BR102020026307A2 - Processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas e nanocápsulas antimicrobianas - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NANOCÁPSULAS ANTIMICROBIANAS E NANOCÁPSULAS ANTIMICROBIANAS. A presente invenção trata-se um processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas e nanocápsulas antimicrobianas assim obtidas aplicáveis na área médica, especialmente no uso tópico de tratamento de infecções microbianas da pele. A presente invenção apresenta uma rota química direta para a síntese e estabilização de nanopartículas de prata encapsuladas em conjunto com agentes farmacológicos, incluindo antibióticos, possibilitando a ação terapêutica sinergística.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NANOCÁPSULAS ANTIMICROBIANAS E NANOCÁPSULAS ANTIMICROBIANAS Campo da invenção

[1] A presente invenção trata-se um processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas e nanocápsulas antimicrobianas assim obtidas aplicáveis na área médica, especialmente no uso tópico de tratamento de infecções microbianas da pele.

Fundamentos da invenção

[2] A presente invenção se insere dentro do conjunto das técnicas de síntese de nanopartículas metálicas e poliméricas, um campo geral que engloba as técnicas de encapsulamento de nanopartículas, a liberação controlada, e a funcionalização superficial das nanopartículas por outros agentes químicos. Dentre as nanopartículas metálicas, as nanopartículas de prata (AgNPs) se destacam como agentes bactericidas, podendo ser utilizadas com finalidades terapêuticas ou em procedimentos de desinfecção.

[3] Já há descrito diversas tentativas do emprego da formamida para a síntese de nanopartículas de prata no estado da arte. As nanopartículas de prata foram formadas por um processo que não resultou em encapsulamento das mesmas, e que resulta na obtenção de partículas com forma de prismas triangulares. Outra forma de tentativa descreve que a prata foi depositada sobre vidro por meio da utilização de reagentes considerados menos limpos. Tanto a deposição sobre vidro quanto a presença de resíduos de reagentes agressivos eliminaram a possibilidade de uso biomédico das nanopartículas.

[4] Com relação ao uso de Ac-Dex, não há descrito seu uso como polímero-base, mas sim o seu precursor (dextrana). Este processo não se mostrou capaz de formar nanopartículas, mas tão somente partículas com diâmetros em escala de micrômetros. Por sua vez, as partículas são formadas neste processo com estruturas cristalinas e com morfologias de discos ou agregados em formato de flores, de modo que mais uma vez não se obtêm nanopartículas encapsuladas e nem materiais adequados à entrega controlada de fármacos. Vale ressaltar ainda que não há descrito a formação de emulsão, o que resulta na formação de micropartículas de prata adsorvidas sobre resíduos do material polimérico e sem estrutura definida.

[5] Com relação às nanopartículas de prata, já descrito sua ação antimicrobiana e efeito sinérgico quando combinadas a antibióticos. Contudo, os trabalhos não objetivaram modificar o estado da arte da técnica de produção de novos materiais e também não se propuseram a testar a eficiência de agentes de liberação controlada.

[6] O estado da arte revela trabalhos no qual foi utilizado nanopartículas de fornecedores reconhecidos, ou então empregaram rotas tradicionais de síntese (muitas das quais não são consideradas tecnologias "limpas") para produção das nanopartículas.

[7] Estas técnicas de síntese tradicionais englobam: dissolução de nitrato de prata em amônia, seguida pela redução por ácido ascórbico; dissolução de prata metálica em ácido nítrico concentrado, seguida por adição de água destilada e cloreto de sódio; ou síntese simultânea à de zeólitas, material inorgânico conhecido como "peneira molecular".

[8] Vale ressaltar que nenhum destes processos é capaz de promover o encapsulamento de fármacos concomitante à formação e estabilização de nanopartículas de prata dentro de uma rede polimérica. Alguns dos trabalhos foram incapazes de obter materiais em escala de nanômetros.

[9] Ainda no estado da técnica, AgNPs são encapsuladas em materiais diferentes do proposto na presente invenção. Tais materiais não apresentam as propriedades únicas oferecidas por polissacarídeos responsivos ao pH (classe à qual pertence o Ac-Dex). Os materiais utilizados para encapsulamento nestes estudos incluem: zeólitas (silicatos inorgânicos); vesículas lipídicas de resistências química, térmicas e mecânicas muito limitadas; ciclodextrinas; hidrogéis que formam materiais adequados à análise química por espectroscopia Raman, mas não à entrega de fármacos; e vesículas aminoglicosídicas, as quais apresentam propriedades termomecânicas superiores às das vesículas lipídicas, mas ainda muito limitadas e inferiores às dos polissacarídeos.

[10] Apesar da superação destas dificuldades ocorrer por método de redução para a síntese de Ag NPs semiesféricas, os métodos encontrados no estado da arte dependem do uso simultâneo de surfactantes iônicos (CTAB e SDS), os quais atuam tanto como agentes estabilizantes quanto como agentes de recobrimento. Ainda, o nitrato de prata (AgNO3) foi utilizado como fonte de prata, enquanto que NaBH4 foi empregado como agente de redução para formar nanopartículas de estrutura micelar hierárquica.

