo sugerem que o metabolismo da glutationa pode ser um alvo terapêutico interessante para a Rabdomiólise.

[0111] O colágeno alfa1 (CO1A1) é uma proteína constituinte da matriz extracelular e controla a fisiologia do músculo esquelético através de colágenos, recentemente foi descrita como degradada pelas catepsinas. O colágeno tipo I é um membro do colágeno do grupo I; O colágeno tipo I é um heterotrímero que consiste em 2 cadeias a1 (I) e uma cadeia a2 (I), codificadas, respectivamente, pelos genes COL1A1 e COL1A2. O colágeno é a proteína da matriz extracelular mais abundante em humanos e é a principal proteína estrutural da pele, osso, tendão, ligamentos e córnea. No presente exemplo de concretização da invenção, observa-se que tal marcador apresentou correlação com dois marcadores clássicos de Rabdomiólise em amostras examinadas antes e após a prática de exercícios extenuantes (M2), conforme figura 2G.

[0112] A proteína de ligação de ácidos graxos do coração (FABPH ou FABP3) foi a proteína com maior abundância relativa em amostras após atividade física extenuante (M2), possui forte correlação com a CATH (spearman-r = 0,685 e valor-p = 0,035). Ο treinamento físico de endurance proporciona muitas adaptações do músculo esquelético, incluindo o aumento da capacidade do metabolismo oxidativo de ácidos graxos e carboidratos. Um aumento na oxidação de ácidos graxos é facilitado pelo aumento da capacidade de captação dessas moléculas pelos miócitos (1997, Biochemical and biophysical research communications, 231, 463-465), seu transporte mitocondrial e subsequente β-oxidação (2002, American journal of physiology. Endocrinology and metabolism, 283, E66-E72).

[0113] O treinamento de endurance aumenta a capacidade de utilização de ácidos graxos. Uma vez que se acredita que os ácidos graxos entram nas células através da difusão facilitada, um possível mecanismo por trás dessa adaptação ao treinamento pode ser um aumento, induzido pelo exercício, de transportadores de ácidos graxos putativos no conteúdo da membrana do sarcolema (1997, Biochemical and Biophysical Research Communications, 231, 463-465).

[0114] A família de proteínas de ligação ácidos graxos se destacou na análise do proteoma urinário após exercício extenuante. Diversas proteínas de ligação de ácidos graxos foram superexpressas em M2, dentre elas a FABP3, que apresentou a maior abundância na urina após o exercício, conforme figura 8. Alguns estudos evidenciaram que a FABP3 é um valioso biomarcador sanguíneo para detecção de lesão muscular, bem como modula a absorção de ácidos graxos nas células musculares (músculo esquelético e coração) e em outras células (fígado, cérebro, intestino delgado) (2008, Toxicological Sciences, 103, 382-396; 2015, Journal of neuromuscular diseases, 2(3), 241-255; 2016, Toxicological sciences, 150,247-256; 2017, Toxicologic Pathology, 45, 943-951; 2017, International journal of rheumatic diseases, 20(2), 252-260; 2019, Expert review of molecular diagnostics, 19(8), 739-755). Outro estudo mostrou que a FABP3 sanguínea, juntamente com outros biomarcadores, foi preditivo para necrose do músculo esquelético (2008, Toxicological Sciences, 103, 382-396). Assim, quando a FABP3 sanguínea, quando utilizada em conjunto com biomarcadores clássicos de lesão muscular, como CK e AST, melhorou a sensibilidade e especificidade dos diagnósticos de lesão muscular esquelética em camundongos (2016, Toxicological sciences, 150, 247-256). FABP3 apresentou maior associação com fraqueza muscular em pacientes com polimiosite e dermatomiosite do que os níveis de soro de CK e mioglobina (2017, International journal of rheumatic diseases, 20(2), 252-260). Um estudo recente mostrou que os níveis de soro de FABP3 podem representar um novo biomarcador para distrofia muscular de Duchenne (2019, Expert review of molecular diagnostics, 79(8), 739-755). Até ο momento, não se tem conhecimento sobre biomarcadores urinários comercialmente disponíveis para danos ao músculo esquelético por atividade física intensa, que se correlacionem significativamente com os biomarcadores de dano muscular sanguíneos após atividade física extenuante.

