BR102019005567A2 - Nanopartículas formadas a partir do n,n-dodecil,metil-pei incorporadas de vancomicina e revestidas com ácido hialurônico:processo de obtenção, composição farmacêutica e aplicação - Google Patents

Abstract

nanopartículas formadas a partir do n,n-dodecil,metil-pei incorporadas de vancomicina e revestidas com ácido hialurônico: processo de obtenção, composição farmacêutica e aplicação. a presente invenção se trata de uma formulação farmacêutica composta por nanopartículas de n,n?dodecil,metil?pei, incorporadas a vancomicina, e revestidas pelo ácido hialurônico. o n,n?dodecil,metil?pei, um polímero funcional, possui atividade contra bactérias gram positivas e gram negativas. a vancomicina, um fármaco antibiótico, atua contra bactérias gram positivos. ambos exercem ação anti-bacteriana sinérgica. o ácido hialurônico, um polissacarídeo mucoadesivo, reveste as nanopartículas, permitindo-as aderir em mucosas infectadas, mantendo as nanopartículas em contato com o tecido por tempo prolongado, garantindo mais efetividade na ação anti-bacteriana.

Description

NANOPARTÍCULAS FORMADAS A PARTIR DO N,N-DODECIL,METIL-PEI INCORPORADAS DE VANCOMICINA E REVESTIDAS COM ÁCIDO HIALURÔNICO:PROCESSO DE OBTENÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E APLICAÇÃO Campo da invenção

[01] A presente invenção se trata de uma formulação farmacêutica composta por nanopartículas de N,N-dodecil,metil-PEI, incorporadas a vancomicina, e revestidas pelo ácido hialurônico. O N,N-dodecil,metil-PEI, um polímero funcional, possui atividade contra bactérias gram positivas e gram negativas. A vancomicina, um fármaco antibiótico, atua contra bactérias gram positivos. Ambos exercem ação anti-bacteriana sinérgica. O ácido hialurônico, um polissacarídeo mucoadesivo, reveste as nanopartículas, permitindo-as aderir em mucosas infectadas, mantendo as nanopartículas em contato com o tecido por tempo prolongado, garantindo mais efetividade na ação anti-bacteriana.

Descrição resumida da Tecnologia

[02] Com o intuito de aumentar o arsenal terapêutico disponível para o tratamento de doenças infecciosas bacterianas, novas formulações farmacêuticas baseadas na nanotecnologia vêm sendo desenvolvidas. Estes sistemas nanométricos medicamentosos possuem a capacidade de atingir populações celulares de forma específica, oferecendo uma liberação controlada e sítio-específica do fármaco diretamente na célula, garantindo um tratamento direcionado, e consequentemente, mais eficaz (BRIONES E.; COLINO C.I.; LANAO, J.M. Delivery systems to increase the selectivity of antibiotics in phagocytic cells, J Control Release. v.125, p.210-227, 2008).

Descrição detalhada da tecnologia

[03] Dentre os sistemas nanométricos, destacam-se as nanopartículas poliméricas carreadoras de fármacos, que são definidas como partículas menores do que 1 micrômetro, produzidas a partir de polímeros de origem natural, sintética ou semi sintética (GAETE, C.G. Polymeric nanoparticles: technologie and pharmaceutical applications. Rev. Farmacol. Chile, v. 7, n. 2, p. 7-16, 2014). As nanopartículas apresentam inúmeras funcionalidades terapêuticas, pois vetorizam fármacos e/ou compostos bioativos de diversas classes farmacológicas, tais como os antibióticos. Adicionalmente, podem ser administradas por meio de diversas vias, tais como a oftálmica, oral e parenteral, oferecendo vantagem em termos farmacocinéticos. Finalmente, as nanopartículas liberam o fármaco e/ou composto bioativo de forma controlada e prolongada, diretamente no alvo, fazendo com que bactérias resistentes tenham contato contínuo com o fármaco e/ou composto bioativo, garantindo a sua eliminação/inibição.

