BR102019007065A2 - Preparação probiótica, sorbet à base de fruta com probiótico e processos para sua obtenção - Google Patents

Abstract

probióticos são suplementos alimentares de microrganismos vivos com efeitos benéficos no hospedeiro pela melhora do balanço intestinal, aprimoramento da resposta imune, adesão ao trato intestinal e produção de substâncias com propriedades antimicrobianas. dentre os microrganismos considerados probióticos, somente aqueles classificados como bactérias do ácido lácticas são considerados importantes em relação à alimentação, com destaca para o lactobacillus plantarum. o sorbet é uma sobremesa gelada à base de fruta sem adição de leite e açúcar e enriquecido com probiótico é tendência alimentar. o objetivo foi disponibilizar um bioprocesso de produção do lactobacillus plantarum ufsjp2 a fim de se obter uma maior biomassa da cepa e menor custo de produção, através do enriquecimento do soro de leite, utilizando o fatorial completo e um delineamento composto central rotacional. a cepa ufsjp2 apresentou atividade microbiana contra linhagens de salmonella e staphylococcus aureus e alta adesão em células ht-29, promovendo a inibição de 35% de salmonella nas células ht-29. a produção de biomassa celular da cepa ufsjp2 foi de 787% maior em relação ao soro de leite não suplementado, com uma produção de 3,7 x 1010 ufc ml-1. a viabilidade da cepa ufsjp2 no sorbet foi comprovada com 1 mês no alimento refrigerado a -20ºc.

Description

PREPARAÇÃO PROBIÓTICA, SORBET À BASE DE FRUTA COM PROBIÓTICO E PROCESSOS PARA SUA OBTENÇÃO CAMPO DE APLICAÇÃO

[01] A presente invenção abrange uma preparação probiótica da cepa UFSJP2 (Lactobacillus plantarum); o bioprocesso para sua obtenção; sorbet à base de fruta com probiótico viável e o processo para sua obtenção.

ESTADO DA TÉCNICA Sorvetes / Sorbet

[02] Acredita-se que sorvetes surgiram há mais de 4 mil anos na China, onde se misturavam neve com frutas e outros tipos de especiarias fazendo uma espécie de sorvete. A técnica foi reformulada pelos persas, no qual se transformou em uma calda gelada chamada de sharbet, e mais tarde evoluiu com os gregos para um gelado sem leite chamado de sorbet (Júnior, J. C. L., da Silva Junior, H. X., Júnior, A. C. D. O. M. Possibilidade de automação para indústria de sorvete predominantemente manual., XIV CEEL, Universidade Federal de Uberlândia, UFU, 2016). Em 2012, Ledeker (Ledeker C. N. et al. Changes in the sensory characteristics of mango cultivars during the production of mango purée and sorbet. Journal of Food Science, v. 77, n. 10, p. S348-S355, 2012) definiu o sorbet como uma sobremesa congelada sem lactose e tipicamente sem gordura contendo uma mistura de purê de frutas, açúcar e água que é congelada e agitado para incorporar ar. Por não possuir em sua formulação nenhum tipo de gordura vegetal ou animal, apresenta uma consistência bem leve e fina. Seu aspecto se assemelha a de uma raspadinha, como pequenos cristais de gelo que se misturam ao sabor adicionado. Devido a essas características o sorbet é utilizado na gastronomia para limpar o paladar entre um prato e outro (Migoya F. J. Frozen desserts. Editora John Wiley trade, 1a Edição, 448 p., 2008).

[03] A ausência de gordura na formulação difere o sorbet de sorvetes convencionais. Em decorrência desta não adição de gordura em sua composição, estudos foram realizados para demonstrar que algumas frutas fornecem ao sorbet uma de sensação de gordura e revestimento na boca, mesmo na ausência de laticínios (Thompson K. R., Chambers D. H., Chambers I. V. E. 2009. Sensory characteristics of ice cream produced in the U.S.A and Italy. J. Sens. Stud., v. 24 n. 3, p. 396-414, 2009). Além disso o sorbet tem ausência de conservantes, por esse motivo estudos foram feitos para qualificar o sabor e frescor do sorbet após um período de tempo. Os resultados demonstraram que as baixas temperaturas de congelamento reduzem a volatilidade de compostos aromáticos, sendo assim, mesmo com a ausência de aromatizantes artificiais e gorduras, o sorbet consegue manter o seu sabor e aroma natural (Covarrubias-Cervantes M., Champion D., Debeaufort F., Voilley A. Aroma volatility from aqueous sucrose solutions at low and sub zero temperatures. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 23, p. 70647069, 2004).

[04] O mercado de sorbet apresenta diversas opções com sabores variados como morango, manga e acerola. O sorbet ainda se mostra uma novidade no mercado brasileiro, mas tem grande chance de ganhar o mercado brasileiro devido à variedade de frutas típicas nacionais que podem ser empregadas para produção dos mais diversos tipos de sorbet. Em estudo foi demonstrado que sorvetes e picolés a base de frutas representam grandes números de vendas (Wernke R., Meurer M., Bitencourt R. M. Análise custo/volume/lucro aplicada em empresa de pequeno porte: estudo de caso em indústria de sorvetes. In VIII Congresso do Instituto Internacional de Custos. Punta Del Este, Uruguai, 2003).

Graviola

[05] A graviola, Annona muricata, é um membro da família Annonaceae e é uma árvore frutífera com uma longa história de uso tradicional. Extensas avaliações fitoquímicas em diferentes partes da planta de A. muricata mostraram a presença de inúmeros compostos fitoquímicos, incluindo alcalóides (Leboeuf M., Cavé A., Bhaumik P., Mukherjee B., Mukherjee R. The phytochemistry of the annonaceae. Phytochemistry, v. 21, p. 2783-2813, 1980; Yang C., Gundala S.R., Mukkavilli R., Vangala S., Reid M.D., Aneja R., Synergistic interactions among flavonoids and acetogenins in graviola (Annona muricata) leaves confer protection against prostate cancer. Carcinogenesis, v. 36, n. 6, p. 656-65, 2015), megastigmanos (Matsushige A., Matsunami K., Kotake Y., Otsuka H., Ohta S. Three new megastigmanes from the leaves of Annona muricata. J. Nat. Med., v. 66, p. 284-291, 2012), flavonoides triglicosídeos (Nawwar M., Ayoub N., Hussein S., Hashim A., El-Sharawy R., Wende K., Harms M., Lindequist U. Flavonol triglycoside and investigation of the antioxidant and cell stimulating activities of Annona muricata Linn. Arch. Pharm. Res., v. 35, p. 761-767, 2012), fenólicos (Jiménez V. M., Gruschwitz M., Schweiggert R.M., Carle R., Esquivel P. Identification of phenolic compounds in soursop (Annona muricata) pulp by high-performance liquid chromatography with diode array and electrospray ionization mass spectrometric detection. Food Res. Int., v. 65, p. 42-46, 2014), ciclopeptídeos e óleos essenciais (Pélissier Y., Marion C., Kone D., Lamaty G., Menut C., Bessière J.M. Volatile components of Annona muricata L. J. Essent. Oil Res. v. 6, p. 411-414, 1994; Kossouoh C., Moudachirou M., Adjakidje V., Chalchat J.C., Figuérédo G. Essential oil chemical composition of Annona muricata L. Leaves from benin. J. Essent. Oil Res. v. 19, p. 307-309, 2007). No entanto, as espécies de Annona, incluindo A. muricata, mostraram ser uma fonte geralmente rica de compostos de acetogenina anonáceos (Rupprecht J. K., Hui Y. H., McLaughlin J. L. Annonaceous acetogenins: A review. J. Nat. Prod. v. 53, p. 237-278, 1990). A presença de diferentes minerais importantes como K+1, Ca+2, Na+1, Cu+2, Fe+2 e Mg+2 sugere que o consumo regular de A. muricata pode ajudar a fornecer nutrientes essenciais e elementos ao corpo humano (Gyamfi K., Sarfo D., Nyarko B., Akaho E., Serfor-Armah Y., Ampomah-Amoako E. Assessment of elemental content in the fruit of graviola plant, Annona muricata, from some selected communities in Ghanaby instrumental neutron activation analysis. Elixir Food Sci. v. 41, p. 5671-5675, 2011).

[06] A partir do conhecimento associado às populações indígenas despertou o interesse da comunidade científica. Inúmeras investigações comprovaram essas atividades, incluindo atividades anticancerígenas, antioxidantes, anticonvulsivantes, antiartríticas, antiparasitárias, antimaláricas, hepatoprotetoras e antidiabéticas (Moghadamtousi S. M., Fadaeinasab M., Nikzad S., Mohan G., Ali H. M., Kadir H. A. Annona muricata (Annonaceae): A Review of its traditional uses, isolated acetogenins and biological activities. Int. J. Mol. Sci. v. 16, p. 15625-15658, 2015).

