BR102017017042A2 - Processo para modificação de bactérias, vetor para modificar célula de bactérias, uso de bactérias - Google Patents

Abstract

processo para modificação de bactérias, vetor para modificar célula de bactérias, uso de bactérias a presente invenção objetiva prover processo para modificação genética de bactérias do gênero clostridium não patogênicas, preferencialmente bactérias do gênero clostridium produtores de álcool, que em seguida, serão usadas para produção de álcoois a partir de fermentação de biomassa em que as referidas bactérias são modificadas geneticamente através da deleção dos genes pta e buk e da inserção do gene sadh.

Description

PROCESSO PARA MODIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS, VETOR PARA MODIFICAR CÉLULA DE BACTÉRIAS, USO DE BACTÉRIAS

Campo da invenção [001] A presente invenção refere-se a um processo para modificação genética de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas, preferencialmente bactérias do gênero Clostridium produtores de álcool. A partir do processo da presente invenção, é possível a realização de processos de bioconversão de biomassa em álcoois, com maior rendimento, através do uso de uma cepa de Clostridium acetobutylicum modificada geneticamente. O processo da presente invenção, através da engenharia metabólica em bactérias não patogênicas, mais preferencialmente em Clostridium acetobutylicum, é concebido pela deleção de certos genes (pta e buk) e adição de outro (sadH) , de modo que o resultado final é o maior rendimento de produtos alcoólicos de fermentação do referido microorganismo, uma vez que substitui a acetona produzida pela via metabólica natural por isopropanol, gerando, assim, maior produção de álcoois IBE (isopropanol-butanol-etanol) para aplicação em processos de bioconversão na indústria em geral.

Antecedentes da invenção [002] Nas últimas décadas, a demanda pela geração de novas formas de energia, principalmente energias mais limpas e oriundas de substratos não fósseis, aumentou consideravelmente, estabelecendo novas prioridades no desenvolvimento tecnológico de processos biofermentativos.

[003] As chamadas fontes alternativas de energia, aí incluída a biomassa, têm sido objeto de diversos estudos e

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2/24 pesquisas. Ainda que existam vários tipos de processos para a transformação da biomassa em energia, aqueles que envolvem a biotecnologia se mostram muito atraentes por suas características de sustentabilidade.

[004] Processos biotecnológicos se utilizam do metabolismo de micro-organismos vivos, e por isso, apresentam também alguns desafios para sua adequação ao ambiente de produção industrial.

[005] Na realidade, o metabolismo dos micro-organismos produz determinados produtos, por exemplo, solventes, como resultado de processos fermentativos de biomassa. No entanto, é de conhecimento do estado da técnica a existência de obstáculos metabólicos que impedem a produção sob condições reais de um ambiente industrial, como a baixa tolerância dos micro-organismos às elevadas concentrações, tanto de matériaprima (substrato, biomassa) quanto de produto (solventes). De fato, muitos solventes orgânicos possuem características agressivas à natureza da célula microbiana que, em condições naturais, são sensíveis ao ataque destes compostos.

[006] Por isso, as ferramentas da engenharia genética se mostram essenciais para adaptar e adequar processos que ocorrem naturalmente às demandas de rendimento e produtividade da indústria, através da construção de micro-organismos metabolicamente adaptados e melhorados.

[007] A produção de álcoois via processos biotecnológicos é uma das mais estudadas, e acontece via um processo fermentativo bacteriano conhecido como ABE, onde o gênero bacteriano Clostridium é utilizado para produção de acetona,

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3/24 butanol e etanol. Outra característica desse micro-organismo é que apresenta capacidade de utilizar substratos variados, desde simples monossacarídeos até os polissacarídeos complexos.

[008] A acetona é um produto que apresenta dificuldade de ser removida do processo de fermentação, além de indesejável como biocombustível, pois é corrosiva e reduz o rendimento de butanol por unidade de massa de substrato utilizado. Observase também que esse processo ABE ainda não apresenta ótimos níveis de produtividade por conta de limitações metabólicas apresentadas pelo micro-organismo do gênero bacteriano Clostridium.

[009] Especialmente em relação ao Clostridium acetobutylicum, muito utilizado para produção de butanol, cabe ressaltar que a sua engenharia metabólica também apresenta determinadas dificuldades, uma vez que essa bactéria possui um sistema de restrição baseado em uma endonuclease que oliva o DNA transformante não protegido e, com isso, a inserção de novos genes para melhoria do desempenho metabólico é comprometida.

[0010] Portanto, a metilação de DNA exógeno é um prérequisito para a transformação genética de Clostridium acetobutylicum, já que esta bactéria possui o referido sistema de restrição em seu metabolismo que é baseado na endonuclease Cac824I, enzima que oliva o DNA transformante não-protegido (L.D. Mermelstein, N.E. Welker, G.N. Bennett, & E.T. Papoutsakis, Bio/Technology 10:190-195, 1992). Esta é, portanto, uma grande limitação para a transformação genética deste micro-organismo.

