BR102020020141A2 - Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos - Google Patents

Abstract

O presente invento se refere ao campo de química, biologia e toxicologia. Mais especificamente se refere a um método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, em que se determina o CENO (Concentração de Efeito Não Observável), CEO (Concentração de Efeito Observável) e CE50 (Concentração Efetiva) na germinação de sementes. É utilizado um meio de cultivo constituído de soluções contendo macro e micronutrientes em concentrações otimizadas e ágar dissolvido, além de diferentes concentrações de ureia adicionadas. Para controlar os diferentes valores de pH do meio de cultivo, foram utilizados dois tipos de soluções tampão. Os testes de germinação devem ser realizados sobre um meio de cultivo com macro e micronutrientes em concentrações otimizadas e em valores de pH fixos.

Description

MÉTODO DE AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DA UREIA COMO AGENTE ESTRESSOR EM ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente invento se refere ao campo de química, biologia e toxicologia. Mais especificamente, a invenção se refere a um método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] A ureia (CO(NH2)2) é um composto muito utilizado como fertilizante em todo mundo para realizar a adubação de plantas. Seu extenso uso é explicado devido à alta concentração de nitrogênio (N).

[003] Apesar da necessidade de grandes quantidades de nitrogênio para o desenvolvimento da planta e da utilidade da aplicação da ureia como fertilizantes, a hidrólise desse composto a partir da enzima urease gera amônia, a qual tem relativa toxicidade ao vegetal.

[004] No solo, a ureia é hidrolisada pela enzima urease que faz com que haja a formação de carbonato de amônio (CO(NH2)2 + 2H2O → (NH4)2CO3) resultando em uma rápida decomposição. Com isso, originam-se amônio, bicarbonato e hidroxila ((NH4)2CO3 + H2O → 2NH4 + + OH- + HCO3 -), acarretando na elevação do pH. A parte do amônio (NH4 +) é transformado em amônia (NH3), podendo se perder na atmosfera caso não seja incorporada ao solo.

[005] A quantidade de nitrogênio volatilizado após a aplicação superficial de ureia é variável dependendo de fatores como, por exemplo, condições climáticas e propriedades relacionadas ao solo. Esse fenômeno pode ser de 1 a 15% ou atingir valores maiores do que 50% do nitrogênio introduzido. A volatilização da ureia pode resultar em uma espécie de queimadura nas folhas das plantas quando ocorre o contato direto.

[006] Desta forma, embora a ureia tenha grande utilização como fertilizante, em determinadas concentrações pode apresentar significativa toxicidade às plantas. Além disto, também pode trazer riscos à saúde humana, como irritação das vias aéreas superiores e da pele.

[007] Quando a ureia é descartada inadequadamente, torna as águas dos reservatórios excessivamente rica em nutrientes minerais e orgânicos, eutrofizando o meio e provocando o crescimento desequilibrado de espécies vegetais aquáticas, com efeitos muito negativos para o ecossistema e para a qualidade da água. Isso acarreta na diminuição dos níveis de oxigênio e altera os valores de pH, podendo causar a morte da fauna e flora.

[008] O pedido de patente PT 1311461 se refere a uma resina fertilizante líquida de ureia-formaldeído de liberação controlada, tendo um nível de nitrogênio de pelo menos cerca de 28% em peso e um método de preparação da resina. De acordo com esta invenção, os fertilizantes líquidos baseados em formaldeído de ureia necessitam da adição de fósforo e potássio, sendo nutrientes essenciais para o crescimento das plantas. O invento proposto em PT 1311461 utiliza a ureia como fertilizante, enquanto a presente invenção utiliza esse composto com a função de agente estressor, devido ao fato da ureia apresentar toxicidade dependendo da sua concentração e do valor do pH do meio.

[009] O pedido de patente PT 1781569 trata-se de um método de produção de um adubo que contém ureia e sulfato de amônio. Este método é baseado na formação de adubo através de um reator que contém diversos fatores inadequados, como a produção de resíduos, o elevado custo e a possibilidade da ureia apresentar toxicidade em determinadas concentrações e valores de pH. Apesar da grande concentração de nitrogênio ser eficaz na fertilização de plantas, os resíduos que o reator proposto pode ter, assim como o adubo em si, dependendo do descarte, do contato com água e o pH do meio, apresenta certa toxicidade.