[11] Outros trabalhos utilizam rotas agressivas para controle dimensional das nanopartículas de prata formadas, o que impede o acoplamento de fármacos. Isto porque, em geral, estas moléculas são incapazes de resistir às condições drásticas utilizadas para o processo de síntese, de modo que as partículas obtidas se destinam a fins bastante distintos da entrega controlada. Estes trabalhos mostram que é feita a dissolução de prata em amônia para formação de nanopartículas coloidais, seguida de método para deposição das Ag NPs em substrato de alumina, formando material destinado a aplicações em catálise, onde é feita a ablação a laser de um alvo de prata metálica, formando nanopartículas cuja composição contém somente este metal. Também está descrito que é feita a redução dos diâmetros de nanopartículas de prata adquiridas de fornecedor comercial por meio de um processo de irradiação destas partículas por laser pulsado, com necessidade de modulação e controle de potência e comprimento de onda da fonte, bem como da pressão externa, a qual deve se encontrar rigorosamente dentro do intervalo entre 30-100 MPa. Outros trabalhos descrevem que as nanopartículas de prata são obtidas por deposição magnética a alto vácuo sobre substrato FTO (material constituído por estanho dopado com óxido e flúor), sendo o material formado adequado ao uso em sistemas de análise físico-química baseada em ressonância plasmônica superficial.

[12] O documento US20060235087 não emprega a formamida como agente de solubilização e redução simultâneo, nem realiza o encapsulamento das partículas. A formamida é empregada neste documento apenas para solubilizar o polímero e os íons metálicos. Prova disso é o fato de que o método sugere que qualquer solvente orgânico levemente polar, como metanol, pode ser utilizado. Muitos dos solventes propostos (como brometo de tri-imidazólio e etilenoglicol) resultam em processos de toxicidade elevada e que não podem ser considerados "verdes" ou ecologicamente amigáveis. Neste documento, na realidade, copolímero em bloco anfifílico poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), PEO-PPO, também conhecido como "Pluronic 123", é misturado a uma solução de íons metálicos dissolvidos em solvente orgânico. A suspensão é deixada em repouso até formar nanopartículas metálicas. Por fim, é feita a diluição em água e a centrifugação para separação das partículas. Um primeiro problema percebido no documento americano é o diâmetro das partículas obtidas por esta técnica, da ordem de 20-100 nm. A presente invenção não utiliza, como visto, o mesmo agente como solvente e redutor, com a vantagem da redução do uso de agentes químicos. O PEO-PPO não apresenta as vantagens da biodegradabilidade do Ac-Dex para liberação controlada, e ele é necessário para o processo apresentado em D1: o PEO atua como redutor principal, convertendo os íons positivos em metais, enquanto que o PPO apresenta a função de estabilização. Além disso, existe dependência do processo com relação à composição deste copolímero, o qual deve apresentar pelo menos 10% em massa de PEO e 10% em massa de PPO. O método apresentado no documento sugere um elevado intervalo de temperaturas para a realização da síntese, entre 4 a 100 °C, bem como diversos solventes empregáveis. Entretanto, sabe-se que estes fatores apresentam impacto direto sobre os diâmetros das nanopartículas obtidas, o que pode explicar a alta variação entre os diâmetros obtidos, que vão desde alguns nanômetros até poucos micrômetros. A síntese proposta no documento americano requer ao menos 48 h para se completar e afirma que, para alguns casos e combinações de parâmetros operacionais, este tempo pode ser reduzido em 24 vezes, mas não diz como isso poderia ser feito. Outro problema grave do documento US20060235087 é que o processo é capaz de prover controle dimensional, mas que também pode ocorrer de as partículas metálicas se manterem adsorvidas sobre o PEO-PPO. Isto faz com que as partículas seguintes se adsorvam sobre as superfícies das primeiras partículas metálicas (e não sobre o polímero), levando à formação de agregados metálicos de diâmetros superiores.

[13] Já a presente invenção resulta em controle dimensional muito superior, obtendo partículas menores, 95% das quais com diâmetros dentro do intervalo (4,5 ± 2,1) nm. Além disso, o processo apresentado no documento US20060235087 não é capaz de obter nanopartículas de baixo diâmetro já encapsuladas, adequadas às aplicações em entrega controlada de fármacos. Em US20060235087, os metais são formados adsorvidos ao polímero, o qual apenas impede que elas se agreguem excessivamente. Isto é revelado pelas próprias análises, as quais mostram materiais cristalinos. Uma vez que o processo proposto na presente invenção enclausura a nanopartícula metálica dentro da rede polimérica, ele impede que haja agregação de múltiplas nanopartículas, contribuindo para o controle dimensional. Outro problema observado em US20060235087 é que o processo proposto não permite a obtenção de nanopartículas metálicas acopladas a agentes farmacológicos (incluindo antibióticos).