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4/24 [0011] Foi identificado no genoma do bacteriófago Φ3Τ que infecta B. subtilis, um gene, denominado Φ3ΤΙ, que codifica para uma metilase (a saber, a metiltransferase Φ3ΤΙ-ΜΤΡ) que

protege sequências	de	DNA	contra	a ação endonucleásica	da
enzima Cac824I. 0	gene	Φ3ΤΙ	foi,	então, clonado em vetor	de
Escherichia coli	para	que	sua	expressão nesse organismo

pudesse proteger qualquer DNA a ser usado em transformação de C. acetobutylicum. O plasmídeo pANl, por exemplo, foi construído para metilar DNA in vivo por meio da ação da metilase Φ3ΤΙ-ΜΤΡ cujo gene foi clonado no mesmo (L.D. Mermelstein & E.T. Papoutsakis, Appl. Environ. Microbiol. 59:1077-1081, 1993). Este vetor, que é derivado do pACYC184, possui um tamanho de aproximadamente 7.0 kb sendo 2,7 kb referentes ao gene Φ3ΤΙ. A principal desvantagem desse vetor é que o mesmo requer que o plasmídeo a ser metilado possua uma origem de replicação diferente do pACYC184 para que ambos sejam compatíveis na mesma célula, o que limita o seu uso.

[0012] Outra abordagem encontrada na literatura é a deleção do gene cacl502 que codifica para a enzima de restrição Cac824I (Croux et al. Biotechnol Biofuels 9:23, 2016). Neste caso, a cepa resultante é capaz de receber qualquer tipo de material exógeno não-metilado, mas as pesquisas ficaram limitadas somente à cepa originalmente deletada para o gene cacl502.

[0013] Em geral, a construção dos vetores se baseia na técnica Alellic-Coupled Exchange, que utiliza sequências homólogas para mediar os eventos de integração. Ainda, todos os plasmídeos para transformação de C. acetobutylicum precisam necessariamente ser amplificados em cepa de E. coli que

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5/24 produza a enzima φ3ΤΙ-ΜΤΡ, a fim de proteger o DNA contra digestão pela enzima Cac824I.

[0014] Assim, muitos estudos têm sido realizados no sentindo de criar e/ou melhorar ferramentas da biologia molecular e da engenharia genética para ultrapassar essas limitações naturais do referido micro-organismo e, assim, aumentar a produtividade e o rendimento do processo fermentativo para produção de álcoois.

[0015] O documento US 8,765,446, por exemplo, discorre sobre modificações em um micro-organismo do gênero Clostridium para aumentar a produtividade de álcoois, uma das modificações sendo a incorporação de um gene que codifica a enzima álcool desidrogenase secundária (sadH) , de preferência de Clostridium beijerincki. Além disso, o micro-organismo pode ser um mutante de Clostridium sem o gene pta (codifica a enzima fosfotransacetilase) ou sem o gene buk (codifica a enzima butirato quinase) . No entanto, o referido documento não prevê a introdução de um gene para transformar a acetona em isopropanol e, ainda, pelo contrário, utiliza um operon para superexpressar genes que levam à produção de acetona.

[0016] Portanto, mostra-se premente o desenvolvimento de um processo para produção melhorada de álcoois via fermentação através de micro-organismos, especialmente do gênero Clostridium não patogênicas, preferencialmente produtoras de álcoois, geneticamente modificadas de forma a aumentar a produtividade do referido processo, pela deleção de certos genes (pta e buk) e adição de outro (sadH).

Sumário da invenção

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6/24 [0017] A presente invenção objetiva prover processo para modificação genética de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas, preferencialmente bactérias do gênero Clostridium produtores de álcool, que em seguida, serão usadas para produção de álcoois a partir de fermentação de biomassa em que as referidas bactérias são modificadas geneticamente através da deleção dos genes pta e buk e da inserção do gene sadH.

[0018] O processo aqui descrito envolve, portanto, modificações genéticas em uma cepa de C. acetobutylicum para o aumento da produção de álcoois por meio da construção de vetores de deleção dos genes associados à formação de ácidos (pta e buk), o que aumenta significativamente a concentração final dos produtos de interesse devido ao redirecionamento do fluxo de carbono no sentido da produção destes solventes. Além disso, também há a construção de um vetor para a expressão do gene sadH, que codifica a enzima álcool desidrogenase secundária, de Clostridium beijerincki, a fim de possibilitar a conversão da acetona produzida em isopropanol, gerando então a mistura de álcoois IBE (iso-propanol, butanol e etanol) desej ada.

[0019] Uma primeira concretização da presente invenção diz respeito a um processo para modificação genética de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas, preferencialmente através da modificação genética de uma cepa de C. acetobutylicum compreendendo as seguintes etapas:

a) sintetizar quimicamente o gene φ3ΤΙ que codifica a metiltransferase do fago φ3Τ de B. subtilis;

b) clonar o gene φ3ΤΤ em vetor para transformação de E. coli;

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c) construir vetores para modificação do C. acetobutylicum;

d) produzir vetores metilados resistentes à enzima Cac284;

e) deletar os genes pta e buk de C. acetobutylicum;

f) sintetizar quimicamente o gene sadH de C. beijerincki;

g) construir vetor para expressão do gene sadH e transformar C. acetobutylicum deletado para os genes pta e buk;

h) selecionar clones produtores dos álcoois butanol, etanol e isopropanol.

[0020] Uma segunda concretização da invenção refere-se aos vetores construídos para modificação genética das bactérias do gênero Clostridium não patogênicas de acordo com o processo da invenção.

