IMUNOBIOLÓGICO PARA CONTROLE DO VETOR DA LEISHMANIOSE, PROCESSOS DE OBTENÇÃO E USOS [001] A presente tecnologia trata de um imunobiológico para controle de flebotomíneos transmissores de diferentes espécies de Leishmania, causadoras da Leishmaniose Visceral (LV) e Tegumentar (LT) em hospedeiros vertebrados, do processo de obtenção do imunobiológico e do extrato e seus usos na produção de vacinas para humanos e/ou caninos. Mais particularmente, a tecnologia refere-se a um imunobiológico que compreende extrato intestinal de Lutzomyia spp. mais adjuvantes e excipientes farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis, o qual pode ser aplicado em cães com leishmaniose ou sadios para induzir uma resposta imune que causará a morte do flebotomíneo após ele alimentar-se no cão. Ainda, este imunobiológico poderá ser utilizado em associação com antígenos vacinais derivados de Leishmania spp. Destaca-se ainda que, em regiões do mundo onde a leishmaniose é uma antroponose, com a transmissão do parasito aos flebotomíneos a partir de pacientes humanos infectados, este imunobiológico poderá ser utilizado nestes pacientes buscando a interrupção do ciclo de transmissão da doença. A análise da taxa de oviposição de fêmeas de flebotomíneos alimentadas em camundongos BALB/c imunizados com tal imunobiológico revelou uma redução estatística (P<0,05) do número de ovos totais ovipostos por fêmeas com relação ao grupo controle, o que pode contribuir para o controle do inseto vetor, levando assim a uma redução da taxa de transmissão das Leishmanioses. [002] Anualmente, cerca de dois milhões de pessoas adquirem Leishmaniose em diferentes regiões do mundo (Desjeux. Comparative Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 7 (2004) 305-318). No Brasil, a Leishmaniose Visceral, que tem como agente etiológico a L. chagasi (sinonímia L. infantum), é amplamente distribuída e tem sido notificada em, pelo menos, 21 estados, sendo que os focos mais endêmicos ocorrem na região Nordeste (Harhay et ai. Trends in Parasitology 27(9) (2011) 403-409). É interessante observar que, com a urbanização, tem ocorrido uma adaptação do ciclo de transmissão no ambiente peridomiciliar, levando a um aumento do número de casos relatados de LV em todo o mundo. Sendo assim, ressalta-se o importante papel dos cães como reservatório no ciclo epidemiológico, favorecendo a transmissão do protozoário a humanos e a outros cães, visto que animais infectados (Deane & Deane, Rev. Inst. Med. Trop. 4 (1955) 149-212), mesmo sem qualquer sinal clínico da doença, podem infectar flebotomíneos (Molina et al. P. R. Health Sei. J. 13(4) (1994), 247-9; Giunchetti et al. J. Comp. Pathol. 135 (2006) 100-107; da Costa-Val et al. Vet J. 174(3) (2007) 636-43). [003] Diante do exposto, o controle da LV preconizado pela Organização Mundial de Saúde baseia-se em um tripé de ações cujos pilares são a eutanásia dos cães infectados, o tratamento de indivíduos doentes e o uso de piretróides para combate do inseto vetor (Palatnik-de-Sousa et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 65(5) (2001) 510-7). Um grande problema no programa de controle da LV está no uso de fármacos destinados ao tratamento de casos humanos para tratamento da doença canina, já que, independentemente do protocolo terapêutico, não é possível obter cura parasitológica nestes animais (Noli & Auxilia. Vet. Dermatol. 16(4) (2005) 213-32; Ministério da Saúde. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral, Secretaria de Vigilância em Saúde, Brasília, Brasil (2006) 122p.) [004] Além disso, o tratamento incorreto na LVC pode possibilitar o surgimento de cepas resistentes a fármacos utilizados para o tratamento humano e por isto o emprego da terapêutica anti-LVC não tem sido indicado, conforme parecer do Ministério da Saúde que proíbe o tratamento da LVC com produtos de uso humanos ou não registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Por outro lado, com a proximidade entre homem e cão na sociedade atual, o recolhimento e a eutanásia dos animais soropositivos, muitas vezes assintomáticos, torna-se cada vez mais complicado (Palatnik-de-Sousa etal. Am. J. Trop. Med. Hyg. 65(5) (2001) 510-7). [005] Considerando que a quimioterapia em cães ainda não proporciona cura parasitológica (Noli & Auxilia. Vet. Dermatol. 16(4) (2005) 213-32), o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC seria a melhor alternativa para combater a crescente expansão da doença podendo contribuir de forma efetiva nos programas de controle da LV (Gradoni. Vet. Parasitol. 100(1-2) (2001) 87-103; Mauel. Immune. Endocr. Metabol. Disord. 