[14] O artigo científico de HÜMEYRA et al. (2020) mostra um processo que guarda semelhança com o presente invento de utilizar um polímero da mesma família (dextrana). Porém, este processo mostra diferenças fundamentais em relação à presente invenção, na qual o próprio solvente (formamida) é utilizado tanto como agente redutor quanto como formador da emulsão, de modo que as nanopartículas são enclausuradas no interior do polímero. Além disso, a dextrana acetalada (Ac-Dex) possui uma série de vantagens sobre a dextrana, em especial a sensibilidade ao pH que permite liberar as nanopartículas metálicas contendo agente antibiótico apenas nas regiões infectadas. Já no invento do artigo, o polímero não só não é utilizado como agente encapsulante, mas também não ocorre acoplamento a um antibiótico ou outro agente farmacológico. Na realidade, o polímero é o agente redutor deste processo. Basicamente, o artigo apresenta um processo de síntese hidrotermal em autoclave, em condições de operação muito mais agressivas do que as propostas na presente invenção. Neste processo do documento, 10 mL de uma solução 0,4% em massa de AgNO3 são misturados a 10 mL de uma segunda solução contendo 0,3% em massa de dextrana, e o sistema é misturado e agitado a 800 rpm por 10 min. A seguir, a mistura é levada a uma autoclave, a qual é pressurizada a 15 psi e aquecida a 120 °C para a condução da reação, o que leva 60 min. As análises (em especial as de calorimetria) fornecidas pelos autores do artigo mostram que, de fato, este processo não resulta em encapsulamento metálico. Após a síntese, existe ainda um conteúdo orgânico adsorvido sobre a prata, o qual é originário da degradação da dextrana. Este conteúdo orgânico guarda diversas semelhanças físico-químicas com o polímero de origem, mas possui menor estabilidade térmica e é degradado quando o material é novamente aquecido entre 200300 °C. Assim, o processo apresentado no artigo utiliza um agente químico como solubilizante e um segundo agente como redutor, sem as vantagens de redução de uso reagentes. O diâmetro obtido por este processo também é consideravelmente superior (da ordem de 10 nm) ao obtido pelo presente invento. Isto é causado pelo fato de que o processo do artigo científico não permite que as nanopartículas metálicas sejam formadas enclausuradas no interior da rede polimérica. Além disso, como o processo não permite enclausurar a nanopartícula pela rede polimérica, não é possível com ele obter materiais adequados à entrega controlada da nanopartícula. Isso porque a nanopartícula de prata estará exposta mesmo quando em regiões cujo pH indica tecido saudável. Isto faz com que as nanopartículas metálicas possam ser mesmo prejudiciais ao organismo, já que elas poderão ter efeito citotóxico em células sadias. Não bastasse, as condições agressivas de pressão e temperatura da síntese hidrotermal empregada podem facilmente degradar e até mesmo carbonizar tanto um polímero que se desejasse usar para enclausurar as nanopartículas quanto um agente farmacológico que devesse ser acoplado à prata. Deste modo, o processo descrito no artigo não é adequado para a produção de materiais que combinem os efeitos da prata com os de outros medicamentos, nem é adequado para formar partículas de liberação controlada. A presente invenção, ao contrário, resulta em menores diâmetros e em maior controle dimensional, e permite que as nanopartículas sejam enclausuradas no interior de redes poliméricas sensíveis ao pH, podendo ser efetivamente empregadas para a entrega controlada de fármacos.

[15] O artigo científico de RIVERA-RANGEL et al. (2017) apresenta um processo que se encontra na classe das sínteses em emulsão coloidal, mas que possui uma série de diferenças em relação ao presente invento, em especial no que concerne à rota de produção e aos materiais utilizados. No artigo, concentrações entre 1 a 2,5 x 10-3 mol/L de estereato de prata são dissolvidos óleo de rícino (ou mamona, a fase oleosa) e, a seguir, são adicionados agentes surfactantes (polioxietileno (10) oleil éter, conhecido como Brij 96) e co-surfactantes (1,2-hexanodiol). Na etapa subsequente, uma fase aquosa deve ser lentamente adicionada sob agitação e temperatura constantes. Esta fase aquosa consiste em extrato de folhas de gerânio (Pelargonium hortorum), o qual deve ser preparado anteriormente. A fase aquosa é adicionada até que a suspensão alcance a massa de 2 g, e é justamente o extrato de gerânio que atua como agente redutor para formar as nanopartículas metálicas. O sistema é mantido a 25 °C por 24 h e, após este período, é centrifugado e submetido a vários ciclos de lavagem com acetona, etanol e água. No processo mostrado no artigo, as partículas são formadas em estrutura semelhante às de vesículas lipídicas, apresentando, portanto, estabilidade química, mecânica, e térmica bastante inferiores à das nanopartículas poliméricas obtidas no presente invento. Além disso, o processo descrito no artigo não permite que as partículas metálicas sejam realmente encapsuladas: elas permanecem sobre a superfície ou membrana externa, sendo facilmente liberadas mesmo em condições de pH de tecidos sadios. As nanopartículas metálicas formadas por este processo apresentam considerável dispersão dos diâmetros, e os diâmetros obtidos são bastante dependentes da umidade (teor mássico de água) presente na emulsão original. Dependendo da concentração de água, os diâmetros das nanopartículas de prata obtidas pelo processo do artigo podem variar entre 25 a até 150 nm. Além disso, este método também não possibilita o acoplamento da nanopartícula metálica a um agente farmacológico, como um antibiótico. O processo do artigo também apresenta o inconveniente da alta dificuldade de escalonamento, já que: mostra elevada dependência com relação às massas de compostos adicionadas; e cada ciclo reacional deve trabalhar com no máximo 2 g. O artigo também demonstra que, para que o processo resulte na formação de nanopartículas de diâmetros menores, é necessária a operação com baixas concentrações de íons prata. Isto gera, consequentemente, o problema de que uma quantidade ainda mais limitada de nanopartículas será formada. Em suma, o processo descrito no artigo: trabalha com micropartículas lipídicas, e não poliméricas; necessita do uso de agentes químicos surfactantes e co-surfactantes; não encapsula as nanopartículas, mas sim as mantém sobre as superfícies das estruturas; não forma nanopartículas de prata acopladas a agentes farmacológicos; não utiliza a formamida como solvente e redutor simultâneos, o que confere a vantagem da redução de agentes químicos à presente invenção; e apresenta limitações da escala de produção. Mais uma vez, a presente invenção resulta em menores diâmetros e em maior controle dimensional, além de permitir que as nanopartículas sejam enclausuradas no interior de redes poliméricas sensíveis ao pH, podendo ser efetivamente empregadas para a entrega controlada de fármacos. Outras vantagens do presente evento incluem a não necessidade de utilização de agentes surfactantes e co-surfactantes, o que resulta em um processo mais limpo, menos tóxico, e sem possibilidade de efeitos potencialmente nocivos resultantes da liberação de resíduos destes agentes químicos no organismo.

