BR102019021551A2

BR102019021551A2 - three-dimensional artificial skin, process and use

Info

Publication number: BR102019021551A2
Application number: BR102019021551-8A
Authority: BR
Inventors: Alfredo Miranda De Goés; Joana Lobato Barbosa; Pricila Da Silva Cunha; Dawidson Assis Gomes
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais; Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2021-04-20

Abstract

A presente tecnologia trata de uma pele artificial tridimensional compreendendo uma bicamada formada por uma membrana artificial compreendendo quitosana e gelatina e uma matriz tridimensional porosa composta de quitosana e polihidroxibutirato. Trata também do processo de preparação da pele artificial tridimensional e de seu uso como cobertura e arcabouço para migração celular em processo regenerativo de lesões na pele de humanos e outros mamíferos.

The present technology deals with a three-dimensional artificial skin comprising a bilayer formed by an artificial membrane comprising chitosan and gelatin and a three-dimensional porous matrix composed of chitosan and polyhydroxybutyrate. It also deals with the process of preparing three-dimensional artificial skin and its use as a covering and framework for cell migration in the regenerative process of skin lesions in humans and other mammals.

Description

THREE-DIMENSIONAL ARTIFICIAL SKIN, PROCESS AND USE

[01] A presente tecnologia trata de uma pele artificial tridimensional compreendendo uma bicamada formada por uma membrana artificial compreendendo quitosana e gelatina e uma matriz tridimensional porosa composta de quitosana e polihidroxibutirato. Trata também do processo de preparação da pele artificial tridimensional e de seu uso como cobertura e arcabouço para migração celular em processo regenerativo de lesões na pele de humanos e outros mamíferos.[01] The present technology deals with a three-dimensional artificial skin comprising a bilayer formed by an artificial membrane comprising chitosan and gelatin and a three-dimensional porous matrix composed of chitosan and polyhydroxybutyrate. It also deals with the process of preparing three-dimensional artificial skin and its use as a covering and framework for cell migration in the regenerative process of skin lesions in humans and other mammals.

[02] Muito progresso tem ocorrido na fabricação de biomateriais que mimetizam de maneira simplificada a função da matriz extracelular (MEC) in vivo. Porém, não existe um único material que atenda a todos os requerimentos necessários para mimetizar a MEC, uma vez que cada tipo celular requer um microambiente e que cada um desses ambientes possui uma combinação única de proteínas e uma estrutura tridimensional específica.[02] Much progress has been made in the fabrication of biomaterials that mimic in a simplified way the function of the extracellular matrix (ECM) in vivo. However, there is no single material that meets all the requirements needed to mimic ECM, since each cell type requires a microenvironment and each of these environments has a unique combination of proteins and a specific three-dimensional structure.

[03] Comumente, a estratégia escolhida para a engenharia de tecidos envolve a formação de blendas (união de dois ou mais polímeros naturais), pois visa unir os aspectos vantajosos dos polímeros individuais e minimizar os seus aspectos negativos. Diferentemente dos polímeros sintéticos, polímeros naturais são biologicamente ativos e promovem excelente adesão e crescimento celular e, por terem boa biodegradabilidade, permitem que as células produzam sua própria matriz extracelular e substituam o scaffold à medida que ele sofre degradação.[03] Commonly, the strategy chosen for tissue engineering involves the formation of blends (union of two or more natural polymers), as it aims to unite the advantageous aspects of individual polymers and minimize their negative aspects. Unlike synthetic polymers, natural polymers are biologically active and promote excellent adhesion and cell growth and, as they have good biodegradability, allow cells to produce their own extracellular matrix and replace scaffold as it undergoes degradation.

[04] Os biomateriais e as blendas podem ser produzidos por diferentes técnicas dependendo do tecido que se objetiva recriar, uma vez que devem funcionar como uma matriz extracelular sintética e possuir funções mecânicas e biológicas semelhantes às do tecido que buscam mimetizar. Algumas técnicas utilizadas nessa produção incluem o método de evaporação do solvente para desenvolvimento de membranas e a liofilização, para a criação de matrizes tridimensionais esponjosas, sendo que a última permite ajustes que levam à manipulação do tamanho do poro, o qual deve variar de 100 a 500 µm, o que irá influenciar na adesão celular e permitir a plena difusão de nutrientes e gases provenientes do meio de cultura.[04] Biomaterials and blends can be produced by different techniques depending on the tissue to be recreated, as they must function as a synthetic extracellular matrix and have mechanical and biological functions similar to those of the tissue they seek to mimic. Some techniques used in this production include the solvent evaporation method for membrane development and lyophilization to create spongy three-dimensional matrices, the latter of which allows adjustments that lead to manipulation of the pore size, which should range from 100 to 500 µm, which will influence cell adhesion and allow the full diffusion of nutrients and gases from the culture medium.

[05] Estudos propõem diferentes polímeros como matrizes de sustentação, constituídas por substâncias similares à derme humana, como a utilização de matrizes de colágeno (Pedrosa, T. do N., Catarino, C. M., Pennacchi, P. C., Assis, S. R. de, Gimenes, F., Consolaro, M. E. L., Maria-Engler, S. S. (2017). A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro, 42:31–37).[05] Studies propose different polymers as supporting matrices, consisting of substances similar to the human dermis, such as the use of collagen matrices (Pedrosa, T. do N., Catarino, CM, Pennacchi, PC, Assis, SR de, Gimenes , F., Consolaro, MEL, Maria-Engler, SS (2017). A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro, 42:31–37).

[06] Membranas de quitosana e gelatina (derivada do colágeno) e matrizes de polihidroxialcanoatos (PHAs) têm sido usadas como biomateriais em diferentes aplicabilidades na engenharia de tecidos. A quitosana é um polissacarídeo linear derivado da desacetilação parcial da quitina, obtida a partir do exoesqueleto do camarão ou lagosta, que é um bioproduto da indústria pesqueira, sendo um copolímero natural e sua estrutura química apresenta três grupamentos funcionais, dois grupos hidroxila e um grupamento amino, que permitem a interação com glicosaminoglicanos e outras moléculas carregadas negativamente, além da formação de interações covalentes e iônicas que alteram positivamente as propriedades mecânicas e biológicas da quitosana.[06] Chitosan and gelatin (collagen-derived) membranes and polyhydroxyalkanoate matrices (PHAs) have been used as biomaterials in different applications in tissue engineering. Chitosan is a linear polysaccharide derived from the partial deacetylation of chitin, obtained from the exoskeleton of shrimp or lobster, which is a byproduct of the fishing industry, being a natural copolymer and its chemical structure has three functional groups, two hydroxyl groups and one group amino, which allow interaction with glycosaminoglycans and other negatively charged molecules, in addition to the formation of covalent and ionic interactions that positively alter the mechanical and biological properties of chitosan.

[07] A quitosana é considerada apropriada para aplicações biomédicas e clínicas, pois além de apresentar alta biocompatibilidade, assim como biodegradabilidade por enzimas encontradas no corpo - especialmente lisozimas, ela não é imunogênica e possui propriedades de absorção. Devido às suas boas propriedades químicas, físicas e biológicas, a quitosana é muito utilizada, formando estruturas como hidrogéis, filmes ou membranas, matrizes tridimensionais porosas e estruturas em bicamada para suporte celular. A quitosana apresenta cargas positivas em pH fisiológico, obtidas pelo protonamento do grupo amino, seu biopolímero é bioadesivo (devido à presença de grupos amino livres), apresenta efeitos bacteriostáticos, além de ser capaz de acelerar a cicatrização de lesões e a síntese de colágeno pelos fibroblastos na fase inicial de cicatrização, caracterizando-se como um polímero bioativo.[07] Chitosan is considered suitable for biomedical and clinical applications, as in addition to presenting high biocompatibility, as well as biodegradability by enzymes found in the body - especially lysozymes, it is not immunogenic and has absorption properties. Due to its good chemical, physical and biological properties, chitosan is widely used, forming structures such as hydrogels, films or membranes, three-dimensional porous matrices and bilayer structures for cell support. Chitosan has positive charges at physiological pH, obtained by the protonation of the amino group, its biopolymer is bioadhesive (due to the presence of free amino groups), has bacteriostatic effects, in addition to being able to accelerate wound healing and collagen synthesis by fibroblasts in the initial stage of healing, characterized as a bioactive polymer.

[08] A combinação da quitosana com a gelatina gera blendas por formar complexos polieletrolíticos devido à interação iônica entre as duas moléculas unindo as diferentes cadeias poliméricas. A gelatina é uma proteína solúvel obtida pela hidrólise do colágeno, principal proteína presente na matriz extracelular da pele, ossos, cartilagens e tecidos conectivos. Assim como a quitosana, ela apresenta baixo custo de produção, biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixa imunogenicidade, alta adesão celular (por ser um derivado de componente da MEC) e permite a migração, diferenciação e proliferação celulares. Diferentemente da quitosana, a gelatina contém repetições de motivos Arg-Gly-Asp (RGD), o que melhora suas características de adesão e interação celulares e forma complexos polieletrolíticos.[08] The combination of chitosan with gelatine generates blends by forming polyelectrolyte complexes due to the ionic interaction between the two molecules uniting the different polymer chains. Gelatin is a soluble protein obtained by hydrolysis of collagen, the main protein present in the extracellular matrix of skin, bones, cartilage and connective tissues. Like chitosan, it has low production cost, biocompatibility, biodegradability, low immunogenicity, high cell adhesion (because it is a derivative of a component of ECM) and allows for cell migration, differentiation and proliferation. Unlike chitosan, gelatin contains Arg-Gly-Asp (RGD) motif repeats, which improves its cell adhesion and interaction characteristics and forms polyelectrolyte complexes.

