BR102019018195A2 - Composição farmacêutica, processo de obtenção e uso de metabólitos secundários produzido pelo fungo exserohilum rostratum na regeneração celular - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo metabólitos secundários produzido pelo fungo exserohilum rostratum na regeneração celular . particularmente, a presente invenção se refere a composição farmacêutica compreendendo metabólitos secundários monocerina e anularina i produzidos a partir da cultura do fungo exserohilum rostratum para regeneração celular. em outro aspecto, a presente invenção se refere ao processo de obtenção e uso dos referidos metabólitos secundários produzido pelo fungo exserohilum rostratum na regeneração celular.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PROCESSO DE OBTENÇÃO E USO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS PRODUZIDO PELO FUNGO EXSEROHILUM ROSTRATUM NA REGENERAÇÃO CELULAR Campo da Invenção A presente invenção se refere ao uso de metabólito secundário produzido pelo fungo Exserohilum rostratum na regeneração celular e tecidual. Particularmente, a presente invenção se refere ao uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I, compostos orgânicos obtidos a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum para regeneração celular em células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1. Antecedentes da Invenção

[001] Fungos endofíticos são fungos que vivem no interior das plantas, habitando, de modo geral, suas partes aéreas, como folhas e caules, sem causar aparentemente nenhum dano a seus hospedeiros. Portanto, eles se diferenciam dos microrganismos fitopatogênicos, que são prejudiciais às plantas, causando-lhes doenças.

[002] Microrganismos endófitos foram mencionados pela primeira vez no início do século XIX, mas foi Bary (1866) quem primeiro delineou uma possível distinção entre endófitos e fitopatógenos. No final dos anos 70, verificou-se que os endófitos propiciam à planta hospedeira proteção contra insetos e pragas, contra outros microrganismos patogênicos e inclusive contra herbívoros. Atualmente, sabem-se que os fungos endófitos podem produzir moléculas que atuam como toxinas, antibióticos, fatores de crescimento e outros fármacos, e ainda muitos outros produtos de interesse biotecnológicos (AZEVEDO, 2004). Os fungos endofíticos fixam nas plantas por aberturas naturais e feridas que servem como portas de entrada vezes nas raízes secundárias laterais. Outras portas de entrada são as aberturas naturais como estômatos e hidatódios, aberturas causadas por insetos e por estruturas de fungos patogênicos, como os apressórios.

Metabólitos primários e secundários produzidos por microrganismos

[003] Uma grande vantagem da prospecção química de metabólitos primários e secundários (MS) produzidos por microrganismos, em relação às demais fontes, é o fato de que microrganismos podem ser cultivados em larga escala em fermentadores. Também não existe prejuízo ao ecossistema, como pode ocorrer com a retirada de plantas e outros organismos de áreas naturais, nem problemas éticos como os que podem advir da prospecção de metabólitos bioativos a partir de insetos, anfíbios e outras espécies animais (TAKAHASHI & LUCAS, 2007).

Metabólitos Primários

[004] Metabólitos primários são as pequenas moléculas produzidas ao longo do crescimento vegetativo. São usados em indústrias alimentícias e de ração incluindo, por exemplo: álcoois (etanol), aminoácidos (glumato monossódico, lisina, treonina, fenilalanina, triptofano), nucleotídeos flavorizantes (ácido 5-guanílico, ácido 5-isosínico), ácidos orgânicos (acético, propiônico, fumárico, láctico), polióis (glicerol, manitol, xilitol), polissacarídeos (xantana), açúcares (frutose, ribose) e vitaminas (riboflavina, cianocobalamina, biotina) (DEMAIN, 2000; RAJASEKARAN et al.,2008).

Metabólitos Secundários (MS)

[005] Metabólitos secundários são sintetizados quando o crescimento microbiano está na fase estacionária; são frequentemente bioativos e de baixa massa molecular. Apresentam grande importância à humanidade devido à atividade antibiótica de importância farmacêutica, bem como atividade imunossupressora e tóxica. Normalmente não são derivados do substrato utilizado para o crescimento celular, e sim sendo sintetizados a partir de um metabólito primário. Em geral, esses metabólitos são formados quando grandes quantidades de precursores de metabólitos primários, tais como aminoácidos, acetato, piruvato e outros, são acumulados. Apresentam algumas características como: distribuição taxonômica restrita, ou seja, nem todas as linhagens de uma mesma espécie são capazes de produzir determinado metabólito e não são essenciais para o crescimento e reprodução do organismo. As condições de cultivo como especialmente a composição do meio controlam a formação destes metabólitos que são produzidos como um grupo de estruturas inter-relacionadas. Podem ser super expressos e são codificados por conjuntos de genes dispensáveis (JAY, 2005; KELLER et al.,2005; MARTÍN et al., 2005; YU & KELLER, 2005; NIGAM, 2009).

[006] Na natureza, MS são importantes para os organismos que os produzem, funcionando como hormônios sexuais, ionóforos, defesa contra bactérias, fungos, amebas, insetos e plantas, agente de simbiose, efetores de diferenciação e atividades desconhecidas (DEMAIN & ADRIO, 2008). Os MS são usualmente separados em cinco grupos: derivados de aminoácidos, peptídeos não ribossomais, policetídeos, derivados de ácidos graxos e híbridos de policetídeos-peptídeos (KEMPKEN & ROHLFS, 2010; ROZE et al., 2011).

[007] Os genes para a biossíntese de metabólitos secundários são usualmente organizados em "clusters" nas linhagens produtoras. Estes "clusters" incluem, além dos genes que codificam as enzimas biossintéticas e as proteínas regulatórias, genes para a resistência à ação tóxica dos metabólitos secundários (para evitar o suicídio das espécies produtoras) e genes para a secreção desses metabólitos (MARTÍN et al., 2005). É usual que diferentes espécies de fungos tenham um ou mais metabólitos secundários em comum, sendo muitos deles produzidos por fungos filogeneticamente muito diferentes (FRISVAD et al., 2008).

[008] A síntese de MS pode garantir ao fungo, vantagem em habitat no qual existe competição com outros microrganismos. Portanto, muitos desses metabólitos apresentam efeitos tóxicos ou inibitórios em outros organismos (KHALDI et al., 2010). Devido a essas propriedades bioativas, muitos metabólitos secundários têm sido utilizados para uso farmacêutico como antibióticos, agentes hipocolesterolemiantes, antitumorais e imunossupressores, sendo que, poucos MS de sucesso não apresentam atividade antibiótica. Uma desvantagem é que micotoxinas e compostos produzidos por fungos patogênicos que induzem aumento da virulência tem impacto negativo na sociedade (DEMAIN, 1999; SHWAB & KELLELR, 2008).

[009] Devido à ampla distribuição destes metabólitos por todo o Reino Fungi, esta se torna uma característica importante para a classificação e a identificação de fungos. A Quimiotaxonomia em fungos, baseada em MS tem sido utilizada com sucesso em diversos gêneros de Ascomicetos como Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Hypoxylon, Penicillium, Stachybotrys, Xylaria e em poucos gêneros de Basidiomicetos, mas não em Zigomicetos e Quitridiomicetos (FRISVAD et al., 2008).

Metabólitos secundários Anularina e Monocerina

[0010] No estado da técnica, são poucos os relatos sobre o isolamento e síntese de monocerinas, assim como, as atividades biológicas já descritas para este composto. Para as anularinas os relatos são ainda mais escassos.

[0011] As monocerinas (12S)-12-hidroximonocerina e (12R)-12-hidroximonocerina já foram isoladas do fungo endofítico Microdochium bolleyi e E. rostratum junto com a monocerina (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil-2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona (Sappapan et al., 2008; Zhang et al., 2008) que também já foi isolada de outras fontes, como da cultura de E. turcum (Robeson e Strobel, 1982; Cuq et al., 1993), Helminthosporium monoceras (Claydon et al., 1979), Fusarium larvarium (Claydon et al., 1979; Grove e Pople, 1979), e de Dreschlera ravenelli (Scott et al., 1984).

[0012] O estudo do metabolismo secundário do fungo E. rostratum levou a identificação de fitotoxinas com ação herbicida (Tan et al., 2004), e do extrato bruto da extração com acetato de etila, o derivado de isocumarina 11-hidroximonocerina foi isolado junto com 12-hidroximonocerina e monocerina cuja potencial ação antimalárica (IC50 de 0,68 μΜ) e de seus análogos foi pela primeira vez descrita (Sappapan et al., 2008). As monocerinas tem ainda ação antifúngica, inseticida e fitotóxica (Sappapan et al., 2008).

[0013] Da cultura do fungo aquático A. triseptatus, o extrato obtido da extração com acetato de etila apresentou ação antifúngica e antibacteriana e o estudo químico resultou no isolamento de 8 compostos, denominados como anularinas A-H (Figura 1) e classificados como metabólitos policetídeos (Li et al., 2003). As anularinas A-F são α-pironas 3,4,5-trisubstituídas e as anularinas G-H são γ-lactonas 3,4-disubstituídas α,β-insaturadas. As anularinas A, B, C e F inibiram o crescimento de Bacillus subtilus (ATCC 6051) induzindo halo de 8-10 mm com 200 μg/disco testado e nesta mesma concentração, a anularina C inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus (ATCC 29213) com halo de 14 mm. Nenhum composto apresentou ação contra C. albicans (ATCC 90029) e com exceção dos compostos D e E (não testados) os demais não foram efetivos contra A. flavus (NRRL 6541).

[0014] Anularinas A-F são α-pironas, membros de uma classe geral comumente encontrada em fungos. Um estudo para a síntese de anularinas foi proposto por Motodate et al., (2010) e a síntese total de anularina F foi relatada pela primeira vez em 2006 (Kurdyumov et al., 2006). Biogeneticamente, as anularinas A-F são presumivelmente derivadas da via de policetídeo e existe a hipótese de que as anularinas G e H tenham origem em uma via biossintética análoga, mas com uma diferente etapa de fechamento do anel.

[0015] De forma semelhante, a monocerina tem origem como heptacetídeo, o que foi demonstrado em um estudo de biossíntese dessa molécula com a incorporação de acetatos marcados com 2H, 13C e 18O em D. ravenelii (Scott et al., 1984).

Origem do fungo Exserohilum rostratum

[0016] A planta velame é um arbusto endêmico da Caatinga, de pequeno porte, encontrado em terreno arenoso com presença de sol intenso, ausência de água nas proximidades e se caracteriza pela presença de látex no interior do caule e intenso aroma. Esta planta foi coletada por nosso grupo, e uma exsicata foi depositada no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) sob o número de Tombo 161257. A exsicata foi identificada como Croton blanchetianus pertencente à família Euphorbiaceae pela Botânica Daniela Carneiro Santos Torres, da UEFS, especialista na Família Euphorbiaceae.

[0017] A família Euphorbiaceae é uma das maiores das Angiospermae, com cerca de 300 gêneros e aproximadamente 7.500 espécies distribuídas em todo o mundo. No Brasil esta família de plantas está amplamente distribuída nos diferentes tipos de vegetação, mas é considerada uma das mais representativas da Caatinga. Segundo Albuquerque et al., (2002) a família Euphorbiaceae é utilizada pelos habitantes da Caatinga com finalidades medicinais, como por exemplo, as espécies do gênero Croton, como C. argirophylloides (nome popular: marmeleiro-branco ou sacatinga), C. rhaminifolius (nome popular: velame) e C. sonderianus (nome popular: marmeleiro). Estas plantas também são usadas como repelente de insetos e como fonte de madeira.

[0018] Caules e folhas da planta velame (C. blanchetianus) foram processados em nosso laboratório para isolamento de fungos endofíticos de acordo com o procedimento descrito por Araújo et al., (2001). Deste processo, 70 fungos endofíticos foram isolados e os extratos orgânicos, obtidos após cultura, foram avaliados em relação à ação antifúngica contra espécies de fungos patogênicos para o homem.

[0019] Dentre os isolados, o fungo endofítico codificado como FV3 foi isolado da folha da planta e taxonomicamente identificado por técnicas de Biologia Molecular (Raeder e Broda 1985; Gonzáles-Mendoza et al., 2010) pelo grupo do nosso colaborador Prof. Wellington L. de Araújo do Departamento de Microbiologia do ICB/USP, como referente a espécie Exserohilum rostratum.

[0020] Esta espécie tem origem terrestre e marinha e pode ser encontrada como patógeno de invertebrados marinhos ou como um fitopatógeno causando doenças em frutos e raízes de plantas (Sappapan et al., 2008). Na Thailandia esta espécie já foi isolada como endofítico de folhas de Stemona sp.

[0021] O artigo de autoria de Pina, J.R.S. (UFPA); Pinheiro, E.A.A. (UFPA); Leite, E.A. (UFPA); Marinho, A.M.R. (UFPA) e intitulado "Novos policetídeos com atividade antibacteriana isolados do fungo Exserohilum rostratum endófito de Bauhinia guianensis" apresentado no 56o Congresso Brasileiro de Química de 07 a 11 de novembro de 2016 em Belém do Pará revela a partir de uma matriz vegetal (Bauhinia guianensis), onde isolou-se a espécie fúngica Exserohilum rostratum 1.11 Er, ao qual foi obtida a biomassa e, assim, foram isolados, os esteroides ergosterol (1) e peróxido de ergosterol (2); a isocumarina, monocerina (3) e os policetídeos de ocorrência inédita na literatura, denominados de anularina I (4) e anularina J (5). Concomitante foram realizados ensaios antimicrobianos. As annularinas I (4) e J (5) apresentaram boas atividades bacteriostática, frente à B. subtilis e E. coli, destacando-se 4 que apresentou atividade bacteriostática na mesma concentração do antibiótico de referência. Quanto ao ensaio de citotoxidade as substâncias mostraram-se inativas.

[0022] O referido artigo de autoria de Pina, J.R.S. revela que as anularinas I (4) e J (5) apresentaram boas atividades bacteriostática, frente à B. subtilis e E. coli, destacando-se (4) que apresentou atividade bacteriostática na mesma concentração do antibiótico de referência. Quanto ao ensaio de citotoxidade as substâncias mostraram-se inativas.

[0023] A presente invenção revela o uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I na regeneração celular em células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1. Neste sentido, o uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I na regeneração celular em células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 é bastante diferente daquele proposto por qualquer documento do estado da técnica.

[0024] Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou muito menos sugere o uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum para regeneração celular, baseando-se em dados experimentais em células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1.

Sumário da Invenção

[0025] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação ao uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I obtidos a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum para uso na regeneração celular, como por exemplo de células endoteliais HUVEC, fibroblastos macrófagos, etc., possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0026] Considerando os dados da literatura, a monocerina e a anularina I obtidas a partir do fungo E. rostratum podem ter sido biossintetizadas pela via de policetídeos. Diversos compostos policetídeos são descritos como potentes antibióticos, antitumorais, antifúngicos, agentes imunossupressores e antivirais (Yadav et al., 2003). Este contexto reforça a relevância da investigação dos efeitos biológicos desses dois compostos e constitui um desafio, principalmente com relação a anularina I ainda pouco estudada.

Breve Descrição dos Desenhos

[0027] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[0028] A Figura 1 mostra as estruturas dos compostos anularinas A-H (1-8) descritas na literatura e obtidas a partir da cultura do fungo aquático Annulatascus triseptatus, da monocerina (F1) e da anularina I (F2) obtidas a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum;

[0029] A Figura 2 mostra as células endoteliais HUVEC em processo de multiplicação celular. Controle (A) e tratamentos das células com o composto anularina I da presente invenção em mM, B (0,07), C (0,14), D (0,28), E (0,56), e F (1,12). Setas na cor vermelha indicam células em processo de multiplicação celular e na cor preta células em processo de apoptose;

[0030] Na Figura 3, o gráfico indica o perfil cromatográfico do extrato obtido da cultura do fungo em meio batata dextrose (BD) dos compostos da presente invenção. As condições da análise foram em coluna C18 (250 x 4, 6 mm), sistema de eluição isocrática com 56,0 % de B em 30 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina e F2=anularina I.

[0031] A figura 4 mostra um gráfico do perfil cromatográfico do extrato obtido da cultura do fungo em meio Czapek dos compostos da presente invenção. As condições da análise foram em coluna C18 (250 x 4, 6 mm), sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 30 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina. Obs.: ausência de anularina I.

[0032] A Figura 5 mostra um gráfico do perfil cromatográfico do extrato obtido da cultura do fungo em meio extrato de malte (marca Synth) dos compostos da presente invenção. As condições da análise foram em coluna C18 (250 x 4,6 mm), sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina e F2=anularina I.

[0033] A Figura 6 mostra um gráfico do perfil cromatográfico do extrato obtido da cultura do fungo em meio extrato de malte (marca Himedia). As condições da análise foram em coluna C18 (250 x 4, 6 mm), sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 30 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina e F2=anularina I.

[0034] A Figura 7 mostra um gráfico do perfil cromatográfico do extrato obtido da cultura do fungo em Meio Mínimo dos compostos da presente invenção. As condições da análise foram em coluna C18 (250 x 4, 6 mm), em sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina e F2=anularina I.

[0035] A Figura 8 mostra um gráfico do perfil cromatográfico da amostra YPSS obtida da cultura do fungo. As condições da análise foram em coluna C18 (250 x 4,6 mm), em sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina e F2=anularina I.

[0036] A Figura 9 mostra um gráfico do perfil cromatográfico da amostra YESD. Coluna C18 (250 x 4,6 mm), em sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 30 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min.

[0037] A Figura 10 mostra um gráfico do perfil cromatográfico da amostra PYG1, no HPLC em coluna C18 (250 x 4,6 mm), em sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 30 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min.

[0038] A Figura 11 mostra uma Curva padrão para monocerina (fração F1) nos comprimentos de onda de 214, 254 e 280 nm de acordo com as concentrações de monocerina que foi injetada.

[0039] A Figura 12 mostra uma curva padrão para anularina I (fração F2) nos comprimentos de onda de 214, 254 e 280 nm, de acordo com as concentrações de anularina I que foi injetada.

[0040] A Figura 13 mostra a viabilidade celular de células endoteliais HUVEC após o tratamento com monocerina e anularina I nas concentrações de 0,02 a 10 mM, nos tempos de 24, 48 e 72 h. Zero igual ao controle RPMI 1640 correspondente a 100% de viabilidade celular. Análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações). Índice de significância de * p<0,1; ** p<0,05; *** p<0,01 para comparações entre os tratamentos em 24 e 48 h e o grupo controle não tratado (0) . Índice de significância de # p< 0,01%; ## p < 0,05%, ### p< 0,01% e #### p< 0,001% para comparações entre o controle e o tempo de 72 h.

[0041] A Figura 14 mostra a viabilidade celular de fibroblastos normais FN1 após o tratamento com monocerina e anularina I nas concentrações de 0,02 a 10 mM, nos tempos de 24, 48 e 72 h. Zero igual ao controle RPMI 1640 correspondente a 100% de viabilidade celular. Análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações). Índice de significância de * p<0,1; ** p<0,05; *** p<0,01 para comparações entre os tratamentos em 24 e 48 h e o grupo controle não tratado (0) . Índice de significância de # p< 0,01%; ## p < 0,05%, ### p< 0,01% e #### p< 0,001% para comparações entre o controle e o tempo de 72 h.

[0042] A Figura 15 mostra a distribuição de células endoteliais HUVEC nas fases do ciclo celular após o tratamento com anularina I nas concentrações de 0,02; 0,15; 0,625 e 2,5 mM, nos tempos de 6, 24, 48 e 72 h. Zero igual ao tratamento controle com meio de cultura RPMI 1640;

[0043] A Figura 16 mostra uma análise de ciclo celular de HUVECs e fibroblastos FN1 tratados com anularina I de 0,02 a 0, 625 mM a 6, 24, 48 e 72 h. As barras representam as proporções de células proliferativas G2 / M; na síntese da fase S; Célula quiescente G0 / G1 e detritos em sub-G1 (DNA fragmentado). Os dados representam média ± DP de três experimentos independentes. * Significativamente diferente do controle não tratado * p <0,05; ** p <0,01 e *** p <0,001.

[0044] A Figura 17 mostra a distribuição de células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 nas fases do ciclo celular após o tratamento com o composto monocerina nas concentrações de 0,02; 0,15 e 0,625 nos tempos de 24, 48 e 72 h. Zero igual ao tratamento controle com meio de cultura RPMI 1640.

[0045] A Figura 18 mostra a taxa proliferativa de fibroblastos humanos normais FN1 e células endoteliais (EC). O tratamento com anularina I foi incapaz de alterar a proliferação celular de células de fibroblastos, mas para EC o tratamento modificou a capacidade proliferativa celular em todos os tratamentos e tempos. Média ± DP. Análise estatística por teste de comparação múltipla One-way ANOVA / Dunnett (entre concentrações).

[0046] A Figura 19 mostra Western blotting representativo da expressão de VEGF-R1 nas incubações de HUVEC com diferentes concentrações de anularina I (1 e 2: RPMI; 3 e 4: 0,15 μΜ, 5 e 6: 0, 625 μΜ) por 24h. Gliceraldeído trifosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como controle de carregamento.

[0047] A Figura 20 mostra a expressão relativa de proteínas em células HUVEC após tratamento com 0,15 and 0,625 mM de anularina I por 6 e 24 h. Resultados expressos pela proporção de proteínas em relação aos controles (GADPH ou β-Actina (media ± SEM) relativizados com valor de 1.

[0048] A Figura 21 mostra células endoteliais HUVEC senescentes após tratamento com anularina I em 0,02; 0,15 e 0,625 mM. Ensaio realizado por β-galactosidases. Média ± DP por 24 e 48 h. Análise estatística pelo teste de comparação múltipla One-way ANOVA / Dunnett (entre as concentrações). Índice significante *** p <0,01 para comparações de tratamento às 6 e 24 heo grupo controle.

[0049] A Figura 22 mostra a porcentagem de células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 senescentes e não senescentes após tratamento com anularina I ou monocerina nas concentrações de 0,02 a 1,25 mM. Ensaio com β-galactosidase.