[0021] Em outra concretização, é revelado o uso do microorganismo, preferencialmente da bactéria do gênero Clostridium modificada geneticamente pela deleção dos genes pta e buk e ainda, a expressão do gene sadH, em processos de bioconversão de biomassa em álcoois

Breve Descrição das Figuras [0022] Figura 1 - apresenta esquema simplificado das vias metabólicas do gênero Clostridium.

[0023] Figura 2 - apresenta o esquema simplificado das vias metabólicas do gênero Clostridium, porém com as representações das modificações genéticas conforme descritas na presente invenção.

[0024] Figura 3 - Sequência da região do o gene que codifica a metiltransferase φ3ΤΙ-ΜΤΡ no fago φ3Τ de B. subtilis.

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[0025]

Figura 4 - Mapa da sequência do gene otimizado ç3TIm.

A região em laranja corresponde ao promotor lacl, em preto a região codante do gene cp3TIm, e em verde o terminador rrnB.

[0026]	Figura 5 - Tradução predita do gene tp3TIm.
[0027]	Figura 6 - Sequência do gene sadH. As regiões em
laranj a	correspondem, respectivamente, ao promotor e o

terminador do gene constitutivo fdx; em preto a região codante do gene sadH.

[0028]

Figura 7 - Mapa da Sequência do gene sadH. As regiões

em laranja correspondem, respectivamente, ao promotor e o terminador do gene constitutivo fdx; em preto a região codante do gene sadH.

[0029]	Figura 8 - Tradução predita do gene sadH.
[0030]	Figura 9 - Sequência do fragmento do gene pta em rosa
(300 pb)	e em vinho a sequência do gene askA (1200pb).
[0031]	Figura 10 - Mapa da sequência do fragmento do gene

pta em rosa (300 pb) e em vinho a sequência do gene askA

(1200pb)	•
[0032]	Figura 11 - Sequência dos genes utilizados para
técnica	ACE de interrupção do gene buk. Em lilás, fragmento
do gene	buk (300 pb) , em verde a sequência do gene ptb (906

pb), em amarelo fragmento do gene cac3077 (300 pb).

[0033]

Figura 12 - Mapa da sequência dos genes utilizados

para técnica ACE de interrupção do gene buk.

[0034]	Figura 13 - Mapa físico do plasmídeo pACYC-cp3TIm.
[0035]	Figuras 14 - Gel de agarose com as amostras digeridas

pelas enzimas.

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9/24 [0036] Figura 15 - Vetor de integração ACE - pMTL-mazF-pta. ORI - origem de replicação, askA - acetato quinase, ptafosfotransacetilase, repL - proteína de replicação, bgaRP promotor e regulador da β-galactosidase, mazF - interferase e catP - resistência a tianfenicol.

[0037] Figura 16 - Vetor de integração ACE pMTL-mazF-buk. ORI - origem de replicação, buk - butirato quinase, ptb fosfotransbutirilase, cac3077 - gene putativo, repL - proteína de replicação, bgaRP - promotor e regulador da βgalactosidase, mazF - interferase e catP - resistência a tianfenicol.

[0038] Figura 17 - Gel de agarose para confirmação da digestão do pMTL-mazF-pta.

[0039] Figura 18 - Transformação de C. acetobutylicum com pMTL-mazF-pta (A) . Controle negativo (B) , células que foram submetidas a eletroporação sem o plasmídeo e semeadas em meio com antibiótico tianfenicol.

Descrição detalhada da invenção [0040] A presente invenção se refere a um processo para modificação genética de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas, preferencialmente bactérias do gênero Clostridium produtores de álcool, que em seguida, serão usadas para produção de álcoois a partir de fermentação de biomassa em que as referidas bactérias são modificadas geneticamente através da deleção dos genes pta e buk e da inserção do gene sadH.

[0041] Os inventores verificaram que pelo processo aqui descrito, é possível a criação de uma linhagem de E. coli que

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10/24 tem a capacidade de metilar plasmideos que serão utilizados para a engenharia genética de Clostridium acetobutylicum.

[0042] A construção de um vetor com tamanho reduzido e contendo uma versão do gene Φ3ΤΙ com códons otimizados para expressão em E. coli e sob regulação de novas sequências regulatórias é nova e inventiva.

[0043] Os vetores da presente invenção são caracterizados por compreender as moléculas de ácido nucleico conforme definidas nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0044] O processo da presente invenção compreende, as seguintes etapas:

a) sintetizar quimicamente o gene da metiltransferase do fago φ3Τ de B. subtilis Φ3ΤΙιη, em que o gene sintético corresponde a uma sequência de DNA conforme SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2;

b) expressar o gene Φ3ΤΙιη em E. coli através do plasmídeo contendo o gene Φ3Τίιη conforme definido na SEQ ID NO: 2, juntamente com o DNA utilizado em C. acetobutylicum, em meio de cultivo;

c) construir vetores para modificação do C. acetobutylicum;

d) produzir vetores metilados resistentes à enzima Cac284, através de molécula de DNA transformante conforme SEQ ID NO:1 em meio de cultivo;

e) deletar os genes pta e buk, conforme respectivamente as SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO:6 de C. acetobutylicum;

f) sintetizar quimicamente o gene sadH conforme definido nas SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 de C. beijerincki,

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g) construir vetor para expressão do gene sadH e transformar C. acetobutylicum através dos vetores construídos;

h) selecionar clones produtores de butanol, etanol e isopropanol.