[09] O polihidroxibutirato (PHB) é um poliéster hidrofóbico que vem sendo utilizado na medicina para uso em suturas, pinos ortopédicos, barreiras de adesão, aparatos de reparação/regeneração de tecidos, aparatos de reparo de cartilagem, ataduras para feridas, entre outros. Ele é produzido por microrganismos que são cultivados sob condições de crescimento não balanceadas na fermentação do xarope da cana-deaçúcar, e é encontrado na forma de grânulos intracelulares. A adição de quitosana ao PHB na formação de blendas pode melhorar as propriedades físico-químicas desse biomaterial como a fragilidade e a hidrofobicidade, obtendo matrizes estáveis em suas propriedades mecânicas e rigidez.[09] Polyhydroxybutyrate (PHB) is a hydrophobic polyester that has been used in medicine for use in sutures, orthopedic pins, adhesion barriers, tissue repair/regeneration apparatus, cartilage repair apparatus, wound dressings, among others . It is produced by microorganisms that are grown under unbalanced growth conditions in the fermentation of sugarcane syrup, and is found in the form of intracellular granules. The addition of chitosan to PHB in the formation of blends can improve the physicochemical properties of this biomaterial, such as fragility and hydrophobicity, obtaining stable matrices in their mechanical properties and rigidity.

[010] Muitos grupos de pesquisa já desenvolveram diferentes tipos de substitutos de pele com o intuito de entender melhor a biologia da pele e do fechamento de feridas, assim como estudar modelos de doenças cutâneas, pois matrizes dermais, ou scaffolds, propiciam um ambiente adequado para a adesão celular, proliferação e regeneração. No entanto, apesar de apresentar essas vantagens, o uso de scaffolds no fechamento de feridas ainda possui limitações, como imunogenicidade e taxa de degradação inadequada.[010] Many research groups have already developed different types of skin substitutes in order to better understand the biology of skin and wound closure, as well as to study models of skin diseases, as dermal matrices, or scaffolds, provide a suitable environment for cell adhesion, proliferation and regeneration. However, despite these advantages, the use of scaffolds to close wounds still has limitations, such as immunogenicity and inadequate degradation rate.

[011] A utilização de scaffolds em bicamada se apresenta como um bom dressing (curativo e arcabouço para migração celular), pois possui uma camada superior fina que promove fechamento da área impedindo a perda de fluidos e o contato com agentes infecciosos. Já o scaffold tridimensional ocupa a área da derme lesada mantendo a umidade local e proporcionando um arcabouço para as interações celulares necessárias para o processo de fechamento da ferida, favorecendo, assim, o processo de regeneração.[011] The use of scaffolds in bilayer is presented as a good dressing (dressing and framework for cell migration), as it has a thin upper layer that promotes closure of the area preventing the loss of fluid and contact with infectious agents. The three-dimensional scaffold, on the other hand, occupies the injured dermis area, maintaining local moisture and providing a framework for the cell interactions necessary for the wound closure process, thus favoring the regeneration process.

[012] Dos substitutos de pele para o tratamento de feridas que são formados por uma bicamada composta de queratinócitos e fibroblastos, os mais utilizados são Apligraf®, MyDermTM e OrCelTM, que utilizam uma matriz ou de colágeno ou de fibrina e seda para a aplicação das células. Existem também os que não são colonizados por células, como o Aloderm® e a IntegraTM, compostos por pele de cadáver liofilizada e uma combinação de polímeros e elementos da MEC, respectivamente.[012] Of the skin substitutes for the treatment of wounds that are formed by a bilayer composed of keratinocytes and fibroblasts, the most used are Apligraf®, MyDermTM and OrCelTM, which use a matrix of either collagen or fibrin and silk for the application of the cells. There are also those that are not colonized by cells, such as Aloderm® and IntegraTM, composed of lyophilized cadaver skin and a combination of polymers and ECM elements, respectively.

[013] Apesar dos substitutos de pele relacionados acima cobrirem uma grande área da ferida, eles ainda apresentam algumas desvantagens, como epitelização lenta, demora na cicatrização, contração da área da ferida, excesso de cicatrização e vascularização lenta. Sendo assim, ainda há a necessidade de aproximar os substitutos utilizados da pele humana in vivo.[013] Although the skin substitutes listed above cover a large area of the wound, they still have some disadvantages, such as slow epithelialization, delayed healing, wound area contraction, excess healing, and slow vascularization. Therefore, there is still a need to bring the substitutes used closer to human skin in vivo.

[014] O documento de patente EP3326660 intitulado “A ready to use biodegradable and biocompatible artificial skin substitute and a method of preparation thereof”, cuja data de prioridade é 28 de novembro de 2016, trata de um sistema de cultura celular para construção de um scaffold a ser utilizado para o tratamento de feridas. No referido documento, são utilizados apenas quitosana e gelatina para a criação de um filme. Além disso, no supracitado documento a promoção de regeneração de lesões é obtida em scaffolds colonizados por células.[014] Patent document EP3326660 entitled "A ready to use biodegradable and biocompatible artificial skin substitute and a method of preparation thereof", whose priority date is November 28, 2016, deals with a cell culture system for building a scaffold to be used for the treatment of wounds. In that document, only chitosan and gelatin are used to create a film. Furthermore, in the aforementioned document, the promotion of lesion regeneration is obtained in scaffolds colonized by cells.

[015] O documento de patente US2012010018, intitulado “Regeneration of tissue without cell transplantation”, cuja data de prioridade é 13 de abril de 2009, trata de uma matriz tridimensional para regeneração tecidual. A matriz porosa no citado documento foi desenvolvida a partir apenas de quitosana e gelatina. O material do pedido US2012010018 foi utilizado para regeneração em defeitos ósseos/cartilaginosos, com uso de fatores de crescimento para a promoção de regeneração.[015] The patent document US2012010018, entitled "Regeneration of tissue without cell transplantation", whose priority date is April 13, 2009, deals with a three-dimensional matrix for tissue regeneration. The porous matrix in the aforementioned document was developed from chitosan and gelatin alone. The material from order US2012010018 was used for regeneration in bone/cartilaginous defects, using growth factors to promote regeneration.

[016] O documento de patente CN1212162, intitulado “Preparation process for artificial skin”, cuja data de prioridade é 22 de agosto de 2003, trata de um método para preparação de uma pele artificial para tratamento de feridas. O scaffold foi obtido a partir da mistura principal de quitosana, quitina e diferentes materiais, incluindo ácido hialurônico e poli-L-lisina. Além disso, a tecnologia de CN 1212162, requer adição de outras substância além das utilizadas na sua fabricação para obter a regeneração tecidual.[016] The patent document CN1212162, entitled "Preparation process for artificial skin", whose priority date is August 22, 2003, deals with a method for preparing an artificial skin for the treatment of wounds. The scaffold was obtained from the main mixture of chitosan, chitin and different materials, including hyaluronic acid and poly-L-lysine. In addition, the CN 1212162 technology requires the addition of substances other than those used in its manufacture to obtain tissue regeneration.

[017] A presente tecnologia trata de uma membrana artificial compreendendo quitosana e gelatina; e de uma pele artificial tridimensional compreendendo uma bicamada formada pela membrana artificial e uma matriz tridimensional porosa composta de quitosana e polihidroxibutirato. Trata também do uso da membrana artificial e da pele artificial tridimensional como cobertura e arcabouço para migração celular em processo regenerativo de lesões na pele de humanos e outros mamíferos. Visto que os resultados de regeneração encontrados para a pele artificial (bicamada) e a membrana foram semelhantes, entre as vantagens da tecnologia pode-se apontar a adaptação do biomaterial ao tipo de ferida e a não necessidade de trocas de curativos. Ambos os materiais produzidos são biodegradáveis e absorvíveis na área da lesão, evitando assim a necessidade de troca de curativos, o que pode levar à remoção da camada epitelial recém-formada e retardamento do processo de cicatrização. Em feridas profundas ou crônicas em que a manutenção da umidade é um fator importante o ideal seria o uso da bicamada, e em feridas superficiais, em que a proteção e isolamento da área é o mais importante, o ideal seria a utilização da membrana. Os materiais aqui desenvolvidos apresentaram boa adesão à área da ferida. Sendo assim, a tecnologia desenvolvida também pode ser utilizada como curativo de emergência estimulando a coagulação e a perda excessiva de sangue em caso de acidentes severos, principalmente se considerarmos a bicamada, que tem alta capacidade de absorção de líquidos.[017] The present technology deals with an artificial membrane comprising chitosan and gelatin; and a three-dimensional artificial skin comprising a bilayer formed by the artificial membrane and a three-dimensional porous matrix composed of chitosan and polyhydroxybutyrate. It also deals with the use of artificial membrane and three-dimensional artificial skin as a covering and framework for cell migration in the regenerative process of skin lesions in humans and other mammals. Since the results of regeneration found for the artificial skin (bilayer) and the membrane were similar, among the advantages of the technology, one can point out the adaptation of the biomaterial to the type of wound and the non-necessity of dressing changes. Both materials produced are biodegradable and absorbable in the wound area, thus avoiding the need to change dressings, which can lead to the removal of the newly formed epithelial layer and delay the healing process. In deep or chronic wounds where the maintenance of moisture is an important factor, the ideal would be the use of a bilayer, and in superficial wounds, where the protection and isolation of the area is the most important, the ideal would be the use of the membrane. The materials developed here showed good adhesion to the wound area. Thus, the technology developed can also be used as an emergency dressing, stimulating clotting and excessive blood loss in case of severe accidents, especially if we consider the bilayer, which has a high capacity for absorbing liquids.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[018] A Figura 1 apresenta a estrutura da membrana avaliada por microscopia eletrônica de varredura e por microscopia de força atômica indicando que a superfície da mesma é rugosa.[018] Figure 1 shows the structure of the membrane evaluated by scanning electron microscopy and atomic force microscopy indicating that the surface of the same is rough.

[019] A Figura 2 apresenta a caracterização da macro e microarquitetura da bicamada. A) Macroarquitetura da bicamada evidenciando a presença da membrana sobre a matriz; B) Porosidade da bicamada; C) MEV demonstrando a microarquitetura da bicamada com a membrana na porção superior e a matriz na inferior e D) MicroCT da bicamada mostrando tridimensionalmente o mesmo resultado visto em C.[019] Figure 2 shows the characterization of the macro and microarchitecture of the bilayer. A) Macroarchitecture of the bilayer showing the presence of the membrane on the matrix; B) Porosity of the bilayer; C) SEM demonstrating the microarchitecture of the bilayer with the membrane on the top and the matrix on the bottom and D) MicroCT of the bilayer showing in three dimensions the same result seen in C.

