BR102017015966A2 - Nanocarreadores emulsionados catiônicos multifuncionais e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um nanocarreador emulsionado catiônico multifuncional com propriedades bioadesivas compreendendo uma fase oleosa, uma fase aquosa, um agente bioativo, uma mistura de tensoativos e co-tensoativos, um composto catiônico, e aditivos adicionais. tal nanocarreador possui capacidade de inibição do transportador de efluxo p-gp para administração intraductal na mama visando o tratamento e prevenção de tumores, lesões pré-tumorais de mama e doenças de cunho inflamatório/infeccioso, como mastite.

Description

NANOCARREADORES EMULSIONADOS CATIÔNICOS MULTIFUNCIONAIS E USOS DOS MESMOS

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se insere no campo da Medicina, mais precisamente na área da mastologia, bem como no tratamento das condições que acometem as mamas, e descreve nanocarreadores multifuncionais, catiônicos e bioadesivos, desenvolvidos especificamente para a administração de agentes quimioterápicos ou capazes de atuar na prevenção do desenvolvimento de tumores diretamente no dueto mamário, de modo a reduzir a biodisponibilidade sistêmica do fármaco, aumentar sua concentração e captação tumoral e aumentar a retenção do fármaco nos duetos e a exposição tumoral ao fármaco.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] O câncer de mama é, atualmente, o segundo tipo de câncer mais comum no mundo e o mais recorrente entre as mulheres, com 1,7 milhões de novos casos em 2012 (World Câncer Research Fund International, 2016). Dentre suas diversas formas, o carcinoma intraductal in situ (DCIS) tem registrado aumento de incidência, correspondendo atualmente a 20-25% dos tumores diagnosticados, o que provavelmente se deve à melhoria de métodos diagnósticos. O método padrão de tratamento desse tipo de tumor consiste na remoção cirúrgica seguida de radiação e tamoxifeno oral, em casos de tumores responsivos ao estrógeno. Formas convencionais de quimioterapia não são utilizadas em decorrência dos efeitos adversos sistêmicos. No entanto, esse padrão de tratamento vem sendo criticado e considerado excessivo quando se trata de lesões de baixo risco.

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2/36 [003] Considerando que tumores se originam das células epiteliais dos duetos, e que concentrações efetivas de quimioterápicos só são necessárias nas mamas, a administração localizada de quimioterápicos diretamente nos duetos pode possibilitar não apenas o tratamento de DCIS de baixo risco, mas também a prevenção do desenvolvimento de tumores em pacientes considerados de alto risco com base no histórico familiar, presença de mutações genéticas e/ou de hiperplasia ductal atípica, lesões que reconhecidamente aumentam o risco de desenvolvimento de câncer de mama.

[004] Aliás, devido à sua alta incidência e aos entraves relacionados ao tratamento do câncer de mama, a doença atualmente está recebendo grande atenção de vários grupos de pesquisa ao redor do mundo. Estima-se que esse tipo de câncer corresponde a cerca de 25% dos novos casos anuais brasileiros, com 14.207 mortes entre as mulheres e 181 entre os homens em 2013, com uma previsão de 57.960 novos casos em 2016 (INCA, 2016) . O aumento da incidência desse tipo de tumor se deve principalmente à melhora e disseminação de métodos de rastreamento mamográficos.

[005] Além da alta incidência, seu tratamento e prevenção apresentam diversas dificuldades uma vez que, por se tratar de um câncer, espera-se encontrar alta diversidade genômica e histopatológica tumoral de paciente para paciente, o que dificulta a padronização do tratamento para todos os casos clínicos. Devido a isso, várias abordagens podem ser utilizadas para o tratamento da doença, técnicas essas que apresentam algumas limitações. Para o tratamento do DCIS utiliza-se mastectomia total ou parcial, radioterapia e administração de tamoxifeno, abordagens

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3/36 utilizadas em conjunto ou individualmente. Porém, alguns pacientes não podem ser submetidos à cirurgia devido às condições de saúde que conferem alto risco ao procedimento, impossibilitando sua realização. 0 mesmo vale para radioterapia, por se tratar de uma abordagem agressiva que causa diversos efeitos adversos.