[07] Além das propriedades nutricionais que a fruta apresenta nas sobremesas geladas, a adição de cepas probióticas em matriz vegetal é uma inovação. O aumento do vegetarianismo e as preocupações dos consumidores em relação a uma dieta alternativa aos produtos lácteos probióticos com alto valor nutricional e livres de colesterol e lactose são de grande interesse para os pesquisadores. Como resultado disso, novas matrizes de alimento como portadores probióticos foram testadas. Sucos de frutas e vegetais inoculados com microrganismos probióticos mostraram resultados promissores (Costa M. G., Fonteles T. V., Jesus A. L., Rodrigues, S. Sonicated pineapple juice as substrate for L. casei cultivation for probiotic beverage development: Process optimisation and product stability. Food Chemistry, v. 139, p. 261-266, 2013; Fonteles T. V., Costa M. G. M., Jesus A. L. T., Rodrigues S. Optimization of the fermentation of cantaloupe juice by Lactobacillus casei NRRL B-442. Food and Bioprocess Technology, v. 5, p. 2819-2826, 2012; Martins E. M. F., Ramos A. M., Vanzela E. S. L., Stringheta P. C., Pinto, C. L. O., Martins J. M. Products of vegetable origin: A new alternative for the consumption of probiotic bacteria. Food Research International, v. 51, p. 764-770, 2013).

Xilitol

[08] Há cada vez mais um crescente número de pessoas que apresentam algum tipo de distúrbio metabólico e diminuir ou mesmo cessar o consumo de açúcar passa a ser uma necessidade. A busca por substitutos do açúcar que sejam, ao mesmo tempo, nutritivos e benéficos para a saúde, atuando na cura ou na prevenção de doenças, é um grande desafio. Nesse contexto destacar-se o xilitol, um adoçante capaz de substituir a sacarose, é tolerado por diabéticos e tem várias aplicações clínicas. No Brasil, as indústrias estão começando a incluir o xilitol na formulação de produtos, atraídas pelo seu efeito refrescante e, sobretudo, pela sua ação anticariogênica (Mussatto S. I., Roberto I. C. xilitol: Edulcorante com efeitos benéficos para a saúde humana. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences v. 38, n. 4, P. 401-413, 2002).

[09] O poder adoçante do xilitol é similar ao da sacarose e superior ao do sorbitol e manitol. Em indivíduos com diabetes, ou seja, com deficiência no metabolismo de glicídeos, é de suma importância o controle da taxa de glicose no sangue, para evitar problemas como hiperglicemia, distúrbios no metabolismo de lipídeos e ainda sintomas como sede e fome exageradas. Ao contrário dos açúcares convencionais, o xilitol independe de insulina para ser metabolizado pelo organismo, sendo, por isso, bem tolerado pelas pessoas portadoras de Diabetes mellitus Tipo I ou Tipo II (Manz U., Vanninen E., Voirol F. Xylitol - it’s properties and use as a sugar substitute in foods. In: F. R. A. Symposium on sugar and sugar replacements, 10., London, 1973; Pepper T., Olinger P. M. Xylitol in sugar - free confections. Food technol., v. 42, n. 10, 1988). De fato, nenhuma das duas principais vias de absorção do xilitol (fígado e flora intestinal) é mediada pela insulina.

[010] O xilitol possui cerca de 40% menos calorias em relação à sacarose e apresenta a mesma capacidade adoçante. Um estudo de revisão entre 2002 e 2014 relacionaram o uso do Xilitol e seu efeito anticariogênico e demonstrou que a utilização de produtos que contêm Xilitol estimula o aumento da salivação e, como consequência, promove a remineralização do esmalte dentário, resultando na menor formação de cáries (Kroth A., Bohneberger G. Xilitol: um adoçante aliado contra a cárie. VI Jornada Acadêmica de Odontologia 2015. v. 3 n. 2, p. 12, 2015).

Probióticos

[011] A evidência científica demonstra inúmeros benefícios atribuídos às bactérias probióticas, definidos como microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício para a saúde do hospedeiro (FAO/WHO. Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, 2002. Disponível em www.who.int/foodsafety/publications/fsmanagement/probiotics2/en/index.html. Acessado em 15 de janeiro de 2018). A descoberta original de que certas bactérias desempenham um papel favorável no cólon humano foi feita por Eli Metchnikoff, que sugeriu que a dependência dos microorganismos intestinais sobre os alimentos possibilita a adoção de medidas para modificar a microbiota intestinal em nossos corpos e para substituir os microoranismos prejudiciais por úteis (Morelli L. In vitro selection of probiotic lactobacilli: a critical appraisal. CurrentIssues in Intestinal Microbiology, v.1, p. 59-67, 2000). Com isso, os probióticos têm efeitos positivos na saúde em geral e como resultado, seu consumo aumentou (Granato D., Branco G.F., Nazzaro F., Cruz A.G., Faria J.A.F. Functional foods and non dairy probiotic food development: trends, concepts, and products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v. 9, p. 292-302, 2010).

[012] Os microrganismos probióticos devem ser ingeridos regularmente e em níveis suficientemente elevados (pelo menos 108 CFU mL-1 por dose diária) para evitar que sejam eliminados pelo organismo e para garantir que seus benefícios sejam acumulados de forma sustentada. A avaliação do potencial de promoção da saúde dos probióticos deve basear-se primeiro em evidências científicas in vitro (utilizando modelos de cultura celular), confirmada posteriormente in vivo (através de modelos animais) e, finalmente, validada por estudos clínicos envolvendo seres humanos (Saarela M., Leahteenmeaki L., Crittenden R., Salminen S., Mattila-Sandholm T. Gut bactéria and health foods and the European perspective. International Journal of Food Microbiology, v. 78, p. 99-117, 2002). Os microrganismos probióticos mais comuns utilizados e comercializados em alimentos em todo o mundo pertencem aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, pois se destacam por apresentarem os critérios de seleção de bactérias probióticas (Saulnier D. M. A., Spinler J. K., Gibson G. R., Versalovic, J. Mechanisms of probiosis and prebiosis: considerations for enhanced functional foods. Current Opinion in Biotechnology, v. 20, p. 135141, 2009; Champagne C. P., Ross R. P., Saarela M., Hansen, K. F., Charalampopoulos D. Recommendations for the viability assessment of probiotics as concentrated cultures and in food matrices. International Journal of Food Microbiology, v. 149, p. 185-193, 2011).

[013] No Brasil os probióticos são encontrados geralmente em matriz láctea, como iogurte, o que dificulta o consumo por pessoas que são intolerantes à lactose. Probióticos em matriz vegetal são uma tendência e permite diversificar a aplicação e o consumo de probióticos. Além das vantagens dos probióticos restabelecerem a microbiota intestinal, um dos benefícios em destaque está relacionado contra a intoxicação alimentar.

Prebióticos

[014] Os prebióticos são ingredientes alimentares não digeríveis que afetam positivamente a saúde do hospedeiro ao estimular seletivamente a atividade e/ou o crescimento de bactérias específicas presentes no cólon, aumentando assim a atividade de saúde. Um dos exemplos de prebióticos são os oligossacarídeos que não são digeríveis pelas enzimas digestivas presentes nos humanos. A fermentação dos prebióticos pelas bactérias probióticas produz ácidos graxos de cadeia curta. As fontes prebióticas mais comum são os galacto-oligossacarídeos, lactulose, frutanos, que são compostos de inulina, fruto-oligossacarídeos e o dissacarídeo sintético (Ashwini A., Ramya H.N., Ramkumar C., et al., Reactive mechanism and the applications of bioactive prebiotics for human health: Review, Journal of Microbiological Methods, Epub ahead of print, 2019.

Intoxicação alimentar

[015] Alimentos saudáveis são elementos vitais para sobrevivência do homem, uma vez que fornecem as moléculas responsáveis pela produção de energia e os monômeros necessários para síntese de macromoléculas. Entretanto se produzidos, manipulados ou servidos inadequadamente, poderão ao contrário, causar doenças, já que vários microrganismos ou parasitas podem utilizar o alimento na veiculação e proliferação de enfermidades Neste contexto as doenças veiculadas por alimentos (DVAs) são caracterizadas pelas ocorrências clínicas causadas por agentes contaminantes (biológicos/micro-organismos, toxinas ou outras substâncias químicas ou físicas), os quais alcançam o organismo humano, por meio da ingestão de alimentos e/ou água contaminados, afetando a saúde do consumidor, em nível individual ou em grupos de população (Ferreira J. A. F.. Panorama das Doenças Transmitidas por Alimentos no Brasil entre 2000 e 2015. Dissertação de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Nutrição em Saúde Pública, Faculdade de Saúde Pública, São Paulo. 76p., 2017).

[016] A Organização Mundial de Saúde (OMS) considera as DVAs uma grande preocupação de saúde pública global e estima-se que, a cada ano, causem o adoecimento de uma a cada 10 pessoas e 33 milhões de anos de vida perdidos. Além disso, as DVAs podem ser fatais, especialmente em crianças menores de 5 anos, causando 420 mil mortes. Na região das Américas, as doenças diarreicas são responsáveis por 95% das DVA. Segundo o Ministério de Saúde no Brasil, a vigilância epidemiológica das DVA (VE-DVA) monitora os surtos de DVA e os casos das doenças definidas em legislação específica. De acordo com dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan), são notificados em média, por ano, 700 surtos de DTA, com envolvimento de 13 mil doentes e 10 óbitos. Também segundo o Ministério da Saúde de 2000 a 2017 houveram, no Brasil, 12.660 surtos com 186 mortes, sendo Salmonella, Escherichia coli e Staphylococcus aureus os principais microrganismos envolvidos (Mistério da saúde, 2018. Disponível:http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2018/julho/02/Aprese ntacao-Surtos-DTA-Junho-2018.pdf. Acessado em 22/10/2018).

