BR102018077081A2

BR102018077081A2 - antibacterial composition comprising volatile oils and feed comprising such composition

Info

Publication number: BR102018077081A2
Application number: BR102018077081-0A
Authority: BR
Inventors: Marta Cristina Teixeira Duarte; Renata Antunes Estaiano De Rezende
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2020-07-07
Also published as: BR102018077081A8

Abstract

A presente invenção se refere a uma composição antibacteriana compreendendo óleos voláteis extraídos de plantas, e seu uso em rações destinadas a aquicultura, em especial a piscicultura.The present invention relates to an antibacterial composition comprising volatile oils extracted from plants, and its use in feed intended for aquaculture, in particular fish farming.

Description

ANTIBACTERIAL COMPOSITION UNDERSTANDING VOLATILE OILS AND FEED UNDERSTANDING SUCH COMPOSITION

FIELD OF THE INVENTION

[1] A presente invenção se refere a uma composição antibacteriana compreendendo óleos voláteis extraídos de plantas, e seu uso em rações destinadas a aquicultura, em especial a piscicultura.[1] The present invention relates to an antibacterial composition comprising volatile oils extracted from plants, and its use in feed intended for aquaculture, in particular fish farming.

[2] A presente invenção se insere no campo de aplicação de criação de animais aquáticos.[2] The present invention falls within the field of application for aquatic animal breeding.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[3] O Brasil é o pais que apresenta o maior potencial do mundo para a produção de pescado através da aquicultura, tendo em vista a vastidão de seu território, com mais de 2/3 ocupando a região tropical, bacias hidrográficas privilegiadas e ricas, onde se destaca a bacia amazônica, responsável por 2 0% da água doce do mundo. Apesar do seu grande potencial para o desenvolvimento da aquicultura, o pais enfrenta o desafio de desenvolvê-la de forma sustentável e com a qualidade exigida pelos mercados interno e externo (OSTRENSKY, 2008)[3] Brazil is the country that has the greatest potential in the world for the production of fish through aquaculture, in view of the vastness of its territory, with more than 2/3 occupying the tropical region, privileged and rich hydrographic basins, where the Amazon basin stands out, responsible for 20% of the world's fresh water. Despite its great potential for the development of aquaculture, the country faces the challenge of developing it sustainably and with the quality required by the domestic and foreign markets (OSTRENSKY, 2008)

[4] Assim, como em outras atividades de criação animal, o uso de antimicrobianos na aquicultura é uma importante ferramenta para assegurar a alta produtividade e sanidade. No entanto, atualmente no Brasil, existem apenas três antimicrobianos registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) para uso na aquicultura, o que contribui para o uso de substâncias ilícitas nesta atividade. Dentre as substâncias utilizadas, podem ser citados antimicrobianos destinados a outras espécies animais, agrotóxicos, inseticidas, herbicidas e
produtos altamente tóxicos, principalmente quando utilizados em corpos d'água (GALVÃO, 2014). Os antimicrobianos provocam ainda problemas de saúde pública, uma vez que podem selecionar bactérias resistentes, colocando em risco a saúde do peixe, do ambiente e do consumidor.[4] Thus, as in other animal husbandry activities, the use of antimicrobials in aquaculture is an important tool to ensure high productivity and health. However, currently in Brazil, there are only three antimicrobials registered with the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA) for use in aquaculture, which contributes to the use of illegal substances in this activity. Among the substances used, antimicrobials for other animal species, pesticides, insecticides, herbicides and
highly toxic products, especially when used in water bodies (GALVÃO, 2014). Antimicrobials also cause public health problems, since they can select resistant bacteria, putting the health of the fish, the environment and the consumer at risk.

[5] Esse quadro de grande importância econômica, por sua vez, justifica a prevenção contra o surgimento de novas doenças, pois a disseminação de uma eventual enfermidade certamente comprometeria a produção, devido às elevadas taxas de mortalidade e lesões provocadas (SCHUTER E FILHO, 2017).[5] This scenario of great economic importance, in turn, justifies prevention against the emergence of new diseases, since the spread of an eventual disease would certainly compromise production, due to the high mortality rates and injuries caused (SCHUTER E FILHO, 2017).

[6] A expansão da piscicultura no Brasil trouxe consigo problemas sanitários relacionados à própria intensificação da atividade. O manejo zootécnico e o desequilíbrio ambiental atuam como fatores estressantes, induzindo nos peixes, aumento da concentração plasmática de cortisol e depressão dos mecanismos de defesa orgânica, aumentando a susceptibilidade às doenças infecciosas e parasitárias[6] The expansion of fish farming in Brazil brought with it health problems related to the intensification of the activity itself. Zootechnical management and environmental imbalance act as stressors, inducing fish to increase plasma cortisol concentration and depression of organic defense mechanisms, increasing susceptibility to infectious and parasitic diseases

[7] Doenças infecciosas e parasitárias são consideradas grandes problemas para a piscicultura por representarem potenciais riscos na produção, e em perdas no estoque. Dentre as enfermidades causadas por bactérias em peixes, foram descritas espécies patogênicas em uma variedade de grupos bacterianos, sendo que os bacilos Gram-negativos representam a porcentagem mais elevada (BARJA E ESTEVEZ-TORANZO, 1988).[7] Infectious and parasitic diseases are considered major problems for fish farming because they represent potential risks in production, and in losses in stock. Among the diseases caused by bacteria in fish, pathogenic species have been described in a variety of bacterial groups, with Gram-negative bacilli representing the highest percentage (BARJA E ESTEVEZ-TORANZO, 1988).

[8] O uso de antibióticos é o principal tratamento aplicado para o controle das bacterioses em peixes. Consequentemente, o largo emprego desses antibióticos leva
ao desenvolvimento e seleção de bactérias resistentes, podendo levar à contaminação de outros animais e do homem (ROMERO et al., 2012).[8] The use of antibiotics is the main treatment applied to control bacteriosis in fish. Consequently, the widespread use of these antibiotics leads to
to the development and selection of resistant bacteria, which can lead to contamination of other animals and man (ROMERO et al., 2012).

[9] Dentre os antimicrobianos licenciados pela Food end Drug Administration (FDA) para uso em peixes estão o florfenicol, oxitetraciclina sulfadimethoxine e ormetroprim, sendo os dois primeiros os mais utilizados (FDA, 2017). Já no Brasil este quadro não é diferente, e dentre os antimicrobianos licenciados para uso em aquicultura estão o florfenicol (Aquaflor 50% premix - Merck Sharp and Dohme) e a oxitetraciclina (TM 700 - Phibro Saúde Animal). O antimicrobiano neomicina (Bacter - Labcon) também tem sua utilização permitida, porém, somente para tratamento de peixes ornamentais. Todavia, sabe-se que também são utilizados rotineiramente na aquicultura outros antimicrobianos que ainda não são permitidos, colocando em risco toda a cadeia produtiva. Não à toa que a Instrução Normativa N° 09, de 21 de fevereiro de 2017 inclui no Plano Nacional De Controle De Resíduos e Contaminantes em Produtos de Origem Animal (PNCRC) os limites de referência e planos de amostragem para 27 antimicrobianos, possivelmente presentes em carne de pescado, tanto provenientes de captura quanto advindos dos sistemas de cultivo (MAPA, 2017)[9] Among the antimicrobials licensed by the Food end Drug Administration (FDA) for use in fish are florfenicol, oxytetracycline sulfadimethoxine and ormetroprim, the first two being the most used (FDA, 2017). In Brazil, this picture is no different, and among the antimicrobials licensed for use in aquaculture are florfenicol (Aquaflor 50% premix - Merck Sharp and Dohme) and oxytetracycline (TM 700 - Phibro Saúde Animal). The antimicrobial neomycin (Bacter - Labcon) is also allowed to be used, however, only for the treatment of ornamental fish. However, it is known that other antimicrobials that are not yet permitted are also routinely used in aquaculture, putting the entire production chain at risk. It is not by chance that Normative Instruction No. 09, of February 21, 2017 includes in the National Plan for the Control of Residues and Contaminants in Products of Animal Origin (PNCRC) the reference limits and sampling plans for 27 antimicrobials, possibly present in fish meat, both from capture and from farming systems (MAPA, 2017)

[10] Em vista do problema de desenvolvimento de resistência bacteriana torna-se urgente o estabelecimento de regras para o uso racional de antimicrobianos e o emprego de terapias alternativas para o controle das bacterioses.[10] In view of the problem of developing bacterial resistance, it is urgent to establish rules for the rational use of antimicrobials and the use of alternative therapies to control bacteriosis.

[11] Os óleos voláteis são substâncias lipofílicas derivadas do metabolismo secundário das plantas, constituídos por uma variedade de compostos aromatizantes,
empregados como matérias-primas nas indústrias cosmética, farmacêutica e alimentícia (MONTEIRO E BRANDELLI, 2017).[11] Volatile oils are lipophilic substances derived from the secondary metabolism of plants, consisting of a variety of flavoring compounds,
used as raw materials in the cosmetic, pharmaceutical and food industries (MONTEIRO E BRANDELLI, 2017).

[12] Os óleos voláteis são constituídos por mono e sesquiterpenos de diferentes classes químicas, biossintetizados nos plastídeos ou citosol das plantas aromáticas. São também chamados de óleos etéreos ou essenciais, por serem líquidos de aparência oleosa à temperatura ambiente. Sua principal característica é a volatilidade, diferindo-se, assim, dos óleos fixos, lipídeos geralmente obtidos de sementes (SIMÕES et al., 1999).[12] Volatile oils are made up of mono and sesquiterpenes of different chemical classes, biosynthesized in the plastids or cytosol of aromatic plants. They are also called ethereal or essential oils, as they are oily-looking liquids at room temperature. Its main characteristic is volatility, thus differing from fixed oils, lipids generally obtained from seeds (SIMÕES et al., 1999).

[13] As propriedades antimicrobianas dos óleos voláteis têm sido reconhecidas empiricamente durante séculos, mas foram confirmadas cientificamente ao longo dos anos a partir de sucessivos estudos científicos. Extratos e óleos voláteis de plantas mostraram-se eficientes no controle do crescimento de uma ampla variedade de microrganismos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e bactérias com diferentes aplicações práticas (DUARTE, 2006, SHEHATA et al., 2013; MILLEZI et al., 2013; FIGUEIREDO, 2017) .[13] The antimicrobial properties of volatile oils have been recognized empirically for centuries, but have been scientifically confirmed over the years from successive scientific studies. Volatile plant extracts and oils have been shown to be effective in controlling the growth of a wide variety of microorganisms, including filamentous fungi, yeasts and bacteria with different practical applications (DUARTE, 2006, SHEHATA et al., 2013; MILLEZI et al., 2013 ; FIGUEIREDO, 2017).

[14] As principais vantagens do emprego desses
óleos como agentes antimicrobianos, se dá devido à
dificuldade na seleção de microrganismos resistentes (o que é consequência da complexidade de sua composição química), seu largo espectro antimicrobiano, sua baixa toxicidade, além de serem considerados seguros ambientalmente, pois possuem uma grande variedade de compostos biodegradáveis, atóxicos para mamíferos, aves e peixes (MISRA et al., 1996; STROH, 1998; FIGUEIREDO, 2017).[14] The main advantages of using these
oils as antimicrobial agents, is due to the
difficulty in selecting resistant microorganisms (which is a consequence of the complexity of their chemical composition), their broad antimicrobial spectrum, their low toxicity, in addition to being considered environmentally safe, as they have a wide variety of biodegradable compounds, non-toxic to mammals, birds and fish (MISRA et al., 1996; STROH, 1998; FIGUEIREDO, 2017).