[020] A Figura 3 demonstra a capacidade de absorção de água, degradação e ensaios mecânicos da bicamada em relação aos seus componentes separados. A) Representação gráfica da capacidade de absorção de água em relação ao tempo da bicamada e seus componentes. **p˂0.001; B) Avaliação da porcentagem de massa perdida pela bicamada ao longo de 8 semanas de incubação com PBS 0,01 M a 37 °C em relação a seus componentes. ****p˂0.0001 Two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (n=2).[020] Figure 3 demonstrates the capacity of water absorption, degradation and mechanical tests of the bilayer in relation to its separate components. A) Graphic representation of the water absorption capacity in relation to the time of the bilayer and its components. **p˂0.001; B) Evaluation of the percentage of mass lost by the bilayer over 8 weeks of incubation with PBS 0.01 M at 37 °C in relation to its components. ****p˂0.0001 Two-way ANOVA with Bonferroni post-test (n=2).

[021] A Figura 4 representa a dinâmica macroscópica do fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar. A) Macroscopia do fechamento da ferida nos diferentes grupos e tempos experimentais; B) Análise quantitativa do fechamento de ferida. Two-way ANOVA com pósteste de Bonferroni (n=3). Imagem e experimento representativo. Grupo Controle, sem colocação de material; grupo membrana, membrana 2:1- 37Água sobre a ferida; grupo bicamada, bicamada (membrana 2:1- 37Água e MGlut) sobre a ferida.[021] Figure 4 represents the macroscopic dynamics of excisional wound closure on the back of Wistar rats. A) Macroscopy of wound closure in different groups and experimental times; B) Quantitative analysis of wound closure. Two-way ANOVA with Bonferroni posttest (n=3). Image and representative experiment. Control Group, without placement of material; membrane group, membrane 2:1-37Water on the wound; bilayer group, bilayer (membrane 2:1-37Water and MGlut) over the wound.

[022] A Figura 5 representa a análise do fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar após 7 dias. A) Grupo Controle corado em HE mostrando espessamento da derme e infiltrado inflamatório na região da lesão, o inserto mostra o exudato, vasos congestos e o acúmulo fibrinoplaqueário (seta grossa) sobre a área da ferida; C) Grupo membrana corado em HE apresentando as bordas delimitadas da ferida e no inserto é possível ver o exudato e os vasos congestos; E) Grupo bicamada corado em HE apresentando as bordas da ferida e intenso infiltrado inflamatório com poucos vasos congestos evidenciados no inserto. B, D e F representam coloração de Gomori para as mesmas áreas que A, C e E, respectivamente. (n=6) Imagens representativas. Epi, epiderme; De, derme; Inf, infiltrado inflamatório; linha tracejada delimita a área da ferida; cabeça de seta indica vasos congestos; seta fina indica exudato.[022] Figure 5 represents the analysis of excisional wound closure on the back of Wistar rats after 7 days. A) Control group stained in HE showing dermis thickening and inflammatory infiltrate in the lesion region, the insert shows the exudate, congested vessels and fibrinoplaque accumulation (thick arrow) over the wound area; C) Membrane group stained in HE showing the delimited edges of the wound and on the insert it is possible to see the exudate and congested vessels; E) HE-stained bilayer group showing the edges of the wound and intense inflammatory infiltrate with few congested vessels evidenced in the insert. B, D and F represent Gomori staining for the same areas as A, C and E, respectively. (n=6) Representative images. Epi, epidermis; From, dermis; Inf, inflammatory infiltrate; dashed line delimits the wound area; arrowhead indicates congested vessels; thin arrow indicates exudate.

[023] A Figura 6 representa a análise do fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar após 14 dias. A) Grupo Controle corado em HE mostrando infiltrado inflamatório na região da lesão, ausência de epiderme, acúmulo fibrino-plaqueário (seta grossa) sobre a área da ferida e o inserto mostra a persistência do infiltrado inflamatório; B) Coloracão de Gomori da mesma área que A, demonstrando a deposição de fibras colágenas desorganizadas e o inserto mostra evidencia os vasos congestos; C) Grupo membrana corado em HE apresentando reepitelização e diminuição do infiltrado inflamatório que é melhor observado no inserto; D) Coloracão de Gomori da mesma área que B, demonstrando a deposição de fibras colágenas desorganizadas; E) Grupo bicamada corado em HE apresentando reepitelilzação e diminuição substancial do infiltrado inflamatório evidenciado no inserto; F) Coloracão de Gomori da mesma área que E, demonstrando a deposição de fibras colágenas desorganizadas. (n=6) Imagens representativas. Epi, epiderme; De, derme; Gl, glândulas; Fol, folículos pilosos; Inf, infiltrado inflamatório; linha tracejada delimita a área da ferida; cabeça de seta indica vasos congestos; seta fina indica exudato.[023] Figure 6 represents the analysis of excisional wound closure on the back of Wistar rats after 14 days. A) Control Group stained in HE showing inflammatory infiltrate in the lesion region, absence of epidermis, fibrin-platelet accumulation (thick arrow) over the wound area and the insert shows persistence of the inflammatory infiltrate; B) Gomori stain of the same area as A, demonstrating the deposition of disorganized collagen fibers and the insert shows evidence of congested vessels; C) HE-stained membrane group showing re-epithelialization and reduced inflammatory infiltrate, which is best observed in the insert; D) Gomori staining of the same area as B, demonstrating the deposition of disorganized collagen fibers; E) HE-stained bilayer group showing re-epithelialization and substantial reduction of the inflammatory infiltrate evidenced in the insert; F) Gomori staining of the same area as E, demonstrating the deposition of disorganized collagen fibers. (n=6) Representative images. Epi, epidermis; From, dermis; Gl, glands; Fol, hair follicles; Inf, inflammatory infiltrate; dashed line delimits the wound area; arrowhead indicates congested vessels; thin arrow indicates exudate.

[024] A Figura 7 representa a análise do fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar após 21 dias. A) Grupo controle corado em HE mostrando reepitelização; C) Grupo membrana corado em HE apresentando anexos na periferia da lesão; E) Grupo bicamada corado em HE apresentando diminuição da área da ferida e folículos pilosos na região de remodelamento do colágeno; B, D e F representam coloração de Gomori para as mesmas áreas que A, C e E, respectivamente, demonstrando a deposição de fibras colágenas desorganizadas evidenciada no inserto. (n=6) Imagens representativas. Epi, epiderme; De, derme; Gl, glândulas; Fol, folículos pilosos; linha tracejada delimita a área da ferida.[024] Figure 7 represents the analysis of excisional wound closure on the back of Wistar rats after 21 days. A) HE stained control group showing re-epithelialization; C) HE-stained membrane group showing appendages in the periphery of the lesion; E) HE-stained bilayer group showing reduced wound area and hair follicles in the collagen remodeling region; B, D and F represent Gomori staining for the same areas as A, C and E, respectively, demonstrating the deposition of disorganized collagen fibers evidenced in the insert. (n=6) Representative images. Epi, epidermis; From, dermis; Gl, glands; Fol, hair follicles; dashed line delimits the wound area.

[025] A Figura 8 representa a análise do fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar após 28 dias. A) Grupo Controle corado em HE mostrando reepitelização e diminuição da área da ferida; B) Coloracão de Gomori da mesma área que A, demonstrando reorganização periférica das fibras colágenas. O inserto evidencia o inicio de reorganização na área central da lesão; C) Grupo membrana corado em HE apresentando reepitelização e diminuição da área da ferida com a presença de anexos na derme profunda; D) Coloração de Gomori da mesma área que B, demonstrando reorganização periférica das fibras colágenas. O inserto evidencia o inicio de reorganização na área central da lesão que parece ser melhor que nos outros grupos; E) Grupo bicamada corado em HE apresentando reepitelização e diminuição da área da ferida com a presença de anexos na derme profunda; F) Coloração de Gomori da mesma área que E, demonstrando reorganização periférica das fibras colágenas. O inserto evidencia o inicio de reorganização na área central da lesão. (n=6) Imagens representativas. Epi, epiderme; De, derme; Gl, glândulas; Fol, folículos pilosos; linha tracejada delimita a área da ferida.[025] Figure 8 represents the analysis of excisional wound closure on the back of Wistar rats after 28 days. A) Control group stained in HE showing re-epithelialization and reduced wound area; B) Gomori staining of the same area as A, demonstrating peripheral reorganization of collagen fibers. The insert shows the beginning of reorganization in the central area of the lesion; C) HE-stained membrane group showing re-epithelialization and reduced wound area with the presence of attachments in the deep dermis; D) Gomori staining of the same area as B, demonstrating peripheral reorganization of collagen fibers. The insert shows the beginning of reorganization in the central area of the lesion, which seems to be better than in the other groups; E) HE-stained bilayer group showing re-epithelialization and reduced wound area with the presence of attachments in the deep dermis; F) Gomori staining of the same area as E, demonstrating peripheral reorganization of collagen fibers. The insert shows the beginning of reorganization in the central area of the lesion. (n=6) Representative images. Epi, epidermis; From, dermis; Gl, glands; Fol, hair follicles; dashed line delimits the wound area.

[026] A Figura 9 demonstra a análise da vascularização da região da ferida com (A) 7, (B) 14, (C) 21 e (D) 28 dias. Contagem do número de vasos por campo entre os grupos. Two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (n=20) *p˂0,01, **p˂0,05 e ****p˂0,0001.[026] Figure 9 demonstrates the analysis of vascularization of the wound region with (A) 7, (B) 14, (C) 21 and (D) 28 days. Counting the number of pots per field between groups. Two-way ANOVA with Bonferroni post-test (n=20) *p˂0.01, **p˂0.05 and ****p˂0.0001.

[027] A Figura 10 apresenta a análise da expressão gênica relativa de Vegfa no fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar. Representação gráfica da quantificação relativa da expressão do transcrito para Vegfa normalizado em relação ao gene constitutivo B2m. One-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (n=3) *p˂0,05.[027] Figure 10 shows the analysis of the relative gene expression of Vegfa in excisional wound closure on the back of Wistar rats. Graphic representation of the relative quantification of the transcript expression for Vegfa normalized in relation to the constitutive gene B2m. One-way ANOVA with Bonferroni post-test (n=3) *p˂0.05.