[017] Certas cepas de S. aureus, quando crescem em alimentos contendo carboidratos e proteínas, produzem uma enterotoxina e é ela a responsável pela intoxicação alimentar. Os principais sintomas são náuseas e vômitos que aparecem até 8h após a ingestão do alimento contaminado. Salmonella apresenta vários sorotipos sendo a salmonelose, causada pela maioria dos sorotipos, a doença mais comum. Os sintomas são diarreia, náuseas e dor abdominal que aparecem de 16 a 72h após a ingestão do alimento. A patologia decorrente da Salmonella sp. se dá pela transmissão fecal-oral (Silva, N., Junqueira V. C. A., Silveira N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. São Paulo: 4a edição, Varela. 625p, 2010).

[018] Porém, o tratamento mais indicado para infecções relacionadas à presença de espécies bacterianas patogênicas é o uso de antibióticos, os quais apresentam algumas desvantagens. Os antibióticos têm frequentemente um espectro considerável de ação e estão sendo relacionados ao desequilíbrio em termos de microbiota comensal, favorecendo a colonização por microorganismos patogênicos. Também podem promover a resistência bacteriana a esses antibióticos (Ventola C. L. The Antibiotic Resistance Crisis. Part 1: Causes and Threats. Pharmacy and Therapeutics, v. 40, n. 4, p. 277283, 2015).

[019] Os antibióticos podem ser comparados a uma espada de quatro gumes contra as bactérias patógenas. Logo após a sua descoberta e implantação, as duas primeiras bordas da espada do antibiótico foram identificadas, agindo no benefício relacionado ao indivíduo no tratamento da sua infecção, assim como no benefício que a comunidade pode ter na prevenção da propagação desse agente infeccioso. A terceira borda, reconhecida por Alexander Fleming (1945), alertava sobre o custo para a comunidade de resistência a antibióticos que inevitavelmente evoluiria e seria selecionado durante a prática clínica. A resistência reduz ou impede as atividades de alguns dos medicamentos mais eficazes para infecções clinicamente importantes, o que acarreta aumento de custos de tratamento. Mas, a quarta borda da espada antibiótica permaneceu pouco apreciada até recentemente, ou seja, o custo que um antibiótico exerce sobre a saúde de um indivíduo através do dano colateral do medicamento a bactérias que normalmente vivem em seres humanos saudáveis: a microbiota intestinal (Blaser M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science, v. 352, n.6285, p. 544-545, 2016).

[020] Nos últimos anos, os cientistas têm explorado essa questão, com resultados predominantemente consistentes. Estudos observacionais, clínicos e epidemiológicos focados em crianças pequenas estão fornecendo um crescente corpo de evidências de que a exposição a antibióticos está associada ao aumento do risco para uma variedade de doenças, incluindo obesidade, diabetes tipo 1 e 2, doenças intestinais inflamatórias, doença celíaca, alergias e asma (Blaser M. J., Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science, v. 352, n.6285, p. 544-545, 2016).

Ensaios clínicos com L. plantarum UFSJP2

[021] Ensaios clínicos com L. plantarum vem sendo realizados. Segundo um estudo de revisão, os resultados são promissores e estão relacionado com o uso por 3 semanas para redução nos valores do índice de massa corpórea e da pressão arterial; uso de 12 semanas para os níveis de glicose e homocisteína ficarem significativamente reduzidos, uso de 1 dia para melhor digestão e tolerância à lactose; 6 semanas de uso para um efeito significativo na redução da diarreia e flatulência; 16 dias para melhoria da integridade da barreira da mucosa intestinal e diminuição das complicações infecciosas (Markowiak P., Slizewska K. Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health, Nutrients, v.9, n. 1021, p. 1-30, 2017).

[022] Uma das soluções preconizadas para prevenir infecções bacterianas é o uso de cepas bacterianas que são antagônicas em relação às espécies patogênicas. Estudos têm mostrado atividade antimicrobiana de probióticos contra patógenos de origem alimentar (Liu X., Liu W., Zhang Q., Tian F., Wang G., Zhang H., Chen W. Screening of Lactobacilli with antagonistic activity against enterro invasive Escherichia coli. Food Control, v. 30, p. 563-568; 2013; Wan M. L. Y., Forsythe S. J., El-Nezami H. Probiotics interaction with foodborne pathogens: a potential alternative to antibiotics and future challenges. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 5, p. 1-14. 2018). Probióticos podem auxiliar na bio-preservação dos alimentos, que está relacionada à vida útil prolongada e ao aumento da segurança microbiana de produtos relacionados a alimentos por sua microflora natural ou controlada (Adeyemo S. M., Afolabi F. T., Awojobi K. O., Abiri T. O. Probiotic effects of lactic acid bactéria and its use as bio-preservative for tomato juice and paste. International Journal of Probiotics and Prebiotics, vol 12, n.2., p 97-102, 2017), assim como aumentar o tempo de prateleira de frutas e vegetais minimamente processados (Siroli L., Patrignani F., Serrazanetti D. I., Tabanelli G., Montanari C., Gardini F., Lanciotti R. Lactic acid bactéria and natural antimicrobials to improve the safety and shelf-life of minimally processed sliced apples and lamb's lettuce. Food Microbiology, v. 47, p. 74-84, 2015). Probióticos do gênero Lactobacillus destacam-se por apresentar altas taxas de sobrevida no trato gastrointestinal, participar na regulação de níveis de IFNy e aumentar a resistência contra infecções por parasitas (Bautista-Garfias C. R., Ixta O., Orduna M., Martinez F., Aguilar B., Cortés, A. Enhancement of resistance in mice treated with Lactobacillus casei: Effect on Trichinellas piralis infection. Veterinary Parasitology, v. 80, p. 251-260, 1999).

[023] A cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 da presente invenção foi isolada de Queijo Minas Artesanal e apresentou potencial probiótico devido a sua resistência ao suco gástrico e sais biliares, hidrofobicidade e propriedades de autoagregação e coagregação, além de apresentar propriedades antimicrobianas in vitro para Salmonella entérica sub sp. Enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 e Staphylococcus aureus 29213 (BR 10 2016 025928 2, 07/11/2016. Juliana Teixeira de Magalhães, Helder Magno Silva Valadares, Daniel Bonoto Gonçalves, Paulo Afonso Granjeiro, Gabriele Moreira Guimarães, Thaiane Pinto Moreira, Leticia Aparecida Soares. Bebida à base de polpa de cacau in natura com adição de probiótico).

Co-produtos lácticos

[024] Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) no terceiro trimestre de 2018 cerca de aproximadamente 6,25 milhões de litros de leite foram produzidos (IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. 2018 Abate de animais, produção de leite, couro e ovos. (Disponível em: http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/producaoagro pecuaria/default.shtm. Acessado em: 28/02/2018). A produção de queijo brasileiro está em torno de 896 mil toneladas por ano, gerando anualmente 8 bilhões de litros de soro (IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Tabela 1 - Produção e vendas dos produtos e/ou serviços industriais, segundo as classes de atividades e a descrição dos produtos- 2010. Disponível em: www.ibge.gov.br. Acessado em: 28/08/2017; Alves, M. P. et al. Soro de leite: tecnologias para o processamento de coprodutos. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, v. 69, n. 3, p. 212-226, 2014). Os co-produtos líquidos da indústria de laticínios são considerados um dos principais responsáveis pela poluição causada pela indústria de laticínios. Em muitos laticínios o soro é descartado junto com os demais efluentes, sendo considerado um forte agravante devido ao seu elevado potencial poluidor. O soro é aproximadamente cem vezes mais poluente que o esgoto doméstico. Atualmente constitui prática incorreta descartar o soro, direta e indiretamente, nos cursos de água. Uma fábrica com produção média de 300.000 litros de soro por dia polui o equivalente a uma cidade com 150.000 habitantes (Da Silva D. J. P. Resíduos na Indústria de Laticínios. Universidade Federal de Viçosa Departamento de Tecnologia de Alimentos Ciência e Tecnologia de Alimentos, Série Sistema de Gestão Ambiental, Viçosa/MG. 2011).

[025] O soro de leite constitui 80 a 90% do volume total do leite usado na produção de queijos, contendo cerca de 55% dos nutrientes do leite como: proteínas solúveis, lactose, vitaminas, minerais e pouca quantidade de gordura (Alves M.P. et al. Soro de leite: tecnologias para o processamento de coprodutos. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, v. 69, n. 3, p. 212-226, 2014). Trabalhos mostram a utilização do soro de leite na fermentação para produção de probiótico como mais uma alternativa de aplicação deste co-produto (Barbosa I. M. V. et al. Otimização das condições da fermentação de soro para produção de probiótico de Lactobacillus acidophilus: condições de pH, tamanho do inóculo e concentração do soro no crescimento celular. Blucher Chemical Engineering Proceedings, v. 1, n. 1, p. 639-644, 2014; Brinques G.B. Otimização da produção de probióticos em biorreatores e suas aplicações em sistemas alimentícios sob a forma imobilizada. 2009. Tese - Doutora em Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009). Na presente invenção a utilização desse co-produto torna a produção de probióticos um processo sustentável.

Desenvolvimento de um bioprocesso inovador

[026] O primeiro passo para se desenvolver um bioprocesso novo e adequado a uma nova linhagem isolada e às variáveis respostas desejadas, constitui-se em determinar se variáveis experimentais (independentes) e suas interações apresentam uma influência significativa sobre a resposta de interesse (Lundstedt T. et al.; Experimental design and optimization. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,v. 42, n. 1, p. 3, 1998).