[16] O artigo científico de YANG et al. (2012) se mostra semelhante à presente invenção no sentido de utilizar um polímero da mesma família (dextrana). Porém, o processo descrito também apresenta diferenças fundamentais em relação à presente invenção. Primeiramente, o processo do artigo também não faz uso de formamida como solvente e redutor simultâneo, o que possibilitaria o uso de menor quantidade de solventes. No artigo, o borohidreto de sódio (NaBH4) é utilizado como agente redutor, enquanto a dextrana é o agente de estabilização. O processo do artigo visa à modificação superficial de nanopartículas de prata, e não ao seu encapsulamento nem ao acoplamento a agentes farmacológicos com dextrana. O processo do artigo é capaz de produzir nanopartículas em 3 diferentes concentrações, dependendo das proporções de reagentes utilizadas: 50, 100 ou 1000 partes por milhão (ppm). Para isso, a dextrana deve ser dissolvida em 12 mL de solução aquosa de AgNO3, de tal forma que a massa de dextrana seja rigorosamente igual a duas vezes a massa de nitrato de prata. Por sua vez, três diferentes concentrações de nitrato de prata podem ser utilizadas, resultando nas diferentes concentrações de produto mencionadas acima: 2,5, 5 ou 50 x 10-3 mol/L de nitrato em 12 mL de solução. Esta mistura deve ser agitada até formar um líquido homogêneo. A seguir, deve ser feita a adição gota-a-gota de 48 mL de uma solução de redutor (NaBH4) previamente resfriado em banho de gelo. Esta solução de redutor pode conter concentrações de 1, 5 ou 20 x 10-3 mol/L de NaBH4. O sistema deve ainda ser agitado vigorosamente com agitador magnético durante todo o processo de adição de redutor. Assim, quando se compara o artigo à presente invenção, são notadas diferenças: com relação à rota química, bastante diferente (não é utilizado processo em que solvente é o próprio redutor, possibilitando economia de reagentes); com relação ao polímero utilizado, que não possui a responsividade ao pH mostrada pelo Ac-Dex; com relação à natureza do produto formado (não são formadas partículas encapsuladas, e o polímero não atua com a função de controle dimensional); com relação ao diâmetro das partículas formadas; e com relação às aplicações possíveis dos materiais obtidos, já que o artigo não apresenta partículas metálicas e agentes farmacológicos encapsulados, mas sim nanopartículas metálicas modificadas superficialmente. De fato, o processo descrito no artigo não possibilita que as nanopartículas de prata sejam formadas acopladas a um agente farmacológico (como um antibiótico) e encapsuladas em um polímero para liberação controlada. Novamente, o processo do artigo depende da utilização de um solvente e de um segundo agente redutor, os quais devem ser misturados. O processo também mostra grande restrição com relação à possibilidade de escalonamento, produzindo sempre concentrações baixas de nanopartículas após tempos de ciclo consideravelmente longos. Um problema grave deste documento é o fato de ele não apresentar dados claros dos tempos de ciclo necessários para completar a síntese. Porém, a necessidade de adição gota-a-gota da solução redutora indica um tempo elevado, e também compromete tanto a automação quanto o escalonamento do processo, exigindo que vazões muito baixas de redutor sejam controladas. Nota-se que o processo do artigo apresenta grande dificuldade de controle dimensional dos produtos obtidos, o que é notado inclusive visualmente. Dependendo das concentrações de reagentes utilizadas, o aspecto visual da mistura reacional pode variar bastante, podendo ser obtidas soluções praticamente incolores, amarelas, marrons ou mesmo pretas. Uma vez que o agente químico não se encontra encapsulado, mas tão somente quimicamente modificado pelo polímero, ele não será entregue de forma segura apenas nos pHs mais baixos característicos de infecções. Desta forma, mais uma vez a prata poderá mostrar efeitos citotóxicos ou mesmo acumulativos em regiões sadias do organismo, comprometendo seu valor terapêutico. Assim, o artigo científico mostra os mesmos problemas de uso da dextrana ao invés do Ac-Dex; e de produção de nanopartículas metálicas expostas, ao invés de encapsuladas (e, consequentemente, não adequadas à liberação controlada), previamente apontados nas análises dos documentos anteriores. Portanto, a presente invenção resulta em menores diâmetros e em maior controle dimensional quando comparada ao processo descrito no artigo: enquanto o presente processo resulta em nanopartículas com diâmetro (4,5 ± 2,1) nm, o processo apresentado no artigo resulta em diâmetros de (10,0 ± 2,5) nm. Assim como apontado na comparação com os documentos anteriores, a presente invenção possui as vantagens intrínsecas de uso de menos reagentes, já que o solvente (formamida) é o próprio redutor; e de alto controle dimensional, com valor médio e dispersão dos diâmetros reduzidas, o que é, em parte, consequência da estratégia de enclausurar as partículas no interior da rede polimérica do Ac-Dex. A estrutura do Ac-Dex, de fato, tanto passiva o metal quanto limita suas dimensões. Além disso, este polímero foi escolhido no presente invento por: permitir a formação de nanopartículas em processo que também possibilita a encapsulação de outros materiais (fármacos); e por ser responsivo ao pH, sofrendo degradação controlada em meio ácido característico de tecidos tumorais e de infecções, o que não foi observado em nenhum dos documentos anteriores.