[028] A Figura 11 apresenta a análise da expressão gênica relativa de Tgfb1 e Tgfb3 no fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar. A) Representação gráfica da quantificação relativa da expressão do transcrito para Tgfb1 normalizado em relação ao gene constitutivo B2m; B) Representação gráfica da quantificação relativa da expressão do transcrito para Tgfb3 normalizado em relação ao gene constitutivo B2m. One-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (n=3) *p˂0,05.[028] Figure 11 shows the analysis of the relative gene expression of Tgfb1 and Tgfb3 in excisional wound closure on the back of Wistar rats. A) Graphic representation of the relative quantification of the transcript expression for Tgfb1 normalized in relation to the constitutive gene B2m; B) Graphic representation of the relative quantification of transcript expression for Tgfb3 normalized in relation to the constitutive gene B2m. One-way ANOVA with Bonferroni post-test (n=3) *p˂0.05.

[029] A Figura 12 demonstra a análise da expressão gênica relativa de Fgf7 no fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar. Representação gráfica da quantificação relativa da expressão do transcrito para Fgf7 normalizado em relação ao gene constitutivo B2m. One-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (n=3) *p˂0,05.[029] Figure 12 demonstrates the analysis of the relative gene expression of Fgf7 in excisional wound closure on the back of Wistar rats. Graphic representation of the relative quantification of the expression of the transcript for Fgf7 normalized in relation to the constitutive gene B2m. One-way ANOVA with Bonferroni post-test (n=3) *p˂0.05.

[030] A Figura 13 representa a análise da expressão gênica relativa de Col1a1 e Col3a1 no fechamento de ferida excisional no dorso de ratos Wistar. A) Representação gráfica da quantificação relativa da expressão do transcrito para Col1a1 normalizado em relação ao gene constitutivo B2m; B) Representação gráfica da quantificação relativa da expressão do transcrito para Col3a1 normalizado em relação ao gene constitutivo B2m. One-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (n=3) *p˂0,05.[030] Figure 13 represents the analysis of the relative gene expression of Col1a1 and Col3a1 in excisional wound closure on the back of Wistar rats. A) Graphic representation of the relative quantification of the expression of the transcript for Col1a1 normalized in relation to the constitutive gene B2m; B) Graphic representation of the relative quantification of the expression of the transcript for Col3a1 normalized in relation to the constitutive gene B2m. One-way ANOVA with Bonferroni post-test (n=3) *p˂0.05.

DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNOLOGY

[031] A presente tecnologia trata de uma pele artificial tridimensional compreendendo uma bicamada formada por uma membrana artificial compreendendo quitosana e gelatina e uma matriz tridimensional porosa composta de quitosana e polihidroxibutirato. Trata também do processo de preparação da pele artificial tridimensional e de seu uso como cobertura e arcabouço para migração celular em processo regenerativo de lesões na pele de humanos e outros mamíferos.[031] The present technology deals with a three-dimensional artificial skin comprising a bilayer formed by an artificial membrane comprising chitosan and gelatin and a three-dimensional porous matrix composed of chitosan and polyhydroxybutyrate. It also deals with the process of preparing three-dimensional artificial skin and its use as a covering and framework for cell migration in the regenerative process of skin lesions in humans and other mammals.

[032] A pele artificial tridimensional compreende uma bicamada composta da membrana de quitosana e gelatina na faixa de proporções em massa entre 1:1 e 3:1, preferencialmente 2:1, em ácido acético 0,05 a 1,25% (v/v), preferencialmente 1% (v/v), liofilizada sobre uma matriz tridimensional porosa contendo quitosana e polihidroxibutirato na faixa de proporções em massa entre 1:1 e 3:1, preferencialmente 1:1, na concentração final variando entre 1,5 a 2,5% (m/v), preferencialmente 2,5% (m/v), reticulada com glutaraldeído 0,002 a 0,005% (v/v), preferencialmente 0,005% (v/v).[032] The three-dimensional artificial skin comprises a bilayer composed of the membrane of chitosan and gelatin in the range of mass ratios between 1:1 and 3:1, preferably 2:1, in acetic acid 0.05 to 1.25% (v /v), preferably 1% (v/v), lyophilized on a three-dimensional porous matrix containing chitosan and polyhydroxybutyrate in the range of mass ratios between 1:1 and 3:1, preferably 1:1, in the final concentration ranging between 1, 5 to 2.5% (m/v), preferably 2.5% (m/v), crosslinked with glutaraldehyde 0.002 to 0.005% (v/v), preferably 0.005% (v/v).

[033] A pele artificial tridimensional apresenta ampla dispersão de poros, com diâmetro médio de 200 a 400μm.[033] The three-dimensional artificial skin has a wide dispersion of pores, with an average diameter of 200 to 400μm.

[034] O processo para obtenção da pele artificial tridimensional compreende as seguintes etapas:

a) Preparar uma matriz tridimensional porosa a partir da mistura de quitosana e polihidroxibutirato em proporções iguais, na concentração final variando entre 1,5 a 2,5% (m/v), preferencialmente 2,5% (m/v), preferencialmente em ácido acético 0,05 a 1,25% (v/v), preferencialmente 1% (v/v);
b) Congelar a matriz obtida em “a” a -10 até -20°C, preferencialmente -20°C, por até 24 horas;
c) Liofilizar a matriz obtida em “b”;
d) Tratar a matriz obtida na etapa “c” com glutaraldeído 0,002 a 0,005% (v/v), preferencialmente 0,005% (v/v);
e) Posicionar uma membrana artificial de quitosana e gelatina sobre a matriz obtida em “d” e congelar a -10 até -20°C, preferencialmente -20°C, por até 24 horas;
f) Liofilizar o produto obtido em “e” para obtenção da pele artificial tridimensional.

[034] The process for obtaining three-dimensional artificial skin comprises the following steps:

a) Prepare a three-dimensional porous matrix from the mixture of chitosan and polyhydroxybutyrate in equal proportions, in the final concentration ranging from 1.5 to 2.5% (m/v), preferably 2.5% (m/v), preferably in acetic acid 0.05 to 1.25% (v/v), preferably 1% (v/v);
b) Freeze the matrix obtained in “a” at -10 to -20°C, preferably -20°C, for up to 24 hours;
c) Freeze-dry the matrix obtained in “b”;
d) Treat the matrix obtained in step “c” with glutaraldehyde 0.002 to 0.005% (v/v), preferably 0.005% (v/v);
e) Place an artificial membrane of chitosan and gelatin on the matrix obtained in “d” and freeze at -10 to -20°C, preferably -20°C, for up to 24 hours;
f) Freeze-dry the product obtained in “e” to obtain three-dimensional artificial skin.

[035] A membrana artificial de quitosana e gelatina da etapa “e” pode ser obtida através das seguintes etapas:

a) Misturar quitosana e gelatina na faixa de proporções em massa entre 1:1 e 3:1, preferencialmente 2:1, em ácido acético 0,05 a 1,25% (v/v),preferencialmente 1% (v/v), formando uma solução final de 1,5 % (m/v), preferencialmente em solução de ácido acético 0,05 a 1,25% (v/v), preferencialmente 1% (v/v), neutralizada para pH entre 6 e 7,2, preferencialmente 6;
b) Secar a mistura obtida em “a”;
c) Lavar a membrana com solução aquosa tamponada e tratar com solução de glicerol em álcool absoluto, na faixa de concentração entre 6 e 8% v/v;
d) Lavar com solução aquosa tamponada e secar em temperatura ambiente;
e) Tratar com água deionizada;
f) Lavar com solução aquosa tamponada e secar à temperatura ambiente.

[035] The artificial membrane of chitosan and gelatin of step "e" can be obtained through the following steps:

a) Mix chitosan and gelatin in the mass ratio range between 1:1 and 3:1, preferably 2:1, in acetic acid 0.05 to 1.25% (v/v), preferably 1% (v/v ), forming a final solution of 1.5% (m/v), preferably in acetic acid solution from 0.05 to 1.25% (v/v), preferably 1% (v/v), neutralized to pH between 6 and 7.2, preferably 6;
b) Dry the mixture obtained in “a”;
c) Wash the membrane with a buffered aqueous solution and treat it with a solution of glycerol in absolute alcohol, in the concentration range between 6 and 8% v/v;
d) Wash with a buffered aqueous solution and dry at room temperature;
e) Treat with deionized water;
f) Wash with buffered aqueous solution and dry at room temperature.

[036] A pele proposta na presente tecnologia pode ser utilizada como cobertura e arcabouço para migração celular em processo regenerativo de lesões na pele de humanos ou outros mamíferos.[036] The skin proposed in this technology can be used as a cover and framework for cell migration in the regenerative process of skin lesions in humans or other mammals.

[037] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida através dos seguintes exemplos, não limitantes da tecnologia.[037] The present technology can be better understood through the following examples, not limiting the technology.

EXAMPLE 1. PRODUCTION OF MEMBRANE AND BILAYER

[038] A membrana foi preparada a partir da mistura de quitosana (Sigma, 85 % desacetilada, derivada de caranguejo) e gelatina (Sigma, Tipo B, da pele de bovino) na proporção 2:1. Inicialmente foram feitas duas soluções separadas, a quitosana foi pesada e dissolvida em ácido acético 1 % (v/v), formando uma solução final de 1,5 % (m/v), e deixada em agitação por 24 horas. Posteriormente, a gelatina foi pesada e dissolvida em ácido acético 1% sobre agitação e aquecimento, formando uma solução final de 1,5 % (m/v). Uma vez dissolvidas, essas soluções foram misturadas sobre agitação na proporção de 2:1, quitosana:gelatina, e a solução foi neutralizada com NaOH até atingir o pH=6.[038] The membrane was prepared from a mixture of chitosan (Sigma, 85% deacetylated, derived from crab) and gelatin (Sigma, Type B, from bovine skin) in a 2:1 ratio. Initially, two separate solutions were made, the chitosan was weighed and dissolved in acetic acid 1% (v/v), forming a final solution of 1.5% (m/v), and left under stirring for 24 hours. Afterwards, the gelatin was weighed and dissolved in 1% acetic acid under stirring and heating, forming a final solution of 1.5% (m/v). Once dissolved, these solutions were mixed under agitation in a 2:1 ratio, chitosan:gelatin, and the solution was neutralized with NaOH until reaching pH=6.