[027] O desenvolvimento de um processo novo, efetivo, com repetibilidade, reprodutibilidade e capacidade preditiva para uso industrial deve passar por metodologias consagradas para se otimizar processos, como é o caso da Metodologia de Superfície de Resposta (Box G. E. P., Wilson K. B.“On the Experimental Attainment of Optimum Conditions”, Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological), vol.13, n.1, Blackley, Manchester/UK, pp. 1-45., 1951). Dentro desta perspectiva metodológica, para se desenvolver um novo processo a partir de uma nova cepa isolada, como o caso do Lactobacillus plantarum UFSJP2, objeto desta invenção, visando a produção de células probióticas, uma estratégia acertada é a utilização do Planejamento Fatorial Completo e do Delineamento Composto Central Rotacionado (DCCR).

[028] Um Planejamento Fatorial Completo é um experimento no qual são analisados os efeitos de interação de todas as variáveis experimentais de interesse (Pereira A. W. Consequências da análise inadequada de um experimento fatorial 2k em parcelas subdivididas e sem replicação Dissertação de Mestrado Matemática Aplicada e Estatística, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal/RN. 2014). Ao realizar experimentos industriais, é comum verificar a necessidade de estudar o efeito de um ou mais fatores de controle ao mesmo tempo. A aplicação das técnicas de planejamentos de experimentos fatoriais completos, mostra-se como uma das soluções para esse tipo de problema e ressaltam que, com essas técnicas, é possível analisar os efeitos sobre uma resposta de interesse. Este tipo de técnica reduz os custos e o tempo de duração dos ensaios (Diniz R. H. S., Rodrigues M. Q. R. B., Fietto L. G., Passos F. M. L., Silveira W. B. Optimizing and validating the production of etanol from cheese whey permeate by Kluyveromyces marxianus UFV-3. Biocatal. Agric. Biotechnol., v. 3, p. 111-117, 2014).

[029] O DCCR, por sua vez, consiste em um grupo de procedimentos, estatísticos e matemáticos, que podem ser usados no estudo das inter-relações entre uma ou mais respostas (variáveis dependentes) com inúmeros fatores (variáveis independentes), permitindo analisar os efeitos combinados e as interações entre as variáveis que influenciam na obtenção do produto de interesse (Dos Santos, L. F. M. et al. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. BioresourceTechnology, v. 218, p. 944-952, 2016; Rodrigues M. I.; Iemm, A. F. Planejamento de experimentos. 1a Edição, Editora Caso do Pão, Campinas/SP, 2005).

[030] O DCCR é comumente utilizado em associação à análise de superfície de resposta, com intuito de determinar as condições ótimas operacionais, fornecendo informações seguras do processo, minimizando ou maximizando-o (Vaz L. G. L. Performance do processo de coagulação/floculação no tratamento do efluente líquido gerado na galvanoplastia. Paraná, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química - UNIOESTE. Dissertação de Mestrado, Toledo/PR, 2009).

[031] Os parâmetros de crescimento foram calculados a partir de contagens (UFC / mL) obtidas pelo método de diluição em placa, os lactobacilos produziram o maior crescimento (> 109 UFC mL-1) quando inoculados em meio Mgl, Mlac, MRS e MRSc; menor crescimento foi obtido nos meios Mw e Msm, enquanto o crescimento mais fraco foi produzido no meio Mpep (Ficoseco C A, Mansilla F I, Maldonado N C, Miranda H, Nader-Macias M E F, Vignolo G M. Safety and growth optimization of lactic acid bacteria isolated from feedlot cattle for probiotic formula design. Front Microbiol v. 9, p.1-12, 2018). O valor de UFC mL-1 foi abaixo ao encontrado nessa invenção, no qual apresentou valor > 1010 UFC / mL.

[032] Dessa forma, a presente invenção demonstra um novo bioprocesso de cepa probiótica, bem como um novo sorbet que contém Lactobacillus plantarum UFSJP2, objeto desta invenção, com ação comprovada in vitro contra as cepas Salmonella enterica sub sp. Entérica serovar Typhimurium e Staphylococcus aureus, podendo prevenir a intoxicação alimentar nas pessoas que consumirem os produtos desta invenção ou ainda restabelecer a microbiota intestinal após o uso intensivo de antibióticos.

Citação de patentes

[033] A invenção KR20150094020A (KR20150094020A. De 19 de Agosto de 2015. Complex microbe for animal feed and complex microbe additions including the same, and feed including complex microbe additions) refere-se a um alimento probiótico composto por um complexo de agentes microbianos, isolados do da água do feijão, tais quais as linhagens de Bacillus, Connie tumefaciens spp, Lactobacillus spp, Sphingomonas sp, Pseudomonas sp e metil tumefaciens sp, Li shinny Bacillus, Bacillus spp e Lactobacillus spp; Micro Rhodococcus sp e a cepa MR-1 (N° de Acesso KCTC12386BP). O complexo com o agente microbiano é aquecido, mesmo quando o tratamento térmico inclui as cepas resistentes ao calor, para exercer a sua função normal e atingir o campo de aplicação, como supressão de doenças em animais e ganho de peso, como exemplo o gado. Na presente invenção, diferentemente da invenção KR20150094020A, foi demonstrado um bioprocesso otimizado de produção da cepa UFSJP2 que pode ser utilizada por humanos em uma matriz vegetal, no caso o sorbet de frutas, e também, para consumo de animais.

[034] A invenção KR20170093605A (KR20170093605A, 2017-08-16, Suh Joo Won; Yang Seung Hwan; Sasi Kumar; Karthiyaini Damodharan. Novel Lactobacillus plantarum with probiotic activities and use thereof) refere-se a uma cepa de L. plantarum com boa resistência aos ácidos biliares, adesão de células epiteliais intestinais, atividade antibacteriana, atividade da beta-galactosidase, atividade da hidrolase de sais biliares ou cloreto de sódio, podendo ser usada como alimento para prevenir e aliviar sintomas de intolerância a lactose. A composição probiótica da invenção é um leite em pó desnatado ou um pó de maltodextrina. Diferentemente da invenção KR20170093605A, a presente invenção demonstra um bioprocesso otimizado de produção de uma cepa probiótica e um alimento probiótico, constituído de uma matriz vegetal e não láctea, um sorbet de graviola, suplementado com a cepa probiótica L. plantarum UFSJP2, isolada de uma região específica do Brasil.

[035] A invenção CN107287136 (A) (CN107287136 (A), 2017-07-06, 2017-1024, Wang Ting; Wang Ruiming; Meng Wu; Wang Jianbin; Sui Songsen, Preparation method of probiotic solid Lactobacillus agent with probiotic function) refere-se a um método de preparação de um produto sólido com uma função probiótica com os seguintes lactobacilos presente, Bifidobacterium, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus curl, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, formato Lactobacillus, Suíça Lactobacillus, um ou mais Lactobacillus casei, L. reuter e Lactobacillus rhamnosus. O método de preparação compreende os seguintes passos: fermentação das cepas de lactobacilos em um meio a base de leite desnatado, mistura de um agente de lactobacilos viável com crioprotetores e liofilização. Podemos destacar que a presente invenção se diferencia da reportada na patente CN107287136 (A), porque utiliza uma matriz vegetal e não láctea, um sorbet de frutas, para consumo de indivíduos que são intolerantes à lactose. A invenção CN107287136 (A) tem como base para os probióticos uma receita com a adição de crioprotetores, o que torna o processo com maior custo, enquanto a presente invenção não faz uso de encapsulamento no processo de obtenção do produto final. A presente invenção faz uso da graviola, uma superfruta com alto valor nutricional. Além do mais a nossa invenção contém um bioprocesso otimizado de produção de uma cepa probiótica de uma linhagem específica de Lactobacillus plantarum UFSJP2.

[036] A invenção KR1020180073972A (KR1020180073972A, 2018-06-27, 2018-07-04, Seo-won, Yang Seung Hwan, Sashikuma, Hottie Katie, Novel Lactobacillus fermentum with probiotic activities and use thereof) fornece uma nova cepa de Lactobacillus fermentum com atividades probióticas. De acordo com a invenção, a cepa pré-determinada de Lactobacillus fermentum tem excelente resistência a bile, excelente adesividade epitelial intestinal, e a maior parte da cepa de Lactobacillus fermentum pode atingir o intestino do individuo. Também, de acordo com a invenção KR1020180073972A, a cepa apresenta atividade antibacteriana e pode ser utilizada como material antibacteriano para alimentos e fármacos, pode ser utilizada como um alimento e material medicamentoso para prevenir, melhorar ou tratar uma hipercolesterolemia, hiperlipidemia, triglicidos elevados no sangue ou dislipidemia possuindo uma excelente actividade de redução do colesterol. A presente invenção se diferencia da reportada na patente KR1020180073972A; por apresentar um bioprocesso otimizado de produção de uma cepa probiótica de uma linhagem específica de Lactobacillus plantarum UFSJP2, capaz de permitir uma produção com baixíssimo custo e aumentar a produção de biomassa da cepa UFSJP2 em 787%, enquanto a patente KR1020180073972A demonstra somente o crescimento de outra espécie de Lactobacillus, sem qualquer tipo de melhoramento na produção de biomassa. É sabido que os lactobacilos são microorganismos fastidiosos, sendo assim, sem esse processo de otimização a produção em larga escala é inviabilizada, pois o custo de produção dessa etapa seria extremamente alto. Além do mais, na presente invenção fazemos uso da graviola, uma superfruta com alto teor nutricional, como veículo para probióticos, enquanto que na invenção KR1020180073972A não há demonstração de uma aplicação do uso do probiótico em matrizes vegetais.