[0045] O processo da presente invenção compreende, mais preferencialmente, sintetizar quimicamente o gene da metiltransferase do fago φ3Τ de B. subtilis; o gene sintético é chamado de Φ3Τίζη e corresponde a uma sequência de DNA correspondente à região codante do gene Φ3ΤΤ, conforme definido na SEQ ID NO:1 que codifica a metiltransferase Φ3ΤΙMTP, conforme SEQ ID NO: 2 com otimização de códons para E. coli e sob o controle do promotor do gene lacl e da sequência terminadora da transcrição do gene rrnB, ambos de E. coli. Em seguida, expressar o gene $3TIm em E. coli; o plasmídeo contendo o gene $3TIm será, então, transformado no microorganismo referido acima, juntamente com o DNA que será utilizado em C. acetobutylicum, utilizando para tal meio Luria-Bertani (LB) , em que o meio LB possui pH que varia na faixa entre 6,5 e 8,0, molécula de DNA transformante (SEQ ID NO:1) em quantidade que varia entre 100 ng e 300 ng, antibióticos para seleção, preferencialmente os antibióticos sendo tetraciclina e ampicilina; e incubação em estufa com temperatura variando entre 30 °C e 37 °C, por um período que varia entre 24 a 48 horas; construir vetores para modificação do C. acetobutylicum, em que foram usados para a referida construção os seguintes genes: colEl e repL, catP e bla, e ainda, compreendem fragmentos dos genes pta ou buk, bgaRP e mazF e ask ou ptb, em que colEl e repL como origens de replicação, catP e bla como antibióticos, fragmentos dos

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12/24 genes pta ou buk, bgaRP e mazF como contrasseleção e ask ou ptb para integração; produzir vetores metilados resistentes à enzima Cac284 em que a cepa de E. coli contendo o plasmideo pACYC-ç3TIm é co-transformada com os vetores pMTL-mazF-pta, que compreende a molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 5 ou pMTL-mazF-buk, que compreende a molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 6, em que o meio LB utilizado tem pH que varia na faixa entre 6,5 e 8,0; em que o DNA transformante (conforme SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6) é utilizado em quantidade que varia entre 100 ng e 300 ng, em que antibióticos para seleção, preferencialmente tetraciclina e ampicilina, são utilizados; e em que a incubação em estufa ocorre a uma temperatura que varia entre 30 °C e 37 °C, por um periodo que varia entre 24 a 48 horas; posteriormente, os vetores metilados foram purificados utilizando Kit de Wizard Plus SV Miniuprep DNA Purification System (Promega) e incubados com a enzima Fnu4HI. Sendo o resultado visualizado em gel de agarose 0,8% - 1%. Em seguida, o processo compreende deletar os genes pta e buk de C. acetobutylicum, em que as deleções são realizadas com base na dupla recombinação homóloga, pela inserção de vetores contendo cópias de 1200pb do gene subsequente ao gene que se quer interromper (pta ou buk, conforme SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente) e selecionando por antibióticos ou moléculas tóxicas os microorganismos mutados. Após essa etapa, sintetizar o gene sadH de C. beijerincki em que o gene sintético corresponde a uma sequência de DNA correspondente à região codante do gene da álcool desidrogenase secundária (sadH) , que compreende a molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 3 sob ação de

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13/24 um promotor constitutivo (Pfdx) de C. acetobutylicum; construir vetor para expressão do gene sadH, que compreende a molécula de ácido nucleico conforme SEQ ID NO: 3, que codifica a proteína conforme definida na SEQ ID NO:4 e transformar C. acetobutylicum. Foram usados para a construção dos vetores os seguintes genes: colEl e repL como origens de replicação, erm e bla como antibióticos e o gene sadH flanqueado por 800 pb da sequência do gene pyrE, para posteriores testes de integração; selecionar clones produtores de butanol, etanol e isopropanol. A seleção dos clones foi realizada a partir de teste de fermentação e medição dos produtos gerados neste processo em HPLC.

[0046] Resultados são mostrados em mais detalhes nos exemplos abaixo.

[0047] A presente invenção provê, então, o desenvolvimento de micro-organismos, preferencialmente aqueles do gênero Clostridium não patogênicos, mais preferencialmente aqueles produtores de álcoois, geneticamente melhorados, e capazes de produzir solventes sob condições otimizadas para fermentação de biomassa com o objetivo de produzir álcoois.

[0048] Na presente invenção, um plasmídeo para clostrídios foi metilado de forma inventiva, eficiente e melhorada, pela metilase codificada pelo plasmídeo pACYC-(p3TIm, pois o mesmo foi usado com sucesso para transformar Clostridium acetobutylicum. Um plasmídeo controle sem o tratamento com a metilase não propiciou o crescimento de clones transformantes.

Exemplos

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14/24 [0049] Os exemplos a seguir vão melhor ilustrar a presente invenção e as condições e parâmetros particulares descritos representam concretizações preferidas, mas não limitantes da presente invenção.

