BR102019015858A2

BR102019015858A2 - Método e kit para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise

Info

Publication number: BR102019015858A2
Application number: BR102019015858-1A
Authority: BR
Inventors: Afonso Luis Barth; Maiara Dos Santos Carneiro
Original assignee: Hospital De Clínicas De Porto Alegre; Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-02-09

Abstract

método e kit para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise resumo: a presente invenção pertence ao setor de microbiologia clínica, refere-se, mais especificamente, a um kit e processo para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise em maldi tof ms, resultando em diminuição do risco biológico inerente ao transporte bacteriano. tal solução apresenta uma forma de transportar sem risco biológico a biomassa bacteriana de laboratórios de pequeno porte que não possuem acesso a tecnologia de maldi tof ms, devido ao custo do equipamento, para laboratórios de referência. alternativas já publicadas de transporte incluem o envio de bactérias em culturas puras ou, alternativamente, através de swab contendo meio de transporte, para execução da técnica direta de maldi tof ms é necessário crescimento bacteriano em meio de cultura, logo a segunda forma de transporte convencional requer necessariamente o repique para meio de cultura, então além de ambas formas de transporte convencional apresentarem alto risco biológico e requerem medidas protetivas de biossegurança, a segunda forma de transporte aumenta em 24h o tempo de obtenção da identificação bacteriana. a utilização do transporte de bactéria proposto é isenta de risco biológico, já que os microrganismos são inviabilizados antes da impregnação em papel filtro sem prejuízo da identificação em maldi tof ms. o kit ora proposto é composto de uma cartela de papel filtro com espaço para 10 isolados bacterianos e respectivas identificações, um frasco de agente bactericida, além de todo o material necessário para a impregnação da bactéria. após o recebimento da cartela de transporte, os spots impregnados são submetidos a processo de extração com solventes orgânicos para posterior análise em maldi tof ms e a identificação bacteriana é obtida.

Description

MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE

Campo de aplicação

[01] De uma maneira geral a presente invenção pertence ao setor de microbiologia clínica, refere-se, mais especificamente, a um kit e processo para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise em MALDI TOF MS, resultando em diminuição do risco biológico inerente ao transporte bacteriano.

Antecedentes da Invenção

[02] O tempo estendido na identificação microbiana é uma ameaça para o tratamento de um grande número de infecções causadas por bactérias. O tratamento empírico e muitas vezes errôneo das infecções causadas por microrganismos, em grande parte resultam em doenças de curso prolongado e um risco aumentado de morte ao paciente. A identificação errônea ou incompleta era considerada um problema clínico apenas em infecções hospitalares, e, geralmente, restrito apenas aos pacientes mais graves, no entanto, atualmente é sabido que as infecções estão amplamente disseminadas, que tem a potencial capacidade de afetar qualquer pessoa, de qualquer idade em qualquer país e em qualquer contexto epidemiológico (associado ou não aos cuidados com a saúde).

[03] A identificação de Bacilos Gram Negativos é feita, tradicionalmente, pela avaliação da utilização de diferentes carboidratos e outros testes bioquímicos (em provas manuais ou automatizadas), os quais permitem a identificação em nível de espécie da maioria dos isolados de importância clínica da ordem Enterobacterales. No entanto, a identificação precisa em nível de subespécie ou de espécies dentro de um mesmo complexo ou mesmo de espécies recém descritas não é possível de ser feita apenas com os testes bioquímicos convencionais.

[04] Da mesma forma, a identificação dos bacilos Gram negativos não fermentadores da glicose (como as espécies dos gêneros Acinetobacter spp. e Pseudomonas spp.) também requerem provas adicionais aos testes bioquímicos convencionais e podem representar um desafio para muitos laboratórios de bacteriologia clínica. De fato, para a identificação bacteriana mais precisa é necessário utilizar técnicas muito mais acuradas que as provas bioquímicas que permitem a identificação de subespécies ou espécies que têm características fenotípicas muito similares.

[05] Idealmente, o tratamento com antimicrobianos deveria ser baseado na identificação e no perfil de suscetibilidade in vitro. Entretanto, tais testes de identificação necessitam em torno de 16 a 18 horas de incubação para que a bactéria seja identificada após crescimento em meio de cultura. É consenso que o tempo até o início da terapia antimicrobiana e a escolha adequada da mesma impactam no desfecho das doenças infecciosas.