[006] Quanto ao tamoxifeno, que é utilizado tanto na prevenção quanto no tratamento do câncer de mama, devese levar em conta algumas limitações para sua administração. Por ser administrado sistemicamente, principalmente através da via oral, o fármaco causa efeitos adversos indesejáveis de forma sistêmica. Além disso, por se tratar de um SERM (do inglês Selective Estrogen Receptor Modulator), o tamoxifeno e seus metabólitos ativos são eficazes apenas contra tumores que apresentam receptores de estrógeno, comportando-se como um antagonista desses receptores e, por conseguinte, minimizando a estimulação da proliferação tumoral. Além disso, a farmacogenômica pode influenciar a resposta do paciente ao tratamento, uma vez que o tamoxifeno é um prófármaco e substrato de proteínas do citocromo P450 que, por apresentar graus de atividade variada, afetam a quantidade de metabólitos ativos disponíveis e a eficácia do fármaco. A quimioterapia convencional não é utilizada em decorrência da alta incidência de efeitos adversos sistêmicos. Além de apresentar essas limitações, o padrão de tratamento de DCIS tem sido criticado e considerado excessivo por diversos grupos, principalmente quando se trata de lesões de baixo risco, uma vez que o crescimento no diagnóstico e o tratamento desses tumores com remoção cirúrgica + radiação (padrão) não tem sido acompanhado pela redução na incidência

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4/36 de formas invasivas do câncer, e a prevenção de recorrências mediante remoção cirúrgica das lesões e radioterapia não parece alterar a mortalidade por câncer de mama em dez anos.

ESTADO DA TÉCNICA [007] Com o intuito de contornar esses entraves, novas abordagens farmacológicas mais localizadas e que apresentem eficácia contra um amplo espectro de tumores de mama, diminuindo a influência histopatológica e genética destes no tratamento, vêm sendo estimuladas. Considerando que DCIS se desenvolve no epitélio dos duetos, a administração intraductal representa uma estratégia promissora para administração de fármacos diretamente no local das lesões, associando eficácia com redução de efeitos adversos sistêmicos, o que se traduz em maior segurança.

[008] A via intraductal foi utilizada para administração de fármacos como paclitaxel, doxorrubicina e 4-hidroxitamoxifeno em modelos de carcinoma mamário induzido por N-metil-nitrosureia em ratos e em modelos de camundongos transgênicos HER-2/neu, sendo demonstrada a redução de tumores estabelecidos e prevenção do desenvolvimento de novos tumores, enquanto resultando em menores concentrações plasmáticas dos fármacos, comparado à administração sistêmica. A viabilidade de uso dessa via também foi avaliada em mulheres como forma de terapia adjuvante precedendo a cirurgia para retirada de tumores. A administração intraductal foi bem tolerada e resultou em concentrações de doxorrubicina maiores na mama e menores no plasma comparado à administração intravenosa do fármaco. Mahoney et al. demonstraram que é possível canular diversos duetos e até mesmo identificar e canular apenas aqueles atingidos por

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DCIS sem efeitos adversos locais ou sistêmicos significativos (apenas eritema local e edema em alguns pacientes foram observados). Esses resultados sugerem a viabilidade da administração intraductal para o tratamento e prevenção de tumores e lesões pré-tumorais na população de alto risco.

[009] Por exemplo, o documento intitulado A Feasibility Study of the Intraductal Administration of Chemotherapy mostra a viabilidade da administração intraductal para o tratamento e prevenção de tumores, mas não avalia ou sugere qualquer tipo de formulação específica que leve em consideração as características da via de administração. Soluções de fármacos, nanopartículas e lipossomas foram utilizadas em estudos que se propuseram a avaliar a possibilidade e facilidade de uso dessa via, mas nenhuma dessas formulações foi desenvolvida levando-se em consideração as características da via de administração intraductal e os objetivos desse tipo de administração. Neste caso, utilizou-se formulações já existentes, desenvolvidas para outras vias de administração (como os lipossomas) ou simplesmente soluções, sem nenhum design experimental. A presente invenção, por sua vez, propõe o desenvolvimento de formulações específicas para a via de administração intraductal.