[037] A invenção US20090011087 (US20090011087. 2007-02-14, 2009-01 -08. Rabault J., Philippe J. Process for the manufacture of a frozen dessert and frozen dessert thus obtaned) refere-se a um processo para a fabricação de uma sobremesa congelada, compreendendo os passos sucessivos consistindo em: congelar uma composição de leite industrial compreendendo de 6 a 45% em peso de matéria seca e leite fermentado ou não fermentado, a referida composição compreende ainda o uso de um purê e/ou sumo de fruta, de modo a obter uma composição congelada; A composição de leite contém, pelo menos, 105 a 107 bactérias probióticas por grama, sendo elas: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus delbruekii, Bifidobacterium animalis animalis , Lactobacillus easel, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus e suas misturas. A presente invenção se diferencia da patente US20090011087A1, porque tem como base para os probióticos uma receita sem a adição de leite, além de utilizarmos um açúcar tolerável para diabéticos. Além do mais, a quantidade mínima exigida pela ANVISA não é alcançada pela patente US20090011087A1, uma vez que essa quantidade varia de 105a 107 UFC, enquanto a presente invenção demonstrou a viabilidade da cepa P2 superior a 109 UFC.

[038] A invenção US20060078651 (US20060078651A1, 2004-10-13, 2006-0413, Esghipour M., Supplemented sesame ice cream) refere-se a um alimento gelado de baunilha suplementado por uma composição láctea contendo pasta de semente de gergelim, semente de gergelim torrada e uma quantidade eficaz de pelo menos um nutracêutico que contém: vitaminas, minerais, erva de São João, caiena, gengibre, ginseng, extrato herbal ou uma combinação destes. Podemos destacar que a presente invenção se diferencia da reportada na patente US20060078651A1, porque tem como base para os probióticos uma receita sem a adição de leite, além de utilizarmos um açúcar tolerável para diabéticos. Os benefícios nutricionais já fazem parte da fruta escolhida na presente invenção, que é a graviola. Além do mais a nossa invenção contém a adição de uma cepa probiótica Lactobacillus plantarum UFSJP2.

[039] A invenção ES2372675T3 (ES2372675T3, 2009-03-18, 2012-01-25, Vries Y. P., Biesebeke R. T. Produto alimentício probiótico de larga duración) refere-se a um produto alimentício lácteo com um prazo de validade de 12 a 24 meses, abrangendo sucos de frutas que possuem um prazo de armazenamento não refrigerado, entre 13 e 26 semanas e bebidas que contenham polpas de frutas de comum período de armazenamento de 3 meses sem refrigeração, o que inclui organismos probióticos em um estado dormente, selecionados do grupo compreendendo por Clostridia e/ou Bacillus e de preferência o B. subtillis, B. subtillis (natto), B. pumilus, B. licheniformis e B. coagulans, e fungos e leveduras como o Aspergillusoryzae, Aspergillussoyae, Hansenula spp., Torulopsis spp., Candida spp., Saccharomyces spp., Clavispora spp., Brettanomyces spp., Pichia spp. Endomycess spp. Kluyveromyces spp., Rhizopus spp. Yarrowialipolytica, Endomycesbuliger, Penicillium spp.,ou misturas destes. A presente invenção se diferencia da reportada na patente ES2372675T3 porque tem como base para os probióticos um sorbet com uma receita sem a adição de leite e de açúcar. Na presente invenção é utilizada uma outra cepa probiótica, a Lactobacillus plantarum UFSJP2, que possui status GRAS, sendo de alta segurança a quem as consomem e conhecidamente com características probióticas, o que não é encontrado em todos os microrganismos utilizados na invenção ES2372675T3. Adicionalmente, na presente invenção o processo de obtenção das bactérias probióticas alcança 3,7x1010 UFCmL-1 de bactérias probióticas, sendo o suficiente para ser adicionado nas concentrações preconizadas pela ANVISA, o que assegurarão efeito benéfico dos probióticos, enquanto na patente ES2372675T3 descrita, essa quantidade varia de 106 a 1010 UFC. Além do mais, na patente ES2372675T3, foram utilizados na composição do suco os seguintes componentes prebióticos: fruto-oligossacárido, galacto-oligossacidos, oligossacidosgalacto fruto-oligossacareos, inulina, contendo fucose, beta-glucano, farinha de alfarroba, gomas, pectinas, sialiloligossacáridos, sialilactosa, galactanas e nucleótidos. Em nossa invenção não foi necessário a adição de componentes prebióticos para a viabilidade da cepa P2 na sorbet à base de fruta.

[040] A invenção JPH07132048A (JPH07132048A, 1993-11-12, 1995-05-23. Oki S., Okumura M., Ohki S., Okumura M.Liquidsherbet base, its production and production of sherbet) refere-se a uma base líquida de sorvete contendo açúcar, um estabilizador do tipo polissacarídeo, gelatina, óleo e gordura comestível e água como componentes essenciais e capazes de fornecer facilmente um sorvete com sabor desejado sem necessitar da operação de agitação no estágio de congelamento. A presente invenção se diferencia da reportada na patente JPH07132048 por ter como base para os probióticos uma receita sem a adição de leite e açúcar à base de uma fruta, a graviola. Na presente invenção é utilizada uma cepa probiótica, a Lactobacillus plantarum UFSJP2.

[041] A invenção descrita em KR20090050559 (KR20090050559, 16-11-2007, 30-05-2009.Chang-Won K., Wook K. S., Hyun-Dong B., Won Y. C., Yagyung, Jang Hyo Il.A mass production method of probiotic Bacillus amyloliquefaciens KU801 by médium optimization) refere-se a um método de produção de biomassa da bactéria probiótica Bacillus amyl Lowry Quebec Pacific Enschede (Bacillus amylo liquefaciens) da linhagem KU801. A referida invenção utiliza como suplementos do meio de cultura a glicose a 1%, extrato de levedura a 1,5% e cloreto de sódio a 0,1%, e a produção ótima de células chega a apenas 2,5x108 UFC mL-1. Em contrapartida, a presente invenção utiliza o soro de leite como fonte de carbono em substituição à glicose, um co-produto da indústria de lacticínios debaixo custo. Adicionalmente, o processo de produção de células probióticas desenvolvido na presente invenção alcança 3,7x1010 UFCmL-1 uma quantidade 200 vezes maior de células em relação às outras tecnologias descritas na patente KR20090050559, gerando um produto de maior valor agregado ao mercado. Além do mais, durante o processo de produção da invenção descrita em KR20090050559 foi utilizada a rotação de 150 rpm para crescimento da bactéria probiótica, enquanto que na presente invenção não é necessária a aplicação de rotação, reduzindo custos operacionais.

[042] A invenção BR1020120189232 (BR 10 2012 018923 2 A2, 30/07/2012, 09/06/2015, Ramos A. M., Martins E. M. F., Martins M. L. Salada de fruta probiótica minimamente processada, processo de obtenção e uso de probióticos em saladas de frutas minimamente processadas) é aplicada à área de alimentos e trata-se do desenvolvimento de uma tecnologia de processamento mínimo de frutas e saladas de frutas selecionadas do grupo contendo abacaxi, mamão, manga, maçã, banana e goiaba adicionadas de culturas láticas probióticas contendo: L. rhamnosus, L. acidophiluse e L. plantarum. A utilização de microrganismos probióticos em frutas tem por objetivo disponibilizar ao consumidor um produto sensorialmente aceitável no qual os microrganismos estão presentes na sua forma viável. Nesse sentido, a invenção BR1020120189232 relata o processo de produção de salada de fruta probiótica, em que os microrganismos probióticos não participam do processo de fermentação. A produção da salada de fruta não passa pela etapa de fermentação, assim, não altera o tempo de fabricação, o que permite maior controle do número de microrganismos probióticos carregados pela salada. A presente invenção tem como vantagem em relação a patente BR1020120189232 proporcionar um produto com bactéria probiótica viável com validade de no mínimo um mês em baixa temperatura, enquanto que a invenção descrita em BR1020120189232 refere-se a uma salada de frutas in natura, com menor tempo de validade de apenas 120h. Podemos destacar também que a presente invenção é uma sorbet à base de graviola, que é uma fruta rica em vitaminas C, B1 e B2 e fibras.

[043] A invenção RU2625975 (RU2625975C1, 2016-04-26, 2017-07-20, inventor: Kupunn Bmktopobmh TyceB, Method for preparing sorbet) refere-se a um método que prevê a introdução de açúcar, glicose e purê de frutas em água fervente. O purê é escolhido entre maçã, laranja, maracujá e limão. Tudo é misturado e trazido de novo para ferver, depois é introduzida a trimolina e a mistura é arrefecida até à temperatura de 18-20°C. A mistura arrefecida é amassada durante 30-40 minutos até se obter a consistência uniforme batida, oxigenada, e por fim é congelada à temperatura de -20 a -25°C. Os moldes são preenchidos com o sorvete resultante. A presente invenção se diferencia da reportada na patente RU2625975, porque tem como base para os probióticos uma receita sem a adição de glicose. Na presente invenção é utilizada uma cepa probiótica, a Lactobacillus plantarum UFSJP2.