[04] Considerando o destaque que as nanopartículas apresentam no contexto da terapêutica, nesta patente, nanopartículas constituídas do polímero N,N-dodecil,metil-PEI, incorporadas de vancomicina, um fármaco antibacteriano, e revestidas com ácido hialurônico, foram elaboradas, com o intuito de tratar infecções bacterianas.

[05] Estas nanopartículas são formadas a partir do polímero N,N-dodecil,metil-PEI, que é obtido por meio da aminação redutiva e da N-alquilação de moléculas da polietilenoimina. O N,N-dodecil,metil-PEI é um polímero sintético, quaternário de amônio, catiônico, altamente hidrofóbico, que apresenta elevada atividade antimicrobiana contra bactérias gram-negativas e gram-positivas (SCHAER, T.P., et al. Hydrophobic polycationic coatings that inhibit biofilms and support bone healing during infection. Elsevier. Biomaterials. ed. 5, v. 33, p. 1245-1254, 2012. WO CHUNG, J.W; HOBBS, D.T. Mini Review: Novel antimicrobial compounds in the age of increasing bacterial resistance. In: Mendez-Vilas A, editor: Formatex Research Center, p. 722-727 2011. LIU, H.K. New Immobilized Antimicrobial Polyethylenimines: Synthesis and Properties. Dissertação (Mestrado). Massachusetts Institute of Technology. Mestrado em Química, 2014). Este polímero foi originalmente elaborado para revestir superfícies e próteses a fim de evitar infecções e a formação de biofilmes (BEHLAU, I.; MUKHERJEE, K.; TODANI, A. et al. Biocompatibility and biofilm inhibition of N,N-hexyl,methylpolyethylenimine bonded to Boston Keratoprosthesis materials. Biomaterials. vol. 32. n. 34. p. 8783-8796, 2011. KOPLIN, S. A., et al. Evaluation of the antimicrobial activity of cationic polyrthyleneimines on dry surfaces. Biotechnol. v. 24, p. 1160-1165, 2008. SCHAER, T.P., et al. Hydrophobic polycationic coatings that inhibit biofilms and support bone healing during infection. Elsevier. Biomaterials. 5 ed, v. 33, p. 1245-1254, 2012). A eficácia biocida deste polímero é atribuída à existência de carga positiva em sua estrutura química e da sua natureza hidrofóbica. Em pH fisiológico, as superfícies bacterianas apresentam carga negativa; sendo assim, o N,N-dodecil,metil-PEI, por apresentar carga positiva, se associa à bactéria por meio da atração das cargas opostas, desestruturando a membrana celular. Em paralelo, a porção hidrofóbica do polímero interage com moléculas hidrofóbicas da parede celular bacteriana, dentre elas os peptideoglicanos, promovendo maior desestabilização do arcabouço da parede celular. Como resultado, há extravasamento de material celular, que é essencial à sobrevivência da bactéria (BEYTH, N; YUDOVIN-FARBER, I; BAHIR, R; DOMB, A.J; WEISS, E.I. Antibacterial activity of dental composites containing quaternary ammonium polyethylenimine nanoparticles against Streptococcus mutans. Biomaterials. v. 27, n. 21, p. 3995-4002, 2006).

[06] A patente US20150328378 descreve a utilização do polímero N,N-dodecil,metil-PEI como revestimento anti-microbiano de implantes ortopédicos e endodôndicos. Este revestimento mostrou-se eficaz na eliminação dos sinais clínicos de infecção microbiana após a inserção destes implantes em modelo animal (SCHAER, T.P; STEWART, S; KLIBANOV, A.M. Antibacterial coatings that inibit biofilm formation on implants. 27 Jul. 2015, 19 Nov. 2015).

[07] KOPLIN e colaboradores (KOPLIN, A; LIN, S; DOMANSKI, T. Evaluation of the Antimicrobial Activity of Cationic Polyethylenimines on Dry Surfaces. Biotechnol. Prog., v.24, n. 5, 2008) avaliaram a atividade antimicrobiana do N,N-dodecil,metil-PEI contra S. aureus, A. baumannii e E. coli. Este polímero foi aplicado como revestimento em superfícies utilizando o procedimento semelhante à pintura. As bactérias foram pulverizadas sob estas superfícies. As superfícies foram altamente biocidas após 30 minutos de pulverização dos microrganismos.