[010] O documento intitulado Cytotoxicity and Apoptosis Enhancement IN Brain Tumor Cells Upon Coadministration of Paclitaxel and Ceramide in Nanoemulsion Formulations descreve o aumento do efeito citotóxico do paclitaxel quando combinado à ceramida C6 em células de glioblastoma. Na presente invenção não foi necessário

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6/36 associar ceramida com outro fármaco de alta toxicidade (como o paclitaxei), uma vez que componentes da própria formulação (mais especificamente a tributirina) potencializaram o efeito da ceramida. Isso pode resultar em redução de custos, já que fármacos citotóxicos são mais caros do que os componentes utilizados na presente invenção. Outra vantagem da presente invenção diz respeito ao seu potencial efeito seletivo. Resultados recentes mostraram que a formulação sem fármaco não é citotóxica para células saudáveis, mas sim para as tumorais, o que sugere que a capacidade da formulação de potencializar os efeitos citotóxicos da ceramida seja mais seletiva para células tumorais. Isso reforça a ideia de que a formulação possa ser utilizada também em indivíduos saudáveis para prevenção de tumores mediante incorporação de agentes anti-proliferantes/quimiopreventivos ao invés de citotóxicos. Vale ressaltar que a formulação proposta na invenção é bastante distinta em termos de composição e características. Isso é refletido no diâmetro inferior (2 ou mais vezes) do nanocarreador e carga positiva, o que é relevante para retenção e melhor interação do nanocarreador com o tecido.

[011] O documento intitulado Discriminated effects of thiolated chitosan-coated pMMA paclitaxel-loaded nanoparticles on different normal and câncer cell lines detalha a obtenção de nanopartículas poliméricas cuja superfície foi modificada pela ligação de um derivado quitosana-glutationa no qual foram introduzidos grupos tiol. A conjugação da quitosana com glutationa e introdução de grupos tiol foram realizadas com as finalidades de aumentar a mucoadesão, simultaneamente, ao efeito promotor de

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7/36 absorção em mucosas, e envolveu diversas etapas, incluindo depolimerização, precipitação e conjugação, as quais necessitam de solventes específicos, reativos e de maior toxicidade, bem como uma diversidade maior de equipamentos. 0 nanocarreador da presente invenção, em contrapartida, se diferencia de tal documento por pelo menos três aspectos, isto é, pelo fato de ser líquido e não sólido (nanopartículas poliméricas são consideradas sistemas sólidos), o que é associado à maior simplicidade de obtenção, maior taxa de encapsulação de agentes ativos e sua liberação rápida, o que é um objetivo da presente invenção quando comparado aos sistemas poliméricos. Além disso, o processo de obtenção do nanocarreador da presente invenção envolve apenas emulsificação e sonicação, enquanto que a produção do carreador descrito no referido documento é complexa, envolve múltiplas etapas, solventes e procedimentos específicos, incluindo borbulhamento de nitrogênio, utilização de nitrato de cério (IV) e amônio (um forte agente oxidante) e ácido nítrico. Dessa forma, a metodologia não é facilmente replicável, envolve reagentes mais tóxicos, maior custo, maior tempo de preparo e maior possibilidade de erros.

[012] Além disso, como não há na presente invenção preocupação com o efeito promotor de absorção (o que, no caso do tecido alvo, viria associado ao efeito sistêmico), não há necessidade de modificação estrutural da quitosana e sua conjugação com glutationa. Na presente invenção, o efeito bioadesivo foi obtido com a quitosana não modificada, o que reduz custos, complexidade e tempo de preparo.

[013] Não obstante, a quitosana é introduzida durante o preparo do nanocarreador, sem necessidade de

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8/36 ligação à sua superfície. Assim, os benefícios do uso da quitosana são obtidos sem a necessidade de etapas adicionais ou adequação estrutural. Ainda, da forma como ela foi utilizada na presente invenção, houve ganho de viscosidade da dispersão, o que contribui para retenção e efeito localizado.

[014] Assim, considerando o que há no estado da técnica relacionado ao tratamento e prevenção de tumores na mama, verifica-se que não há qualquer ensinamento a respeito do uso de nanocarreadores para administração intraductal, visando aumento da eficácia e localização de compostos usados no tratamento e/ou prevenção de tumores de mama, lesões prétumorais e outras doenças que acometam as mamas. Mediante o tratamento localizado, espera-se aumentar a eficácia aliada à redução de efeitos adversos decorrentes da exposição sistêmica de agentes quimioterápicos, anti-inflamatórios e outros tipos de fármacos que apresentem baixa seletividade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [015] A presente invenção tem por objetivo propor nanocarreadores emulsionados catiônicos com caráter multifuncional conferido pelo uso de compostos com múltiplas funções, como (i) quitosana, utilizada para conferir carga positiva e propriedades bioadesivas ao nanocarreador contribui também para aumentar a viscosidade do sistema, propriedades que contribuem para aumentar o tempo de permanência do nanocarreador nos duetos e sua captação por células tumorais, (ü) tributirina, utilizada como componente da fase oleosa, é precursora de ácido butírico e capaz de potencializar a atividade citotóxica de fármacos, como a ceramida C6 e (iii) monoleína, um dos componentes da