[0115] Exames clínicos e laboratoriais adicionais podem ser combinados, sem prejuízo para o(s) resultado(s) do ensaio dos biomarcadores da presente invenção. Estes incluem outros biomarcadores relacionados á Rabdomiólise por esforço como CK,LDH E TGO.

[0116] Outros indícios clínicos que podem ser combinados sem prejuízo para o(s) resultado(s) do ensaio dos biomarcadores da presente invenção, inclui informações demográficas (por exemplo, peso, sexo, idade, raça), histórico médico (por exemplo, histórico familiar, traço falciforme, doença pré-existente, como distrofias musculares, proteinúria, insuficiência renal ou sepse, tipo de exposição a drogas, como AINEs, cocaína, estatinas), variáveis ambientais (por exemplo, intensidade da atividade física, temperatura ambiente).

[0117] Outras medidas de dano muscular que podem ser combinadas com o(s) resultado(s) do ensaio do marcador são descritos a seguir e em Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Ed., McGraw Hill, New York, páginas 1741-1830, e Current Medical Diagnosis & Treatment 2008, 47 m Ed, McGraw Hill, Nova York, páginas 785-815, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

EXEMPLO 3: Insuficiência renal aguda causada por RE, após treinamento físico militar extenuante.

[0118] Este exemplo descreve a aplicação do painel de marcadores no acompanhamento da progressão de lesão renal aguda causada por Rabdomiólise por esforço, após treinamento físico militar extenuante.

[0119] Um paciente de 24 anos compareceu ao hospital com queixa de náuseas e vômitos, relatando ter executado treinamento físico militar 20 h antes. As amostras de urina para as análises proteômicas comparadas neste estudo foram coletadas do paciente em 4 momentos distintos. A primeira coleta (DO) foi realizada no ato da sua matrícula no curso de especialização em Comandos Anfíbios no CIASC (Centro de Instrução Almirante Sylvio de Camargo da Marinha do Brasil, no Rio de Janeiro). Três dias depois, os alunos participaram de 12h de treinamento físico militar extenuante, e o aluno 3201 evoluiu para Rabdomiólise por esforço com Insuficiência Renal Aguda. A internação ocorreu no dia seguinte. Outras duas amostras foram colhidas 72 h após o treinamento (D5_6h e D5_14h). A quarta amostra avaliada foi colhida na data da alta do paciente (D12).

[0120] No momento da internação, seus resultados laboratoriais mostraram um nível elevado de CK sérica de 9.300 U/L e níveis elevados de uréia (U) e creatinina sérica de 147 mg/dL e 5,7 mg/dL, respectivamente. O exame de urina mostrou mioglobinúria significativa em D5. O paciente iniciou a diálise no segundo dia de internação, interrompeu em D3 e retornou em D5 e permaneceu em diálise durante todo o curso. Suas taxas laboratoriais normalizaram durante sua internação e recebeu alta hospitalar no dia 12.

[0121] A análise do proteoma urinário revelou a diferenciação quanto à expressão de três marcadores do painel revelado, indicando que COL1A1 e DEFB1 estiveram subexpressas e FABP3 esteve superexpressa durante o período de internação avaliado, conforme figura 9 (COL1A1 e FABP3) e figura 10 (DEFB1), em comparação aos resultados quantitativos destas mesmas proteínas nas amostras colhidas pré-treinamento (DO) e após a alta (D12).

[0122] Estes dados evidenciaram que a avaliação das proteínas urinárias a partir dos marcadores revelados neste documento é capaz de monitorar o desenvolvimento e a progressão da Rabdomiólise.