[039] Em seguida foram pipetados 10 mL dessas soluções em placas de petri de plástico com 13 cm de diâmetro (J. Prolab – PR/Brasil) e deixadas para secar em estufa 37 ºC por 24 horas. Após esse período as membranas foram lavadas com Tampão fosfato-salino (PBS) e tratadas com uma solução de álcool absoluto e glicerol por 2 horas com constante agitação, seguido de lavagem com PBS e secagem em temperatura ambiente. Uma vez secas, as membranas foram tratadas com água deionizada, por 3 horas, sempre em constante agitação, seguido de lavagem com PBS e secagem em temperatura ambiente.[039] Then, 10 mL of these solutions were pipetted into plastic petri dishes with a diameter of 13 cm (J. Prolab – PR/Brazil) and left to dry in an oven at 37 ºC for 24 hours. After this period, the membranes were washed with Phosphate-Saline Buffer (PBS) and treated with a solution of absolute alcohol and glycerol for 2 hours with constant agitation, followed by washing with PBS and drying at room temperature. Once dry, the membranes were treated with deionized water for 3 hours, always under constant agitation, followed by washing with PBS and drying at room temperature.

[040] A bicamada foi preparada pela liofilização conjunta da membrana, descrita acima, e de uma matriz tridimensional porosa. A matriz porosa foi produzida a partir da mistura de dois polímeros, quitosana e PHB (PHB Industrial S.A. - Usina da Pedra, Serrana-SP/Brasil), em proporções iguais formando uma solução final a 2,5% (m/v). Inicialmente a quitosana foi pesada e dissolvida em ácido acético 1 %, e deixada em agitação por 24 horas. Após esse período o PHB foi pesado e dissolvido em clorofórmio P.A. (Neon – SP/Brasil) por 20 minutos sob agitação e aquecimento a 60 ºC. Foram utilizados 10 mL de cada uma das soluções que foram misturadas e agitadas, e então foi acrescido 20 mL de ácido acético 1 %, ainda sob agitação. Essa solução final de 40 mL foi vertida sobre uma placa de petri de plástico coberta com papel alumínio e levada imediatamente para congelamento a -20 ºC. Após 24 horas as placas foram liofilizadas overnight e então tratadas por 3 horas com glutaraldeído 0,005 %.[040] The bilayer was prepared by the joint lyophilization of the membrane, described above, and a three-dimensional porous matrix. The porous matrix was produced from a mixture of two polymers, chitosan and PHB (PHB Industrial S.A. - Usina da Pedra, Serrana-SP/Brazil), in equal proportions, forming a final solution at 2.5% (m/v). Initially, the chitosan was weighed and dissolved in 1% acetic acid, and left to stir for 24 hours. After this period, the PHB was weighed and dissolved in P.A. chloroform (Neon – SP/Brazil) for 20 minutes under stirring and heating at 60 ºC. 10 ml of each of the solutions were used, which were mixed and stirred, and then 20 ml of 1% acetic acid was added, still under stirring. This final 40 mL solution was poured onto a plastic petri dish covered with aluminum foil and immediately taken to freezing at -20°C. After 24 hours the plates were lyophilized overnight and then treated for 3 hours with 0.005% glutaraldehyde.

[041] Posteriormente ao tratamento com glutaraldeído a membrana que já estava seca foi posicionada sobre a matriz ainda aquosa e as estruturas foram congeladas por 24 horas seguido de nova liofilização overnight. Após esse período as estruturas foram denominadas bicamadas e foram cortadas para utilização nos experimentos subsequentes.[041] After treatment with glutaraldehyde, the membrane that was already dry was positioned on the still aqueous matrix and the structures were frozen for 24 hours followed by another overnight lyophilization. After this period, the structures were called bilayers and were cut for use in subsequent experiments.

[042] A membrana apresentou rugosidade tanto na análise por microscopia eletrônica de varredura, quanto por microscopia de força atômica, característica vantajosa para a adesão celular (Figura 1).[042] The membrane showed roughness both in the analysis by scanning electron microscopy, as by atomic force microscopy, an advantageous characteristic for cell adhesion (Figure 1).

[043] A porção formada pela membrana apresentou opacidade devido ao processo de liofilização (Figura 2 A) e a porção formada pela matriz possuia aspecto esponjoso (Figura 2 C e D) e coloração alaranjada (Figura 2 A). Em vista lateral, é possível observar que a bicamada é composta por duas regiões distintas, uma membrana lisa e uma região porosa, o que é confirmado pela imagem obtida no MicroCT (Figura 2 D). Observa-se também a formação da bicamada na Figura 2 D pela continuidade da membrana com a matriz. A Figura 2 B demonstra a porosidade da bicamada que apresentou maior dispersão de poros quando comparada com a MGlut sozinha, com maior concentração de poros com diâmetro entre 200 e 400 µm.[043] The portion formed by the membrane showed opacity due to the lyophilization process (Figure 2 A) and the portion formed by the matrix had a spongy appearance (Figure 2 C and D) and orange color (Figure 2 A). In a lateral view, it is possible to observe that the bilayer is composed of two distinct regions, a smooth membrane and a porous region, which is confirmed by the image obtained in MicroCT (Figure 2D). It is also observed the formation of the bilayer in Figure 2D by the continuity of the membrane with the matrix. Figure 2B demonstrates the porosity of the bilayer, which showed greater pore dispersion when compared to MGlut alone, with a higher concentration of pores with a diameter between 200 and 400 µm.

EXAMPLE 2. MEMBRANE AND BASELAYER CHARACTERIZATION

[044] A capacidade de absorção de água foi realizada pelo método gravimétrico com a utilização de balança de precisão. As bicamadas (n=6) foram pesadas e em seguida imersas em PBS 0,01 M, pH 7,4, a 37 °C por 15 minutos, 30 minutos, 1, 2, 3, 6, 12, 24 e 48 horas. Após cada tempo, as amostras foram removidas da solução, secas superficialmente com papel filtro e pesadas. A absorção de água pelos materiais foi determinada utilizando a equação: água absorvida (%) = [(massa final – massa inicial)/massa inicial] ×100. Em relação à capacidade de absorção de água, observou-se que a bicamada absorveu água correspondente a mais de 1000 % do seu peso já nos primeiros 15 minutos de experimento e assim permaneceu durante toda a análise. Também é possível concluir que ela apresentou uma capacidade de absorção intermediária em relação aos seus constituintes separados (Figura 3 A). Na Figura 3 B observa-se que ao longo das oito semanas de análise a bicamada teve uma degradação expressiva e intermediária em relação a seus constituintes analisados separadamente. Com uma semana a MGlut apresentou menor degradação que os outros materiais e com quatro semanas foi observada diferença de degradação da bicamada em relação aos outros materiais, que permaneceu com oito semanas.[044] The water absorption capacity was performed by the gravimetric method using a precision scale. The bilayers (n=6) were weighed and then immersed in 0.01 M PBS, pH 7.4, at 37 °C for 15 minutes, 30 minutes, 1, 2, 3, 6, 12, 24 and 48 hours . After each time, the samples were removed from the solution, superficially dried with filter paper and weighed. The water absorption by the materials was determined using the equation: absorbed water (%) = [(final mass – initial mass)/initial mass] ×100. Regarding the water absorption capacity, it was observed that the bilayer absorbed water corresponding to more than 1000% of its weight in the first 15 minutes of the experiment and remained so throughout the analysis. It is also possible to conclude that it had an intermediate absorption capacity in relation to its separate constituents (Figure 3A). In Figure 3B, it is observed that over the eight weeks of analysis the bilayer had an expressive and intermediate degradation in relation to its constituents analyzed separately. After one week, MGlut presented less degradation than the other materials and after four weeks, there was a difference in degradation of the bilayer in relation to the other materials, which remained for eight weeks.

[045] As matrizes tridimensionais porosas e membranas (n=6) foram pesadas inicialmente em balança de precisão e tratadas com PBS 0,01 M. Os materiais foram mantidos a 37 °C por 1, 2, 4 e 8 semanas. A solução foi trocada duas vezes por semana, e, após cada tempo, as amostras foram lavadas três vezes com água deionizada, secas à temperatura ambiente por 72 horas em papel filtro e pesadas. A porcentagem de massa perdida foi calculada usando-se a seguinte fórmula: Taxa de degradação (%) = [(massa final – massa inicial)/massa inicial] ×100.[045] The three-dimensional porous matrices and membranes (n=6) were initially weighed on a precision balance and treated with 0.01 M PBS. The materials were kept at 37 °C for 1, 2, 4 and 8 weeks. The solution was changed twice a week, and, after each time, the samples were washed three times with deionized water, dried at room temperature for 72 hours on filter paper and weighed. The percentage of lost mass was calculated using the following formula: Degradation rate (%) = [(final mass – initial mass)/initial mass] ×100.

[046] Para determinar as propriedades mecânicas (tensão máxima de tração, deformação específica e módulo de elasticidade) das membranas e matrizes, foi utilizado o equipamento universal EMIC DL3000, com uma célula de carga de 200 N, velocidade do ensaio 5 mm/min, e corpos de prova com 5 mm de largura, 30 mm de comprimento e aproximadamente 0,034 mm de espessura. Cinco corpos de prova de cada amostra foram testados, à temperatura ambiente. O ensaio foi realizado seguindo as normas da ASTM D683 e D882.[046] To determine the mechanical properties (maximum tensile stress, specific deformation and modulus of elasticity) of membranes and matrices, the universal equipment EMIC DL3000 was used, with a 200 N load cell, test speed 5 mm/min , and specimens 5 mm wide, 30 mm long and approximately 0.034 mm thick. Five specimens from each sample were tested at room temperature. The test was performed following ASTM D683 and D882 standards.

