BR102021015108A2 - Processo de obtenção de biocurativo tridimensional, biocurativo tridimensional obtido e seu uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um processo de obtenção de um biocurativo tridimensional (3D) que compreende as etapas de (a) isolar e cultivar células mesenquimais com soro AB humano; (b) realizar bioimpressão tridimensional (3D) utilizando um biomaterial, tal como alginato de sódio, e células obtidas na etapa "a"; (c) colocar em repouso o biocurativo 3D obtido após a bioimpressão; (d) recobrir o biocurativo 3D com uma solução de cloreto de cálcio 100 mM; (e) lavar o biocurativo 3D; (f) adicionar meio de cultura de Eagle modificado por Dulbeccos (DMEM); e (g) manter o biocurativo em incubadora por até 15 dias. Adicionalmente, a presente invenção se refere ao biocurativo 3D obtido compreendendo, preferencialmente alginato de sódio 4% e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs), o qual possui efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico. Ainda, a presente invenção se refere ao uso do biocurativo 3D no tratamento de pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE BIOCURATIVO TRIDIMENSIONAL, BIOCURATIVO TRIDIMENSIONAL OBTIDO E SEU USO Campo de Aplicação:

[0001] A presente invenção se insere no campo de curativos, mais especificamente, na área de biocurativos, uma vez que a presente invenção se refere a um processo de obtenção de um biocurativo tridimensional (3D) compreendendo uma associação entre células mesenquimais e biomaterial para o tratamento de pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves.

Antecedentes da Invenção:

[0002] Uma vez que a pele desempenha funções imprescindíveis ao organismo, a perda de sua integridade como observado em feridas complexas, resulta em uma série de complicações.

[0003] A cicatrização é um processo dinâmico e complexo, composto por três fases: inflamação, proliferação e remodelação tecidual, sendo assim, cada fase é finamente regulada por células do sistema imunológico e outras, citocinas e fatores de crescimento específicos, por outro lado, falhas nesse processo, podem ocasionar feridas que demoram longos tempos para cicatrizar, as chamadas feridas crônicas. Patologias de base como diabetes e anemia falciforme estão comumente relacionadas ao desenvolvimento de feridas crônicas. Essas feridas, bem como outras lesões graves de pele tais como as ocasionadas por queimaduras extensas estão associadas a mau prognóstico, longos períodos de tratamento e altos custos para os sistemas de saúde.

[0004] Nesse contexto, a medicina regenerativa por meio da terapia celular tem emergido como alternativa de tratamento para esses pacientes. Dentre as células utilizadas terapeuticamente, as células mesenquimais (CMs) destacam-se principalmente por suas propriedades imunomoduladoras e regenerativas. Contudo, o cultivo dessas células em condições Good Manufacture Pratices (GMP), bem como os métodos para administração dessas células representam desafios para a translação da terapia celular.

[0005] Assim, a associação entre técnicas de cultivo ideais e a utilização de estratégias da engenharia de tecidos e da bioimpressão tridimensional (3D) permitem a obtenção de estruturas celulares tridimensionais reprodutíveis, garantindo não só a manutenção do potencial terapêutico das células como também a segurança do processo de terapia celular e seu fornecimento de maneira menos invasiva aos pacientes.

[0006] Nesse sentido, a presente invenção propõe um processo de obtenção de um biocurativo 3D que utiliza CMs derivadas do cordão umbilical humano (MCUs) ou do tecido adiposo humano (ADSCs) e biomaterial, tal como alginato de sódio, produzidos através da técnica de bioimpressão tridimensional para o tratamento de pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves.

[0007] Alguns documentos do estado da técnica descrevem a utilização de células mesenquimais e biomaterial para a obtenção de materiais para bioimpressão, tal como um biocurativo 3D.

[0008] Ο pedido de patente internacional n° WO 2016/161944 Al, publicado em 13 de outubro de 2016, em nome de SICHUAN REVOTEK CO., LTD., intitulado: "Compositions for cell-based three dimensional printing" descreve uma composição de bio solução ("bio-tinta") que compreende uma pluralidade de "bio-blocos", em que os bio-blocos podem servir como blocos básicos de bioimpressão baseada em células, tais como células mesenquimais (MSC) cultivadas em soro fetal bovino. Em uma concretização, para obtenção dos "bio-blocos", utiliza-se uma solução de alginato de sódio tanto para o preparo do núcleo quanto do exterior do "bio-bloco". Para cura, os bio-blocos são suspensos em uma solução de cloreto de cálcio a 0,1 M. Além disso, os referidos bio-blocos podem ser utilizados para bioimpressão 3D de um scaffold para ser colocado em pele danificada.

[0009] Diferentemente, a presente invenção propõe um processo de obtenção de um biocurativo 3D que utiliza biomaterial (alginato de sódio) e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano, cultivadas livre de xenoantígenos (em soro AB humano), destinado ao tratamento de feridas crônicas e queimaduras graves, em que a solução de cloreto de cálcio é manipulada após pelo menos 5 minutos à bioimpressão do biocurativo. No pedido de patente internacional n° WO 2016/161944 Al é utilizado uma combinação de alginato com colágeno, fibrina, ácido hialurõnico, agarose, entre outros, formando assim uma mistura complexa de alginato e outros biopolímeros, em que provavelmente não produz um bio-bloco livre de xeno-antígenos. Além do referido bio-bloco ser constituído desses biomateriais, é válido ressaltar que as células são depositadas em cima dos mesmos, e não no meio do hidrogel, conforme proposto pela presente invenção, uma vez que é de conhecimento no estado da técnica que a viabilidade celular diminui se colocá-las misturadas com o biomaterial.

[0010] O pedido de patente internacional n° WO 19122351 Al, publicado em 27 de junho de 2019, em nome de CELLINK AB e ENGITIX LTD, intitulado: "Tissue-specific human bioinks for the physiological 3D-hioprinting of human tissues for in vitro culture and transplantation" descreve uma composição para uso em bioimpressão 3D que compreende uma solução de hidrogel de polissacarídeo que pode ser alginato e um material de matriz extracelular específica de tecido humano ou animal (ECM) obtido de tecido descelularizado, em que a composição é fornecida com células, preferencialmente células humanas, tais como células mesenquimais ou derivadas. Além disso, o biocurativo obtido é proposto para uso na cicatrização de feridas.

[0011] Diferentemente, a presente invenção propõe um processo de obtenção de um biocurativo 3D, em que o cultivo de células é realizado em soro AB humano, cada centímetro quadrado do biocurativo contém 1 x 105 células mesenquimais, e após a bioimpressão, é realizada uma cura com solução de cloreto de cálcio a 100 mM apenas após uma pausa de 5 a 15 minutos à bioimpressão do biocurativo. A presente invenção não utiliza tecido descelularizado para obter a matriz para bioimpressão. De maneira geral, o processo proposto pela presente invenção é muito mais simples e, surpreendentemente demostrou que as células misturadas ao alginato sobreviveram e mantiveram ο efeito terapêutico. Normalmente, a literatura cita que as células não sobrevivem bem quando somente o alginato é utilizado.

[0012] O artigo intitulado "Wound Dressing Model of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells-Alginates Complex Promotes Skin Wound Healing by Paracrine Signaling" de autoria de Song Wang et al, publicado em 31 de dezembro de 2015 na revista Stem Cells International, volume 2016, sob DOI n° 10.1155/2016/3269267, descreve o preparo de um biocurativo compreendendo células mesenquimais do cordão umbilical humano suspensas em solução de alginato. Em uma concretização, 1 ml de células foram misturadas com 2 mL de uma solução de 150 mM de alginato de sódio, e posteriormente solidificadas em solução de 150 mM de cloreto de sódio durante 2 a 3 minutos, em que as células foram cultivadas em 10% de soro fetal bovino. Nada é mencionado referente a bioimpressão 3D.

[0013] Diferentemente, a presente invenção propõe um processo de obtenção de um biocurativo 3D, em que o cultivo de células é realizado em soro AB humano, cada centímetro quadrado do biocurativo contém 1 x 105 células mesenquimais, e após a bioimpressão, é realizada cura com solução de cloreto de cálcio a 100 mM apenas após uma pausa de 10 a 15 minutos à bioimpressão do biocurativo. O referido artigo não utiliza o cultivo em soro AB e é silente quanto ao processo de bioimpressão de um biocurativo.

[0014] A tese de doutorado intitulada: "3D Biofabrication of Cell-laden Alginate Hydrogel Structures", publicada em junho de 2017, em nome de Atabak Ghanizadeh Tabriz, descreve um método de bioimpressão 3D para produzir estruturas de hidrogel de alginato mais complexas. Diferentemente, a presente invenção propõe um processo de obtenção de um biocurativo 3D no formato de uma trama com camadas, em que cada centímetro quadrado do biocurativo contém 1 x 105 células mesenquimais, e após a bioimpressão, é realizada cura com solução de cloreto de cálcio a 100 mM apenas após uma pausa de 10 a 15 minutos à bioimpressão do biocurativo.

[0015] A dissertação de mestrado intitulada: "Desenvolvimento de metodologia para produção de soro AB humano para suplementação de melo de cultura destinado ao cultivo de células mesenquimais", publicada em 13 de abril de 2017, em nome de Vanessa Tieko Marques dos Santos, apenas revela a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano para a cultura de células mesenquimais e nada é descrito sobre o uso dessas células em um biocurativo 3D com efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico.

[0016] Portanto, diferentemente do estado da técnica, a presente invenção se refere a preparação de um biocurativo 3D que utiliza biomaterial, tal como alginato de sódio, e células mesenquimais de cordão umbilical humano (MCUs) ou tecido adiposo humano (ADSCs), cultivadas livre de xenoantígenos (em soro AB humano), destinado ao tratamento de feridas crônicas e queimaduras graves.