[0050] A Figura 23 mostra fotomicrografias representativas de células endoteliais tratadas com anularina I a 0,02 (1B) 0,15 (1C), 0,625 mM (1D) durante 24 h e 0,02 (2B) 0,15 (2C), 0, 625 mM (2D) durante 48 h. Controles de 24 h e 48 h são representados por 1A e 2A, respectivamente. As células em azul são senescentes e incolores são células não senescentes detectadas pelo ensaio da β-galactosidase.

[0051] A Figura 24 mostra um histograma da análise de apoptose em células HUVECs tratadas com monocerina de 0,02 a 1,25 mM. Análise pela marcação dupla com anexina V-FITC/Iodeto de propídeo e por citometria de fluxo. Gráficos representativos do tipo dot plot para cada uma das concentrações testadas. Quadrantes: inferior esquerdo= células viáveis; inferior direito= células em apoptose (anexina-V +); superior direito= células em apoptose tardia (anexina-V + e iodeto de propídeo +; superior esquerdo= células em necrose (iodeto de propídeo +).

[0052] A Figura 25 mostra a determinação de apoptose em células HUVECs pela dupla marcação com anexina V-FITC/Iodeto de propídeo. Distribuição das células em viáveis, em processo de morte celular do tipo necrose, apoptose inicial ou tardia após tratamento com monocerina de 0,02 a 1,25 mM. O controle corresponde a tratamento somente com RPMI 1640.

[0053] A Figura 26A mostra o perfil cromatográfico da purificação da fração monocerina SPE100 pela primeira etapa (A): Método: coluna C18 (250 x 10 mm), sistema de eluição isocrática 48,0% B em 60 minutos e vazão 2,5 mL / min.

[0054] A Figura 26B mostra a monocerina purificada após a segunda etapa de purificação; Método: coluna C18 (250 x 4,6 mm), sistema de eluição isocrática 56,0% B em 30 minutos e taxa de fluxo 1,0 mL / min. Solução A: H2O / TFA (99,9 / 0,1%), solução B: MeOH / H2O / TFA (90: 9,9: 0,1%).

[0055] A Figura 27 mostra uma representação gráfica do tamanho da ferida medida pelo Paquímetro. Tamanho da ferida representado como média ± DP para grupos de animais tratados por 14 dias. n = 80, os dados foram analisados por ANOVA unidirecional seguida de comparações múltiplas de Tukey-Kramer usando o Graph pad Prism 5.1. Os tratamentos foram comparados com o grupo não tratado e não houve diferença estatística significante.

[0056] A figura 28 mostra uma representação gráfica do tamanho da ferida medida pela imagem In Vivo de raios-X (MS-FX Pro). O tamanho da ferida é representado como média ± SEM para grupos de animais tratados por 14 dias. N = 4 animais em cada grupo. Foram utilizados dois animais de cada grupo para medir o tamanho da ferida por MS-Fx Pro. Os dados foram calculados usando o Graph pad Prism 5.1 e os tratamentos foram comparados com o grupo não tratado.

[0057] A Figura 29 mostra uma imagem de raios X in vivo para feridas realizadas por MS FX PRO. Esta figura representa o tamanho das feridas de dois animais por grupo tratado por 24 h, 48 he 72 h. Por comparação com os grupos controle (G1 e G5), é possível observar que as feridas de animais tratados com monocerina a 0,005% começaram a ser bem reduzidas após 72 h;

[0058] A figura 30 mostra uma imagem de raios X in vivo para feridas realizadas por MS FX PRO. Esta figura representa o tamanho das feridas de dois animais por grupo tratado por 7, 10 e 14 dias. Por comparação com os grupos controle (G1 e G5), é possível observar que as feridas de animais tratados com monocerina a 0,005% foram quase totalmente cicatrizadas após 10 dias;

[0059] A Figura 31 mostra fotomicrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura da derme de camundongos tratados por 24 h, 72 h, 7 e 14 dias. Grupo controle não tratado G1): Manutenção da matriz extracelular do fragmento de cicatriz de 24 horas a 14 dias (setas vermelhas); Grupo colagenase (G2): presença de numerosas células mortas e hemácias identificadas de 24 horas a 14 dias (setas azuis); Monocerina 0,0006% (G3): forte formação de fibras colágenas; Monocerina 0,005% (G4): Fibras de colágeno (seta amarela) - fibronectinas observadas de 24 a 14 dias (seta amarela); Veículo (G5): microfibrilas, glóbulos vermelhos, células inflamatórias (seta verde) até o 14° dia;

[0060] A Figura 32 mostra coloração de tecidos de animais a partir de 24 horas de experiências. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Pricosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), monocerina 0,0006% (G3), monocerina 0,005% (G4) e veículo (G5).

[0061] A Figura 33 mostra a coloração de tecidos de animais a partir de 72 h de experiências. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Pricosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), monocerina 0,0006% (G3), monocerina 0,005% (G4) e veículo (G5).

[0062] A Figura 34 mostra a coloração de tecidos de animais a partir de experiências de 7 dias. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Pricosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), monocerina 0,0006% (G3), monocerina 0,005% (G4) e veículo (G5);

[0063] A Figura 35 mostra a coloração de tecidos de animais a partir de experiências de 7 dias. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Pricosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), monocerina 0,0006% (G3), monocerina 0,005% (G4) e veículo (G5);

[0064] A figura 36 mostra o percentual de colágeno presente nos tratamentos em grupo de 24 horas a 14 dias. Dados representados pela média ± SEM para animais em cada grupo (N = 4). Dados analisados por ANOVA unidirecional seguida de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. Os tratamentos com monocerina foram comparados com o grupo não tratado e quando estatisticamente significante são representados por * P <0,005;

[0065] A Figura 37 mostra fotomicrografias da pele de camundongo Balb / C coradas com vermelho de Picrosirius e avaliadas por microscopia polarizada usando um programa padronizado (software de microimagem) Zen Blue 2.6 para captura de imagens. As imagens foram capturadas para tratamento de 24 h, 72 h, 7 e 14 dias, permitindo a observação de todos os constituintes da pele. Birrefringência de cabelos (tons de verde) e colágeno (x10). Ep: epiderme; C: colágenos; D: derme; Gs: glândulas sebáceas; Gp: glândulas sudoríparas; *: cabelos; seta: músculo arrector pili.

[0066] A figura 38 mostra os parâmetros hematológicos para tipos individuais de células sanguíneas. Os indicadores relacionados às hemácias e as células imunes pertencentes à classe de leucócitos foram analisados no sangue periférico a partir de diferentes intervalos de tempo 24h. 7d e 14 d. Os seguintes grupos são ilustrados por diferentes cores de coluna. Grupo controle (branco); Colagenase (cinza); Monocerina 0,0006% (vermelho); Monocerina 0,005% (azul); Veículo (preto).

[0067] A Figura 39 mostra a análise hematológica para tipos individuais de células sanguíneas. Os indicadores relacionados às hemácias e as células imunes pertencentes à classe de leucócitos foram analisados no sangue periférico em diferentes intervalos de tempo 24h, 7d e 14d. Os seguintes grupos ilustram as cores diferentes. Grupo controle (branco); Colagenase (cinza); Monocerina 0,0006% (vermelho); Monocerina 0,005% (azul); Veículo (preto).

[0068] A Figura 40 mostra uma fotomicrografia de tecidos imunocorados com anticorpo contra VEGF nos grupos controle e tratado por 24 h. Para todos os grupos é possível observar a imunorreatividade contra o VEGF (setas), enquanto para os controles negativos não houve imunoreatividade conforme o esperado; A exceção é para a reação de controle negativo para o grupo G1, que também foi imunorreativo, mas de baixa intensidade, conforme o esperado. Barra de escala 40 x 100 μm. Os dados foram analisados medindo os pixels da barra de escala de 1024 x 2048 pixels.

[0069] A Figura 41 mostra uma representação gráfica da área % de histointensidade imune ao VEGF calculada pela Imagem j e dados obtidos calculados pela Origem 9.1.

[0070] A figura 42 mostra uma representação gráfica do tamanho da ferida medida pelo Paquimeter. Tamanho da ferida representado como média ± DP para grupos de animais tratados por 14 dias. n = 80, os dados foram analisados por ANOVA unidirecional seguida de comparações múltiplas de Tukey-Kramer usando o Graph pad Prism 5.1. Os tratamentos foram comparados com o grupo não tratado e não houve diferença estatística significante.

[0071] A figura 43 mostra uma representação gráfica do tamanho da ferida medida pela imagem In Vivo de raios-X (MS-FX Pro). O tamanho da ferida é representado como média ± SEM para grupos de animais tratados por 14 dias. N = 4 animais em cada grupo. Foram utilizados dois animais de cada grupo para medir o tamanho da ferida por MS-Fx Pro. Os dados foram calculados usando o Graph pad Prism 5.1 e os tratamentos foram comparados com o grupo não tratado.

[0072] A figura 44 mostra imagem de raios X in vivo para feridas realizadas por MS FX PRO. Esta figura representa o tamanho das feridas de um animal por grupo tratado por 24 h, 72 h, 7, 10 e 14 dias. Por comparação com os grupos controles, é possivel observar que as feridas de animais tratados com anularina I a 0,003% e 0,0005% foram quase totalmente cicatrizadas após 10 dias.

[0073] A Figura 45 mostra parâmetros hematológicos para tipos individuais de células sanguineas. Os indicadores relacionados às hemácias e as células imunes pertencentes à classe de leucócitos foram analisados no sangue periférico a partir de diferentes intervalos de tempo de 24 h, 7 e 14 dias. Os seguintes grupos são ilustrados por diferentes cores de coluna. Grupo controle (branco); Colagenase (cinza); Anularina I 0,003% (vermelho); Anularina I 0,0005% (azul); Veiculo (preto).

[0074] A Figura 46 mostra Parâmetros hematológicos para tipos individuais de células sanguineas. Os indicadores relacionados às hemácias e as células imunes pertencentes à classe de leucócitos foram analisados no sangue periférico a partir de diferentes intervalos de tempo de 24 h, 7 e 14 dias. Os seguintes grupos são ilustrados por diferentes cores de coluna. Grupo controle (branco); Colagenase (cinza); Anularina I 0,003% (vermelho); Anularina I 0,0005% (azul); Veiculo (preto).

[0075] A figura 47 mostra fotomicrografias obtidas por MEV da derme de camundongos tratados por 24 h, 72 h, 7 e 14 dias. Grupo controle não tratado G1): manutenção da matriz extracelular do fragmento de cicatriz de 24 horas a 14 dias (setas vermelhas); Grupo colagenase (G2): presença de numerosas células mortas e hemácias identificadas de 24 horas a 14 dias (setas azuis); Anularina 0,003% (G3): forte formação de fibras de colágeno; Anularina 0,0005% (G4): Fibras de colágeno (seta amarela) - fibronectinas observadas de 24 horas a 14 dias (seta amarela); Veículo (G5): microfibrilas, glóbulos vermelhos, células inflamatórias (seta verde) até o 14° dia.

[0076] A figura 48 mostra a coloração de tecidos de animais a partir de 24 horas de experiências. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Picrosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), Anularina 0,003% (G3), Anularina 0,0005% (G4) e veículo (G5).

[0077] A Figura 49 mostra a coloração de tecidos de animais a partir de 72 h de experiências. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Picrosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), Anularina 0,003% (G3), Anularina 0,0005% (G4) e Veículo (G5).

[0078] A Figura 50 mostra a coloração de tecidos de animais a partir de experiências de 7 dias. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Picrosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), Anularina 0,003% (G3), Anularina 0,0005% (G4) e Veículo (G5).

[0079] A Figura 51 mostra a coloração de tecidos de animais de experiências de 14 dias. Magnitude de 10x. A) Hemotoxilina e Eosina (H&E); B) Coloração Picrosirius Red (PR) e C) Masson Trichome (MT). Grupo Controle (G1), Colagenase (G2), Anularina 0,003% (G3), Anularina 0,0005% (G4) e Veículo (G5).

[0080] A figura 52 mostra uma ilustração gráfica em 3D de tecidos com coloração vermelha Picrosirius de 24h a 14 dias. Fotomicrografias da pele de camundongo Balb / C coradas com vermelho Picrosirius e avaliadas por microscopia polarizada usando um programa padronizado (software de microimagem) Zen Blue 2.6 para captura de imagem. As imagens foram capturadas para tratamento de 24 h, 72 h, 7 e 14 dias, permitindo a observação de todos os constituintes da pele. Birrefringência de cabelos (tons de verde) e colágeno (x10) . Ep: epiderme; C: colágenos; D: derme; Gs: glândulas sebáceas; Gp: glândulas sudoríparas; *: cabelos; seta: músculo arrector pili

[0081] A Figura 53 mostra o percentual de formação de colágeno induzido por tratamentos com anularina I até 14 dias. Análise pela imagem J 5.1 e dados calculados por prisma gráfico 5.1.

[0082] A Figura 54 mostra a porcentagem de formação de colágeno induzida por tratamentos com monocerina até 14 dias. Análise pela imagem J 5.1 e dados calculados por prisma gráfico 5.1.

[0083] A Figura 55 mostra uma representação gráfica 3D de tecidos usando microscópio polarizado. Quantificação da formação de colágeno por monocerina a 0,0006% e 0,005% e tratamentos de anularina I a 0,0005% e 0,003%. A área ocupada por fibras de colágeno foi quantificada usando o Image J e o software Graph Pad Prism 5.1. As fibras de colágeno exibiram cores de polarização no vermelho-laranja, enquanto para os controles as fibras de colágeno eram esparsas e imaturas. O controle do grupo não tratado exibiu intensa birrefringência verde - amarela, sugerindo que o conteúdo de colágeno foi reduzido e suas fibras estavam muito frouxamente compactadas. Fibras verdes - típicas do colágeno tipo III foram mais frequentemente localizadas na derme superior e na epiderme nos grupos tratados com anularina. Os grupos controle (controle, colagenase e veículo) apresentaram fibras grossas vermelhas e amarelas (típicas do colágeno tipo I) localizadas na derme profunda inferior. No geral, os grupos tratados com monocerina e anularina I mostraram arranjo de fibras colágenas visíveis e organizadas dos grupos tratados com anularina.

Descrição Detalhada da Invenção

[0084] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes concretizações, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma concretização preferida com o entendimento de que a presente concretização deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito neste relatório.

[0085] A presente invenção se refere ao uso de metabólito secundário produzido pelo fungo Exserohilum rostratum na regeneração celular. Particularmente, a presente invenção se refere ao uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I obtidos a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum para regeneração celular tendo como referência o efeito em células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1.

[0086] Basicamente, a presente invenção se refere ao uso de metabólito secundário, tais como monocerina e anularina I produzido pelo fungo Exserohilum rostratum, como agente indutor de proliferação celular, processo de fundamental importância no reparo de tecidos, como, por exemplo, na cicatrização de feridas.

Produção e purificação dos metabólitos secundários, monocerina e anularina I a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum

[0087] Para a produção de metabólitos secundários, o fungo E. rostratum foi cultivado em meio de cultura batata dextrose por 15 dias a 28°C e 150 rpm, e o caldo/sobrenadante da cultura foi submetido a extração em fase sólida (Solid Phase Extraction - SPE) com cartucho C18 (Spe-ed SPE Cartridges - Octadecyl C18/18%), e o material retido foi extraído com metanol a 100% resultando o extrato bruto.

[0088] Este extrato apresentou ação antifúngica contra Cryptococcus neoformans ATCC 90112, Trichophytum rubrum IOC 4527, Candida albicans ATCC 36802 e Aspergillus fumigatus IOC 4526 (CLSI, 2002a,b) com concentrações inibitórias mínimas de 31,25 a 500 pg/mL (Tabela 1).
Tabela 1. Ação antifúngica do extrato bruto e dos compostos monocerina e anularina I produzidos pelo fungo E. rostratum (CIM em pg/mL)

[0089] Para fracionamento, o extrato bruto foi submetido à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em coluna C8 (250 x 10 mm) e sistema de eluição isocrática variando de 44 a 60% com fluxo de 2,5 a 4 mL/min (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%) e duas frações principais foram obtidas e repurificadas usando coluna fenil (250 x 4,6 mm) e eluição isocrática de 44 a 60%. As frações F1 e F2 obtidas puras foram avaliadas em relação à ação antifúngica, e físico-quimicamente caracterizadas por ressonância magnética nuclear de 2H e 23C e espectrometria de massas como sendo os compostos monocerina - (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil-2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona, e anularina 4-metoxi-5-metil-6-butil-2H-piran-2-one, respectivamente, conforme estruturas representadas na Figura 1. A caracterização foi realizada com a colaboração do Prof. Roberto Berlinck do IQSC/USP.

[0090] Esta anularina também foi obtida por outros pesquisadores e denominada como anularina I (Pinheiro et al, 2016). Seguindo a nomenclatura do grupo de anularinas até então descritas (A-H), na sequência esta seria anularina I. Esta molécula difere estruturalmente das anularinas A-H anteriormente descritas e tem um CH2 a mais em relação a anularina D.

Caracterização físico-química da monocerina e anularina I: Monocerina (nome IUPAC): (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8- dimetoxi-2-propil-2,3,3a,9b-tetra-hiclro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona

[0091] 1H RMN (499, 8 MHz, CDCl3): δ 11,17 (s, OH); 6,85 (s, 1H); 5,20 (dd, 6,0 e 3,2Hz, 1H); 4,6 (d, 3,2 Hz, 1H); 4,00 (m, 1H); 3,89 (s, OCH3); 3,71 (s, OCH3); 2,60 (ddd, 14,5; 8,4 e 6,0 Hz, 2H); 1,90 (dd, 8,4 e 6,0 Hz, 2H); 1,47 (m, 2H); 1,26 (m, 2H); 0,84 (t, 7,3 Hz, 3H). 13C NMR (125,7 MHz, CDCl3): δ 168,1; 158,8; 155,3; 136,7; 132,4; 105,7; 102,0; 82,0; 77,9; 73,9; 60,4; 56,8; 38,8; 38,3; 19,1; 14,4. EM: M+ = 3 0 8,1; [M-C3H7] +=265,1

Anularina I (nome IUPAC): 4-metoxi-5-metil-6-butil-2H-piran-2-ona

[0092] 3H RMN (499, 8 MHz, CDCl3): δ 5,53 (s, 1H), 2,27 (t, 6,4 Hz, 2H), 1,29 (m, 4H), 0,86 (t, 7,7 Hz, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,16 (s, 3H)· 13C NMR (125,7 MHz, CDCl3) δ 170,8; 163,4; 158,3; 111,1; 87,8; 57,0; 31,4; 23,6; 22,2; 17,2; 14,1. EM: M+ = 196,1; [M-C2H3O] +=153,0.

[0093] A Figura 1 mostra as estruturas dos compostos anularinas A-H (1-8) descritas na literatura e obtidas a partir da cultura do fungo aquático Annulatascus triseptatus, da monocerina (F1) e da anularina I (F2) obtidas a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum.

Anularina e monocerina — origem e atividade biológica

[0094] Na literatura, são poucos os relatos sobre o isolamento e síntese de monocerinas, assim como as atividades biológicas já descritas para este composto. Para as anularinas os relatos são ainda mais escassos. As monocerinas (12S)-12-hidroximonocerina e (12R)-12-hidroximonocerina já foram isoladas do fungo endofítico Microdochium bolleyi e E. rostratum junto com a monocerina (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil-2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona (Sappapan et al., 2008; Zhang et al., 2008) que também já foi isolada de outras fontes, como da cultura de E. turcum (Robeson e Strobel, 1982; Cuq et al., 1993), Helminthosporium monoceras (Claydon et al., 1979), Fusarium larvarium (Claydon et al., 1979; Grove e Pople, 1979), e de Dreschlera ravenelli (Scott et al., 1984).O estudo do metabolismo secundário do fungo E. rostratum levou a identificação de fitotoxinas com ação herbicida (Tan et al., 2004), e do extrato bruto da extração com acetato de etila, o derivado de isocumarina 11-hidroximonocerina foi isolado junto com 12-hidroximonocerina e monocerina cuja potencial ação antimalárica (IC50 de 0,68 μΜ) e de seus análogos foi pela primeira vez descrita (Sappapan et al., 2008). As monocerinas tem ainda ação antifúngica, inseticida e fitotóxica (Sappapan et al., 2008).

[0095] Da cultura do fungo aquático A. triseptatus, o extrato obtido da extração com acetato de etila apresentou ação antifúngica e antibacteriana e o estudo químico resultou no isolamento de 8 compostos, denominados como anularinas A-H (Figura 1) e classificados como metabólitos policetídeos (Li et al., 2003). As anularinas A-F são α-pironas 3,4,5-trisubstituídas e as anularinas G-H são γ-lactonas 3,4-disubstituídas α,β-insaturadas. As anularinas A, B, C e F inibiram o crescimento de Bacillus subtilus (ATCC 6051) induzindo halo de 8-10 mm com 200 μg/disco testado e nesta mesma concentração, a anularina C inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus (ATCC 29213) com halo de 14 mm. Nenhum composto apresentou ação contra C. albicans (ATCC 90029) e com exceção dos compostos D e E (não testados) os demais não foram efetivos contra A. flavus (NRRL 6541).

[0096] Anularinas A-F são α-pironas, membros de uma classe geral comumente encontrada em fungos. Um estudo para a síntese de anularinas foi proposto por Motodate et al., (2010) e a síntese total de anularina F foi relatada pela primeira vez em 2006 (Kurdyumov et al., 2006). Biogeneticamente, as anularinas A-F são presumivelmente derivadas da via de policetídeo e existe a hipótese de que as anularinas G e H tenham origem em uma via biossintética análoga, mas com uma diferente etapa de fechamento do anel.

[0097] De forma semelhante, a monocerina tem origem como heptacetídeo, o que foi demonstrado em um estudo de biossíntese dessa molécula com a incorporação de acetatos marcados com 2H, 13C e 18O em D. ravenelii (Scott et al., 1984).

[0098] Considerando os dados da literatura, a monocerina e a anularina I obtidas na presente invenção a partir da cultura do fungo E. rostratum podem ter sido biossintetizadas pela via de policetídeos. Diversos compostos policetídeos são descritos como potentes antibióticos, antitumorais, antifúngicos, agentes imunossupressores e antivirais (Yadav et al., 2003). Este contexto reforça a relevância da investigação dos efeitos biológicos desses dois compostos e constitui um desafio, principalmente para a anularina I ainda pouco estudada. Estudos preliminares da monocerina e anularina I produzidas pelo fungo E. rostratum.