[06] Uma das tecnologias mais modernas que vem sendo utilizada em laboratórios de microbiologia e revolucionando a forma de identificação microbiana utiliza espectrometria de massa sendo denominada “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry (MS). Tal sucesso é essencialmente associado a simplicidade, a rapidez na identificação de microrganismos, a classificação taxonômica exata e ao baixo custo de reagentes. O MALDI-TOF consiste em um sistema no qual o microrganismo (bactéria ou fungo isolado em meio de cultura) é colocado em uma placa metálica juntamente com uma matriz polimérica. Feixes de laser emitidos pelo equipamento vaporizam e ionizam a amostra em diversos fragmentos de proteínas ribossomais, que são aspiradas num tubo de vácuo e levadas a um detector. Conforme o tamanho e a carga do fragmento de proteína, o tempo de chegada ao detector (“time of flight”) é diferente. Os espectros obtidos são comparados com uma base algorítmica que geram scores (razão de carga e massa) em relação aos espectros de referência (banco de dados) em tempo real. Para cada espécie bacteriana ou fúngica, obtémse um perfil gráfico específico. Uma base de dados computadorizada interpreta e fornece o resultado/identificação.

[07] O equipamento de MALDI TOF MS apresenta grande versatilidade, já que pode ser utilizado desde a identificação convencional de microrganismos até a detecção de resistência. Assim, a técnica MALDI TOF MS permite resultados reprodutíveis e confiáveis combinados com o rápido processamento de amostras.

[08] A implementação do MALDI-TOF MS nos laboratórios de microbiologia vem reduzindo o tempo para liberação de exames culturais em aproximadamente 24 horas. Com esta tecnologia, a identificação em nível de espécie pode ser realizada em menos de 10 minutos a partir de colônias isoladas, e a identificação pode ser realizada diretamente de fluidos corporais, como sangue e urina.

[09] Os materiais para identificação bacteriana no sistema de MALDI TOF MS apresentam custos muito baixos, no entanto, é necessário um alto investimento inicial para obter o equipamento. A maioria dos laboratórios brasileiros não possuem equipamentos de MALDI-TOF sendo que o transporte de isolados clínicos de laboratórios de menor porte para laboratórios de maior porte já tem sido uma rotina no Brasil.

[010] A preparação usual da amostra a ser identificada no sistema MALDI TOF MS utiliza uma colônia bacteriana obtida de crescimento puro em cultura, a qual é depositada diretamente na placa alvo. No método usual, as bactérias são viáveis e os aspectos de biossegurança devem ser sempre considerados quando há transporte de microrganismos, seja pelo correio convencional quanto por empresas de “courier”. O desenvolvimento de metodologias que envolvam redução ou eliminação deste risco biológico se faz necessário para que seja possível que instituições de menor porte tenham acesso aos benefícios da tecnologia de MALDITOF MS, via laboratórios de referência.

[011] O papel filtro vem sendo usado há mais de 20 anos com o propósito de coletar amostras de sangue, especialmente de recém-nascidos, com a finalidade de identificar e/ou medir componentes que auxiliem no diagnóstico de doenças. Diversas publicações já reportaram o uso de papel filtro previamente tratado com conservantes/anticoagulantes para possibilitar/otimizar o transporte e análise de materiais biológicos. O uso de papel filtro para o transporte de amostras bacterianas pode beneficiar significativamente o envio de microrganismos para laboratórios de referência.

[012] Diante do papel fundamental do laboratório de microbiologia na identificação bacteriana rápida e acurada, fica clara a importância da adequação das técnicas tradicionais de envio de amostras bacterianas através de desenvolvimento de alternativas de transporte entre laboratórios.

[013] Disto, também existem algumas alternativas que representam o atual estado da técnica e que são descritas em documentos de patentes. Alguns exemplos podem ser observados como no caso da patente de invenção WO2010127059 “MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF MICROORGANISMS IN SAMPLES” a qual faz referência a um sistema para análise por espectrometria de massa de microrganismos em amostras transportadas em material poroso, que lança mão da tecnologia de paper spray Ionization.