[15] Quanto ao emprego dos óleos voláteis na
piscicultura, Castro et al. (2008) avaliaram a atividade antibacteriana de 46 espécies de plantas nativas da região sudoeste brasileira contra bactérias patogênicas para peixes (S. agalactiae, F. columnare e A. hydrophila). Destes extratos, 31 foram ativos, porém nenhum se mostrou ativo para A. hydrophila e S. agalactiae, simultaneamente.[15] Regarding the use of volatile oils in
fish farming, Castro et al. (2008) evaluated the antibacterial activity of 46 species of plants native to the southwestern Brazilian region against pathogenic bacteria for fish (S. agalactiae, F. columnare and A. hydrophila). Of these extracts, 31 were active, but none were active for A. hydrophila and S. agalactiae, simultaneously.

[16] Diferentes modos de ação dos óleos voláteis compõem os mecanismos de inibição dos microrganismos. Os compostos fenólicos presentes nos óleos voláteis têm sido conhecidos por possuir atividade antimicrobiana e alguns são classificados como "substâncias reconhecidamente seguras" e, por isso, poderiam ser usadas para prevenir o crescimento bacteriano. Estas substâncias sensibilizam a bicamada fosfolipídica da membrana celular do microrganismo, causando aumento da permeabilidade e perdas dos constituintes intracelulares vitais ou levando a danos nos sistemas enzimáticos deste, ou seja, o mecanismo de ação é o mesmo dos antimicrobianos tradicionais. (SINGH et al., 2002),[16] Different modes of action of volatile oils make up the mechanisms of inhibition of microorganisms. The phenolic compounds present in volatile oils have been known to have antimicrobial activity and some are classified as "known safe substances" and, therefore, could be used to prevent bacterial growth. These substances sensitize the phospholipid bilayer of the microorganism's cell membrane, causing increased permeability and loss of vital intracellular constituents or leading to damage to its enzymatic systems, that is, the mechanism of action is the same as traditional antimicrobials. (SINGH et al., 2002),

[17] Já, seu emprego em formulações requer processos farmacotécnicos visando a proteção do óleo contra as perdas por volatilização e devido à facilidade em sofrer reações de oxidação, redução e rearranjos (BERTOLINI, 1999; SUTILI, 2017).[17] Now, its use in formulations requires pharmacotechnical processes aimed at protecting the oil against losses due to volatilization and due to the facility to undergo oxidation, reduction and rearrangement reactions (BERTOLINI, 1999; SUTILI, 2017).

[18] A microencapsulação de óleos voláteis através da secagem por atomização tem sido objeto de diversos estudos, para estabelecer as melhores condições do processo, a natureza e composição do polímero microencapsulante, e a influência destes na retenção do material ativo (BANG E REINECCIUS, 1990; ROSENBERG et al., 1990; BHANDARI et al., 1992) .[18] The microencapsulation of volatile oils through spray drying has been the subject of several studies to establish the best conditions of the process, the nature and composition of the microencapsulating polymer, and their influence on the retention of the active material (BANG AND REINECCIUS, 1990; ROSENBERG et al., 1990; BHANDARI et al., 1992).

[19] O desenvolvimento de alternativas
terapêuticas na piscicultura tem caráter inovador e proporcionará redução nos prejuízos relacionados à falta de qualidade, além de reduzir o uso indiscriminado de antimicrobianos tradicionais e o impacto ambiental.[19] The development of alternatives
therapies in fish farming have an innovative character and will provide a reduction in losses related to lack of quality, in addition to reducing the indiscriminate use of traditional antimicrobials and the environmental impact.

TECHNICAL STATUS

[20] A literatura já pesquisa a atividade antibacteriana de óleos essenciais, inclusive para o cultivo de peixes.[20] The literature already researches the antibacterial activity of essential oils, including for the cultivation of fish.

[21] ROMERO e colaboradores (2012) abordam o uso de óleos essenciais, componentes naturais de plantas, que são geralmente reconhecidos como substâncias seguras (GRAS). Devido às suas propriedades antimicrobianas, estes óleos podem constituir agentes profiláticos e terapêuticos alternativos na aquicultura.[21] ROMERO and collaborators (2012) address the use of essential oils, natural components of plants, which are generally recognized as safe substances (GRAS). Due to their antimicrobial properties, these oils can constitute alternative prophylactic and therapeutic agents in aquaculture.

[22] Já Okocha e colaboradores (2018) apenas relatam a existência dos óleos essenciais para controle bacteriano, como alternativa aos antibióticos. Ademais o documento aborda o uso correto de antimicrobianos na alimentação da piscicultura, para reduzir resíduos e consequentes efeitos de segurança alimentar.[22] Okocha et al. (2018) only report the existence of essential oils for bacterial control, as an alternative to antibiotics. In addition, the document addresses the correct use of antimicrobials in fish farming to reduce waste and the consequent effects of food security.

[23] Esses documentos são apenas ilustrativos do estado da técnica, e citam informações que são pertinentes com a tecnologia da presente invenção, como a existência do uso de óleos essenciais para tratamento antibacteriano em piscicultura.[23] These documents are only illustrative of the state of the art, and cite information that is relevant to the technology of the present invention, such as the existence of the use of essential oils for antibacterial treatment in fish farming.

[24] Os documentos mais relevantes encontrados são detalhados a seguir.[24] The most relevant documents found are detailed below.

[25] SHEHATA et al., 2013 abordam a investigação da atividade antibacteriana de óleos essenciais com sua
aplicação para a alimentação na piscicultura. Os autores avaliaram apenas a atividade in vitro dos óleos essenciais frente a micro-organismos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Lactococcus lactis e Bacillus cereus), não relacionados diretamente com as principais doenças em peixes, mas sim deterioradores de alimentos.[25] SHEHATA et al., 2013 address the investigation of the antibacterial activity of essential oils with their
application for food in fish farming. The authors evaluated only the in vitro activity of essential oils against microorganisms (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Lactococcus lactis and Bacillus cereus), not directly related to the main diseases in fish, but rather deteriorators of foods.

[26] Os autores utilizaram um ensaio qualitativo para avaliar a atividade antibacteriana dos óleos essenciais in vitro. Sabe-se que este método pode incorrer em problemas de difusão das amostras dependendo do meio de cultura utilizado nos ensaios. Além disso, a doença causada pelas bactérias não foi induzida nos peixes (desafio - inoculação das bactérias nos peixes).[26] The authors used a qualitative assay to assess the antibacterial activity of essential oils in vitro. It is known that this method can cause problems of diffusion of the samples depending on the culture medium used in the tests. In addition, the disease caused by bacteria was not induced in fish (challenge - inoculation of bacteria in fish).

[27] Uma das deficiências do trabalho é que na formulação os autores usaram a técnica de pelletização com o óleo essencial de Tymus, o que pode levar à perda dos compostos presentes no óleo, por degradação ou volatilização. A concentração ótima de óleo de Thymus proposta pelo autor foi de 0,25%.[27] One of the shortcomings of the work is that in the formulation the authors used the pelletizing technique with the essential oil of Tymus, which can lead to the loss of the compounds present in the oil, through degradation or volatilization. The optimal concentration of Thymus oil proposed by the author was 0.25%.

[28] Na presente invenção as atividades antibacterianas foram primeiramente avaliadas in vitro frente aos 3 principais micro-organismos de importância em piscicultura (Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare e Aeromonas hydrophylla), nenhum destes avaliados pelos autores do documento acima.[28] In the present invention, antibacterial activities were first evaluated in vitro against the 3 main microorganisms of importance in fish farming (Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare and Aeromonas hydrophylla), none of which were evaluated by the authors of the above document.

[29] Nos ensaios in vivo da presente invenção, os peixes foram desafiados (foi induzida a doença) com a bactéria Aeromonas hydrophylla, a que apresentou maior resistência aos óleos essenciais nos ensaios in vitro.[29] In the in vivo tests of the present invention, the fish were challenged (the disease was induced) with the bacterium Aeromonas hydrophylla, which showed greater resistance to essential oils in the in vitro tests.

[30] Nos ensaios in vivo os autores apenas avaliaram os efeitos do óleo de Thymus sobre os parâmetros relacionados ao desempenho do animal (ganho de peso e ingestão de ração, enguanto gue na presente invenção os animais foram alimentados com a ração formulada contendo a mistura de óleos essenciais e em seguida a doença foi induzida. Neste caso, não houve diferença entre o tratamento com óleos essenciais e o antibiótico padrão utilizado comumente em piscicultura (o enrofloxacino).[30] In in vivo tests, the authors only evaluated the effects of Thymus oil on the parameters related to the animal's performance (weight gain and feed intake, while in the present invention the animals were fed with the formulated feed containing the mixture of essential oils and then the disease was induced. In this case, there was no difference between treatment with essential oils and the standard antibiotic commonly used in fish farming (enrofloxacin).

[31] Ranjan e colaboradores (2017) aborda a alimentação na piscicultura como a forma de veicular medicamentos e, adicionalmente, explica o uso de antibióticos na alimentação para o controle de infecções por bactérias especificas, como por exemplo Flavobacterium columnare.[31] Ranjan et al. (2017) discusses food in fish farming as a way of delivering medicines and, additionally, explains the use of antibiotics in food to control infections by specific bacteria, such as Flavobacterium columnare.

[32] Este é um trabalho de revisão e estudo da arte do problema de doenças em peixes e do uso de antibióticos. Flavobacterium é uma das 3 principais bactérias que causam doenças em peixes e está entre as 3 bactérias estudadas na presente invenção. Os autores não citam alternativas naturais ao tratamento com antibióticos, nem citam a possibilidade do uso de óleos essenciais em substituição aos antibióticos.[32] This is a review and study of the art of the problem of disease in fish and the use of antibiotics. Flavobacterium is one of the 3 main bacteria that cause disease in fish and is among the 3 bacteria studied in the present invention. The authors do not mention natural alternatives to treatment with antibiotics, nor do they mention the possibility of using essential oils instead of antibiotics.

[33] A presente invenção propõe uma alternativa natural ao uso de compostos sintéticos, sem risco de poluição ambiental, dentre outras vantagens. Na presente invenção um método de recheio de baixo custo, simples e rápido foi desenvolvido para facilitar a veiculação de óleos voláteis na ração comercial destinada a prevenção e tratamento de animais acometidos por bacterioses na piscicultura.[33] The present invention proposes a natural alternative to the use of synthetic compounds, without risk of environmental pollution, among other advantages. In the present invention, a low cost, simple and fast filling method was developed to facilitate the delivery of volatile oils in commercial feed intended for the prevention and treatment of animals affected by bacteriosis in fish farming.

[34] Majolo e colaboradores (2018) abordam o uso de óleos essenciais para o tratamento antibacteriano na piscicultura frente a apenas uma das três bactérias avaliadas na presente invenção. Dentre as plantas utilizadas pelos autores, apenas uma, a Lippia sidoides foi também utilizada na presente invenção. Ainda, apresenta os resultados referentes ao óleo de alecrim pimenta como sendo o melhor do estudo para a finalidade pretendida, que, assim como a presente invenção, é a aplicação na alimentação da piscicultura.[34] Majolo et al. (2018) discuss the use of essential oils for antibacterial treatment in fish farming in view of only one of the three bacteria evaluated in the present invention. Among the plants used by the authors, only one, Lippia sidoides was also used in the present invention. Still, it presents the results referring to rosemary pepper oil as being the best of the study for the intended purpose, which, like the present invention, is the application in fish farming.