2 (2002) 201-226; Desjeux. Comparative Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 7 (2004) 305-318; Ravindran & Ali. Curr. Mol. Med. 4(6) (2004) 697-709; Reis et al. Trends Parasitol. 26(7) (2010) 341-9). Entretanto, até o momento ainda não existem vacinas aprovadas pelo Ministério da Saúde que sejam comprovadamente eficazes e que possam ser empregadas no âmbito nacional do programa de controle da leishmaniose visceral canina (Ministério da Saúde. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral, Secretaria de Vigilância em Saúde, Brasília, Brasil (2006) 122p.). Apesar do esforço despendido por diferentes grupos de pesquisa para identificação de uma vacina anti-leishmaniose visceral, até o presente momento o Ministério da Saúde ainda não indica nenhum candidato vacinai para ser empregado na campanha de controle da LV em nosso país. Deste modo, a presente invenção emprega antígenos provenientes do intestino do hospedeiro invertebrado (Lutzomyia longipalpis), para atuar no bloqueio da transmissão do parasito (diferentes espécies de Leishmania) pelo inseto vetor (Lutzomyia longipalpis, bem com outras espécies de Lutzomyia e Phlebotomus). Assim, mesmo se o animal (ou mesmo paciente humano) estiver infectado, não ocorrerá transmissão do agente. O presente produto poderá ser usado em associação com qualquer vacina contra leishmaniose, e/ou ainda poderá ser utilizado isoladamente em cães ou pacientes humanos com leishmaniose. Ao ser empregado em cães com leishmaniose, será possível evitar a eutanásia destes animais, uma vez que o cão infectado perderá a capacidade de transmitir o parasito e, assim, não interferirá no programa de controle desta doença. O mesmo se aplica aos pacientes humanos com leishmaniose, pois este imunobiológico favorecerá o controle de flebotomíneos, impedindo a transmissão do parasito a novos hospedeiros vertebrados (animais reservatórios ou mesmo ao homem). [006] Através das buscas, foram encontrados documentos que utilizam extrato salivar ou proteínas isoladas da saliva de Lutzomyia como vacina contra leishmaniose, como exemplo, pode-se citar: o documento US2006/0051364, que descreve polipeptídeos salivares de Lutzomyia longipalpis e nucleotídeos que codificam esses polipeptídeos e o uso deles no diagnóstico, prevenção e tratamento da Leishmaniose. [007] O artigo intitulado “Functional Transcriptomics of Wild-Caught Lutzomyia intermedia Salivary Glands: Identification of a Protective Salivary Protein against Leishmania braziliensis Infection” descreve uma proteína salivar de Lutzomyia intermedia que induz resposta imune celular em camundongos protegendo-os contra infecção por Leishmania braziliensis (Moura et al. PLOS Neglected Tropical Diseases 7 (2013) e2242). [008] O artigo intitulado “The effect of anti-sandfly saliva antibodies on Phlebotomus argentipes and Leishmania donovanf' descreve que anticorpos antisaliva de Phlebotomus argentipes servem como importante ferramenta no controle do vetor e no bloqueio da transmissão da leishmaniose (Ghosh et al. International Journal for Parasitology 28 (1998) 275-28 I). [009] O artigo intitulado “A killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays immunogenicity in dogs” avalia a imunogenícidade de uma vacina contra leishmaniose visceral canina compreendendo proteína de Leishmania braziliensis, extrato da glândula salivar do mosquito e o adjuvante saponina (Giunchetti et al. A killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays immunogenicity in dogs. Vaccine 26 (2008) 623-638). [010] Ainda, maior parte das publicações utilizam proteínas provenientes do próprio parasito na produção de imunobiológicos para o tratamento da leishmaniose, como por exemplo, o documento US5834592 descreve polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção imunogênica de um ou mais antígenos de Leishmania e o uso desses polipeptídeos na prevenção, tratamento e diagnóstico de leishmaniose. [011] O documento US5674503 descreve peptídeos de Leishmania capazes de induzir uma resposta imune contra leishmaniose. [012] O documento WO2012/019268 descreve uma vacina e Kit imunodiagnóstico para leishmaniose, desenvolvidos através da identificação, produção e seleção de novos antígenos de Leishmania por meio de análise proteômica, bioinformática, síntese peptídica e imunoensaios enzimáticos. [013] No entanto não foram encontrados no estado da técnica trabalhos que descrevem o uso de extrato ou proteínas do intestino de Lutzomyia longipalpis como imunobiológico para bloqueio da transmissão da leishmaniose através do extermínio do vetor. [014] Assim, a presente invenção