[014] É possível citar as patentes US20160122795 “MICROORGANISM CULTURING MATERIAL AND METHOD FOR DETECTING MICROORGANISMS” a qual faz referência a um composto polimérico para cultura de microrganismos, a patente BR200410640 “DEVICE OF CULTURE OF ORGANISMS AND METHOD OF CULTURE” que trata-se de um aparelho para cultura de microrganismos que pode ser preparado e armazenado por longo período sem restringir uma espécie de organismo a ser cultivado e a patente US7695900 “METHOD AND DEVICE FOR DETECTING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES” que descreve um método para detectar substâncias biologicamente ativas através de luminescência e fornece suporte para transportar substâncias a serem testadas, porém todos os dispositivos acima citados exigem o correto acondicionamento e medidas de biossegurança quando transportados para outro laboratório.

[015] Há também as patentes US20130089887 A1 “METHOD FOR RAPID DETECTION AND IDENTIFICATION OF MICRO-COLONIES USING IMPREGNATED POROUS” tal patente descreve um método para detecção e identificação de colônias e micro-colônias de microrganismos que crescem na superfície de um ágar levando em consideração suas necessidades nutritivas e a patente WO2017138046 “CULTURE MEDIUM WITH TWO LAYERS FOR DETECTING MICROORGANISM” que faz referência a um meio de cultura cromogênico, no qual a bactéria é capaz de degradar o substrato e alterar a coloração do meio, apesar de serem testes relativamente simples, são limitados pois não atendem as necessidades nutricionais de todos os microrganismos, ou seja, não fazem distinção entre espécies e em muitos casos há a necessidade de identificação em centros de referência.

[016] Já a patente WO9966304 “TRACE LEVEL DETECTION OF ANALYTES USING ARTIFICIAL OLFACTOMETRY” faz menção a um dispositivo para detectar a presença de um analito em material absorvente capaz de absorver e dessorver o analito posteriormente, similar a presente proposta, entretanto, tal patente é empregada na detecção de várias condições médicas com exceção de análises bacteriológicas.

[017] A patente GB2024421 “DETECTION OF PATHOGENS IN BLOOD” aborda um processo e dispositivo para a detecção de patógenos, como bactérias, fungos e vírus, no sangue. O patógeno é separado através de circulação extracorpórea do sangue e se liga seletivamente ao dispositivo e é analisado por métodos microbiológicos ou microscopia eletrônica, tratando-se de um método complexo devido ao número de etapas e necessidade de equipamentos sofisticados.

[018] A patente EP1113269 A2 “TEST TRAY, KIT AND METHODS FOR SCREENING BODY FLUIDS OF NEWBORNS BY TANDEM MASS SPECTROMETRY” descreve um teste, kit e método para uso na triagem de recém-nascidos para distúrbios metabólicos. As amostras são armazenadas individualmente em um cartão de papel filtro e posteriormente são analisadas por espectrometria de massas em tandem.

[019] A patente WO2012145390 “CARDS FOR SAMPLE STORAGE AND DELIVERY COMPRISING SINTERED POROUS PLASTIC” reporta cartões de plástico poroso que pode ser utilizado na coleta de amostras líquidas, no armazenamento, transporte e/ou entrega de um analito. Assim com o papel filtro, são considerados inertes e de fácil manuseio.

[020] A patente 102017027176-5 "KIT E MÉTODO PARA TESTE DE DEFICIÊNCIA DA ENZIMA DPD A PARTIR DE SOBRECARGA COM URACIL E COLETA DE SANGUE SECO EM PAPEL" refere-se, a um kit e método para teste de deficiência da enzima DPD (dihidropirimidina desidrogenase) onde o analito também é impregnado em um cartão de papel filtro.

[021] Com isso, a partir dos inconvenientes listados acima, é visível a existência de uma lacuna na criação de um kit e processo para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise em MALDI TOF MS, o qual resultará em diminuição do risco biológico inerente ao transporte bacteriano.

Sumário da Invenção

[01] A presente invenção propõe uma forma inovadora de transportar bactéria inativada em papel filtro para análise em equipamento de MALDI TOF MS e, portanto, facilitando o envio de amostras de laboratórios de pequeno porte que não dispõem dessa tecnologia para laboratórios de referência.

[02] A presente invenção emprega uma metodologia que tem revolucionado a forma de identificação microbiana, entretanto, a forma convencional de identificação através do MALDI TOF MS requer crescimento bacteriano fresco em meio de cultura (elevado risco biológico), já nessa proposta a bactéria é transportada de forma inativada em papel filtro, dessa forma, apresenta facilidades, não só no transporte bacteriano, como também na logística, uma vez que a amostra inativada não requer medidas de biossegurança no transporte bacteriano, acarretando em diminuição do custo associado ao mesmo.