[17] Por fim, é importante comparar o presente invento ao artigo científico de BRAGA et al. (2019). No processo descrito no artigo, os autores utilizaram uma metodologia já conhecida de nanoemulsão simples (óleo/água), empregando acetato de etila e fase aquosa para encapsular um composto quimioterápico e um corante. Tal metodologia empregada não apresenta nenhuma novidade em termos de processo ou reagentes utilizados; não apresenta a novidade de um solvente que atua simultaneamente como redutor, diminuindo a quantidade de solvente produzido; e nem possibilita a síntese de nanopartículas metálicas com controle dimensional e que combinam os benefícios terapêuticos da prata com os de outros agentes farmacológicos. Já na presente invenção, foi empregada uma emulsão dupla (formamida/óleo/água), na qual a formamida foi utilizada como solvente e como agente redutor. Assim sendo, várias diferenças entre o presente invento e o artigo podem ser destacadas: (1) Materiais: enquanto o artigo empregou acetato de etila e uma solução aquosa para formar as gotículas, a presente invenção utiliza formamida, clorofórmio e fase aquosa, uma composição bastante distinta. Por sua vez, o artigo não expõe nenhuma estratégia de produção de nanopartículas metálicas e nem nenhuma estratégia para controle dimensional de nanopartículas. No artigo, foi feito o encapsulamento de um quimioterápico acompanhado de um corante. Já o processo proposto na presente invenção permite a síntese de nanopartículas com alto controle dimensional, realizando o encapsulamento simultâneo de sal de prata e de uma molécula de antibiótico-modelo. Vale ressaltar que o Ac-Dex foi escolhido como polímero do presente invento por uma questão de conveniência, já que possui as características mencionadas acima (é biodegradável; é responsivo ao pH, sofrendo degradação em pHs ácidos característicos de tecidos tumorais e infecções; pode atuar como agente passivador; devido à combinação destas características, pode ser utilizado para a entrega controlada e direcionada de fármacos), e por ser um material cujos autores apresentam familiaridade. Porém, poderia ser substituído por polímeros com características semelhantes, como celulose ou poli(ácido lático). (2) Processo: o artigo mostra um processo de emulsão simples no qual são formadas gotículas de acetato de etila em água. Em etapa subsequente, ocorre a remoção do acetato de etila por evaporação. Na presente invenção, por sua vez, foi produzida uma emulsão dupla: gotículas de formamida estão dispersas em clorofórmio. O clorofórmio, por sua vez, está disperso na fase aquosa. (3) Objetivo ou finalidade do processo: o objetivo do processo descrito no artigo é tão somente o encapsulamento de moléculas de agentes terapêuticos dentro das partículas de dextrana acetalada. Isto o diferencia de forma fundamental do processo aqui proposto, o qual visa à formação e estabilização de nanopartículas de prata de diâmetros controlados, as quais devem ser encapsuladas juntamente com a molécula de antibiótico para garantir o efeito terapêutico sinérgico destas moléculas com a prata. Além disso, o presente processo é projetado para consumir menos reagentes e solventes, e para possibilitar a entrega e a liberação controladas dos agentes terapêuticos em pHs ácidos característicos de infecções e tumores. Partindo-se do processo mostrado no artigo, não é possível formar e encapsular nanopartículas de prata no interior das nanopartículas poliméricas. Isso porque a metodologia empregada no artigo só pode ser empregada para o encapsulamento de moléculas hidrofóbicas e com elevada solubilidade em solventes orgânicos como acetato de etila. Esta limitação fundamental impossibilita o encapsulamento de sais inorgânicos por meio do processo mostrado no artigo, o que é um requisito fundamental para a formação das nanopartículas metálicas (já que o metal é reduzido a partir de sua forma catiônica). Já o processo aqui proposto garante a formação destas partículas ao mesmo tempo em que realiza o controle dimensional e as encapsula conjuntamente ao agente farmacológico. Além disso, o artigo demonstra que o processo resulta em duas populações de partículas (i.e., duas distribuições estatísticas de diâmetros), o que resulta em menor reprodutibilidade para ensaios biomédicos. Já a metodologia proposta na presente invenção permite sintetizar e encapsular nanopartículas de prata a partir de sais de prata, enquanto que o processo descrito no documento D5 permite apenas o encapsulamento de moléculas hidrofóbicas. A utilização da formamida na presente invenção apresenta dupla função, pois, além de permitir a redução dos íons de prata, atua como solvente, provendo maior capacidade para solubilizar moléculas, independente da polaridade destas. Desta forma, o processo proposto na presente invenção permite o encapsulamento de extensa gama de moléculas e ainda de sais inorgânicos, os quais são insolúveis em solventes orgânicos. Um último ponto de comparação importante é que o processo proposto na presente invenção garante a formação de nanopartículas monodispersas (i.e., com apenas uma população de tamanho) e com alto controle dimensional, o que garante maior reprodutibilidade para aplicações biomédicas.

[18] Resumindo, a presente invenção apresenta uma rota química direta para a síntese e estabilização de nanopartículas de prata, as quais são obtidas encapsuladas em carreadores de dextrana acetalada (Ac-Dex) em conjunto com agentes farmacológicos incluindo antibióticos. Isto possibilita a ação terapêutica sinergética entre as nanopartículas de prata e o fármaco coencapsulado.

[19] A formamida é utilizada simultaneamente como solvente e redutor, reduzindo a quantidade de solvente dispendida e permitindo a síntese de nanopartículas por rota menos agressiva ao meio ambiente e que oferece menos riscos ao operador. É, portanto, um processo que se diferencia fundamentalmente da maioria das técnicas tradicionais de obtenção das nanopartículas metálicas, uma vez que estas técnicas comumente empregam uma série de etapas dispendiosas em termos de tempo e reagente.

Breve descrição da invenção

[20] A presente invenção trata-se um processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas e nanocápsulas antimicrobianas assim obtidas aplicáveis na área médica, especialmente no uso tópico de tratamento de infecções microbianas da pele.