[0010] O pedido de patente PT 2225188 trata-se de uma mistura para o tratamento de fertilizantes contendo ureia, com o objetivo de inibir a urease. Os autores discorrem sobre como esse elemento, após a aplicação sobre os fertilizantes contendo o reagente, apresenta estabilidade após o armazenamento por um período longo, possibilitando que a mistura não apresente quaisquer objeções do ponto de vista toxicológico e que não afete negativamente a atividade da substância ativa. Nesta invenção a ser patenteada, foi constatado que a ureia apresenta toxicidade a espécies vegetais a partir de determinadas concentrações.

[0011] O pedido de patente PT 3109223 relata uma mistura de inibidores de urease e inibidores de nitrificação para o tratamento de fertilizantes contendo ureia. O principal objetivo desta patente é aperfeiçoar o uso dos adubos com ureia para que haja menor perda de azoto, portanto, a mesma se difere da presente invenção por não constar a potencial toxicidade da ureia e utilizá-la como fertilizante. Além disso, a patente PT 3109223 refere-se à utilização da mistura para a redução das perdas de azoto em fertilizantes orgânicos, em áreas de pastagem ou durante o armazenamento de chorume e para a diminuição da carga de amoníaco em estábulos de animais.

[0012] O pedido de patente BR 11 2020 000376 0 refere-se a uma mistura, composição agroquímica e métodos para melhorar a eficiência de uso de fertilizantes contendo ureia para aumentar a saúde de uma planta e material de propagação de plantas. A patente encontrada utiliza de um inibidor de urease e um inibidor de nitrificação, com a finalidade de interromper o processo e melhorar a saúde de uma planta. Portanto com o uso desses inibidores a ureia é empregada como adubo, sem causar malefícios a plantação. Dessa forma, essa patente diverge da presente invenção ao empregar a ureia como adubo ainda que utilizando de uma metodologia que aplica inibidores visando diminuir a toxicidade da ureia. A presente invenção traz um método simples onde é possível determinar uma quantidade de ureia que não seja tóxica a uma espécie vegetal, sem o uso de inibidores, tratando-se, portanto, de uma metodologia mais barata.

[0013] O pedido de patente PI 0715097-0 utiliza-se de um herbicida já comercializado, um policarboxilato, um taurato, um lignossulfato, cloquintocet-mexila, um condensado polimérico de ureia-formaldeído para maximizar as propriedades de adubos já comercializados, com a finalidade de controlar ervas daninhas e gramas. Pode-se observar que o estudo utiliza mais de um composto com a finalidade de desenvolver um agente estressor de alta qualidade e amplo espectro de aplicação, com o intuito de atingir plantas específicas. Há uma ligação na utilização da ureia como agente inibidor do desenvolvimento da planta, porém, não é constatado a concentração que potencializa esse efeito e o pH ótimo para que isso ocorra. Dessa forma, a presente invenção revela características inovadoras.

[0014] O pedido de patente PI 0700921-6 refere-se a produtos fertilizantes à base de ureia e o processo para fabricação do produto. Mais especificamente relaciona-se a fabricação de um produto granulado composto por ureia, revestido por sulfato de cobre e ácido bórico, através de técnica que possui quantidade de nitrogênio volatilizado reduzida e inibição de perda de amônia da ureia. A ureia ao ser hidrolisada resulta em amônia a qual em determinadas quantidades apresenta-se tóxica ao meio. Contudo, nesta patente não é considerado a toxicidade que a inibição de amônia pode causar ao ambiente em que o fertilizante é aplicado.

[0015] O pedido de patente HK1257951 ilustra uma metodologia de preparo de grânulos de ureia para ser utilizado como nutrientes. No passado, as partículas de ureia eram geralmente produzidas por cristalização por pulverização, com uma fusão de ureia essencialmente anidra (teor de água de 0,1 a 0,3% em peso) sendo pulverizada do topo de uma torre de cristalização por pulverização em uma corrente ascendente de ar à temperatura ambiente e as gotículas solidificadas em cristais. Os grânulos obtidos desta forma têm diâmetros relativamente pequenos e baixa resistência mecânica. Outros processos conhecidos para a produção de composições contendo ureia em partículas usam sistemas de granulação em tambor ou placa, bem como os chamados tambores esferodizadores para produzir as partículas. A patente encontrada utiliza a ureia na forma sólida com a finalidade de fertilizar o solo sem formação de poeira. Tendo isso em vista, é importante compreender que a invenção a ser patenteada se difere da patente relatada por utilizar a ureia como agente estressor e possuir diferente metodologia de preparo da solução de ureia.

