BR102020017861A2

BR102020017861A2 - Vaccine composition for anopheles mosquito control and use

Info

Publication number: BR102020017861A2
Application number: BR102020017861-0A
Authority: BR
Inventors: Rodolfo Cordeiro Giunchetti; Reysla Maria Da Silveira Mariano; Walderez Ornelas Dutra; Paulo Filemon Paolucci Pimenta; Nagila Francinete Costa Secundino; Breno Dos Anjos Costa; Alessandra Da Silva Orfanó; Rodrigo Correa Oliveira; Denise Da Silveira Lemos Giunchetti
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais; Fundação De Ensino E Tecnologia De Alfenas
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2022-05-03

Abstract

A presente tecnologia trata de uma composição vacinal contendo extrato de proteínas de mosquitos, preferencialmente proteínas do hospedeiro invertebrado Anopheles spp para atuar no controle da transmissão da malária.

The present technology deals with a vaccine composition containing extract of mosquito proteins, preferably proteins from the invertebrate host Anopheles spp, to act in the control of malaria transmission.

Description

VACCINATION COMPOSITION FOR ANOPHELES MOSQUITO CONTROL AND USE

[01] A presente tecnologia trata de uma composição vacinal contendo extrato de proteínas de mosquitos, preferencialmente proteínas do hospedeiro invertebrado Anopheles spp para atuar no controle da transmissão da malária.[01] The present technology deals with a vaccine composition containing extract of mosquito proteins, preferably proteins from the invertebrate host Anopheles spp to act in the control of malaria transmission.

[02] A malária é objeto de grande preocupação das autoridades governamentais. Em 2006, a doença foi responsável por elevada morbidade, de cerca de 247 milhões de episódios/ano e também por elevada mortalidade, estimada em 881 mil óbitos/ano. Mais de 91% desses óbitos ocorreram na África, principalmente em crianças menores de cinco anos. Nas Américas, a malária é endêmica em 21 países. O Brasil é o país com maior número de casos, 99,9% oriundos da Região Amazônica, onde a doença acomete indistintamente crianças, adolescentes e adultos. Em 2006, o Brasil notificou 548.597 casos de malária (73,4% pelo Plasmodium vivax). Em 2008, houve registro de 314.869 casos da doença, em que 84,4% corresponderam ao P. vivax, seguindo-se o Plasmodium falciparum com 14,6% e o restante, 1,0%, correspondendo aos casos de malária mista (P. vivax + P. falciparum), P. malariae e P. ovale (este último importado da África, pois essa espécie de plasmódio inexiste no País) (SIVEP/MALARIA. Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica – Notificação de Casos de Malária. Relatórios. Resumo epidemiológico, Região Malária. Ministério da Saúde. DATASUS).[02] Malaria is a major concern for government authorities. In 2006, the disease was responsible for high morbidity, around 247 million episodes/year, and also for high mortality, estimated at 881,000 deaths/year. More than 91% of these deaths occurred in Africa, mainly in children under five years of age. In the Americas, malaria is endemic in 21 countries. Brazil is the country with the highest number of cases, 99.9% from the Amazon region, where the disease affects children, adolescents and adults without distinction. In 2006, Brazil reported 548,597 cases of malaria (73.4% due to Plasmodium vivax). In 2008, there were 314,869 cases of the disease, of which 84.4% corresponded to P. vivax, followed by Plasmodium falciparum with 14.6% and the remainder, 1.0%, corresponding to cases of mixed malaria ( P. vivax + P. falciparum), P. malariae and P. ovale (the latter imported from Africa, as this plasmodium species does not exist in the country) (SIVEP/MALARIA. Epidemiological Surveillance Information System – Malaria Case Notification. Reports. Epidemiological summary, Malaria Region. Ministry of Health. DATASUS).