[08] Larson e colaboradores (LARSON, A.M; HSU, B.B; RAUTARAY, D; HALDAR, J. et al. Hidrophobic polycationic coatings disinfect polivirus and rotavirus solutions. Biotechnol Bioeng. v.108, n. 3, p. 720-723, 2011) e Haldar e colaboradores (HALDAR, J; CHEN, J; TUMPEY, T.M; GUBAREVA, L.V; KILBANOV, A.M. Hidrophobic polycationic coatings inactive wild-type and zanamivir- and/or oseltamivir - resistant human and avian influenza viruses. Biotechnol Lett. v.30, p. 475-479, 2008) evidenciaram que superfícies revestidas por N,N-dodecil,metil-PEI, aplicado por procedimento de pintura, apresentaram atividade anti-microbiana frente a cepas do vírus da gripe, humanos e aviários. Estes estudos concluíram que o polímero é eficaz na inativação destes vírus, incluindo àqueles resistentes aos fármacos disponíveis no mercado, devido aos danos provocados no envelope dos vírus.

[09] A patente US20140202964 descreve a utilização do N,N-dodecil,metil-PEI em um sistema para desinfecção de água, em que o polímero foi ligado covalentemente à areia. Deste modo, os microorganismos são inativados à medida que a água corrente passa pelo filtro. Os autores observaram que ao contrário dos desinfetantes de água convencionais, o filtro de areia desenvolvido com o polímero antimicrobiano não cria subprodutos de desinfecção nocivos (GU, A.P; KLIBANOV, A.M; ONNIS-HAYDEN, A. HSU B.B LEWIS, K. Antimicrobial polycationic sand filter for water disinfection.10 maio 2013. 24 jul 2014).

[010] Apesar da aplicabilidade do N,N-dodecil,metil-PEI como agente antimicrobiano, na presente invenção, este polímero apresenta a função de compor estruturalmente as nanopartículas poliméricas e agir sinergicamente com a vancomicina contra as bactérias em mucosas biológicas.

[011] A vancomicina foi encapsulada nas nanopartículas por ser um fármaco antibiótico do grupo dos glicopeptídeos, e atuar sobre cocos e bacilos gram-positivos, como por exemplo, Staphylococcus aureus, Streptomyces orientalis e Staphylococcus epidermidis, além de ser efetiva contra cepas de estafilococus resistentes a meticilina (LOPES, H. V. O papel atual da vancomicina nas infecções estafilocócicas. Revista Panamericana de Infectologia, v.9, n.3, p. 70-71, 2007). A vancomicina exerce sua ação anti-bacteriana por ser um antagonista competitivo da polimerização da cadeia de peptideoglicano. A má ou não formação desta cadeia compromete a formação da parede celular bacteriana, alterando a permeabilidade da membrana citoplasmática e interferindo na síntese de ácido ribonucleico (TAVARES, W. Manual de antibióticos e quimioterápicos. 3° ed., 1216p, Atheneu, São Paulo, 2002. HECK, A. J. R.; BONNICI, P. J.; BREUKINK, E.; MORRIS, D.; WILLS, M. Modification and inhibition of vancomycin group antibiotics by formaldehyde and acetaldehyde. Chemical European Journal, v.7, p. 910-916, 2001).

[012] A vancomicina vem sendo utilizada em sistemas nanoestruturados em os quais são compostos por materiais poliméricos sintéticos ou naturais, conforme descrito a seguir.

[013] A patente US20130089599A1 (De SILVA, M.N, O’CONNOR, k, TIBA, A. Nano Encapsulated therapy for the treatment of chronic diseases and other diseases, 2012) descreve a elaboração de nanopartículas constituídas de poli (caprolactona), poli (alquilcianoacrilatos) e ácido poli (DL-lático-co-glicólico) (PLGA), para atuar na liberação direta, localizada e prolongada de fármacos antibióticos em feridas, a vancomicina está dentre os agentes antimicrobianos descritos.

