BR102020001929A2 - Processo para extração de dna de plantas com altos teores de metabólitos secundários - Google Patents

Abstract

processo para extração de dna de plantas com altos teores de metabólitos secundários. a presente invenção consiste em um processo de extração de dna de plantas com altos teores de metabólitos secundários, de maneira rápida, barata e segura, dispensando a necessidade de múltiplas etapas de purificação e reduzindo o uso de reagentes caros e/ou tóxicos, tais como o clorofórmio e o ß-mercaptoetanol. através da utilização do presente processo, é possível a extração de dna íntegro, livre de contaminantes e em quantidade suficiente para maioria das análises moleculares realizadas atualmente, como, por exemplo, digestão com enzimas de restrição e amplificação via reação em cadeia da polimerase (pcr). portanto, este processo de extração de dna será uma importante ferramenta para análises moleculares de espécies vegetais, para fins de conservação ou aproveitamento econômico.

Description

PROCESSO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE PLANTAS COM ALTOS TEORES DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS Campo da invenção

[001] A presente invenção se insere no campo geral da Biotecnologia, mais especificamente na área de biologia molecular de plantas, e descreve um processo eficiente de extração de DNA de plantas com altos teores de metabólitos secundários por meio do uso conjunto de dodecilsulfato de sódio (SDS) e Triton X-100, eliminando a necessidade de diversas etapas de limpeza e purificação e o uso de reagentes tóxicos, como clorofórmio e β-mercaptoetanol, o que torna o método mais rápido, barato e seguro, quando comparado aos demais já desenvolvidos e testados em espécies com estas características bioquímicas.

Estado da Técnica

[002] Seja para conservação da biodiversidade, melhoramento genético, estudos filogenéticos e de hereditariedade, desenvolvimento de organismos geneticamente modificados ou para diversas outras finalidades, existem várias técnicas moleculares para auxiliar o trabalho de geneticistas, melhoristas, ecologistas e produtores.

[003] Com o advento da amplificação do DNA, por meio do desenvolvimento da técnica de PCR, em meados da década de 1980, surgiu um grande número de marcadores moleculares, provocando um impulso na geração de dados moleculares para diversas espécies. Os principais marcadores moleculares usados atualmente baseiam-se na técnica de PCR, tais como o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), o STS (Sequence Tagged Sites), o SCAR (Sequence Characterized Amplified Region), o AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism), o SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e os microssatélites.

[004] Estes marcadores possibilitam o estudo de uma maior quantidade de características; a obtenção de um número praticamente ilimitado de polimorfismos genéticos; a identificação direta do genótipo sem influência do ambiente; e a detecção de polimorfismos em qualquer estádio de desenvolvimento das plantas ou mesmo a partir de cultura de células ou tecidos.

[005] As novas tecnologias de sequenciamento de DNA, denominadas de sequenciamento de nova geração, também representam uma importante ferramenta para a genética da conservação e para o melhoramento vegetal, por permitir o conhecimento do genoma das plantas, o estudo de variantes alélicas, o desenvolvimento de marcadores moleculares primers-específicos e a clonagem baseada em mapeamento genético

[006] Para o desenvolvimento satisfatório de todas estas técnicas, DNA em quantidade suficiente, íntegro e livre de contaminantes é essencial.

[007] Há diversos protocolos de extração de DNA já descritos e testados para diferentes grupos de espécies, sendo que a escolha de um determinado protocolo depende da qualidade e quantidade de DNA requerida, do número de amostras e da presença e quantidade de substâncias que podem interferir no processo de extração e nas análises subsequentes. A maioria dos protocolos disponíveis baseia-se no rompimento das membranas celulares por meio do uso do detergente CTAB ou, em menor frequência, do SDS. Existem, ainda, vários kits comerciais para extração de DNA de plantas disponíveis no mercado, que garantem DNA em quantidade e qualidade para análises moleculares.

[008] Estes kits comerciais apresentam alto custo, o que torna o seu uso inviável para boa parte dos laboratórios. Já os métodos tradicionais utilizam reagentes tóxicos e possuem múltiplas etapas para a obtenção de DNA, o que aumenta o tempo de execução, os custos e as chances de erros. Com espécies ricas em polissacarídeos e metabólitos secundários, como terpenos e fenóis, estes métodos muitas vezes ainda falham na obtenção de DNA puro, íntegro e em boa quantidade para análises moleculares.