[0017] Nenhum documento do estado da técnica revela um biocurativo 3D livre de xenoantígenos, tal como proposto pela presente invenção.

[0018] Além disso, um problema técnico existente nos processos de obtenção de biocurativo 3D do estado a técnica é o fato do biomaterial (alginato de sódio) sofrer facilmente deformação quando este é utilizado para bioimpressão 3D. Isso acontece porque em baixas concentrações a viscosidade do mesmo é baixa e o processo de cura e de oxidação do mesmo não é o suficiente para que sua estrutura seja mantida, ao contrário disso, normalmente quando as concentrações de alginato de sódio são maiores, o microambiente para que as células sejam mantidas vivas não é adequado, nesse caso, deve haver um balanço entre a estrutura ideal e a viabilidade celular.

[0019] De modo a resolver o problema técnico apontado, a presente invenção propõe um processo que compreende uma etapa que surpreendentemente evita a deformação do biomaterial. Para tal, a presente invenção propõe a utilização de aproximadamente 4% de concentração de alginato de sódio, na estrutura ideal, obtida por bioimpressão e com o processo de cura mais demorado, contendo um intervalo de aproximadamente 10 minutos antes da adição do cloreto de cálcio.

[0020] Nesse sentido, o efeito técnico que evita a deformação do alginato se encontra, justamente, na etapa de adição da solução do cloreto de cálcio após pelo menos 5 minutos à bioimpressão do biocurativo. Assim, essa etapa é surpreendentemente essencial para a manutenção da forma do biocurativo 3D proposto.

[0021] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve ou sugere um processo de obtenção de um biocurativo 3D que utiliza CMs derivadas de cordão umbilical ou de tecido adiposo humanos cultivadas em meio de cultivo suplementado com soro AB humano e biomaterial, tal como alginato de sódio, produzidos através da técnica de bioimpressão tridimensional para o tratamento de pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves.

Sumário da Invenção;

[0022] A presente invenção propiciará vantagens significativas em relação ao processo de obtenção de biocurativo tridimensional, assim como o biocurativo tridimensional obtido, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0023] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um processo de obtenção de um biocurativo tridimensional (3D) que compreende as etapas de (a) isolar e cultivar células mesenquimais com soro AB humano; (b) realizar bioimpressão tridimensional (3D) utilizando um biomaterial, tal como alginato de sódio, e células obtidas na etapa "a"; (c) colocar em repouso o biocurativo 3D obtido após a bioimpressão; (d) recobrir o biocurativo 3D com uma solução de cloreto de cálcio 100 mM; (e) lavar o biocurativo 3D; (f) adicionar meio de cultura de Eagle modificado por Dulbeccos (DMEM); e (g) manter o biocurativo em incubadora por até 15 dias em meio de cultura DMEM suplementado com soro AB humano.

[0024] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere ao biocurativo 3D obtido compreendendo, preferencialmente alginato de sódio 4% e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs), o qual possui efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico.

[0025] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere ao uso do biocurativo 3D no tratamento de pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves.

Breve descrição das figuras;

[0026] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidos mediante referência às imagens em anexo e a seguinte descrição.

[0027] As Figuras lA-B se referem a um desenho esquemático da trama bioimpressa a partir de arquivo gcode, em que "A" se refere a vista superior do biocurativo, e "B" se refere ã distribuição em camadas do biocurativo.

[0028] A Figura 2 é uma fotografia do aspecto inicial do biocurativo 3D formado após a bioimpressão e cura em solução de cloreto de cálcio 100 mM.

[0029] A Figura 3 representa graficamente ensaios de proliferação de linfócitos em presença de diferentes concentrações de linfócitos co-cultivados com os biocurativos contendo as MCU AB.

[0030] As Figuras 4A-B representam uma fotografia que apresenta a bioimpressora Genesis 3DBS utilizada, em que "A" se refere ao posicionamento da bioimpressora 3D na cabine de fluxo laminar, e "B" se refere ao detalhe dos bicos extrusores da bioimpressora.

[0031] A Figura 5 representa graficamente a cinética da viabilidade celular das MCUs SFB bioimpressas.

[0032] A Figura 6 representa graficamente a cinética da viabilidade celular das MCUs AB bioimpressas.

[0033] A Figura 7 representa graficamente a cinética da viabilidade celular das MCUs bioimpressas em presença de meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de SFB e de meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de plasma rico em plaquetas humano PRP.

[0034] A Figura 8 representa graficamente a comparação da viabilidade celular de MCUs no biocurativo em meio de cultura com 10% de PRP e 10% de soro humano AB.

[0035] As Figuras 9 A-D representam imagens de microscopia confocal dos biocurativos 3D produzidos na bioimpressora Genesis-3DBS, em que A-D são células mesenquimais coradas por CFSE nos períodos referentes a 1, 5, 7 e 10 dias após a bioimpressão.

[0036] As Figuras 10 A-L representam imagens de uma avaliação histológica da reepitelização epidérmica em fragmentos de pele humana incubados com o produto avaliado biocurativo 3D, em que "A-C" se refere ao corte histológico da pele ex vivo submetida à lesão por bisturi seguida de tratamento com placebo, "D-F" se refere ao corte histológico da pele ex vivo submetida à lesão por bisturi seguida de tratamento com o biocurativo 3D, "G-I" se refere ao corte histológico da pele ex vivo submetida à lesão por punch seguida de tratamento com placebo, "J-L" se refere ao corte histológico da pele ex vivo submetida à lesão por punch seguida de tratamento com o biocurativo 3D, em que a barra de referência corresponde a 50 μm.

[0037] A Figura 11 representa graficamente o efeito do produto avaliado biocurativo 3D sobre a produção de TGF-β em cultura de pele humana, submetida à lesão tecidual com auxilio de bisturi e punch, em que os dados representam a média ± desvio padrão de 04 replicatas (ANOVA - Bonferroni).

[0038] A Figura 12 representa graficamente o efeito do produto avaliado biocurativo 3D sobre a produção de KGF em cultura de pele humana, submetida à lesão tecidual com auxilio de bisturi e punch, em que os dados representam a média ± desvio padrão de 04 replicatas (ANOVA - Bonferroni).

[0039] A Figura 13 representa graficamente o potencial de inibição da proliferação de linfócitos dos biocurativos 3D.

[0040] A Figura 14 representa graficamente o potencial de inibição da proliferação de linfócitos dos biocurativos 3D.

[0041] As Figuras 15 A-B representam graficamente o efeito do sobrenadante do biocurativo com CMs coletado 3 (A) e 7 (B) dias após a impressão do biocurativo na hiperalgesia induzida por carragenina em ratos.

[0042] A Figura 16 representa graficamente o efeito do sobrenadante do biocurativo de CMs coletado 3 e 7 dias após a impressão do biocurativo na hiperalgesia induzida por carragenina em ratos.

Descrição detalhada da invenção;

[0043] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes concretizações, os desenhos e a seguinte discussão detalhada mostram uma concretização preferida com o entendimento de que a presente concretização deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito neste relatório.

[0044] A presente invenção se refere a um processo de obtenção de um biocurativo 3D que compreende as seguintes etapas:

• a) Isolar e cultivar células mesenquimais com 5 a 15% de soro AB humano;
• b) Realizar bioimpressão tridimensional (3D) com 1 a 6% de um biomaterial e 0,5 x 105 a 1 x 106 de células obtidas na etapa "a";
• c) Colocar em repouso o biocurativo 3D obtido por pelo menos 5 minutos após a bioimpressão;
• d) Recobrir o biocurativo 3D com uma solução de cloreto de cálcio 100 mM por 5 a 15 minutos;
• e) Lavar o biocurativo 3D por pelo menos 3 vezes em uma solução salina;
• f) Adicionar meio de cultura de Eagle modificado por Dulbeccos (DMEM) compreendendo 5 a 15% de soro fetal bovino ou soro AB humano; e
• g) Manter em incubadora a 33 a 37 °C e 5 a 7% de CO2 por 1 a 15 dias.

[0045] Na etapa "a", as células mesenquimais são selecionadas dentre células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (ADSCs) e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs).

[0046] Em uma concretização preferencial, são utilizadas as células mesenquimais derivadas do MCUs.

[0047] O isolamento e cultivo dessas células é realizado conforme técnicas do estado da arte amplamente divulgadas. Entretanto, é válido ressaltar que o soro AB humano é utilizado para que o processo todo seja feito em condições livres de xeno-antígenos. Alternativamente, o soro fetal bovino (SFB) pode ser utilizado. Mais alternativamente, o plasma rico em plaquetas humano (PRP) pode ser utilizado.

[0048] Após o isolamento e cultivo de células mesenquimais, a etapa "b" de bioimpressão tridimensional é realizada.

[0049] Para tal, a partir da bioimpressora 3D utilizada, primeiramente, são obtidos arquivos compatíveis contendo o código fonte para que seja bioimpressa a malha do biocurativo, bem como seu tamanho e suas de 2 a 10 camadas para a geração de estruturas tridimensionais de 1cm2 a 100 cm2 com o auxilio de um software para fatiamento da imagem.

[0050] O referido arquivo para a confecção do biocurativo 3D deve consistir na deposição camada a camada de 2 a 10 camadas de uma trama, onde as células são dispostas de maneira equidistantes. Preferencialmente, o biocurativo 3D possui de 2 a 10 camadas, mais preferencialmente, 3 camadas. Os poros por sua vez, permitem a passagem de gases e nutrientes, para que a viabilidade celular seja mantida.