permitirá o controle da leishmaniose através do controle do inseto vetor. Neste sentido, a presente invenção consiste em um produto que age no controle de flebotomíneos, impedindo a transmissão da infecção. Ressalta-se ainda que não existe um produto que possa ser aplicado no hospedeiro vertebrado infectado por espécies de Leishmania (homem, cão, dentre outros animais) impedindo que o agente infeccioso seja transmitido a outros hospedeiros. Em cães, esta tecnologia terá impacto direto no modo de controle atual da leishmaniose, já que torna desnecessária a realização da eutanásia em cães infectados.Immunobiology for Leishmaniasis VECTOR CONTROL, OBTAINMENT PROCESSES AND USES [001] The present technology deals with an immunobiological for the control of phlebotomine transmitters of different Leishmania species that cause Visceral (LV) and Tegumentary (LT) Leishmaniasis in vertebrate hosts, of the process of obtaining the immunobiological and the extract and their uses in the production of vaccines for humans and / or canines. More particularly, the technology relates to an immunobiological comprising intestinal extract of Lutzomyia spp. more pharmaceutically and pharmaceutically acceptable adjuvants and excipients, which may be applied to dogs with leishmaniasis or healthy to induce an immune response that will cause death of the sand fly after feeding on the dog. Furthermore, this immunobiological may be used in combination with Leishmania spp. It is also noteworthy that in regions of the world where leishmaniasis is an anthroponosis, with the transmission of the parasite to sandflies from infected human patients, this immunobiological can be used in these patients seeking to interrupt the disease transmission cycle. Analysis of the oviposition rate of females of sand flies fed on BALB / c mice immunized with this immunobiological revealed a statistical reduction (P <0.05) in the number of total eggs oviposited by females in relation to the control group. the control of the vector insect, thus leading to a reduction in the transmission rate of leishmaniasis. Every year, about two million people acquire leishmaniasis in different regions of the world (Desjeux. Comparative Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 7 (2004) 305-318). In Brazil, Visceral Leishmaniasis, whose etiological agent is L. chagasi (synonym L. infantum), is widely distributed and has been reported in at least 21 states, with the most endemic outbreaks occurring in the Northeast (Harhay). et al Trends in Parasitology 27 (9) (2011) 403-409). Interestingly, with urbanization, there has been an adaptation of the transmission cycle in the peridomiciliary environment, leading to an increase in the number of reported cases of VL worldwide. Thus, the important role of dogs as a reservoir in the epidemiological cycle is emphasized, favoring the transmission of protozoa to humans and other dogs, since infected animals (Deane & Deane, Rev. Inst. Med. Trop. 4 (1955)). 149-212), even without any clinical sign of the disease, can infect sandflies (Molina et al. PR Health Sci. J. 13 (4) (1994), 247-9; Giunchetti et al. J. Comp. Pathol. 135 (2006) 100-107; Costa-Val et al., Vet J. 174 (3) (2007) 636-43). Given the above, the control of VL advocated by the World Health Organization is based on a tripod of actions whose pillars are the euthanasia of infected dogs, the treatment of sick individuals and the use of pyrethroids to combat the insect vector ( Palatnik-de-Sousa et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 65 (5) (2001) 510-7). A major problem in the VL control program is the use of drugs to treat human cases to treat canine disease, since, regardless of the therapeutic protocol, it is not possible to obtain parasitological cure in these animals (Noli & Auxilia. Vet. Dermatol 16 (4) (2005) 213-32; Ministry of Health. Visceral Leishmaniasis Surveillance and Control Manual, Health Surveillance Secretariat, Brasilia, Brazil (2006) 122p.) [004] In addition, incorrect treatment in LVC may lead to the emergence of drug resistant strains used for human treatment and for this reason the use of anti-LVC therapy has not been indicated, according to the opinion of the Ministry of Health that prohibits the treatment of LVC with human or unregistered products. at the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply. On the other hand, with the proximity between man and dog in today's society, the collection and euthanasia of the often asymptomatic seropositive animals becomes increasingly complicated (Palatnik-de-Sousa et al. Am. J. Trop. Med Hyg. 65 (5) (2001) 510-7). Considering that chemotherapy in dogs has not yet provided a parasitological cure (Noli & Auxilia. Vet. Dermatol. 