[0099] A monocerina inibiu o crescimento do fungo dermatófito T. rubrum, da levedura Candida albicans e do fungo filamentoso Aspergillus fumigatus com CIMs de 15 a 500 μg/mL. A anularina I inibiu o crescimento do dermatófito T. rubrum somente a 250 pg/mL, e não foi efetiva sobre C. albicans e A. fumigatus até a concentração de 500 μg/mL (ver Tabela 1).

[00100] A ação antifúngica para a monocerina e anularina I não é significativa quando comparada com compostos antifúngicos de uso na clínica. Como alternativa de aplicação, a atividade citotóxica foi avaliada em células da linhagem tumoral K562 (leucemia eritrocítica crônica) e B16F10 (melanoma murino) pelo ensaio do MTT que avalia a viabilidade celular pela ação da enzima mitocondrial succinato desidrogenase (Mosmann, 1983).

[00101] A monocerina e a anularina I, até a concentração de 2 mM, não diminuíram a viabilidade celular de forma significativa nas células K-562 (leucemia humana) e B16F10 (melanoma murino), e em algumas concentrações promoveram proliferação celular. Este efeito de indução de proliferação celular foi um resultado não esperado; porém, muito relevante e interessante do ponto de vista de aplicação terapêutica.

[00102] Para confirmação deste efeito, ensaios para análise da capacidade proliferativa da monocerina e da anularina I foram realizados em células endoteliais da veia do cordão umbilical humano (HUVEC), também pelo método do MTT, e por observação da morfologia por microscopia. O resultado anterior foi confirmado, e nestas células, a monocerina e a anularina I induziram proliferação na proporção de duas e cinco vezes, respectivamente, em relação ao controle. Pela análise morfológica foi possível observar células em multiplicação celular, como representado na Figura 2 para o composto anularina I. A viabilidade celular também foi avaliada para estes dois compostos em macrófagos J774 até a concentração de 1 mM. A monocerina induziu perda da viabilidade celular com somente 50% das células viáveis na concentração de 45 μΜ (IC50) e a anularina I não foi tóxica para as células que permaneceram totalmente viáveis até a máxima concentração testada de 1 mM.

[00103] A Figura 2 mostra as células endoteliais HUVEC em processo de multiplicação celular. Controle (A) e tratamentos das células com a anularina I em mM, B (0,07), C (0,14), D (0,28), E (0,56), e F (1,12). Setas na cor vermelha indicam células em processo de multiplicação celular e na cor preta células em processo de apoptose.

[00104] Considerando estes dados, e a perspectiva para um estudo mais aprofundado da aplicação da anularina I como agente indutor de proliferação celular, processo de fundamental importância no reparo de tecidos, como, por exemplo, na cicatrização de feridas, novos ensaios foram realizados em células endoteliais HUVEC e em fibroblastos normais FN1.

[00105] Em estudo paralelo foi realizado a cultura do fungo E. rostratum em diferentes condições para otimização da produção dos metabólitos secundários monocerina e anularina I.

Procedimento experimental para otimização da produção dos compostos monocerina e anularina I Cultura do fungo e processo de extração dos Metabólitos Secundários (MS)

[00106] O fungo E. rostratum foi cultivado em placa contendo meio de cultura batata dextrose ágar (BDA) por 7 dias, e em estufa a 28°C. Posteriormente, com o auxílio de alças de Pasteur descartáveis e estéreis, a colônia foi fragmentada e transferida cuidadosamente para frasco erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL dos meios de cultura líquidos: Batata Dextrose (BD), Meio Czapek Dox CD), Meio Mínimo (MM), Extrato de Malte 2% marca Synth (EMS), Extrato de Malte 2% marca Himedia (EMH), YPSS, YESD e PYG. A cultura foi realizada em duplicata por 15 dias a 28°C, e a 150 rpm.

[00107] Após a cultura, em cabine de biossegurança nível II, a suspensão fúngica foi filtrada em membrana de poliéster ou algodão (gaze) (filtração 1) e posteriormente em lã de vidro (filtração 2) para remoção da maior proporção de biomassa, e o pH do sobrenadante foi medido com fita indicadora de pH.

[00108] O sobrenadante da cultura (filtrado 2) foi transferido para garrafas plásticas de 500 mL e congelado a -20°C por pelo menos 48 horas. A etapa de congelamento é importantíssima para a precipitação de pequenas partículas como resíduos de esporos e/ou células não removidos na filtração 2. Em seguida, o filtrado 2 foi submetido à nova filtração em membrana de fibra de vidro com porosidade de 1 μm (filtração 3) e então submetido a extração em fase sólida (EFS). Para a EFS (ou SPE), cartuchos C18 (Octadecyl C18/18% - 50 mg/6mL) foram condicionados com metanol P.A. a 100%, lavados com água destilada e o filtrado 3 foi sendo adicionado ao cartucho com auxílio de bomba de vácuo. O produto retido no cartucho foi extraído com metanol P.A. 100% resultando no extrato bruto. Após a extração, o solvente do extrato foi totalmente removido por rotaevaporação sob vácuo em banho-maria na temperatura máxima de 45°C.

[00109] A extração pode ser também por extração líquido-líquido (ELL) usando solventes como acetato de etila, hexano, diclorometano, etc. assim como a extração pode ser também em fase sólida usando discos de Octadecil C18/18%. Além de Octadecyl C18/18%, a extração seria eficiente usando cartuchos ou discos com algum dos sorventes comercialmente disponíveis e baseados em grupos orgânicos, como C18, C8, C4, C2, cicloexil, fenil, cianopropil, aminopropil (NH2), ligados quimicamente à sílica.

[00110] As vantagens apresentadas pela EFS em comparação com a extração líquido-líquido clássica são: menor consumo de solvente orgânico, não formação de emulsões, facilidade de automação, altas porcentagens de recuperação do analito, volumes reduzidos de resíduos tóxicos, capacidade de aumentar seletivamente a concentração do analito e disponibilidade comercial de muitos equipamentos e sorventes para EFS.
Análise Instrumental
Os extratos obtidos de cada cultura nos diferentes meios foram pesados e dissolvidos em metanol na concentração de 5 mg/mL para serem analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/HPLC) de fase reversa, em coluna C18 (250 x 4,6 mm) e sistema de eluição isocrática com 56,0 % de fase móvel B em 30-35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%). Por CLAE duas frações principais F1 (monocerina) e F2 (anularina I) foram detectadas e o perfil cromatográfico foi analisado para quantificação da porcentagem dos compostos. A quantificação dos compostos monocerina e anularina I presentes nos extratos foi determinada por comparação a uma curva padrão previamente estabelecida.

[00111] Conforme apresentado na Tabela 2, as massas brutas dos extratos obtidos foram quantificadas e os valores estão apresentados pela média da cultura em duplicata ± o desvio padrão.

[00112] Embora o inóculo seja estimado, de forma a conter o mesmo número de unidades formadoras de colônias por inóculo, pode se observar, que para o meio Czapeck houve grande diferença nos valores da massa obtida resultando em um alto valor do desvio padrão. Até o momento não temos explicação para este fato.

[00113] Após a cultura do fungo E. rostratum nos diferentes meios de cultura, os valores de pH dos filtrados 2 das culturas foram medidos com fita indicadora de pH e os valores estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Massa bruta em miligramas dos extratos obtidos para os diferentes meios de cultura usados no cultivo do fungo E. rostratum e valores de pH.

*Valor médio das duplicatas, SD=desvio padrão.

[00114] Comparando com a massa dos compostos monocerina e anularina I obtidos de diferentes meios de cultura pode-se observar a relação do pH com a produção desses metabólitos secundários. O meio BD que apresentou maior rendimento possui o pH na faixa de 5,5. Os meios em extrato de malte, YPSS, YESD e PYG possuem o pH na faixa 7,0-9,0 e além dos compostos monocerina e anularina I também induziram a produção de outros metabólitos detectados nas condições da corrida cromatográfica e presentes nos respectivos cromatogramas. Portanto, pode-se concluir que o pH ácido na faixa de 5,5 é um fator importante para a produção dos compostos de interesse e pode ser estudado mais detalhadamente.

[00115] Os extratos obtidos de cada cultura foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC) e os perfis cromatográficos estão representados nas figuras 3 a 10.

[00116] De acordo com o perfil cromatográfico do extrato das culturas em meio líquido BD apresentado na figura 3, os dois compostos de interesse, monocerina e anularina I foram produzidos, e nas condições cromatográficas usadas no estudo a presença de outros compostos não foi detectada.

[00117] O perfil cromatográfico das amostras obtidas do meio de cultura Extrato de Malte 2% (marca Synth - EMS) é apresentado na figura 5. Para este meio de cultura, os dois compostos monocerina e anularina I foram detectados, entretanto, a anularina I apresentou baixa absorbância indicando a baixa concentração na amostra. Para a cultura neste meio, pelo método de análise outros MS interferentes não foram detectados.

[00118] A figura 4 representa o perfil cromatográfico dos extratos obtidos das culturas em meio Czapek Dox (MC). Pode-se observar que o extrato não continha MS além daqueles esperados, porém, o mesmo não induziu a produção do composto anularina I.

[00119] A Figura 5 mostra o perfil cromatográfico do extrato obtido da cultura em meio extrato de malte (marca Synth). Coluna C18 (250 x 4, 6 mm), sistema de eluição isocrática 56,0 % de B em 35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e com fluxo de 1 mL/min. F1=monocerina e F2=anularina I.

[00120] Os compostos monocerina e anularina I foram detectados nos extratos produzidos no meio de cultura em extrato de malte (marca Himedia - EMH) (figura 6), entretanto, apresentou outros compostos.

[00121] A figura 7 representa o perfil cromatográfico do extrato obtido do meio de cultura mínimo (MM). No meio de cultura MM além dos compostos monocerina e anularina I outros compostos foram detectados, porém a anularina I foi detectada com baixa absorbância, indicando baixa concentração.

[00122] As figuras 8, 9 e 10 representam o perfil cromatográfico dos extratos obtidos das culturas em meios YPSS, YESD e PYG, respectivamente. Para estes extratos, as frações foram detectadas, porém com absorbâncias muito baixas indicando a baixa concentração dos compostos presentes no extrato. Além disso, outros compostos não identificados pelo nosso grupo também foram detectados.

Quantificação dos compostos monocerina e anularina I produzidos nos diferentes meios de cultura

[00123] Para a quantificação dos compostos monocerina e anularina I presentes nos extratos orgânicos, uma curva padrão com estes compostos, previamente obtidos, foi preparada utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/HPLC) em coluna C18 250 x 4, 6 mm, em sistema de eluição isocrática 56,0 % de fase móvel B em 35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%) e detecção a 214 nm, 254 nm e 280 nm.

[00124] Inicialmente, os compostos monocerina e anularina I foram pesados, dissolvidos em metanol puro grau espectroscópico na concentração de 5 mg/mL, e em seguida as soluções foram diluídas para concentrações de 1 a 12,5 μg/10 μL para se estabelecer uma curva linear (ver Tabela 5).

[00125] Os compostos monocerina e anularina I nas diferentes concentrações foram injetados no HPLC, em volume de 10 μL, em duplicata, e eluídos em coluna C18 250 x 4,6 mm, em sistema de eluição isocrática 56,0 % de fase móvel B em 35 minutos (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%) e detecção a 214 nm, 254 nm e 280 nm.

[00126] Os valores da área sob a curva para cada composto, nos comprimentos de onda de 214 nm, 254 nm e 280 nm foram calculados e usados para a elaboração da curva padrão.
Tabela 5. Dados utilizados para elaboração das curvas padrão para 214, 254 e 280 nm para a monocerina (F1).

mAU= mili absorbância
Tabela 6. Dados da regressão linear para a fração F1 (monocerina) nos comprimentos de onda de 214, 254 e 280 nm. Intensidade da área.

[00127] Equação reta para monocerina (214 nm): y = 49,234x - 8,0952, ou x= y + 8,0952/49,234.
Tabela 7. Dados utilizados para elaboração das curvas padrão para 214, 254 e 280 nm para a anularina I (F2). Intensidade da área sob a curva em mAU.

mAU= mili absorbância
Tabela 8. Dados da regressão linear para anularina I (fração F2). Intensidade da Área sob a curva em mAU.

mAU= mili absorbância; Equação da reta para anularina I (214 nm): y = 45,328x + 45,577, ou x= y - 45,577/45,328;

[00128] Tanto para monocerina como para anularina I, as curvas padrão apresentaram coeficiente de correlação (R2) > 0,99 atendendo o requisito da resolução de conformidade da Anvisa RE 899 de 2003.

[00129] Para a monocerina e anularina I com base no coeficiente de correlação, o comprimento de onda de 214 nm foi o que apresentou maior resolução e, portanto, foi utilizado para a quantificação desses compostos nos extratos, respectivamente.

[00130] Após serem efetuadas as análises dos extratos das culturas em diferentes meios, por CLAE/HPLC, a concentração dos compostos monocerina e anularina I produzidos em cada cultura foi calculada considerando a área (mAU) de acordo com cada intensidade de absorbância apresentada (altura por mAU) para a monocerina (F1) e anularina I (F2) em 214 nm, de acordo com as tabelas 13, 14, e 15 e com as equações das retas (abaixo) e calculadas para cada curva padrão dos compostos.

[00131] Equação para monocerina (214 nm): y = 49,234x - 8,0952, ou x= y + 8,0952/49,234

[00132] Equação para anularina I (214 nm): y = 45, 328x + 45,577, ou x= y - 45,577/45,328
Tabela 9. Determinação da área sob a curva (mAU) e da absorbância (mAU) das frações F1 (monocerina) e F2 (anularina I) em 214 nm, presentes nos extratos da fração SPE100.

*absorbância indetectável
Tabela 10. Determinação da área sob a curva (mAU) e da absorbância (mAU) das frações F1 (monocerina) e F2 (anularina I) em 254 nm, presentes nos extratos da fração SPE100.

Tabela 11. Determinação da área sob a curva (mAU*mL) e da absorbância (mAU) das frações F1 (monocerina) e F2 (anularina I) em 280 nm, presentes nos extratos da fração SPE100.

Comparação da massa de monocerina e anularina I produzidas, em porcentagem, nos diferentes meios de cultura.

[00133] Para cada meio de cultura foi calculado a porcentagem de monocerina e de anularina I produzida e o resultado final (Tabelas 12-14) mostra que a ordem de rendimento para a monocerina a partir do extrato bruto foi BD > EM > MM > YESD > PYG > YPSS e para anularina I foi BD > EM >>>> demais meios.

[00134] Alguns resultados apresentaram valores negativos para os MS monocerina e anularina I devido à baixa concentração presente no extrato.
Tabela 12. Valores das concentrações de monocerina (área sob a curva em 214 nm) de acordo com a equação da reta y = 49,234x - 8,0952, ou x= y + 8,0952/49,234.

Tabela 13A. Cálculo da porcentagem média de monocerina produzida pela cultura do fungo Exserohilum rostratum nos diferentes meios de culturas. Cálculo considerando todos os dados da Tabela 16.

Tabela 13B. Cálculo da porcentagem de monocerina nos extratos brutos excluindo alguns dados

Tabela 14. Valores das concentrações de anularina I (área sob a curva em 214 nm) de acordo com a equação da reta y = 45,328x + 45,577, ou x= y - 45,577/45,328.

*absorbância não detectável, portanto não existe pico e nem área sob a curva, e nem massa detectada.
Tabela 15A. Cálculo da porcentagem média de anularina I produzida pela cultura do fungo Exserohilum rostratum nos diferentes meios de culturas. Cálculo considerando todos os dados positivos da Tabela 17.

*Nos meios MM, MC, PYG e YPSS o fungo Exserohilum rostratum não produziu anularina I.

Avaliação do tempo de cultura mais adequado para a produção dos compostos monocerina e anularina I.

[00135] Colônias do fungo E. rostratum foram adicionadas em tubo de ensaio de 50 mL contendo 10 mL de solução salina e a suspensão homogeneizada. Para os inóculos, 1 mL da suspensão foi adicionado a erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio batata dextrose (BD), que foram incubados em shaker a 28°C e 150 rpm. Os frascos foram mantidos em cultura por 2, 3, 7, 10, 15, 21 e 28 dias.

[00136] Nos tempos específicos, os frascos foram retirados da cultura e a biomassa removida por filtração em membrana de poliéster (filtração 1), e em seguida em membrana de fibra de vidro de 50 mm e porosidade de 1 μm (filtração 2) com auxílio de bomba de vácuo.

[00137] Os sobrenadantes das culturas foram aplicados em cartuchos de extração em fase sólida (SPE) de 500 mg/6 mL previamente condicionados (com três aplicações de metanol puro e água destilada), respectivamente e a extração do material retido foi realizada com metanol a 25, 50, 75 e 100%, sem TFA. Para 25, 50 e 75% foram usados um volume de coluna para a extração. Para 100% usou-se três volumes de coluna deixando a sílica secar no final do procedimento.

[00138] O material extraído foi totalmente seco em rotaevaporador e as frações SPE25, SPE50, SPE75 e SPE100 foram obtidas.

[00139] As frações foram ressuspendidas em 400 μL de metanol com pureza analítica (grau espectroscópico - HPLC) e 5 μL de cada amostra foram injetados em cromatógrafo líquido (HPLC). A eluição foi realizada com método gradiente de 0 a 100 % de B em 30 minutos. O perfil analítico permitiu detectar a presença ou não dos compostos monocerina e anularina I, e comparar as suas proporções em cada fração.

[00140] Os compostos monocerina e anularina I presentes nas frações SPE foram purificados por HPLC em coluna C18 ou fenil (250x46 mm) em método isocrático de 4850% de fase móvel B em 50 ou 55 minutos com detecção a 214, 254 e 280 nm. O pool resultante das coletas foi submetido a rotaevaporação para eliminação do solvente e obtenção dos compostos totalmente puros e secos.

[00141] O rendimento de cada cultura, nos diferentes tempos, e dos respectivos compostos monocerina e anularina I estão representados na tabela 16.

[00142] Pode-se concluir que nos tempos de 2 e 3 dias não ocorreu a produção dos compostos monocerina e anularina I que não foram obtidos pelo método de extração empregado e consequentemente não detectados por HPLC.

[00143] Os compostos monocerina e anularina I não foram extraídos por extração com 25% de metanol, e, portanto, esta porcentagem de metanol pode ser usada para remoção de resíduos de meio de cultura que possa ter sido retido na fase estacionária do cartucho.

[00144] Os compostos obtidos das frações SPE75 e SPE100 de cada tempo de cultura foram purificados e a massa quantificada para análise do tempo de cultura com maior rendimento na produção dos compostos.

[00145] Pela análise dos dados pode-se concluir que o tempo de 15 dias é o mais efetivo para a produção do extrato bruto e também para os compostos monocerina e anularina I.

[00146] Como esperado, o tempo de 21 e de 28 dias não são adequados porque provavelmente a cultura entra em fase de declínio e morte das células fúngicas, e consequentemente ocorre baixo rendimento dos compostos de interesse que podem estar sendo de alguma forma degradados no meio.

[00147] Para cada 1,824 mg de monocerina obteve-se 1 mg de anularina I confirmando a proporção de maior produção de monocerina durante a cultura.
Tabela 16. Rendimento das culturas do fungo E. rostratum em meio de cultura batata dextrose nos tempos de 2 a 28 dias, a 150 rpm e 28°C.

ND - não determinado; SPE=extração em fase sólida

[00148] De acordo com os resultados obtidos, o meio de cultura batata dextrose (BD) foi considerado o mais adequado para a cultura do fungo Exserohilum rostratum e maior rendimento na obtenção dos metabólitos secundários monocerina e anularina.

[00149] Também se pode observar melhor efetividade da cultura em pH na faixa de 5,5-6,0.

[00150] O tempo de cultura mais adequado é de 15 dias porque favorece a produção dos compostos monocerina e anularina I.

EFEITO BIOLÓGICO Estudo da capacidade regenerativa endotelial do metabólito secundário anularina I produzida pelo fungo Exserohilum rostratum

[00151] O conjunto de resultados indica que a monocerina induz maiores efeitos citotóxicos em relação à anularina I em células endoteliais, sendo capaz de modificar a proporção de células em G0/G1 e células com DNA fragmentado.

[00152] A anularina I se mostrou um composto com potencial na indução de proliferação em células endoteliais, manutenção da proporção de células em G0/G1, diminuição das células com DNA fragmentado e indução de senescência que pode significar a manutenção de células em proliferação. Esses efeitos foram acompanhados pela expressão diferencial de proteínas que regulam os pontos de controle e progressão do ciclo celular.

Cultura das células endoteliais e fibroblastos

[00153] As células endoteliais usadas no estudo são da linhagem ATCC CRL-1730/HUVEC, e as células de fibroblastos normais humanos FN1 foram em estudo anterior isoladas da pálpebra de olho obtida de cirurgia de blefaroplastia na Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e os procedimentos aprovados pelo Conselho de Ética (Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa do HCFMUSP - CAPPesq HCFMUSP No. 921/06). Essas células foram estabelecidas em cultura, congeladas e armazenadas para uso por tempo indefinido após a reativação em cultura.

[00154] As células foram cultivadas a 37°C em meio RPMI-1640 contendo suplementos (SFB 5-10%, penicilina e estreptomicina), e em atmosfera úmida e 5% de CO2. Após a subconfluência, as células foram processadas e ressuspensas em meio de cultura RPMI-1640 com SFB e antibióticos. Para cada ensaio, a concentração celular foi ajustada de acordo com a recomendação necessária.

Preparação dos compostos anularina I e monocerina

[00155] Para uso nos ensaios em cultura celular, os compostos monocerina e anularina I foram dissolvidos em dimetilsulfóxido, filtrados em membrana de celulose regenerada de 0,22 μm e armazenados em alíquotas, a -20 °C. No momento do uso, os compostos foram diluídos em tampão fosfato de sódio (PBS) a 10 mM, e em seguida em meio de cultura RPMI 1640 (sem SFB e com antibióticos) nas concentrações desejadas para cada ensaio.