[0051] A Figura 1A-B representa um desenho esquemático da trama bioimpressa a partir de um arquivo gcode, em que A é a vista superior do curativo e B é a distribuição em camadas do biocurativo.

[0052] Para bioimpressão à base de extrusão, é utilizado um sistema de seringa única para injeção de soluções viscosas (biotintas), em que a seringa é carregada com um biomaterial.

[0053] O biomaterial é selecionado dentre alginato de sódio, colágeno, ácido hialurônico,gelatina ou celulose.

[0054] Em uma concretização da invenção, o biomaterial é o alginato de sódio a 4% p/v.

[0055] Assim, a estrutura do biocurativo é gerada e impressa sobre placas de cultura estéreis, a partir de modelo criado em um software CAD, do inglês Computer Aided Design.

[0056] Ainda na etapa "b", para a bioimpressão das células, a bioimpressora, após assepsia da mesma, é instalada dentro de uma cabine de fluxo laminar, o que garante a esterilidade do produto bioimpresso. As células são tripsinizadas, contadas e ressuspensas em 1 a 6% de biomaterial em uma concentração de 0,5 x 105 a 1,0 x 106 células/mL, preferencialmente 0,4 x 106 células/mL. Para tal, o bico extrusor da bioimpressora é preenchido com a suspensão de células.

[0057] Dessa forma, cada centímetro quadrado de biocurativo compreende 0,1 x 106 células em 250 μL de biomaterial.

[0058] Após a bioimpressão, na etapa "c", o biocurativo 3D permanece em repouso por pelo menos 5 minutos. Preferencialmente, o biocurativo 3D permanece em repouso por 10 a 15 minutos. Alternativamente, o biocurativo 3D permanece em repouso por 30 minutos.

[0059] A referida pausa é fundamental para a obtenção do biocurativo 3D, uma vez que auxilia para que a estrutura do biocurativo seja mantida antes da adição do cloreto de cálcio.

[0060] Logo após a pausa, na etapa "d" o biocurativo 3D é recoberto por solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 100 mM por um período de 5 a 20 minutos, preferencialmente 10 minutos, para induzir a reticulação pós-impressão.

[0061] Na etapa "e" o biocurativo é lavado por pelo menos 3 vezes em uma solução salina, a qual é selecionada do grupo que consiste em solução salina tamponada com fosfato (PBS), soro fisiológico ou meio de cultivo, em que preferencialmente a solução salina é PBS.

[0062] Posteriormente à lavagem, na etapa "f" é adicionado meio de cultura DMEM compreendendo com 5 a 15% de soro fetal bovino (SFB) ou soro AB humano.

[0063] Alternativamente, é adicionado 10% de plasma rico em plaquetas (PRP) em substituição aos soros SFB ou AB humano após a bioimpressão das células de modo a potencializar o crescimento das mesmas no biocurativo 3D a partir do primeiro dia de cultivo.

[0064] Por fim, na etapa "g", o biocurativo é mantido em incubadora a 35 a 37 °C e 5 a 7% de CO2 por 1 a 15 dias, preferencialmente a 37 °C e 5% de CO2 sem haver troca de meio de cultivo.

[0065] Durante o referido tempo de 1 a 15 dias, o biocurativo obtido já se encontra pronto para uso, podendo ser utilizado em qualquer dia, dentro desse período. Todavia, preferencialmente, o ideal é que seja utilizado após 3 (três) dias de incubação em incubadora de CO2, pois no terceiro dia as células atingem um pico de proliferação.

[0066] Para aplicação do biocurativo o mesmo deve ser retirado da placa de cultura com auxilio de uma pinça estéril, lavado em solução salina e aplicado sobre a ferida/queimadura.

[0067] A Figura 2 é uma fotografia do biocurativo 3D obtido conforme processo da presente invenção.

[0068] Portanto, de forma surpreendente, o processo aqui descrito possibilita a obtenção de um biocurativo 3D composto por células MCUs cultivadas livre de xeno-antigenos (MCU AB) que apresenta viabilidade celular adequada após a bioimpressão de até 15 dias após a bioimpressão.

[0069] Desse modo, adicionalmente, a presente invenção se refere ao biocurativo 3D obtido conforme processo aqui descrito.

[0070] O referido biocurativo 3D compreende:

• - de 0,5 X 105 a 1 X 106% de células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (ADSCs) e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs); e
• - de 1 a 6% de biomaterial.

[0071] Em uma concretização preferencial, o biocurativo 3D é composto por células mesenquimais derivadas do MCUs.

[0072] O biomaterial é selecionado dentre alginato de sódio, colágeno, ácido hialurônico, gelatina ou celulose.

[0073] Em uma concretização preferencial, o biomaterial é o alginato de sódio a 4% p/v.

[0074] O referido biocurativo 3D é composto por pelo menos 2 camadas, preferencialmente 2 a 10 camadas, em que cada centímetro quadrado de biocurativo compreende 0,1 x 106 células em 250 μL de biomaterial.

[0075] O tamanho do biocurativo pode variar entre 1 a 100 cm2.

[0076] O referido biocurativo 3D apresenta viabilidade celular de até 15 dias após a bioimpressão. Para tal, ensaios in vitro de viabilidade resazurina e microscopia confocal foram realizados.

[0077] Ainda, o referido biocurativo possui efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico.

[0078] Portanto, o referido biocurativo 3D da presente invenção é obtido por bioimpressão tridimensional conforme o processo aqui descrito.

[0079] Adicionalmente, a presente invenção propõe o uso do referido biocurativo 3D para cicatrização de feridas de diferentes etiologias.

[0080] O efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico do biocurativo 3D da presente invenção favorece a utilização do mesmo como alternativa de tratamento para pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves, tais como queimaduras de 2 a 4° graus e extensas em superfícies corporais acima de 10% melhorando o prognóstico e a qualidade de vida dos mesmos e minimizando o ônus que o tratamento dessas feridas representa aos sistemas de saúde.

[0081] Adicionalmente é válido enfatizar que o ensaio de cicatrização em pele humana ex vitro demonstrou que a adição dos biocurativos foi capaz de acelerar e melhorar ο processo de cicatrização e aumentar a produção dos fatores de crescimento TGF-β e KGF, importantes durante o processo de cicatrização.

[0082] Com relação ao potencial imunomodulador dos biocurativo da presente invenção, o ensaio de imunossupressão de linfócitos in vitro, demonstrou que os biocurativos 3D diminuiram a proliferação de linfócitos T. Além disso, o efeito analgésico do uso dos biocurativos 3D foi avaliado em modelo experimental de hiperalgesia induzida por carragenina em ratos demonstrando que a utilização dos mesmos foi capaz de produzir um efeito analgésico nesse modelo experimental.

[0083] Portanto, a seguir são apresentados os resultados obtidos pelos diversos testes realizados, os quais são promissores à medida que foi desenvolvido um produto voltado para terapia celular obedecendo características preconizadas pelas regulações vigentes (FDA e Anvisa), com superioridade.

Concretizações Preferenciais da Invenção:

[0084] Para fins de referência, sem limitar a totalidade das possibilidades de processos de isolamento e cultivo das células mesenquimais, a seguir são apresentados exemplos de processos de isolamento e cultivo dessas células.

Isolamento e cultivo de células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (ADSCs):

[0085] Células mesenquimais são obtidas a partir de tecido adiposo humano proveniente de cirurgias de lipoaspiração. O tecido adiposo é mantido em solução de PBS com 10% de antibiótico e anti-fúngico (Gibco) a 4-8 °C por 6 horas. O processo de isolamento de CMs provenientes de tecido adiposo consiste na fragmentação e posterior digestão enzimática do tecido em solução de PBS contendo 30% colagenase tipo 1 (Gibco). O material é incubado nessa solução por 1 hora em Banho Maria a 37 °C. Após incubação, a colagenase é inativada pela adição de igual volume de meio de cultura DMEM/F12 (Gibco)10% SFB (Thermo Scientific), essa solução é centrifugada por 10 minutos a 500 g e o pellet ressuspenso em PBS. Após centrifugação, o sobrenadante é descartado e o pellet ressupenso em meio de cultura DMFM/F12 10% SFB. A suspensão de células é plaqueada em garrafas de cultura e mantida em estufa com 5% de CO2 a 37°C.

[0086] Após 24-36 horas em cultura, todo o sobrenadante contendo as células não aderentes é removido e é adicionado novamente meio de cultura DMEM 15% SFB; as garrafas são mantidas em estufa (5% de CO2 à 37°C).

- Isolamento, cultivo e expansão de células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs):

[0087] Todo o cordão umbilical é processado. Sumariamente, o cordão umbilical é fragmentado em pedaços com o menor tamanho possível e submetido ã técnica de cultivo por explantes que são transferidos para garrafas de cultura e cultivados a 37° C, em meio DMEM suplementado com 10% soro AB humano, acrescido de L-glutamina, antibióticos (penicilina e estreptomicina) e anfotericina B.

[0088] As células não aderentes são removidas após 4 a 6 dias de cultivo e as células aderentes são cultivadas nas mesmas condições até confluência média de 80%, quando são coletadas por tripsinização. As amostras que apresentaram alteração nos testes de triagem sorológica são descartadas.

[0089] Após a caracterização das MCUs, as mesmas foram utilizadas no processo de bioimpressão dos biocurativos. A seguir é apresentado uma concretização do processo da presente invenção.

- Bioimpressão tridimensional:

[0090] Para bioimpressão tridimensional (manufatura aditiva) foi utilizado a bioimpressora 3D produzida pela 3D Biotecnology Solutions (3DBS).