16 (4) (2005) 213-32), the development of an anti-LVC vaccine would be the best alternative to combat increasing spread of the disease may contribute effectively to VL control programs (Gradoni. Vet. Parasitol. 100 (1-2) (2001) 87-103; Mauel. Immune. Endocr. Metabol. Disord. 2 (2002) 201 Desjeux Comparative Immunol Microbiol Infect Dis 7 Dis (2004) 305-318 Ravindran & Ali Curr Mol 4 (6) (2004) 697-709 Reis et al Trends Parasitol. 26 (7) (2010) 341-9). However, to date there are no vaccines approved by the Ministry of Health that are proven to be effective and can be employed at the national level of the canine visceral leishmaniasis control program (Ministry of Health. Visceral Leishmaniasis Surveillance and Control Manual, Secretariat of Health Surveillance, Brasilia, Brazil (2006) 122p.). Despite the efforts made by different research groups to identify a visceral anti-leishmaniasis vaccine, the Ministry of Health has not yet indicated any vaccine candidate to be employed in the VL control campaign in our country. Thus, the present invention employs antigens from the gut of the invertebrate host (Lutzomyia longipalpis) to block parasite transmission (different Leishmania species) by the vector insect (Lutzomyia longipalpis, as well as other Lutzomyia and Phlebotomus species). Thus, even if the animal (or even human patient) is infected, no agent transmission will occur. The present product may be used in combination with any leishmaniasis vaccine, and / or may be used alone in dogs or human leishmaniasis patients. When used in dogs with leishmaniasis, it will be possible to avoid euthanasia of these animals, since the infected dog will lose the ability to transmit the parasite and thus will not interfere with the control program of this disease. The same applies to human patients with leishmaniasis, as this immunobiological will favor the control of sand flies, preventing the transmission of the parasite to new vertebrate hosts (reservoir animals or even to man). [006] Through searches, documents were found using salivary extract or proteins isolated from Lutzomyia saliva as a vaccine against leishmaniasis, as an example, US2006 / 0051364, which describes salivary polypeptides of Lutzomyia longipalpis and nucleotides that encode these polypeptides and their use in the diagnosis, prevention and treatment of leishmaniasis. [007] Article entitled “Functional Transcriptomics of Wild-Caught Lutzomyia intermedia Salivary Glands: Identification of a Protective Salivary Protein against Leishmania braziliensis Infection” describes a salivary protein of Lutzomyia intermedia that induces cellular immune response in mice protecting them against Leishmania infection. braziliensis (Moura et al. PLOS Neglected Tropical Diseases 7 (2013) and 2242). [008] The article entitled 'The effect of anti-sandfly saliva antibodies on Phlebotomus argentipes and Leishmania donovanf' describes that Phlebotomus argentipes anti-saliva antibodies serve as an important tool in vector control and in blocking leishmaniasis transmission (Ghosh et al. International Journal for Parasitology 28 (1998) 275-28 I). [009] The article entitled "A killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays immunogenicity in dogs" evaluates the immunogenicity of a vaccine against canine visceral leishmaniasis comprising Leishmania braziliensis protein, mosquito salivary gland extract and saponin adjuvant. (Giunchetti et al. A killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays immunogenicity in dogs. Vaccine 26 (2008) 623-638). Also, most publications use parasite proteins themselves to produce immunobiologicals for the treatment of leishmaniasis, for example, US5834592 describes polypeptides containing at least an immunogenic portion of one or more Leishmania antigens and use of these polypeptides in the prevention, treatment and diagnosis of leishmaniasis. US5674503 describes Leishmania peptides capable of inducing an immune response against leishmaniasis. WO2012 / 019268 describes a vaccine and immunodiagnostic kit for leishmaniasis developed through the identification, production and selection of new Leishmania antigens by proteomic analysis, bioinformatics, peptide synthesis and enzyme immunoassays. [013] However, no studies describing the use of Lutzomyia longipalpis intestine extract or proteins as immunobiological to block leishmaniasis transmission through extermination of the vector were found in the prior art. Thus, the present invention will allow the control of leishmaniasis through the control of the insect vector. In this sense, the present invention consists of a product that acts on the control of sand flies, preventing the transmission of infection. It is noteworthy that there is no product that can be applied to the vertebrate host infected by Leishmania species (man, dog, among other animals) preventing the infectious agent from being transmitted to other hosts. In dogs, this technology will have a direct impact on the current mode of control of leishmaniasis, as it makes unnecessary euthanasia in infected dogs.