[35] A atividade antimicrobiana não foi avaliada in vivo, apenas in vitro, e é sabido que resultados in vitro nem sempre se traduzem in vivo, de modo que os resultados in vivo apresentados aqui não são óbvios. Além disso, não foi proposta uma formulação com incorporação dos óleos essenciais na ração para peixes.[35] Antimicrobial activity has not been evaluated in vivo, only in vitro, and it is known that in vitro results do not always translate in vivo, so the in vivo results presented here are not obvious. In addition, a formulation with the incorporation of essential oils in fish feed has not been proposed.

[36] Gulec e colaboradores (2013) aborda o uso de óleos essências, como o tomilho, no tratamento antibacteriano na piscicultura. Adicionalmente, o artigo conclui que a suplementação dietética com os óleos de ervas utilizados pode aumentar a resistência a doenças.[36] Gulec et al. (2013) discusses the use of essential oils, such as thyme, in antibacterial treatment in fish farming. In addition, the article concludes that dietary supplementation with the herbal oils used can increase resistance to disease.

[37] Assim como nos trabalhos anteriores os autores avaliaram a ação antibacteriana apenas dos óleos de Thymus e funcho e não uma mistura de três óleos como é o caso da presente invenção.[37] As in previous works, the authors evaluated the antibacterial action only of the oils of Thymus and fennel and not a mixture of three oils as is the case with the present invention.

[38] O micro-organismo avaliado pelos autores foi a bactéria Yersinia, que é um patógeno conhecido mais por causar doença transmitida por alimentos em humanos, do que como patógeno em peixes, enquanto na presente invenção foram avaliados os 3 principais micro-organismos de importância em
aquicultura. Outras diferenças incluem o método de obtenção da formulação de Gulec, por pulverização dos óleos essenciais, o que pode incorrer em perdas dos compostos voláteis dos óleos. Além disso, os autores utilizaram uma alta concentração de óleos na ração (10%).[38] The microorganism evaluated by the authors was the bacterium Yersinia, which is a pathogen known more for causing foodborne disease in humans, than as a pathogen in fish, while in the present invention the 3 main microorganisms of importance in
aquaculture. Other differences include the method of obtaining the Gulec formulation, by spraying essential oils, which may incur losses of volatile oil compounds. In addition, the authors used a high concentration of oils in the feed (10%).

[39] Navarrete e colaboradores (2010) aborda o uso de óleos essenciais como suplemento alimentar para o tratamento antibacteriano na piscicultura. O objetivo foi avaliar os efeitos da suplementação da dieta com óleo de Thymus sobre a microbiota intestinal de truta. O autor usou como formulação a técnica de peletização, o que pode levar à perda dos compostos presentes no óleo, por degradação ou volatilização.[39] Navarrete et al. (2010) discusses the use of essential oils as a food supplement for antibacterial treatment in fish farming. The objective was to evaluate the effects of supplementing the diet with Thymus oil on the intestinal trout microbiota. The author used the pelletizing technique as a formulation, which can lead to the loss of compounds present in the oil, due to degradation or volatilization.

[40] Além do exposto acima, apesar da concentração de óleo essencial na formulação ter sido menor do que a utilizada na presente invenção, o autor realizou ensaios in vitro apenas, e contra espécies de bactérias que são probióticas (benéficas para peixes) e não patogênicas, como é o caso das bactérias avaliadas na presente invenção.[40] In addition to the above, although the concentration of essential oil in the formulation was lower than that used in the present invention, the author performed in vitro tests only, and against species of bacteria that are probiotic (beneficial to fish) and not pathogenic, such as the bacteria evaluated in the present invention.

[41] O relatório anual CIRAD de 2008 aborda o uso de óleos essências como alternativa ao uso de antibióticos, devido ao grande número de microrganismos resistentes que têm aparecido por conta do uso indiscriminado de antimicrobianos. Os autores não realizaram ensaios nem de avaliação de atividade de óleos essenciais in vitro e nem ensaios in vivo com peixes. O trabalho aborda a teoria da problemática relacionada ao uso de antibióticos em ração de peixes. As bactérias citadas pelo autor são bactérias comuns na água e podem causar doenças mais em humanos, através do consumo da carne de peixes, do que em peixes. Além disso,
todas diferentes das bactérias por nós avaliadas, que foram as 3 espécies mais importantes como causadoras de doenças em peixes.[41] The 2008 CIRAD annual report addresses the use of essential oils as an alternative to the use of antibiotics, due to the large number of resistant microorganisms that have appeared due to the indiscriminate use of antimicrobials. The authors did not carry out tests or evaluate the activity of essential oils in vitro or in vivo tests with fish. The work addresses the theory of problems related to the use of antibiotics in fish feed. The bacteria mentioned by the author are common bacteria in water and can cause diseases more in humans, through the consumption of fish meat, than in fish. Besides that,
all different from the bacteria we evaluated, which were the 3 most important species that cause disease in fish.

[42] A presente invenção propõe uma formulação para ração de peixes, com plantas diferentes das citadas pelo autor na revisão.[42] The present invention proposes a formulation for fish feed, with plants different from those mentioned by the author in the review.

[43] O documento CN103120251 aborda o uso de óleos essenciais, como por exemplo o de tomilho, como aditivos na alimentação em piscicultura. O aditivo pode promover o crescimento animal, melhorar a eficiência da conversão alimentar e reduzir a incidência de doenças, sendo utilizado de forma segura e possuindo a vantagem de não gerar resistência.[43] The document CN103120251 addresses the use of essential oils, such as thyme, as additives in fish farming. The additive can promote animal growth, improve the efficiency of feed conversion and reduce the incidence of diseases, being used safely and having the advantage of not generating resistance.

[44] Os autores fazem uma emulsão e depois transformam isso em um pó pela adição de farelo de arroz desengordurado. A adição direta dos óleos no tanque não garante homogeneidade, uma vez que os óleos são imiscíveis em água, aumenta a perda por lixiviação dos componentes e a degradação dos óleos essenciais, uma vez que estes são fotodegradáveis. Além disso, o trabalho enfoca não apenas óleos essenciais.[44] The authors make an emulsion and then make it into a powder by adding defatted rice bran. The direct addition of oils to the tank does not guarantee homogeneity, since the oils are immiscible in water, increases the leaching loss of the components and the degradation of essential oils, since they are photodegradable. In addition, the work focuses not only on essential oils.

[45] O documento CN107047975 refere-se a uma formulação, um aditivo de ração e um método de preparação do mesmo. O aditivo alimentar é capaz de inibir bactérias nocivas e promover as probióticas, uma vez que possui o óleo essencial da canela, que apresenta atividade antibacteriana de amplo espectro. A formulação descrita é uma mistura alcoólica dos componentes, que após sua evaporação transforma-se num pó que é utilizado como alimentação. Difere, portanto, da presente invenção, que trata de uma
composição com diferentes óleos essenciais que é incorporada como recheio em uma ração.[45] CN107047975 refers to a formulation, a feed additive and a method of preparing it. The food additive is able to inhibit harmful bacteria and promote probiotics, since it has the essential oil of cinnamon, which has broad spectrum antibacterial activity. The formulation described is an alcoholic mixture of the components, which after its evaporation turns into a powder that is used as food. It therefore differs from the present invention, which deals with a
composition with different essential oils that is incorporated as a filling in a feed.

[46] Sutili e colaboradores (2017) abordam o uso de óleos essenciais como aditivos alimentares de peixes, destacando o potencial como moduladores da comunidade bacteriana intestinal e discutindo alguns aspectos relacionados à sua estabilidade em alimentos. Os autores não realizaram estudos nem in vitro nem in vivo. Em relação a formulações, o autor não cita recheio de óleos essenciais em ração. Ele fala somente de pulverização e mistura física. Eles salientam as dificuldades na formulação com óleos essenciais descrita por outros autores, principalmente enfoca que a pulverização da ração com óleos essenciais, apesar de rápida e prática, produz um material com curta vida de prateleira, o que corrobora com o que já pontuamos acima em relação ao trabalho de outros autores.[46] Sutili et al. (2017) address the use of essential oils as fish food additives, highlighting the potential as modulators of the intestinal bacterial community and discussing some aspects related to their stability in food. The authors did not conduct studies either in vitro or in vivo. Regarding formulations, the author does not mention filling essential oils in feed. He speaks only of spraying and physical mixing. They highlight the difficulties in the formulation with essential oils described by other authors, mainly focusing on the fact that spraying the feed with essential oils, although fast and practical, produces a material with a short shelf life, which corroborates what we have already pointed out above in relation to the work of other authors.

SUMMARY OF THE INVENTION

[47] É um objeto da presente invenção proporcionar uma composição antibacteriana que compreende:

a) de 0,5% a 1,5% p/p de óleos voláteis selecionados de plantas pertencentes ao grupo que compreende Tomilho vermelho, Tomilho, Orégano, Capim limão (Cymbopogon citratus), Pimenta chinesa (May Chang Litsea cubeba), Citronela (Cymbopogon winterianus) , Alecrim Pimenta (Lippia sidoides) e combinações das mesmas; e
b) de 98,5% a 99,5% p/p de um veiculo hidrofóbico.

[47] It is an object of the present invention to provide an antibacterial composition comprising:

a) from 0.5% to 1.5% w / w of volatile oils selected from plants belonging to the group comprising red thyme, thyme, oregano, lemongrass (Cymbopogon citratus), Chinese pepper (May Chang Litsea cubeba), citronella (Cymbopogon winterianus), Alecrim Pimenta (Lippia menosides) and combinations thereof; and
b) from 98.5% to 99.5% w / w of a hydrophobic vehicle.

[48] Em uma realização preferencial, a composição compreende 1,0% p/p de uma mistura de óleos voláteis de orégano, tomilho e tomilho vermelho, e compreende ácido esteárico como veiculo hidrofóbico.[48] In a preferred embodiment, the composition comprises 1.0% w / w of a mixture of volatile oils of oregano, thyme and red thyme, and comprises stearic acid as a hydrophobic vehicle.

[49] Em um objeto adicional da presente invenção proporcionar uma ração para animais compreendendo de 5% a 15% p/p da composição antibacteriana com óleos voláteis.[49] In an additional object of the present invention to provide an animal feed comprising from 5% to 15% w / w of the antibacterial composition with volatile oils.

[50] Em uma realização preferencial, a ração compreende 10% p/p da composição antibacteriana.[50] In a preferred embodiment, the feed comprises 10% w / w of the antibacterial composition.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Pathogenic microorganisms

[51] Para efeitos da presente invenção, entende-se como microrganismos patogênicos as bactérias capazes de causar infecções em peixes, incluindo as infecções oportunistas.[51] For the purposes of the present invention, pathogenic microorganisms are understood to be bacteria capable of causing infections in fish, including opportunistic infections.

[52] Exemplos não limitantes desses microrganismos são Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilla,[52] Non-limiting examples of these microorganisms are Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilla,

Volatile oils with antibacterial activity

[53] Para efeitos da presente invenção, os óleos
voláteis com ação antibacteriana são extraídos de plantas selecionadas do grupo que compreende Tomilho vermelho (TV), Tomilho (T), Orégano (O), Capim limão (Cymbopogon citratus) (CL), Pimenta chinesa (May Chang Litsea cubeba) (PC) , Citronela (Cymbopogon winterianus) (C) e Alecrim Pimenta
(Lippia sidoides) (AP) .[53] For the purposes of the present invention, oils
volatiles with antibacterial action are extracted from plants selected from the group comprising red thyme (TV), thyme (T), oregano (O), lemongrass (Cymbopogon citratus) (CL), Chinese pepper (May Chang Litsea cubeba) (PC) , Citronella (Cymbopogon winterianus) (C) and Alecrim Pimenta
(Lippia sidoides) (AP).