[0016] O pedido de patente SU1183078 refere-se ao estudo da toxicologia a partir de interação de três agroquímicos derivados da ureia, sendo eles, dozanex, linuron e fenuron, aplicados em três grupos de dez ratos. Para isso, os animais testes foram expostos ao contaminante e após 24 horas, coletou-se alíquotas de 1 ml de sangue de cada roedor. Podese observar a distinção em relação a invenção a ser patenteada, ao utilizarem animais para o estudo, visto que, no invento em questão utiliza-se plantas como organismo teste.

[0017] A presente invenção propõe uma técnica que utiliza o uso de sementes como organismos testes, produção de meio de cultura de forma simplificada, elevada sensibilidade e baixo custo. E apresenta benefícios ao examinar os impactos que a ureia pode causar ao cultivo, considerando os valores de pH, através de técnica de simples aplicação, dessa forma auxiliando no controle da toxicidade da ureia em um meio que pode ser descartado.

SUMÁRIO DO EVENTO

[0018] A presente invenção trata-se de um método de avaliação do comportamento da ureia como um agente estressor em ensaios ecotoxicológicos que utiliza duas soluções tampão, uma solução de nutrientes, uma solução estressora contendo a ureia e uma solução de cultivo.

[0019] A primeira solução de tamponamento é composta por fosfato monopotássico (KH2PO4) e fosfato dipotássico (K2HPO4), e a segunda solução de tamponamento é composta por fosfato de amônio monobásico (NH4H2PO4) e fosfato de amônio dibásico [(NH4)2HPO4] , em concentrações de 0,1 mol.L-1 diluídos em água destilada.

[0020] Para o início do preparo da solução de nutrientes, a solução KH2PO4 é adicionada a solução K2HPO4 até atingir a faixa de pH de 5,5 a 7,5. E a solução de [(NH4)2HPO4] é adicionada a solução NH4H2PO4 também até atingir a mesma faixa de pH. O pH dessas soluções definem o pH da solução de nutrientes e variam de acordo com a espécie de interesse a ser cultivada e testada.

[0021] A solução de nutrientes deve conter o valor de pH e as concentrações de macro e micronutrientes necessárias para o desenvolvimento das plântulas de interesse do estudo.

[0022] A solução de nutrientes pode ser composta pela solução de tamponamento (KH2PO4/K2HPO4) 0,01 mol.L-1 para suplementação com potássio, solução de tamponamento ((NH4)H2PO4/(NH4)2HPO4) 0,01 mol.L-1 para suplementação com fósforo, solução (NH3)2SO4 1000 mg.L-1 para suplementação com nitrogênio; CaCO3 1000 mg.L-1 para suplementação com cálcio; MgSO4.7H2O 1000 mg.L-1 para suplementação com magnésio; H3BO3 1000 μg.L-1 para suplementação com boro; e (NH4)6Mo7O24.4H2O 1000 μg.L-1 para suplementação com molibdênio. Essas soluções são preparadas separadamente e misturadas para o preparo da solução de nutrientes.

[0023] As soluções estressoras de ureia devem ser preparadas em água destilada, resultando em soluções estoques com concentrações de 500, 1000, 2000 e 5000 mg.L-1, para posteriores diluições nas concentrações de uso desejadas. As concentrações de uso das soluções estressoras de ureia variam entre 1 a 5000 mg.L-1 sendo definidas por ensaios prévios nas plântulas a serem testadas.

[0024] O meio de cultivo deve conter ágar dissolvido na solução de nutrientes, o aquecimento auxilia nessa etapa de dissolução. Quando a temperatura do meio de cultura atingir a faixa de 40º a 50°C, deve ser acrescentado entre 0,1 a 1,0 mL de solução do agente estressor, nas concentrações de interesse para o teste e 0,2 a 0,8 mL de água sanitária para evitar a contaminação do meio.