[21] Processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas que compreender as seguintes etapas:

• 1) Dissolver um sal de prata, preferencialmente tetrafluoroborato de prata (mg) em formamida(ml), na concentração variável entre 22.5mg/360ml e 27.5mg/440ml, preferencialmente na concentração de 25mg/400μL;
• 2) Adicionar antibiótico, preferencialmente doxiciclina,50 mg;
• 3) Manter a solução incolor obtida na etapa (2) em temperatura ambiente até que ela se torne amarelo-pálida, preferencialmente por 15s;
• 4) Dissolver dextrana acetalada em clorofórmio, na concentração variável entre 80mg/3.2ml e 120mg/4.8ml, preferencialmente na concentração de 100 mg/4 mL;
• 5) Adicionar a solução obtida na etapa (4) à solução da etapa (3);
• 6) Submeter a ciclo de sonicação com amplitude de 250 W, imersa em banho com água e gelo com duração de 30 s com impulsos por sonda impõe de 0,5s com 0,1s de intervalo entre cada pulso;
• 7) Adicionar 5 mL de uma terceira solução contendo 3% de álcool polivinílico (PVA; massa molecular entre 13.000—23.000 g/mol, grau de hidrolização entre 87—89%) em tampão PBS (tampão de sais fosfato, solução contendo 3% em massa de PBS);
• 8) Submeter a ciclo de sonicação com amplitude de 250 W, imersa em banho com água e gelo com duração de 30 s com impulsos por sonda impõe de 0,5s com 0,1s de intervalo entre cada pulso; e
• 9) Obtenção de nanocápsulas antimicrobianas.

[22] As nanocápsulas antimicrobianas obtidas pelo processo da presente invenção possuem as seguintes características: elevada esfericidade, superfícies regulares e índice de polidispersidade variável entre 0.15 ± 0.06, diâmetro médio de 100 nm e diâmetros no intervalo 2.4 e 6.6 nm.

Breve descrição das figuras

[23] A Figura 1 apresenta o esquema que resume o procedimento e montagem experimental para obtenção das nanocápsulas da presente invenção.

[24] A Figura 2 apresenta as etapas do processo: (a) AgBF4 e doxiciclina dissolvidos em formamida, (b) solução com aspecto leitoso obtida após a emulsificação e, (c) nanopartículas sólidas coencapsulando Ag NPs e doxiciclina após centrifugação.

[25] A Figura 3 apresenta distribuições de tamanhos em função de (a) intensidade; (b) contagem de nanopartículas de Ac-Dex produzidas pela emulsão formamida-clorofórmio.

[26] A Figura 4 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear 1H obtido para a dextrana acetalada (Ac-Dex) em CDCl3.

[27] A Figura 5 apresenta imagens de microscopia eletrônica de varredura obtidas para as nanopartículas de Ac-Dex em duas magnificações diferentes.

[28] A Figura 6 apresenta imagens de microscopia eletrônica de transmissão mostrando as nanopartículas de Ac-Dex coencapsulando nanopartículas de prata e moléculas do antibiótico doxiciclina. As regiões escuras da imagem correspondem às nanopartículas de prata.

[29] A Figura 7 apresenta histograma dos diâmetros das nanopartículas de prata obtidas, mostrando a curva lognormal ajustada (R2 ajustado = 0.97). O histograma foi obtido a partir de diversas imagens de microscopia eletrônica de transmissão nas quais foram avaliadas 243 nanopartículas. A figura destaca o intervalo de 95% de confiança para os diâmetros: (4.5 ± 2.1) nm.

[30] A Figura 8(a e b) apresenta Imagens de microscopia eletrônica de varredura e transmissão (STEM); e (c a e d) imagens de microscopia eletrônica de transmissão mostrando as nanopartículas de Ac-Dex coencapsulando nanopartículas de prata e doxiciclina (antibiótico-modelo). As setas destacam as nanopartículas de prata ocluídas na rede do Ac-Dex.

[31] A Figura 9 apresenta a viabilidade celular de células de câncer de mama humano MCF-7 para o nanoencapsulado (Ac-Dex NPs coencapsulando doxiciclina) e Ag NPs após (a) 24 h e (b) 48 h.

Descrição detalhada da invenção

[32] A presente invenção trata-se um processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas e nanocápsulas antimicrobianas assim obtidas aplicáveis na área médica, especialmente no uso tópico de tratamento de infecções microbianas da pele.

[33] A presente invenção trata-se de um processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas que compreende as seguintes etapas:

• 1) Dissolver um sal de prata, preferencialmente tetrafluoroborato de prata (mg) em formamida(ml), na concentração variável entre 22.5mg/360ml e 27.5mg/440ml, preferencialmente na concentração de 25mg/400μL;
• 2) Adicionar antibiótico, preferencialmente doxiciclina, 50 mg (Figura 2(a));
• 3) Manter a solução incolor obtida na etapa (2) em temperatura ambiente até que ela se torne amarelo-pálida (Figura 2(b)), preferencialmente por 15s;
• 4) Dissolver dextrana acetalada em clorofórmio, na concentração variável entre 80mg/3.2ml e 120mg/4.8ml, preferencialmente na concentração de 100 mg/4 mL;
• 5) Adicionar a solução obtida na etapa (4) à solução da etapa (3);
• 6) Submeter a ciclo de sonicação com amplitude de 250 W, imersa em banho com água e gelo com duração de 30 s com impulsos por sonda impõe de 0,5s com 0,1s de intervalo entre cada pulso;
• 7) Adicionar 5 mL de uma terceira solução contendo 3% de álcool polivinílico (PVA; massa molecular entre 13.000—23.000 g/mol, grau de hidrolização entre 87—89%) em tampão PBS (tampão de sais fosfato, solução contendo 3% em massa de PBS);
• 8) Submeter a ciclo de sonicação com amplitude de 250 W, imersa em banho com água e gelo com duração de 30 s com impulsos por sonda impõe de 0,5s com 0,1s de intervalo entre cada pulso (Figura 2(c)); e
• 9) Obtenção de nanocápsulas antimicrobianas.