[0091] Arquivos contendo os parâmetros para a geração de estruturas tridimensionais de 1cm2 ou 8 cm2 foram gerados com o auxilio do software Cura para fatiamento da imagem criada em Autocad. Os arquivos em formato stl. e gcode. podem ser reconhecidos pelo software de domínio público Pronterface compatível com o protótipo de bioimpressora utilizado.

[0092] Foi utilizado um sistema de seringa única para injeção de soluções viscosas (biotintas). A seringa foi carregada com alginato de sódio a 4% p/v (número do produto: W201502, Sigma-Aldrich) (HE et a1., 2016). As estruturas dos biocurativos foram geradas e impressas sobre placas de cultura estéreis, a partir de modelo criado em CAD.

[0093] Para a bioimpressão das células, o equipamento foi instalado dentro da cabine de fluxo laminar, o que garantiu a esterilidade do produto bioimpresso.

[0094] As Figuras 4A-B mostram a bioimpressora Genesis 3DBS utilizada, em que "A" se refere ao posicionamento da bioimpressora 3D na cabine de fluxo laminar, e "B" se refere ao detalhe dos bicos extrusores da bioimpressora.

[0095] As células foram tripsinizadas, contadas e ressuspensas no hidrogel de alginato 4% (Sigma-Aldrich) em uma concentração de 0,4 x 106 células/mL. Dessa forma, cada centímetro quadrado de biocurativo continha 0,1 x 106 células em 250 μL de alginato.

[0096] Após a bioimpressão, os biocurativos 3D, permaneceram em repouso por 10-15 min e foram então recobertos por solução de cloreto de cálcio 100 mM (Sigma-Aldrich). Transcorridos 10 minutos essa solução foi retirada e os biocurativos lavados por 3 vezes em PBS.

[0097] Por fim, foi adicionado meio de cultura DMEM (Gibco) contendo 10% de soro fetal bovino (Thermo Scientific) ou 10% de soro AB humano e os biocurativos foram mantidos em incubadora a 37°C e 5% de CO2 sem que houvesse troca de meio de cultivo.

[0098] Como alternativa, o presente processo utiliza plasma rico em plaquetas (PRP) como estimulo para manutenção celular do biocurativo 3D, as quais foram obtidas conforme a seguir:

- Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como estímulo para manutenção celular:

[0099] O sangue venoso periférico foi obtido de doadores voluntários sadios, com idade entre 26-28 anos, a partir de venóclise do antebraço. O sangue foi coletado em tubos contendo anticoagulante citrato de sódio a 3,2% (4,5 mL) (BD, New Jersey, USA).

[0100] O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) foi obtido a partir da centrifugação das amostras a 200 g por 10 minutos para a separação do plasma. Posteriormente, a fração de plasma sobrenadante foi coletada e transferida para tubo falcon de 15 mL. O plasma foi centrifugado, novamente, a 200 g por 10 minutos para a concentração plaquetária. Após a segunda centrifugação, a fração liquida equivalente a 2/3 superior do volume contida no tubo foi descartada, sendo o 1/3 inferior do volume definido como a fração correspondente ao PRP.

- Soro AB humano em substituição do soro fetal bovino (SFB):

[0101] Após a padronização dos biocurativos utilizando o cultivo convencional, onde o soro fetal bovino (SFB) é o principal nutriente do meio de cultura, objetivando o cultivo livre de xeno-antígenos, foi utilizado o soro AB humano. O soro humano, foi obtido do processamento de plasma comum AB, após o cumprimento da "quarentena" por meio da adição de CaCl2 0,1M na proporção de 9:1 ou C12H22CaO14 0,01M.

Testes realizados:

[0102] Os testes para avaliação da identidade celular foram realizados entre a 5a e a 6a passagem das células, e consistiram em: a) testes para avaliação da identidade (imunofenotipagem por citometria de fluxo) e b) testes para avaliação da potência celular (diferenciação multipotencial).

- Testes para caracterização das células mesenquimais

[0103] A avaliação da identidade celular foi feita pelo acompanhamento da morfologia celular, potencial de diferenciação em adipócitos e osteócitos e pela análise do perfil de expressão dos marcadores de superfície por citometria de fluxo as células. Esses testes em conjunto definem as células como mesenquimals.

[0104] Nesse sentido, células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs) foram isoladas e cultivadas tanto nas condições habituais (MCU SFB) quanto em condições livre de xeno-antígenos (MCU AB). Para o cultivo em condições livre de xeno-antígenos, em substituição ao soro fetal bovino (SFB) foi adicionado ao meio de cultura, 10% de soro AB humano. Antes de serem utilizadas essas células foram caracterizadas e demonstraram possuir identidade compatível às células mesenquimais.

a) Avaliação da morfologia por microscopia invertida.

[0105] Foi realizada a cada passagem celular.

b) Imunofenotipagem por citometria de fluxo, com os seguintes marcadores: CD14, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD73, CD105, CD146, CD166, HLA-ABC, HLA-DR, KDR.

[0106] Para a análise do perfil de expressão dos marcadores de superfície por citometria de fluxo, as células foram transferidas para tubos de ensaio e marcadas direta ou indiretamente por anticorpos monoclonais ou isotipos controles conjugados a fluorocromos. Foram feitas marcações com diversos antígenos para análise das subpopulações celulares, além destes, as células foram marcadas com anexina e 7AAD para avaliação concomitante da viabilidade celular. A seguir, as células foram adquiridas no citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, BD) e analisadas utilizando-se o software Cellquest (BD).

[0107] A Tabela 1 demonstra que as MCUs AB, apresentaram imunofenótipo característico de células mesenquimais (HORWITZ et al., 2005) com alta expressão dos marcadores: CD73, CD44, CD13, CD29, CD90, CD49, CD54, CD105, CD146 e CD166 e ausência ou baixa expressão dos marcadores: CD14, CD45, CD106, CD34, CD31, CD338, HLA-DR e HLA-1.

[0108] É interessante observar as baixas marcações para HLA-DR e HLA-1, moléculas do complexo principal de histocompatibilidade, responsáveis pelo reconhecimento de alo-antígenos e pela rejeição e complicações em transplantes não aparentados (DELGADO; LA, 2018). Essa baixa expressão de HLA, compatível com CMs de diversas fontes (LE BLANC et al., 2003) é um ponto fundamental na proposta de produção de biocurativos 3D originados de fontes alogênicas, demonstrando a viabilidade da utilização de bancos de células pré-estabelecidos.

[0109] Os biocurativos 3D compostos por células alogênicas podem ser estocados e estarem disponíveis rapidamente quando necessário, o que representará um ganho para o tratamento do paciente grande queimado, uma vez que o mesmo necessita de cuidados rápidos (ATIYEH; GUNN; HAYEK, 2005) e o cultivo de células autólogas é um processo relativamente demorado.

[0110] Uma vez que CMs apresentam fortes propriedades imunomoduladoras, um método muito comum para avaliação das propriedades terapêuticas de CMs em cultura consiste no ensaio de inibição de proliferação de linfócitos. Nesse ensaio, as CMs são cultivadas com PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) submetidos à estímulos antigênicos e o potencial de supressão da proliferação de linfócitos é avaliado. Nesse contexto, as MCUs AB quando co-cultivadas com linfócitos estimulados foram capazes de diminuir a proliferação dos mesmos de aproximadamente 71% para cerca de 5% comprovando seu potencial imunossupressor in vitro (Figura 3).

c) Diferenciação celular em adipócltos e osteócltos.

[0111] Alíquotas de 1 mL contendo 20.000 células/mL (diferenciação em adipócitos e osteócltos) e 5.000 células/mL (controle) foram cultivadas em placas de 24 poços com lamínulas para a realização de estudos morfológicos. O meio utilizado para a indução da diferenciação em adipócitos foi o DMEM 15% SBF, suplementado com 10 μΜ de dexametasona, 10 μg/mL de insulina e 100 mM de indometacina, já para os osteócltos, foi utilizado DMEM 7,5% SBF suplementado com 0,10 μΜ de dexametasona, 100 μΜ de ácido ascórbico e 10 mM de β gllcerolfosfato.

- Ensaios de viabilidade celular por microscopia confocal e por resazurina:

[0112] Para o ensaio de viabilidade celular por microscopia confocal, as CMs utilizadas nos biocurativos foram previamente coradas pelo marcador fluorescente carhoxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE-Thermo Scientific).

[0113] Alíquotas de 1 x 106 células foram ressuspensas em 2,0 mL de PBS contendo 5,0 μΜ de CFSE (Carhoxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Molecular Probes, USA) por 10 minutos a 37°C. Essa reação foi interrompida pela adição de 5 volumes de RPMI 10% (Gibco), SBF (Thermo Scientific) gelado, em seguida, a suspensão celular foi incubada por 5 minutos em gelo e no escuro.

[0114] Após esse procedimento as células foram lavadas em PBS por 3 vezes, contadas e utilizadas para a bioimpressão.

[0115] As imagens foram realizadas em microscópio confocal de escaneamento a laser Leica TCS SP8.

[0116] O ensaio de viabilidade por resazurina tem sido muito utilizado uma vez que a reação intracelular de conversão da forma oxidada não fluorescente da resazurina na forma reduzida fluorescente pode ser detectada por espectrofotometria identificando as células metabolicamente ativas (BONNIER et al., 2015).

[0117] Para a realização do ensaio, os biocurativos foram retirados do meio de cultura e incubados em solução de rezasurina (Sigma-Aldrich) (0,025 mg/mL em PBS) por 6 horas a 37°C em incubadora com 5% de CO2. Após a incubação, a intensidade de fluorescência foi analisada em espectrofotômetro (ʎ excit 540 nm e ʎ emi 590 nm).