Antibacterial composition

[54] A composição antibacteriana da presente
invenção compreende óleos voláteis com atividade antibacteriana em um veículo hidrofóbico adequado. A concentração dos óleos voláteis na composição antibacteriana varia dentro da faixa que vai de 0,5% a 1,5% p/p,
preferencialmente 1,0% p/p.[54] The antibacterial composition of this
The invention comprises volatile oils with antibacterial activity in a suitable hydrophobic vehicle. The concentration of volatile oils in the antibacterial composition varies within the range of 0.5% to 1.5% w / w,
preferably 1.0% w / w.

[55] O veiculo hidrofóbico pode ser qualquer
composto hidrofóbico conhecido do estado da técnica capaz de permitir a solubilização dos óleos voláteis. De preferência, o veiculo hidrofóbico deve ser liquido a altas temperaturas e sólido após resfriamento, facilitando assim a incorporação dos óleos e o manuseio da composição.[55] The hydrophobic vehicle can be any
hydrophobic compound known in the prior art capable of allowing the solubilization of volatile oils. Preferably, the hydrophobic vehicle should be liquid at high temperatures and solid after cooling, thus facilitating the incorporation of oils and handling the composition.

[56] Exemplos não limitantes desses compostos são ácidos graxos, como ácido esteárico, ceras, como cera de abelha e manteiga de cacau. Preferencialmente, o veiculo hidrofóbico é o ácido esteárico. O veiculo está presente na composição antibacteriana em uma concentração que varia de 98,5% a 99,5% p/p, preferencialmente 99,0 % p/p.[56] Non-limiting examples of these compounds are fatty acids, such as stearic acid, waxes, such as beeswax and cocoa butter. Preferably, the hydrophobic vehicle is stearic acid. The vehicle is present in the antibacterial composition at a concentration ranging from 98.5% to 99.5% w / w, preferably 99.0% w / w.

Feed comprising the antibacterial composition

[57] A ração da presente invenção é uma ração para
peixes em que foi incorporada a composição antibacteriana descrita anteriormente. Em uma realização preferencial a incorporação é feita mediante inserção da composição antibacteriana dentro da ração, como por exemplo por meio de um furo na ração feito previamente. Alternativamente, a incorporação pode ser por absorção da composição
antibacteriana caso ela esteja em uma forma liquida.[57] The feed of the present invention is a feed for
fish in which the antibacterial composition described above has been incorporated. In a preferred embodiment, incorporation is done by inserting the antibacterial composition into the feed, such as through a hole in the feed previously made. Alternatively, the incorporation can be by absorption of the composition
antibacterial if it is in a liquid form.

[58] É importante que a ração compreendendo a composição antibacteriana mantenha as mesmas características que a ração sem o aditivo, como por exemplo a capacidade de flutuar na água.[58] It is important that the feed comprising the antibacterial composition maintains the same characteristics as the feed without the additive, such as the ability to float in water.

[59] A ração da presente invenção compreende de 5% a 15% p/p da composição antibacteriana contendo óleos voláteis, preferencialmente, a ração contém 10% p/p da composição antibacteriana.[59] The feed of the present invention comprises from 5% to 15% w / w of the antibacterial composition containing volatile oils, preferably the feed contains 10% w / w of the antibacterial composition.

EXAMPLES EXAMPLE 1 - EVALUATION OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF VOLATILE OILS FROM MEDICINAL AND AROMATIC PLANTS, IN FRONT OF THE BACTERIA S. agalactiae, F. columnare AND A. hydrophi1a Obtaining volatile oils

[60] As extrações dos óleos voláteis pertencentes à Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas - CPMA - UNICAMP foram realizadas por hidrodestilação em sistema do tipo Clevenger, utilizando material vegetal fresco picado. Ao balão de destilação foram adicionados cerca de 3,5 L de água destilada, volume suficiente para cobrir toda planta. O tempo de extração foi de 3 h, a partir do inicio da destilação e o óleo volátil foi coletado com auxílio de pipeta Pasteur. O óleo volátil obtido foi pesado e acondicionado em frasco âmbar em freezer, até o momento da análise.[60] The extractions of the volatile oils belonging to the Collection of Medicinal and Aromatic Plants - CPMA - UNICAMP were carried out by hydrodistillation in a Clevenger type system, using chopped fresh vegetable material. Approximately 3.5 L of distilled water was added to the distillation flask, enough to cover the entire plant. The extraction time was 3 h from the beginning of the distillation and the volatile oil was collected with the aid of a Pasteur pipette. The volatile oil obtained was weighed and stored in an amber bottle in a freezer until the moment of analysis.

Microorganisms and crop maintenance

[61] Foram utilizadas nesse estudo cepas das bactérias S. agalactiae, A. hydrophila e F. columnare. As cepas provenientes de isolados clínicos provenientes de peixes doentes foram doadas pelo Dr. Flávio Ruas de Moraes, do Departamento de Patologia Veterinária do Centro de Aquicultura da UNESP, Jaboticabal. Também foram estudadas as cepas padrão de A. hydrophila ATTC 7966 e S. agalactiae ATCC 13813, ambas provenientes da Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia André Tosello - Campinas.[61] Strains of the bacteria S. agalactiae, A. hydrophila and F. columnare were used in this study. The strains from clinical isolates from sick fish were donated by Dr. Flávio Ruas de Moraes, from the Department of Veterinary Pathology at the UNESP Aquaculture Center, Jaboticabal. Standard strains of A. hydrophila ATTC 7966 and S. agalactiae ATCC 13813 were also studied, both from the Tropical Research and Technology Foundation André Tosello - Campinas.

[62] As bactérias A. hydrophila (cepa padrão e isolado clinico) e F. columnare (isolado clinico) foram cultivadas em caldo BHI por aerobiose por 24-48 h em estufa bacteriológica a 25°C antes dos ensaios de atividade.[62] The bacteria A. hydrophila (standard strain and clinical isolate) and F. columnare (clinical isolate) were grown in BHI broth by aerobiosis for 24-48 h in a bacteriological oven at 25 ° C before the activity tests.

[63] A bactéria S. agalactiae (padrão e isolado clinico) foi repicada em meio em caldo BHI acrescido de
cloreto de cisteína 0,50%, e cultivada em estufa de CO2 (Sanyo CO2 Incubator) a 20%, e temperatura de 30°C por 48 h, antes dos ensaios de atividade.[63] The bacterium S. agalactiae (standard and clinical isolate) was grown in BHI broth medium plus
cysteine chloride 0.50%, and grown in a greenhouse of CO2 (Sanyo CO2 Incubator) at 20%, and temperature of 30 ° C for 48 h, before the activity tests.

[64] Esses procedimentos também foram realizados para ambas as bactérias, durante a manutenção das culturas. Réplicas dos microrganismos foram armazenados em criotubos com glicerol e mantidos em ultrafreezer a -80°C.[64] These procedures were also performed for both bacteria, during the maintenance of cultures. Replicas of the microorganisms were stored in cryotubes with glycerol and kept in an ultra-freezer at -80 ° C.

Inoculum preparation

[65] O preparo dos inóculos para os testes de determinação da atividade antibacteriana dos óleos voláteis foram realizados segundo as recomendações do protocolo M7-A6 para bactérias (NCCLS, 2003). Células de crescimento recente cultivadas durante 24 h em meio BHI foram transferidas para tubos de ensaio contendo 4,0 mL de solução salina estéril. As soluções de bactérias foram homogeneizadas em vórtex e alíquotas de 2,0 mL foram tomadas para leitura em espectrofotômetro (Shimadzu UV mini 1240) a 625 nm, e ajustadas com solução salina 0,85% para densidade ótica entre 0,08 a 0,10, correspondente à concentração de 1,5 x 108 UFC mL-1. Aos 2,0 mL remanescentes das soluções de bactérias foram adicionadas as mesmas quantidades de solução salina utilizada no ajuste em espectrofotômetro. A partir das soluções padronizadas foram feitas diluições seriadas de forma a se obter, ao final da mesma, a concentração de 1,5 x 106 UFC mL-1. Desta última, 6,0 mL foram transferidos para tubos contendo 3,0 mL de meio de cultura (Caldo BHI), estabelecendo-se uma concentração de 1 x 106 UFC mL-1 ou 1,0 x 105 em 100 μL. A concentração final de células nos compartimentos inoculados das microplacas, foi de 0,5 x 105 UFC.mL-1.[65] The preparation of the inoculants for tests to determine the antibacterial activity of volatile oils were carried out according to the recommendations of the M7-A6 protocol for bacteria (NCCLS, 2003). Fresh growth cells cultured for 24 h in BHI medium were transferred to test tubes containing 4.0 ml of sterile saline. The bacterial solutions were homogenized in a vortex and 2.0 mL aliquots were taken for reading in a spectrophotometer (Shimadzu UV mini 1240) at 625 nm, and adjusted with 0.85% saline for optical density between 0.08 to 0, 10, corresponding to the concentration of 1.5 x 108 CFU mL-1. To the remaining 2.0 mL of the bacterial solutions, the same amounts of saline solution used in the spectrophotometer adjustment were added. Serial dilutions were made from the standardized solutions in order to obtain, at the end of it, a concentration of 1.5 x 106 CFU mL-1. Of the latter, 6.0 mL were transferred to tubes containing 3.0 mL of culture medium (BHI broth), establishing a concentration of 1 x 106 CFU mL-1 or 1.0 x 105 in 100 μL. The final concentration of cells in the inoculated compartments of the microplates was 0.5 x 105 CFU.mL-1.

Determination of Minimum Inhibitory Concentration - CIM

[66] Para os ensaios de microdiluição foram utilizadas microplacas esterilizadas de 96 compartimentos ou orifícios (8 linhas A-H/1-12 colunas). Na primeira coluna foram depositados 50 μL do óleo volátil diluido (controle de esterilidade das amostras). Na segunda coluna foram depositados 50 μL de cada óleo diluído com 150 μL de meio de cultura. A partir da terceira coluna foram inseridos 100 μL da diluição do orifício da coluna anterior com 100 μL de meio de cultura. Esse procedimento se repetiu até a coluna 12, sendo os 100 μL finais desprezados. As concentrações avaliadas foram entre 2000 mg mL-1 e 1,95 μg mL-1. Posteriormente, da coluna 2 a 12 foram adicionados 100 μL do inóculo padronizado, sendo as placas, seladas com para film®. Em seguida, as placas foram incubadas em estufa a 35 °C por 24 h.[66] For microdilution assays, sterile 96-well or well microplates (8 rows A-H / 1-12 columns) were used. In the first column, 50 μL of the diluted volatile oil were deposited (sterility control of the samples). In the second column, 50 μL of each oil diluted with 150 μL of culture medium were deposited. From the third column, 100 μL of the dilution of the orifice of the previous column was inserted with 100 μL of culture medium. This procedure was repeated until column 12, with the final 100 μL being discarded. The concentrations evaluated were between 2000 mg mL-1 and 1.95 μg mL-1. Subsequently, from column 2 to 12, 100 μL of the standardized inoculum were added, and the plates were sealed with film®. Then, the plates were incubated in an oven at 35 ° C for 24 h.

[67] Como controle positivo foram utilizadas somente as bactérias (BHI + inóculo) e como controle negativo o antibiótico penicilina (BHI + penicilina), além do controle de esterilidade do meio BHI.[67] Only positive bacteria were used (BHI + inoculum) and negative antibiotic penicillin (BHI + penicillin), in addition to the sterility control of the BHI medium.