[044] Um método de preparo de sorvete de frutas e vegetais fermentados com probióticos pertencendo ao campo técnico de bebidas frias é descrito na invenção CN103005134 (CN103005134, 26-12-2012, 03-04-2013. Tao X. Mingyong X., Qianqian G., Gaoping S.Preparation method of probiotics-fermented fruit and vegetable jam ice cream). A invenção é caracterizada por um método que compreende as seguintes etapas: realizar a fermentação usando probióticos, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium adolescentis, que possuem alta atividade para fermentação de frutas e vegetais e preparar polpa crua de frutas e vegetais fermentados com probióticos. Segundo, na invenção CN103005134, o sorvete de frutas e vegetais fermentado com probióticos tem sabor e funções nutricionais muito superiores aos sorvetes tradicionais, com custo de produção menor do que o sorvete probiótico comum e tem um número de probióticos ativos de até 107 UFC a 108 UFC. Não se testou, porém, na patente CN103005134, por quanto tempo as células probióticas ficam viáveis no produto fermentado, e nem a temperatura ótima de estocagem. O processo apresentado na invenção objeto desta matéria, sob uma outra perspectiva, tem como base para os probióticos a graviola uma fruta com alto valor nutricional. Adicionalmente, a tecnologia permite que a quantidade de probiótico a ser adicionado no sorbet de graviola seja no mínimo de 109 UFC. Ainda, o produto apresentado na presente invenção apresentou viabilidade das células probióticas em -20°C por um período de pelo menos um mês.

[045] A invenção US6022568 (US6022568, 1997-07-05, 2000-02-08. Lesens C., Dufort C., Pfeifer A. M. A., Rochat F. Ice cream with coating containing lactic acid bacteria) refere-se ao uso de bactérias do ácido láctico na preparação de um creme para cobrir todo ou parte de um sorvete, esta calda de revestimento contém 103 a 109 UFC g-1 de bactérias lácticas. O revestimento pode incluir 1% a 70% de um leite fermentado por bactérias lácticas, 0,5% a 5% de proteínas animais ou vegetais, um teor de gordura láctica de 2% a 20% e preferivelmente a estirpe Lactobacillus acidophilus CNCM I-1225. Na presente invenção o processo de obtenção das bactérias probióticas garante o mínimo de 109 UFC de bactérias determinado pela ANVISA adicionadas ao sorbet, o que assegura o efeito benéfico dos probióticos, enquanto na patente US6022568 descrita, essa quantidade varia de 103 a 109 UFC. Podemos destacar também que a presente invenção se diferencia da patente US6022568A por ter como base para os probióticos uma receita sem a adição de leite e açúcar. Na presente invenção é utilizada uma cepa probiótica, a Lactobacillus plantarum UFSJP2.

[046] A invenção PI 0013178-4 (PI 0013178-4, 03/07/2000, 01/02/2001.Sharkasi T. Y., Vaghela M. N., Groh B. F. Processo para produzir produtos congelados aerados com uma melhorada resistência a choque térmico, bem como sorvete e sorbet congelados) refere-se a um produto congelado aerado, incluindo, porém não limitado a, sorvete, sorbet, iogurte congelado, etc., e aos métodos para preparar os produtos congelados aerados. Na presente invenção é utilizada uma cepa probiótica, a Lactobacillus plantarum UFSJP2.

Problemas do estado da técnica

[047] No Brasil não há uma plataforma de produção de probióticos, além do país não dispor de uma invenção protegida por uma Instituição Nacional. Dessa maneira, os probióticos comercializados nos diferentes setores industriais são importados. Isso resulta em custos e tempo elevados relacionados à importação, que corrobora para elevação do valor do produto final. Além disso, a maior parte das composições existentes necessitam de adição de prebióticos e ou adjuvantes, para aumentar a viabilidade das células probióticas no produto, sendo também que apenas algumas composições apresentam viabilidade para preparações probióticas.

Vantagens da invenção

[048] A presente invenção trata-se de um bioprocesso de produção de biomassa, de baixo custo, com grande produtividade e rendimento, que alcança uma quantidade de células produzidas superior a métodos existentes no estado da técnica, em um menor tempo de fermentação.

[049] Os prebióticos são naturalmente adicionados à composição probiótica durante o bioprocesso sem custo adicional, além de resultar em uma diminuição dos custos de produção da preparação probiótica devido à utilização de um co-produto de baixo custo da indústria de laticínios.

[050] O uso de fruta associado à preparação probiótica traz benefícios à saúde humana, tanto por parte da fruta quanto do microrganismo, a partir da composição de uma sobremesa gelada à base de sorbet contendo a cepa probiótica em uma matriz vegetal em que o processo de obtenção resulta em uma maior viabilidade da cepa probiótica em relação ao estado da técnica. A cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 apresenta viabilidade celular comprovada de no mínimo um mês com este processo. O sorbet com adição da cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 pode ser uma sobremesa funcional alternativa para pessoas que apresentam dietas restritas como intolerantes a lactose e às proteínas do leite.

[051] Foi percebido o potencial probiótico por adesão em células HT-29 caracterizado da cepa de Lactobacillus plantarum UFSJP2. Tal adesão permite a utilização da cepa probiótica da biodiversidade brasileira com potencial atividade biológica específica na prevenção de infecções alimentares, como a Salmonella enteritidis e Staphylococcus aureus, validada in vitro.

Descrição detalhada da Tecnologia Adesão em células intestinais HT-29 e inibição da aderência de Salmonella P2

[052] A adesão em células intestinais HT-29 (ATCC HTB-38) foi determinada de acordo com Tulini e colaboradores (2013), com algumas modificações (Tulini F. L., Winkelstroter L. K., Martinis, E. C. P. Identification and evaluation of the probiotic potential of Lactobacillus paraplantarum FT259, a bacteriocin ogenic strain isolated from Brazilian semi-hard artesanal cheese. Anaerobe, n. 22, p. 57-63, 2013). As células HT-29 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro (v/v), 1,6 mg L-1 de penicilina, 0,4 mg L-1 de estreptomicina e 2,5 mg L-1 de fluconazol por 24 h a 37°C em 0,5% de CO2 em microplacas de 24 poços. Após incubação, as monocamadas de células continham 105 células mL-1. As células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato (PBS) e 900 µL de DMEM sem os antibióticos foi adicionado. Uma cultura overnight (100 µL) da cepa P2 obtida após crescimento em caldo MRS a 37o C (108 UFCmL-1) foi adicionado em cada poço para se obter uma infecção de 100:1 (MOI). Após incubação nas mesmas condições por 2 h, os poços foram lavados duas vezes com tampão fosfato (PBS), lisados com EDTA (0,25%), PBS e Triton X-100 0,05% (v/v). As células foram recuperadas por centrifugação a 10.000 g por 5 min e em seguida, homogeneizadas em 1 mL de PBS. As bactérias foram enumeradas em ágar MRS e as placas incubadas a 37°C por 48 h sob anaerobiose. A taxa de adesão foi expressa pela porcentagem de bactérias aderidas e recuperadas a partir do inóculo inicial. O experimento foi realizado 3 vezes.

[053] No teste de inibição de Salmonella, células HT-29 foram pré-incubadas em meio livre de antibiótico por 4 h com o pH ajustado para 6,5 com 1 N HCl. A cepa UFSJP2 e a Salmonella foram recuperadas por centrifugação (10,000 x g, 2 min a 4°C) e lavadas duas vezes com tampão fosfato Dulbecco (PBS), pH 7,0. A densidade celular foi de 108 UFC por poço em 900 pL para cada cultura. Para a combinação da cepa P2 com o enteropatógeno Salmonella enterica sub sp. Entérica serovar Typhimurium ATCC 14028, as condições de competição foram testadas. No teste de adesão competitivo, ambas as cepas foram adicionadas nos poços contendo as monocamadas de HT-29 na mesma quantidade e ao mesmo tempo, sendo co-incubadas por 90 min. No teste de inibição da adesão, a cepa UFSJP2 foi deixada aderir às células HT-29 por 90 min. As bactérias não aderidas foram removidas dos poços e as monocamadas de HT-29 foram lavadas 2 vezes com 1 mL de PBS. Salmonella foi adicionada e a incubação foi por mais 90 min. A co-incubação de células HT-29 com as cepas UFSJP2 e Salmonella sozinhas foram usadas como controle. Foi determinado que em 30 min de tratamento com 0,05% (v/v) Triton X-100 em PBS a 37°C não afetou a viabilidade das células bacterianas. O lisado de HT-29 incluindo as células bacterianas aderidas foram diluídas e adicionadas em ágar MRS e ágar MacConkey. A enumeração foi realizada após 24h de incubação a 37°C. Todos os testes de adesão foram realizados 3 vezes. Na Tabela 1 estão demonstradas as porcentagens de adesão e de inibição das bactérias às células HT-29. As porcentagens de adesão foram superiores a 95% para ambas as cepas testadas, com destaque para a P2. Quando analisamos o efeito da cepa P2 na % de inibição de adesão de Salmonella em células HT-29 foi possível observar que a inibição foi de aproximadamente 35%.