Avaliação da viabilidade celular pelo ensaio do MTT

[00156] Para o ensaio de viabilidade celular as células HUVEC e FN1 em meio de cultura RPMI-1640 foram plaqueadas em placas de 96 cavidades e fundo chato, na concentração de 1x104 células/cavidade. Após adesão, o meio de cultura foi removido e as células foram tratadas com monocerina ou anularina I nas concentrações de 0,02 a 10 mM. Após 24, 48 e 72 h a viabilidade celular foi avaliada por leitura da absorbância a 540 nm de acordo com protocolo anteriormente descrito (Mosmann, 1983) e as figuras 13 e 14 representam os valores das porcentagens de células viáveis após os tratamentos.

[00157] A análise estatística mostra que até 5 mM o efeito da anularina I sobre as células HUVEC não é estatisticamente diferente do controle até o tempo de 48 h, com exceção do tratamento a 0,04 mM que induziu proliferação celular.

[00158] As células HUVEC tornam-se mais sensíveis ao tratamento com anularina I somente no tempo de 72 h e para a concentração de e/ou acima de 1,25 mM. Para 0,625 mM, em torno de 88% das células permaneceram viáveis em todos os tempos de tratamento. Para o tempo de 24 h a viabilidade celular foi de 71,34; 65,74 e 55,97 para tratamentos com 1,25; 2,5 e 5 mM, respectivamente conforme apresentado na Tabela 17.
Tabela 17. Representação da porcentagem de células HUVEC viáveis pelo método do MTT (média ± SD), após tratamento com anularina I e monocerina nas concentrações de 0,02 a 10 mM.

[00159] Para os tratamentos em 24 e 48 h, as células endoteliais HUVEC foram pouco sensíveis à ação da monocerina. Em 24 h, a viabilidade celular foi diferente do tratamento controle somente para 10 mM e para 48 h, a partir de 2,5 mM.

[00160] Com relação ao tempo de 72 h a viabilidade celular foi diferente do controle para todas as concentrações de monocerina testadas. Para as concentrações de 0,02; 0,04; 0,15; 0,32; 0, 625 e 1,25 mM para o tratamento de 24 h, 99,04; 99,55; 100,02; 95,61; 95,84 e 83,73% das células estavam viáveis, respectivamente. Para 0,08 mM houve proliferação celular com maior número de células que no grupo controle, porém este valor não é estatisticamente significante.

[00161] Em fibroblastos FN1 tratados com anularina I a viabilidade celular apresenta valores próximos tanto para 24 h, como para 48 h. A partir de 0, 625 mM a viabilidade celular é estatisticamente diferente da do grupo controle no tempo de 24 h, e para 48 h somente a 10 mM. Para o tratamento de 72 h a viabilidade celular é reduzida a partir de 0,08 mM de anularina. Para 2,5 mM de anularina haviam 58,13 ± 9,94%; 69,19 ± 10,54% e 68,53±8,31% de células viáveis, com os tratamentos por 24, 48 e 72 h, respectivamente conforme mostrado na Tabela 18. Para 5 mM, nos tempos de 24 e 48 h de tratamento ainda haviam 62,63 ± 16,20 e 67,68 ± 7,86% de células viáveis, respectivamente. Para 10 mM, em 24 h, 53,25 ± 11,07 % das células estavam viáveis.
Tabela 18. Representação da porcentagem de fibroblastos FN1 viáveis pelo método do MTT (média ± SD), após tratamento com anularina I e monocerina nas concentrações de 0,02 a 10 mM.

[00162] Para monocerina, em fibroblastos FN1 a viabilidade celular é diferente da do controle a partir de 0,15 mM nos tempos de 48 h e 72 h. Em 24 h somente a partir de 2,5 mM. A partir de 2,5 mM, em 24 h, a viabilidade celular de fibroblastos era inferior a 50%. Para os tempos de 48 e 72 h, com 0, 625 mM de monocerina havia em torno de 40% de viabilidade celular.

[00163] Os dados mostram que em fibroblastos FN1, a monocerina é menos citotóxica que a anularina I. Porém, em células endoteliais HUVEC ocorre efeito inverso. Pode-se observar baixa citotoxidade induzida pela anularina, e até 0,32 mM o índice de viabilidade celular está próximo a 100%.

[00164] Como esperado, a maior citotoxicidade foi observada com 10 mM de anularina I e de monocerina em todos os tempos de tratamento.

[00165] A Figura 13 apresenta dados de viabilidade celular de células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 após o tratamento com monocerina nas concentrações de 0,02 a 10 mM, nos tempos de 24, 48 e 72 h. Zero igual ao controle RPMI 1640 correspondente a 100% de viabilidade celular. Análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações). Índice de significância de * p<0,1; ** p<0,05; *** p<0,01 para comparações entre os tratamentos em 24 e 48 h e o grupo controle não tratado (0) . Índice de significância de # p< 0,01%; ## p < 0,05%, ### p< 0,01% e #### p< 0,001% para comparações entre o controle e o tempo de 72 h.

[00166] A Figura 14 mostra dados de viabilidade celular de células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 após o tratamento com anularina I nas concentrações de 0,02 a 10 mM, nos tempos de 24, 48 e 72 h. Zero igual ao controle RPMI 1640 correspondente a 100% de viabilidade celular. Análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações). Índice de significância de * p<0,1; ** p<0,05; *** p<0,01 para comparações entre os tratamentos em 24 e 48 h e o grupo controle não tratado (0) . Índice de significância de # p< 0,01%; ## p < 0,05%, ### p< 0,01% e #### p< 0,001% para comparações entre o controle e o tempo de 72 h.

Análise das fases do ciclo celular de células endoteliais HUVEC e fibroblastos humanos normais FN1 tratados com anularina I e monocerina - Análise por Citometria de Fluxo

[00167] Para análise do efeito da anularina I e da monocerina no ciclo celular, as células HUVEC e FN1 (2x105 células/poço, placa de 6 poços) foram tratadas com anularina I a 0,02; 0,15; 0, 625 e 2,5 mM, e com monocerina a 0,02; 0,15 e 0,625 mM por 6, 24, 48 e 72 h. Após o tratamento, as células foram tripsinizadas, ressuspensas em PBS, fixadas com álcool RNase, e armazenadas a -20°C para posterior análise.

[00168] As células foram centrifugadas e o pellet foi homogeneizado com tampão contendo Triton X-100, RNAse e iodeto de propídeo, e analisadas em citômetro de fluxo FACsCalibur (BD). No citômetro de fluxo, a aquisição da população celular, em média de 10.000 eventos foi realizada pelo programa "Cell Quest" (BD) e o conteúdo de DNA medido pela intensidade de fluorescência foi analisado usando o software ModFit versão 4.0. Os resultados estão expressos em porcentagem média de células nas diferentes fases do ciclo celular: Fase quiescente G0/G1, Fase de síntese - S e Fase G2/M (mitose).

[00169] A análise dos dados foi realizada usando o software ModFit versão 4.0, e os resultados estão expressos nas figuras 15 e 16, em porcentagem média de células nas diferentes fases do ciclo celular: Fase quiescente G0/G1, Fase de síntese - S e Fase G2/M (mitose).

[00170] A figura 15 mostra a distribuição de células endoteliais HUVEC e FN1 nas fases do ciclo celular após o tratamento com anularina I nas concentrações de 0,02; 0,15; 0,625 e 2,5 mM, nos tempos de 6, 24, 48 e 72 h. Zero igual ao tratamento controle com meio de cultura RPMI 1640.

[00171] Em fibroblastos tratados por 24 e 48 h com 0,02 e 0,15 mM de anularina I há um aumento das células na fase S. Para 72 h, o aumento ocorre somente para 0,02 mM. O aumento ocorre de acordo com a proporção de células com DNA fragmentado (Figura 15).

[00172] Nas células HUVECs, por sua vez o tratamento com anularina I após 24 e 48 horas aumentou a presença de células na fase de proliferação G2M e após 72 h induziu aumento na fase S (Figura 15). Para células HUVECs e fibroblastos humanos tratadas com monocerina ocorre parada do ciclo celular em G0/G1 em todos os tempos do tratamento. Nas duas linhagens celulares a porcentagem de células com DNA fragmentado é similar ao grupo controle. Para fibroblastos ocorre aumento de células na fase S, e G2M não difere do controle. Para HUVECs as células em fase S são também similares ao controle.

Determinação da proliferação celular

[00173] O estudo da indução de proliferação celular por ação da anularina I e monocerina em células HUVEC e FN1 foi realizado por marcação das células com CFSE-DA (CFSE -Carboxifluoresceína diacetato succinimidil ester) (Milovanova et al., 2004).

[00174] O CFSE-DA é um marcador fluorescente intracelular que é dividido igualmente entre células filhas. Neste sistema, a divisão celular pode ser avaliada em múltiplas gerações por citometria de fluxo, permitindo a identificação de até 10 gerações in vitro e in vivo.

[00175] A entrada do corante CFSE-DA nas células é pela forma deacetilada que o torna permeável e permite o rápido fluxo através da membrana plasmática. Esterases presentes nas células clivam o acetato resultando na forma CFSE muito menos permeável e que se concentra no interior da célula. As formas CFSE-DA e CFSE possuem a cadeia lateral succinimidil reativa a aminas, mas somente a forma CFSE é fluorescente. A alta concentração intracelular de CFSE facilita a rápida, e o alto nível de marcação de proteínas intracelulares. A marcação das células deve ocorrer de forma rápida para se obter população de células homogeneamente marcadas, o que é crítico na diferenciação das células que passaram por várias divisões celulares (Quah e Parish, 2010; Lyons et al., 2013.).

[00176] O marcador difunde-se para o interior da célula e se liga covalentemente a aminas intracelulares, resultando em marcação fluorescente bastante estável que pode ser fixada com aldeídos. O excesso do reagente não conjugado difunde-se passivamente para o meio extracelular e é removido junto com o sobrenadante por centrifugação.

[00177] Os picos de emissão e excitação após hidrólise são a 492 e 517 nm, respectivamente. As células marcadas podem ser analisadas por citometria de fluxo em equipamento com fonte de excitação a 488 nm.

[00178] Neste estudo, as células foram marcadas com CFSE-DA (1 μL de CFSE-DA a 5 μΜ para 1 mL de suspensão contendo 1x106 células resultando na concentração final de 5 nM do marcador) e transferidas para placas de 6 poços na concentração de 1x105 células/poço. Após a adesão celular as células foram tratadas por 24, 48 e 72 h com anularina I e monocerina de 0,02 a 2,5 mM diluídas em meio de cultura RPMI-1640 sem SFB.

[00179] Após o tratamento, as células foram tripsinizadas, centrifugadas e o sobrenadante descartado. O pellet celular foi ressuspenso em 1 mL de tampão para citometria de fuxo e armazenado em geladeira para posterior análise.

[00180] As análises foram realizadas utilizando a percentagem de células responsivas e o número de divisões de cada célula analisada, discriminadas de acordo com o conteúdo de CFSE-DA por citometria de fluxo em citometro FACSCalibur® (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA, EUA) e analisados pela aquisição e análise no programa CellQuest Pro Modfit Becton-Dickson (Modfit-BD).

[00181] A análise estatística dos resultados de proliferação celular não indicou diferença significativa entre o tratamento com anularina I e monocerina nas células HUVECs e em fibroblastos FN1.

[00182] A Figura 17 mostra o índice de proliferação celular pela média ± SD para células endoteliais HUVEC e fibroblastos FN1 tratados com anularina I e monocerina em concentrações de 0,02 mM a 2,5 mM nos tempos de 6, 24, 48 e 72 h. Pela análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações) não houve significância estatística entre o controle e os tratamentos em nenhum dos tratamentos nos diferentes tempos.

Determinação da proliferação celular

[00183] O estudo da indução de proliferação celular por ação da anularina I e monocerina em células HUVEC e FN1 foi realizado por marcação das células com CFSE-DA (CFSE -Carboxifluoresceína diacetato succinimidil ester) (Milovanova et al., 2004).

[00184] O CFSE-DA é um marcador fluorescente intracelular que é dividido igualmente entre células filhas. Neste sistema, a divisão celular pode ser avaliada em múltiplas gerações por citometria de fluxo, permitindo a identificação de até 10 gerações in vitro e in vivo.

[00185] A entrada do corante CFSE-DA nas células é pela forma deacetilada que o torna permeável e permite o rápido fluxo através da membrana plasmática. Esterases presentes nas células clivam o acetato resultando na forma CFSE muito menos permeável e que se concentra no interior da célula. As formas CFSE-DA e CFSE possuem a cadeia lateral succinimidil reativa a aminas, mas somente a forma CFSE é fluorescente. A alta concentração intracelular de CFSE facilita a rápida, e o alto nível de marcação de proteínas intracelulares. A marcação das células deve ocorrer de forma rápida para se obter população de células homogeneamente marcadas, o que é crítico na diferenciação das células que passaram por várias divisões celulares (Quah e Parish, 2010; Lyons et al., 2013).

[00186] O marcador difunde-se para o interior da célula e se liga covalentemente a aminas intracelulares, resultando em marcação fluorescente bastante estável que pode ser fixada com aldeídos. O excesso do reagente não conjugado difunde-se passivamente para o meio extracelular e é removido junto com o sobrenadante por centrifugação.

[00187] Os picos de emissão e excitação após hidrólise são a 492 e 517 nm, respectivamente. As células marcadas podem ser analisadas por citometria de fluxo em equipamento com fonte de excitação a 488 nm.

[00188] Neste estudo, as células foram marcadas com CFSE-DA (1 μL de CFSE-DA a 5 μΜ para 1 mL de suspensão contendo 1x106 células resultando na concentração final de 5 nM do marcador) e transferidas para placas de 6 poços na concentração de 1x105 células/poço. Após a adesão celular as células foram tratadas por 24, 48 e 72 h com anularina I e monocerina de 0,02 a 2,5 mM diluídas em meio de cultura RPMI-1640 sem SFB.

[00189] Após o tratamento, as células foram tripsinizadas, centrifugadas e o sobrenadante descartado. O pellet celular foi ressuspenso em 1 mL de tampão para citometria de fuxo e armazenado em geladeira para posterior análise.

[00190] As análises foram realizadas utilizando a percentagem de células responsivas e o número de divisões de cada célula analisada, discriminadas de acordo com o conteúdo de CFSE-DA por citometria de fluxo em citometro FACSCalibur® (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA, EUA) e analisados pela aquisição e análise no programa CellQuest Pro Modfit Becton-Dickson (Modfit-BD).

[00191] A análise estatística dos resultados de proliferação celular não indicou diferença significativa entre o tratamento com anularina I e monocerina nas células HUVECs e em fibroblastos FN1.

[00192] A Figura 17 mostra o índice de proliferação celular pela média ± SD para células endoteliais HUVEC e fibroblastos FN1 tratados com anularina I nas concentrações de 0,02; 0,15 e 0,625 mM nos tempos de 24, 48 e 72 h. Pela análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações) não houve significância estatística entre o controle e os tratamentos em nenhum dos tratamentos nos diferentes tempos.

[00193] Os resultados estão expressos na figura 17 e pode-se observar que a anularina I não induziu proliferação celular em fibroblastos nas concentrações testadas nos tempos de 24 h, 48 h e 72 h, porém para células HUVECs há uma tendência de aumento da proliferação para as concentrações de 0,02 e 0,15 mM nos três tempos de tratamento. Para 48 e 72 h a proliferação celular é menor do que no controle e este dado está em consonância com os dados de viabilidade celular que mostraram redução da viabilidade celular para esta concentração e tempo de tratamento.

[00194] A Figura 18 mostra o índice de proliferação celular pela média ± SD para células endoteliais HUVEC e fibroblastos FN1 tratados com monocerina nas concentrações de 0,02 e 0,15 mM nos tempos de 24, 48 e 72 h. Pela análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações) não houve significância estatística entre o controle e os trataentos em nenhum dos tratamentos nos diferentes tempos.

[00195] Em fibroblastos, em 24 h a monocerina a 0,15 mM induziu pequeno aumento na proliferação celular. Para 48 h e 72 h, nos grupos tratados o índice foi inferior ao dos grupos controles, resultado também observado no ensaio de viabilidade celular. Para células HUVECs em 24 h houve pequeno aumento do índice de proliferação, porém em 48 e 72 h o índice é similar ao dos grupos controles.

Expressão proteínas - análise do efeito da anularina sobre células endoteliais HUVEC por Western Blotting Obtenção do lisado celular, eletroforese, transferência e Western Blotting

[00196] As células endoteliais HUVEC (8x105 células/poço, placa de 6 poços) foram tratadas com anularina I a 0,15 e 0, 625 mM por 6 e 24 h. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS e lisadas com 400 μL de tampão RIPA/poço (contendo inibidores de proteases e fosfatases e EDTA) em banho de gelo. Após centrifugação, a concentração de proteínas foi determinada no lisado proteico e este armazenado a -80°C até a utilização.

[00197] A análise da expressão de proteínas específicas foi feita no lisado total por eletroforese em gel de 12,5 % ou 4-20 % de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE- Mini PROTEAN TGX pre-cast gel, Bio-Rad Lab) a 130 V por 10 min e 100 V por 2 horas em tampão SDS-PAGE (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0,1 % SDS, pH 8,3), utilizando 20 ou 40 μg do lisado proteico e 10 μL de marcador de peso molecular de proteínas PageRuler™ (Plus) Prestained Protein Ladder 10-250 kDa ou Spectra™ Multicolor High Range Protein Ladder 40-300 kDa (Thermo Scientific). Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por 30-45 min com voltagem de 20 V em um sistema semi-seco utilizando tampão de transferência (12 mM Tris, 96 mM Glicina, 20 % metanol, pH 8,3). Após a transferência, a membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio (BSA 1 % em TBS-T) a 4 °C por mais ou menos 12 horas (overnight) e lavada 3 vezes com TBS-T, 5 min cada sob agitação constante de 60 rpm. O primeiro anticorpo (Abcam) foi diluído em BSA 1 % em TBS-T. A membrana foi colocada em contato em toda a sua superfície com uma quantidade adequada da solução de anticorpo e incubada a temperatura ambiente por 1 h ou a 4°C por mais ou menos 12 horas (overnight) sob agitação constante, dependendo do anticorpo. A seguir a membrana foi lavada 3 vezes com TBS-T e incubada com o segundo anticorpo anti-coelho ou anti-camundongo (marca Thermo) como anteriormente, por 1 h a temperatura ambiente. A membrana foi novamente lavada com TBS-T por 3 vezes e as marcações reveladas utilizando o reagente SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific) e o equipamento de imagem digital ChemiDoc MP (Bio-Rad Lab) com detecção de quimioluminescência. As densitometrias das bandas correspondentes à marcação das proteínas com os anticorpos foram realizadas utilizando o software Image Lab (Bio-Rad Lab).

[00198] Para a análise da expressão proteica as condições do gel, transferência e diluições foram padronizadas para os seguintes anticorpos: ciclina D1, p53, p21, FGF-2, Ki-67, p27, VEGF-1, TGF-β, β-actina e GAPDH. As condições padronizadas estão descritas na Tabela 19, e após os testes, 40 μg do lisado proteico das amostras foram usados em gel de 12,5 % ou 4-20 % seguindo as seguintes diluições dos anticorpos primários e secundários.
Tabela 19. Condições para diluição dos anticorpos nos ensaios de expressão proteica.

PM= peso molecular

[00199] As células endoteliais HUVEC foram tratadas com anularina I a 0,15 e 0, 625 mM por 6 e 24 h e a expressão proteica foi avaliada para todas as proteínas listadas na Tabela 21 utilizando como controle de carregamento as proteínas GADPH ou β-actina.

[00200] A Figura 19 mostra um Western blotting representativo da expressão de VEGF-R1 nas incubações de HUVEC com diferentes concentrações de anularina I (1 e 2: RPMI; 3 e 4: 0,15 μΜ, 5 e 6: 0, 625 μΜ) por 24h. Gliceraldeído trifosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como controle de carregamento.

[00201] Os resultados da expressão proteica estão expressos na Tabela 20 e nas figuras 19, 20 e 21. Pode-se observar que ocorreu redução da expressão de p27 para os grupos tratados com anularina I nos tempos de 6 h, porém de forma estatisticamente significante somente para 0,625 mM. Em 24 h observa-se efeito inverso com expressivo aumento para as duas concentrações testadas, porém não significante.
Tabela 20. Expressão proteica para células HUVECs tratadas com anularina I a 0,15 e 0,625 mM nos tempos de 6 h e 24 h.

DP= desvio padrão. * nos gráficos os valores estão em erro padrão.

[00202] Para ciclina D1 também ocorreu redução da expressão em 6 h, mas não significante, e em 24 h ocorreu aumento da expressão, estatisticamente significante, principalmente para 0,15 mM com maior aumento.

[00203] Os níveis de p53 estão bem acima dos níveis do grupo controle e pode-se observar que este aumento inicia-se a partir do tempo de 6 h atingindo maior valor para o tratamento com 0,625 mM em 24 h.

[00204] Ocorre redução da expressão de p21 em 6 h para 0,625 mM e expressivo aumento em 24 h; aumento de TGF-β em 6 h para 0,15 mM, e em 24 h nas duas concentrações.

[00205] Com 6 h houve significante redução de FGF-2 para tratamento com 0,625 mM, mas para 0,15 mM em 6 h e em 24 h nas duas concentrações, a expressão foi muito superior ao controle, e estatisticamente significante nas duas concentrações testadas.

[00206] Para VEGF-R1 o aumento foi expressivo em 6 h, mas para 24 h foi reduzido em relação ao controle nas duas concentrações avaliadas.

[00207] A Figura 22 mostra a expressão proteínas pela media ± SEM. Análise estatística por One-way ANOVA / Dunnett's multiple comparison test (entre concentrações). Índice de significância de * p<0,1; ** p<0,05; *** p<0,01 para comparações entre os tratamentos em 6 e 24 h e o grupo controle não tratado (0). Índice de significância de · p< 0,01%; ·· p < 0,05% e ··· p< 0,01% para comparações entre os tempos de 6 e 24 h para as concentrações de 0,15 e 0,625 mM de anularina.

[00208] Para TGF-β houve aumento da expressão em 6 h para 0,15 e 0,625 mM, e em 24 h a expressão foi superior ao grupo controle somente para 0,15 mM; para 0,625 mM, embora de forma não significativa, a expressão diminuiu de 1,0 ± 0,174 para 0,791 ± 0,223 conforme pode ser observado na Tabela 23.