Exemplo 1: Cultivo de micro-organismos [0050] As bactérias utilizadas nesse trabalho foram: Escherichia coli cepas DH5a e DH10B, e Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824. Entre os meios utilizados para o cultivo, estão: Luria-Bertani (LB) [extrato de levedura 0,5%, peptona 1% e NaCI 1%; com pH 7,2 (BERTANI, 1951)]; NM [solução

de sais M9	lOx	1%, glicose	2%, adenina-HCl 5	mM	, solução	de
aminoácidos	3%,	MgSCM 10 mM,	tiamina	10%, ZnSO4	10	mM, CaCl2	100
mM, uracila	20	mM, histidina 0.1%	(SEREBRIISKII,	I. G. ,	AND

JOUNG, 2002)] os sais foram utilizados a partir de soluçõesestoque 1 M, previamente filtradas em membrana de 0,22 pm; BHI (Brain Heart Infusion Broth - Sigma-Aldrich), RCM (reinforced clostridial médium - BD) ; CGM [KH2PO4 5,5 mM; K2HPO4 4 mM; MgSO₄-H₂O 3 mM; MnSO₄‘H₂O 0,6 M; FeSO₄ -7H₂O 0,6 M; NaCI 0,2 M; asparagina 0,15 M; extrato de levedura 0,5%; (NH4)2SO4, 0,15 M e glicose 0,5% (WIESENBORN; RUDOLPH; PAPOUTSAKIS, 1989)].

[0051] As etapas de clonagem foram realizadas em E. coli DH5a. O cultivo das bactérias foi feito a 37 °C. No caso de crescimento em meio líquido, a agitação utilizada foi de 200 rpm. Para os micro-organismos anaeróbicos, os meios foram reduzidos em nitrogênio e a incubação mantida em câmara de anaerobiose (Forma 1025/1029 Anaerobic Chamber - Thermo Scientific) com a seguinte atmosfera: 85% de nitrogênio, 5% de hidrogênio e 10% de dióxido de carbono.

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Exemplo 2: Preparação de células bacterianas competentes [0052] E. coli DH5a e DH10B foram semeadas em placa de meio LB ágar a partir de estoque armazenado a -80 °C e incubada a 37°C por 16 h. Uma colônia isolada foi inoculada em 10 mL de meio SOB em frasco Erlenmeyer de 125 mL e incubada a 37 °C por 16 h, com agitação de 200 rpm. Um mililitro desse pré-inóculo foi adicionado a 100 mL de meio SOB fresco, incubando a 37 °C até atingir uma ODôoo de 0,3.

[0053] Após atingir a ODôoo desejada, a cultura foi então resfriada por 15 min em banho de gelo e as células foram centrifugadas a 3000 x g por 5 min a 4 °C. O sedimento de células foi ressuspendido em 32 mL de tampão de transformação I e incubado no gelo por mais 15 min. Foi feita uma nova centrifugação, nas mesmas condições, e as células foram ressuspendidas em 4 mL de tampão de transformação II. O conteúdo foi dividido em alíquotas de 100 pL e armazenado a 80 °C (SAMBROOK J, 2001).

Exemplo 3: Transformação bacteriana - choque térmico [0054] Uma alíquota de células competentes foi retirada do armazenamento a -80 °C e descongelada em gelo. Foram adicionados 10 pL do sistema de ligação às células e foi feita a incubação em gelo por 30 min. O choque térmico foi feito a 42 °C por 90 s, seguido de 2 min em gelo. Em seguida, foi adicionado 1 mL de meio LB e o sistema foi incubado a 37 °C por 1 h. As células transformadas foram semeadas em meio LB ágar contendo antibiótico (100 pg/mL ampicilina ou 5 pg/mL tetraciclina).

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Exemplo 4: Preparação de DNA plasmidial em pequena escala (miniprep):

[0055] A extração de DNA plasmidial de E. coli foi feita de acordo com o protocolo descrito por Sambrook e colaboradores (2001), com adaptações. Uma colônia isolada da placa de transformantes foi inoculada em 5 mL de meio LB com o antibiótico adequado e este foi incubado a 37 °C por 16 h sob agitação. As células de 3 mL de cultura foram coletadas por centrifugação a 10000 x g por 2 min e o precipitado foi ressuspendido em 200 pL de solução I. Foram adicionados 360 pL de solução II (recém-preparada) para provocar a lise das células, e a amostra foi incubada a temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente foram adicionados 300 pL de solução III gelada e a mistura foi incubada por 5 min em gelo. A amostra foi centrifugada a 10000 x g por 5 min e o sobrenadante foi transferido para outro tubo, centrifugando novamente caso o sobrenadante não estivesse límpido. O sobrenadante foi adicionado a 750 pL de isopropanol 100%, homogeneizado por inversão e centrifugado a 10000 x g por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 200 pL de solução I.

[0056] Foram adicionados 110 pL de acetato de amônio 7,5 M e a amostra foi homogeneizada em agitador do tipo vortex. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 10000 x g por 10 min o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e precipitado através da adição de 750 pL de etanol 100% gelado. Seguiu-se uma centrifugação a 10000 x g por 5 min, o descarte do sobrenadante e uma lavagem com 500 pL de etanol 7 0% gelado. Foi feita uma última centrifugação a 10000 x g por 2 min, o

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17/24 sobrenadante descartado e o precipitado foi então seco em um concentrador a vácuo. 0 precipitado foi então ressuspendido em 50 pL de água milliQ contendo RNase A (20 pg/mL) e incubado a 37 °C por 15 min. 0 DNA foi armazenado a -20 °C.

Exemplo 5: Preparação de DNA plasmidial em grande escala (midi e maxiprep):

[0057] Para a extração de plasmideos bacterianos em grande escala foi utilizado Qiagen Plasmid Midi and Maxi Kit (Qiagen) e as orientações do fabricante foram seguidas.