Avaliação da atividade Antimicrobiana

[054] A detecção de atividade antimicrobiana da cepa UFSJP2 foi testada contra as bactérias Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Staphylococcus aureus ATCC 29213 e Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 empregando o teste spot-on-the-lawn e difusão de poço de acordo com Meira e colaboradores (2012) e González e colaboradores (2007) com algumas modificações (Meira, S. M. M., Helfer, V. E., Velho, R. V., Lopes, F. C. and Brandelli, A. Probiotic potential of Lactobacillus spp. isolated from Brazilian regional ovine cheese. Journal of Dairy Research. v. 79(1), p. 119-127, 2012; González, L., Sandoval, H., Sacristán, N., Castro, J. M., Fresno, J. M. and Tornadijo, M. E. Identification of lactic acid bacteria isolated from Genestoso cheese throughout ripening and study of their antimicrobial activity. Food Control. v. 18(6), pp. 716-722, 2007). Um volume de 5 μL de culturas crescidas foram adicionados em ágar MRS e as placas incubadas anaerobicamente a 37°C por 24 h. Após, 10 mL de ágar semi-sólido BHI (Infusão de cérebro e coração) contendo 105 UFC mL-1 foram inoculados nas placas. A incubação foi sob aerobiose a 37°C por 24 h. A presença de halos de inibição em torno dos spots foi considerada efeito positivo. No teste de difusão de poço, os ácidos orgânicos e o peróxido de hidrogênio produzidos pela cepa foram excluídos. A cepa previamente crescida em caldo MRS foi centrifugada a 4000 g por 10 min a 4°C. O sobrenadante obtido foi neutralizado com 2.5 M de NaOH e filtrado com filtros de 0.22 μm de poros. O peróxido de hidrogênio foi eliminado pela adição de solução estéril de catalase 1 mg mL-1 e deixado a 25°C por 30 min. Cerca de 1 mL das linhagens testes (cerca de 1x105 CFU mL-1) foram inoculados em 10 mL de ágar nutriente fundido a 45°C e a mistura foi adicionada nas placas. Após solidificação do ágar poços de 3mm de diâmetro foram feitos e 30 µL do extrato de P2 preparado anteriormente foram adicionados. As placas foram mantidas a 25°C por 4 h para difusão do extrato e os halos de inibição avaliados após incubação a 37°C por 24 h (Tabela 2).

Obtenção da curva de crescimento da bactéria láctica

[055] A bactéria láctica Lactobacillus plantarum UFSJP2 está sendo conservada em meio caldo MRS com 20% de glicerol à temperatura de -80°C. Para a obtenção do pré-inóculo o microrganismo foi cultivado em erlenmeyer contendo soro de leite suplementado com, 1 a 25 g L-1 de extrato de levedura, 0,1 a 25 g L-1 de peptona e 0,1 a 3 g L-1 de sulfato de magnésio, 0,1 a 3 g L-1 de sulfato de manganês, previamente esterilizado em autoclave à 121°C por 20 min, sem rotação, em temperatura de 37°C por um período de 13~15 h, sendo o volume de meio 50% do frasco utilizado. As culturas pré-cultivadas foram centrifugadas a uma rotação de 3500 rpm por 30 min e lavadas com 0,85% de solução salina. As células obtidas após as lavagens foram ressuspendidas em água destilada estéril e uma alíquota foi medida em espectrofotômetro a 600nm com o objetivo de se realizar um inóculo controlado com uma densidade óptica de 0,2.

[056] Após a realização do pré-inóculo, descrito acima, foi realizada uma curva de crescimento do Lactobacillus plantarum UFSJP2, a fim de padronizar o tempo ótimo de crescimento desta cepa. A cepa L. plantarum UFSJP2 foi inoculada em frascos erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL de meio. Os frascos foram incubados sem rotação a 37°C por 24 h. Foram coletadas amostras a cada 3 h. A biomassa foi acompanhada através da liofilização. A liofilização foi realizada a partir de 24 mL do caldo fermentado, estes foram centrifugados a 4000 rpm por 20 min, lavados duas vezes com solução salina e secos através da liofilização, até atingir peso constante. Foi utilizado sempre um branco de meio (sem células) para realizar a correção do valor de biomassa formada. Considerando que este valor foi constante ao longo de cada experimento, foi realizado também contagem de UFC mL-1, para estimarmos o número total de células viáveis. Utilizando 1 mL do caldo fermentado para a realização das diluições seriadas (10-5/10-6/10-7), nos tempos de 0, 6, 9, 15, 18, 21 e 24 h. As placas foram incubadas a 37°C por 48 h, modificado de Brinques (2009) (Brinques, G. B. Otimização da produção de probióticos em biorreatores e suas aplicações em sistemas alimentícios sob a forma imobilizada. Tese -Doutorado em Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS, 2009).

[057] Os resultados foram avaliados através do controle da contagem celular por UFC mL-1 e pelo peso do liofilizado. O tempo de 18 h foi o tempo que proporcionou maior crescimento para a cepa UFSJP2 (UFC mL-1 de 6,2 x1010 e 0,3 g L-1) (Figura 1).

Desenvolvimento do Bioprocesso de Produção de biomassa Seleção das variáveis significantes por Fatorial Completo (DFC)

[058] Para o desenvolvimento de um processo para produção de biomassa de Lactobacillus plantarum UFSJP2, o primeiro passo foi a seleção das variáveis independentes que atuam sobre a resposta (variável dependente), que é a produção de biomassa. Um fatorial completo foi executado para a seleção das variáveis significantes que atuam sobre a produção de biomassa do Lactobacillus plantarum UFSJP2, visando avaliar a suplementação do soro de leite. As variáveis avaliadas foram as concentrações de: extrato de levedura, peptona, MgSO4 e MnSO4. Na Tabela 3 podemos observar o delineamento do experimento para a cepa UFSJP2, obtidos pelo programa R®.

[059] Após a execução do bioprocesso nas 12 condições avaliadas, foi realizado o plaqueamento para se avaliar a concentração celular (UFC mL-1) das diluições seriadas (10-5/10-6/10-7). Na Tabela 4 pode-se observar os valores de UFC mL-1.

[060] Os resultados foram analisados por meio de Análise de Variância, mostrada na Tabela 5. As variáveis que influenciaram significativamente no aumento da biomassa (UFC mL-1) P2 foram aferidas através da análise do p-valor. Foi analisada a interferência de cada componente do meio e as interações de segunda ordem destes componentes. Ao observar a tabela 4, o primeiro dado encontrado é em relação ao modelo que foi significativo com p-valor < 0,05. Analisando detalhadamente, nota-se que para todas as variáveis menos o magnésio, o p-valor foi menor que 0,05, mostrando a influência destes componentes do meio sobre a produção de uma alta biomassa. O magnésio não influenciou no aumento da produção de biomassa, sendo assim foi desconsiderado para as próximas etapas do experimento. Para as interações de segunda ordem, foi observado influência sobre a produção na interação entre todos os fatores combinados, por apresentarem p-valor > 0,05. O coeficiente de determinação, também chamado de R2, é uma medida de ajustamento de um modelo estatístico linear generalizado, com a regressão linear, em relação aos valores observados. O R2 encontrado foi de 99,8% indicando que 99,8% da variável dependente consegue ser explicada pelas repressores presentes no modelo.

[061] A Tabela 6 demonstra os coeficientes da regressão do fatorial completo. Esses coeficientes expressam a intensidade e o sinal do efeito dos fatores sobre a resposta na produção de biomassa. A partir dela, observa-se que o extrato de levedura apresenta o efeito positivo mais expressivo na produção de biomassa, calculada através do UFC mL-1. A peptona, manganês e o magnésio também apresentaram uma interferência positiva, porém mais baixa, na produção de biomassa, destacamos que a interferência do magnésio não houve significância estatística como demonstrado nas tabelas 4 e 5. Com o aumento da concentração do extrato de levedura, peptona e manganês é evidente que a produção da biomassa da P2, calculada pela UFC mL-1, também aumenta.

[062] A variável extrato de levedura se destacou como a variável com maior interferência no aumento da UFC mL-1, sendo visualizado no gráfico de Pareto, podemos observar que a peptona e o manganês também foram significativos para um aumento de biomassa (Figura 2). A partir desse gráfico, também se pode visualizar que houve influência das interações de segunda ordem entre todos os componentes demonstrando que estes juntos influenciam significativamente no aumento da produção de biomassa na cepa UFSJP2.

Delineamento composto central rotacional (DCCR)

[063] Após a elucidação de quais fatores da suplementação do soro de leite influenciam a produção de biomassa, procedeu-se à segunda fase do desenvolvimento do processo: a modelagem matemática para, a partir dos resultados obtidos com o DFC, determinar quais as condições que maximizam a variável resposta visando ajustar modelos de segunda-ordem que descrevam e que o processo. Em cada experimento a UFC mL-1 foi determinada. Na Tabela 7 podemos observar o delineamento do experimento para a cepa P2, obtidos pelo programa R®. A matriz do planejamento apresentou o delineamento de 20 unidades experimentais para as três variáveis que apresentaram significância estatística no fatorial completo, sendo elas: extrato de levedura, peptona e manganês.

[064] Os intervalos avaliados para o extrato de levedura estiveram entre as concentrações de 1 a 50 g L-1, para a peptona foi variada de 1 a 50 g L-1 e para o manganês variou de 0,1 a 5 g L-1. Os resultados obtidos em UFC mL-1 em 24h de cultivo para cada um dos ensaios dados pelo DCCR estão demonstrados na Tabela 8.