[047] A bicamada foi avaliada quanto ao módulo de elasticidade, tensão máxima e deformação específica - quando seca e quando imersa em PBS - e apresentou maior módulo elástico e tensão máxima que seu componente tridimensional sozinho (Tabela 1).[047] The bilayer was evaluated for elastic modulus, maximum stress and specific deformation - when dry and when immersed in PBS - and showed higher elastic modulus and maximum stress than its three-dimensional component alone (Table 1).

[048] Tabela 1. Propriedades mecânicas da bicamada em relação a seus componentes antes e após imersão em PBS.

[048] Table 1. Mechanical properties of the bilayer in relation to its components before and after immersion in PBS.

[049] A avaliação do interior da matriz incluindo porosidade e interconectividade dos poros foi realizada utilizando o equipamento SkyScan 1174 (Bruker micro-CT, Belgium). Os parâmetros de energia definidos para o escaneamento foram 40 kV, corrente de 800 μA e tamanho de pixel de 10.03 μm. As amostras foram colocadas em uma plataforma que girava 180º com imagens sendo adquiridas a cada 0,7º. As projeções em sombra obtidas (formato 16-bit TIFF) foram reconstruídas em camadas 2D utilizando o software NRecon (v.1.6.9.18, Skyscan, Bruker micro-CT, Belgium). Análises quantitativas foram realizadas com o software CTAn (v.1.15.4.0, Bruker micro-CT, Belgium) e o software CTVol (v.2.3.1.0, Skyscan, Bruker micro-CT, Belgium) foi utilizado para visualização volumétrica 3D.[049] The evaluation of the interior of the matrix including porosity and interconnectivity of the pores was performed using the SkyScan 1174 equipment (Bruker micro-CT, Belgium). The energy parameters defined for the scan were 40 kV, current of 800 μA and pixel size of 10.03 μm. The samples were placed on a platform that rotated 180º with images being acquired every 0.7º. The obtained shadow projections (16-bit TIFF format) were reconstructed in 2D layers using NRecon software (v.1.6.9.18, Skyscan, Bruker micro-CT, Belgium). Quantitative analyzes were performed with the CTAn software (v.1.15.4.0, Bruker micro-CT, Belgium) and the CTVol software (v.2.3.1.0, Skyscan, Bruker micro-CT, Belgium) was used for 3D volumetric visualization.

[050] As membranas e bicamadas porosas foram distribuídas em placas de 48 poços, uma por poço, mantidas à temperatura ambiente e esterilizadas por irradiação gama a 15 kGy no Laboratório de Irradiação Gama do Centro de Desenvolvimento de Tecnologia Nuclear/Comissão Nacional de Energia Nuclear (CDTN/CNEN). E em seguida, foram utilizadas nos testes in vivo.[050] The porous membranes and bilayers were distributed in 48-well plates, one per well, kept at room temperature and sterilized by gamma irradiation at 15 kGy in the Gamma Irradiation Laboratory of the Nuclear Technology Development Center/National Nuclear Energy Commission (CDTN/CNEN). And then they were used in in vivo tests.

[051] A caracterização morfológica das membranas e bicamadas foi realizada pela MEV no Centro de Microscopia Eletrônica da UFMG. As amostras foram revestidas com 20 nm de platina e analisadas no MEV (JEOL JSM - 6360LV) à 5.00 kV.[051] The morphological characterization of membranes and bilayers was performed by MEV at the Electron Microscopy Center at UFMG. The samples were coated with 20 nm platinum and analyzed in SEM (JEOL JSM - 6360LV) at 5.00 kV.

EXAMPLE 3. WOUND CLOSURE ASSESSMENT

[052] A dinâmica do fechamento de ferida in vivo foi avaliada através da realização de duas feridas excisionais (aproximadamente 1 cm de diâmetro) no dorso de ratos Wistar. Como curativo e arcabouço para migração celular foi feita a colocação da membrana ou da bicamada sobre a ferida e, no terceiro grupo experimental, a área foi deixada exposta (controle). A caracterização da dinâmica de fechamento foi realizada após a eutanásia nos tempos de 7, 14, 21 e 28 dias por macroscopia, análise histológica e quantificação dos transcritos de genes relacionados ao processo de fechamento por PCR quantitativa em tempo real (qPCR).[052] The dynamics of wound closure in vivo was assessed by performing two excisional wounds (approximately 1 cm in diameter) on the back of Wistar rats. As a dressing and framework for cell migration, the membrane or bilayer was placed over the wound and, in the third experimental group, the area was left exposed (control). The characterization of the closure dynamics was performed after euthanasia at 7, 14, 21 and 28 days by macroscopy, histological analysis and quantification of gene transcripts related to the closure process by quantitative real-time PCR (qPCR).

[053] Seis ratos Wistar machos, com 60 dias e peso médio de 200 g, foram utilizados por tempo experimental (7, 14, 21 e 28 dias) e por tipo de material (membrana, bicamada e controle). Os procedimentos envolvendo animais foram feitos de acordo com os Princípios éticos da Experimentação Animal, adotados e aprovados pela Comissão de Ética de Uso de Animais da Universidade Federal de Minas Gerais (processo nº: 88/2017).[053] Six male Wistar rats, 60 days old and average weight of 200 g, were used by experimental time (7, 14, 21 and 28 days) and by type of material (membrane, bilayer and control). Procedures involving animals were carried out in accordance with the Ethical Principles of Animal Experimentation, adopted and approved by the Ethics Committee on the Use of Animals of the Federal University of Minas Gerais (process number: 88/2017).

[054] Após cada eutanásia foi feita documentação fotográfica da ferida para determinação da taxa de fechamento. Na Figura 4 A observam-se as imagens obtidas e é possível notar que nos animais do grupo Controle com 7 dias houve deposição de rede fibrino-plaquetária, formando uma proteção sobre a região da ferida, o que não ocorre nos outros grupos experimentais. Com 14 dias, as feridas já estão praticamente fechadas, não sendo observada diferença quantitativa do fechamento de feridas entre os grupos nesse tempo nem nos demais (Figura 4 B).[054] After each euthanasia, photographic documentation of the wound was made to determine the closure rate. Figure 4 A shows the images obtained and it is possible to notice that in the animals of the Control group at 7 days there was deposition of a fibrin-platelet network, forming a protection over the wound region, which does not occur in the other experimental groups. After 14 days, the wounds are practically closed, and no quantitative difference in wound closure was observed between the groups at this time or in the others (Figure 4B).

[055] No tempo de 7 dias após a formação da ferida, observou-se em todos os grupos a delimitação da área da ferida na região do epitélio, com bordas bem definidas e intenso infiltrado inflamatório composto principalmente por linfócitos (Figura 5), sendo mais proeminente no grupo bicamada, que também apresentou retração da área da ferida (Figura 5 E). Observou-se ainda a presença de um exudato na derme, assim como o acúmulo fibrino-plaquetário na região superficial do grupo Controle. Houve também a presença de vasos congestos na área central da ferida de todos os grupos e discreta hemorragia nos grupos controle e membrana (Figura 5 A, C e E). A avaliação da deposição de fibras colágenas foi feita em lâminas coradas com Tricrômico de Gomori e foi possível notar que o espessamento visto no grupo Controle estava relacionado a exudatos e infiltrado inflamatório, e não à deposição de fibras colágenas, que foi observada de maneira discreta em todos os grupos (Figura 5 B, D e F).[055] Within 7 days after wound formation, it was observed in all groups the delimitation of the wound area in the epithelium region, with well-defined borders and intense inflammatory infiltrate composed mainly of lymphocytes (Figure 5), being more prominent in the bilayer group, which also showed retraction of the wound area (Figure 5 E). It was also observed the presence of an exudate in the dermis, as well as the fibrin-platelet accumulation in the superficial region of the Control group. There was also the presence of congested vessels in the central area of the wound in all groups and mild hemorrhage in the control and membrane groups (Figure 5 A, C and E). The assessment of collagen fiber deposition was carried out on slides stained with Gomori's Trichrome and it was possible to notice that the thickening seen in the Control group was related to exudates and inflammatory infiltrate, and not to collagen fiber deposition, which was discreetly observed in all groups (Figure 5 B, D and F).

[056] Com 14 dias após a formação da ferida, observou-se em todos os grupos a delimitação da área da ferida na epiderme e na derme (Figura 6), diminuição da área assim como diminuição do infiltrado inflamatório, principalmente no grupo bicamada (Figura 6 E). Observou-se também regeneração dos anexos na periferia da ferida de todos os grupos. No grupo Controle ainda é possível notar vasos congestos na região central da ferida (Figura 6 A) e esse também foi o único grupo que não apresentou completa reepitelização da área da ferida. A avaliação da deposição de fibras colágenas foi feita em lâminas coradas com Tricrômico de Gomori e observou-se a deposição de fibras colágenas na derme, ainda de maneira desorganizada, em todos os grupos (Figura 6 B, D e F).[056] With 14 days after wound formation, it was observed in all groups the delimitation of the wound area in the epidermis and dermis (Figure 6), a decrease in the area as well as a decrease in the inflammatory infiltrate, especially in the bilayer group ( Figure 6 E). Regeneration of appendages in the periphery of the wound was also observed in all groups. In the Control group, it is still possible to notice congested vessels in the central region of the wound (Figure 6 A) and this was also the only group that did not present complete re-epithelialization of the wound area. The evaluation of collagen fiber deposition was carried out on slides stained with Gomori's Trichrome and the deposition of collagen fibers in the dermis was observed, still in a disorganized manner, in all groups (Figure 6 B, D and F).

[057] No tempo de 21 dias após a formação da ferida, observou-se que todos os grupos já se encontram reepitelizados, sendo que a delimitação da área da ferida se fez, principalmente, pela derme, com a ausência de anexos na região central da ferida (Figura 7 A, C e E). No grupo bicamada já foi possível observar a presença de folículos pilosos na região central profunda (Figura 7 E). A avaliação da deposição de fibras colágenas foi feita em lâminas coradas com Tricrômico de Gomori e observou-se o início da organização das fibras colágenas em todos os grupos (Figura 7 B, D e F).[057] Within 21 days after wound formation, it was observed that all groups are already re-epithelialized, and the delimitation of the wound area was mainly done by the dermis, with the absence of attachments in the central region of the wound (Figure 7 A, C and E). In the bilayer group, it was already possible to observe the presence of hair follicles in the deep central region (Figure 7 E). The assessment of collagen fiber deposition was performed on slides stained with Gomori's Trichrome and the beginning of collagen fiber organization was observed in all groups (Figure 7 B, D and F).