[68] Decorrido o período de incubação foram depositados em todos os poços 50 μL de solução 0,1% de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) e as placas re-incubadas por um período de 3 h. A CIM foi definida como a menor concentração capaz de impedir o aparecimento de coloração vermelha, conferida ao meio quando as células apresentam atividade respiratória (NCCLS, 2003).[68] After the incubation period, 50 μL of 0.1% triphenyl tetrazolium chloride (TTC) solution was deposited in all wells and the plates re-incubated for a period of 3 h. MIC was defined as the lowest concentration capable of preventing the appearance of red staining, conferred to the medium when the cells show respiratory activity (NCCLS, 2003).

Determination of Minimum Bactericidal Concentration - CBM

[69] Após determinação da CIM foram determinadas as CBMs dos óleos voláteis, Alíquotas de 10 μL provenientes
dos poços de CIM e dos poços referentes a três concentrações superiores foram plaqueadas na superfície do meio Nutriente Agar, por espalhamento para A hydrophila e F columnare. Para a bactéria S. agalactiae, o meio foi acrescido de 0,5 % de cisteína. A CBM foi definida como a menor concentração capaz de conferir a morte de 99,9% das bactérias, ou seja, onde nenhum crescimento foi detectado.[69] After determining the MIC, the volatile oil CBMs were determined, 10 μL aliquots from
from the CIM wells and from the wells referring to three higher concentrations, they were plated on the surface of the Nutrient Agar medium, by spreading to A hydrophila and F columnare. For S. agalactiae, the medium was added with 0.5% cysteine. CBM was defined as the lowest concentration capable of conferring the death of 99.9% of the bacteria, that is, where no growth was detected.

Results

[70] Embora os isolados clínicos tenham demonstrado maior resistência aos óleos voláteis, alguns óleos se destacaram no que diz respeito à atividade contra todos os isolados estudados, como é o caso dos óleos de Tomilho e Tomilho vermelho, Capim cidreira, Orégano, Pimenta chinesa, Alecrim Pimenta e Citronela. Se considerarmos tanto a atividade (CIM) , como o espectro de ação, os 7 óleos citados apresentaram alta atividade antibacteriana (até 500 μg.mL-1) contra a maioria das cepas estudadas.[70] Although clinical isolates have shown greater resistance to volatile oils, some oils have stood out with respect to activity against all studied isolates, such as Thyme and Red Thyme, Lemongrass, Oregano, Chinese Pepper oils , Rosemary Pepper and Citronella. If we consider both the activity (MIC) and the spectrum of action, the 7 oils mentioned showed high antibacterial activity (up to 500 μg.mL-1) against most of the studied strains.

[71] Frente aos resultados obtidos nos ensaios de atividade in vitro, foram selecionados somente os óleos de Tomilho, Tomilho vermelho, Orégano, Capim limão, Pimenta chinesa, Alecrim Pimenta e Citronela para as etapas posteriores do trabalho.[71] In view of the results obtained in the in vitro activity tests, only the oils of Thyme, Red Thyme, Oregano, Lemongrass, Chinese Pepper, Rosemary Pepper and Citronella were selected for the later stages of the work.

[72] Escolha das misturas de óleos mais ativas a partir da atividade CIM e CBM encontradas nos ensaios[72] Choice of the most active oil mixtures from the CIM and CBM activity found in the tests

[73] Após determinação da CIM e CBM dos óleos voláteis puros, foram realizadas misturas casuais entre as amostras de melhor atividade (Tabela 1) . Essas misturas também foram submetidas aos ensaios de CIM e MBC
Tabela 1: Óleos voláteis mais ativos utilizados no
planejamento experimental de misturas. A soma da
concentração máxima de óleo volátil na mistura foi de 1,0 mg mL-1. Tomilho vermelho (TV), Tomilho (T) , Orégano (O), Capim limão (CL), Pimenta chinesa (PC), Citronela (C) e Alecrim Pimenta (AP).

[73] After determining the MIC and CBM of the pure volatile oils, random mixtures were performed between the samples with the best activity (Table 1). These mixtures were also subjected to CIM and MBC tests
Table 1: Most active volatile oils used in
experimental mix planning. The sum of
maximum concentration of volatile oil in the mixture was 1.0 mg mL-1. Red thyme (TV), Thyme (T), Oregano (O), Lemongrass (CL), Chinese pepper (PC), Citronella (C) and Rosemary pepper (AP).

Preliminary test of antibacterial activity of mixtures of the most active volatile oils

[74] Frente aos resultados obtidos nos ensaios de atividade in vitro, foram selecionados somente os óleos citados anteriormente para as etapas seguintes do trabalho. As misturas dos óleos que apresentaram melhores respostas antibacterianas foram realizadas de forma aleatória.[74] In view of the results obtained in the in vitro activity tests, only the oils mentioned above were selected for the following stages of the work. Mixtures of oils that showed better antibacterial responses were performed at random.

[75] Os resultados de MIC e MBC obtidos para as misturas dos óleos voláteis frente às bactérias de importância no cenário aquícola mostram que todas as 28 misturas de óleos voláteis estudados nesta etapa do trabalho foram ativos para F. columnare, sendo esta a bactéria mais susceptível (CIM 15,62 μg mL-1 - 2000 pg mL-1) , enquanto as menos susceptíveis foram os isolados clínicos de S. agalactiae (CIM 500 μg mL-1 - 2000 μg mL-1) . As amostras 23 e 27 apresentaram melhores resultados de atividade frente a A. hydrophila, S. agalactiae e F. columnare, e foram selecionados para as etapas seguintes do trabalho.[75] The MIC and MBC results obtained for mixtures of volatile oils against bacteria of importance in the aquaculture scenario show that all 28 mixtures of volatile oils studied in this stage of the work were active for F. columnare, which is the most common bacterium. susceptible (MIC 15.62 μg mL-1 - 2000 pg mL-1), while the least susceptible were the clinical isolates of S. agalactiae (MIC 500 μg mL-1 - 2000 μg mL-1). Samples 23 and 27 showed better results of activity against A. hydrophila, S. agalactiae and F. columnare, and were selected for the next stages of the work.

[76] A partir da escolha das duas misturas (23 e 27) foi empregado um planejamento experimental de misturas, no intuito de escolher dentre as duas melhores misturas obtidas nos ensaios preliminares, aquela que apresentava as melhores respostas para o ensaio de atividade antibacteriana. As variáveis selecionadas foram os diferentes óleos essenciais presentes em cada uma das misturas: Orégano (O),
Capim-limão (CL), Pimenta Chinesa (PC), Alecrim Pimenta (AP) referente a mistura 23 e Alecrim Pimenta (AP), Citronela (C), Tomilho (T), Tomilho Vermelho (TV) referente a mistura 27. A resposta avaliada no planejamento experimental foi a Atividade Antimicrobiana - CIM e CBM (mg mL-1) . As Tabelas 2 e 3 apresentam as condições experimentais de cada ensaio, representadas pelas variáveis codificadas.
Tabela 2 - Variáveis relacionadas a mistura contendo óleo volátil de Orégano (O) , Capim-limão (CL), Pimenta Chinesa (PC), Alecrim Pimenta (AP) - Mistura 23

Tabela 3: Variáveis relacionados a mistura contendo óleo volátil de Alecrim Pimenta (AP), Citronela (C), Tomilho (T), Tomilho Vermelho (TV) - Mistura 27[76] From the choice of the two mixtures (23 and 27), an experimental mix design was employed, in order to choose among the two best mixtures obtained in the preliminary tests, the one that presented the best responses for the antibacterial activity test. The selected variables were the different essential oils present in each of the mixtures: Oregano (O),
Lemongrass (CL), Chinese Pepper (PC), Rosemary Pepper (AP) for mixture 23 and Rosemary Pepper (AP), Citronella (C), Thyme (T), Red Thyme (TV) for mixture 27. A The response evaluated in the experimental design was Antimicrobial Activity - MIC and CBM (mg mL-1). Tables 2 and 3 show the experimental conditions of each test, represented by the coded variables.
Table 2 - Variables related to the mixture containing volatile oil of Oregano (O), Lemongrass (CL), Chinese Pepper (PC), Rosemary Pepper (AP) - Mixture 23

Table 3: Variables related to the mixture containing volatile oil of Rosemary Pepper (AP), Citronella (C), Thyme (T), Red Thyme (TV) - Mixture 27

Aeromonas hydrophila ATCC 7966 is clinical isolate

[77] Os resultados de atividade antimicrobiana frente a cepa padrão de A. hydrophila estão apresentadas na Tabela 4 para a mistura de óleo identificada como 23, e na Tabela 5 para a mistura de óleo identificada como 27.[77] The results of antimicrobial activity against the standard strain of A. hydrophila are shown in Table 4 for the oil mixture identified as 23, and in Table 5 for the oil mixture identified as 27.

[78] Através dos resultados da Tabela 4 é possível observar que houve melhor resposta no ensaio 14, cuja composição abrangia os óleos de capim limão, pimenta chinesa e alecrim pimenta (1/3), com efetiva atividade antibacteriana na concentração de 25 mg/mL de cada óleo. Os demais ensaios envolvendo a mistura 23 apresentaram valores elevados de CIM.

[78] Through the results of Table 4, it can be seen that there was a better response in trial 14, whose composition included oils of lemon grass, Chinese pepper and rosemary pepper (1/3), with effective antibacterial activity at a concentration of 25 mg / mL of each oil. The other tests involving mixture 23 showed high MIC values.

[79] A Tabela 5 mostra que a melhor resposta ocorreu no ensaio 12, de composição contendo os óleos de alecrim pimenta, citronela e tomilho vermelho (1/3), sendo a atividade antibacteriana mais efetiva na concentração de
0,125 mg mL-1 de cada óleo.[79] Table 5 shows that the best response occurred in test 12, of composition containing the oils of rosemary pepper, citronella and red thyme (1/3), being the most effective antibacterial activity in the concentration of
0.125 mg mL-1 of each oil.

[80] As atividades antimicrobianas frente ao isolado clinico de A. hydrophila estão apresentadas nas Tabelas 6 para a mistura de óleo identificada como 23, e na Tabela 7 para a mistura de óleo identificada como 27.[80] The antimicrobial activities against the clinical isolate of A. hydrophila are shown in Tables 6 for the oil mixture identified as 23, and in Table 7 for the oil mixture identified as 27.

[81] Pelos resultados apresentados na Tabela 6 é possível observar resposta efetiva nos ensaios 11 a 19, onde foram encontradas atividades de até 1,0 mg mL-1. Os demais ensaios do planejamento não apresentaram atividade significativa frente as cepas de isolados clínicos.[81] From the results presented in Table 6, it is possible to observe an effective response in tests 11 to 19, where activities of up to 1.0 mg mL-1 were found. The other planning trials did not show significant activity against strains of clinical isolates.

[82] Os dados apresentados na Tabela 7 confirmam a resistência do isolado clinico de A. hydrophila frente às misturas de óleos voláteis, tendo sido observado valor de CIM de 0,5 mg mL-1 nos ensaios 13 a 18. Em relação à CBM, apenas no ensaio 13 o CBM foi de 1,0 mg mL-1. Nos demais ensaios os valores de CBM foram superiores a 1,0 mg mL-1.[82] The data presented in Table 7 confirm the resistance of the clinical isolate of A. hydrophila against volatile oil mixtures, with a MIC value of 0.5 mg mL-1 being observed in trials 13 to 18. In relation to CBM , only in trial 13 the CBM was 1.0 mg mL-1. In the other tests, CBM values were higher than 1.0 mg mL-1.