Avaliação da senescência celular - Ensaio enzimático da β-galactosidase

[00209] Uma das características da senescência é a paralização do crescimento celular. Além disso, as células senescentes geralmente aumentam em tamanho, muitas vezes duplicando em volume e, se aderentes, adquirem uma morfologia achatada. A coloração histoquímica para a β-galactosidase associada à senescência (SA-Bgal) (Dimri et al., 1995) é um marcador comumente usado para células em senescência. Esta atividade deriva da super-expressão de β-galactosidase ácida lisossomal.

[00210] As células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 (1x105 células/poço, placa de 12 poços), após a adesão, foram tratadas com anularina I ou monocerina nas concentrações de 0,02 a 1,25 mM em triplicata, e os tratamentos mantidos por 6, 24, 48 ou 72 h. Células controles receberam somente meio de cultura (sem SFB e com antibióticos). Os tratamentos foram removidos, as células cuidadosamente "lavadas" com PBS e fixadas com tampão de fixação (Sigma Código F1797) por 6-7 min em temperatura ambiente (0,6 mL/poço). Após nova "lavagem" com PBS, as células foram marcadas com 0,5 mL da solução de β-galactosidase/poço (Kit Sigma código CS0030), mantidas em estufa a 37°C sem CO2 até se corarem de azul (tempo de 2-10 h).

[00211] A solução de β-galactosidase foi removida, as células foram cobertas com glicerol a 70% e mantidas em geladeira até a observação em microscópio óptico. Para cada poço, as imagens de três campos foram fotografadas, e as células coradas de azul (senescentes) ou sem coloração (não senescentes) foram contadas.

[00212] Os resultados foram expressos em porcentagem de células senescentes e não senescentes, para cada concentração testada nas duas linhagens celulares.

[00213] As células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 tratadas com anularina I ou monocerina nas concentrações de 0,02 a 1,25 mM foram avaliadas com relação à indução de senescência.

[00214] Os resultados estão expressos nas figuras 22 e 23 e tabelas 22, 23 e 24, em porcentagem de células senescentes e não senescentes, para cada concentração testada nas duas linhagens celulares, e ilustrados na figura 25.

[00215] Pode-se observar que com 24 h e 48 h de tratamento, a anularina I induziu maior senescência nas células HUVECs, principalmente para 0,625 mM, e consequentemente ocorre diminuição na porcentagem de células não senescentes.
Tabela 21. Porcentagem de células endoteliais HUVEC senescentes e não senescentes após tratamento com anularina I nas concentrações de 0,02; 0,15 e 0,625 mM.

S= senescentes; NS= não senescente; SD= desvio padrão.

[00216] A tabela 22 abaixo mostra a expressão relativa de proteínas representadas na Figura 20.

[00217] A Figura 21 mostra a porcentagem de células endoteliais HUVEC senescentes e não senescentes após tratamento com anularina I nas concentrações de 0,02; 0,15 e 0,625 mM. Ensaio com β-galactosidase.

[00218] Pela figura 22, pode-se verificar que para células HUVECs, a porcentagem de células senescentes com o tratamento com monocerina foi similar à de células controle que receberam somente meio de cultura em todos os tempos de tratamento. Pode-se concluir que em células HUVECs o índice de senescência induzido pela monocerina é muito baixo.

[00219] Para fibroblastos FN1, em 24 h ocorreu alta porcentagem de senescência inclusive no grupo controle. A análise dos gráficos referentes aos tratamentos de 48 e 72 h (Figura 23) mostra que nesses tempos, com o aumento da concentração de monocerina ocorre também aumento da porcentagem de célula em senescência. Este resultado é incompatível com os de 24 h, tempo no qual já havia alta porcentagem de senescência.

[00220] Para fibroblastos que são células humanas primárias, os efeitos de senescência, são comumente observados nessas condições de cultivo, pela cinética de crescimento celular já que não são linhagem imortalizada.
Tabela 23. Porcentagem de células endoteliais HUVEC senescentes e não senescentes após tratamento com monocerina a 0,02 a 1,25 mM (media ± SD).

NS= não senescente; S= senescente; SD=desvio padrão.
Tabela 24. Porcentagem de fibroblastos normais FN1 senescentes e não senescentes após tratamento com monocerina a 0,02 a 1,25 mM (media ± SD).

FN1= fibroblastos normais FN1; NS= não senescente; S= senescente; SD=desvio padrão.

[00221] Em 24 h as células estavam em senescência e este fenômeno foi observado na análise microscópica das células. Para os tratamentos de 48 e 72 h, pela análise microscópica das lâminas pode-se constatar baixíssima densidade celular indicando que as células senescentes haviam perdido a adesão e consequentemente foram eliminadas no processo de fixação das células. Em decorrência desse fato, as células senescentes e não senescentes representadas em porcentagem, nos gráficos para os tempos de 48 e 72 h são referentes somente àquelas que não perderam a adesão, e consequentemente o valor dos desvios padrão são bem altos.

[00222] A Figura 22 mostra a porcentagem de células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1 senescentes e não senescentes após tratamento com monocerina nas concentrações de 0,02 a 1,25 mM. Ensaio com β-galactosidase.

[00223] A Figura 23 mostra fotomicrografias representativas de culas endoteliais tratadas com anularina I a 0,02 (1B) 0,15 (1C), 0,625 mM (1D) durante 24 h e 0,02 (2B) 0,15 (2C), 0,625 mM (2D) durante 48 h. Controles de 24 he 48 h são representados por 1A e 2A, respectivamente. As células em azul são senescentes e incolores são células não senescentes detectadas pelo ensaio da β-galactosidase).

Ensaio realizado com β-galactosidase. Determinação de apoptose em células HUVECs por marcação com anexina V-FITC/Iodeto de propídeo e leitura por citometria de fluxo

[00224] A possibilidade de indução de apoptose foi avaliada pela dupla coloração com anexina V-FITC e iodeto de propídeo.

[00225] A anexina V é um fosfolipídio com atividade anticoagulante vascular que é encontrada em maior proporção na face citosólica das membranas celulares. A utilidade da anexina V em aplicações de citometria de fluxo é derivada de sua afinidade seletiva para fosfolipídios negativamente carregados. A anexina V/FITC é usualmente utilizada em associação com um marcador vital de células, como por exemplo, iodeto de propídeo (PI). Células viáveis apresentam a membrana plasmática íntegra, e dessa forma, conseguem excluir o corante vital PI, enquanto as membranas de células mortas são permeáveis ao corante, que se incorpora no DNA. Com isso, a partir destes marcadores é possível identificar células viáveis (Anexina V/FITC e PI negativas), células em um estágio recente de apoptose (Anexina V/FITC positivas e PI negativas) e células que estão em um estágio tardio de apoptose ou mesmo mortas (Anexina V/FITC e PI positivas) (Koopman et al., 1994).

[00226] Para o ensaio, as células HUVECs foram plaqueadas a 4x105 células/poço (em placa de 6 poços), e após a adesão foram tratadas com monocerina de 0,02 a 1,25 mM (em RPMI 1640 sem SFB e com antibióticos), em sextuplicata e por 24 h. Após tripsinização, as células foram transferidas para tubos de 2 mL e processadas para marcação com anexina V e iodeto de propídeo de acordo com o protocolo do fabricante (Anexina-V-FITC Molecular Probes) e na ausência de luz direta. As células foram ressuspensas em 250 μL de tampão FACs com paraformaldeído 4% e a leitura realizada em citômetro de fluxo. Como controles foram usadas células HUVECs sem tratamento e sem marcação, células sem tratamento até a etapa da marcação da anexina V, células sem tratamento até a etapa da marcação com iodeto de propídeo e células sem tratamento e marcadas com anexina V e iodeto de propídeo.

[00227] A figura 24 ilustra a classificação das células de acordo com a marcação com anexina V/iodeto de propídeo, e os resultados mostram que mesmo na concentração de 1,25 mM as células encontram-se viáveis, em estado de necrose, apoptose inicial ou tardia na proporção de 91,53%, 2,28%, 3,65% e 0,53%, respectivamente (Tabela 27, figura 25). Este dado está de acordo com os resultados encontrados no ensaio de viabilidade celular por MTT e de senescência após tratamento das células com monocerina a 1,25 por 24 h, indicando ausência de citotoxidade desse composto em células HUVEC no período de 24 h.

[00228] O ensaio foi em quadruplicata, mas a análise estatística não foi realizada por se tratar de resultado de somente um ensaio.
Tabela 25. Determinação de apoptose em células HUVECs tratadas com monocerina de 0,02 a 1,25 mM. Valores em porcentagem.

[00229] A Figura 25 mostra determinação de apoptose em células HUVECs pela dupla marcação com anexina V-FITC/Iodeto de propídeo. Distribuição das células em viáveis, em processo de morte celular do tipo necrose, apoptose inicial ou tardia após tratamento com monocerina de 0,02 a 1,25 mM. O controle corresponde a tratamento somente com RPMI 1640.

Análise por microscopia de varredura a laser confocal

[00230] As células HUVECs foram tratadas com monocerina e após marcação com acridina Orange ou rodamina 123 foram analisadas por microscopia de varredura a laser confocal. As observações referentes a cada concentração da monocerina e tratamentos foram descritas e as imagens foram registradas.

[00231] Acridina-orange é um corante de fluorescência utilizado para corar vacúolos ácidos (lisossomas, endossomas e autofagossomas), RNA e DNA em células vivas.

[00232] O corante se intercala nos ácidos nucléicos em dupla fita (DsDNA) sendo detectado como fluorescência verde a 530 nm. Também se liga eletrostaticamente a grupos fosfatos em ácidos nucleicos em fita simples (ssDNA), RNA ou vacúolos, e nesse caso, a detecção é em 640 nm (McMaster e Carmichael, 1977).

[00233] A rodamina 123 é um marcador fluorescente, conhecido por inibir a função do potencial elétrico das mitocôndrias. Rodamina 123 liga-se às membranas da mitocôndria e inibi os processos de transporte, especialmente o transporte de elétrons, retardando a respiração celular interna.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

[00234] As análises obtidas no MEV são formadas através de um feixe de elétrons que é usado para varrer a amostra, o qual emite os chamados elétrons secundários e ocorre interação de um feixe primário com a superfície de interesse. As imagens obtidas neste estudo forneceram informações analíticas das alterações e arranjos da ultraestrutura ou da morfologia das células nas diferentes condições de tratamento e período de análise.

[00235] A cascata do processo apoptótico pode ser iniciada por duas principais vias: a extrínseca, que é mediada por receptores de morte presentes na superfície celular, e a intrínseca, que envolve alterações na mitocôndria (Burz et al., 2009; Portt et al., 2011). Estas vias são reguladas por diversas proteínas, como p53, os membros da família Bcl-2 (B-celllymphomaprotein2), as IAPs (proteínas inibidoras da apoptose) e as MAPKs (proteínas quinases ativadas por mitógenos) (Liu et al., 2011; Sankari et al., 2012).

[00236] Diversos são os fatores que podem desencadear a apoptose, entre eles: ligação de moléculas a receptores de membrana, agentes quimioterápicos, radiação ionizante, danos no DNA, choque térmico, privação de fatores de crescimento, baixa quantidade de nutrientes e níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio (Hengartner, 2000).

[00237] A análise ultraestrutural das células endoteliais HUVECs por MEV demonstraram que as células morrem após a ativação de mecanismos pré-apoptóticos, dependentes da concentração, e do tempo de exposição ao composto monocerina.

[00238] Os resultados de MEV indicam que as alterações na membrana plasmática durante a apoptose são principalmente de natureza bioquímica, não envolvendo alterações morfológicas com exceção da perda das microvilosidades com consequente retração citoplasmática, que foi observada nas células tratadas dependendo do tempo de tratamento, sendo essas as principais características da apoptose, destacando-se pela formação de corpos apoptóticos e a degradação da membrana celular. Os grânulos aderidos à membrana das células HUVECs do grupo controle (que recebeu somente meio de cultura), se modificaram significativamente após o tratamento com a monocerina dependendo do tempo e da concentração, o que favoreceu a manutenção da atividade citotóxica, como demonstrados nos ensaios de viabilidade celular (MTT), quantidade de DNA fragmentado nas fases do ciclo celular, e das diferentes proporções de células senescentes encontradas após o tratamento.

[00239] A senescência celular foi descrita pela primeira vez por Hayflick e Moorhead como a perda progressiva e irreversível do potencial proliferativo das células somáticas (Hayflick e Moorhead, 1961). Este fenómeno caracteriza-se não apenas por uma perda de capacidade replicativa, mas também por uma série de alterações na morfologia celular, expressão gênica, metabolismo, epigenética, entre outros.

[00240] A resistência à apoptose produz células senescentes.

[00241] Nos experimentos com células HUVECs tratadas com anularina I observou-se diminuição da proporção de células nas diferentes fases do ciclo celular com aumento das células com DNA fragmentado. Isto provavelmente se deve a capacidade das células endoteliais produzirem substâncias, como por exemplo, fatores de crescimento e aminas vasoativas que alteram o ambiente tecidual e podem contribuir, não só para o processo de envelhecimento, para a gênese de doenças como também em processo de reparo tecidual (Carneiro, 2007).

[00242] Dimri et al. demostraram que a expressão da enzima β-galactosidase está aumentada em células senescentes num estado de senescência replicativa associada a atividade enzimática da β-galactosidase (SA - β- Gal), em pH 6,0 (Dimri et al., 1995).

[00243] Nesta etapa de senescência replicativa, normalmente as células atingem confluência e adquirem aumento em seu volume celular e expandem seus prolongamentos citoplasmáticos, semelhantes às células mesenquimais, e podem tornar-se multinucleadas e altamente granuladas. Estas características foram encontradas nas células HUVECs após o tratamento com o composto monocerina nos diferentes períodos, o que foi observado no ensaio por MEV e microscopia confocal a laser.

[00244] Os fatores que possivelmente são responsáveis por essas modificações citológicas são os inibidores da histona desacetilase, que relaxam a cromatina sem danificar fisicamente o DNA, danos reparáveis ao DNA, ativação da ATM (ataxia telangiectasia) e a supressão da p53, o que influenciam diretamente a dinâmica de distribuição e progressão das fases do ciclo celular.

[00245] Dados recentes indicam que as células senescentes desempenham uma variedade de funções durante processos como desenvolvimento embrionário, supressão tumoral, cicatrização de feridas e reparação de tecidos (Krizhanovsky et al., 2008; Munoz-Espín et al., 2013; Demaria et al., 2014; Ritschka et al., 2017). Fatos que corroboram com o possível papel da monocerina e anularina I no equilíbrio entre os fatores de proliferação e senescência como verificado nos ensaios da marcação da enzima β-galactosidase e na determinação dos índices proliferativos.

[00246] A atividade dos compostos monocerina e anularina I sobre a proliferação de células normais humanas foi avaliada utilizando a análise de fase do ciclo celular para comparar os resultados obtidos entre as células tratadas com diferentes concentrações dos compostos e o grupo não tratado. A transição da fase do ciclo G1 para S requer a montagem e ativação de um complexo de replicação de DNA para iniciar a síntese de DNA. As células endoteliais HUVECs sofrem inibição de contato, inibem a sua proliferação após a confluência e tornam-se quiescentes. O ciclo celular em células de eucariotas controla a progressão, entre e dentro das fases, através de pontos de controle que coordenam a proliferação das células com o ambiente circundante, assegurando com precisão a replicação e divisão.

[00247] Em fibroblastos humanos tratados por 24 e 48 h com 0,02 e 0,15 mM do composto anularina I há um aumento das células na fase S. Para 72 h, o aumento ocorre somente para 0,02 mM. O aumento ocorre de acordo com a proporção de células com DNA fragmentado. Nas células HUVECs, por sua vez o tratamento com anularina I, aumentou após 24 e 48 horas a presença de células na fase de proliferação G2M e posteriormente, induziu a parada das células na fase G2 / M.

[00248] Os fibroblastos são os principais componentes celulares dos tecidos conjuntivos encontrados na maioria dos órgãos do corpo. A manutenção do equilíbrio entre proliferação e diferenciação é crucial para a homeostase. Após a ativação por lesão, danos no DNA, estresse oxidativo ou injuria mecânica, os fibroblastos ativam processo de migração, aderem à matriz extracelular provisória e proliferam (Eckes et al., 2014).

[00249] Este fenômeno pode ocorrer por diversos mecanismos envolvidos no controle de proliferação e diferenciação celular, dentre estes, os mecanismos que controlam a progressão do ciclo celular.

[00250] Para entrar no ciclo, as células quiescentes devem passar pela transição de G0 para G1, que funciona como uma porta de entrada para o ciclo celular. Esta transição envolve a transcrição de um grande conjunto de genes, incluindo vários proto-oncogenes e genes necessários para a síntese e a tradução de proteínas. As células podem se manter em G0 ou em G1 (Células quiescentes) ou em seguida completar a mitose (células de replicação contínua). As células que entraram em G1 progridem no ciclo e atingem uma fase crítica na transição G1/S, ponto de restrição, um passo limitante para a replicação. Passando este ponto de restrição, células normais se tornam irreversivelmente comprometidas com a replicação do DNA. A progressão através do ciclo celular, particularmente a transição G1/S, é fortemente regulada por proteínas chamadas ciclinas e enzimas associadas chamadas quinases dependentes de ciclina (CDKs). As CDKs adquirem atividade catalítica através da formação de complexos com as ciclinas. CDKs ativadas por esses complexos conduzem o ciclo celular e outras proteínas são fosforiladas que são críticas para a progressão do ciclo celular. Neste contexto, a expressão das proteínas ciclina D1, p53, p21 e p27 demostraram os efeitos de controle dos pontos de restrição e controle da progressão do ciclo celular promovidos pelo composto anularina I.

[00251] Outras proteínas avaliadas no estudo foram a expressão do VEGF-R1 e FGF-2 após o tratamento com o composto anularina I em células endoteliais HUVECs.

[00252] O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) é um potente e seletivo fator mitogênico para o endotélio. Ele produz uma rápida e completa resposta angiogênica e um aumento da permeabilidade capilar. Produzido e secretado por uma série de células normais, ele tem expressão marcada em células tumorais e endoteliais, ou o endotélio o ativa por fatores inflamatórios. O VEGF pertence a uma família das glicoproteínas, que inclui o VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e o fator de crescimento placentário. O principal mediador da angiogênese e vasculogenese é o VEGF-A, usualmente referido como VEGF. Vários fatores contribuem para o aumento da expressão do VEGF, dentre eles, a baixa concentração de oxigênio intracelular bloqueia a degradação do fator indutor da hipóxia (HIF-1a), o que eleva os níveis de expressão do seu receptor (VEGF-R1) e determina a hipoxia intracelular, que, por sua vez, determina o aumento de sua atividade pela ativação da transcrição do gene VEGF ou dos fatores relacionados a sua expressão como o FGF-2, expresso em fibroblastos (Boudreau e Myers, 2003) .

[00253] O VEGF e o FGF-2 são fatores importantes na indução da formação de novos vasos sanguíneos.

[00254] A expressão do fator VEGF facilita a migração e a proliferação das células endoteliais, resultando nos processos de vasculogênese ou angiogênese. Neste trabalho, a expressão do VEGF-R1 foi avaliada nas células endoteliais HUVECs, tratadas por 6 e 24 h com o composto anularina I, comparado ao grupo controle não tratado. Para o composto anularina I, os resultados mostraram aumento da expressão dos receptores de VEGF-R1 após 6 h de tratamento, e para a expressão do FGF-2 esse aumento foi observado principalmente após 24 h o que demonstra claramente os efeitos de regulação da proliferação e diferenciação endotelial. Esse fenômeno é caracterizado pela indução do receptor de crescimento de brotamento vascular e expansão endotelial, e indução do fator de crescimento de fibroblasto responsável pela manutenção da proliferação celular.

[00255] O FGF-2 é membro de uma família de 13 fatores de crescimento ligados estruturalmente e relacionados à heparina. É expresso ubiquamente em células de origem mesodermal e neuroectodérmica, e em uma variedade de células. In vitro, FGF-2 é um potente mitógeno para diferentes tipos de células, incluindo células endoteliais vasculares e fibroblastos. Quando as células endoteliais são cultivadas, o FGF-2 induz um fenótipo antigênico que consiste em aumento da proliferação, migração, produção e expressão de integrinas específicas. In vivo, por sua vez, é um potente indutor da angiogênese e tem efeitos pleiotrópicos no desenvolvimento e diferenciação em vários órgãos.

[00256] A proliferação celular pode ser influenciada por condições fisiológicas e patológicas, sendo amplamente controlada por sinais, fatores solúveis ou contato-dependentes, de microambientes que agem estimulando-a ou inibindo-a. O mecanismo de proliferação celular mais importante é a conversão de células quiescentes em proliferativas. O recrutamento das células quiescentes e a progressão do ciclo celular requerem sinais estimulantes para sobrepujar a inibição fisiológica da proliferação celular. As atividades do ciclo celular são comandadas por ciclinas, cinases dependentes de ciclina (CDK-s) e seus inibidores. Durante todo o ciclo, a função das ciclinas é ativar as CDK-s, sendo que seus níveis caem após exercerem essa função. A atividade dos complexos ciclina-CDK é regulada por fatores inibidores de CDK-s. Existem duas classes principais de inibidores: as famílias Cip/Kip e INK-4/ARF. Dentro da família Cip/Kip destacam-se p21, p27 e p53 e, pertencentes à família INK-4/ARF, p16 e p14, que funcionam como supressores da progressão do ciclo celular.

[00257] A atividade transcricional de p21 está sob o controle da proteína p53. A p21 também irá competir com a ciclina D com o mesmo objetivo de provocar a parada no ciclo celular. A p27 responde aos supressores de crescimento e irá competir com o complexo ciclina E/CDK-2, também provocando uma parada do ciclo celular no ponto de restrição G1/S, modificando a proporção de células paradas e quiescentes/senescentes.

[00258] A proteína supressora de tumor p53 é proteína chave na apoptose de células HUVEC e desempenha um papel importante nas vias de transdução de sinal de apoptose em diversos tipos de células, incluindo fibroblastos e células endoteliais vasculares. A função de p53 é de grande importância no estresse genotóxico onde modula e integra vários tipos de resposta que controlam a apoptose, a parada do ciclo celular, senescência e outros processos fisiológicos (Speidel, 2010).