[058] Com 28 dias após a formação da ferida, todos os grupos se mostraram reepitelizados, com diminuição da área de lesão e com a presença de anexos na periferia (Figura 8), sendo que nos grupos membrana e bicamada foi possível notar a presença de alguns anexos na derme profunda na região da lesão (Figura 8 C e E). Quanto à deposição de fibras colágenas feita em lâminas coradas com Tricrômico de Gomori, observou-se que na periferia da lesão já houve reorganização das fibras colágenas em todos os grupos e que no grupo membrana esta reorganização aparentava mais avançada que nos outros grupos (Figura 8 B, D e F).[058] At 28 days after wound formation, all groups were re-epithelialized, with a decrease in the lesion area and with the presence of attachments in the periphery (Figure 8), and in the membrane and bilayer groups it was possible to notice the presence of some attachments in the deep dermis in the region of the lesion (Figure 8 C and E). As for the deposition of collagen fibers on slides stained with Gomori's Trichrome, it was observed that on the periphery of the lesion there was already a reorganization of collagen fibers in all groups and that in the membrane group this reorganization appeared more advanced than in the other groups (Figure 8 B, D and F).

[059] Antes e durante o experimento, os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas – UFMG, dentro de gaiolas individuais, com maravalha, recebendo alimentação sólida balanceada e água filtrada ad libitum.[059] Before and during the experiment, the animals were kept in the vivarium of the Department of Biochemistry and Immunology of the Institute of Biological Sciences - UFMG, inside individual cages, with wood shavings, receiving balanced solid food and filtered water ad libitum.

[060] O procedimento cirúrgico foi adaptado de Wang e colaboradores (2013). Os animais foram inicialmente pesados e anestesiados com Ketamina e Cloridrato de Xylazina, na proporção 1:1 com dose de 0,10 mL/100 gramas de massa corporal do animal, via intramuscular. Posteriormente, foi realizada a tricotomia da região dorsal. Os animais foram, então, posicionados em decúbito ventral e foi realizada a assepsia da região com PVPI (solução de iodo 10 %). Em seguida, os animais foram posicionados lateralmente e, com o auxílio de um punch de 9 mm de diâmetro, foi realizada uma incisão que atravessou completamente a pele do animal, criando duas feridas excisionais na região mediana do dorso, aproximadamente 3 cm abaixo da omoplata. Foi realizada documentação fotográfica e um anel de silicone foi colado com Super Bonder (Loctite®) e dois pontos cirúrgicos foram feitos para assegurar a permanência do anel no local de cada uma das feridas. Posteriormente, o implante dos diferentes tipos de materiais foi realizado, posicionandoos abaixo do anel e em contato direto com a fáscia do animal. Nos animais Controle foi feita somente a colocação do anel.[060] The surgical procedure was adapted from Wang et al. (2013). The animals were initially weighed and anesthetized with Ketamine and Xylazine Hydrochloride, in a 1:1 ratio, with a dose of 0.10 mL/100 grams of animal body weight, intramuscularly. Subsequently, the trichotomy of the dorsal region was performed. The animals were then placed in the prone position and the region was asepsied with PVPI (10% iodine solution). Then, the animals were positioned laterally and, with the aid of a 9 mm diameter punch, an incision was made that completely crossed the animal's skin, creating two excisional wounds in the median region of the back, approximately 3 cm below the shoulder blade . Photographic documentation was performed and a silicone ring was bonded with a Super Bonder (Loctite®) and two surgical stitches were made to ensure the permanence of the ring at the site of each wound. Subsequently, the implant of different types of materials was performed, placing them below the ring and in direct contact with the animal's fascia. In Control animals, only the placement of the ring was performed.

[061] Após 7, 14, 21 e 28 dias, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e tiveram o pelo do dorso raspado para exposição da área da cirurgia. Nesse momento, foi realizada documentação fotográfica com a presença de uma régua para escala. As imagens foram posteriormente analisadas com o auxílio do software livre ImageJ 1x e o diâmetro das feridas foi medido em todos os tempos experimentais.[061] After 7, 14, 21 and 28 days, the animals were euthanized in a CO2 chamber and had the back hair shaved to expose the area of surgery. At that time, photographic documentation was carried out with the presence of a scale ruler. The images were later analyzed with the help of the free ImageJ 1x software and the wound diameter was measured at all experimental times.

[062] Para avaliação da vascularização da região da ferida após 7, 14, 21 e 28 dias de cirurgia, foram analisados 10 campos por animal no aumento de 40 X e a contagem de vasos foi realizada. Observou-se que, com 7 dias os animais que receberam o implante tiveram aumento na vascularização quando comparados ao grupo Controle (Figura 8), evidenciando que a presença dos scaffolds promove neovascularização. Observou-se que com 14 e 21 dias não houve diferença quanto ao número de vasos entre os grupos (Figura 9). Por fim, observou-se que, com 28 dias, os animais do grupo bicamada tiveram aumento na neovascularização quando comparados aos grupos controle e membrana (Figura 9), evidenciando o papel do ambiente proporcionado pela presença da MGlut na neovascularização.[062] To assess the vascularization of the wound region after 7, 14, 21 and 28 days of surgery, 10 fields per animal were analyzed at 40X magnification and the vessel count was performed. It was observed that, after 7 days, the animals that received the implant had an increase in vascularization when compared to the Control group (Figure 8), showing that the presence of scaffolds promotes neovascularization. It was observed that at 14 and 21 days there was no difference in the number of vessels between groups (Figure 9). Finally, it was observed that, at 28 days, the animals in the bilayer group had an increase in neovascularization when compared to the control and membrane groups (Figure 9), evidencing the role of the environment provided by the presence of MGlut in neovascularization.

[063] As regiões da ferida foram removidas e, em seguida, uma das feridas do animal foi congelada para extração de RNA e a outra foi fixada em formaldeído 10 % e incluída em parafina para análises histológicas. Cortes longitudinais de 5 μm de espessura foram obtidos por microtomia, fixados em lâminas e corados por Hematoxilina e Eosina (HE) ou Tricrômico de Gomori. Os cortes foram avaliados com microscópio de luz Olympus BX51 equipado com software Image-Pro Express 4,0 (Media Cybernetics) e com o Microscópio digital – scanner de lâminas 3D Histech do CAPI/UFMG.[063] The wound regions were removed and then one of the animal's wounds was frozen for RNA extraction and the other was fixed in 10% formaldehyde and embedded in paraffin for histological analysis. Longitudinal sections 5 μm thick were obtained by microtomy, fixed on slides and stained with Hematoxylin and Eosin (HE) or Gomori's Trichrome. The sections were evaluated with an Olympus BX51 light microscope equipped with Image-Pro Express 4.0 software (Media Cybernetics) and with a digital microscope – Histech 3D slide scanner from CAPI/UFMG.

[064] Foram obtidas pelo menos 10 imagens de cada lâmina/animal e essas micrografias foram utilizadas para avaliação da dinâmica de fechamento da ferida, sua composição celular, assim como o número de vasos por campo, que foi mensurado utilizando o software livre ImageJ 1x.[064] At least 10 images of each slide/animal were obtained and these micrographs were used to assess the dynamics of wound closure, its cellular composition, as well as the number of vessels per field, which was measured using the free ImageJ 1x software .

[065] PCR em tempo real foi realizado para quantificação dos transcritos gênicos presente durante o processo do fechamento das feridas. Os genes Vegfa, Tgfb1, Tgfb3, Col1a1, Col3a1 e Fgf7 foram avaliados, utilizando o B2m para normalização dos dados. Para tanto foi realizada extração de RNA total das regiões da área da ferida nos três grupos, tratamento com DNase e síntese de cDNA. As sequências dos oligonucleotídeos iniciadores e o tamanho esperado de cada amplicon são apresentados na Tabela 2.[065] Real-time PCR was performed to quantify the gene transcripts present during the process of wound closure. The genes Vegfa, Tgfb1, Tgfb3, Col1a1, Col3a1 and Fgf7 were evaluated, using the B2m for data normalization. For this purpose, total RNA extraction was performed from the regions of the wound area in the three groups, treatment with DNase and cDNA synthesis. The sequences of the oligonucleotide primers and the expected size of each amplicon are shown in Table 2.

[066] Tabela 2. Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores e tamanho esperado dos amplicons.

[066] Table 2. Sequence of oligonucleotide primers and expected size of amplicons.

[067] Cada reação de qPCR continha 5μL de GoTaq® qPCR Matser Mix 2X (Promega); 0,1 µL de CXR Reference Dye (Promega), 2 μL de mix de primers F e R específicos, 80 ng de cDNA e água nuclease-free para um volume final de 10 μL. As condições de amplificação foram de um passo inicial de 95 °C por 2 minutos, seguido de 40 ciclos com uma etapa de desnaturação a 95 °C por 15 segundos e uma etapa associada de hibridização e extensão a 60 °C por 1 minuto. Após os 40 ciclos de amplificação todas as amostras foram submetidas à desnaturação gradual para determinação da curva de dissociação (melting curve), com o objetivo de verificar a especificidade da reação de amplificação, a formação de dímeros de primers e determinar o Tm de cada amplicon. Em todas as corridas de qPCR foi feito um controle branco de amplificação para cada par de primers, onde água estéril foi acrescentada no lugar de cDNA. Cada amostra foi analisada em triplicata utilizando o equipamento 7900HT Real-Time PCR System e os dados foram processados utilizando o software SDS v2.4 (Applied Biosystems).[067] Each qPCR reaction contained 5μL of GoTaq® qPCR Matser Mix 2X (Promega); 0.1 µL CXR Reference Dye (Promega), 2 µL specific F and R primer mix, 80 ng cDNA and nuclease-free water for a final volume of 10 µL. Amplification conditions were an initial step of 95 °C for 2 minutes, followed by 40 cycles with a denaturation step at 95 °C for 15 seconds and an associated annealing and extension step at 60 °C for 1 minute. After 40 cycles of amplification, all samples were subjected to gradual denaturation to determine the dissociation curve, in order to verify the specificity of the amplification reaction, the formation of primer dimers and determine the Tm of each amplicon . In all qPCR runs a blank amplification control was made for each primer pair, where sterile water was added in place of cDNA. Each sample was analyzed in triplicate using the 7900HT Real-Time PCR System and the data were processed using the SDS v2.4 software (Applied Biosystems).