[0118] Tanto as MCUs cultivadas em condições habituais (MCU SFB) quanto as cultivadas livre de xeno-antigenos (MCU AB) apresentaram viabilidade celular adequada após a bioimpressão. A cinética da viabilidade celular tanto das MCU SFB quanto das MCU AB demonstrou um breve crescimento em torno do terceiro dia de cultivo, seguido de decréscimo, porém permanecendo viável pelo período analisado.

[0119] A Figura 5 representa graficamente a cinética da viabilidade celular das MCUs SFB bioimpressas, em que a cinética é avaliada através da marcação com corante fluorescente resazurina, e os resultados são expressos em relação à média de no mínimo três biocurativos por período avaliado.

[0120] Já a Figura 6 representa graficamente a cinética da viabilidade celular das MCUs AB bioimpressas, em que a cinética é avaliada através da marcação com corante fluorescente resazurina, e os resultados são expressos em relação à média de no mínimo três biocurativos por período avaliado.

[0121] Com o intuito de melhorar a viabilidade das células bioimpressas e também de obter outro tipo de alternativa para o cultivo celular livre de xeno-antígenos, foi testado ainda o cultivo dos biocurativos 3D em plasma rico em plaquetas (PRP), como citado anteriormente, o PRP é um potente estimulante de crescimento celular in vitro (SILVA et al., 2018; STESSUK et al., 2016) e a adição de 10% de PRP em substituição ao SFB após a bioimpressão das células, potencializou o crescimento das mesmas nos biocurativos 3D a partir do primeiro dia de cultivo, perdurando até o quinto dia, como demonstrado na Figura 7.

[0122] A Figura 7 representa graficamente a cinética da viabilidade celular das MCUs bioimpressas em presença de meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de SFB e de meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de PRP, em que a cinética é avaliada através da marcação com corante fluorescente resazurina, e os resultados são expressos em relação ã média de no mínimo três biocurativos 3D por período avaliado.

[0123] O mesmo comportamento foi observado quando foi avaliado a cinética dos biocurativos 3D contendo MCUs cultivadas livre de xeno-antígenos, isto é, cultivo celular suplementado com soro AB ou PRP. Da mesma forma que nos experimentos anteriores, a adição de PRP ao meio de cultivo dos biocurativos 3D potencializou o crescimento celular quando comparado ao soro AB.

[0124] A Figura 8 representa graficamente a comparação da viabilidade celular de MCUs no biocurativo em meio de cultura com 10% de PRP e 10% de soro humano AB, em que os biocurativos de MCUs contidas no alginato tiveram seu crescimento acompanhado por 5 dias tanto quando cultivados em meio de cultura com 10% soro AB humano (MCU/AB) ou 10% PRP (MCU/PRP), e a viabilidade celular é inferida pela quantificação da fluorescência em nm emitida através da reação com a resazurina após 6h de incubação.

[0125] Dessa forma, uma vez que o cultivo celular em 3D oferece um desafio extra ao crescimento celular quando comparado ao cultivo bidimensional, em monocamada, o PRP representou um bom estimulador do crescimento celular.

[0126] Assim, a avaliação da viabilidade celular das MCUs AB contidas nos biocurativos 3D foi confirmada por microscopia confocal (qualitativa) onde as MCUs permaneceram viáveis durante o período analisado (10 dias após a bioimpressão) (Figura 9).

- Ensaio de cicatrização em modelo de pele humana ex vivo e dosagem de TGF-β e KGF:

[0127] O ensaio de cicatrização em modelo de pele humana ex vivo foi realizado pela empresa Kosmoscience, de acordo com o protocolo que segue:

[0128] Fragmentos de pele humana obtidos de cirurgia plástica eletiva foram submetidos à lesão tecidual por bisturi e punch e tratados com o biocurativo da presente invenção por 144 horas. Em seguida, foi realizada a avaliação histológica e quantificação dos fatores de crescimento TGF-β e KGF.

- Cultura de pele humana:

[0129] Os fragmentos de pele utilizados neste estudo foram provenientes de um (01) indivíduo sadio, do sexo feminino, fototipo III, 56 anos, submetido à cirurgia plástica eletiva na região do abdômen (abdominoplastia). Após a realização do procedimento cirúrgico os fragmentos de pele foram coletados em frascos plásticos contendo soro fisiológico 0,9% e mantidos em refrigeração por até 24 horas. Esse projeto não contemplou o armazenamento e estocagem do material biológico para uso futuro, sendo que os fragmentos sobressalentes foram descartados apropriadamente como lixo infectante. A utilização de fragmentos de pele humana provenientes de cirurgias eletivas para realização deste estudo foi submetida para o Comitê de Ética em Pesquisas da Universidade São Francisco - SP, CAAE 82685618.9.0000.5514, sob o parecer 2.493.285.

- Protocolo de tratamento:

[0130] Os fragmentos de pele foram fracionados em pedaços de aproximadamente 1,5 cm2, acondicionados em placas de culturas (Corning, USA) com meio de cultivo apropriado e mantidos em incubadora a 37°C em presença de 5% de CO2. Em seguida, foram submetidos à lesão tecidual, com auxilio de bisturi e punch e tratados com o biocurativo da presente invenção por 144 horas. Após esse período, os fragmentos foram submetidos ã análise histológica para avaliação da reepitelização epidérmica e mensuração do fator de crescimento transformador (TGF-β) e fator de crescimento de queratinócitos (KGF) por ELISA.

- Quantificação de TGF-β e KGF:

[0131] As quantificações dos mediadores TGF-β e KGF foram realizadas no sobrenadante por meio de ensaio imunoenzimático, utilizando kits adquiridos comercialmente (R&D, BD). A leitura da absorbância foi realizada a 450 nm em monocromador Multiskan GO (Termo Scientific).

- Análise estatística:

[0132] Para a avaliação estatística utilizou-se o teste ANOVA que permitiu mensurar a variação dos resultados, comparando os dados entre os grupos. Em seguida foi aplicado o pós-teste Bonferroni, que reforçou e tornou ainda mais preciso o resultado apresentado no teste ANOVA. Foi utilizado o nível de significância de 5% (GraphPad Prism v6).

[0133] No processo de cicatrização cutâneo, os queratinócitos desempenham um papel central não apenas como célula estrutural chave na pele regenerada, mas também como fonte de fatores de crescimento e estimulo da proliferação e migração celular, tal como fator de crescimento de queratinócitos (KGF), demonstrando um papel crucial no reparo tecidual.

[0134] A produção de mediadores inflamatórios, tais como PGE2 e IL-6, associados à pele lesionada, assim como ao processo de envelhecimento cutâneo intrínseco e extrínseco, é um importante fator na exacerbação da resposta imunológica que pode interferir negativamente com o processo de cicatrização da pele, desarmonizando as etapas de re-epitelização, coesão e hidratação epidérmica.

[0135] Assim, a disponibilização de produtos com propriedades regeneradoras através da otimização da atividade dos fibroblastos e estimulo da hidratação e coesão cutânea promovendo uma melhora na produção das proteínas acima descritas podem ser um diferencial importante no processo de reparação tecidual.

[0136] Na figura 10 são apresentados os resultados da reepitelização epidérmica a partir de fragmentos de pele ex vivo.

[0137] Conforme pode-se observar, a Figura 10 demonstra uma aparente regeneração principalmente na região dérmica, acompanhando o sentido homeostático de renovação -da derme reticular para papilar. Além disso, a densidade das fibras após tratamento com o biocurativo 3D é maior do que quando comparado ao grupo placebo (Biocurativo 3D sem MCUs).

[0138] Nas Figuras 11 e 12 são apresentados os resultados de quantificação dos fatores de crescimento TGF-β e KGF, a partir de fragmentos de pele ex vivo submetidos à lesão tecidual, por bisturi e punch. Na Figura 11 pode-se observar que os fragmentos submetidos à lesão por bisturi seguido de tratamento com o biocurativo 3D da presente invenção produziu um aumento de 39,74% na produção de TGF-β quando comparado ao grupo PLACEBO (P<0,001). Já os fragmentos submetidos à lesão por punch seguido de tratamento com o biocurativo 3D da presente invenção produziu um aumento de 28,31% na produção de TGF-β quando comparado ao grupo PLACEBO (P<0,05).

[0139] Na figura 12 pode-se observar que os fragmentos submetidos à lesão por bisturi seguido de tratamento com ο biocurativo 3D da presente invenção não produziu alteração na produção de KGF quando comparado ao grupo PLACEBO. Por outro lado, os fragmentos submetidos à lesão por punch seguido de tratamento com o biocurativo 3D da presente invenção produziu um aumento de 21,11% na produção de KGF quando comparado ao grupo PLACEBO (P<0,05).

[0140] Os resultados obtidos permitem inferir que o biocurativo 3D da presente invenção avaliado exerce um efeito positivo no processo de reparo e regeneração tecidual, auxiliando no processo de cicatrização da pele, por meio do aumento na produção de TGE-β e KGE.

- Ensaio de ímunossupressão da proliferação de células T:

[0141] Um importante efeito terapêutico das CMs é baseado em seu potencial imunomodulador, essa propriedade é extremamente interessante para tratamento de lesões complexas de pele uma vez que uma fase inflamatória da cicatrização bem orquestrada é fundamental para o curso ideal de todo o processo. O processo de imunomodulação pelas CMs é descrito em inúmeras células do sistema imunológico (GAO, 2016), nesse sentido, buscamos responder se o potencial imunomodulador das CMs seria mantido após o processo de bioimpressão e do cultivo dessas células nos biocurativos.