[03] O relatório mundial sobre a malária de 2018 mostra que, após um período sem precedentes de sucesso no controle global da malária, o progresso parou. Os dados de 2015–2017 destacam que não houve progresso significativo na redução dos casos globais de malária nesse período. Estima-se que houve 219 milhões de casos e 435.000 mortes relacionadas em 2017 (WORLD MALARIA REPORT 2018/WHO- World Health Organization. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. World Malaria Report 2018. World Health Organization, 210 p. ISBN 978 92 4 156565 3).[03] The 2018 World Malaria Report shows that after an unprecedented period of success in global malaria control, progress has stalled. Data from 2015–2017 highlights that there has been no significant progress in reducing global malaria cases in this period. It is estimated that there were 219 million cases and 435,000 related deaths in 2017 (WORLD MALARIA REPORT 2018/WHO- World Health Organization. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. World Malaria Report 2018. World Health Organization, 210 p. ISBN 978 92 4 156565 3).

[04] Na tentativa de um controle mais efetivo da doença diferentes estratégias têm sido empregadas, tais como, o mapeamento dos principais vetores e a análise da resistência destes aos inseticidas e o tratamento precoce dos humanos infectados. No entanto, o surgimento de casos graves de malária associados a limitação da disponibilidade das drogas antimaláricas sugere que o desenvolvimento de novas medidas controle se fazem necessárias. Desta forma, considera-se que o desenvolvimento de uma vacina preventiva poderia reduzir de forma significativa o surgimento de novos casos de malária, especialmente uma vacina visando o controle dos vetores. Há registro de algumas tecnologias que envolvem o desenvolvimento de vacinas contra a malária usando diferentes formulações com antígenos de Plasmodium ou fragmentos imunogênicos (EP1623720A3, US20080317787A1, CA2376926A1, EP1357128A4) tanto para prevenção quanto para tratamento. Porém, o ciclo de vida do parasito é complexo e possui muitos estágios de desenvolvimento. A resposta do sistema imunológico pode ser direcionada a apenas uma dessas fases, não afetando o próximo estágio do parasito, fato que torna o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a malária muito mais difícil em relação a outras doenças como as causadas por vírus ou bactérias, impondo diversos desafios no desenvolvimento de uma vacina segura, eficaz e acessível.[04] In an attempt to control the disease more effectively, different strategies have been used, such as mapping the main vectors and analyzing their resistance to insecticides and early treatment of infected humans. However, the emergence of severe cases of malaria associated with limited availability of antimalarial drugs suggests that the development of new control measures is necessary. Thus, it is considered that the development of a preventive vaccine could significantly reduce the emergence of new cases of malaria, especially a vaccine aimed at controlling the vectors. There are records of some technologies that involve the development of vaccines against malaria using different formulations with Plasmodium antigens or immunogenic fragments (EP1623720A3, US20080317787A1, CA2376926A1, EP1357128A4) for both prevention and treatment. However, the life cycle of the parasite is complex and has many stages of development. The immune system's response can be directed at only one of these stages, not affecting the next stage of the parasite, a fact that makes the development of an effective vaccine against malaria much more difficult in relation to other diseases such as those caused by viruses or bacteria, imposing several challenges in the development of a safe, effective and accessible vaccine.

[05] Os invertebrados que hospedam e disseminam estes parasitos para os hospedeiros vertebrados são mosquitos da subfamília Anophelinae, gênero Anopheles. Cerca de 400 espécies fazem parte deste gênero, porém apenas poucas espécies são importantes como vetores dos parasitos da malária. Cerca de 40 espécies de anofelinos são consideradas vetores importantes e outras como vetores secundários. Cinco espécies são consideradas como vetores importantes no Brasil, Anopheles darlingi, A. aquasalis, A. albitarsis s.l., A. cruzi s.l. e A. bellator. Vale ressaltar que o A. aquasalis é um dos vetores mais importantes de malária, além de vetor secundário da filariose bancroftiana no Brasil. Neste sentido, o desenvolvimento de uma medida eficaz de controle da população de vetores de Plasmodium levará a interrupção do ciclo biológico do parasito e consequentemente a diminuição do número de humanos infectados.[05] The invertebrates that host and spread these parasites to vertebrate hosts are mosquitoes of the subfamily Anophelinae, genus Anopheles. About 400 species belong to this genus, but only a few species are important as vectors of malaria parasites. About 40 anopheline species are considered important vectors and others as secondary vectors. Five species are considered important vectors in Brazil, Anopheles darlingi, A. aquasalis, A. albitarsis s.l., A. cruzi s.l. and A. bellator. It is worth mentioning that A. aquasalis is one of the most important vectors of malaria, as well as a secondary vector of bancroftian filariasis in Brazil. In this sense, the development of an effective measure to control the population of Plasmodium vectors will lead to the interruption of the parasite's biological cycle and, consequently, the decrease in the number of infected humans.