[0058] Reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0059] Todas as reações de PCR foram feitas com a enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

Exemplo 6: Digestão de DNA com enzimas de restrição:

[0060] Todas as digestões de DNA foram realizadas de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante das enzimas. De acordo com a quantidade de DNA a ser digerido, a quantidade de enzima foi calculada, não ultrapassando um volume maior que 10% do volume total da reação. Todas as reações foram incubadas por 2 h na temperatura adequada para cada enzima.

Exemplo 7: Análise de DNA por eletroforese:

[0061] A análise de DNA por eletroforese foi feita de acordo com SAMBROOK et al. (2001), com adaptações. O gel foi feito utilizando tampão TAE IX com uma concentração de 1% de agarose e 0,5 pg/mL de brometo de etidio. As amostras foram aplicadas no gel e submetidas a uma diferença de potencial para provocar a migração e separação dos fragmentos de DNA. Como o brometo

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18/24 de etidio foi utilizado como corante, a visualização foi feita com a exposição do gel à luz ultravioleta. Na Figura 14 a linha 5 corresponde ao espaço entre as digestões, sem DNA. Linha 1- Marcador de massa molecular (MM - 1Kb), 2- pACYCç3TIm intacto, 3- pACYC-ç3TIm digerido com Fnu4HI, 4- pACYCç3TIm digerido com EcoRI, 6- pACYC184 intacto, 7- pACYC184 digerido com Fnu4HI e 8- pACYC184 digerido com EcoRI

Exemplo 8: Purificação e eluição de fragmentos de DNA:

[0062]	A purificação de DNA proveniente de reações de PCR,
assim	como de bandas	provenientes	de	géis	de agarose, foi
feita	com o kit Wizard	SV	Gel	and	PCR	Clean-Up System

(Promega, EUA) seguindo as orientações do fabricante.

Exemplo 9: Precipitação de DNA:

[0063] Após a digestão do DNA com enzimas de restrição, para retirar sais e enzimas as amostras foram precipitadas adicionando acetato de sódio para uma concentração final de 0,3 M e 2,5 volumes de etanol 100% gelado. Foi realizada uma incubação a -20 °C por 16 h, e então as amostras foram centrifugadas a 10000 x g por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com 500 pL de etanol 70% e centrifugado novamente a 10000 x g por 2 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi seco em um concentrador a vácuo e ressuspendido em volume adequado de água milliQ.

Exemplo 10: Preparo das células para eletroporação:

C. acetobutylicum ATCC 824:

[0064] Uma colônia foi adicionada ao meio CGM ou BHI e incubada a 37 °C até atingir a ODôoo 0,6. A preparação do

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19/24 inóculo foi feita com a adição de 10% do pré-inoculo a 50 mL de meio CGM ou BHI e incubada a 37 °C até atingir a ODôoo 1,2. O cultivo foi transferido para tubos Falcon de 50 mL e centrifugados a 6000 x g por 10 min, as células coletadas foram lavadas duas vezes e ressuspendidas em 1,8 mL de uma solução de NaHzPCU 5 mM e glicose 270 mM. A mistura foi dividida em duas cubetas de 4 mm e incubadas no gelo por 5 min, após os 2 primeiros minutos o plasmídeo pMTL-mazF-pta (500 ng) foi adicionado para os testes de deleção do gene pta e o plasmídeo pMTL-mazF-buk para a deleção do gene buk e integração do sadH.

Exemplo 11: Eletroporação:

[0065] Para C. acetobutylicum, as condições de eletroporação foram 2000 V, 25 pF, 600 Ω em 6 ms. A cubeta utilizada foi de 4 mm e após o choque as amostras que foram submetidas a eletroporação foram injetadas em meio CGM ou BHI reduzido e incubadas por 4 h a 37 °C. As células foram semeadas em placas de meio CGM ou BHI contendo tianfenicol (15 pg/mL) ou eritromicina (25 pg/mL) e incubadas a 37 °C em câmara anaeróbica.

Exemplo 12: Contrasseleção:

C. acetobutylicum:

[0066] As colônias crescidas em meio contendo tianfenicol foram repicadas para o meio contendo fluoracetato de sódio, cuja hidrólise é tóxica para as bactérias que não tiverem o gene pta interrompido. Após a incubação a 37 °C por até 72 h os clones obtidos foram selecionados para extração do DNA genômico e posterior confirmação da integração por PCR.

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20/24 [0067] Para a deleção do gene buk, cada colônia crescida em meio contendo tianfenicol foi repicada respectivamente para 2

placas,	uma contendo meio BHI e	outra contendo	antibiótico e
lactose.	Após	a incubação a 37	°C por até	72	h os clones
obtidos	foram	selecionados para	extração do	DNA genômico e

posterior confirmação da integração por PCR.

Exemplo 13: Extração de DNA total de bactéria:

[0068] A extração de DNA total de E. coli foi realizada com o kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega), para as colônias crescidas nos meios citados, de acordo com as orientações do fabricante. Para o clostridio, foi adicionada uma etapa de aquecimento a 80 °C por 30 min para rompimento dos esporos possivelmente formados, anterior à utilização do kit.

Exemplo 14: Amplificação pela PCR:

[0069] Os primers utilizados nesse trabalho estão listados na Tabela 1. As amplificações foram realizadas utilizando-se a Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.