Descrição das Figuras [015] A Figura 1 representa graficamente a média do número total de ovos de fêmeas de L. longipalpis alimentadas com sangue de camundongos imunizados com saponina (Controle) ou alimentadas com sangue de camundongos imunizados com o antígeno vacinai e saponina (Antígeno). As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas através de linhas conectoras.Description of the Figures [015] Figure 1 graphically represents the average total number of eggs of L. longipalpis females fed blood from mice immunized with saponin (Control) or fed blood from mice immunized with vaccine antigen and saponin (Antigen ). Significant differences (P <0.05) are represented by connecting lines.
Descrição detalhada da tecnologia [016] Considerando que o controle da leishmaniose está relacionado ao combate do inseto transmissor (flebotomíneos), a presente invenção permite realizar o controle deste vetor de parasitos do gênero Leishmania. Neste sentido, esta invenção caracteriza-se por um imunobiológico compreendendo extrato intestinal de Lutzomyia spp., seu processo de obtenção e seus usos no controle da leishmaniose canina, com aplicação também em humanos apresentando as diferentes formas clínicas das leishmanioses. Apresenta-se como uma ferramenta na imunoprofilaxia da doença, já que permitirá o controle de flebotomíneos e, consequentemente, a interrupção da transmissão do parasito. [017] O imunobiológico da presente tecnologia compreende extrato intestinal de Lutzomyia spp., adjuvantes e excipientes farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis. [018] O imunobiológico pode ser utilizado na produção de vacinas de uso humano e/ou canino, podendo ser administrado pelas vias dérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados. [019] O imunobiológico pode ser aplicado em cães com leishmaniose ou sadios para induzir uma resposta imune que causará interferência no ciclo biológico do flebotomíneo após ele alimentar-se no cão. Destaca-se ainda que, em regiões do mundo onde a leishmaniose é uma antroponose, com a transmissão do parasito aos flebotomíneos a partir de pacientes humanos infectados, este imunobiológico poderá ser utilizado nestes pacientes buscando a interrupção do ciclo de transmissão da doença. [020] Ainda, este imunobiológico poderá ser utilizado em associação com antígenos vacinais derivados de diferentes espécies de Leishmania. [021] Além disso, a presente invenção também apresenta o processo de obtenção de imunobiológico para controle do vetor da leishmaniose, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a. Coleta dos intestinos médios de Lutzomyia spp. em recipientes adequados e homogeneização em solução salina estéril; b. Rompimento dos intestinos em equipamento de ultrassom, por meio da submissão das amostras a quatro ciclos de ultrassom (50-200W) por um tempo entre 10-60 segundos, seguido de um banho em gelo de 10-60 segundos entre cada ciclo. c. Adição de adjuvantes e excipientes farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis. [022] Os recipientes utilizados para coleta dos intestinos são, preferencialmente, tubos plásticos do tipo microtubos de centrífuga com capacidade de 2,5 mL. A solução salina estéril empregada para homogeneização dos intestinos compreende preferencialmente solução de cloreto de sódio a 0,85%. [023] O adjuvante a ser utilizado poderá ser selecionado do grupo compreendendo: extrato total de saponina ou frações purificadas, MPL Monophosphoryl Lipid A (MPL), emulsão contendo MPL e a fração purificada QS-21 da saponina (AS02), Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), Bacillus Calmette-Guérin (BCG), emulsões de óleo minerais (adjuvante incompleto de Freund e/ou adjuvante completo de Freund), emulsões de óleo biodegradável como emulsões contendo óleo de amendoim e/ou esqualeno, surfactantes de copolímeros, lipossomos e microesferas de polímeros biodegradáveis, hidróxido de alumínio e/ou fosfato de alumínio, óleo mineral (Montanide™ ISA 720), componente da vacina de influenza (MF59), complexo de saponina Quil A, colesterol e fosfolipídios (ISCOMS®), emulsão óleo-em-água contendo monofosforil lipídio A (MPL) associado a dicorinomicolato de trehalose (Sistema Adjuvante Sigma), dinucleotídeos não-metilados (CpG) e enterotoxinas ADP-ribosiladas. [024] A presente invenção descreve, ainda, o processo de obtenção do extrato intestinal de Lutzomyia spp., o qual também é um imunobiológico, sendo tal processo caracterizado por compreender as seguintes etapas: a. Coleta dos intestinos médios de Lutzomyia spp. em recipientes adequados e homogeneização em solução salina estéril; b. Rompimento dos intestinos em equipamento de ultrassom, por meio da submissão das mostras a quatro ciclos de ultrassom (50- 200W) por um tempo entre 10-60 segundos, seguido de um banho em gelo de 10-60 segundos entre cada ciclo. [025] O extrato obtido por meio deste processo pode ser usado na produção de vacinas de uso humano e/ou canino. [026] O extrato intestinal de Lutzomyia spp. obtido pelo processo acima pode ser armazenado preferencialmente em freezer à temperatura de -80 a -20 °C em solução salina a 0,85 % até o momento da imunização ou armazenado refrigerado (1 a 8°C) após processo de liofilização. Para utilização, procede-se o descongelamento do imunobiológico em banho de gelo e imersão dos tubos com o conteúdo intestinal em um equipamento que produz ondas ultrassônicas na água a fim de promover a solubilização das proteínas. [027] A presente tecnologia poderá ser melhor compreendida a partir dos exemplos, não limitantes, que seguem.DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNOLOGY Since the control of leishmaniasis is related to the control of the transmitting insect (sandflies), the present invention allows the control of this vector of Leishmania parasites. In this sense, this invention is characterized by an immunobiological comprising intestinal extract of Lutzomyia spp., Its obtaining process and its uses in the control of canine leishmaniasis, with application also in humans presenting the different clinical forms of leishmaniasis. It is presented as a tool in the immunoprophylaxis of the disease, as it will allow the control of sand flies and, consequently, the interruption of parasite transmission. The immunobiological of the present technology comprises Lutzomyia spp. Intestinal extract, pharmaceutically and pharmaceutically acceptable adjuvants and excipients. [018] The immunobiological may be used in the production of human and / or canine vaccines and may be administered by dermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal or as devices that may be implanted or injected. [019] The immunobiological can be applied to dogs with leishmaniasis or healthy dogs to induce an immune response that will interfere with the phlebotomine's biological cycle after feeding on the dog. It is also noteworthy that in regions of the world where leishmaniasis is an anthroponosis, with the transmission of the parasite to sandflies from infected human patients, this immunobiological can be used in these patients seeking to interrupt the disease transmission cycle. [020] This immunobiological may also be used in combination with vaccine antigens derived from different Leishmania species. Furthermore, the present invention also provides the process of obtaining immunobiological for controlling the leishmaniasis vector, comprising the following steps: a. Collection of the middle intestines from Lutzomyia spp. in suitable containers and homogenization in sterile saline solution; B. Intestinal disruption in ultrasound equipment by submitting the samples to four ultrasound cycles (50-200W) for a time between 10-60 seconds, followed by an ice bath of 10-60 seconds between each cycle. ç. Addition of pharmacologically and pharmaceutically acceptable adjuvants and excipients. [022] The bowel collection vessels are preferably centrifuge microtube type plastic tubes with a capacity of 2.5 mL. The sterile saline employed for intestinal homogenization preferably comprises 0.85% sodium chloride solution. The adjuvant to be used may be selected from the group comprising: total saponin extract or purified fractions, MPL Monophosphoryl Lipid A (MPL), emulsion containing MPL and purified saponin fraction QS-21 (AS02), Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), Bacillus Calmette-Guérin (BCG), mineral oil emulsions (incomplete Freund's adjuvant and / or Freund's complete adjuvant), biodegradable oil emulsions such as peanut and / or squalene oil-containing emulsions, copolymer surfactants, liposomes and biodegradable polymer microspheres, aluminum