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9/36 fase oleosa que também apresenta propriedade bioadesiva. Os referidos nanocarreadores são utilizados para a administração intraductal de agentes quimioterápicos capazes de atuar na prevenção do desenvolvimento de tumores diretamente no dueto mamário, de modo a reduzir a biodisponibilidade sistêmica do fármaco, aumentar sua concentração e captação tumoral e aumentar a retenção do fármaco nos duetos e a exposição tumoral ao fármaco.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [016] A FIG. 1 apresenta os gráficos relativos ao tamanho (A, C e E) e ao potencial zeta (B, D e F) dos nanocarreadores obtidos sem quitosana (adicionando apenas água em substituição à solução aquosa de quitosana) (A e B) ou com quitosana de acordo com o protocolo 1 (C e D) ou protocolo 2 (E e F) , nos quais variou-se a etapa de adição da quitosana. O tamanho e potencial zeta foram obtidos utilizando-se o equipamento Zetasizer ZS90 (Malvern), após diluição na proporção de 1:10 (v/v) com água em cubeta descartável (Malvern). Para medida do potencial zeta foi utilizado dip cell (Malvern). As mediadas foram realizadas em duplicatas utilizando 3 lotes de cada formulação;

[017] A FIG. 2 apresenta graficamente a avaliação das propriedades reológicas das nanoemulsões obtidas sem quitosana (A) ou com quitosana (B) . A avaliação destas características foi realizada utilizando reômetro do tipo cone-placa (Brookfiled) com taxa de cisalhamento de até 3000 1/s à 25C;

[018] A FIG. 3 apresenta graficamente a avaliação de tamanho (à esquerda) e potencial zeta (à direita) dos sistemas resultantes da incubação por 30 minutos do

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10/36 nanocarreador com tampão fosfato (A), de dispersão de mucina com tampão fosfato (B) e do nanocarreador com dispersão de mucina (C);

[019] A FIG. 4 apresenta graficamente a viabilidade de células MCF-7 tratadas por 48 h com o nanocarreador (sem fármaco) com tributirina (NE+T) ou sem tributirina (NE) , quando comparada ao PBS (considerado seguro). Dados mostrados como média ± DP de 8-10 replicatas em 4-5 experimentos independentes. Foi realizado o ensaio de MTT para a avaliação da viabilidade celular de células MCF7 após o tratamento, sendo estas células uma linhagem de adenocarcinoma mamário humano, cultivadas na estufa em meio de cultura DMEM - GlutaMAX™ contendo 10% de soro bovino fetal e Penicilina 100 U/mL + estreptomicina 100 pg/mL, em atmosfera úmida a 5% de CO2 e a 37 °C. Uma vez cultivadas, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma concentração de 10.000 células/poço, sendo mantidas na estufa por mais 24h antes do início do tratamento com as formulações. Células não tratadas foram utilizadas como controle negativo; já o controle positivo consistiu no tratamento das células com diversas concentrações de doxorrubicina obtidas através da diluição seriada. Quanto ao tratamento das células com nanocarreadores, foi adotado este mesmo protocolo de diluição seriada, sendo 2 mg/mL a concentração mais elevada. Após 24h decorridas do início do tratamento, este foi interrompido através da troca do meio de cultura das células, sendo então incubadas por mais 24h; ao final deste período, foi incubada por 3h com solução de MTT 0,5 mg/mL, metabolizado pela mitocôndria a formazan, quantificando-se sua absorbância através do

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11/36 espectrofotômetro no comprimento de onda de 595 nm, estimando-se, assim, a viabilidade celular.