[009] Os polissacarídeos inibem a ação de enzimas de restrição e tornam a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migração do DNA em corridas eletroforéticas. Os compostos fenólicos oxidam o DNA, deixando as amostras escuras, reduzindo a sua vida útil e tornando-as impróprias para análises moleculares. Para aumentar a pureza do DNA extraído, são adicionadas ao tampão diferentes concentrações de agentes antioxidantes (PVP e/ou βmercaptoetanol) e/ou proteases, bem como são realizadas etapas de purificação com clorofórmio, que são reagentes altamente tóxicos, diminuindo, assim, a segurança do método.

[0010] Portanto, o desenvolvimento de um método de extração de DNA eficiente, rápido, barato e seguro é de grande importância para que estudos com espécies vegetais que possuem alto teor de metabólitos secundários possam ser realizados com sucesso.

[0011] Neste contexto, a presente invenção tem como objetivo apresentar um método rápido, eficiente, simples e menos tóxico para extração de DNA de espécies vegetais com elevadores teores de metabólitos secundários com qualidade e em quantidade suficiente para as principais análises moleculares realizadas atualmente. O método apresentado baseia-se no uso conjunto de SDS e Triton X-100, eliminando a necessidade de realização de etapas de purificação pós-extração e o uso de reagentes caros e/ou altamente tóxicos, como nitrogênio líquido, clorofórmio e β-mercaptoetanol.

[0012] O processo descrito na presente invenção poderá ser utilizado por indústrias especializadas na elaboração de kits de extração de DNA de plantas, em substituição a kits que necessitam de diversas etapas de limpeza e purificação e usam reagentes tóxicos, para análises moleculares com espécies vegetais que possuem elevadores teores de metabólitos secundários.
Breve descrição das figuras
A FIGURA 1 apresenta a análise da qualidade do DNA extraído pelo presente processo em dez diferentes espécies por meio da eletroforese de 50 ng de DNA em gel de agarose 0,8 % (M: 1 kb ladder; AH: A. humile; AF: A. falcata; BD: B. dracunculifolia; BG: B. gaudichaudii; CA: C. adamantium; ED: E. dysenterica; HS: H. stigonocarpa; PC: P. campestris; SL: S. lycocarpum; SA: S. adstringens).
A FIGURA 2 apresenta o resultado da digestão do DNA extraído pelo presente método por EcoRI em dez diferentes espécies por meio da eletroforese em gel de agarose 0,8 %, considerando a mesma ordem e as mesmas espécies descritas na FIGURA 1.
A FIGURA 3 apresenta o resultado da amplificação do DNA extraído com primers ITS em dez diferentes espécies por meio da eletroforese em gel de agarose 1,5 %, considerando a mesma ordem e as mesmas espécies descritas na FIGURA 1.

Descrição da invenção

[0013] O processo de extração de DNA descrito na presente invenção é constituído pelas seguintes etapas:

[0014] Colocar aproximadamente 100 mg de tecido foliar liofilizado e triturado em um tubo de polipropileno de 15 mL, adicionar o tampão de extração (1,4 M NaCl; 100 mM Tris-HCl pH 8.0; 20 mM EDTA; 5 % Triton X-100; 5 % SDS) pré-aquecido a 65 ºC em banho-maria até completar cerca de 5 mL, agitar no vortex por cerca de 30 s e incubar em banho-maria a 65 ºC por 15 min.

[0015] Agitar no vortex rapidamente (menos de 30 s), transferir o sobrenadante (aproximadamente 2 mL) para um microtubo de 2 mL, centrifugar a 13.000 rpm por 7 min, transferir o sobrenadante (aproximadamente 1 mL) para um novo microtubo de 2 mL e acrescentar o mesmo volume de etanol absoluto gelado

[0016] Misturar invertendo o microtubo levemente, centrifugar a 13.000 rpm por 7 min para obtenção do pellet de DNA, descartar o sobrenadante com cuidado, deixar o pellet de DNA secar em temperatura ambiente por pelo menos 30 min para remover o etanol residual e ressuspender o pellet in 100 µL de Tris-HCL.

[0017] Armazenar o material a -4 ºC para uso imediato ou a -20 ºC por um longo período de tempo.

Exemplos de concretizações da invenção

[0018] Para testar a eficiência do processo, descrito na presente invenção, na extração de DNA em quantidade e qualidade para análises moleculares, foi realizada a extração do DNA de dez espécies de ocorrência natural no bioma Cerrado (12 amostras por espécie), conhecidas por apresentarem elevados teores de metabólitos secundários como visto na TABELA 1 e na FIGURA 1.