[34] As nanocápsulas antimicrobianas obtidas apresentam: elevada esfericidade, superfícies regulares e índice de polidispersidade variável entre 0.15 ± 0.06, diâmetro médio de 100 nm e diâmetros no intervalo 2.4 e 6.6 nm.

[35] As nanocápsulas são responsivas às variações de pH e se degradam em ambiente ácido cujo pH é inferior a 7, possuem alta capacidade de encapsulamento sendo capazes de carrear moléculas orgânicas e nanopartículas de prata. A eficiência de encapsulação é evidenciada pela ausência de nanopartículas de prata fora das nanocápsulas de Ac-Dex (Figura 6), corroborando o mecanismo de formação das nanopartículas de prata dentro da rede polimérica. As partículas possuem um diâmetro médio de aproximadamente 100 nm de acordo com a Figura 3.

[36] Neste processo, a formamida é utilizada simultaneamente como solvente para emulsão e agente redutor e um polímero é empregado como agente de passivação e limitante dimensional, permitindo a formação de nanopartículas de prata que seguem uma distribuição lognormal altamente comportada (p-valor = 0.56 para o teste Anderson-Darling), com parâmetros μ = 1,55 nm e σ = 0,20 nm, resultando em 95% das partículas com diâmetros no intervalo 2.4 e 6.6 nm (R2 ajustado da curva lognormal ao histograma = 0,97, mostrado na Figura 7).

[37] Outros parâmetros calculados para a distribuição estatística dos diâmetros das nanopartículas de prata são: moda = 4,5 nm; mediana = 4,8 nm; variância = 0,9 (nm)2; distorção = 0,6; e curtose = 0,7. Vale notar que o fato de o processo resultar em uma distribuição lognormal ao invés de uma distribuição normal reduz significativamente o intervalo de 95% de confiança para os diâmetros. Como comparação, o intervalo de 95% de confiança de uma curva normal corresponde a uma incerteza aproximadamente igual a três vezes o desvio-padrão. Supondo a mesma dispersão verificada no processo deste documento, isto resultaria em uma incerteza de 2,8 nm, um valor que é 33,3% superior à incerteza de 2,1 nm obtida com o processo proposto.

[38] As nanocápsulas formadas pelas nanopartículas de prata em Ac-Dex apresentam os diâmetros e índices de polidispersidades mostrados na Tabela 1, a qual representa o resultado da avaliação por dois métodos diferentes (intensidade e contagem). A caracterização por ressonância magnética nuclear (Figura 5) confirma que o polímero que encapsula as partículas é, de fato, o Ac-Dex, de modo que o sistema é responsivo ao pH, sofrendo degradação em meio ácido. As imagens de microscopia eletrônica de varredura, transmissão, e varredura transmissão (Figuras 5, 6 e 8) confirmam a formação de nanopartículas de Ac-Dex e nanopartículas prata com elevada esfericidade. Em particular, a Figura 8 mostra o efetivo encapsulamento das nanopartículas de prata com o antibiótico-modelo pela rede polimérica do Ac-Dex e a distribuição homogênea das nanopartículas de prata dentro da rede polimérica.

[39] A formamida (metanamida, CAS 75-12-7) reduz íons Ag+ dentro da rede polimérica, permitindo que a emulsão seja formada simultaneamente à formação de prata metálica no interior das gotículas. O polímero empregado atua como rede que limita as dimensões das nanopartículas em crescimento, auxiliando no controle dimensional. Além disso, o polímero passiva a superfície, diminuindo a tendência à agregação das nanopartículas de prata. O processo é baseado no fato de que a formamida possui diversas propriedades físicas semelhantes às da água, incluindo a constante dielétrica (elevada polaridade). Isto permite formar nanoemulsões com clorofórmio e outros solventes orgânicos apolares, além de poder solubilizar completamente a doxiciclina (fármaco-modelo testado) e tetrafluoroborato de prata (AgBF4), reduzindo os íons prata à temperatura ambiente. Como agente polimérico, foi escolhida a dextrana acetalada (Ac-Dex), por ser este um polímero promissor responsivo a variações de pH. Ainda, o seu precursor, a dextrana, é um homopolissacarídeo solúvel em água, derivado de bactérias, aprovado pela FDA e largamente disponível. O Ac-Dex possui, ainda, as propriedades de ser um material hidrofóbico preparado a partir da proteção de grupos hidroxila da dextrana com grupos acetal e facilmente processado por diferentes técnicas de emulsificação. Assim, as nanopartículas de Ac-Dex apresentam a capacidade de encapsular tanto moléculas hidrofóbicas quanto hidrofílicas, dependendo apenas do processo de emulsão empregado, conferindo a elas enorme potencial biomédico.

[40] Para que o processo seja conduzido de forma apropriada, as seguintes proporções foram encontradas como ideais, e devem ser mantidas em outras escalas de produção: 25 mg de AgBF4 são dissolvidos em 400 μL de formamida. Nesta etapa, adiciona-se também um agente farmacológico que se deseja encapsular para liberação controlada (como modelo, foram adicionados 50 mg de doxiciclina). Após aproximadamente 15 s, tempo que pode ser maior em outras escalas de produção, a solução inicialmente incolor torna-se amarelo-pálida. Após a mudança de cor, uma segunda solução contendo 100 mg de Ac-Dex dissolvidos em 4 mL de clorofórmio é completamente adicionada à solução amarelada de formamida/Ag, e o sistema é submetido a um primeiro ciclo de sonicação. Finalmente, adicionam-se 5 mL de uma terceira solução contendo 3% de álcool polivinílico (PVA; massa molecular entre 13.000—23.000 g/mol, grau de hidrolização entre 87—89%) em tampão PBS (tampão de sais fosfato, solução contendo 3% em massa de PBS), e procede-se a um segundo ciclo de sonicação. Os ciclos de sonicação são conduzidos pela introdução de uma sonda de ultrassom na solução, a qual deve permanecer imersa em banho com água e gelo. Cada ciclo tem duração de 30 s e, dentro deste intervalo, a sonda impõe pulsos de 0,5 s com 0,1 s de intervalo entre cada pulso. A amplitude utilizada foi 50% da máxima potência de saída, a qual é dada por 250 W.