[014] A patente EUA 9.694.085 B2 (Nano DERM Sciences, Inc. Target therapeutic nanoparticles, 2017) descreve a utilização de poloxâmeros para a encapsulação e liberação controlada de antimicrobianos (penicilina, cefalosporina e glicopeptídeos) destinados a atingir bactérias resistentes a múltiplos fármacos.

[015] A patente EUA 7.291.598 B2 (SUNG, H.W, LIN, Y.H, TU, H. Nanoparticles for protein drug delivery, 2017) refere-se a aplicação de nanopartículas destinadas a administração por via oral, compostas por quitosana, para carrear fármacos proteicos (calcitonina e vancomicina) a fim de aumentar a liberação paracelular do fármaco.

[016] A patente US7449200B2 (SUNG, H.W; CHEN, M.C; LEE, P.W; TU, H. Nanoparticles for protein/peptide delivery and delivery means, 2006) descreve a produção e aplicação de nanopartículas formadas a partir de poli (ácido glutâmico) contendo proteínas ou peptídeos, dentre eles cita-se a vancomicina. Os sistemas foram desenvolvidos visando infecções em animais.

[017] A patente US 2006/0233883 A1 (ISHIHARA T; MIZUSHIMA, Y. Intravenous nanoparticles for targeting drug delivery and sustained drug release, 2004) descreve o método de preparo e utilização de nanopartículas formadas a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) e poli (ácido láctico) (PLA), para encapsular fármacos hidrofílicos de diferentes classes, dentre eles a vancomicina.

[018] A presente invenção destaca-se das demais formulações descritas, devido a utilização do polímero funcionalizado N,N-dodecyl,metil-PEI, que além de compor estruturalmente as nanopartículas, proporciona ação sinérgica com a vancomicina, liberada no local de ação, levando a uma maior efetividade no tratamento anti-bacteriano.

[019] Para que as nanopartículas permaneçam por tempo prolongado sob as mucosas infectadas por bactérias, estes sistemas foram revestidos com ácido hialurônico, que é um polissacarídeo com propriedades mucoadesivas (HE, M. et al. Hyaluronic acid coated poly(butyl cianoacrylate) nanoparticles as anticâncer drug carries. Int. J. Pharm, v. 373, p. 165-173, 2009). A permanência das nanopartículas no local infectado garante que a vancomicina liberada esteja continuamente em contato com a bactéria, eliminando-a e evitando resistência. Adicionalmente, o polímero N,N-dodecil,metil-PEI, que também apresenta ação anti-bacteriana, age sinergicamente no processo de eliminação destes microrganismos. Estas nanopartículas podem atuar em infecções oculares, vaginais, orais, nasais, e quaisquer outros tecidos corporais contaminados, em humanos e animais.

[020] A patente BR 10 2018 067481 1 (DA SILVA, G.R.; MELO, C.M. Nanopartículas constituídas de poli (cloreto demetacrilato de acrilato de etilo-metacrilato de co-metil-co-trimetilamonioetilo) e anfotericina B e revestidas com ácido hialurônico: processo de obtenção, composição farmacêutica e aplicação) descreve a elaboração de nanopartículas compostas pelo poli (cloreto demetacrilato de acrilato de etilo-metacrilato de co-metil-co-trimetilamonioetilo), incorporadas de anfotericina B, um agente antifúngico, e revestidas com ácido hialurônico, visando a mucoadesividade destes sistemas sob a mucosa ocular para o tratamento das endofltamites fúngicas que acometem o segmento posterior do olho. O ácido hialurônico foi utilizado por apresentar propriedades mucoadesivas e permitir que as nanopartículas permaneçam por tempo prolongado sob a mucosa ocular, garantindo a eliminação dos fungos infectantes.

[021] Diante das informações descritas, tem-se como objetivo, nesta patente, descrever a elaboração de uma formulação farmacêutica representada por nanopartículas poliméricas constituídas do N,N-dodecil,metil-PEI e vancomicina e revestidas com ácido hialurônico destinadas ao tratamento das infecções bacterianas localizadas em mucosas e quaisquer outros tecidos corporais contaminados do organismo humano e/ou animal, sendo que tanto o polímero quanto o fármaco encapsulado contribuem sinergicamente com o efeito antibacteriano.