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Tabela 1 - Primers utilizados neste trabalho. E os micro-organismos para o qual foram produzidos.

	Γ		CO		cn	O	x—1	CX]	cn
	ο		ο		o	x—1	x—1	x—1	χ—1	χ—1
Q	ο		ο		o	o	o	o	ο	ο
J	3		3		3	3	3	3	3	3
cr φ ω	Q		Q		Q	Q	Q	Q	Q	Q
Η		Η		H	H	H	H	Η	Η
	οι		οι		cn	cn	cn	cn	cn	οι
	Μ		Μ		M	M	M	M	Μ	Μ
	ω		ω		ω	ω	ω	ω	ω	ω
							e	e
							3	3	3	3
Ê φ							o	o	ο	ο
						•H	•H	•Η	•Η
Q	•Η		•Η		•H	•H
tid ü·							4-J	4-J	4-J	4-J
ο		ο		o	o	3	3	3	3
ο		ο		o	o	X)	X)	X)	X)
N							O	O	Ο	Ο
•		•		•	•	4-J	4-J	4-J	4-J
r|	Εή		Εή		EU	EU	QJ	QJ	QJ	QJ
rH			o	o	ο	ο
μ							rçj	rçj	Π3	Π3
D							O	O	Ο	Ο
	4->		4-1
	4->		Ο
	Ο		tn
	4->		Ο
	4->		tn
	ο		4-1
	4->		Ο
	ίϋ		4-1
	ο		tn
	4->		Ο
	4->		tn
	ο		ίϋ
	tn		ο
	4-)		4-1
	ο		4-1
	ίϋ		4-1
	ίϋ		Ο
X	4->		tn
m	4->		ο
1	tn		4-1
X	Ο		ίϋ
in	ίϋ		tn
XIM*»	tn		4-1
	4-)		4-1
	ίϋ		tn
r|	ο	Ο	O
u	4->	Ο	tn	O				EH
α	tn	Εη	tn				EH	O
φ	tn		ίϋ	3			O	Eh
2.	4->	Ο	tn	3	Eh		O	O	<	Ο
	O	ο	ίϋ	o	O		<	O	Εη	Εη
φ	4-)		ίϋ		Eh	O	EH	Eh	Ο	Ο
ω	tn	ο	ίϋ	o	O	Eh	O	Eh		Ο
	tn		4-)	o		EH	Eh	Eh		ο
	ίϋ	ο	tn	o		EH	EH	O	Ο	ο
	ίϋ	Εη	4-)		O		O	Eh	Εη	ο
	tn	Εη	ο	o	o	O	EH		Ο	Εη
	ίϋ	Ο	tn	Eh	o	O	EH		Ο	Εη
	ίϋ	Ο	O	Eh	Eh	Eh	O	O	<
	ο		O	O		O	EH	O	ο
	4-1	Ε-)	4-1	O	<f	O	EH	o	ο	Ο
	ίϋ	Εη	o	O	3	o	O	<	Εη	ο
	ο	Εη	íti		o	o	O	Eh	Ο	ο
	4-1		o	O		o	<	O	ο	<
	ίϋ	Ο	tn		o	Eh	O	Eh	ο	Εη
	ο	Ο	4-1	o	o		<	Eh	Εη	Ο
	ο	Εη	íti	íti	o	Eh	O	O	Ο	Εη
	ο	Ο	o	tn	o	Eh	o	O	ο	Εη
	tn	Ο	4-1	tn		O	<	<	Εη	Ο
(0 Μ g
rH		OJ		m
	fa		fa		fa	fa	fa	Λ	fa	Λ
Μ	Μ		M		M	M	Φ	(Ü	44	Μ
CL	>1		>1		>1	>1	μ	μ	3	3
CL		CL		CL	CL	CL	CL	X)	X)

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Resultados

Síntese química do gene codificador da metiltransferase do fago φ3Τ de B. subtilis [0070] A ferramenta molecular mais fundamental para a manipulação de clostridios é a metiltransferase (ou metilase) φ3ΤΙ-ΜΤΡ produzida pelo fago φ3Τ de B. subtilis sendo codificada pelo gene φ3ΤΙ. Todos os plasmideos para transformação de C. acetobutylicum precisam necessariamente ser amplificados em cepa de E. coli contendo o gene φ3ΤΙ a fim de proteger o DNA contra digestão pela enzima Cac824I.

Sintese quimica do gene otimizado de DNA metiltransferase do fago φ3Τ de B. subtilis [0071] A região do fago φ3Τ contendo a sequência codante do gene φ3ΤΙ foi otimizado pela substituição do códon de iniciação atípico, TTG, pelo códon de iniciação canônico, ATG, e sintetizado pela empresa IDT DNA (Iowa, USA) na forma de um fragmento de 1535 pb e os sítios de restrição para EcoRI também foram adicionados às extremidades para clonagem no vetor pACYC184 digerido com a mesma enzima. O gene otimizado foi denominado <p3TIm e o vetor resultante onde este foi clonado foi denominado pACYC-cp3Tm (Figura 13) .

[0072] A amplificação do vetor pACYC-cp3Tm foi realizada em E. coli DH5a e a seleção feita em meio contendo tetraciclina. Para a confirmação da presença do gene correto de 1535 pb no plasmídeo foi realizada a digestão do mesmo com a enzima de restrição EcoRI, gerando os perfis da Figura 14. Nesse mesmo experimento foi também realizado o teste da funcionalidade do gene <p3TIm usando a enzima Fnu4HI, um isoesquizômero de

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Cac824I, cuja ação no vetor sem metilação seria o corte em mais de 40 sítios.