[06] O documento de patente BR1020170278859, intitulado “Composição vacinal contendo extrato bruto de proteínas intestinais de mosquito e processo de obtenção”, depositado em 22/12/2017, trata de composição para controle da população de mosquitos Aedes aegypti, vetores para diferentes arboviroses como Zika, Chickungunya, Febre amarela e Dengue.[06] Patent document BR1020170278859, entitled “Vaccine composition containing crude extract of mosquito intestinal proteins and process of obtaining”, filed on 12/22/2017, deals with composition for controlling the population of Aedes aegypti mosquitoes, vectors for different arboviruses such as Zika, Chickungunya, Yellow Fever and Dengue.

[07] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia similar a compreendida na presente invenção, a qual utiliza uma composição vacinal contendo antígenos intestinais do mosquito A. aquasalis para o controle do inseto vetor da malária.[07] In the state of the art, technology similar to that comprised in the present invention was not found, which uses a vaccine composition containing intestinal antigens of the A. aquasalis mosquito for the control of the insect vector of malaria.

[08] Assim sendo, a presente invenção propõe a utilização de alvos vacinais de A. aquasalis com o intuito de controlar as populações de campo desta espécie de mosquito. O grande potencial biótico de A. aquasalis, observado pelo seu rápido ciclo de vida nas temperaturas tropicais de várias cidades do Brasil endêmicas para malária, o hábito crepuscular e antropofílico fazem deste mosquito uma das principais espécies de vetores de Plasmodium spp. em nosso país. Desta forma, a utilização de vacinas em humanos contra estes vetores considerados de difícil controle populacional terá por intuito contribuir positivamente para a redução dos casos de malária.[08] Therefore, the present invention proposes the use of A. aquasalis vaccine targets in order to control the field populations of this mosquito species. The great biotic potential of A. aquasalis, observed by its rapid life cycle in the tropical temperatures of several malaria-endemic cities in Brazil, the crepuscular and anthropophilic habit make this mosquito one of the main vector species of Plasmodium spp. in our country. In this way, the use of vaccines in humans against these vectors considered difficult to control the population will aim to contribute positively to the reduction of malaria cases.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[09] A Figura 1 representa a avaliação da sobrevivência de fêmeas de A. aquasalis após repasto sanguíneo em camundongos BALB/c. O percentual de sobrevivência dos mosquitos foi avaliado ao longo de 10 dias do repasto sanguíneo. O gráfico de sobrevivência ilustra a comparação dos três grupos avaliados: Grupo Controle, Grupo Adjuvante e Grupos Vacina. Os valores de P foram obtidos pelo teste GehanBreslow-Wilcoxon considerados estatisticamente significativos quando <0,05.[09] Figure 1 represents the evaluation of the survival of females of A. aquasalis after blood meal in BALB/c mice. The percentage of mosquito survival was evaluated over 10 days of the blood meal. The survival graph illustrates the comparison of the three groups evaluated: Control Group, Adjuvant Group and Vaccine Groups. P values were obtained by the GehanBreslow-Wilcoxon test, considered statistically significant when <0.05.

DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNOLOGY

[010] A presente tecnologia trata de uma vacinal contendo antígenos do hospedeiro invertebrado Anopheles aquasalis para atuar no controle da transmissão da malária.[010] The present technology deals with a vaccine containing antigens from the invertebrate host Anopheles aquasalis to act in the control of malaria transmission.