Exemplos

[022] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos exemplos a seguir:

Exemplo 1: Obtenção de vancomicina base livre a partir de cloridrato de vancomicina.

[023] Para a obtenção de vancomicina base, dissolve-se o cloridrato de vancomicina em água obtendo-se uma solução a 70 mg/mL. Em seguida, o pH ajusta-se o pH para 8 - 8,2 por meio da adição de solução de hidróxido de sódio 3 mol L. Mantém-se a solução em repouso por 60 minutos. Centrifugase e lava-se por 3 vezes com 10 mL de etanol 70% (v/v) e 2 vezes com metanol. Lava-se novamente com 10 mL de água purificada e liofiliza-se.

Exemplo 2: Obtenção das nanopartículas formadas a partir do N,N-dodecil.metil-PEI. incorporadas a vancomicina do Exemplo 1 utilizando delineamento fatorial 23 como réplicas no ponto central

[024] Dissolveram-se 1 mg de vancomicina e 8 a 12 mg de N,N-dodecil,metil-PEI em uma mistura de solventes orgânicos. Em seguida, verte-se esta mistura em 4 mL de água purificada contendo 0,5 a 1,5% de tensoativo. Agita-se a mistura com o sonicador em banho de gelo por 6 a 14 minutos. As soluções resultantes são mantidas sob agitação magnética por 8 a 12 horas, a temperatura ambiente, para a evaporação dos solventes orgânicos. Remove-se a vancomicina não encapsulada por centrifugação à 14.000 g por 30 a 40 minutos. Realiza-se o delineamento fatorial 23 com quintuplicata no ponto central por meio da modificação de três variáveis independentes, sendo elas: (1) massa do polímero; (2) tempo de agitação no sonicador; (3) concentração do tensoativo. Produzem-se 9 lotes de nanopartículas diferentes devido ao delineamento fatorial, os quais foram numerados de 1 a 9.

Exemplo 3: Caracterização das nanopartículas obtidas no Exemplo 2.

[025] Caracterizaram-se as nanopartículas obtidas nos 9 lotes por meio da avaliação do diâmetro, índice de polidispersão, potencial zeta e eficiência de encapsulação da vancomicina base incorporada aos sistemas manométricos. As nanopartículas obtidas no Exemplo 2 apresentaram diâmetro entre 160 e 285 nanômetros, índice de polidispersão entre 0,099 e 0,326, potencial zeta entre + 39,1 e +53,9, e eficiência de encapsulação entre 80,70 e 96,42%.

Exemplo 4: Revestimento com ácido hialurônico das nanopartículas otimizadasdo lote 4 do Exemplo 3.

[026] Revestiram-se com ácido hialurônico as nanopartículas otimizadas do lote 4 do Exemplo 3. As nanopartículas são revestidas empregando-se o método da adsorção, em que soluções aquosas de ácido hialurônico a 0,5 a 4,5 mg/mL são adicionadas, por gotejamento e agitação, sob a suspensão de nanopartículas, e mantidas sob agitação magnética por 1 a 2 horas.

Exemplo 5: Caracterização das nanopartículas revestidas obtidas no Exemplo 4.

[027] Caracterizaram-se as nanopartículas revestidas por meio da avaliação do diâmetro, índice de polidispersão, potencial zeta e eficiência de encapsulação. As nanopartículas obtidas no Exemplo 4 apresentaram diâmetro entre 148 e 153 nanômetros, índice de polidispersão entre 0,169 e 0,281, potencial zeta entre + 21,5 e +36,8, e eficiência de encapsulação entre 90,00 e 94,00%.

Exemplo 6: Estudo de liberação in vitro da vancomicina a partir das nanopartículas revestidas obtidas no Exemplo 4.