[0019] A concentração (ng/µL) e a pureza (A260/A280) do DNA extraído foi medida em espectrofotômetro (L-Quant®, Loccus, Brazil). A qualidade do DNA extraído foi analisada através de eletroforese em gel de agarose 0,8 % a 80 V/cm por 60 min

[0020] Para avaliar se o DNA extraído está adequado para uso em algumas das principais análises moleculares com espécies vegetais atualmente realizadas, foi feita a digestão do DNA extraído por enzima EcoR1 (1,5 U por 250 ng de DNA), a 37 ºC por 3 h, seguida de uma etapa de inativação a 70 ºC por 15 min. O DNA digerido foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8 % a 80 V/cm por 3 h para adequada separação.

[0021] A eficácia do processo também foi averiguada por meio da amplificação com primers da região ITS (18S-25S rDNA). A reação de PCR foi realizada em um volume final de 20 µL, composto por 25 ng de DNA, 100 µM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 µM de cada primer, 1 U de Taq DNA polimerase e 1 X de tampão. As condições de amplificação foram: desnaturação inicial a 94 ºC por 3 min; 35 ciclos de 94 ºC por 30 s, 57 ºC por 60 s e 72 ºC por 60 s; e extensão final a 72 ºC por 7 min. Os produtos da amplificação foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,5 % a 80 V/cm por 3 h.

[0022] Todos os géis foram corados com GelRed e visualizados em um sistema de foto documentação sob luz ultravioleta

[0023] Para todas as espécies testadas, a concentração média de DNA extraído pelo protocolo variou de 156 a 1.166 ng/µL, TABELA 1, quantidade adequada para uso na maioria das aplicações moleculares. A eletroforese do DNA extraído mostrou a presença de grandes quantidades de DNA íntegro, com mais de 10 kb e livre de contaminantes (Figura 1). A razão A260/A280 variou de 1,78 a 1,92, indicando níveis insignificantes de proteínas e fenóis (Tabela 1). A adequada digestão do DNA por enzima EcoR1 mostrou que o DNA obtido estava livre de substâncias interferentes , como visto na FIGURA 2. No mesmo sentido, os resultados da amplificação via PCR também mostraram padrões de bandas nítidas e claras, FIGURA 3.

[0024] A maioria dos processos de extração de DNA já publicados, basicamente, consiste em modificações do protocolo CTAB para espécies específicas, portanto, sempre consomem muito tempo, usam reagentes tóxicos, necessitam de longas etapas de incubação e requerem várias etapas de purificação. Contudo, o processo descrito nesta invenção permitiu a obtenção de DNA puro e íntegro, em boa quantidade, sem os principais problemas inerentes ao protocolo CTAB.

[0025] O processo também já foi utilizado com sucesso (resultados não apresentados) para extração de DNA de outras espécies vegetais, como Coffea arabica, Lactuva sativa e Zea mays, o que mostra que o processo é reproduzível e apresenta potencial para uso em estudos moleculares com diversas espécies de plantas.

Claims (2)

1. PROCESSO para extração de DNA de plantas com altos teores de metabólitos secundários, caracterizado por possuir as seguintes etapas:

   • a. Colocar 100 mg de tecido foliar liofilizado e triturado em um tubo de polipropileno de 15 mL, adicionar o tampão de extração (1,4 M NaCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,0; 20 mM EDTA; 5 % Triton X-100; 5 % SDS) préaquecido a 65 ºC em banho-maria até completar cerca de 5 mL, agitar no vortex por cerca de 30 s e incubar em banho-maria a 65 ºC por 15 min;
   • b. Agitar no vortex rapidamente (menos de 30 s), transferir o sobrenadante para um microtubo de 2 mL, centrifugar a 13.000 rpm por 7 min, transferir o sobrenadante para um novo microtubo de 2 mL e acrescentar o mesmo volume de etanol absoluto gelado;
   • c. Misturar invertendo o microtubo levemente, centrifugar a 13.000 rpm por 7 min para obtenção do pellet de DNA, descartar o sobrenadante com cuidado, deixar o pellet de DNA secar em temperatura ambiente por pelo menos 30 min para remover o etanol residual e ressuspender o pellet em 100 µL de Tris-HCL;
   • d. Armazenar o material a -4 ºC para uso imediato ou a -20 ºC por um longo período de tempo.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por usar em conjunto SDS e Triton X-100 para extração de DNA de plantas com elevados teores de metabólitos secundários, sem a necessidade de várias etapas de limpeza e purificação e sem o uso de reagente tóxicos, como clorofórmio e βmercaptoetanol.

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