[03] Alternativamente, a presente invenção permite o envio das amostras em envelope padrão e em temperatura ambiente, com alta estabilidade e sem prejuízo da qualidade de identificação bacteriana, dispensando a necessidade de medidas de contenção do risco biológico.

[04] Os resultados obtidos, através do kit e método ora propostos não são comparáveis de forma direta a nenhum outro invento, já que não há registros de patentes de transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise em MALDI TOF MS. Assim, a solução proposta, permite de forma inédita, obter resultados confiáveis de identificação bacteriana a partir de um meio de transporte alternativo (papel filtro) e mais seguro, já que não apresenta potencial infectante.

[05] Desta forma, a presente solução incorpora a combinação de acessibilidade ao equipamento de MALDI TOF MS, com os ganhos de praticidade e logística das amostras inativadas e impregnadas em papel filtro.

[06] A solução apresentada permite o amplo acesso ao equipamento de MALDI TOF MS para fins de identificação bacteriana, podendo-se prever uma extensa aplicação no setor de bacteriologia clínica.

[07] Portanto, resumidamente, com o objetivo de sanar as falhas do estado atual da técnica destacadas acima, a presente invenção visa propor uma solução para o problema principal, relacionado ao risco biológico associado ao transporte bacteriano, através de um método de simples execução no qual a bactéria é inativada antes do transporte para análise em MALDI TOF MS.

Breve descrição das Figuras

[08] A fim de que a presente invenção seja plenamente compreendida e levada à prática por qualquer laboratório, a mesma será descrita tendo como base os desenhos anexos:

[09] Figura 1: representa o diagrama de blocos da etapa pré analítica do método proposto na presente invenção.

[010] Figura 2: representa o diagrama de blocos da etapa analítica do método proposto na presente invenção.

[011] Figura 3: representa o cartão de papel filtro de aplicação das amostras a serem transportadas, evidenciando o local onde elas devem ser aplicadas.

Descrição detalhada da Tecnologia

[012] A presente invenção propõe um kit composto de materiais que permitem a inativação, impregnação e armazenamento de bactéria em papel filtro. Além disso, propõe um processo para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise em MALDI TOF MS.

[013] O kit para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro, que compreende a invenção, é composto basicamente de um cartão de papel filtro com espaço para 10 isolados bacterianos e respectivas identificações, um frasco de agente bactericida, envelope plástico para o transporte do cartão de coleta, material necessário para a impregnação da bactéria, eppendorfs de 1,5 mL, além de suporte plástico para transporte não refrigerado dos componentes e manual de instruções para inativação.

[014] O cartão para coleta trata-se de um suporte de papel filtro onde serão depositadas, em espaços demarcados e destacáveis, as células bacterianas inativadas correspondentes ao isolado bacteriano a ser identificado, cada cartão possui espaço para 10 isolados bacterianos com suas respectivas informações. O papel filtro de escolha pode ser Whatman 903 ou similar, sendo que a dimensão por amostra deste papel deve ser suficiente para aplicação de uma alça de 10 µL de biomassa bacteriana, compreendendo uma área de 1 cm x 1 cm.

[015] A biomassa bacteriana deve ser adicionada em eppendorfs estéreis (em quantidade correspondente a uma alça de 10 µL) e posteriormente 1 mL do agente bactericida, que é envasado em frasco de 10 mL, deve ser adicionado, misturado até a formação de uma solução homogênea e deixado em repouso por 15 minutos. Após a completa inativação bacteriana, deve-se centrifugar a mistura e impregnar o pellet no cartão de papel filtro no espaço demarcado para cada isolado, cobrindo toda a superfície. Dessa forma, a amostra biológica é depositada através da compressão da biomassa bacteriana na área visualmente delimitada.

[016] A invenção prevê um método de inativação de células bacterianas para transporte de amostras impregnadas em cartões de papel filtro para posterior análise em MALDI TOF MS. Na figura 1 e 2 é apresentado o diagrama de blocos para melhor compreensão das etapas do método. O processo deve ser realizado a partir de crescimento bacteriano fresco (cultura de 18 a 24 horas), a fim de garantir a integridade dos componentes bacterianos, mais especificamente, das proteínas ribossomais. Uma vez coletado o material, o cartão de coleta deve ser seco ao ar ambiente e acondicionado em envelope plástico para evitar a entrada de umidade no cartão durante o transporte.