[83] Nos demais ensaios do planejamento de misturas não foi observada atividade frente aos isolados clínicos.
Tabela 4: Atividade antimicrobiana da Mistura 23
frente à cepa padrão da bactéria A. hydrophila

Tabela 5: Atividade antimicrobiana da Mistura 27 frente à cepa padrão da bactéria A. hydrophila

Tabela 6: Atividade antimicrobiana da Mistura 23
frente ao isolado clinico da bactéria A. hydrophila.

Tabela 7: Atividade antimicrobian da Mistura 27 frente ao isolado clinico da bactéria A. hydrophila.

[83] In the other mix design trials, no activity was observed against clinical isolates.
Table 4: Antimicrobial activity of Mixture 23
against the standard strain of the bacterium A. hydrophila

Table 5: Antimicrobial activity of Mixture 27 against the standard strain of the bacterium A. hydrophila

Table 6: Antimicrobial activity of Mixture 23
against the clinical isolate of the bacterium A. hydrophila.

Table 7: Antimicrobial activity of Mixture 27 against the clinical isolate of the bacterium A. hydrophila.

Flavobacterium columnare isolated clinic

[84] As atividades antimicrobianas frente ao
isolado clinico de F. columnare estão apresentadas na Tabela
8 para a mistura de óleo identificada como 23, e na Tabela
9 para a mistura de óleo identificada como 27.[84] Antimicrobial activities against the
clinical isolate of F. columnare are shown in Table
8 for the oil mixture identified as 23, and in Table
9 for the oil mixture identified as 27.

[85] Pelos resultados apresentados na Tabela 8 observa-se uma resposta efetiva nos ensaios 13 e 14, todos apresentando atividade antimicrobiana de 0,125 mg mL-1, tanto para CIM quanto para CBM. Os demais ensaios do planejamento também apresentaram atividade significativa frente as cepas advindas de isolados clínicos para CIM, porém com valores superiores para CBM.[85] Based on the results presented in Table 8, an effective response is observed in trials 13 and 14, all showing antimicrobial activity of 0.125 mg mL-1, for both MIC and CBM. The other planning trials also showed significant activity against strains from clinical isolates for MIC, but with higher values for CBM.

[86] Nos resultados apresentados na Tabela 9 observa-se uma resposta efetiva no ensaio 14, todos apresentando atividade onde pode-se observar atividade antimicrobiana de 0,015 mg.mL-1 tanto para CIM quanto para CBM. Os demais ensaios do plane j amento também apresentaram atividade significativa frente as cepas advindas de isolados clínicos, porém com valores superiores tanto para CIM quanto CBM.
Tabela 8: Atividade antimicrobiana da Mistura 23
frente ao isolado clinico da bactéria F. columnare.

Tabela 9: Resultado do planejamento experimental da Mistura 27 frente às cepas advindas de isolados clínicos da bactéria F. columnare.

[86] In the results presented in Table 9, an effective response is observed in trial 14, all showing activity where one can observe antimicrobial activity of 0.015 mg.mL-1 for both MIC and CBM. The other planning trials also showed significant activity against strains from clinical isolates, but with higher values for both MIC and CBM.
Table 8: Antimicrobial activity of Mixture 23
against the clinical isolate of the bacterium F. columnare.

Table 9: Result of the experimental planning of Mistura 27 against strains from clinical isolates of F. columnare bacteria.

Streptococcus agalactiae ATCC 13813

[87] As atividades antimicrobianas frente à cepa padrão de S. agalactiae estão apresentadas na Tabela 10 para a mistura de óleos identificada como 23, e na Tabela 11 para a mistura de óleos identificada como 27.[87] Antimicrobial activities against the standard strain of S. agalactiae are shown in Table 10 for the oil mixture identified as 23, and in Table 11 for the oil mixture identified as 27.

[88] Através dos resultados apresentados na Tabela 10 observa-se uma resposta efetiva do ensaio 15 ao 19, referentes ao ponto central do planejamento experimental, onde a atividade antimicrobiana foi de 0,25 mg mL_1, tanto para a CIM quanto para a CBM.[88] Through the results presented in Table 10, an effective response from assay 15 to 19 is observed, referring to the central point of the experimental design, where the antimicrobial activity was 0.25 mg mL_1, both for CIM and CBM .

Streptococcus agalactiae isolated clinic

[89] As atividades antimicrobianas frente ao isolado clinico de S. agalactiae estão apresentadas na Tabela
12 para a mistura de óleo identificada como 23, e na Tabela
13 para a mistura de óleo identificada como 27. Os resultados
de atividade da mistura 23 mostram que houve uma resposta efetiva nos ensaios 11 ao 19, onde é possível observar atividade antimicrobiana de 0,5 mg mL-1 tanto para CIM quanto para CBM.[89] Antimicrobial activities against the clinical isolate of S. agalactiae are shown in Table
12 for the oil mixture identified as 23, and in Table
13 for the oil mixture identified as 27. The results
activity of mixture 23 show that there was an effective response in tests 11 to 19, where it is possible to observe antimicrobial activity of 0.5 mg mL-1 for both MIC and CBM.

[90] Em relação ao ensaio 27 - Tabela 13 houve uma resposta efetiva dos ensaios 12 ao 18, cuja atividade antimicrobiana foi de 0,5 mg mL-1 tanto para CIM quanto para CBM.[90] In relation to trial 27 - Table 13, there was an effective response from trials 12 to 18, whose antimicrobial activity was 0.5 mg mL-1 for both MIC and CBM.

[91] De acordo com os resultados de CIM e CBM obtidos para os óleos voláteis frente a A. hidrophylla, F. columnare e S. agalactiae, bactérias de importância no cenário aquicola, a atividade antibacteriana foi observada para a maioria das misturas estudadas. Porém, assim como nos ensaios de triagem dos óleos essenciais, a atividade dos óleos diferiu consideravelmente em função da espécie de bactéria avaliada, principalmente quando comparadas as cepas padrão com os isolados clínicos. Através dos resultados nota-se ainda que nem todas as combinações foram ativas para as bactérias na faixa de concentração estudada, fato que demonstra diferenças nas susceptibilidades das cepas avaliadas, e confirmando a importância de estudos abrangendo diferentes isolados clinicos de uma mesma espécie.[91] According to the results of MIC and CBM obtained for volatile oils against A. hidrophylla, F. columnare and S. agalactiae, bacteria of importance in the aquaculture scenario, antibacterial activity was observed for most of the studied mixtures. However, as in the screening tests for essential oils, the activity of the oils differed considerably according to the species of bacteria evaluated, especially when comparing standard strains with clinical isolates. Through the results it is also noted that not all combinations were active for the bacteria in the studied concentration range, a fact that demonstrates differences in the susceptibilities of the strains evaluated, and confirming the importance of studies covering different clinical isolates of the same species.

[92] Embora os isolados clínicos tenham demonstrado maior resistência aos óleos voláteis, algumas combinações desses óleos se destacaram no que diz respeito à atividade contra todos os isolados estudados, como é o caso da mistura dos óleos de tomilho, tomilho vermelho e alecrim pimenta (atividade de até 1,0 mg mL-1) contra a maioria das cepas estudadas, incluindo os isolados clínicos de Aeromonas hydrophila, que apresentaram maior resistência a todos os tratamentos.
Tabela 10: Atividade antimicrobiana da Mistura 23
frente à cepa padrão da bactéria S. agalactiae.

Tabela 11: Atividade antimicrobiana da Mistura 27
frente à cepa padrão da bactéria S. agalactiae

Tabela 12: Atividade antimicrobiana da Mistura 23
frente ao isolado clinico da bactéria S. agalactiae

Tabela 13: Atividade antimicrobiana da Mistura 27
frente ao isolado clinico da bactéria S. agalactiae.

[92] Although clinical isolates have shown greater resistance to volatile oils, some combinations of these oils stood out with respect to activity against all studied isolates, such as the mixture of thyme, red thyme and pepper rosemary oils ( activity of up to 1.0 mg mL-1) against most strains studied, including clinical isolates of Aeromonas hydrophila, which showed greater resistance to all treatments.
Table 10: Antimicrobial activity of Mixture 23
against the standard strain of S. agalactiae bacteria.

Table 11: Antimicrobial activity of Mixture 27
against the standard strain of S. agalactiae bacteria

Table 12: Antimicrobial activity of Mixture 23
against the clinical isolate of S. agalactiae bacteria

Table 13: Antimicrobial activity of Mixture 27
against the clinical isolate of the bacterium S. agalactiae.

[93] Em função dos resultados encontrados no planejamento experimental e nos ensaios de atividade in vitro, foi selecionada a mistura 27 - ensaio 13 (óleos essenciais de tomilho, tomilho vermelho e alecrim pimenta) , para preparo da formulação da ração a ser utilizada nos ensaios in vivo.[93] Depending on the results found in the experimental planning and in vitro activity tests, the mixture 27 - test 13 (essential oils of thyme, red thyme and pepper rosemary) was selected to prepare the formulation of the feed to be used in in vivo assays.

EXAMPLE 2 - DEVELOPMENT OF VOLATILE OIL-BASED FEED Sample of commercial feed

[94] Ração comercial da marca Pirá Ideal tilápia (Campinas, Brasil) foi utilizada nos ensaios de revestimento com o antimicrobiano Enrofloxacino ou com recheio contendo uma blenda de óleos voláteis.[94] Commercial feed of the Pirá Ideal brand tilápia (Campinas, Brazil) was used in the coating tests with the antimicrobial Enrofloxacino or with a filling containing a blend of volatile oils.

[95] A ração é extrusada, segundo o seu fabricante, apresenta dentre os componentes de sua formulação, 8% de umidade, 32% de proteína bruta, 6,5% de extrato etéreo, 10% de matéria mineral, 1,2% de Cálcio e 0,6% de Fósforo. Tem diâmetro na faixa entre 4 a 6 mm, sendo ideal para a ingestão de 1% do peso corpóreo[95] The feed is extruded, according to its manufacturer, it presents among the components of its formulation, 8% moisture, 32% crude protein, 6.5% ether extract, 10% mineral matter, 1.2% Calcium and 0.6% Phosphorus. It has a diameter in the range between 4 to 6 mm, making it ideal for ingesting 1% of body weight

[96] Para veicular os componentes ativos, foi realizado furo central nas rações com furadeira de mão da marca Mondial. Após recheio com óleo volátil ou revestimento com Enrofloxacina, as rações foram porcionadas em 100 g, acondicionadas em sacos de polipropileno e armazenadas sob temperatura de - 20°C até o momento dos ensaios.[96] To convey the active components, a central hole was drilled in the rations with a Mondial hand drill. After filling with volatile oil or coating with Enrofloxacin, the rations were portioned in 100 g, packed in polypropylene bags and stored at - 20 ° C until the time of the tests.

Coating solution for feed medicated with enrofloxacin (ENR)

[97] A solução de revestimento foi preparada com 120 mg de ENR gentilmente cedido pela Desvet (Desvet medicamentos veterinários) com pureza superior a 98%, e dissolvida em 21 mL de solução de ácido acético glacial 1% (70:30).[97] The coating solution was prepared with 120 mg of ENR, kindly provided by Desvet (Desvet veterinary medicines) with purity greater than 98%, and dissolved in 21 mL of 1% glacial acetic acid solution (70:30).