[020] A FIG. 5 apresenta graficamente a viabilidade de células MCF-7 tratadas por 48 h com o nanocarreador com tributirina, com ceramida em solução de DMSO ou incorporada no nanocarreador com tributirina (NE + T + ceramida) ou sem tributirina (NE + ceramida). A: efeito da nanoencapsulação e combinação com tributirina sobre a concentração de ceramida necessária para reduzir a viabilidade celular para 50%; B: efeito da combinação com ceramida sobre a concentração de tributirina necessária para reduzir a viabilidade celular para 50%. Dados representados como média ± desvio padrão de 9-12 amostras em 4-5 experimentos diferentes. Foi realizado o ensaio de MTT para a avaliação da viabilidade celular de células MCF7 após o tratamento, sendo estas células uma linhagem de adenocarcinoma mamário humano, cultivadas na estufa em meio de cultura DMEM - GlutaMAX™ contendo 10% de soro bovino fetal e Penicilina 100 U/mL + estreptomicina 100 pg/mL, em atmosfera úmida a 5% de CO2 e a 37 °C. Uma vez cultivadas, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma concentração de 10.000 células/poço, sendo mantidas na estufa por mais 24h antes do inicio do tratamento com as formulações. Células não tratadas foram utilizadas como controle negativo; já o controle positivo consistiu no tratamento das células com diversas concentrações de doxorrubicina obtidas através da diluição seriada. Quanto ao tratamento das células com nanocarreadores, foi adotado este mesmo protocolo de diluição seriada, sendo 2 mg/mL a concentração mais elevada. Após 24h decorridas do inicio do tratamento, este foi interrompido através da troca do meio

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12/36 de cultura das células, sendo então incubadas por mais 24h; ao final deste período, foi incubada por 3h com solução de MTT 0,5 mg/mL, metabolizado pela mitocôndria a formazan, quantificando-se sua absorbância através do espectrofotômetro no comprimento de onda de 595 nm, estimando-se, assim, a viabilidade celular.

[021] A FIG. 6 representa graficamente que a incorporação de elacridar na nanoemulsão promove inibição do transportador P-gp. A habilidade do nanocarreador de inibir P-gp em frações de membrana contendo o transportador foi determinada utilizando kit Pgp glo (Promega). Neste ensaio, a atividade da P-gp é medida em função do consumo de ATP. Em presença de ATP, as frações de membrana estimuladas com verapamil (substrato de P-gp) foram expostas ao nanocarreador contendo elacridar (losangos cinzas) ou isentos do inibidor (quadrados pretos). A quantidade de ATP não utilizada foi quantificada por luminescência.

[022] A FIG. 7 apresenta as alterações na membrana corioalantóide de ovos tratados com salina (controle negativo), NaOH (controle positivo) e nanoemulsão. O NaOH gerou hemorragia, lise e coagulação, o que está de acordo com a literatura (Liebsch et al., 2002; Lotz et al. , 2016) . Os ovos foram incubados por 9 dias a 37 °C ± 0,5 e umidade relativa de aproximadamente 70%. A membrana corioalontóide dos ovos foi exposta ao nanocarreador (0,1 mL) , controle positivo (NaOH 0,1 M) e negativo (salina), e o desenvolvimento de hemorragia, lise vascular e coagulação foi avaliado nos tempos 0, 30 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min e 5 min de contato em esteromicroscópio.

[023] A FIG. 8 compara a localização no tecido

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13/36 mamário de um marcador fluorescente (Alexa Fluor 647) encapsulado no nanocarreador 2 após 1, 2 4 ou 12 Oh da administração em ratas Wistar. É possível observar claramente a localização do marcador no tecido mamário por até 120 h quando da administração do nanocarreador por via intraductal, enquanto que a administração intraperitoneal resulta em fluorescência dispersa, que desaparece em 24 h, demonstrando que não há direcionamento para o tecido mamário.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [024] A presente invenção refere-se um nanocarreador emulsionado catiônico multifuncional com propriedades bioadesivas e capacidade de inibição do transportador de efluxo P-gp para administração intraductal na mama visando o tratamento e prevenção de tumores, lesões pré-tumorais de mama e doenças de cunho inflamatório/infeccioso, como mastite. O referido nanocarreador é composto por: uma fase oleosa, uma fase aquosa, um agente bioativo, uma mistura de tensoativos e cotensoativos, um composto catiônico, e aditivos adicionais.

Fase oleosa [025] Para a fase oleosa são utilizados compostos apoiares, onde são dissolvidos fármacos hidrofóbicos. Como exemplo, inclui-se mono, di e triglicerídeos e ácidos graxos de cadeia curta, média ou longa, desde que líquidos à temperatura ambiente, óleos vegetais, ésteres de ácido graxos (como miristato de isopropila). Muitos óleos vegetais apresentam ação antioxidante e deve-se atentar para que eles não sejam utilizados em formulações destinadas ao tratamento de tumores. Em formulações destinadas à quimioprevenção, óleos com propriedades antioxidantes podem ser utilizados.