[0123] Embora modalidades exemplares dos processos e produtos descritos tenham sido apresentadas neste relatório, não se pretende que o escopo de proteção seja I imitado à Iiteralidade das mesmas. Portanto, a descrição deve ser interpretada não como Iimitativa, mas meramente como exemplificações de modalidades particulares que guardam o conceito inventivo aqui apresentado. Um técnico no assunto poderá prontamente aplicar ensinamentos aqui apresentados em soluções análogas, decorrentes dos mesmos, l imitadas apenas pelo escopo das reivindicações deste pedido.

Claims (11)

1. Método de investigação proteômica em amostra para diagnosticar rabdomiólise, caracterizado por:
   dado um painel de biomarcadores selecionados do grupo que compreende: catepsina H (CTSH); cadeia de colágeno alfa-1 (I) (CO1A1); proteína 1 de interação a fosfatidilinositol-3-quinase (PIK3IP1); beta-defensina 1 (DEFB1); integrina beta-1 (ITGB1); proteína central de Brevican (BCAN); um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 10C (TNFRSF10C); gama-glutamilciclotransferase (GGCT); Glutaredoxina (GLRX), Flavina redutase (NADPH) (BLVRB); Desmocollin-2 (DSC2); Cadeia de colágeno alfa-1 (l)(COL1A1); Cotransportador de sódio / nucleosídeo 1 (S28A1); Uteroglobina (LITER); Subunidade alfa de hemoglobina (HBA); Hemicentina-1 (HMCN1); Membro da família CCN 3 (CCN3); Proteína 7 da doença de Parkinson (PARK7); Molécula de adesão intercelular 2 (ICAM2); Proteína 1 relacionada a Ly-6 / uPAR secretada (SLURP1); N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (PGRP2); Catepsina Z (CATZ); Proteína 5 de ligação a ácidos graxos (FABP5); Atractin (ATRN); Peptidil-prolil cis-trans isomerase A (PPIA) e proteína de ligação de ácidos graxos do coração (FABP3);
   detectar, em uma amostra biológica retirada de um indivíduo, pelo menos dois biomarcadores do referido painel que apresentem diferenças significativas na abundância relativa em relação a um conjunto de valores de referência.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que conjunto de valores de referência é obtido de amostras retiradas do referido indivíduo antes do treinamento físico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que conjunto de valores de referência é obtido de amostras retiradas de um conjunto de indivíduos antes do treinamento físico.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de urina.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é incubada com um anticorpo ou um fragmento de antígeno de proteína que se liga especificamente a uma proteína ou fragmento de peptídeo de uma proteína do referido painel, sob condições que permitem que o anticorpo ou fragmento específico de antígeno forme um complexo com:

   • (a) um fragmento de peptídeo de uma proteína do referido painel; ou
   • (b) o complexo covalente ou não covalente de pelo menos uma molécula selecionada do grupo que compreende: fragmentos de peptídeo de uma proteína do referido painel; e, proteínas intactas do referido painel, em que é feita a detecção e medição do complexo formado.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a detecção e medição do complexo formado é feita por ensaio de imunoabsorção enzimática tipo ELISA.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a detecção e medição do complexo formado é feita por espectrometria de massa.
9. Kit de investigação proteômica em amostra para diagnosticar rabdomiólise, caracterizado por ser configurado para realizar o método das reivindicações 1 a 8, em que o kit compreende:
   um suporte sólido que recebe a amostra biológica;
   um reagente de captura, preferencialmente um anticorpo, depositado no suporte sólido, para capturar biomarcadores do painel presentes na amostra biológica; e
   meios de detecção e quantificação dos biomarcadores do painel capturados.
10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que meios de detecção e quantificação dos biomarcadores do painel na amostra biológica são constituídos de um material que emite fluorescência, quimioluminescência, turbidimetria e nefelometria em contato com um dos biomarcadores do painel.
11. Kit, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meios de detecção e quantificação dos biomarcadores do painel na amostra biológica são constituídos de um material que gera um sinal em contato com um dos biomarcadores do painel e transmite o sinal para um meio de aquisição de sinal e armazenamento de dados.

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