[00259] Normalmente, os níveis de p27 apresentam-se aumentados em células quiescentes e caem rapidamente após estimulação por mitógenos. O aumento na expressão p27 em célula HUVECs com o composto anularina I, possivelmente representa os efeitos de proliferação celular provocados pelo composto nos períodos de 6 e 24 h. Por outro lado, a proteína p21 é um efetor crítico da via p53-dependente e provoca uma parada no ciclo celular pela inibição da cinase dependente de ciclina. Portanto, p21 exerce papel central na apoptose, e também está relacionada com a manutenção do estado de diferenciação das células endoteliais. Os resultados das expressões das proteínas inibidoras da progressão do ciclo celular p21, p27 e p53 por Western blot corroboram com os dados do teste de proliferação celular e da determinação da proporção de células em apoptose (ensaio de senescência, MEV e Microscopia de confocal). Anularina I em HUVECs não induz efeitos de morte celular por apoptose dependente de p53, nos períodos de tempo estudados.

[00260] O conjunto de resultados indica que a monocerina induz maiores efeitos citotóxicos em relação à anularina I em células endoteliais, sendo capaz de modificar a proporção de células em G0/G1 e células com DNA fragmentado.

[00261] A anularina I se mostrou um composto com potencial na indução de proliferação em células endoteliais, manutenção da proporção de células em G0/G1, diminuição das células com DNA fragmentado e indução de senescência que pode significar a manutenção de células em proliferação. Esses efeitos foram acompanhados pela expressão diferencial de proteínas que regulam os pontos de controle e progressão do ciclo celular.

[00262] Para a monocerina, em decorrência do seu efeito de inibição da proliferação em fibroblastos, seria interessante avaliar a indução da expressão de proteínas relacionadas aos pontos de controle e progressão do ciclo celular, assim como realizado para a anularina I, na perspectiva de caracterizar os diferentes mecanismos de ação envolvidos neste efeito, como por exemplo, em cicatrização hiperplásica.

[00263] Para a anularina I, os ensaios de análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise mitocondrial por microscopia confocal a laser e ensaio de expressão gênica serão realizados em breve. No entanto, considerando os ensaios já realizados e os efeitos da anularina I e seu potencial de ação em células endoteliais, os dados direcionam para a importância do estudo em modelos experimentais de remodelamento e reparo tecidual, e de cicatrização in vivo.

Efeito dos compostos monocerina e anularina I avaliado in vivo, em um modelo de ferida experimental nos camundongos

[00264] Devido ao seu potencial no remodelamento de tecidos, especialmente no controle de processos de cicatrização de feridas, o efeito dos compostos monocerina e anularina I foi avaliado in vivo, em um modelo de ferida experimental nos camundongos Balb/C por 24 h, 72 h, 7 e 14 dias.

[00265] Os compostos puros foram dissolvidos em propilenoglicol e incorporados em uma formulação na forma de creme (formulação já conhecida e descrita no estado da técnica) nas concentrações de 0,0005 e 0,003% para anularina I e de 0,0006% e 0,005% para monocerina.

[00266] As feridas foram induzidas no dorso dos animais no tamanho de 1 cm2, e os tratamentos dos animais foram da seguinte forma:
G1: Grupo controle - não tratado;
G2: Grupo controle - tratamento com colagenase (produto comercial - Kollagenase Cristalia® - contendo 0.6 U/g de colagenase mais cloranfenicol 1%;
G3: Grupo tratado com monocerina a 0,0006%;
G4: Grupo tratado com monocerina a 0,005%;
G5: Grupo tratado com anularina I a 0,0005%;
G6: Grupo tratado com anularina I a 0,003%;
G7: Grupo tratado com veículo - creme sem o princípio ativo.

[00267] Camundongos Balb / C (4 animais / grupo) foram tratados diariamente com as formulações pelo período de 24 h, 72 h, 7 e 14 dias.

[00268] Após o tratamento, o sangue dos animais foi coletado para análises bioquímicas e hematológicas. O tamanho da ferida foi medido diariamente usando um paquímetro, bem como raio X MS FX-pro (Bruker). A reepitelização tecidual foi analisada por microscopia óptica usando a coloração das células com hematoxilina e eosina, picrosirius red e tricrômico de Masson, para detectar alterações histopatológicas, quantificar o conteúdo de fibras colágenas e colágeno tipo I. Além disso, o tecido regenerativo também foi analisado por imunohistoquímica e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os parâmetros bioquímicos, hematológicos e histológicos indicaram efeito proliferativo devido à presença de fibroblastos, queratinócitos, células epiteliais e fibras colágenas.

[00269] O tratamento com as formulações contendo os compostos foi muito eficaz e reduziu o tamanho da ferida dos animais em 7 dias promovendo a cicatrização da ferida em 13 dias sem cicatrizes na pele regenerada.

OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DA MONOCERINA SECUNDÁRIA DE METABOLITE PRODUZIDA PELO FUNGUS E. ROSTRATUM

[00270] O fungo E. rostratum foi cultivado em meio de agar dextrose de batata (PDA) por sete dias a 28 °C, e após o crescimento algumas colônias foram transferidas para um balão de Erlenmeyer contendo 800 mL de PDB e incubadas em um agitador orbital (Marconi® , MA-830) a 28 ° C, a 150 rpm por 15 dias. Cada cultura foi realizada com seis Erlenmeyers em um total de 6,4 litros por lote. Vários lotes foram cultivados para obter monocerina necessária para os ensaios. Após a cultura, a biomassa foi removida por filtração e o caldo de cultura foi submetido a extração em fase sólida (SPE) em cartucho C18 (Cartuchos Speed SPE - Octadecyl C18 / 18%, 2 gramas). A fração de metanol SPE-100 foi seca por evaporação em rota (Bucchi © R-210). A fração SPE-100 foi purificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) por um método isocrático (40-54% B, LC / MS ACE © dimensões preparativas coluna C18 250x10x10 mm; fases móveis: A: H2O / TFA (99,9: 0,1 %) e B: MeOH / H2O / TFA (90: 9,9: 0,1%) e a fração obtida do SPE-100 posteriormente seca usando um sistema Speed-vac (CHRIST RVC 2-18 CD plus). A fração obtida F1 contendo monocerina impura que foi purificada novamente em uma segunda etapa na mesma condição usando uma coluna menor de dimensões preparativas LC / MS ACE © (C18 250x4,6 mm). A monocerina pura foi analisada por espectrometria de massa por cromatografia em fase gasosa (GC-MS Agilent 7890 / 5975C) para garantir o grau de pureza.

PREPARAÇÕES DE FORMULAÇÕES QUE CONTÊM MONOCERINA

[00271] Um creme de base não iônico modificado foi preparado de acordo com o Formulário Nacional da Farmacopeia Brasileira, 5a edição (BRASIL, 2012). Resumidamente, uma emulsão foi preparada com uma fase aquosa contendo propilenoglicol, metil parabeno e água purificada, que após aquecimento foi adicionada a uma fase oleosa contendo uma base auto-emulsificante não iônica, óleo mineral e propil parabeno.

[00272] A monocerina foi dissolvida em propilenoglicol e incorporada no creme resfriado, gota a gota, para obter as concentrações finais de 0,0006% e 0,005%. As formulações foram preparadas em cabine de fluxo laminar para garantir condições assépticas e mantidas na geladeira até o uso.

ENSAIO IN VIVO

[00273] Para este experimento, camundongos machos Balb / C, de 6 a 8 semanas de idade, com peso de 20 a 22 g, foram obtidos do Centro Animal Central do Instituto Butantan e mantidos em caixas (quatro animais por caixa) com aparas de pinho, água e comida ad libitum. Os animais foram mantidos nas instalações clínicas experimentais do Laboratório de Biologia Molecular do Instituto Butantan sob temperatura controlada e ciclo de luz pelo menos por uma semana antes dos ensaios.

[00274] O protocolo experimental in vivo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais do Instituto Butantan (CEUAIB # 3932260218) e pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (CEUA # 9897150818).

INDUÇÃO E TRATAMENTO DE FERIDAS

[00275] Os animais receberam anestesia geral com cetamina (10 mg / kg) e xilazina (100 mg / kg) por administração intraperitoneal e a região dorsal foi raspada e limpa com etanol a 70%. A área dorsal do mouse foi marcada com carimbo circular de 10 mm e, em seguida, a ferida de excisão foi cuidadosamente induzida usando uma tesoura.

[00276] A ferida foi deixada sem roupa após a cirurgia e os animais foram colocados em colchões térmicos para melhor recuperação, a fim de evitar qualquer tipo de perda de animais.

[00277] Antes da indução da ferida e após o processo pós-operatório, o animal recebeu tramadol por via intraperitoneal a 20 mg / kg como analgésico.

[00278] Oitenta animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos com quatro animais cada, e foram tratados diariamente por 24 h, 72 h, 7 e 14 dias com 50 mg de seu respectivo tratamento, conforme descrito abaixo. Grupos G1, G2, G3, G4 e G5.
G1: grupo controle - animais não tratados;
G2: grupo controle - tratamento com colagenase (produto comercial Kollagenase Cristalia® - contendo 0,6 U / g de colagenase mais cloranfenicol 1%);
G3: tratamento com monocerina a 0,0006%;
G4: tratamento com monocerina a 0,005%;
G5: tratamento com o veículo (formulação sem monocerina)

[00279] Após o final do teste, às 24 h, 72 h, 7 e 14 dias, o camundongo recebeu anestesia por inalação de isoflurano com overdose da dose geral recomendada e a amostra de sangue foi coletada por punção cardíaca e adicionada a um tubo contendo anticoagulante revestido com EDTA, para análises bioquímicas adicionais. A superfície da ferida na pele foi coletada após a eutanásia de cada animal com o empurrão para separar o pescoço do animal. O tecido de granulação se formou na área da lesão, que foi cuidadosamente excisada, deixando uma margem de 5 mm da pele normal para avaliação histológica e morfológica e determinação da hidroxiprolina.

[00280] Para análise histológica e morfológica, o tecido da ferida excisado de todos os grupos foi lavado com solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes e fixado com formalina a 10% por 24 h, e mantido à temperatura ambiente até que a respectiva análise fosse realizada.

AVALIAÇÃO CLÍNICA DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DA PELE

[00281] A avaliação clínica do processo de cicatrização da pele foi realizada diariamente. Aspectos macroscópicos das áreas e bordas da ferida foram avaliados quanto a edema, hiperemia, sangramento, granulação e formação de crostas. A presença ou ausência desses processos foi atribuída aos seguintes escores: baixa (*), moderada (**) e alta intensidade (***).

[00282] Diariamente, antes dos tratamentos, a medição de cada ferida era realizada com paquímetro. Para cada animal, a borda da ferida foi medida considerando quatro lados opostos e, em seguida, o meio foi calculado para o tamanho e o fechamento da ferida. Os dados foram calculados e expressos por comparação com o grupo controle.

[00283] O raio-X também monitorou o tamanho da ferida dos animais no tratamento de 14 dias. Para isso, dois animais de cada grupo (G1, G2, G3, G4 e G5) receberam anestesia com isoflurano, e a imagem da ferida foi registrada por imagem de raios X In vivo (MS FX PRO Bruker®) às 24 h, 72 h , 7, 10 e 14 dias (SATO et al., 2016). A análise do tamanho da ferida foi realizada com o Bruker MI Software Versão 7.2 e calculada usando o GraphPad Prism 5.0. Os dados foram expressos por comparação com o grupo controle.

ANÁLISE DE HEMATOLOGIA

[00284] As amostras de sangue coletadas dos animais em diferentes intervalos de tempo nas 24 h, 72 h, 7 e 14 dias foram centrifugadas por (Eppendorf ® Centrifuge 5424 R Mini Spin Plus) a 2.000 rpm por 10 minutos para separar o soro e o plasma da amostra de sangue, analisados hematologicamente usando o analisador de hematologia IDEXX ProCyte Dx®.

[00285] O soro foi armazenado para análise de citocinas e o sangue total analisado para glóbulos brancos, plaquetas, neutrófilos e monócitos. Os resultados foram transformados em gráficos usando o software Graph Pad Prism 5.0.

ANÁLISE MORFOLÓGICA E HISTOLÓGICA DO TECIDO FERIDO

[00286] Para a análise da amostra, os fragmentos de tecidos coletados, com intervalos de tempo determinados 24h, 72h, 7 e 14 dias, foram previamente fixados em formaldeído a 10%, desidratados gradualmente em uma sequência de álcoois (70, 80, 95, 100 e 100%, 1 hora em cada), diafanizados em xilol por (2 horas) e seguidos de imersão em parafina (Histosec-MERCK®), seções de 5 μm foram obtidas em um micrótomo automático (Leica, RM2165®) para preparar as lâminas para coloração (TOLOSA et al. 2003). As lâminas foram analisadas sob um microscópio óptico (Nikon 80i®) em uma objetiva de 40x.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)

[00287] a MEV foi realizado para avaliar a organização da matriz extracelular (MEC) e colágenos. Para cada grupo, os tecidos foram fixados em formol a 10%, pós-fixados com 1% de tetróxido de ósmio (pH 7,4) a 4 ° C por 1 hora. Posteriormente, as amostras foram lavadas primeiro com solução salina tamponada com fosfato a 1% (PBS) (3x por 5 minutos) e também com água destilada (3x por 3 minutos) usando um ultra-som (exclusivo®). Em seguida, as amostras foram desidratadas gradualmente em etanol (50%, 70%, 90% e 100%) em um aparelho de ponto crítico seco (LEICA EM CPD300®), e montadas em tocos de alumínio e cobertas com ouro, através do aparelho blasterer sputter com (EMITECH K550®) e analisados pelo microscópio SEM Zeiss (Leo 435 VP®) no Setor de Anatomia dos "Animais Domésticos e Silvestres" na "Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia" (FMVZ) da Universidade de São Paulo, de acordo com estudo anterior.

ANALISE HISTOLÓGICA PELO HEMATOXYLIN / EOSIN, E COLORAÇAO POR VERMELHO DE PICROSIRIUS E MASSON TRICHOME

[00288] As seções de tecidos foram coradas com Mayers Hematoxilina e Eosina Y (HE) para estimar os graus de cicatrização de feridas e regeneração epidérmica e formação de tecido de granulação, conforme descrito anteriormente (KIM et al., 2003).

[00289] Seções adicionais foram coradas com vermelho Picrosirius para observação de fibras de colágeno, fibras musculares, citoplasma e glóbulos vermelhos, e com tricrômio de Masson para observar eritrócitos, citoplasma, fibrina, músculo e colágeno (KIM et al., 2012)

[00290] As seções vermelhas de picrosirius foram coradas com o Kit comercial (Sigma Aldrich) (Cat # P6744-1GA). Para as seções de picrosirius red de wax e hidrate parafina, depois manche os núcleos com Mayers hematoxilina por 5 minutos e depois lave as lâminas por 10 minutos em água corrente. Depois disso, manche as lâminas de tecido em vermelho picrosirius por 45 minutos e coloque na incubadora a 30° C. Em seguida, lavada em duas trocas de água acidificada também removeu a água fisicamente das lâminas por agitação vigorosa e depois desidrata as lâminas de tecido em três trocas de etanol a 100% e, no final, limpa em Xileno por 5 minutos cada (2x) e montou o desliza em meio resinoso. A intensidade da cor vermelha referente à distribuição do colágeno foi calculada pela área que ajusta o campo usando o Image Pro Plus 4.5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). A porcentagem de colágeno foi calculada para cada grupo tratado por 14 dias.

[00291] As manchas foram analisadas microscopicamente usando uma lente objetiva de 20x e 40x de um microscópio óptico conectado a uma câmera digital (Coolpix 990; Nikon Eclipse80i). Áreas representativas dos efeitos dos tratamentos foram fotografadas para registrar a regeneração tecidual na derme e epiderme e a formação de granulação tecidual (KIM et al., 2012).

ANÁLISE DE TECIDOS DE VERMELHO DE PICROSIRIUS USANDO MICROSCÓPIO POLARIZADO

[00292] A coloração vermelha de Picrosirius também foi analisada por microscópio polarizado. A coloração especial do vermelho de Picrosirius destaca a birrefringência natural das fibras de colágeno quando expostas à microscopia de luz polarizada (Olympus BX-model®, com filtro U-POT e U-ANT).

[00293] Os resultados da birrefringência permitem avaliar também a organização das fibras de colágeno nos tecidos, como possíveis artefatos que possam ocorrer.

[00294] Os filtros e o condensador foram adaptados para permitir uma boa captura de imagem. O programa para captura de imagens foi Zeiss Lite (versão 2.6, Zen blue, Alemanha https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software.html.

AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA E MORFOMÉTRICA

[00295] A recuperação antigênica foi realizada com tampão citrato (pH 6,0, 4x 5x) em banho-maria a 95 ° C, seguido pelo bloqueio da atividade endógena da peroxidase por 15 min à temperatura ambiente e protegido da luz com 3% de peróxido de hidrogênio (H2O2) diluído em água destilada e bloqueando a ligação inespecífica com soro de cabra diluído a 2% em 1x PBS por 30 minutos.

[00296] Em seguida, as seções de tecido embebidas em parafina foram incubadas com os anticorpos primários: coelho policlonal anti-VEGF 1: 200 (anticorpo anti-VEGF MSDS) (Millipore Cat. # ABS82 Lote # ABS82 Lote # 2142671), durante a noite em uma câmara úmida a 4 ° C e depois lavado em tampão fosfato (PBS, NaCl 136,9 mM, KCl 4,8 mM, KH2PO4 14,8 mM e NaOH 8,7 mM, pH 7,2). A interação da proteína inespecífica será bloqueada com albumina sérica bovina a 2% por 30 minutos. A reação foi detectada por um kit Dako Advance HRP que continha o anticorpo secundário (# K6068, DakoCarpinteria, EUA) e a cor desenvolvida com diaminobenzidina DAB (# K3468, Dako).

[00297] As lâminas foram levemente coradas com hematoxilina. Entre cada passo após a incubação do anticorpo, as lâminas foram lavadas em PBS contendo BSA a 0,2%. Finalmente, as lâminas são montadas e visualizadas ao microscópio.

[00298] Além disso, os anticorpos foram comparados ao controle negativo, que utilizava BSA a 0,2% em vez do anticorpo primário. Foram selecionados sete campos de uma seção imunocorada (VEGF) e capturados para cada amostra. A quantificação foi avaliada em imagens capturadas de alta qualidade (buffer de 2048 χ 1536 pixels) usando o Image Pro Plus 4.5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) e processada através do Origin 9.1 e GraphPad Prism 5.1. O resultado da coloração foi expresso como média ± desvio padrão através do software Image J. Esta análise foi realizada apenas para o grupo de tratamento de 24 horas.

RESULTADOS OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MONOCERINA

[00299] Como esperado, a monocerina foi produzida com sucesso pela cultura do fungo E. rostratum e após o processo de purificação por HPLC, o composto puro foi obtido.

[00300] A Figura 26A mostra o perfil de HPLC da primeira etapa de purificação, quando a fração F1 contendo monocerina impura foi coletada. Após a evaporação do metanol, a fração F1 foi totalmente purificada no segundo passo, como mostra a Figura 26B.

[00301] A monocerina foi caracterizada como previamente descrito por ressonância magnética nuclear (RMN) 1H e 13C (RMN) e espectrometria de massa (MS) e usada para a formulação de creme a 0,0006% e 0,005%.

AVALIAÇÃO CLÍNICA E MEDIÇÃO DO TAMANHO DA FERIDA

[00302] Os procedimentos cirúrgicos foram realizados com sucesso para todos os grupos de camundongos. Todos os dias, os animais passavam pelo processo de cicatrização de feridas e suas bordas avaliadas macroscopicamente quanto a edema, hiperemia, sangramento, granulação e formação de crostas. A presença ou ausência desses processos foi atribuída como intensidade baixa (*), moderada (**) ou alta (***). Essas características macroscópicas estão representadas na Tabela 26.

[00303] Pela análise clínica, foi possível observar a presença de sangramento e coagulação nos animais de todos os grupos. Entretanto, o mesmo evento esteve presente até o 5° dia no grupo tratado com colagenase (G2) e até o 3° dia no grupo tratado com monocerina a 0, 0006% (G3) e 0,005% (G4). Por fim, o grupo que recebeu apenas o veículo (G5) apresentou atraso na cicatrização e recuperação até o 10° dia. Um grau significativo de cicatrização foi observado no quinto e no décimo dia nos aspectos clínicos dos grupos tratados com g3 e g4 monocerina, mostrados na Tabela 26.

[00304] O tamanho da ferida foi medido diariamente por paquímetro e os tamanhos estão representados, desde as primeiras 24 horas até o 14° dia, para todos os grupos de tratamento. O tamanho da ferida no sétimo dia dos grupos tratados com monocerina a 0,0006% (Grupo G3) e 0,005% (Grupo G4) foi de 4,75 ± 0,80 e 3,72 ± 0,42 mm, respectivamente, enquanto durante 10 dias foi de 2,20 ± 0,62 mm e 1,26 ± 0,29 mm, respectivamente. No 7° e 10° dia, o tamanho do creme comercial com colagenase (Grupo G2) foi maior, sendo 5,62 ± 0,39 e 2,6 ± 0,69 mm, respectivamente (Tabela 27). O tamanho da ferida também é representado na figura 27 pelo período de 24 horas, 72 horas e 7° e 14° dia.
Tabela 26 - Intensidade da avaliação clínica para edema, hiperemia, sangramento, granulação e formação de crostas.

*** = alta intensidade; ** = media intensidade; * = baixa intesidade; ausência representada como (-).
Tabela 27 - Medição diária dos tamanhos das feridas por paquímetro e representada pelo meio ± DP para quatro animais / grupo em ensaios (mm).