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Fase aquosa [026]

Para a fase aquosa é utilizada a água ou solução tampão para controle do pH. Esta é a fase dispersante, onde fármacos e outros podem ser dissolvidos. Exemplos são:

compostos hidrofilicos água, tampão fosfato,

PBS, soluções aquosas de fármacos. É possível misturar baixas concentrações (inferior a 10% da massa total) de solventes polares como propilenoglicol e glicerol.

Agente bioadesivo [027] O agente bioadesivo utilizado serve para conferir propriedades bioadesivas ao nanocarreador. Exemplos preferenciais são o ácido hialurônico, quitosana, alginato de sódio e monoleína. Podem ser incorporados na fase aquosa, oleosa ou mistura de tensoativos durante a produção do nanocarreador, ou posteriormente na dispersão do nanocarreador pronto para recobrir e modificar a superfície.

Mistura de tensoativos e co-tensoativos [028] A mistura de tensoativos e co-tensoativos permite a dispersão das fases oleosa e aquosa. Idealmente, os tensoativos devem ser capazes de formar sistemas nos quais a fase aquosa é a fase dispersante e mais abundante. Os tipos preferencialmente utilizados (sozinhos ou em combinação) são os tensoativos biocompatíveis, como os fosfolipídios, e os não iônicos, tais como polisorbatos (preferencialmente 60 ou 80) , álcoois graxos etoxilados (da série BRIJ e MIRJ), poloxamer (principalmente o 407) e alquil poliglicosídeos. Dependendo da fase oleosa utilizada, pode ser necessário associar esses tensoativos com outros mais lipofílicos, que incluem os ésteres de sorbitan (série Span, especialmente monooleato, monoestearato e monopalmitato de sorbitan) e

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15/36 álcoois de alta massa molecular (como monoestearato de glicerila e álcool cetilico desde em quantidades até 5% a fim de evitar o aumento excessivo da viscosidade). Também podem ser associados co-tensoativos para reduzir ainda mais a tensão interfacial e favorecer a formação de nanogoticulas e estabilização do sistema, tais como glicerol e propilenoglicol.

Composto catiônico [029] Os compostos catiônicos são fármacos tensoativos ou lipidios (dentre outros compostos) que conferem carga positiva ao nanocarreador, o que, além melhorar a interação com o epitélio, melhora a repulsão elétrica entre as goticulas, conferindo maior estabilidade à dispersão. Podem ser dissolvidos na fase aquosa, oleosa ou na mistura de tensoativos dependendo a solubilidade. Exemplos de lipidios catiônicos incluem fosfoesfingosina, fosfolipídeos (como fosfatifdilestearilamina) e ceramidas de longa cadeia alifática (como fitoesfingosina). Exemplos de tensoativos catiônicos são os compostos de amônio quaternários como cloreto de benzalcônio e DMAB (brometo de didocildimetilamônio). Polímeros catiônicos, como quitosana, também podem ser utilizados. Podem ser adicionados na fase oleosa, aquosa ou mistura de tensoativos para facilitar a solubilização e incorporação.

Aditivos opcionais [030] Podem ser adicionados inibidores de transportadores de efluxo ou promotores de direcionamento (capazes de reconhecer células doentes aumentando a seletividade). Na presente invenção foi incorporado o elacridar, um inibidor de P-gp. A faixa necessária depende

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16/36 da função de cada aditivo. Podem ser adicionados na fase oleosa, aquosa ou mistura de tensoativos para facilitar a solubilização e incorporação.

[031] De maneira geral, a Tabela 1 mostra as faixas propostas para os componentes utilizados na obtenção do nanocarreador multifuncional

Tabela 1: Com	oosição da formulação proposta
Composto	Concentração
Fase oleosa	Até 20%
Fase aquosa	60-95%
Agente bioadesivo	Até 5% (no caso da quitosana e alginato, preferencialmente entre 0.5 e 1% para evitar ganho excessivo de viscosidade, o que pode dificultar a injeção)
Tensoativo	5-25% razão de tensoativo:co-tensoativo, se for utilizado co-tensoativo no sistema, deve ser entre 50:1 e 1:1, m/m
Composto catiônico	Até 1%, preferencialmente até 0,5%
aditivos	Até 1%

Exemplos da Invenção [032] Os exemplos aqui mostrados têm o objetivo de demonstrar algumas das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma, podendo ser concretizada em outras formas especificas, sem fugir dos atributos essenciais da mesma.