[0142] Para isso, foi realizado um ensaio de inibição da proliferação de linfócitos em presença do biocurativo 3D e foram testadas três concentrações de CMs e PBMCs (peripheral blood mononuclear cell), 1 CM para 1 PBMC (1:1), 1 CM para 2 PBMCs (1:2) e 1 CM para 4 PBMCs (1:4), dessa forma, uma vez que a concentração de CMs nos biocurativos é fixa, variou-se apenas o número de PBMCs.

[0143] Os biocurativos 3D contendo CMs foram co-cultivadas com células mononucleares de sangue periférico (PBMC) marcadas com Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) em diferentes concentrações e estimuladas com Phytohemagglutinin (PHA). A proliferação dos linfócitos foi analisada pela diluição de CFSE por citometria de fluxo. Na citometria de fluxo foram selecionados os linfócitos T através da marcação com anticorpos anti CD3, anti-CD-4 e anti-CD8 (BD, Biosciense).

[0144] Nas análises por citometria de fluxo, foram adicionados anticorpos anti-CD3 + anti-CD4 para a identificação de linfócitos TCD4 ou anti-CD3 + anti-CD8 para a quantificação de linfócitos TCD8 e as análises foram feitas a partir dessas populações celulares especificas.

[0145] Após 3 dias do co-cultivo dos biocurativos 3D com PBMCs observamos uma porcentagem de inibição da proliferação de linfócitos de aproximadamente 50% para a maior concentração de CMs utilizada (1:1), de aproximadamente 30% para a concentração 1:2 e de 20% para a concentração 1:4 (Figura 13), sendo que a porcentagem de inibição da proliferação foi similar para linfócitos TCD4 e para linfócitos TCD8.

[0146] A Figura 13 representa graficamente o potencial de inibição da proliferação de linfócitos dos biocurativos 3D, em que as PBMCs são marcadas com CFSE (5 μΜ) em diferentes concentrações e estimuladas com PHA (2 μg/mL). Os resultados são referentes ao terceiro dia de co-cultivo e para o cálculo do potencial de Inibição foi utilizada a seguinte fórmula: [(% células CD3+CFSE low -células CD3+CFSE low co-cultivadas com os biocurativos)% células CD3+CESE low] x 100. Ainda, os resultados são apresentados como média ± desvio padrão.

[0147] Transcorridos cinco dias do co-cultivo dos biocurativos 3D com as PBMCs, as análises por citometria de fluxo demonstraram que altas taxas de Inibição da proliferação de linfócitos foram obtidas, chegando a cerca de 90% para as concentrações 1:1 e 1:2 e 80% para a concentração 1:4, tanto para linfócitos TCD4 quanto para linfócitos TCD8 (Figura 14).

[0148] A Figura 14 representa graficamente o potencial de Inibição da proliferação de linfócitos dos biocurativos 3D, em que as PBMCs são marcadas com CFSE (5 μΜ) em diferentes concentrações e estimuladas com PHA (2 μg/mL). Os resultados são referentes ao quinto dia de co-cultivo e para o cálculo do potencial de inibição foi utilizada a seguinte fórmula: [(% células CD3+CFSE low -células CD3+CFSE low co-cultivadas com os biocurativos)% células CD3+CFSE low] x 100. Ainda, os resultados são apresentados como média ± desvio padrão.

[0149] Esses resultados sugerem que o potencial imunomodulador das CMs dos biocurativos é mantido após a confecção dos mesmos, indicando o potente efeito anti- inflamatório dos biocurativos 3D produzidos.

- Ensaio para avaliação do limiar nociceptivo:

[0150] Feridas são lesões que podem ser extremamente dolorosas para os seus portadores, a dor, na maioria das vezes é a principal queixa desses pacientes, dessa forma, diminuir a dor dos pacientes portadores de feridas crônicas ou queimaduras graves é extremamente relevante à medida que promove a melhora da qualidade de vida desses pacientes.

[0151] Nesse sentido, o potencial analgésico dos biocurativos 3D foi testado em modelo de hiperalgesia Induzida por carragenina em ratos.

[0152] Seis ratos Wistar (300-350g) foram utilizados por grupo experimental.

[0153] A hiperalgesia foi induzida através da aplicação de solução de carragenina 100μg/50μL/pata. A solução de carragenina foi feita diluindo a droga em 0,9%NaCl (salina) imediatamente antes do uso. Foi demonstrado que a dose de 100μg induz hiperalgesia cujo pico ocorre 3h após a administração e persiste por pelo menos 24h (Bonet et al., 2013).

[0154] Uma vez que grande parte do efeito terapêutico das CMs advém de seu efeito parácrino (Meirelles, 2009), amostras do sobrenadante de cultivo dos biocurativos 3D foram coletadas 3 dias e 7 dias após o cultivo dos biocurativos. Dessa forma, para a realização desse ensaio, os animais submetidos ao modelo de hiperalgesia com carragenina foram tratados com aplicação local do sobrenadante do cultivo dos biocurativo.

[0155] Após a indução da hiperalgesia 50μL do sobrenadante do cultivo do biocurativo com CMs coletado 3 e 7 dias após a impressão do biocurativo foram injetados nas patas dos animais. O controle do experimento foi feito através da injeção de 50μL de meio de cultura não condicionado. Todas as drogas foram injetadas no tecido subcutâneo do dorso da pata traseira.

[0156] A hiperalgesia mecânica foi quantificada usando o teste de retirada de pata de Randall-Sellito (Randall & Sellito, 1957). Este equipamento possui um dispositivo de compressão com dois itens: uma superfície plana na qual a planta da pata repousa e uma parte cônica que exerce pressão no dorso da pata. No momento do teste, o experimentador pressiona um pedal que transmite ã parte cônica uma força que aumenta linearmente, pressionando a pata do rato. Esta pressão é quantificada por um cursor móvel que desliza sobre uma escala e mostra, em gramas, a pressão sendo exercida no momento. Quando o rato retira a pata, o experimentador libera o pedal para parar o indicador de força e lê a escala. O Limiar de Retirada da Pata (LRP) foi definido como a média de três medidas alternadamente realizadas.

[0157] Os animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos experimentais. No dia do experimento os tratamentos foram avaliados como segue: foi avaliado o limiar de retirada de pata (LRP) basal, e logo após a Carragenina (100μg/50μL) foi administrada no dorso da pata traseira e o LRP foi avaliado 1h e 2h após a injeção. Imediatamente após a avaliação realizada 2 h após a injeção de carragenina (1h antes do pico da hiperalgesia induzida pela carragenina), os ratos receberam a administração no dorso da pata traseira ipsilateral a que recebeu carragenina um dos seguintes tratamentos:

• - Grupo 1: sobrenadante de biocurativo com células mesenquimais coletado 3 dias após a impressão do biocurativo;
• - Grupo 2: sobrenadante de biocurativo com células mesenquimais coletado 7 dias após a impressão do biocurativo;
• - Grupo 3: meio de cultura celular (veiculo). O LRP, então, foi avaliado imediatamente, 1h e 2h após o tratamento.

[0158] Para analisar se houve diferenças entre os diferentes grupos ao longo de todo o período de experimentação foi feita análise de variância two-way (two-way ANOVA), seguido pelo teste de Bonferroni. A análise dos tratamentos em apenas um tempo foi feita através da análise de variância one-way (one-way ANOVA) seguido pelo teste de Tukey. O nível aceito para significância estatística foi de p<0,05.

[0159] Os animais tratados com o sobrenadante do biocurativo 3D coletado 3 e 7 dias após a impressão do biocurativo tiveram um Limiar de Retirada de Pata (LRP) significativamente maior do que os do grupo que recebeu apenas meio de cultura nos tempos 0, 1 e 2 horas após os tratamentos (Figura 15).

[0160] As Figuras 15 A-B representam graficamente o efeito do sobrenadante do biocurativo com CMs coletado 3 (A) e 7 (B) dias após a impressão do biocurativo na hiperalgesia induzida por carragenina em ratos. A Carragenina (100μg/50μL) foi administrada no dorso da pata traseira de ratos. Depois de 2h, a mesma pata recebeu 50μL de meio de cultura celular (veículo) ou do sobrenadante de biocurativo com células mesenquimais - 3 dias (A) ou 7 dias (B). Ambos os tratamentos foram capazes de aumentar o LRP imediatamente, 1 e 2 horas após a injeção (2-Way ANOVA para medidas repetidas seguido por teste de Bonferroni. *p<0,05; **: p<0,01; ***p<0,001 indica LRP significativamente maior (analgesia) que ο do grupo de animais que recebeu o meio de cultura. Dados apresentados como média ± erro padrão da média de 6 ratos/grupo).

[0161] Como o aumento do Limiar de Retirada de Pata representa analgesia, os resultados demonstram sobrenadante do biocurativo 3D com CMs possui efeito analgésico.

[0162] Foi demonstrado que o pico da hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina ocorre 3h após a sua administração (BONET, 2013). Os ratos foram tratados 2 horas após a injeção de carragenina e o LRP avaliado 0, 1 e 2 horas após. O efeito dos tratamentos sobre o LRP 3 horas após a injeção de carragenina está demonstrado na Figura 16. Tanto os grupos tratados com o sobrenadante do biocurativo coletado 3 dias após a bioimpressão quanto os tratados com biocurativo de 7 dias apresentaram um LRP significativamente maior do que o dos animais tratados com meio de cultura (Figura 16) demonstrando o efeito analgésico dos tratamentos no pico da hiperalgesia induzida por carragenina. O LRP do grupo tratado com sobrenadante de biocurativo de 7 dias foi semelhante ao LRP basal e significativamente maior do que o LRP do grupo tratado com sobrenadante de biocurativo de 3 dias e meio de cultura, o que indica que o sobrenadante do biocurativo de 7 dias possui um efeito analgésico maior que o sobrenadante do biocurativo de 3 dias.