[00305] O tamanho das feridas dos animais tratados por 14 dias também foi monitorado por imagem in vivo de raios-X (MS Fx Pro) no tempo zero 24 h, 48 h, 72 h, 7 d, 10 d e 14 dias e os dados são representado na figura 28 e na tabela 28. As imagens foram registradas e estão representadas nas figuras 29 e 30. A análise permite observar a cicatrização e o fechamento da ferida no grupo tratado com monocerina a 0,0006% e 0,005%.
Tabela 28- Medição do tamanho das feridas por imagem radiológica in vivo (MS Fx pro) em milímetros (mm) representada pelos meios ± DP para 2 animais / grupo.

ANÁLISE MORFOLÓGICA DA FERIDA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

[00306] Imagens de microscopia eletrônica de varredura (Figura 31 mostram que camundongos do grupo não tratado (G1) e do grupo colagenase (G2) demonstraram integridade da matriz extracelular, mas uma baixa deposição de fibras de colágeno dimensionalmente imaturas quando comparadas ao grupo tratado com monocerina a 0,0006% (G3) e 0,005% (G4) .Os animais do grupo que recebeu apenas o veículo (G5) apresentaram processo inflamatório e presença de coagulação no 7° dia.

[00307] Além disso, o tecido de granulação parecia frágil com monocerina na pomada a 0,005%, possivelmente devido ao aumento da imagens ultra-estruturais da derme capturada por MEV mostram os tecidos de granulação dos animais do grupo tratado com monocerina 0,0006% (G3) com presença de numerosas células mortas e abundantes células sanguíneas; também é possível observar fibronectina e sangue vermelho em tecidos infiltrados por capilares.Há evidências consistentes de que mecanismos complexos regulam a correlação entre inflamação e coagulação em. As feridas cirúrgicas tratadas com monocerina em ambas as concentrações (grupos G3 e G4) exibiram formações de coágulos e muitas fibronectinas foram observadas após 7 dias.

[00308] A pele ferida dos grupos tratados com monocerina (G3 e G4) revelou claramente que a ativação das células de reepitelização da pele era mais eficaz e mais rápida do que os grupos de controle de veículo e não tratados.

ANÁLISE HISTOLÓGICA DOS TECIDOS FERIDOS

[00309] Pela avaliação histológica dos retalhos cutâneos revelados pela coloração HE, foi possível observar regressão das lesões com melhor epitelização nos grupos não tratado (G1) e tratado com colagenase (G2)), mas esse processo foi mais eficaz, mostrando melhor reorganização dos derme nos dois grupos tratados com monocerina (G3 e G4) até o 14° dia. A indicação clara dos tecidos histológicos da ferida nas experiências de 24 e 72 h é mostrada nas Figuras 31 e 32.

[00310] Para o grupo não tratado (G1), é possível observar: (H&E) - tecido cicatricial visível grande número de células e vasos sanguíneos de fibroblastos (amarelo seta); (PR) redução de colágeno necrose densa e organizada (seta laranja); (MT) grande número de células inflamatórias cicatrizes visíveis (setas vermelhas) estavam presentes. No caso de tratamento com colagenase (G2): cicatrizes de inflamação (H&E), células de necrose (seta amarela) (PR) inflamação dos tecidos adiposos (seta laranja); (MT) grande número de células inflamatórias resistiu claramente às células de resposta imune na cicatrização de feridas (seta vermelha). Para o tratamento de monocerina a 0,0006%, as evidências são: (H&E) - boa distribuição de células epiteliais e tecido organizado da pele (seta vermelha); (PR) colágeno e camada epitelial densa (seta laranja); (MT) grande formação de fibroblastos, células inflamatórias reduzidas foram marcadas nas figuras 31 e 32 dos tecidos corados com intervalos de 24 e 72 horas.

[00311] A distribuição do poço de colágenos (seta vermelha). O grupo monocerina 0,005% (G4): (H&E) - Neste grupo as células epiteliais são mais organizadas e há alta distribuição de colágeno (seta amarela); (PR) grande número de células de fibroblastos indica sinais de cicatrização e os colágenos também estavam apoiando a regeneração da pele (seta laranja); (MT) abundantes células de fibroblastos e a camada de epiderme foram mais organizadas (seta vermelha). Menos, mas não o último, no grupo tratado com veículo (G5) (H&E) - grande número de células inflamatórias (seta amarela); (PR) privação de colágenos (seta laranja); (MT) grande número de células inflamatórias adiposas (seta vermelha).

[00312] Os tecidos da ferida para experimento histológico de 7 e 14 dias são mostrados nas Figuras 33 e 34. O controle não tratado (G1): (H&E) células visíveis de fibroblastos do tecido cicatricial e vasos sanguíneos (seta amarela); (PR) os colágenos são densos e organizados (seta laranja); Camada de epiderme (MT) mais densa (setas vermelhas) foi observada nos 7 e 14 dias de tratamento. Tratamento com colagenase (G2): foram observadas inflamação (H&E) e cicatrizes (seta amarela); (PR) tecidos adiposos foram observados e também inflamação foi observada até o 14° dia (seta laranja); (MT) O grande número de células inflamatórias também esteve presente no tratamento de 7 e 14 dias (seta vermelha). O grupo monocerina 0,0006% (G3): (H&E) registrou boa distribuição de células epiteliais e tecido cutâneo organizado (seta vermelha); (PR) colágeno e camada epitelial foram densos e melhores que os grupos controle (seta laranja); (MT).

[00313] A grande formação de fibroblastos no intervalo de 7 dias. Além disso, as células inflamatórias foram reduzidas no tratamento de 7 e 14 dias (seta vermelha). Grupo monocerina a 0, 005% (G4) : (H&E) A proliferação nas células epiteliais foi revelada (seta amarela); (PR) ocorre a queratinização e os colágenos estão bem organizados (seta laranja) mostrados nas figuras 33 e 34 em intervalos de 7 dias; (MT) células de fibroblastos abundantes e camada de epiderme organizada levam à recuperação e cicatrização em menos de 14 dias (seta vermelha); Por fim, no grupo veículo (G5): (H&E), foi observado pequeno número de células inflamatórias no 14° dia (seta amarela); Por MT, um grande número de células inflamatórias e tecidos adiposos é mostrado nas figuras 33 e 34 para o intervalo de 7 e 14 dias, o que significa que as feridas não foram totalmente recuperadas e confiável (seta vermelha).

[00314] A avaliação pela coloração por Picrosirius permitiu reconhecer a densidade total de colágeno devido à presença de fibras de colágeno (amarelo avermelhado nas figuras 31, 32, 33, 34 e 35). A área ocupada por fibras de colágeno foi quantificada usando a Imagem J e o software Graph Pad Prism 5.1, apresentado na figura 35. Os dados foram obtidos para quatro animais por cada grupo e representados pela porcentagem de meios ± DP mencionados na Tabela 28. O valor final foi representado comparando todos os grupos (Tabela 28). Em comparação com os grupos controles (G1, G2 e G5). A porcentagem de colágeno foi mais intensa nos grupos G3 e G4 tratados com monocerina a 0,0006% e 0,005% para todo o tempo dos experimentos. A maior porcentagem de colágeno foi observada no experimento de 14 dias, sendo 60,44 ± 5,47% e 70,36 ± 13,31%, respectivamente.

ANÁLISE DE TECIDOS DE VERMELHO DE PICROSIRIUS USANDO MICROSCÓPIO POLARIZADO

[00315] O corante especial vermelho de picrosirius tem a capacidade de aumentar a birrefringência natural do colágeno quando exposto à luz polarizada. O colágeno tipo I mostraria uma cor amarelo-vermelho, enquanto o tipo III seria verde, como mostrado na Figura 37.

[00316] Às 24 e 72 horas, os grupos tratados com monocerina G3 a 0,0006% e G4 a 0,005% mostraram um arranjo denso e compacto de colágenos em comparação aos grupos controle (G1, G2 e G5). Nas 24 e 72 horas, o grupo G1 não tratado mostrou uma expressão significativamente baixa de colágenos
No tratamento por 7 dias, houve uma clara diferença observada entre os grupos controle (G1. G2 e G5) e os grupos tratados com monocerina G3 e G4, onde a população de fibras colágenas exibiu cores de polarização no vermelho-laranja, enquanto para os controles o colágeno as fibras eram escassas e imaturas. O grupo G1 não tratado exibiu intensa birrefringência verde - amarela, sugerindo que o conteúdo de colágeno foi reduzido e suas fibras estavam muito frouxamente empacotadas.

[00317] No entanto, no 14° dia para os grupos tratados com monocerina a 0, 0006% e 0, 005% (G3. G4), mais fibras amarelas e vermelhas foram vistas, possivelmente indicando a presença de colágeno tipo I. As fibras verdes (típicas do colágeno tipo III) foram mais frequentemente localizadas na derme superior e na epiderme no grupo G3 tratado com monocerina a 0,005%. Os grupos controle (G1, G2 e G5) apresentaram fibras grossas vermelhas e amarelas (típicas do colágeno tipo I ) localizada na derme profunda inferior. No geral, os grupos tratados com monocerina foram de 0,0006% e 0,005% (G3 e G4). A figura 37 mostra a disposição das fibras colágenas visíveis e organizadas dos grupos tratados com monocerina.

ANÁLISE DE HEMATOLOGIA

[00318] Neste estudo, foi examinado o sangue periférico de camundongos Balb / C entre os grupos controle G1 (não tratado), G2 (colagenase) e G5 (veículo) e tratados com monocerina a 0,0006% e 0,005% (G3 e G4). Os dados estão representados nas figuras 38 e 39.

[00319] Foram analisadas as três principais categorias de células imunes, como glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos), glóbulos brancos (glóbulos brancos) e plaquetas. Como mostrado na Figura 38, a monocerina a 0,0006% e 0,005% (Grupos G3 e G4) apresentou os níveis mais altos de hemácias em 24 h, em comparação com outros grupos de controle G1, G2-colagenase e veículo G5. Mais tarde, após 7 dias em fase de proliferação. As hemácias mantiveram seu equilíbrio e resultados quase semelhantes foram observados para todos os grupos, exceto o veículo do grupo G5, que mostrou um número baixo e significativo de glóbulos vermelhos em comparação aos grupos tratados com monocerina (G3 e G4).

[00320] Em 24 horas, os grupos tratados com monocerina a 0,0006% e 0,005% (G3 e G4) apresentaram níveis mais elevados de leucócitos quando comparados aos demais grupos (G1, G2 e G5). Níveis levemente mais altos de leucócitos foram observados após 7 dias no grupo G1 controle não tratado. Enquanto, após 14 dias, os grupos tratados com monocerina (G3 e G4) eram mais altos do que outros grupos controle (G1, G2 e G5). No caso de plaquetas em 24 h, os grupos tratados com monocerina em fase de inflamação (G3 e G4) apresentaram niveis mais altos de plaquetas do que outros grupos controle (G1, G2 e G5), o que leva à regeneração da pele e à resposta imune após a aplicação de grupos tratados com monocerina. Curiosamente, os niveis de plaquetas foram mais baixos no grupo G3 tratado com monocerina a 0,0006% do que no grupo G4 tratado com monocerina a 0,005%.

[00321] Adicionalmente, na fase de proliferação após 7 dias, o nivel de plaquetas foi maior no grupo G2 de colagenase G2 em comparação com outros grupos, mas os grupos monocerina G3 e G4 foram maiores que o grupo não tratado G1 e o grupo tratado com veículo G5. Na fase de remodelação após 10 dias, as plaquetas do grupo G3, G4 tratadas com monocerina foram observadas mais altas do que os outros grupos controle G1 e G5, exceto o grupo G2 Collagenase.

[00322] Parâmetros adicionais relacionados à RBC, como teste de hematócrito e concentração de hemoglobina, também foram analisados. Curiosamente, em 24 h grupos tratados com monocerina (G3 e G4) acentuadamente uma concentração mais alta de hemoglobina em comparação com outros grupos G1, G2 e G5. Em 7 dias, os grupos tratados com monocerina (G3 e G4) apresentaram maior nível de concentração do que outros grupos controle, exceto o grupo não tratado (G1). No entanto, em 14 dias todas as leituras dos grupos foram mantidas com nível quase idêntico de HGB, também não houve distinção no percentual de volume de células de hematócrito entre todos os grupos, o mesmo comportamento do HCT foi registrado e mostrado no (Figura 39).

[00323] As subpopulações de leucócitos em grupos tratados com 24 horas de monocerina (G3 e G4) apresentaram os níveis mais baixos de linfócitos em comparação com outros grupos (G1, G2 e G5). Em 7 dias, o nível de linfócitos para o grupo monocerina em 0,0006% e 0,005% (G3 e G4) foi superior ao grupo não tratado controle G1 (Figura 37). Além disso, em 14 dias a monocerina a 0,0006% (grupo G3) foi superior aos grupos G1, G2 e G3 e o nível de monocerina a 0,005% (grupo G4) foi superior aos grupos G1 e G2, mas inferior aos grupos G4 e G5 ..

[00324] Nas 24h, o grupo G2 apresentou nível de monócitos levemente superior ao monocerina G3 e G4 em 0,0006% e 0,005%. Nesse momento, o nível de monócitos dos grupos G1 e G5 era significativamente menor que os grupos G2, G3 e G4 (Figura 38).

[00325] A porcentagem de monócitos para o grupo G1 controle - não tratado. A monocerina G3 e G4 a 0, 0006% e 0,005% foi maior que o grupo G2 colagenase e o grupo veículo G5 por 7 dias de tratamento. No final do experimento, aos 14 dias, a monocerina no grupo tratado com 0, 005% (G4) foi significativamente maior do que nos outros grupos G1 controle não tratado. Colagenase G2. G3 monocerina a 0,0006% e grupo G5 de veículos (Gráfico 5).

[00326] Para os neutrófilos em 24 h, os grupos G1, G2 e G5 apresentaram os níveis mais baixos em comparação aos grupos tratados com G3 e G4. Em 7 dias, o G1 apresentou nível ligeiramente superior aos demais grupos G2, G3, G4 e G5. Para G4 monocerina no nível de 0,005% de neutrófilos foi maior que G2 colagenase. Grupo de veículos G5 e para monocerina G3 a 0,0006%. Curiosamente, em 14 dias, a monocerina G4 a 0, 005% foi maior que nos grupos G1, G2, G3 e G5 (Figura 39).

[00327] No geral, os grupos tratados com monocerina a 0,0006% e 0,005% (G3 e G4) mostraram presença significativa de linfócitos, neutrófilos e monócitos e populações maiores de granulócitos. Os resultados obtidos deixaram os sinais de entendimento sobre o tratamento com monocerina, que foram efetivamente contrários à resposta inflamatória e ajudam a ativar a resposta das células imunes no mecanismo de cura, em comparação com outros grupos de controle apresentados nas Figuras 38 e 39.

ANÁLISES IMUNOHISTOQUÍMICAS

[00328] As análises imunoistoquímicas foram realizadas para o VEGF. Esta análise será repetida incluindo a análise dos anticorpos TIMP-2. MMP-3 e MMP-9 também envolvidos no processo da ferida.

[00329] A Figura 40 mostra uma fotomicrografia de tecidos imunocorados com anticorpo contra VEGF nos grupos controle e tratado por 24 h. Para todos os grupos é possível observar a imunorreatividade contra o VEGF (setas), enquanto para os controles negativos não houve imunorreatividade conforme o esperado; A exceção é para a reação de controle negativo para o grupo G1, que também foi imunorreativo, mas de baixa intensidade, conforme o esperado. Barra de escala 40 x 100 μm. Os dados foram analisados medindo os pixels da barra de escala de 1024 x 2048 pixels.

[00330] Os dados para imunocoloração contra VEGF mostraram que, em comparação com o grupo controle não tratado, o tratamento com grupo Collagenase (G2) apresentou maior imunoreatividade, com 87,2% de colágeno, e os grupos monocerina tratados com 0,005% e 0,0006%, respectivamente, 85,4 e 83,5%. Os dados são representados na Figura 41.

[00331] O metabolito secundário dos fungos mostrou potencial e tem sido consistentemente uma importante fonte de agentes terapêuticos (VOLK et al., 2013).

[00332] Portanto, neste estudo, a monocerina foi incorporada em uma formulação em creme a 0,0006% e 0,005% e sua eficácia foi avaliada em um modelo cirúrgico cutâneo in vivo de ferida. A fim de avaliar o efeito da monocerina, embora nos estágios iniciais do processo de reparação tecidual, o tratamento das lesões tenha começado após cerca de 3 h após a indução nos animais.

[00333] A ação dos metabólitos secundários no sistema imunológico não foi estudada extensivamente, mas a atividade anti-inflamatória dos flavonóides mostrou ser atribuída à sua capacidade de inibir a degranulação de neutrófilos; diminuindo a liberação de ácido araquidônico e outros mediadores das células imunes (NIJVELDT et al., 2001).

[00334] Esse efeito provavelmente pode interferir no reparo da pele. O processo de cicatrização de feridas é caracterizado por eventos dinâmicos e interativos que envolvem mediadores solúveis, células sanguíneas, MEC e células parenquimatosas, o que resulta na restauração permanente da integridade anatômica e funcional. O termo "ordenado" refere-se à sequência de fases de cicatrização de feridas que incluem inflamação, formação e remodelação de tecidos (SINGER; CLARK, 1999).

[00335] Os metabólitos secundários do fungo foram associados a uma forte atividade anti-inflamatória, antimicrobiana e antioxidante, essenciais para a cicatrização de feridas. As atividades específicas dos extratos de metabólito secundário de E. rostratum e seus constituintes benéficos para a cicatrização de feridas foram relatadas como incluindo efeitos inibitórios no sangramento, aumento da contração da ferida, aumento dos níveis do fator básico de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas e estimulação de parâmetros hematológicos como glóbulos brancos e vermelhos (AGYARE C; AKINDELE; STEENKAMP, 2019).

[00336] Os parâmetros hematológicos são importantes marcadores da doença na medicina humana e veterinária. O sistema imunológico e os sistemas neuroendócrinos são os dois componentes principais que mantêm a homeostase corporal. Amostras de sangue periférico podem indicar anormalidades no corpo, que geralmente causam várias ameaças à saúde humana, incluindo doenças autoimunes ou metabólicas devastadoras.

[00337] Na análise geral dos resultados referentes à proporção da área da ferida em relação ao tempo inicial de pós-operatório, houve um efeito do grupo, o tempo da análise e a interação entre esses fatores (teste ANOVA one-way de medidas repetitivas , p <0,005).

[00338] Na análise por grupos ao longo de diferentes tempos de cicatrização, foi observada uma redução significativa na proporção da área da ferida em relação ao tempo inicial (teste de comparação de Tukey, p <0,05). Para os grupos G3 e G4 houve diferença significativa entre os 7 e 14 dias (p> 0,05), que apresentaram redução progressiva da área da ferida (p <0,05) em todos os momentos de cicatrização. Na comparação entre os grupos experimentais em cada momento de análise, foi evidenciado que a proporção da área da ferida para o grupo veículo G5 e grupo G2 colagenase aos 7 e 14 dias foi menor em relação aos grupos G3 e G4 tratados com monocerina (pós -Teste de Tukey, p <0,005), e não houve diferença significativa entre os grupos nos 3 e 7 dias de cicatrização. Os dados indicam que, pelos dois métodos utilizados para medir o tamanho da ferida (raio X e paquímetro) para os grupos tratados com monocerina a 0,0006% e 0,005% (G3 e G4), a redução e o fechamento da ferida foram mais eficientes do que em os grupos de controle.

[00339] A investigação hematológica mostrou que os grupos tratados com monocerina (G3 e G4) apresentaram alta porcentagem de hemácias e leucócitos em comparação com outros grupos controle (G1, G2 e G5). Em 14 dias, todos os grupos mantiveram o nível de distribuição das células, mas em 24 horas, 72 horas e 7 dias, a distribuição de leucócitos e hemácias nos grupos tratados com monocerina (G3 e G4) foi maior que em outros grupos controle.

[00340] Os animais tratados com a formulação contendo monocerina em ambas as concentrações apresentaram redução estatisticamente significativa do tamanho da ferida e a pele foi mais compacta e densa. Nos animais tratados com a formulação, transportando monocerina, a formação de tecido e a reepitelização foram eficazes, com aumento da distribuição e deposição de colágeno, e angiogênese significativamente melhorada nas lesões cutâneas tratadas com monocerina. Durante o processo, observou-se uma formação clara de crosta granular e sangue, coagulação sem sintomas graves de sangramento e líquido mucoso ou com vazamento nas feridas tratadas com monocerina.

[00341] A coagulação sanguínea é um mecanismo de defesa do hospedeiro que, paralelamente às respostas inflamatórias, não apenas ajuda a proteger a integridade do sistema vascular, mas também promove o reparo após lesão tecidual. A formação de um coágulo sanguíneo serve não apenas para fechar as bordas da ferida, mas também para atravessar as fibronectinas, o que fornece uma matriz provisória na qual os fibroblastos células endoteliais e queratinócitos podem entrar na ferida (MONROE DM; MAUREANE, 2012).

[00342] Os fibroblastos estavam envolvidos na síntese de colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs). proteoglicanos e glicoproteínas adesivas e reconhecidos como de importância essencial no processo de cicatrização de feridas tratadas por 72 h. predominantemente em monocerina nos grupos tratados com 0,0006% e 0,005% (G3 e G4). No entanto, o grupo tratado com G2 colagenase mostrou a degradação de colágenos que elabora claramente o sinal de inflamação.

[00343] Os dados observados na análise SEM na Figura 6 permitem concluir que os animais G3 e G4 tratados com monocerina apresentaram tendência à regeneração dos tecidos e melhor formação de fibronectinas colágenas e glóbulos vermelhos, o que foi indicação de cicatrização em animais. A análise histológica dos tecidos dos animais revelou que a organização da pele e a distribuição de colágeno dos animais tratados com monocerina foi melhor que os grupos G1 ( não tratado e tratamento com veículo G5) e mesmo que G2 (tratamento com colagenase) em 24 horas e 14 dias.

[00344] TENGRUP et al., (1988) mencionaram que uma reação inflamatória persistente com acúmulo de leucócitos polimorfo-nucleares pode ser parcialmente responsável pelo baixo conteúdo de colágeno no tecido de granulação. Uma vez que estas células contêm enzimas degradadoras de colagénio, p. colagenase. Como no grupo tratado com colagenase (G2) os animais feridos na pele mostraram exatamente a degradação dos colágenos e inflamação nos intervalos de 24, 72, 7 e 14 dias. A avaliação clínica mostrou que os grupos tratados com monocerina (G3 e G4) exibiram a organização do tecido de granulação. Este tipo de organização também foi observado pela luz polarizada do microscópio na pele da ferida corada com vermelho de Picrosirius dos grupos tratados com monocerina. Foi possível observar que a distribuição dos colágenos foi mais densa e superior à dos demais grupos controle (G1, G2 e G5), o que evidenciou que o tecido de granulação estava iniciando em seu nível macro molecular.