[017] A amostra deve ser destacada do cartão de coleta nos pontos de impregnação de biomassa bacteriana, a qual deve ser extraída do disco de papel filtro através de solventes orgânicos, adiciona-se 150 µL de ácido fórmico 70%, homogeneíza-se e adiciona-se a mesma proporção de acetonitrila absoluta, homogeneíza-se até que haja a visualização de turvação no tubo e, posteriormente, concentra-se através de processo de centrifugação. O sobrenadante é depositado na placa de MALDI TOF MS, recoberto com 1 µL de matriz (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid - HCCA) e submetido a análise em equipamento de espectrometria de massa - MALDI TOF, onde feixes de laser emitidos pelo equipamento vaporizam e ionizam a amostra e são aspirados num tubo de vácuo e levadas a um detector. Conforme o tamanho e a carga do fragmento de proteína, o tempo de chegada ao detector é diferente. Os espectros obtidos são comparados com uma base algorítmica que geram scores em relação aos espectros de referência. Os critérios interpretativos (Bruker MALDI Biotyper) foram utilizados da seguinte forma: ≥ 2,3 (+++), ≥ 2 a 2,29 (++), ≥ 1,7 a 1,99 (+) e <1,7 (-).

[018] Tal teste com a utilização de biomassa bacteriana inativada em papel filtro apresentou sensibilidade de 97,3% e especificidade de 100%, considerando as identificações com escores ≥ 1,7.

[019] Tratou-se no presente relatório descritivo de um kit e método inovador para transporte de células bacterianas inativadas em papel filtro para análise em MALDI TOF MS, dotado de novidade e atividade inventiva, requisitos essenciais para a concessão do privilégio.

Claims

MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE caracterizado por um cartão de coleta de papel filtro específico para transportar células bacterianas inativadas com espaço para 10 isolados bacterianos e respectivas identificações, um frasco de agente bactericida, envelope plástico para o transporte do cartão de coleta, material necessário para a impregnação da bactéria, eppendorfs de 1,5 mL, além de suporte plástico para transporte não refrigerado dos componentes e manual de instruções para inativação.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado por um frasco de agente bactericida.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado por envelope plástico para o transporte do cartão de coleta.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado por material necessário para a impregnação da bactéria.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado por eppendorfs de 1,5 mL.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado por suporte plástico para transporte não refrigerado dos componentes.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado por manual de instruções para inativação.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE de acordo com a reivindicação 1, e ainda caracterizado pelo papel ser Whatman 903 ou similar, sendo que a dimensão por amostra deste papel deve ser suficiente para aplicação de uma alça de 10 µL de biomassa bacteriana, compreendendo uma área de 1 cm x 1 cm.
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE caracterizada por compreender os seguintes processos:
a) Subcultivar a bactéria em meio de cultura;
b) Passar uma alça de 10 µL de bactéria para eppendorf de 1,5 mL;
c) Adicionar 1 mL de solução bactericida;
d) Misturar até a formação de uma solução homogênea;
e) Deixar em repouso por 15 minutos a temperatura ambiente;
f) Centrifugar a 13.000 rpm por 3 minutos;
g) Retirar o sobrenadante;
h) Impregnar o pellet em papel filtro;
i) Deixar secar em temperatura ambiente;
j) Acondicionar em envelope plástico;
k) Enviar para transporte;
l) Destacar a amostra do cartão de coleta;
m) Extrair com solventes orgânicos;
n) Homogeneizar até a obtenção de turvação;
o) Centrifugar a 13.000 rpm por 3 minutos;
p) Pipetar 1 µL do sobrenadante na placa alvo;
q) Recobrir com 1 µL da matriz polimérica HCCA;
r) Analisar em equipamento de MALDI TOF MS – BRUKER.
- i. A etapa “b” deve ser realizado com cultivo de bactéria fresco (18 a 24 horas);
- ii. A etapa “h” deve ser realizada comprimindo-se a biomassa bacteriana na área visualmente delimitada do cartão de coleta;
- iii. A etapa “m” deve ser realizada através da adição de 150 µL de ácido fórmico 70% e Adicionar 150 µL de acetonitrila absoluta;
MÉTODO E KIT PARA TRANSPORTE DE CÉLULAS BACTERIANAS INATIVADAS EM PAPEL FILTRO PARA ANÁLISE conforme reivindicação 9, e ainda caracterizado pela etapa “r” ser associada utilização da técnica de Espectrometria de Massas – MALDI TOF.