[011] Mais especificamente, a composição vacinal para controle de Anopheles spp é composta por extrato de proteínas intestinais do mosquito e adjuvantes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis.[011] More specifically, the vaccine composition for controlling Anopheles spp is composed of extract of intestinal proteins from the mosquito and pharmaceutically and pharmacologically acceptable adjuvants.

[012] Os adjuvantes podem ser selecionados do grupo compreendendo sais de alumínio, AS04, AS03, MF59, virossomas, partículas semelhantes a vírus, micro / nanopartículas e potenciadores da resposta imune inata através da ativação de PRRs, preferencialmente Monofosforil lipídeo A.[012] Adjuvants can be selected from the group comprising aluminum salts, AS04, AS03, MF59, virosomes, virus-like particles, micro/nanoparticles and enhancers of the innate immune response through activation of PRRs, preferably Monophosphoryl lipid A.

[013] A composição vacinal proposta na presente tecnologia pode ser utilizada para o controle da população de mosquitos Anopheles spp.[013] The vaccine composition proposed in the present technology can be used to control the population of Anopheles spp.

[014] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida pelos exemplos que se seguem, não limitantes da tecnologia.[014] The present technology can be better understood by the following non-limiting examples of the technology.

EXAMPLE 1 - OBTAINING THE VACCINATION COMPOSITION CONTAINING GROSS MOSQUITO INTESTIN PROTEIN EXTRACT

[015] Intestinos de fêmeas de A. aquasalis foram coletados com a auxílio de lupa estereoscópica após serem anestesiados a frio (0-24°C) por 2 minutos.[015] Intestines of female A. aquasalis were collected with the aid of a stereoscopic magnifying glass after being cold anesthetized (0-24°C) for 2 minutes.

[016] Com o auxílio de uma pinça o tórax foi fixado e o abdômen foi puxado lentamente até a exposição total do intestino médio. Os túbulos de Malpighi foram retirados e descartados. Os intestinos foram transferidos para microtubos (0,6mL) estéreis contendo 100μL de solução salina a 0,9% e foram mantidos em freezer a -80ºC até o momento do uso.[016] With the aid of forceps, the thorax was fixed and the abdomen was slowly pulled until the full exposure of the midgut. Malpighian tubules were removed and discarded. The intestines were transferred to sterile microtubes (0.6mL) containing 100μL of 0.9% saline solution and kept in a freezer at -80ºC until use.

[017] Para preparo da vacina, os microtubos contendo os intestinos, foram levados a um sonicador ultrassônico de banho (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUA) e foram realizados 3 ciclos de 10 minutos, a 60hz para rompimento da membrana intestinal. Em seguida foi realizada a dosagem das proteínas pelo método de Ácido Bicinconínico (BCA).[017] To prepare the vaccine, the microtubes containing the intestines were taken to an ultrasonic bath sonicator (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA) and 3 cycles of 10 minutes were performed at 60hz to rupture the intestinal membrane. . Then, protein dosage was performed using the Bicinchoninic Acid (BCA) method.

EXAMPLE 2 - VACCINATION ASSAY WITH GROSS EXTRACT OF INTESTIN PROTEINS FROM FEMALE A. AQUASALIS IN MICE

[018] O esquema de vacinação consistiu em três doses subcutâneas de 100μL, com intervalo de 14 dias. Para o inóculo, utilizou-se seringas hipodérmicas descartáveis de 1mL e agulhas descartáveis de 26G, ambas estéreis. A aplicação foi realizada via subcutânea na região dorsal. Foram utilizados 26 camundongos BALB/c machos, com seis semanas de idade. Os animais foram divididos em três grupos:
Grupo controle, composto por 8 indivíduos inoculados com 100μL de solução salina estéril (pH 7,2);
Grupo adjuvante MPLa, composto por 8 indivíduos inoculados com 100μL (10μg) de MPLa;
Grupo vacina, composto por 10 indivíduos inoculados com 60µg de antígeno de fêmeas de Anopheles aquasalis em 100μL de MPLa (10μg).[018] The vaccination schedule consisted of three subcutaneous doses of 100μL, with an interval of 14 days. For the inoculum, 1mL disposable hypodermic syringes and 26G disposable needles were used, both sterile. The application was performed subcutaneously in the dorsal region. Twenty-six six-week-old male BALB/c mice were used. The animals were divided into three groups:
Control group, composed of 8 individuals inoculated with 100μL of sterile saline solution (pH 7.2);
MPLa adjuvant group, composed of 8 individuals inoculated with 100μL (10μg) of MPLa;
Vaccine group, composed of 10 individuals inoculated with 60µg of Anopheles aquasalis female antigen in 100μL of MPLa (10μg).