[41] O processo apresenta as vantagens únicas de utilizar o próprio solvente do processo de emulsão como agente redutor da prata, garantindo maior simplicidade e reprodutibilidade para a metodologia empregada. Vale ressaltar que a medida que o processo de emulsão se desenvolve as nanopartículas de prata são formadas e estabilizadas dentro da rede polimérica. Essa estratégia garante a coencapsulação de nanopatículas de prata com outros agentes antimicrobianos, possibilitando a obtenção do efeito sinergético entre a prata e o fármaco no combate às infecções microbianas ou no combate a tumores. Esta estratégia é de fundamental importância para impedir que os agentes infecciosos desenvolvam cepas resistentes a um determinado agente, uma vez que a prata se mostra um agente de espectro largo e capaz de atuar por vários mecanismos em diversos microrganismos. Não bastasse, a escolha do polissacarídeo Ac-Dex, o qual deriva de matéria-prima largamente disponível e aprovada para uso biomédico (dextrana) traz ainda mais vantagens ao processo: em primeiro lugar, a dextrana pode atuar como agente de passivação, encapsulando a prata e o agente farmacológico ao mesmo tempo em que realiza o controle dimensional das nanopartículas, ou seja, é um mecanismo de controle inerente ao processo e que lhe confere alta previsibilidade de resultados. Não obstante, o Ac-Dex se degrada de forma altamente controlada quando o pH se modifica. Em particular, a degradação em pHs típicos de desenvolvimento tumoral é lenta, de modo que este processo pode ser adaptado para o acoplamento de prata a um fármaco de ação anticancerígena, pois o Ac-Dex sofrerá a degradação ao atingir a região de pH mais ácido (próximo a 5,5) e de maneira controlada. Deste modo, o material é capaz de manter um perfil de concentração de fármaco mais constante, ao contrário de agentes de encapsulação que sofrem degradação rápida e promovem picos de concentração de fármacos seguidos de períodos com concentração insuficiente para a ação desejada.

Modalidade construtiva

[42] Síntese, encapsulamento e entrega controlada de nanopartículas de prata acopladas a agentes farmacológicos, permitindo a ação sinergética, principalmente para o tratamento de infecções microbianas da pele, em animais e humanos, uma vez que a formulação desenvolvida na presente invenção possui aspecto semi-sólido podendo ser aplicada como pomada.

[43] Dado o caráter viscoso do material, filmes antimicrobianos poderiam ser desenvolvidos através da aplicação direta ou da pulverização das nanopartículas desenvolvidas. Os filmes potencialmente desenvolvidos poderiam ser aplicados como agentes profiláticos, dificultando o desenvolvimento e proliferação de doenças causadas por microorganismos.

[44] Os experimentos de viabilidade celular demonstram a baixa citotoxidade das nanopartículas de Ac-Dex co-encapsulando nanopartículas de prata e o antibiótico modelo. Os resultados mostram que após 24h e 48h as nanopartículas foram citotóxicas apenas para a concentração de 10 mg/mL. Entretanto, essa concentração seria muito superior à concentração empregada para um tratamento de infecção utilizando esse sistema.

[45] Ainda, as aplicações biomédicas não descartam a utilização da presente invenção em processos eletrônicos, ou sistemas de ressonância plasmônica superficial, incluindo uso em sensores.

Claims (2)

1. Processo de obtenção de nanocápsulas antimicrobianas caracterizado por compreender as etapas:

   • 1. Dissolver um sal de prata, preferencialmente tetrafluoroborato de prata (mg) em formamida(ml), na concentração variável entre 22.5mg/360ml e 27.5mg/440ml, preferencialmente na concentração de 25mg/400μL;
   • 2. Adicionar antibiótico, preferencialmente doxiciclina, 50 mg;
   • 3. Manter a solução incolor obtida na etapa (2) em temperatura ambiente até que ela se torne amarelo-pálida, preferencialmente por 15s;
   • 4. Dissolver dextrana acetalada em clorofórmio, na concentração variável entre 80mg/3.2ml e 120mg/4.8ml, preferencialmente na concentração de 100 mg/4 mL;
   • 5. Adicionar a solução obtida na etapa (4) à solução da etapa (3);
   • 6. Submeter a ciclo de sonicação com amplitude de 250 W, imersa em banho com água e gelo com duração de 30 s com impulsos por sonda impõe de 0,5s com 0,1s de intervalo entre cada pulso;
   • 7. Adicionar 5 mL de uma terceira solução contendo 3% de álcool polivinílico (PVA; massa molecular entre 13.000—23.000 g/mol, grau de hidrolização entre 87—89%) em tampão PBS (tampão de sais fosfato, solução contendo 3% em massa de PBS);
   • 8. Submeter a ciclo de sonicação com amplitude de 250 W, imersa em banho com água e gelo com duração de 30 s com impulsos por sonda impõe de 0,5s com 0,1s de intervalo entre cada pulso; e
   • 9. Obtenção de nanocápsulas antimicrobianas.
2. Nanocápsulas antimicrobianas caracterizadas por serem obtidas pelo processo descrito na reivindicação 1 e compreender elevada esfericidade, superfícies regulares, índice de polidispersidade variável entre 0.15 ± 0.06, diâmetro médio de 100 nm e diâmetros no intervalo 2.4 e 6.6 nm.

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