[0025] O método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos aqui descrito, é capaz de avaliar a toxicidade aguda e crônica da ureia em espécies vegetais.

[0026] Neste método foi utilizado o CENO (Concentração de Efeito Não Observável), CEO (Concentração de Efeito Observável) e CE50 (Concentração Efetiva) como parâmetros de análise e foi utilizado um grupo controle para comparação dos efeitos da adição da ureia ao meio de cultivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] Figura 1. Toxicidade crônica de ureia frente à espécie Raphanus sativus L. (rabanete) em valor de pH 7,0.

[0028] Figura 2. Toxicidade aguda de ureia frente à espécie Raphanus sativus L. (rabanete) em valor de pH 7,0.

[0029] Figura 3. Toxicidade crônica de ureia frente à espécie Brassica oleracea L. (couve) em valor de pH 7,5.

[0030] Figura 4. Toxicidade aguda de ureia frente à espécie Brassica oleracea L. (couve) em valor de pH 7,5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] Para avaliar a toxicidade da ureia no cultivo de plantas, a presente invenção utilizou sementes das espécies Raphanus sativus L. (rabanete) e Brassica oleracea L. (couve) como organismos testes apenas de forma ilustrativa e não restritiva. A metodologia a seguir não tem a aplicação restrita as espécies testes citadas na presente invenção.

[0032] Avaliou-se as toxicidades agudas e crônicas provocadas pela ureia. A escolha destas espécies deu-se por possuírem rápido e prático desenvolvimento, além de uma fácil visualização dos efeitos da toxicidade após a germinação, mesmo em baixas concentrações de agente estressor.

[0033] Os impactos provocados aos organismos vivos também são diferentes, enquanto a toxicidade aguda refere-se a dose letal, a toxicidade crônica é de concentração inferior e avalia os efeitos que podem estar relacionados à mutagenicidade, carcinogenicidade ou simplesmente inibição do desenvolvimento do organismo teste. Para ambos, os mecanismos toxicológicos são distintos, podendo diferenciar nos mecanismos da intoxicação, diferenciando inclusive o local de atuação do agente tóxico.

[0034] Ao utilizar plantas como organismos teste nos ensaios ecotoxicológicos é necessário desenvolver um meio de cultura com condições nutricionais otimizadas e em valores de pH fixos para um ótimo desenvolvimento. Alguns elementos e compostos aplicados para os testes controlam a disponibilidade de nutrientes para a planta de acordo com o pH especificado.

[0035] Preparo das Soluções Tampão: Primeiramente, são preparadas soluções precursoras, compostas por fosfato monopotássico (KH2PO4), fosfato dipotássico (K2HPO4), fosfato de amônio monobásico (NH4H2PO4) e fosfato de amônio dibásico [(NH4)2HPO4] , todas em concentrações de 0,1 mol.L-1. As massas foram obtidas por meio do cálculo da concentração da solução estoque (g.L-1) multiplicada pelo volume (L) e massa molar (g.mol-1) de cada reagente. Os valores finais são de: 1,36 g de KH2PO4; 1,74 g de K2HPO4; 1,15 g de NH4H2PO4 e 1,32 g de [(NH4)2HPO4] , os quais são pesados em uma balança semianalítica, e posteriormente diluídos com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL.

[0036] A titulação é realizada por meio da adição de uma alíquota de 50 mL de solução KH2PO4 e 50 mL da solução K2HPO4 em um béquer e em uma bureta, respectivamente. Através de um pHmetro os valores de pH analisados foram: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e 7,5.

[0037] De maneira similar, 50 mL com solução de [(NH4)2HPO4] é gotejada em um béquer de 250 mL contendo 50 mL de solução NH4H2PO4, na presença de um pHmetro, até atingir-se os valores de pH: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e 7,5.

[0038] Preparo da Solução de Nutrientes: Esta solução contém concentrações otimizadas de macro e micronutrientes que são necessários para o desenvolvimento de plântulas. A solução de nutrientes pode ser preparada em diversos valores de pH de acordo com a variação das soluções tampão as quais são empregadas no preparo. As soluções são preparadas nos valores de pH desejados para os ensaios e possuem, em suas estruturas moleculares, os nutrientes que farão parte do meio de cultivo.