hydroxide and / or phosphate aluminum, mineral oil (Montanide ™ ISA 720), influenza vaccine component (MF59), Quil A saponin complex, cholesterol and phospholipids (ISCOMS®), oil emulsion -in-water containing monophosphoryl lipid A (MPL) associated with trehalose dichlorinomycolate (Sigma Adjuvant System), unmethylated dinucleotides (CpG) and ADP-ribosylated enterotoxins. [024] The present invention further describes the process for obtaining the intestinal extract of Lutzomyia spp., Which is also an immunobiological, which process comprises the following steps: a. Collection of the middle intestines from Lutzomyia spp. in suitable containers and homogenization in sterile saline solution; B. Intestinal disruption in ultrasound equipment by submitting the samples to four ultrasound cycles (50-200W) for a time between 10-60 seconds, followed by an ice bath of 10-60 seconds between each cycle. [025] The extract obtained by this process can be used in the production of human and / or canine vaccines. [026] The intestinal extract of Lutzomyia spp. obtained by the above process may preferably be stored in a freezer at -80 to -20 ° C in 0.85% saline until the time of immunization or stored refrigerated (1 to 8 ° C) after freeze drying. For use, the immunobiological is thawed in an ice bath and the tubes are immersed with the intestinal contents in a device that produces ultrasonic waves in the water to promote protein solubilization. The present technology may be better understood from the following non-limiting examples.
Exemplol: Produção do imunobiológico [028] Para a obtenção do extrato vacinai proteico, foi realizada a dissecação de fêmeas de L. longipalpis, com 3 a 5 dias de nascidas, alimentadas com glicose. Após a dissecação, os intestinos foram transferidos para tubo de microcentrífuga contendo salina a 0,85%. Todo o procedimento foi feito em banho de gelo e os tubos foram mantidos em freezer a -80°C até o momento do uso. [029] No momento do preparo do imunobiológico, os intestinos coletados foram retirados do freezer e descongelados em banho de gelo. Após o descongelamento, os microtubos foram imersos em um equipamento que produz ondas ultrassônicas na água a fim de promover a solubilização das proteínas intestinais. Tal processo consistiu em submeter os tubos de microcentrífuga contendo as amostras a quatro ciclos de ultrassom (50-200W) por um tempo entre 10-60 segundos, seguido de um banho em gelo de 10-60 segundos entre cada ciclo. [030] Assim, foi obtido o extrato contendo os antígenos de interesse. Para determinar a concentração de proteínas solúveis deste extrato, foi realizada a dosagem de proteínas pelo kit BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific). O ensaio foi realizado em duplicata e de acordo com as instruções do fabricante. Foi possível determinar que o extrato de cada intestino continha, aproximadamente, 2,4pg de proteína.Example: Immunobiological Production [028] To obtain the protein vaccine extract, dissection of L. longipalpis females, 3 to 5 days old, fed glucose was performed. After dissection, the intestines were transferred to a microcentrifuge tube containing 0.85% saline. The entire procedure was done in an ice bath and the tubes were kept in a freezer at -80 ° C until the moment of use. [029] At the time of immunobiological preparation, the collected intestines were removed from the freezer and thawed in an ice bath. After thawing, the microtubes were immersed in equipment that produces ultrasonic waves in the water to promote intestinal protein solubilization. Such a process consisted of subjecting the microcentrifuge tubes containing the samples to four ultrasound cycles (50-200W) for a time between 10-60 seconds, followed by a 10-60 second ice bath between each cycle. Thus, the extract containing the antigens of interest was obtained. To determine the soluble protein concentration of this extract, protein was measured by the BCA Protein Assay Reagent kit (Thermo Scientific). The assay was performed in duplicate and according to the manufacturer's instructions. It was determined that the extract from each intestine contained approximately 2.4pg of protein.