[033]

Para obtenção dos nancoarreadores, os aditivos, composto catiônico e agente bioadesivo foram incluídos na fase oleosa ou aquosa, dependendo da solubilidade.

As Tabelas 2 a 5 ilustram composições preferenciais e justificativa de seus componentes. Notar que

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17/36 alguns componentes são utilizados com múltiplas funções, como a quitosana.

Tabela 2: Exemplo de composição (nanocarreador 1) e proporções utilizadas:

Fase	Concentração	Composição
oleosa	17%	Tributirina:tricaprilina:monoleína (1:2:1, m/m/m)
aquosa	66%	Solução aqueosa de poloxamer 407 (podendo variar entre 0,1-1%; no exemplo foi utilizado 1% de poloxamer) e quitosana (podendo variar entre 0,5-1%; no exemplo foi utilizado 0,5%)
Mistura de tensoativo	17%	Polisorbato 80

Tabela 3: Componentes utilizados no nanocarreador 1 e suas funções:

Composto	Função
Polisorbato 80	Tensoativo com alto HLB (hidrof ílico) para formação de sistemas cuja fase dispersante seja água.
Monoleina	Componente da fase oleosa, selecionado por possuir propriedade bioadesiva.
Tributirina	Triglicerideo de cadeia curta componente da fase oleosa e precursor do ácido butirico, composto com ação anti-tumoral em algumas linhagens celulares; nosso resultados mostraram que sua inclusão potencializa o efeito citotóxico de fármacos.
Tricaprilina	Componente da fase oleosa, selecionado por

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	permitir a formação de nanoestruturas com distribuição mais homogênea de tamanho.
Água	Fase aquosa.
Poloxamer	Tensoativo desagregante e estabilizante, capaz de facilitar a emulsificação e aumentar a estabilidade estérica das goticulas devido à sua alta massa molecular.
Quitosana	Polímero natural, catiônico e bioadesivo, utilizado para modificar a superfície das nanogotículas conferindo carga positiva e propriedades bioadesivas. Além disso, pela sua massa molecular, funciona também como agente estabilizante, contribuindo para a estabilização estérica da nanoformulação.

Tabela 4: Exemplo de composição (nanocarreador 2) e proporções utilizadas:

Fase	Concentração	Composição
oleosa	10%	tricaprilina
aquosa	80%	Solução de poloxamer 407 (podendo variar entre 0-1%; utilizado 0,12 nos exemplos) e quitosana (0,5-1%, utilizado 0,5% nos exemplos) com ou sem DMAB (0,025-0.1%, utilizado 0,01, 0,025 e 0,05% nos exemplos) em PBS
Mistura de tensoativos	10%	Fosfatidilcolina:Polisorbato 80:glicerol (2:l:0,5; m/m/m)

Tabela 5: Componentes utilizados no nanocarreador 2 e suas funções:

Composto

Função

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Polisorbato 80	Tensoativo com alto HLB (hidrofílico) para formação de sistemas cuja fase dispersante seja água.
Fosfatidilcolina	Tensoativo biocompativel.
Glicerol	Co-tensoativo.
Tricaprilina	Componente da fase oleosa, selecionado por permitir a formação de nanoestruturas com distribuição mais homogênea de tamanho.
PBS	Fase aquosa.
Poloxamer	Tensoativo desagregante e estabilizante, capaz de facilitar a emulsificação e aumentar a estabilidade estérica das goticulas devido à sua alta massa molecular.
Quitosana	Polímero natural, catiônico e bioadesivo, utilizado para conferir carga positiva e propriedades bioadesivas. Além disso, pela sua massa molecular, funciona também como agente estabilizante, contribuindo para a estabilização estérica da nanoformulação. Pode ser susbtiruíto por alginato de sódio ou ácido hialurônico para manter a propriedade bioadesiva, mas compromete a obtenção de carga positiva. Para manutenção da carga positiva, um cotensoativo catiônico deve ser utilizado (como cloreto de cetilpiridínio ou DMAB).
DMAB	Co-tensoativo catiônico, utilizado para aumentar o potencial zeta do nanocarreador.