[0039] A tabela 1 apresenta as concentrações ideais de macro e micronutrientes imprescindíveis para o desenvolvimento das espécies na solução. Um elemento é considerado essencial quando faz parte de uma molécula sendo intrínseca da estrutura ou metabolismo da planta ou também se esta exibir alterações em seu crescimento, desenvolvimento e reprodução se for privada do elemento.

[0040] Ensaios prévios demonstraram que o valor de pH adequado para o melhor desenvolvimento das sementes de rabanete é de 7,0 e para a couve, 7,5. É importante salientar que quando em excesso no solo, o nitrogênio orgânico é oxidado a amônia (NH3) ou dióxido de nitrogênio (NO2) pelas bactérias nitrificantes que são aeróbicas, gram-negativas e autotróficas. Os microrganismos responsáveis pela nitrificação são sensíveis aos valores de pH baixos, requerendo do meio valores entre 7,0 e 7,6 para atingirem crescimento ideal. Em solos ácidos, a população de Nitrossomonas e Nitrobacter é baixa, e como a maioria do solo cultivável no Brasil apresenta acidez considerável a decomposição do nitrogênio orgânico pode ficar comprometida.

[0041] Utilizou-se tampão (KH2PO4/K2HPO4) 0,01 mol.L-1 para quantidade ideal de potássio; tampão ((NH4)H2PO4/ (NH4)2HPO4) 0,01 mol.L-1 para fósforo; (NH3)2SO4 1000 mg.L-1 de N para nitrogênio; CaCO3 1000 mg.L-1 de Ca para cálcio; MgSO4.7H2O 1000 mg.L-1 de Mg para magnésio; H3BO3 1000 μg.L-1 de B para boro; e (NH4)6Mo7O24.4H2O 1000 μg.L-1 de Mo para molibdênio. As soluções são preparadas separadamente e posteriormente acrescentadas em balão volumétrico de 1000 mL para o preparo da solução de nutrientes.

[0042] Na tabela 2, encontram-se as concentrações e volumes das soluções estoque em valores de pH 7,0 para o preparo de solução de nutrientes da espécie Raphanus sativus L. e no quadro 3, as concentrações e volumes em valores de pH 7,5 para o preparo de solução de nutrientes da espécie Brassica oleracea L.

[0043] Preparo das soluções estressoras: As soluções estressoras de ureia foram preparadas através de sua dissolução em água destilada, resultando em soluções estoques com concentrações de 500, 1000, 2000 e 5000 mg.L-1, para posteriores diluições nas concentrações desejadas.

[0044] Preparo do meio de cultivo: 0,8g de ágar é dissolvido em 100 mL de solução de nutrientes. A mistura é aquecida em um béquer de 250 mL em uma chama de bico de Bunsen, com o auxílio de um tripé com tela de amianto, até a fervura para total dissolução do ágar.

[0045] Quando a temperatura atingir aproximadamente 45 °C adiciona-se com auxílio de uma pipeta volumétrica, 1,0 mL de solução do agente estressor (em diversas concentrações para avaliação ecotoxicológica) e duas gotas de água sanitária (a fim de minimizar espécies patógenas e desenvolvimento de fungos).

[0046] Ensaio teste e não restritivo da presente invenção: Para o preparo dos ensaios teste da presente invenção, o conteúdo do meio de cultivo foi dividido ainda líquido (temperatura aproximada de 40ºC), em volumes iguais (em torno de 30 mL) em três recipientes de polipropileno transparente (250 mL). Após o enrijecimento do meio de cultivo, foram acondicionadas 30 sementes de cada espécie, homogeneamente, em seus respectivos frascos. Os estudos foram realizados em triplicatas para melhor verificação das estatísticas.

[0047] Para comparação do desenvolvimento das plântulas, foram utilizadas "amostras controle" também em triplicata, apenas com a adição de 1,0 mL de água destilada para comparar o desenvolvimento das plântulas sem o uso do agente estressor.

[0048] Os recipientes foram fechados e submetidos à luz natural (em ambiente fresco, sem exposição direta do sol) até serem avaliadas ao final do quarto dia de exposição (análise de toxicidade aguda) e do sétimo dia de exposição (análise de toxicidade crônica).