[98] Após solubilização do ENR foi adicionado o polimero polivinilpirrolidona (PVP) na concentração final de 2% e, por fim, acrescidas de 9, 0 mL de álcool etílico absoluto. Essa mistura de solventes permitiu a solubilização do ENR na água acidificada, auxiliando o processo de secagem. A concentração
de ENR foi estabelecida considerando 20% de possíveis perdas durante o processo de revestimento (REZENDE, 2012).[98] After the solubilization of the ENR, the polyvinylpyrrolidone polymer (PVP) was added at a final concentration of 2% and, finally, added with 9.0 ml of absolute ethyl alcohol. This mixture of solvents allowed the solubilization of ENR in acidified water, helping the drying process. The concentration
ENR was established considering 20% of possible losses during the coating process (REZENDE, 2012).

[99] O volume de solvente utilizado para a incorporação do fármaco na ração (com ou sem o polímero de revestimento) foi mantido em 30 mL para todos os ensaios, nos quais foram utilizados 100 g de ração.[99] The volume of solvent used for incorporating the drug in the feed (with or without the coating polymer) was maintained at 30 mL for all tests, in which 100 g of feed was used.

[100] Solução de recheio para ração medicada com as blendas de óleos voláteis.[100] Filling solution for feed medicated with volatile oil blends.

[101] A solução de recheio foi preparada com 0,12 g de ácido esteárico e 1,2 mg da blenda de óleos voláteis (tomilho, tomilho vermelho e alecrim pimenta) para cada 1 g de ração previamente perfurada. Levou-se em consideração a ingestão de ração equivalente a 1% do peso corpóreo.[101] The filling solution was prepared with 0.12 g of stearic acid and 1.2 mg of the blend of volatile oils (thyme, red thyme and pepper rosemary) for each 1 g of feed previously perforated. Feed intake equivalent to 1% of body weight was taken into account.

[102] Após fusão do ácido esteárico a 65°C, a blenda contendo os óleos de melhor atividade (tomilho, tomilho vermelho e alecrim pimenta) foi incorporada à mistura. A concentração final da mistura de óleos foi estipulada considerando 20% de possíveis perdas durante o processo de recheio. Esse valor foi estabelecido segundo resultados encontrados nos ensaios in vitro de concentração inibitória minima (CUM) e concentração bactericida minima (CBM), frente ao microrganismo mais resistente,[102] After melting the stearic acid at 65 ° C, the blend containing the oils with the best activity (thyme, red thyme and pepper rosemary) was incorporated into the mixture. The final concentration of the oil mixture was stipulated considering 20% of possible losses during the filling process. This value was established according to results found in the in vitro assays of minimum inhibitory concentration (CUM) and minimum bactericidal concentration (CBM), against the most resistant microorganism,

[103] Para a realização dos estudos de eficácia in vivo, a quantidade de óleo volátil precisa ser conhecida, assim como a quantidade de enrofloxacino a ser administrada[103] For in vivo efficacy studies, the amount of volatile oil needs to be known, as well as the amount of enrofloxacin to be administered

Preparation of coating of feed medicated with enrofloxacin

[104] Baseando-se nas técnicas de revestimento magistral e de acordo com os trabalhos de Rezende (2012), foi utilizado o método de aspersão para a produção das rações
revestidas com medicamento enrofloxacino (ALLEN, 2002; USP PHARMACISTS PHARMACOPEIA, 2005).[104] Based on the techniques of masterful coating and according to the works of Rezende (2012), the spraying method was used for the production of feed
coated with enrofloxacin (ALLEN, 2002; USP PHARMACISTS PHARMACOPEIA, 2005).

[105] Durante o procedimento de aspersão empregado no revestimento da ração, utilizou-se uma betoneira de bancada Mobilgear modelo Mobil 636, operando com rotação de 800 rpm.[105] During the spraying procedure used in the feed coating, a Mobilgear model 636 mobile mixer was used, operating at 800 rpm.

[106] A aspersão da solução de revestimento foi realizada com o pulverizador manual com gatilho de jato regulável e capacidade de 450 mL da marca Vonder em vazão constante até o final da aplicação. Concomitantemente, o solvente foi volatilizado com ar aquecido a 50°C, utilizando
o secador da marca TANY.[106] The spraying of the coating solution was carried out with the manual spray with adjustable jet trigger and 450 mL capacity of the Vonder brand at constant flow until the end of the application. Concomitantly, the solvent was volatilized with air heated to 50 ° C, using
the TANY brand dryer.

[107] A temperatura de secagem deve ser branda, concomitante a pulverização, porém suficiente para permitir a evaporação da solução hidroalcoólica sem degradar o fármaco. Diante do exposto, estabeleceu-se o tempo de 2 min para pulverização, rotação do equipamento de 80 rpm e temperatura máxima de secagem de 50°C, durante 10 min[107] The drying temperature must be mild, concomitant with spraying, but sufficient to allow the evaporation of the hydroalcoholic solution without degrading the drug. In view of the above, the time for spraying was set at 2 min, equipment rotation at 80 rpm and maximum drying temperature of 50 ° C, for 10 min.

Preparation of feed medicated with the blend of volatile oils

[108] Ainda quente, a solução fundida de ácido esteárico mais a blenda de óleos foi injetada manualmente nas rações e armazenadas sob refrigeração até o momento dos ensaios in vivo. A solução de recheio foi preparada com 0,12 g de ácido esteárico e 1,2 mg da blenda de óleos para cada
1 g de ração previamente perfurada. Levou-se em consideração a ingestão de ração equivalente a 1% do peso corpóreo. Após fusão do ácido esteárico em 65°C, a blenda contendo os óleos de melhor atividade foi incorporada na mistura.[108] Still hot, the molten solution of stearic acid plus the blend of oils was manually injected into the feed and stored under refrigeration until the time of in vivo testing. The filling solution was prepared with 0.12 g of stearic acid and 1.2 mg of the blend of oils for each
1 g of feed previously perforated. Feed intake equivalent to 1% of body weight was taken into account. After melting the stearic acid at 65 ° C, the blend containing the oils with the best activity was incorporated into the mixture.

[109] O polímero fundido e acrescido da mistura de óleos voláteis foi adicionado ao furo, ainda quente numa temperatura controlada de até 50°C. As rações foram
preparadas com a blenda de óleos voláteis de acordo com a quantidade ingerida por animal, considerando o consumo de 1% de ração em relação a seu peso corpóreo/dia.[109] The polymer melted and added to the mixture of volatile oils was added to the hole, still hot at a controlled temperature of up to 50 ° C. The rations were
prepared with the blend of volatile oils according to the amount ingested per animal, considering the consumption of 1% of feed in relation to their body weight / day.

[110] Após a inserção do recheio no interior da ração, aguardou-se o completo endurecimento do ácido esteárico antes do armazenamento em freezer -20 °C[110] After inserting the stuffing inside the feed, the complete hardening of the stearic acid was awaited before storage in a freezer -20 ° C

[111] Testes prévios durante o preparo do recheio, garantiram a flutuabilidade da ração, fator preponderante para alimentos que seriam fornecidos durante o período de confinamento dos animais presentes em sistemas aquáticos (REZENDE, 2012) .[111] Previous tests during the preparation of the filling, guaranteed the buoyancy of the feed, a preponderant factor for food that would be provided during the confinement period of the animals present in aquatic systems (REZENDE, 2012).

[112] Os óleos voláteis utilizados nesta etapa do trabalho, após incorporação no ácido esteárico, foram submetidos a headspace seguida de análise cromatográfica (CGEM) , a fim de se identificar e quantificar os seus constituintes. Os compostos identificados nos respectivos óleos voláteis mais ativos estão apresentados na Tabela 14.
Tabela 14: índice de Retenção (IR) e Porcentagem Relativa dos compostos majoritários presentes nas amostras de óleos voláteis que apresentaram melhor atividade frente às bactérias estudadas. Tomilho (T), Tomilho vermelho (TV) e Alecrim Pimenta (AP) na presença de ácido esteárico.

[112] The volatile oils used in this stage of the work, after incorporation in stearic acid, were submitted to headspace followed by chromatographic analysis (CGEM), in order to identify and quantify its constituents. The compounds identified in the respective most active volatile oils are shown in Table 14.
Table 14: Retention Index (IR) and Relative Percentage of the major compounds present in the samples of volatile oils that showed better activity against the studied bacteria. Thyme (T), Red Thyme (TV) and Alecrim Pimenta (AP) in the presence of stearic acid.

[113] As análises químicas demostraram que os compostos majoritários presentes na blenda de óleos se mantiveram após o processo de preparo do recheio da ração, mesmo depois de submetidas a temperaturas de até 50°C durante o período de preparo. Esse resultado demonstra que a concentração estipulada da blenda de óleos voláteis presente no recheio irá permanecer no alimento desde o momento de sua inserção na ração, durante o período de armazenamento adequado até o momento de administração aos animais[113] Chemical analyzes showed that the major compounds present in the oil blend remained after the process of preparing the feed stuffing, even after being subjected to temperatures of up to 50 ° C during the preparation period. This result demonstrates that the stipulated concentration of the blend of volatile oils present in the filling will remain in the food from the moment of its insertion in the feed, during the appropriate storage period until the moment of administration to the animals.

EXAMPLE 3 - BACTERIAL CHALLENGE WITH Aircraft
hydrophlla AFTER ADMINISTRATION OF FEED FILLED WITH MIXTURE OF VOLATILE OILS WITH ANTIMICROBIAL ACTIVITY Experimental animals

[114] Juvenis machos de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) com peso inicial de aproximadamente llg, provenientes da mesma desova foram doados pela piscicultura Polettini - Mogi Mirim, SP. Assim que chegaram no local do ensaio, foram acondicionados, por 30 dias em caixas d'água de polietileno, com fluxo continuo de água e aeração continua para aclimatação em condições laboratoriais. Neste período os peixes foram alimentados 2 vezes ao dia, com ração comercial extrusada até a aparente saciedade.[114] Male juveniles from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) with an initial weight of approximately 11 g, originating from the same spawning were donated by Polettini - Mogi Mirim, SP. As soon as they arrived at the test site, they were packed, for 30 days, in polyethylene water tanks, with continuous water flow and continuous aeration for acclimatization under laboratory conditions. During this period the fish were fed 2 times a day, with commercial feed extruded until the apparent satiety.

Sample of commercial feed

[115] Ração comercial da marca Pirá Ideal Tilápia (Campinas, Brasil) foi utilizada durante todo o período de aclimatação dos animais e nos ensaios in vivo. Essa ração comercial que foi utilizada nos ensaios, tanto nos ensaios controle, quanto para veicular a ENR a blenda de óleos voláteis, é extrusada, o que facilita a flutuabilidade e a disponibilidade aos animais.[115] Commercial feed of the Pirá Ideal Tilápia brand (Campinas, Brazil) was used throughout the animals' acclimatization period and in in vivo tests. This commercial feed that was used in the tests, both in the control tests, and to convey the blend of volatile oils, is extruded, which facilitates buoyancy and availability to animals.

[116] As rações destinadas ao desafio na presença de medicamento sintético, foram revestidas com o antimicrobiano enrofloxacino, conforme descrito por REZENDE (2012) na concentração de 1,2 mg de ENR por g de ração. Foi empregado o enrofloxacino gentilmente cedido pela Desvet (Desvet medicamentos veterinários) com pureza superior a 98%[116] The diets intended for the challenge in the presence of synthetic medication, were coated with the antimicrobial enrofloxacin, as described by REZENDE (2012) in the concentration of 1.2 mg of ENR per g of feed. The enrofloxacin kindly provided by Desvet (Desvet veterinary medicines) with purity greater than 98% was used

[117] As rações destinadas ao desafio com a blenda de óleo volátil foram produzidas conforme Exemplo 2[117] The rations destined for the challenge with the volatile oil blend were produced according to Example 2

[118] Após recheio com as blendas ou revestimento com ENR, s rações forma porcionadas em 100 g, acondicionadas em sacos de polipropileno e armazenadas a - 20°C.[118] After filling with blends or coating with ENR, the rations were portioned in 100 g, packed in polypropylene bags and stored at - 20 ° C.