[028] Realiza-se o estudo de liberação in vitro utilizando-se tampão fosfato de potássio (PBS) pH 7,4 como meio de liberação seguindo as condições de esgotamento, pelo método da membrana de diálise. Em tempos pré-determinados, o meio de liberação é recolhido para a quantificação da vancomicina liberada a partir das nanopartículas, e novo meio recentemente preparado foi reposto. Determinou-se a porcentagem de fármaco liberada por meio do método espectrofotométrico a 280 nm. As nanopartículas liberaram a vancomicina de forma controlada e aproximadamente 58% deste fármaco foi liberado em 96 horas do experimento.

Exemplo 7: Avaliação da atividade antimicrobiana das nanopartículas revestidas obtidas no Exemplo 4.

[029] Avalia-se a atividade antimicrobiana das nanopartículas revestidas por meio do teste de difusão em ágar. Semeia-se o inóculo de Staphylococcus aureus em ágar Mueller-Hinton por meio de estrias uniformes. Deposita-se 50 microlitros de solução aquosa de vancomicina (controle positivo), de nanopartículas otimizadas sem revestimento e de nanopartículas otimizadas com revestimento de ácido hialurônico. Filtraram-se estas soluções com filtros 0,22 micrômetros antes do depósito no ágar. Após 24 horas de incubação, observam-se os halos de inibição para cada solução, que foram 12,6 milímetros, 16,78 milímetros e 16,23 milímetros para a vancomicina, nanopartículas não revestidas e nanopartículas com ácido hialurônico, respectivamente.

Claims (12)

1. Nanopartículas, caracterizadas por serem constituídas de N,N-dodecil,metil-PEI, incorporadas de vancomicina, e revestidas com ácido hialurônico.
2. Nanopartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por apresentarem diâmetro entre 148 e 153 nanômetros, índice de polidispersão inferior a 0,3 e potencial zeta positivo.
3. Nanopartículas de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas por apresentarem adicionalmente outros fármacos incorporados.
4. Nanopartículas de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizadas por serem administradas sob mucosas e outros tecidos corporais infectados por bactérias em seres humanos e animais.
5. Processo de preparo das nanopartículas, definidas nas reivindicações 1 a 4, caracterizado pela seguinte etapa: prepara-se uma solução dissolvendo-se 1 mg de vancomicina e 8 a 12 mg do N,N-dodecil,metil-PEI em mistura de solventes orgânicos, esta solução é vertida lentamente, por meio de gotejamento, sob agitação moderada, em 4 mL de solução aquosa contendo o tensoativo a 0,5 e 1,5% (p/v), os solventes orgânicos são posteriormente removidos por meio da evaporação e a vancomicina não encapsulada é centrifugada.
6. Processo de preparo das nanopartículas, definidas nas reivindicações 1 a 4, caracterizado pelas seguintes etapas: as soluções aquosas de ácido hialurônico a 0,5 e 1,5% (p/v) foram gotejadas sob as nanopartículas recentemente preparadas com o intuito de revesti-las por adsorção.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, etapa, caracterizado pela mistura de solventes orgânicos ser clorofórmio e metanol (1:1).
8. Composição farmacêutica anti-bacteriana, caracterizada por conter as nanopartículas constituídas de N,N-dodecil,metil-PEI, incorporadas de vancomicina, e revestidas com ácido hialurônico, definidas nas reivindicações 1 a 4, e compostas por excipientes biologicamente aceitáveis.
9. Composição farmacêutica anti-bacteriana, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por ser administrada sob mucosas e outros tecidos corporais infectados por bactérias em seres humanos e animais.
10. Aplicação da composição farmacêutica anti-bacteriana, definida na reivindicação 8, caracterizada por ser para preparação de um medicamento para o tratamento das infecções bacterianas, principalmente as que atingem as mucosas e tecidos corporais, em seres humanos e animais.
11. Aplicação da composição farmacêutica anti-bacteriana, definida nas reivindicações 1 a 4, caracterizada por ser para preparação de um medicamento para o tratamento das infecções bacterianas, principalmente as que atingem as mucosas e tecidos corporais, em seres humanos e animais.
12. Aplicação, de acordo com as reivindicações 10 e 11, caracterizada pelo medicamento ser administrado em mucosas e tecidos corporais.