Exemplo2: Análise da taxa de oviposição de fêmeas de flebotomíneos alimentadas em camundongos BALB/c imunizados com extrato intestinal de Lutzomyia longipalpis [031] Para a análise da mortalidade de flebotomíneos imunizados com as proteínas intestinais de L. longipalpis, foi realizado um ensaio pré-clínico vacinai empregando-se 20 machos de camundongos BALB/c, com idade entre 4-6 semanas. Assim, estes animais foram divididos em dois grupos experimentais: (i) Grupo controle (n=10) - inoculad o com saponina (100pg diluído em salina estéril); (ii) Grupo vacinado (n=10) - inoculado com as proteínas de membrana intestinal (60ug/dose/camundongo) e 100pg do adjuvante saponina diluída em salina estéril. Os inóculos foram administrados em três doses intervaladas de 14 dias e administradas por via subcutânea em um volume finai de 100pL. [032] Após 20 dias do último inóculo, todos os animais foram anestesiados com ketamina e xilazina e colocados para que fêmeas de L. longipalpis realizem o repasto sanguíneo. Assim, flebotomíneos não contaminados foram colocados em um recipiente apropriado e fechado para a realização do repasto sanguíneo (da Costa-Val et al., 2007). Brevemente, flebotomíneos foram alimentados durante aproximadamente 60 minutos em uma sala escura. Após o repasto, somente as fêmeas ingurgitadas foram colocadas em potes. Para cada animal, foi disponibilizado um pote para avaliação da oviposição. Para tanto, foram colocadas 15 fêmeas no recipiente, mantidas sob condições ideais de umidade e alimentação com glicose. Após 12 dias, as fêmeas restantes foram eliminadas e foi feita a contagem de ovos totais com auxílio de uma lupa. Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental do software GraphPad Prism 6 (Prism Software, Irvine, CA, USA). Foi realizado o teste t de Student para a análise de oviposição e o teste de Kaplan-Meier para a estimativa de sobrevivência. Os dados obtidos foram considerados estatisticamente significativos quando o valor de P foi <0,05. [033] Foi observada uma redução estatística (P<0,05) do número de ovos totais ovipostos por fêmeas de L. lortgipalpis alimentadas em camundongos que receberam o antígeno vacinai (média 511,8 ± 53,7) com relação ao grupo controle (média 337,9 ± 28) (Figura 1). [034] A redução da oviposição observada neste ensaio é de extrema importância e pode contribuir para o controle do inseto vetor, levando assim a uma redução da taxa de transmissão das Leishmanioses. [035] Considerando os resultados encontrados neste ensaio pré-clínico, o uso de extrato intestinal de L. longipalpis apresenta-se como um promissor método para o controle das leishmanioses canina e humana.Example 2: Analysis of oviposition rate of female sandflies fed on BALB / c mice immunized with Lutzomyia longipalpis intestinal extract [031] For the analysis of mortality of sandflies infected with L. longipalpis intestinal proteins, a pre-test was performed. vaccinator using 20 male BALB / c mice, aged 4-6 weeks. Thus, these animals were divided into two experimental groups: (i) Control group (n = 10) - inoculated with saponin (100pg diluted in sterile saline); (ii) Vaccinated group (n = 10) - inoculated with intestinal membrane proteins (60ug / dose / mouse) and 100pg of saponin adjuvant diluted in sterile saline. Inocula were administered at three 14-day interval doses and administered subcutaneously at a final volume of 100pL. [032] After 20 days of the last inoculum, all animals were anesthetized with ketamine and xylazine and placed so that L. longipalpis females perform the blood meal. Thus, uncontaminated sand flies were placed in an appropriate closed container for blood repast (da Costa-Val et al., 2007). Briefly, sand flies were fed for approximately 60 minutes in a dark room. After repast, only engorged females were placed in pots. For each animal, a pot was provided for oviposition evaluation. For this, 15 females were placed in the container, kept under ideal conditions of humidity and feeding with glucose. After 12 days, the remaining females were eliminated and the total eggs were counted using a magnifying glass. Statistical tests were performed with the instrumental support of GraphPad Prism 6 software (Prism Software, Irvine, CA, USA). Student's t-test was used for oviposition analysis and Kaplan-Meier test for survival estimation. The data obtained were considered statistically significant when the P value was <0.05. [033] There was a statistical reduction (P <0.05) in the number of total eggs oviposited by L. lortgipalpis females fed on mice receiving the vaccine antigen (mean 511.8 ± 53.7) compared to the control group. (mean 337.9 ± 28) (Figure 1). [034] The reduction in oviposition observed in this trial is of utmost importance and may contribute to the control of the vector insect, thus leading to a reduction in the rate of Leishmaniasis transmission. [035] Considering the results found in this preclinical trial, the use of L. longipalpis intestinal extract is a promising method for the control of canine and human leishmaniasis.