[068] A concentração ótima de cada oligonucleotídeo iniciador foi determinada por meio do teste de concentração de primers, em que foram testadas as concentrações 0,05; 0,075; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3 e 0,4 μM. A partir desse teste, foram padronizadas as concentrações de cada iniciador forward (F) e reverse (R) a serem utilizadas nos ensaios de qPCR (Tabela 3). Curvas padrão para cada marcador foram obtidas por meio de reações envolvendo diluições logarítmicas seriadas de cDNA (teste de eficiência de amplificação da reação de qPCR). Os valores de slope (coeficiente angular da reta) foram utilizados no cálculo da eficiência de amplificação da reação de qPCR para cada marcador [Eficiência = (10-1/slope -1)]. A partir desse teste padronizou-se a quantidade de cDNA a ser utilizada em todos os ensaios de qPCR (80 ng/amostra).[068] The optimal concentration of each oligonucleotide primer was determined through the primer concentration test, in which concentrations were tested 0.05; 0.075; 0.1; 0.15; 0.2; 0.3 and 0.4 µM. From this test, the concentrations of each forward (F) and reverse (R) primer to be used in the qPCR assays were standardized (Table 3). Standard curves for each marker were obtained through reactions involving serial logarithmic dilutions of cDNA (qPCR reaction amplification efficiency test). The slope values (straight angular coefficient) were used to calculate the amplification efficiency of the qPCR reaction for each marker [Efficiency = (10-1/slope -1)]. From this test, the amount of cDNA to be used in all qPCR assays (80 ng/sample) was standardized.

[069] Tabela 3. Concentração ótima de cada iniciador e eficiência de amplificação da reação de qPCR.

[069] Table 3. Optimal concentration of each primer and amplification efficiency of the qPCR reaction.

[070] A variação entre as corridas de qPCR foi corrigida usando um calibrador entre placas (gene B2m da amostra pertencente ao grupo controle 7 dias). Todos os valores de Cq utilizados nas análises de expressão gênica foram obtidos após a correção para o calibrador entre placas utilizando o software Thermo Fisher Cloud. O cálculo da expressão gênica foi realizado usando o método Pfaffl, onde foram consideradas as eficiências de amplificação dos genes alvo e de referência previamente determinadas. Nessas análises, a amostra referente ao grupo controle 7 dias foi utilizada como calibrador (amostra de referência) nos cálculos da expressão relativa.[070] The variation between qPCR runs was corrected using a cross-plate calibrator (B2m gene from the sample belonging to the 7 day control group). All Cq values used in gene expression analyzes were obtained after correction for the interplate calibrator using Thermo Fisher Cloud software. The calculation of gene expression was performed using the Pfaffl method, where the amplification efficiencies of previously determined target and reference genes were considered. In these analyses, the sample referring to the 7-day control group was used as a calibrator (reference sample) in the calculation of the relative expression.

[071] Quando a expressão de Vegfa foi avaliada - fator relacionado à promoção de angiogênese e assim à nutrição e clearance de debris - observou-se que os grupos bicamada e controle 21 dias diferem de expressão quando comparados a todos os outros grupos e tempos (Figura 10).[071] When the expression of Vegfa was evaluated - factor related to the promotion of angiogenesis and thus to nutrition and debris clearance - it was observed that the bilayer and 21-day control groups differ in expression when compared to all other groups and times ( Figure 10).

[072] A expressão de membros da família dos TGFs também foi avaliada, por estar relacionada a diversos momentos do processo de fechamento de feridas, como nas fases de inflamação, remodelação, angiogênese e apoptose e na quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos, sendo que uma maior expressão de Tgfb3 em relação a Tgfb1 está relacionada a processos regenerativos. Pode-se observar na Figura 11 A que a expressão de Tgfb1 no grupo membrana 7 dias foi maior quando comparada aos outros grupos em todos os tempos, exceto em relação ao grupo bicamada 21 dias.[072] The expression of members of the TGF family has also been evaluated, as it is related to different moments of the wound closure process, such as in the phases of inflammation, remodeling, angiogenesis and apoptosis and in fibroblast and macrophage chemotaxis, with a greater expression of Tgfb3 compared to Tgfb1 is related to regenerative processes. It can be seen in Figure 11 A that the expression of Tgfb1 in the 7-day membrane group was higher when compared to the other groups at all times, except for the 21-day bilayer group.

[073] Quanto à expressão de Tgfb3, foi possível observar na Figura 11 B expressão aumentada no grupo bicamada 21 dias em relação aos outros grupos e tempos, não diferindo dos grupos bicamada 7 dias, membrana 14 dias e controle 21 dias.[073] As for the expression of Tgfb3, it was possible to observe in Figure 11 B increased expression in the 21-day bilayer group compared to the other groups and times, not differing from the 7-day bilayer, 14-day membrane and 21-day control groups.

[074] Pode-se observar ainda que com 21 dias o grupo bicamada apresentou maior expressão de Tgfb3 que de Tgfb1. Fgf7 é expresso por fibroblastos e outras células mesenquimais e atua sobre células epiteliais promovendo a migração, proliferação e sobrevivência dos queratinócitos na área da lesão. Observa-se na Figura 12 que houve aumento da expressão no grupo membrana 7 dias quando comparado aos demais grupos e tempos, não diferindo de membrana 14 dias.[074] It can also be observed that at 21 days the bilayer group showed greater expression of Tgfb3 than Tgfb1. Fgf7 is expressed by fibroblasts and other mesenchymal cells and acts on epithelial cells promoting migration, proliferation and survival of keratinocytes in the lesion area. It is observed in Figure 12 that there was an increase in expression in the membrane group 7 days when compared to the other groups and times, not differing from the membrane 14 days.

[075] A expressão de Col1a1 e Col3a1 foi avaliada por serem estes os principais constituintes da derme e por sua expressão excessiva estar relacionada a eventos que levam à cicatrização com fibrose (maior expressão de Col1a1) e não à regeneração (maior expressão de Col3a1). Observa-se na Figura 13 A aumento da expressão de Col1a1 nos grupos membrana e bicamada 14 dias quando comparado ao grupo controle com 28 dias. Quanto à expressão de Col3a1 foi possível observar aumento no grupo membrana 14 dias quando comparado aos demais grupos e tempos, exceto aos grupos Controle 14 dias e membrana 21 dias (Figura 13 B)[075] The expression of Col1a1 and Col3a1 was evaluated because these are the main constituents of the dermis and because their overexpression is related to events that lead to healing with fibrosis (greater expression of Col1a1) and not regeneration (greater expression of Col3a1) . Figure 13 shows the increased expression of Col1a1 in the membrane and bilayer groups at 14 days when compared to the control group at 28 days. As for the expression of Col3a1 it was possible to observe an increase in the 14 days membrane group when compared to the other groups and times, except for the Control 14 days and 21 days membrane groups (Figure 13 B)

Claims

THREE-DIMENSIONAL ARTIFICIAL SKIN, characterized by comprising a bilayer composed of a membrane of chitosan and gelatin in the range of mass proportions between 1:1 and 3:1, preferably 2:1, in acetic acid from 0.05 to 1.25% (v /v), preferably 1% (v/v), lyophilized on a three-dimensional porous matrix containing chitosan and polyhydroxybutyrate in the mass ratio range between 1:1 and 3:1, preferably 1:1, in the final concentration between 1.5 and 2.5% (m/v), preferably 2.5 (m/v), crosslinked with glutaraldehyde 0.002 to 0.005% (v/v), preferably 0.005% (v/v).

THREE-DIMENSIONAL ARTIFICIAL SKIN, according to claim 3, characterized by comprising a wide dispersion of pores, with an average diameter of 200 to 400μm.

PROCESS FOR OBTAINING THREE-DIMENSIONAL ARTIFICIAL SKIN defined in claims 1 and 2, characterized in that it comprises the following steps:

a) Prepare a three-dimensional porous matrix from the mixture of chitosan and polyhydroxybutyrate in equal proportions, at a final concentration between 1.5 and 2.5% (m/v), preferably 2.5% (m/v), in acid acetic 0.05 to 1.25% (v/v), preferably 1% (v/v);
b) Freeze the matrix obtained in “a” at -10 to -20°C, preferably -20°C for up to 24 hours;
c) Freeze-dry the matrix obtained in “b”;
d) Treat the matrix obtained in step “c” with glutaraldehyde 0.002 to 0.005% (v/v), preferably 0.005% (v/v);
e) Place an artificial membrane of chitosan and gelatin on the matrix obtained in “d” and freeze at -10 to -20°C, preferably -20°C, for up to 24 hours;
f) Freeze-dry the product obtained in “e” to obtain three-dimensional artificial skin.

The PROCESS, according to claim 3 step "e", characterized by the artificial membrane of chitosan and gelatin is obtained through the following steps:

a) Mix chitosan and gelatin in the mass ratio range between 1:1 and 3:1, preferably 2:1, in acetic acid 0.05 to 1.25% (v/v), preferably 1% (v/v ), forming a final solution of 1.5% (m/v), preferably in acetic acid solution from 0.05 to 1.25% (v/v), preferably 1% (v/v), neutralized to pH between 6 and 7.2, preferably 6;
b) Dry the mixture obtained in “a”;
c) Wash the membrane with a buffered aqueous solution and treat it with a glycerol solution in absolute alcohol between 6 and 8% v/v;
d) Wash with a buffered aqueous solution and dry at room temperature;
e) Treat with deionized water;
f) Wash with buffered aqueous solution and dry at room temperature.

USE of the product defined in claims 1 and 2, characterized in that it is a cover and framework for cell migration in the regenerative process of skin lesions in humans and other mammals.