[0163] A Figura 16 representa graficamente o efeito do sobrenadante do biocurativo de CMs coletado 3 e 7 dias após a impressão do biocurativo na hiperalgesia induzida por carragenina em ratos. Na 3ah após a injeção de carragenina e 1h após os tratamentos, os ratos tratados com sobrenadante do biocurativo tiveram um LRP maior do que os ratos que receberam meio de cultura (indicado por "***"). O tratamento com sobrenadante do biocurativo de 7 dias induziu um efeito analgésico maior do que o sobrenadante do biocurativo de 3 dias (indicado por "##"). ***p<0,001 indica um LRP significativamente maior que o do grupo que recebeu o meio de cultura; ##p<0,01 indica um LRP significativamente maior que o do grupo que recebeu o sobrenadante de biocurativo coletado de 3 dias após a impressão do biocurativo. Dados apresentados como média ± erro padrão da média de 6 ratos/grupo).

[0164] Portanto, o desenvolvimento de biocurativos 3D utilizando tanto células mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSCs) quanto células derivadas do cordão umbilical (MCUs) é inédito e demonstrou-se viável em experimentos in vitro.

[0165] A possibilidade de utilização de células de origem alogênicas, provenientes de bancos de células pré-existentes pode representar a agilidade do tratamento dos pacientes e escalabilidade da produção, além disso, a utilização de células menos maduras (MCUs) provenientes de indivíduos mais novos é promissora com relação ao potencial terapêutico.

[0166] Apesar de as agências regulatórias atualmente não exigirem que as células destinadas a terapia celular sejam cultivadas em condições livre de xeno-antígenos, o processo de obtenção do biocurativo 3D da presente invenção utilizando células mesenquimais demonstrou-se viável, dessa forma, ο produto obtido é adequado à essas características o que atribui maior grau de segurança.

[0167] Por fim, ensaios funcionais demonstraram que os biocurativos 3D contendo CMs possuem efeito anti-inflamatório e analgésico, além disso, indicam também que o potencial cicatricial das CMs é mantido após o processo de bioimpressão.

[0168] Assim, as concretizações apresentadas na presente invenção não limitam a totalidade das possibilidades, será entendido que várias omissões, substituições e alterações podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.

[0169] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidos e contemplados.

[0170] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai.

[0171] Os técnicos versados no assunto irão valorizar os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas concretizações apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[0172] ADRIANO FARINA, J. et al. Autologous adipose-derived stem cell for painful leg ulcers in patients with sickle cell disease. A preliminary study. British Journal of Haematology, 2019.

[0173] ATIYEH, B. S. ; GUNN, S. W.; HAYEK, S. N. State of the art in burn treatment. World journal of surgery, v. 29, n. 2, p. 131-48, Feb. 2005.

[0174] BADILLO, A. T. et al. Treatment of diabetic wounds with fetal murine mesenchymal stromal cells enhances wound closure. Cell and tissue research, v. 329, n. 2, p. 301-11, Aug. 2007.

[0175] ATIYEH, B. S.; GUNN, S. W.; HAYEK, S. N. State of the art in burn treatment. World journal of surgery, v. 29, n. 2, p. 131-48, Feb. 2005.

[0176] BADILLO, A. T. et al. Treatment of diabetic wounds with fetal murine mesenchymal stromal cells enhances wound closure. Cell and tissue research, v. 329, n. 2, p. 301-11, Aug. 2007.

[0177] BARTHEL, R.; ABERDAM, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: JEADV, v. 19, n. 4, p. 405-13, Jul. 2005.

[0178] BELLINI, Z. et al. Combining xanthan and chitosan membranes to multipotent mesenchymal stromal cells as bioactive dressings for dermo-epidermal wounds. Journal of biomaterials applications, v. 0, n. 0, p. 1-12, 2014.

[0179] BOLAND, T. et al. Drop-on-demand printing of cells and materials for designer tissue constructs. Material Science & Engineering, v. 27, p. 372-376, 2007.

[0180] BONET, IJM; FISCHER, L; PARADA, CA; TAMBELI, CH. (2013) The role of Transient Receptor Potencial A 1 (TRPAl) in the development and maintenance of carrageenan-induced hyperalgesia. Neuropharmacology, 65:206-212.

[0181] BONNIER, F. et al. Cell viability assessment using the Alamar blue assay : A comparison of 2D and 3D cell culture models. Toxicology in Vitro, v. 29, p. 124-131, 2015.

[0182] BOULTON, A. J. et al. The global burden of diabetic foot disease. Lancet, v. 366, n. 9498, p. 1719-1724, 2005.

[0183] CALIARI-OLIVEIRA, C. et al. Xenogeneic mesenchymal stromal cells improve wound and modulate the immune response in an extensive burn model. Cell Transplantation, 2015.

[0184] CLARK, M. Alginates in Dressings and Wound Management. Birmingham: [s.n.] .

[0185] COLOMBO, M.; RAPOSO, G.; THÉRY, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology, v. 30, n. 1, p. 255-289, 2014.

[0186] COSTA, A. M. et al. Custos do tratamento de úlceras por pressão em unidade de cuidados prolongados em uma instituição hospitalar de Minas Gerais. Enfermagem revista, v. 18, p. 58-74, 2015.

[0187] DAI, W. L. et al. Efficacy of Platelet-Rich Plasma in the Treatment of Knee Osteoarthritis: A Metaanalysis of Randomized Controlled Trials. Arthroscopy -Journal of Arthroscopic and Related Surgery, v. 33, n. 3, p. 659-670.el, 2017.

[0188] DE-SOUZA, D.; MARCHESAN, W. G.; GREENE, L. J. Epidemiological data and mortality rate of patients hospitalized with burns in Brazil. Burns, v. 24, p. 433-438, 1998 .

[0189] DELANEY, K.-M. H. et al. Leg Ulcers in Sickle Cell Disease: Current Patterns and Practices. Hemoglobin, v. 37, n. 4, p. 325-332, 2013.

[0190] DELGADO, J. C.; LA, E. Preface H L A in Tr a nsplantationand Beyond. Clin and Lab Med, v. 38, 2018.

[0191] DOMINICI, M. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, v. 8, n. 4, p. 315-7, Jan. 2006.

[0192] EL OMAR, R. et al. Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells: The New Gold Standard for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapies? Tissue Engineering Part B: Reviews, v. 20, n. 5, p. 523-544, 2014.

[0193] ENOCH, S.; GREY, J. E.; HARDING, K. G. Recent advances and emerging treatments. BMJ (Clinical research ed.), V. 332, n. 7547, p. 962-5, 22 Apr. 2006.

[0194] FALANGA, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. Lancet, v. 366, p. 1736-1743, 2005.

[0195] FALANGA, V. et al. Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells delivered in a fibrin spray accelerate healing in murine and human cutaneous wounds. Tissue engineering, v. 13, n. 6, p. 1299-312, Jun. 2007.

[0196] FOLEY, E.; ROBINSON, A.; MALONEY, M. Skin Substitutes and Dermatology: A Review. Current Dermatology Reports, v. 2, n. 2, p. 101-112, 2 Apr. 2013.

[0197] FONDER, M. A. et al. Treating the chronic wound: A practical approach to the care of nonhealing wounds and wound care dressings. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 58, p. 185-206, 2008.

[0198] Gao, F; Chiu, S M; Motan, D A L; Zhang, Z; Chen, L ; Ji, H-L ; Tse, H-E; Fu, Q-L; Lian, Q. Mesenchymal stem cells and immunomodulation: current status and future prospects. Cell Death and Disease. 7, 1, 2016.

[0199] GAO, G. et al. Bioactive nanoparticles stimulate bone tissue formation in bioprinted three-dimensional scaffold and human mesenchymal stem cells. Biotechnology Journal, p. 1-23, 2014.

[0200] GAO, G. et al. Improved properties of bone and cartilage tissue from 3D inkjet-bioprinted human mesenchymal stem cells by simultaneous deposition and photocrosslinking in PEG-GelMA. Biotechnology Letters, v. 37, n. 11, p. 2349-2355, 2015.

[0201] GROEBER, F. et al. Skin tissue engineering in vivo and in vitro applications. Advanced drug delivery reviews, v. 63, n. 4-5, p. 352-66, 30 Apr. 2011.

[0202] HALABI-TAWIL, M. et al. Sickle cell leg ulcers: A frequently disabling complication and a marker of severity. British Journal of Dermatology, v. 158, n. 2, p. 339-344, 2008.

[0203] HASS, R. et al. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling, v. 9, p. 1-14, 2011.

[0204] HE, Y. et al. Research on the printability of hydrogels in 3D bioprinting. Nature Publishing Group, n. 6, p. 1-13, 2016.

[0205] HOFFMANN, M. et al. Spatial organization of mesenchymal stem cells in vitro--results from a new individual cell-based model with podia. PloS one, v. 6, n. 7, p. e21960, Jan. 2011.

[0206] HORWITZ, E. et al. Clarification of the nomenclature for MSC. Cytotherapy, v. 7, n. 5, p. 393-395, 2005.

[0207] JAVAZON, E. H. et al. Enhanced epithelial gap closure and increased angiogenesis in wounds of diabetic mice treated with adult murine bone marrow stromal progenitor cells. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society, V. 15, n. 3, p. 350-9, 2007.

[0208] JI, S.; GUVENDIREN, M. Recent Advances in Bioink Design for 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, v. 5, n. April, p. 1-8, 2017.

[0209] KATAOKA, K.; MEDINA, R. J. Short Communication Participation of Adult Mouse Bone Marrow Cells in Reconstitution of Skin. American journal of pathology, v. 163, n. 4, p. 1227-1231, 2003.