[0049] O desenvolvimento das sementes foi observado em tempos curtos e longos, definidos como toxicidade aguda (CE50 – Concentração Efetiva) que avalia a dosagem capaz de apresentar toxicidade a 50% dos organismos testes em até 96 horas; e crônica (CENO - Concentração de Efeito Não Observável e CEO – Concentração de Efeito Observável) que avalia os efeitos provocados por um agente estressor em tempo superior a 96 horas de exposição.

[0050] Após o período considerado efetivo para a toxicidade, realiza-se uma média aritmética simples do crescimento do caule da plântula, já que as raízes podem apresentar desenvolvimento disforme. Avaliou-se os efeitos de redução do crescimento do caule das plântulas em relação à concentração de ureia empregada no meio de cultivo. Para isso, gráficos foram plotados utilizando o programa de computador Origin 6®, software para análise de dados e estatística desenvolvido pela Originlab® para execução em plataforma Windows.

[0051] Na análise da toxicidade crônica da espécie Raphanus sativus L. foram preparadas quatro soluções com diferentes quantidades de agente estressor, 20 mg.L-1; 30 mg.L-1; 40 mg.L-1; 50 mg.L-1 para valor de pH 7,0. Observouse o CENO em torno de 20,0 mg.L-1 de ureia e o CEO em 30,0 mg.L-1 (Figura 1).

[0052] Na análise da toxicidade aguda dessa mesma espécie, também foram preparadas quatro soluções com diferentes quantidades de agente estressor, 50 mg.L-1; 100 mg.L-1; 150 mg.L-1; 200 mg.L-1 para valor de pH 7,0. A partir disso pode-se calcular o CE50 que apresentou valor de aproximadamente 183,0 mg.L-1, para um desenvolvimento de 9,8 mm, conforme observado na Figura 2.

[0053] Ao estudar a toxicidade crônica da espécie Brassica oleracea L. observou-se que a couve apresenta maior sensibilidade comparada com o rabanete, por essa razão as soluções de agente estressor utilizadas apresentaram menores concentrações: 1 mg.L-1; 2 mg.L-1; 3 mg.L-1; 4 mg.L-1, para valor de pH 7,5. Como visto na Figura 3, o CENO se apresentou em 1,0 mg.L-1 de agente estressor e o CEO em 2,0 mg.L-1.

[0054] Para ser feita a análise da toxicidade aguda dessa espécie, foram preparadas soluções com concentrações de 300 mg.L-1; 350 mg.L-1; 400 mg.L-1; 450 mg.L-1, em valor de pH 7,5. O CE50 apresentou valor de aproximadamente 418,0 mg.L-1, para um desenvolvimento de 7,4mm, conforme observado na Figura 4.

[0055] Comparando os ensaios, pôde-se observar que a couve apresentou maior sensibilidade frente à concentração da ureia, sendo verificado por meio do estudo de Toxicidade Crônica, que apresentou efeito tóxico em 2,0 mg.L-1, enquanto o rabanete mostrou uma resistência mais significativa frente a concentrações elevadas, 30 mg.L-1.

[0056] Para cada cultura haverá sempre uma demanda de nutrientes específica da espécie que está sendo cultivada. Neste estudo, em que se verificou o desenvolvimento de duas hortaliças, foi observado que o CENO aparece em concentrações bastante distintas. Isto implica que em cada cultura deve ser utilizada quantidades apropriadas de fertilizantes principalmente os que empregam ureia em sua formulação. A falta deste nutriente pode acarretar no baixo desenvolvimento da plântula e o excesso pode provocar impactos ambientais gravíssimos não somente a planta, mas também ao meio ambiente como um todo.

[0057] Foi verificado que a couve, pelo fato de ser a espécie mais sensível em tempo de análise prolongada, é mais indicada para avaliações ambientais principalmente de estudo de nitrogênio orgânico. O rabanete apresentou-se mais indicado para estudos de toxicidade aguda, já que reage mais rapidamente em concentrações menores.

[0058] A metodologia proposta na presente invenção avalia, portanto, o comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos e apresenta uma real possibilidade de aplicação em grande escala.

[0059] A análise apresenta uma metodologia de fácil aplicação que pode ser realizada em curto espaço de tempo, não necessitando de laboratórios sofisticados, tampouco de um controle muito sistemático para que os organismos cresçam, o que minimiza os custos com a análise.