Studies

[119] Os experimentos foram divididos em duas fases: Fase I que representa a fase de ingestão das rações durante o período que antecede a inoculação bacteriana e a Fase II que representa o período após o desafio com a bactéria A. hydrophila.[119] The experiments were divided into two phases: Phase I, which represents the feed intake phase during the period preceding bacterial inoculation, and Phase II, which represents the period after the challenge with the bacterium A. hydrophila.

[120] Fase I - Após o período de aclimatação, 168
peixes foram anestesiados com benzocaína (100 mg L-1) , pesados individualmente (11,57 ± 0,23 g) e distribuídos
aleatoriamente em 12 aquários (200 L) com sistema de água individual (4 L min -1 por aquário) incluindo controle individual de válvula, filtro físico e biológico,
temperatura controlada digitalmente, resistência elétrica (5.000 W) e aeração suplementar (746 W). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com três grupos experimentais: Grupo Controle (dieta livre de
antimicrobiano), Grupo OV (dieta comercial acrescida com a blenda de óleos voláteis) e Grupo ENR (dieta comercial
acrescida com o antimicrobiano ENR) quatro repetições (12 peixes por repetição / unidade experimental). Os peixes foram alimentados manualmente ad libitum às 8h, 11h, 13h, e 16:30h, durante 20 dias.[120] Phase I - After the acclimatization period, 168
fish were anesthetized with benzocaine (100 mg L-1), weighed individually (11.57 ± 0.23 g) and distributed
randomly in 12 aquariums (200 L) with individual water system (4 L min -1 per aquarium) including individual valve control, physical and biological filter,
digitally controlled temperature, electrical resistance (5,000 W) and supplementary aeration (746 W). The experimental design was completely randomized, with three experimental groups: Control Group (diet free of
antimicrobial), OV Group (commercial diet added with the blend of volatile oils) and ENR Group (commercial diet
plus with the antimicrobial ENR) four repetitions (12 fish per repetition / experimental unit). The fish were manually fed ad libitum at 8:00 am, 11:00 am, 1:00 pm, and 4:30 pm, for 20 days.

[121] Três peixes por unidade experimental (total de 36 peixes) foram utilizados para coleta de sangue e abatidos para coleta de fígado. As amostras foram analisadas quanto aos parâmetros hematológicos e bioquímicos e analisados para designar sua condição antes do inicio da Fase II. Os peixes que foram coletados não retornaram às unidades experimentais.[121] Three fish per experimental unit (total of 36 fish) were used for blood collection and slaughtered for liver collection. The samples were analyzed for hematological and biochemical parameters and analyzed to designate their condition before the start of Phase II. The fish that were collected did not return to the experimental units.

[122] Fase II - Todos os peixes remanescentes da Fase I foram desafiados com a inoculação de Aeromonas hydrophila durante 24 horas e a alimentação dos grupos foi retirada totalmente durante este período. Após o período, três peixes por unidade experimental foram submetidos à indução anestésica com eugenol (100 mg L_1) para coleta de sangue e fígado para designação de sua condição após o desafio bacteriano. Cada unidade experimental foi cuidadosamente cronometrada.[122] Phase II - All remaining fish from Phase I were challenged with the inoculation of Aeromonas hydrophila for 24 hours and the groups' food was removed entirely during this period. After the period, three fish per experimental unit were submitted to anesthetic induction with eugenol (100 mg L_1) to collect blood and liver to designate their condition after the bacterial challenge. Each experimental unit was carefully timed.

[123] Os peixes remanescentes desafiados da Fase II foram observados durante 15 dias para verificar a taxa de sobrevivência (%). Durante esse período, os animais de todos os grupos experimentais receberam a dieta controle[123] The remaining fish challenged from Phase II were observed for 15 days to check the survival rate (%). During this period, animals from all experimental groups received the control diet

Inoculum preparation

[124] A cepa Aeromonas hydrophila proveniente de isolado clinico foi mantida em meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI) com glicerol a 30% (estéril), a - 80°C. Uma alíquota de 20 pL (cepa) foi inoculada em 5 mL de meio BHI estéril e incubada em incubadora bacteriológica à 28°C por
24 h. Após este período, 700 mL de meio BHI estéril foram adicionados e incubados novamente seguindo o mesmo procedimento citado anteriormente. A suspensão bacteriana foi centrifugada a 12.000 rpm durante 20 min, e o sobrenadante descartado. Em seguida foi utilizado tampão PBS (0,01 M) para lavar os sedimentos duas vezes e centrifugado a 12.000 rpm durante 20 min. No final, a suspensão com 1 ×
106 UFC mL-1 foi ajustada de acordo com a escala nefelométricas de McFarland Standard e lida em espectrofotômetro (Spectronic Genesys 5, Milton Roy Company, PA, EUA) (DO 600 = 0,845), usando tampão PBS (0,01 M) . A suspensão bacteriana foi previamente foi empregada para permitir a estimulação do sistema imunológico dos peixes, sem a intenção de causar nos animais.[124] The Aeromonas hydrophila strain from clinical isolate was maintained in Brain Heart Infusion (BHI) culture medium with 30% glycerol (sterile), at - 80 ° C. A 20 pL aliquot (strain) was inoculated into 5 mL of sterile BHI medium and incubated in a bacteriological incubator at 28 ° C for
24 h. After this period, 700 mL of sterile BHI medium was added and incubated again following the same procedure mentioned above. The bacterial suspension was centrifuged at 12,000 rpm for 20 min, and the supernatant was discarded. Then PBS buffer (0.01 M) was used to wash the pellets twice and centrifuged at 12,000 rpm for 20 min. In the end, the 1 × suspension
106 UFC mL-1 was adjusted according to the McFarland Standard nephelometric scale and read in a spectrophotometer (Spectronic Genesys 5, Milton Roy Company, PA, USA) (DO 600 = 0.845), using PBS buffer (0.01 M). The bacterial suspension was previously used to allow the stimulation of the fish's immune system, without the intention of causing the animals.

[125] Na Fase II, todos os peixes remanescentes da Fase I foram desafiados com a inoculação da bactéria A. hydrophila durante 24 horas e a alimentação. Durante este período, a alimentação de ambos os tratamentos foi retirada por completo. Logo após, três peixes por unidade experimental foram submetidos à indução anestésica com eugenol (100 mg L-1) para coleta de sangue e fígado para designação de sua condição após o desafio bacteriano. Cada unidade experimental foi cuidadosamente cronometrada.[125] In Phase II, all remaining fish from Phase I were challenged with inoculation of the bacterium A. hydrophila for 24 hours and feeding. During this period, the feed for both treatments was completely removed. Soon after, three fish per experimental unit were submitted to anesthetic induction with eugenol (100 mg L-1) to collect blood and liver to designate their condition after the bacterial challenge. Each experimental unit was carefully timed.

[126] Os peixes remanescentes do desafio da Fase II foram observados durante 15 dias para avaliar a taxa de sobrevivência (%). Durante esse período, os animais de todos os grupos experimentais receberam a dieta controle. A qualidade da água e a limpeza do tanque permaneceram controladas até o final do experimento.[126] Fish remaining from the Phase II challenge were observed for 15 days to assess survival rate (%). During this period, animals from all experimental groups received the control diet. The quality of the water and the cleaning of the tank remained controlled until the end of the experiment.

[127] Ao final do período experimental, os peixes
foram capturados com o auxilio de puçás e colocados em baldes com água e anestesiados com benzocaina (65 mg L-1) e submetidos à eutanásia.[127] At the end of the trial period, the fish
were captured with the aid of puçás and placed in buckets of water and anesthetized with benzocaine (65 mg L-1) and subjected to euthanasia.

Survival rate after 15 days of challenge against A. hydrophila

[128] Os animais que se alimentaram somente com ração controle e OV durante os ensaios in vivo por 15 dias após a inoculação com A. hydrophila apresentaram taxa de sobrevivência (%) de 87,5± 1,20 e 96,43± 1,27 respectivamente. Já os animais que se alimentaram com ENR não apresentaram morte natural durante o período. Navarrete et al. (2011) descreveu a ausência de efeito sobre a sobrevivência em juvenis de truta (Oncorhynchus mykiss) alimentados com dietas contendo variadas concentrações de óleo volátil de tomilho (Thymus vulgaris) e Zheng et al. (2009) descreveu a sobrevivência de diferentes espécies de juvenis de bagre (Ictalurus punctatus) alimentados com dietas adicionadas de óleo volátil de orégano. Shalaby et al. (2006) relataram elevada sobrevida para alevinos de tilápia do nilo criados numa densidade de 200 alevinos/m3 e alimentados com dietas contendo diferentes níveis de extrato de alho.[128] Animals that fed only control and OV rations during in vivo tests for 15 days after inoculation with A. hydrophila had a survival rate (%) of 87.5 ± 1.20 and 96.43 ± 1 , 27 respectively. The animals that were fed with ENR did not present natural death during the period. Navarrete et al. (2011) described the lack of effect on survival in juvenile trout (Oncorhynchus mykiss) fed diets containing varying concentrations of volatile thyme oil (Thymus vulgaris) and Zheng et al. (2009) described the survival of different species of juvenile catfish (Ictalurus punctatus) fed diets with volatile oregano oil. Shalaby et al. (2006) reported a high survival rate for Nile tilapia fingerlings reared at a density of 200 fingerlings / m3 and fed diets containing different levels of garlic extract.

[129] De acordo com os resultados encontrados, a sobrevivência dos animais durante o experimento não foi relacionada com os niveis de OV administrados durante a fase I (p>0,05). As condições experimentais e a densidade dos animais provavelmente propiciaram uma condição de baixo estresse, não interferindo na sobrevida dos animais presentes nos grupos. Os resultados apresentados nesta etapa do trabalho também evidenciam que os níveis de OV e ENR administrados aos animais não apresentam toxicidade,
sugerindo segurança durante a utilização destes produtos.[129] According to the results found, the animals' survival during the experiment was not related to the levels of OV administered during phase I (p> 0.05). The experimental conditions and the density of the animals probably provided a condition of low stress, not interfering in the survival of the animals present in the groups. The results presented in this stage of the work also show that the levels of OV and ENR administered to the animals do not present toxicity,
suggesting safety when using these products.

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Claims

Antibacterial composition characterized by
understand:

The. from 0.5% to 1.5% w / w of volatile oils selected from plants belonging to the group comprising red thyme, thyme, oregano, lemongrass (Cymbopogon citratus), Chinese pepper (May Chang Litsea cubeba), citronella (Cymbopogon winterianus), Alecrim Pimenta (Lippia menosides) and combinations thereof; and
B. from 98.5% to 99.5% w / w of a hydrophobic vehicle.

Antibacterial composition according to claim 1, characterized by the volatile oils being red thyme, thyme and oregano.

Antibacterial composition according to either of Claims 1 or 2, characterized in that it comprises 1.0% w / w of the mixture of volatile oils.

Antibacterial composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the hydrophobic vehicle is stearic acid.

Feed characterized by comprising from 5% to 15% w / w of the antibacterial composition defined in claims 1 to 4.

Feed according to claim 5, characterized in that it comprises 10% w / w of the antibacterial composition defined in claims 1 to 4.

Use of the feed as defined in any of claims 5 and 6, characterized by the fact that it is for aquaculture, especially fish farming.