[0210] KOGA, A. Y. et al. Evaluation of wound healing effect of alginate films containin g Aloe vera ( Aloe barbadensis Miller ) gel. Biomaterials applications, p. Ι-ΙΟ, 2018.

[0211] LACCI, K. M.; DARDIK, A. Platelet-Rich Plasma : Support for Its Use in Wound Healing. Yale Journal of Biological and medicien, v. 83, p. 1-9, 2010.

[0212] LAI, R. C.; YEO, R. W. Y.; LIM, S. K. Mesenchymal stem cell exosomes. Seminars in Cell and Developmental Biology, v. 40, p. 82-88, 2015.

[0213] LE BLANC, K. et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Experimental Hematology, v. 31, p. 890-896, 2003.

[0214] MAVER, T. Polysaccharide Based Wound Care. [s.1: s.n.] .

[0215] MCCAVIT, T. L. Sickle Cell Disease. Pediatrics in Review, v. 33, n. 5, p. 195-206, 2012.

[0216] MEIRELLES, L. D. S. et al. Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells. Cytokine & growth factor reviews, v. 20, n. 5-6, p. 419-27, 2009.

[0217] MEIRELLES, S.; CHAGASTELLES, P. C.; NARDI, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of cell science, v. 119, n. 11, p. 2204-2213, 2006.

[0218] MINNITI, C. P. et al. Leg ulcers in sickle cell disease. American Journal of Hematology, v. 85, n. 10, p. 831-833, 2010.

[0219] MIR, Μ. et al. Synthetic polymeric biomaterials for wound healing: a review. Progress in Biomaterials, 2018.

[0220] PIEL, F. B. et al. Global Burden of Sickle Cell Anaemia in Children under Five, 2010-2050: Modelling Based on Demographics, Excess Mortality, and Interventions. PLoS Medicine, v. 10, n. 7, 2013.

[0221] RANDALL, LO & SELLITO, JJ. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch nt Pharmacod n thérapie 111:409-419, 1957.

[0222] RANI, S. et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy, v. 23, n. 5, p. 812-823, 2015.

[0223] RATNER, B. D. et al. Biomaterials science, an introduction to materials in medicine. San Diego: Spciety for biomaterials, 1996.

[0224] RATNER, B. D.; BRYANT, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annual review of biomedical engineering, v. 6, n. 1, p. 41-75, Jan. 2004.

[0225] SCHREML, S.; BERNEBURG, M. The global burden of diabetic wounds. British Journal of Dermatology, v. 176, n. 4, p. 845-846, 2017.

[0226] SEN, C. K. et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy: PERSPECTIVE ARTICLE. Wound Repair and Regeneration, v. 17, p. 763-771, 2009.

[0227] SERJEANT, G. Leg ulceration in Sickle Cell Anaemia. Archives of Internal Medicine, v. 133, n. 4, p. 690-694, 1974.

[0228] SHORES, J. T., GUPTA, G.A.. Skin substitutes and alternatives: a review. Advances in skin & wound care. 20, 9, 494-508, 2007.

[0229] SILVA, A. et al. Platelet-rich plasma lyophilization enables growth factor preservation and functionality when compared with fresh platelet-rich plasma. Regenerative Medicine, 2018.

[0230] SKARDAL, A. et al. Bioprinted Amniotic Fluid-Derived Stem Cells Accelerate Healing of Large Skin Wounds. Stem Cells Translational Medicine, v. 1, p. 70-78, 2012.

[0231] STESSUK, T. et al. Platelet-rich plasma (PRP) and adipose-derived mesenchymal stem cells : stimulatory effects on proliferation and migration of fibroblasts and keratinocytes in vitro. Archives of dermatological research, p. 1-10, 2016.

[0232] UCCELLI, A.; MORETTA, L. ; PISTOIA, V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells. European journal of immunology, v. 36, n. 10, p. 2566-73, Oct. 2006.

[0233] VITTAL, B. A Growing Market : Wound Care Management - Hospital Management. Management, n. October 2010, p. 3-6, 2010.

[0234] VOLK, S. W. et al. Stromal progenitor cell therapy corrects the wound-healing defect in the ischemic rabbit ear model of chronic wound repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society, v. 15, n. 5, p. 736-47, 2007.

[0235] WU, Y. et al. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem cells (Dayton, Ohio), v. 25, n. 10, p. 2648-59, Oct. 2007.

[0236] ZHANG, P. et al. Global epidemiology of diabetic foot ulceration: a systematic review and meta-analysisf. Annals of Medicine, v. 49, n. 2, p. 106-116, 2017.

Claims (25)

1. Processo de obtenção de um biocurativo tridimensional (3D) caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

   • a) Isolar e cultivar células mesenquimais com 5 a 15% de soro AB humano;
   • b) Realizar bioimpressão tridimensional (3D) com 1% a 6% de um biomaterial e 0,5 x 105 a 1 x 106 de células obtidas na etapa "a";
   • c) Colocar em repouso o biocurativo 3D obtido por pelo menos 5 minutos após a bioimpressão;
   • d) Recobrir o biocurativo 3D com uma solução de cloreto de cálcio 100 mM por 5 a 15 minutos;
   • e) Lavar o biocurativo 3D por pelo menos 3 vezes em uma solução salina;
   • f) Adicionar meio de cultura de Eagle modificado por Dulbeccos (DMEM) compreendendo 5 a 15% de soro fetal bovino ou soro AB humano; e
   • g) Manter em incubadora a 35 a 37 °C e 5 a 7% de CO2 por 1 a 15 dias.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "a", as células mesenquimais serem selecionadas dentre células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (ADSCs) e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs), em que preferencialmente são utilizadas as células mesenquimais derivadas do MCUs.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de, alternativamente, as células mesenquimais serem cultivadas com 5 a 15% de soro fetal bovino (SFB) ou soro de plasma rico em plaquetas (PRP).
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser em condições livres de xeno-antíqenos.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de, na etapa "b", primeiramente, serem obtidos arquivos compatíveis contendo o código fonte para que seja bioimpressa a malha do biocurativo, bem como seu tamanho e suas de 2 a 10 camadas para a geração de estruturas tridimensionais de 1cm2 a 100 cm2 com o auxilio de um software para fatiamento da imagem.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o referido arquivo consistir na deposição camada a camada de uma trama, com 2 a 10 camadas, onde as células são dispostas de maneira equidistantes, em que preferencialmente o biocurativo 3D possui de 2 a 10 camadas, mais preferencialmente 3 camadas, em que os poros permitem a passagem de gases e nutrientes para que a viabilidade celular seja mantida.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de, na etapa "b", ser utilizado um sistema de seringa única para injeção de soluções viscosas, em que a seringa é carregada com um 1 a 6% de biomaterial selecionado dentre alginato de sódio colágeno, ácido hialurõnico, gelatina ou celulose, em que preferencialmente o biomaterial é o alginato de sódio a 4% p/v.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de a estrutura do biocurativo ser gerada e impressa sobre placas de cultura estéreis, a partir de modelo criado em um software CAD.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de, na etapa "b", a bioimpressora, após assepsia da mesma, ser instalada dentro de uma cabine de fluxo laminar, e posteriormente as células serem tripsinizadas, contadas e ressuspensas em 1 a 6% de biomaterial em uma concentração de 0,5 x 105 a 1x106 células/mL, preferencialmente 0,4 x 10® células/mL, em que o bico extrusor da bioimpressora é preenchido com a suspensão de células.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de cada centímetro quadrado de biocurativo compreender 0,1 x 106 células em 250 μL de biomaterial.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de, na etapa "e", a referida solução salina ser selecionada do grupo que consiste em solução salina tamponada com fosfato (PBS), soro fisiológico ou meio de cultivo, e em que na etapa "f", alternativamente é adicionado 10% de plasma rico em plaquetas (PRP) em substituição ao SFB ou soro AB humano após a bioimpressão do biocurativo 3D.
12. Biocurativo tridimensional (3D) caracterizado pelo fato de compreender:

    • - de 0,5 x 105 a 1x106 de células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (ADSCs) e células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (MCUs); e
    • - de 1 a 6% de biomaterial.
13. Biocurativo 3D, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de, preferencialmente, ser composto por células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano.
14. Biocurativo 3D, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de o biomaterial ser selecionado dentre alginato de sódio, colágeno, ácido hialurônico, gelatina ou celulose, preferencialmente alginato de sódio a 4% p/v.
15. Biocurativo 3D, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de ser composto por pelo menos 2 camadas, preferencialmente 3 camadas, em que cada centímetro quadrado de biocurativo compreende 0,1 x 106 células em 250 μL de biomaterial.
16. Biocurativo 3D, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de seu tamanho variar entre 1 a 100 cm2.
17. Biocurativo 3D, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de apresentar viabilidade celular de até 15 dias após a bioimpressão.
18. Biocurativo 3D, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de possuir efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico.
19. Biocurativo 3D, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizado pelo fato de ser livre de xeno-antígenos.
20. Biocurativo 3D, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizado pelo fato de ser obtido por bioimpressão tridimensional, preferencialmente conforme processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
21. Uso de biocurativo 3D conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 20 caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para tratar feridas.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para tratar feridas crônicas e queimaduras graves.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de o medicamento possuir efeito cicatrizante, anti-inflamatório e analgésico.
24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de o medicamento acelerar e melhorar o processo de cicatrização e aumentar a produção dos fatores de crescimento TGF-β e KGF.
25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de o medicamento ser utilizado após um período selecionado dentre 1 a 15 dias de incubação, em que preferencialmente é utilizado em após 3 dias de incubação.

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