Claims (19)

1. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos caracterizado por utilizar:

   • - duas soluções de tamponamento;
   • - uma solução de nutrientes;
   • - uma solução estressora contendo ureia;
   • - uma solução de cultivo.
2. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de avaliar a toxicidade aguda e crônica da ureia em espécies vegetais.
3. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da primeira solução de tamponamento ser composta por fosfato monopotássico (KH2PO4) e fosfato dipotássico (K2HPO4), e a segunda solução de tamponamento ser composta por fosfato de amônio monobásico (NH4H2PO4) e fosfato de amônio dibásico [(NH4)2HPO4] , em concentrações de 0,1 mol.L-1 diluídos em água destilada.
4. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 3, caracterizado pelo fato da solução KH2PO4 ser adicionada a solução K2HPO4 até atingir o pH na faixa de 5,5 a 7,5.
5. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 3, caracterizado pelo fato da solução de [(NH4)2HPO4] ser adicionada a solução NH4H2PO4 até atingir o pH na faixa de 5,5 a 7,5.
6. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, 3, 4 e 5 caracterizado pelo fato das soluções de tamponamento definirem o pH da solução de nutrientes.
7. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da solução de nutrientes conter o valor de pH e as concentrações de macro e micronutrientes necessárias para o desenvolvimento de plântulas.
8. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 7, caracterizado pelo fato da solução de nutrientes ser composta pela solução de tamponamento (KH2PO4/K2HPO4) 0,01 mol.L-1 para suplementação com potássio, solução de tamponamento ((NH4)H2PO4/(NH4)2HPO4) 0,01 mol.L-1 para suplementação com fósforo, solução(NH3)2SO4 1000 mg.L-1 para suplementação com nitrogênio; CaCO3 1000 mg.L-1 para suplementação com cálcio; MgSO4.7H2O 1000 mg.L-1 para suplementação com magnésio; H3BO3 1000 μg.L-1 para suplementação com boro; e (NH4)6Mo7O24.4H2O 1000 μg.L-1 para suplementação com molibdênio.
9. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 8, caracterizado pelo fato das soluções de (KH2PO4/K2HPO4) 0,01 mol.L-1, ((NH4)H2PO4/(NH4)2HPO4) 0,01 mol.L-1, (NH3)2SO4 1000 mg.L1, CaCO3 1000 mg.L-1, MgSO4.7H2O 1000 mg.L-1, H3BO3 1000 μg.L-1 e (NH4)6Mo7O24.4H2O 1000 μg.L-1 serem preparadas separadamente e utilizadas para o preparo da solução de nutrientes.
10. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da solução de nutrientes ser preparada na faixa de pH de 5,5 a 7,5.
11. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da solução estressora de ureia ser preparada em água destilada, resultando em soluções estoques com concentrações de 500, 1000, 2000 e 5000 mg.L-1, para posteriores diluições nas concentrações de uso.
12. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da concentração de uso da solução estressora de ureia ser de 1 a 5000 mg.L-1.
13. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do meio de cultivo utilizar ágar e ser dissolvido na solução de nutrientes, aquecido até a total dissolução do ágar.
14. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 13, caracterizado pelo fato de ser adicionado entre 0,1 a 1,0 mL de solução estressora ao meio de cultura, quando a temperatura do meio de cultura atingir a faixa de 40º a 50°C.
15. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 14, caracterizado pelo fato da solução estressora ser utilizada em concentrações entre 1 e 450 mg.L-1.
16. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser adicionado 0,2 a 0,8 mL de água sanitária ao meio de cultura.
17. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das espécies serem cultivadas no meio de cultura e posteriormente analisadas quanto a toxicidade aguda e crônica da ureia.
18. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1 e 17, caracterizada pelo fato da toxicidade da ureia na germinação de sementes é analisada através do CENO (Concentração de Efeito Não Observável), CEO (Concentração de Efeito Observável) e CE50 (Concentração Efetiva).
19. Método de avaliação do comportamento da ureia como agente estressor em ensaios ecotoxicológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser utilizado um grupo controle para comparação dos efeitos da adição da ureia como agente estressor no meio de cultivo.

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