[019] Para realização do repasto sanguíneo de fêmeas de Anopheles aquasalis em camundongos BALB/c imunizados, os animais foram previamente anestesiados, via intraperitoneal, com 100µL de solução anestésica contendo 22µL (2,16mg) de Quetamina (Cetamina Cloridrato, Vetnil, Louveira, SP), 13µL (0,27mg) de Xilazina (Xilazina Cloridrato, Syntec, Santana de Parnaíba, SP) e 65µL de solução salina estéril 0,9% (pH 7,2), dose calculada considerando o peso médio dos animais de 27g. O repasto foi realizado individualmente, com 30 mosquitos fêmea por animal. Foram utilizadas fêmeas de Anopheles aquasalis com 3-5 dias de idade, em jejum, por grupo. Após constatar sedação, os animais foram transferidos para a tela localizada na porção superior da gaiola, e permaneceram com a região ventral em contato com os mosquitos. Após o término do repasto, os camundongos foram transferidos novamente para as caixas de origem.[019] To perform the blood meal of female Anopheles aquasalis in immunized BALB/c mice, the animals were previously anesthetized, intraperitoneally, with 100µL of anesthetic solution containing 22µL (2.16mg) of Ketamine (Cetamine Hydrochloride, Vetnil, Louveira , SP), 13µL (0.27mg) of Xylazine (Xylazine Hydrochloride, Syntec, Santana de Parnaíba, SP) and 65µL of sterile saline solution 0.9% (pH 7.2), dose calculated considering the average weight of the animals 27g. The meal was performed individually, with 30 female mosquitoes per animal. Females of Anopheles aquasalis with 3-5 days of age, fasted, were used per group. After noticing sedation, the animals were transferred to the mesh located in the upper portion of the cage, and remained with the ventral region in contact with the mosquitoes. After the meal was over, the mice were transferred back to their original boxes.

[020] Para a avaliação da sobrevivência após repasto, as fêmeas de A. aquasalis/animal/grupo, foram mantidas nas mesmas condições descritas anteriormente, em gaiolas próprias previamente identificadas, e alimentadas com solução de sacarose (5%). O acompanhamento foi realizado sempre no mesmo horário e iniciado imediatamente após o término do repasto sanguíneo.[020] For the evaluation of survival after feeding, the females of A. aquasalis/animal/group were kept under the same conditions described above, in their own previously identified cages, and fed with sucrose solution (5%). Follow-up was always performed at the same time and started immediately after the end of the blood meal.

[021] Na Figura 1 pode-se observar que houve uma redução significativa da taxa de sobrevivência do grupo Vacina quando comparado com o grupo Controle (p=0,0034).[021] In Figure 1 it can be seen that there was a significant reduction in the survival rate of the Vaccine group when compared to the Control group (p=0.0034).

Claims

VACCINE COMPOSITION FOR CONTROL OF Anopheles spp, characterized by comprising extract of intestinal proteins from the mosquito and pharmaceutically and pharmacologically acceptable adjuvants.

VACCINE COMPOSITION FOR CONTROL OF Anopheles spp, according to claim 1, characterized in that the adjuvant is selected from the group comprising aluminum salts, AS04, AS03, MF59, virosomes, virus-like particles, micro/nanoparticles and enhancers of the innate immune response through of activation of PRRs, preferably Monophosphoryl lipid A.

USE of the vaccine composition defined by claims 1 and 2, characterized in that it is for the control of the mosquito population, preferably Anopheles spp.