[0073] A vantagem do uso do vetor pACYC-cp3Tm é que, por ter a origem de replicação pl5A, é permitida a amplificação (e metilação) de outro plasmídeo contendo a origem de replicação colEl presente na maioria dos vetores usados rotineiramente. Dessa forma, os vetores que serão usados para modificar C. acetobutylicum podem ser produzidos.

[0074] Outra vantagem deste vetor é seu reduzido tamanho em comparação a outro (pANl) rotineiramente descrito na literatura. O menor tamanho do vetor pACYC-cp3Tm permite uma manipulação mais fácil in vitro.

Construção dos vetores de integração para Clostridium [0075]

Alellic-Coupled homologia para

A construção dos mediar os

Exchange

vetores	se	baseou	na técnica	de
(ACE),	que	utiliza	sequências	de
eventos	de	integração. Todos	os

precisam de C. acetobutylicum plasmídeos para transformação necessariamente serem clonados em E. coli contendo o gene φ3ΤΙ a fim de proteger o DNA contra digestão pela enzima Cac824I. A região de integração contendo os genes askA (1200 pb) e um fragmento do gene pta (300 pb) foi sintetizado pela empresa Epoch Biosciences na forma de um fragmento de 1500 pb com sequência idêntica àquela descrita na literatura. O vetor resultante foi denominado pMTL-mazF-pta (Figura 15).

[0076] O segundo vetor de integração foi produzido da mesma forma que o primeiro. A região de integração contendo os genes ptb (900 pb), cac3077 (300 pb) e um fragmento do gene buk (300 pb) foi sintetizado pela empresa Epoch Biosciences na forma de

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24/24 um fragmento de 1500 pb com sequência idêntica àquela descrita na literatura. O vetor resultante foi denominado pMTL-mazF-buk (Figura 16).

Metilação do vetor para integração em C. acetobutylicum [0077] A clonagem e a metilação do vetor foi realizada em E. coli DH10B, que continha o plasmídeo pACYC-ç3TIm e, como controle, foi usada a mesma linhagem contendo o plasmídeo pACYC184 vazio, a seleção feita em meio contendo tianfenicol. Para a confirmação da presença de metilação foi realizado o corte pela enzima de restrição Fnu4HI, cuja ação no vetor sem metilação foi o corte em mais de 40 sítios, gerando os perfis da Figura 17. O vetor clonado na cepa contendo o gene da metilase φ3ΤΙ-ΜΤΡ ficou imune à digestão com Fnu4HI.

Primeiro evento de Integração em C. acetobutylicum [0078] A transformação das cepas de clostrídios por eletroporação resultaram no crescimento de colônias nas placas contendo o antibiótico tianfenicol (Figura 18) indicando a presença e possível primeira integração do plasmídeo ao genoma. A confirmação da integração foi realizada usando a técnica de PCR.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para modificação de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   a. sintetizar quimicamente o gene φ3ΤΙ que codifica a metiltransferase do fago φ3Τ de B. subtilis;

   b. clonar o gene φ3ΤΙ em vetor para transformação de E. coli através de molécula de DNA transformante da etapa (a) em meio de cultivo;

   c. construir vetores para modificação do C. acetobutylicum;

   d. produzir vetores metilados resistentes à enzima Cac284, através de molécula de DNA transformante da etapa (c) em meio de cultivo;

   e. deletar os genes pta e buk de C. acetobutylicum;

   f. sintetizar quimicamente o gene sadH de C. beijerincki;

   g. construir vetor para expressão do gene sadH e transformar C. acetobutylicum deletado para os genes pta e buk ;

   h. selecionar clones produtores dos álcoois butanol, etanol e isopropanol.
2. 2. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de

   1 a 2, caracterizado pelo fato de que o gene da etapa (a) compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 1.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de

   1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene da etapa (a)

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   2/3 compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a metiltransferase de acordo com a SEQ ID NO:2.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultivo das etapas (b) e (d) é preferencialmente, meio LB.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o meio LB tem pH que varia entre 6,5 e 8,0.
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade de molécula de DNA transformante das etapas (b) e (d) varia entre 100 ng e 300 ng.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por o gene da etapa (f) compreender molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 3.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por a etapa (e) compreender ainda a co-transformação com os vetores pMTL-mazF-pta, que compreende a molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 5 ou pMTL-mazF-buk, que compreende a molécula de ácido nucleico conforme a SEQ ID NO: 6.
9. 9. Vetor para modificar célula de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas conforme processo definido nas reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é metilado para resistir à enzima Cac284.
10. 10. Vetor para modificar célula de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas conforme processo definido nas reivindicações de 1 a 8, caracterizado por exprimir um gene sadH.

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11. 11. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações de

    9 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende:

    a. molécula de ácido nucleico conforme definida na SEQ ID NO: 1 ;

    b. molécula de ácido nucleico conforme definida na SEQ ID NO: 3.
12. 12. Uso de bactérias do gênero Clostridium não patogênicas modificadas de acordo com o processo conforme definido nas reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é em processos de bioconversão de biomassa em álcoois.