[00345] Além disso, os grupos G3 e G4 tratados com monocerina apresentaram reepitelização da pele após 24 horas de lesão, também observam que a atividade mais evidente na fase proliferativa da cicatrização, terminando durante a remodelação da matriz extracelular. Os queratinócitos da monocerina nos grupos tratados com 0,005% (G4) estavam presentes na borda das feridas secretam fatores de crescimento que estimulam a proliferação e migração dessas células para a cobertura da área lesada.

[00346] O colágeno, o principal constituinte dérmico, pode ser analisado ou quantificado através de diferentes técnicas, como imuno-histoquímica, reação em cadeia da polimerase por microscopia confocal (PCR) e múltiplas manchas (COELHO et al., 2018). Neste estudo, os cortes histológicos corados com vermelho Picrosirius foram analisados sob microscopia de luz polarizada na figura 37.

[00347] O último estágio da cicatrização da ferida cutânea é a fase de remodelação na qual a matriz extracelular provisória é remodelada. Após 14 dias de tratamento com monocerina a 0,005% (Grupo G3), a área lesada é completamente reepitelizada e ocorre uma resposta contrátil mediada por miofibroblasto. Devido aos seus múltiplos locais de ligação com colágeno, os miofibroblastos se ligam às fibras de colágeno e contraem a redução da área da ferida, como mostrado nos resultados das Figuras 31, 32, 33, 34 e 35.

[00348] Os dados mostram que o metabólito secundário monocerina a 0,0006% e 0,005% realizado em uma formulação em creme estimula a ativação da proliferação de fibroblastos das células epiteliais, o aumento do colágeno tipo 1 e a diminuição do infiltrado inflamatório.

[00349] Durante toda a avaliação histológica por três processos de coloração. por MEV e por microscopia polarizada, é possivel concluir que a monocerina transportada em uma formulação em creme foi um agente eficaz para a remodelação da pele, conforme ilustrado nos resultados, principalmente nas Figuras 31, 32, 33, 34, 35 e 36.

[00350] Os resultados aqui apresentados indicam que a monocerina é um composto muito promissor com potencial para ser aplicado em formulações para cicatrização de feridas.

[00351] Os dados apresentados foram obtidos a partir da primeira etapa dos ensaios in vivo realizados apenas com quatro animais por grupo. Em uma próxima etapa, os ensaios In Vivo serão repetidos com mais quatro animais por grupo para obter dados suficientes para uma análise estatística confiável.

[00352] É evidente que a formulação portadora da monocerina em sua maior concentração de 0,005% foi mais eficaz no processo de cicatrização de feridas. No entanto, a faixa preferencial com formulação contendo monocerina é de 0,0006%, a 0,05%. Esses medicamentos de fontes naturais podem levar a melhores formas de terapia para pacientes com feridas agudas, crônicas e cirúrgicas na pele.

EFEITO DO COMPOSTO ANULARINA I AVALIADO IN VIVO, EM UM MODELO DE FERIDA EXPERIMENTAL NOS CAMUNDONGOS. Avaliação clínica da ferida

[00353] Pela análise clínica (Tabela 29), foi possível observar a presença de sangramento e coagulação nos animais de todos os grupos. No entanto, o mesmo evento esteve presente até o 5° dia para o grupo tratado com colagenase (G2) e até o 3° dia para os grupos tratados com anularina a 0, 005% (G3) e 0, 0006% (G4). Por fim, o grupo que recebeu apenas o veículo (G5) apresentou atraso na cicatrização e recuperação até o 10° dia. Observou-se uma diferença proeminente entre os grupos controle e o grau de cicatrização no quinto e décimo dia nos aspectos clínicos dos grupos tratados com anularina G3 e G4, mostrados na Tabela. A partir da avaliação clínica, as feridas tratadas com anularina I mostraram contração, coagulação, granulação e bordas suturadas ou grampeadas da ferida se contraindo acentuadamente com o tempo e a aplicação de compostos de anularina nas feridas. Portanto, as feridas do grupo controle também foram observadas e mostraram uma cura eficaz no 13° e no 14° dia, que também foram observadas e fotografadas.
Tabela 29. Intensidade da avaliação clínica para edema, hiperemia, sangramento, granulação e formação de crostas

*** = alta intensidade; ** = Média intensidade; * = baixa intensidade; Ausência representada como (-).

Tamanho da ferida

[00354] O tamanho da ferida foi medido diariamente por paquímetro e os tamanhos estão representados, desde as primeiras 24 horas até o 14° dia, para todos os grupos de tratamento. O tamanho da ferida no sétimo dia dos grupos tratados com anularina a 0,005% (Grupo G3) e 0,0006% (Grupo G4) foi de 4,48 ± 0,18 e 4,39 ± 0,10, respectivamente, enquanto durante 10 dias foi de 1,81 ± 0,86 e 1,62 ± 0,30 mm, respectivamente. No 7° e 10° dia, o tamanho do creme comercial com colagenase (Grupo G2) foi maior, sendo 5,62 ± 0,39 e 2,6 ± 0,69 mm, respectivamente (Figura 42, Tabela 30). O tamanho da ferida também é representado no gráfico 1 pelo período de 24 horas, 72 horas e 7° e 14° dia.

[00355] A ilustração gráfica da figura 42 mostra que os grupos tratados com anularina a 0,003% e 0,0005% curaram menos de 14 dias em comparação com os grupos não tratados. Observou-se uma rápida remodelação da pele dos grupos tratados de anularina I. No caso de MsFx pro X ray (Figura 43, Tabela 31), os resultados mostram que os grupos tratados com anularina e os grupos não tratados curaram em 14 dias. Por representação gráfica, também observou que após 24 h até o 7° dia, o tamanho da ferida para os grupos tratados com anularina I diminuiu melhor do que o grupo não tratado; Para o grupo tratado com anularina I, a pele estava mais organizada e compacta e nenhuma cicatriz foi observada. No 14° dia, as feridas dos grupos não tratados foram curadas, mas a cicatriz foi pequena.

[00356] Os resultados obtidos pela Radiografia In Vivo Image indicam que, para os grupos tratados com anularina a 0,005% (Grupo G3) e 0,0003% (Grupo 4), as feridas foram cicatrizadas de forma tão eficaz e precoce, quando comparadas a outros grupos. No caso do grupo tratado com colagenase (G2), as feridas não foram cicatrizadas adequadamente. Para o grupo não tratado (G1), é possível observar que a ferida não foi cicatrizada e houve cicatriz na pele. No caso do grupo que recebeu apenas o veículo (G5) no 14° dia do tratamento, o tamanho das feridas do animal foi maior do que o grupo tratado com anularina. Este efeito é representado na Figura 44.
Tabela 30. Medição do tamanho das feridas diariamente por paquímetro e representada por meio ± DP para quatro animais / grupo em milímetros (mm).

Tabela 31. Medição do tamanho das feridas por imagem radiológica in vivo (MS Fx pro) em milímetros (mm) representada pelos meios ± DP para 2 animais / grupo

ANÁLISE DE HEMATOLOGIA

[00357] As amostras de sangue coletadas dos animais em diferentes intervalos de tempo nas 24 h, 72 h, 7 e 14 dias foram centrifugadas por (Eppendorf ® Centrifuge 5424 R Mini Spin Plus) a 2.000 rpm por 10 minutos para separar o soro e o plasma da amostra de sangue, analisados hematologicamente usando o analisador de hematologia IDEXX ProCyte Dx®.

[00358] Foram analisadas as três principais categorias de células imunes, como glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos), glóbulos brancos (glóbulos brancos) e plaquetas. Conforme mostrado nas Figuras 45 e 46 para a anularina I a 0,003% e 0,0005%, apresentaram os níveis mais altos de hemácias em 24 h, em comparação com outros grupos de controle G1, G2-colagenase e veículo G5. Mais tarde, após 7 dias, o grupo tratado com anularina I principalmente com concentração de 0,003%, com maior número de leucócitos e PLT até o 14° dia, em comparação com os grupos não tratados. Os dados permitem concluir que o grupo tratado com anularina I também prolifera células imunes, o que leva a uma melhor remodelação da pele.

ANÁLISE MORFOLÓGICA DA FERIDA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

[00359] Imagens de microscopia eletrônica de varredura (figura 47) mostram que camundongos do grupo não tratado (G1) e do grupo colagenase (G2) demonstraram integridade da matriz extracelular, mas uma baixa deposição de fibras de colágeno dimensionalmente imaturas quando comparadas com o grupo tratado com anularina a 0,003% e 0,0005 % Os animais do grupo que recebeu apenas o veículo (G5) apresentaram processo inflamatório e presença de coagulação no 7° dia. Além disso, o tecido de granulação parecia frágil com anularina a 0,005% de pomada, possivelmente devido ao aumento da permeabilidade vascular. Imagens ultra-estruturais da derme capturada por MEV mostram os tecidos de granulação dos animais do grupo tratado com anularina a 0,0005% e 0,003% no 7° dia também com presença de numerosas células mortas e células sanguíneas abundantes; também é possível observar fibronectina e glóbulos vermelhos em tecidos infiltrados por capilares. Há evidências consistentes de que mecanismos complexos regulam a correlação entre inflamação e coagulação. As feridas cirúrgicas tratadas com anularina em ambas as concentrações exibiram formações de coágulos e muitas fibronectinas foram observadas após 24 horas e 14 dias.

Avaliação Histológica

[00360] Pela avaliação histológica dos retalhos cutâneos pela coloração da Hematoxilina Eosina (HE), foi possivel observar regressão das lesões com melhor epitelização nos grupos não tratado (G1) e tratado com colagenase (G2), mas esse processo foi mais eficaz, mostrando melhor re -organização da derme em ambos os grupos tratados com anularina I até o 14° dia.

[00361] A indicação clara dos tecidos histológicos da ferida nas experiências de 24 e 72 h, 7 e 14 h dias foi mostrada nas Figuras 47 a 51. Para o grupo não tratado (G1), é possivel observar: (H&E) - tecido cicatricial visível grande número de fibroblastos células e vasos sanguíneos (seta amarela); (PR) redução de colágeno necrose densa e organizada (seta laranja); (MT) grande número de células inflamatórias cicatrizes visíveis (setas vermelhas) estavam presentes.

[00362] No caso de tratamento com colagenase (G2): cicatrizes de inflamação (H&E), inflamação dos tecidos adiposos das células necróticas (PR); (MT) grande número de células inflamatórias resistiu claramente às células de resposta imune na cicatrização de feridas. Para o tratamento com anularina I em 0,003% e 0,0005%, as evidências são: (H&E) - boa distribuição de células epiteliais e tecido cutâneo organizado; (PR) colágeno e camada epitelial densa; (MT) grande formação de fibroblastos, células inflamatórias reduzidas foram marcadas nas figuras s de 24 h e 72 h, intervalos de tempo de 7 e 14 dias tecidos manchados.

[00363] A distribuição do poço de colágenos nos grupos tratados com anularina e as forças mecânicas dos colágenos são mais fortes e organizadas em comparação aos grupos de controle. Os grupos tratados com anularina mostraram melhores camadas celulares epiteliais e há alta distribuição de colágeno (PR); um grande número de células de fibroblastos indica sinais de cura e os colágenos também estavam apoiando a regeneração da pele observada e marcada também em (MT); células de fibroblastos abundantes e a camada de epiderme foram mais organizadas em grupos tratados com anularina.

[00364] Portanto, mais fraca distribuição e intensidade de colágenos no grupo tratado com veículo também em (H&E) - colorindo grande número de células inflamatórias; (PR) privação de colágenos; (MT) grande número de células adiposas inflamatórias foi observado até o 14° dia.

ANÁLISE DE TECIDOS DE VERMELHO DE PICROSIRIUS USANDO MICROSCÓPIO POLARIZADO - DADOS PARA MONOCERINA E ANNULARINA I

[00365] O corante vermelho de Picrosirius tem a capacidade de aumentar a birrefringência natural do colágeno quando exposto à luz polarizada.

[00366] A intensidade da formação de colágeno induzida pelos grupos tratados com monocerina e anularina I foi maior ao longo dos 14 dias de tratamento, em comparação aos controles (Figuras 53 e 54). Para ambos os compostos, a maior concentração mostrou mais intensidade de colágeno em comparação com as menores concentrações. Após os 7 dias, os grupos tratados com colagenase mostraram que a intensidade dos colágenos estava degradada e os resultados calculados mostraram a menor intensidade dos colágenos em 7 e 14 dias.

[00367] A avaliação por coloração com vermelho de Picrosirius permitiu reconhecer a densidade total de colágeno devido à presença de fibras de colágeno (amarelo avermelhado na figura 55). A área ocupada pelas fibras de colágeno foi quantificada usando o Image J e o software Graph Pad Prism 5.1, apresentado nas Figuras 53 e 54. Os dados foram obtidos para quatro animais de cada grupo e representados pela porcentagem de média ± DP. O valor final foi representado comparando todos os grupos com os grupos controles (controle, colagenase e veículo). A porcentagem de colágeno foi mais intensa nos grupos tratados com monocerina e anularina I em todas as concentrações durante todo o tempo das experiências. A maior porcentagem de colágeno foi observada no experimento de 14 dias e mostrada no gráfico 6 e 7.

[00368] O colágeno tipo I mostraria uma cor amarelo-vermelho, enquanto o tipo III seria verde, como mostrado na Figura 12. Às 24 e 72 h, os grupos tratados com monocerina e anularina I mostraram um arranjo denso e compacto de colágeno em comparação aos grupos controle (controle , colagenase e veículo). Nas 24 e 72 horas, o grupo controle não tratado mostrou uma expressão significativamente baixa de colágenos.

[00369] No tratamento por 7 dias, houve uma clara diferença observada entre os grupos controle e os grupos tratados com monocerina e anularina I, que mostraram uma quantidade mais densa e compacta de colágenos. A população de fibras de colágeno exibiu cores de polarização no vermelho-laranja, enquanto para os controles as fibras de colágeno eram esparsas e imaturas. O controle do grupo não tratado exibiu intensa birrefringência verde - amarela, sugerindo que o conteúdo de colágeno foi reduzido e suas fibras estavam muito frouxamente compactadas.

[00370] No entanto, no 14° dia, os grupos tratados com monocerina e anularina I apresentaram mais fibras amarelas e vermelhas, o que foi visto possivelmente indicando a presença de colágeno tipo I. As fibras verdes (típicas do colágeno tipo III) foram mais frequentemente localizadas na derme superior e na epiderme nos grupos tratados com anularina. Os grupos controle (controle, colagenase e veículo) apresentaram fibras grossas vermelhas e amarelas (típicas do colágeno tipo I) localizadas na derme profunda inferior. No geral, os grupos tratados com monocerina e anularina I mostraram arranjo de fibras colágenas visíveis e organizadas dos grupos tratados com anularina.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[00371] Em outro aspecto da presente invenção, proporcionam-se aqui composições farmacêuticas que compreendem o composto (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil-2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona (monocerina), e pelo menos, um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00372] Em outro aspecto, proporcionam-se aqui composições farmacêuticas que compreendem o composto 4-metoxi-5-metil-6-butil-2H-piran-2-one (anularina I), e pelo menos, um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00373] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável” inclui, mas não está limitado a qualquer veículo que não interfira com a eficácia da atividade biológica dos dos princípios ativos e que não seja tóxico para o paciente a quem é administrado. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões óleo / água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Tais veículos podem ser formulados por métodos convencionais e podem ser administrados ao indivíduo na dose e em esquemas terapêuticos mais adequados a cada caso. De preferência, as composições são estéreis, mas também podem ser preparadas em condições assépticas. Estas composições podem também conter adjuvantes, conservantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. As formulações farmacêuticas podem ser para uso humano, e/ou veterinário/animal. As formulações podem ser preparadas na forma de sistemas particulados como por exemplo, micropartículas, nanopartículas, microesferas, nanoesferas, lipossomas, em complexos carreadores como em ciclodextrinas (alfa, beta e gama); ainda na forma de liberação controlada. As formulações podem ser preparadas pela associação dos compostos monocerina e anularina I nas proporções e doses/concentrações mais adequadas. As formulações podem ser na forma de cremes, pomadas, géis, adesivos, sprays, incluindo ainda formulações de base nanotecnológica, ou ainda a associação com outros princípios ativos de mesmo efeito biológico, ou ainda associação com antimicrobianos.

[00374] A administração das composições da presente invenção pode ser efetuada por diferentes maneiras, por exemplo por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica, particularmente, as principais são cutânea, subcutânea, tópica, intradérmica, retal, intraocular, nasal e auricular.

[00375] A via de administração, é claro, depende do tipo de tratamento e do tipo de composto contido na composição farmacêutica. O regime de dosagem será determinado pelo médico e de outros fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o peso do paciente, a área de superfície corporal, a idade, o sexo, a composição farmacêutica carreando o composto em particular a ser administrado, o tempo e via de administração, o tipo de terapia, estado geral de saúde e outros fatores a serem considerados e administrados concomitantemente.

USO DAS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DA PRESENTE INVENÇÃO.

[00376] A presente invenção se refere ao uso de metabólito secundário produzido pelo fungo Exserohilum rostratum na regeneração celular. Particularmente, a presente invenção se refere ao uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I obtidos a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum para preparação de medicamentos para regeneração celular, preferencialmente, regeneração celular em células endoteliais HUVEC e fibroblastos normais FN1.

[00377] Particularmente, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas como agente indutor de proliferação celular, preferencialmente, no reparo de tecidos.

[00378] Assim, as concretizações apresentadas na presente invenção não limitam a totalidade das possibilidades, será entendido que várias omissões, substituições e alterações podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

[00379] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidos e contemplados.

[00380] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceitual. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

REFERÊNCIAS

[00381] Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade:

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Claims (16)

1. Composição farmacêutica para regeneração celular e tecidual caracterizada pelo fato de que compreende o composto (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil- 2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona (monocerina) e um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a monocerina está na composição em uma concentração entre 0,0006% a 0,005%
3. Composição farmacêutica para regeneração celular caracterizada pelo fato de que compreende o composto 4-metoxi-5-metil-6-butil-2H-piran-2-one (anularina I) e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a anularina I está na composição em uma concentração entre a 0,0006% a 0,005%.
5. Composição farmacêutica para regeneração celular caracterizada pelo fato de que compreende a associação dos compostos (2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil- 2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona (monocerina) e 4-metoxi-5-metil-6-butil-2H-piran-2-one (anularina I) e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Processo de produção de metabólitos secundários a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   • a) cultivar o fungo E. rostratum em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono por 15 dias entre 25°C a 45° C, sem agitação, ou com agitação atingindo até 400 rpm,
   • b) submeter o caldo da cultura a congelamento, entre zero a -20°C por pelo menos 48-72 horas e em seguida proceder nova filtração em membrana de vidro, para remoção de resíduos de cultura como esporos e/ou micelas fúngicas para posterior extração em fase sólida (Solid Phase Extraction - SPE) com cartucho C18 (Spe-ed SPE Cartridges - Octadecyl C18/18%),
   • c) remover os resíduos do meio de cultura e impurezas com metanol a 20% no cartucho,
   • d) extrair o material retido com um solvente orgânico, e
   • e) obter a fração SPE100.
7. Processo de produção de metabólitos secundários, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa a, o meio contendo uma fonte de carbono é, preferencialmente, um meio batata dextrose (BD).
8. Processo de produção de metabólitos secundários, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa b, a extração, opcionalmente pode ser também por extração líquido-líquido (ELL) usando solventes como acetato de etila, hexano, diclorometano, ou a extração pode ser feita também em fase sólida usando discos de Octadecil C18/18%.
9. Processo de produção de metabólitos secundários, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa e, o solvente orgânico pertence ao grupo selecionado entre metanol, acetonitrila, acetato de etila, preferencialmente, metanol a 100%.
10. Processo de produção de metabólitos secundários, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda submeter a fração SPE100 a uma etapa de fracionamento.
11. Processo de produção de metabólitos secundários, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que na etapa de fracionamento a fração SPE100 é submetida à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em coluna C18, C8 ou fenil (250 x 4,6 mm; 250 x 7,75 mm; ou 250 x 10 mm) e sistema de eluição isocrática variando de 44 a 60% com fluxo de 1,0 a 4 mL/min (solução A:H2O/TFA, 99,9/0,1%; solução B: MeOH/H2O/TFA, 90:9,9:0,1%), e duas frações principais (F1 e F2) foram obtidas e repurificadas usando coluna C18, C8 ou fenil (250 x 4, 6 mm; 250 x 7,75 mm; ou 250 x 10 mm) com eluição isocrática de 44 a 60%, ou sistema de eluição com gradiente de 0 a 50-56 % de B seguido de isocrático de 50-56 % B em 25-30 minutos e gradiente de 5056% B a 0 % de B em 10 minutos.
12. Processo de produção de metabólitos secundários, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que frações F1 e F2 obtidas são os compostos monocerina -(2S,3aR,9bR)-6-hidroxi-7,8-dimetoxi-2-propil-2,3,3a,9b-tetra-hidro-5H-furo[3,2-c] isocromen-5-ona, e anularina I -4-metoxi-5-metil-6-butil-2H-piran-2-one, respectivamente.
13. Uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I produzidos a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum conforme definido pelas reivindicações 6 a 12 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para regeneração celular.
14. Uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é como agente indutor de proliferação celular, preferencialmente, no reparo de tecidos.
15. Uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o reparo de tecidos é, preferencialmente, na cicatrização de feridas.
16. Uso dos metabólitos secundários monocerina e anularina I produzidos a partir da cultura do fungo Exserohilum rostratum conforme definido pelas reivindicações 6 a 13 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para ação antifúngica contra Cryptococcus neoformans, Trichophytum rubrum, Candida albicans e Aspergillus fumigatus com concentrações inibitórias mínimas de 31,25 a 500 μg/mL.

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