[065] Após a análise dos resultados da tabela 8, utilizando o programa R, foi gerada uma tabela de análise de variância para as UFC mL-1 (Tabela 9). As variáveis que influenciaram significativamente no aumento da UFC mL-1 da P2 foram aferidas através da análise do p-valor. Foi analisada a interferência de cada componente do meio e as interações de segunda ordem destes. Ao observar a tabela 8, o primeiro dado encontrado é em relação ao modelo que foi significativo com p-valor<0,05. Analisando detalhadamente, nota-se que para todas as variáveis exceto o manganês, o p-valor foi menor que 0,05, mostrando a influência destes componentes do meio para a produção de concentrações elevadas de biomassa. As interações de segunda ordem não influenciaram a produção por apresentarem p-valor > 0,05.

[066] A Tabela 10 demonstra os coeficientes da regressão do DCCR. Esses coeficientes expressam a intensidade e o sinal do efeito dos fatores sobre a resposta na produção de biomassa. A partir dela, observa-se que o extrato de levedura e peptona, apresentam efeito positivo na produção de biomassa, calculada através do UFC mL-1. Com o aumento da concentração do extrato de levedura e peptona é evidente que a produção da biomassa da cepa UFSJP2, calculada pela UFC mL-1, também aumenta.

[067] A região de UFC mL-1 máxima ajustada pôde ser alcançada quando se utilizou valores na faixa de 8 a 25 g L-1 de extrato de levedura, 5 a 25 g L-1 de peptona e 0,05 a 3 g L-1 de sulfato de manganês (Condição 1). Com esta condição ótima após o desenvolvimento do bioprocesso foi possível alcançar a produção de 3,7 x 1010 UFC mL-1, sendo assim, com a suplementação do soro de leite a produção de biomassa foi aproximadamente de 787 % em relação ao soro de leite não suplementado, o qual fornece uma UFC mL-1 de 4,7 x 109 (Tabela 3), demonstrando a importância do processo para o aumento do rendimento e a diminuição dos custos.

[068] Além do ponto ótimo, foi escolhido mais um ponto para se trabalhar, pensando em uma produção economicamente mais viável. Dessa forma, optou-se pelas concentrações nas faixas de 1 a 8 g L-1 de extrato de levedura, 0,1 a 5 g L-1 de peptona e 0,01 a 1 g L-1 de sulfato de manganês (Condição 2). Foi realizada então a validação destes dois pontos.

Validação dos modelos

[069] As melhores condições determinadas nas etapas anteriores foram utilizadas para nova experimentação em bancada, realizando uma produção em 25 mL de meio de cultura. A capacidade preditiva dos modelos estabelecidos foi avaliada empregando os fatores bias (FB) e exatidão (FA), equações 1 e 2, respectivamente (Baranyi, J., Pin, C. & Ross, T. Validating and comparing predictive models. Int. J. Food Microbiol. 48, 159-66, 1999).

em que: P corresponde aos valores preditos; O corresponde aos valores observados e n representa o número de dados experimentais. O fator bias indica o desvio médio relativo existente entre os valores preditos e observados, fornecendo a confiança do modelo. Um valor de Fb igual a 1 indica que os valores preditos e observados estão em total acordo. O fator exatidão indica como os valores experimentais se dispõem em torno dos valores preditos, fornecendo a exatidão do modelo. Valores aceitáveis de Fa devem estar em torno de 1. Este fator é apropriado para comparar dois ou mais modelos.

[070] As condições usadas para o experimento de validação basearam-se nos valores estimados de cada fator para a produção de biomassa, calculada através do UFC mL-1, (Condição 1 e Condição 2). Os valores escolhidos representaram a função desejabilidade (d) igual a 1. Os experimentos foram conduzidos em triplicata, com resultados expressos em UFC mL-1 e os valores obtidos para cada parâmetro fermentativo foram utilizados para o cálculo dos fatores Bias e Exatidão (Tabela 11). É possível observar que os valores dos fatores bias e exatidão estão próximos de 1, indicando que a função expressa pelo DCCR possui boa exatidão de resultados.

Produção do sorbet

[071] Para produção de 250 mL de sorbet de graviola utilizou-se 65g de banana prata, 196 g de polpa de graviola e 10 g de xilitol. Todos os ingredientes apresentavam temperatura de 4°C. Com o auxílio de multiprocessador doméstico, todos os ingredientes foram misturados pelo período de 3 min. A mistura neste ponto apresentou uma consistência cremosa e uniforme. Posteriormente a mistura foi armazenada em um congelador a temperatura média de -20°C por 30 min. Após esse período, a mistura foi retirada do congelador e novamente homogeneizada, agora em batedeira doméstica, por 3 min para a incorporação de ar na massa, deixando, dessa forma, o produto com característica airada. Repetiu-se essa última etapa do procedimento por mais cinco vezes, até adquirir uma consistência próxima de sorvete cremoso.

Viabilidade do probiótico no sorbet

[072] A capacidade de sobrevivência da cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 em sorbet de graviola congelado por um mês foi avaliada. Sabe-se que além da seleção adequada de cepas, o método de sua preparação é de fundamental importância, pois, a viabilidade das células probióticas na matriz alimentar é um pré-requisito para garantir o efeito benéfico do alimento. A viabilidade das linhagens probióticas dependem de fatores como pH do alimento, microrganismos competitivos, temperatura de armazenagem e presença de inibidores bacterianos na matriz alimentar. As polpas de graviola foram adquiridas no comércio da região, processadas para produção do sorbet e pasteurizadas conforme descrito acima. A cepa foi pré-incubada por 16 h a 37°C e, em seguida, inoculadas em 45 mL de caldo MRS. Após 24 h nas mesmas condições de incubação, as células foram lavadas uma vez com salina 0,85% e 0,9 mL desta suspensão foi adicionada em 4,1 mL de sorbet, de forma que a concentração final de bactérias fosse em torno de 109 células mL-1. Cerca de 5 mL de sorbet contendo a bactéria foi congelado a -20°C. As contagens do número de células vivas foram realizadas no momento da inoculação no sorbet (T0) e após 30 dias (T1). Para tal, alíquota de 1 mL era retirada das amostras, diluída e plaqueada em ágar MRS. As placas eram incubadas em anaerobiose por 48 h a 37°C. Os experimentos foram realizados em triplicata. O controle foi o sorbet pasteurizado sem a adição da bactéria. A tabela 12 mostra o número de sobreviventes ao longo do tempo.

Breve descrição das figuras

[073] Figura 1: Curva de crescimento da cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 A) avaliação da UFC mL-1 pelo tempo. B) Avaliação do peso do liofilizado pelo tempo.

[074] Figura 2: Gráfico de pareto para a cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2. EL: Extrato de levedura; Mg: Magnésio; Mn: Manganês.

Claims (5)

1. Processo de produção de uma preparação probiótica viável, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a) Pré-cultivar a cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 para obtenção do inóculo nas condições sem rotação, 37°C, 10-24 h e os componentes do meio 1 a 25 g L-1 de extrato de levedura, 0,1 a 25 g L-1 de peptona e 0,1 a 3 g L-1 de sulfato de magnésio, 0,1 a 3 g L-1 de sulfato de manganês previamente esterilizado em autoclave à 121°C por 20 min;
   • b) Cultivar a cepa Lactobacillus plantarum UFSJP2 nas condições sem rotação, 37°C, 15-48 h e os componentes do meio 1 a 25 g L-1 de extrato de levedura, 0,1 a 25 g L-1 de peptona e 0,1 a 3 g L-1 de sulfato de manganês, previamente esterilizado em autoclave à 121°C por 20 min;
   • c) Centrifugar o produto da fermentação em 2500 a 5000 rpm durante 5 a 30 min;
   • d) Alternativamente a centrifugação pode ser substituída por decantação ou por filtração;
   • e) Lavar o produto da fermentação com água ou solução tampão;
   • f) Repetir os passos (c) e (d);
   • g) Opcionalmente, pode-se secar a preparação probiótica;
2. Processo de produção de um sorbet a base de fruta com cepa probiótica, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a) Ambientar a 4°C os ingredientes: Musa sp, Annona sp e xilitol;
   • b) Triturar os ingredientes nas proporções de 24% (10-30%) de Musa sp, 72% (60-80%) de Annona sp e 4% (1-8%) de xilitol por 3 (1-5) min até a obtenção de uma consistência cremosa e uniforme;
   • c) Manter o preparado a -20°C (15 a 25°C) por 20 (10 a 30) min;
   • d) Misturar o preparado por 3 (1-5) min;
   • e) Repetir o procedimento (d) por 2 a 8 vezes;
   • f) Aquecer a mistura a 70 a 100°C por um tempo de 15 a 45 min, depois resfriado em banho de gelo por 15 a 45 min, homogeneizando a cada 10 a 15 min;
   • g) Adição do probiótico (mistura e proporção) na proporção de no mínimo 108 UFC para cada porção a ser consumida individualmente de 100 a 750 mL;
   • h) Homogeneizar por 0,5 - 5 min;
3. Sorbet, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser à base de fruta e possuir cepa probiótica viável;
4. Sorbet a base de fruta com cepa probiótica viável, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por conter a cepa probiótica Lactobacillus plantarum UFSJP2 com atividade antimicrobiana comprovada in vitro contra Salmonella enterica sub sp. Entérica serovar Typhimurium e Staphylococcus aureus;
5. Sorbet a base de fruta com cepa probiótica viável, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por conter a cepa probiótica Lactobacillus plantarum UFSJP2 na quantidade de 108 UFCmL-1.

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