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20/36 [034] O caráter multifuncional dos nanocarreadores é conferido pelo uso de compostos que conferem múltiplas funções. Por exemplo: (i) a quitosana, utilizada para conferir carga positiva (FIG. 1) e propriedades bioadesivas ao sistema (FIG. 3), contribuiu também para aumentar moderadamente a viscosidade (FIG. 2), (ii) a tributirina, utilizada como componente da fase oleosa, é precursora de ácido butirico e capaz de potencializar a atividade citotóxica de fármacos, como a ceramida C6 (FIG. 5), e (iii) a monoleina é um dos componentes da fase oleosa que também apresenta propriedade bioadesiva. Além disso, a incorporação do inibidor de P-gp elacriar reduziu a concentração do nanocarreador necessária para inibir o transportador (FIG.

6) , adicionando a possibilidade de reverter a resistência tumoral induzida pela superexpressão de P-gp como mais uma função que pode ser desempenhada pelo nanocarreador.

[035] A adição da quitosana também conferiu propriedades bioadesivas ao nanocarreador, conforme observado na FIG. 3. O ensaio para avaliação dessa propriedade foi realizado em célula de difusão de Franz utilizando-se 2 mL de solução de mucina (250 pg/mL em tampão fosfato 10 mM, pH 7.4) . À essa dispersão, foi adicionada a nanoemulsão (1% v/v), sendo o sistema incubado à 37 °C, por 30 minutos sob agitação de 100 rpm. Como controle, a solução de mucina e o nanocarreador foram incubados separadamente com tampão fosfato. Após incubação, uma alíquota de cada amostra foi diluída em água destilada (1:100 v/v) e submetida à caracterização quanto ao tamanho e potencial zeta das partículas. Observou-se que a incubação da nanoemulsão com tampão fosfato (veículo de dispersão de mucina) sob agitação

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21/36 à 37 °C não alterou tamanho e potencial zeta, que se mantiveram similares àqueles encontrados após sua obtenção (aproximadamente 50 nm e +13 mV, respectivamente) (Figura 3A) . A dispersão de mucina (após incubação com tampão fosfato) apresentou aglomerados de cerca de 900 nm e potencial zeta negativo (aproximadamente -20 mV) (Figura 5B) . A incubação do nanocarreador e solução de mucina resultou em duas populações, com 100 nm e 1000 nm, indicativos da co-existência das nanogoticulas (100 nm) e agregados de quitosana (1000 nm) . Esses resultados também mostram um leve aumento do tamanho das nanogoticulas (de 50 para 60 nm) , possivelmente, decorrente da interação com quitosana. Concomitantemente, o potencial zeta caiu para valores negativos (2 picos, -30 e -13 mV) , o que indica modificação na distribuição de cargas na superfície do nanocarreador, corroborando para a ocorrência de interações entre o nanocarreador (catiônico) e a mucina (aniônica). Essas interações indicam o potencial bioadesivo da formulação.

[036] O fato de o nanocarreador ser emulsionado permite que fármacos com diferentes características físicoquimicas possam ser incorporados simultaneamente, o que não ocorre com nano ou micropartículas poliméricas e soluções aquosas ou oleosas. Além disso, a eficiência de encapsulação em sistemas nanoemulsionados é maior comparado a nanopartículas ou lipossomas. Considerando ainda que diversos agentes antitumorais são substratos dos transportadores de efluxo como a glicoproteína P (P-gp), comumente expressos em células tumorais e responsáveis pelo desenvolvimento de resistência, é possível incorporar

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22/36 inibidores destes transportadores, como o elacridar, melhorando a eficácia do tratamento.

[037] Por exemplo, foram encapsulados três fármacos com características físico-químicas distintas para mostrar a versatilidade do nanocarreador: a ceramida C6, o paclitaxel e o diclofenaco de sódio. A ceramida C6 é um segundo mensageiro lipídico, produto do metabolismo de esfingomielina, a qual está presente na membrana celular e é capaz de induzir apoptose através de três principais mecanismos descritos até o momento: disfunção mitocondrial culminando na liberação de citocromo c, inibição de vias pró-sobrevivência da cascata de Akt e estimulação da via das caspases cujo processo final é a fragmentação do DNA e morte celular. Além disso, estudos indicam que esta molécula atua, preferencialmente, em células tumorais. A ceramida C6 apresenta grande potencial para o tratamento de diversos tipos de tumores, obtendo-se resultados satisfatórios contra células de câncer de mama, de glioblastoma e de câncer colorretal. O paclitaxel é um agente anti-tumoral muito utilizado para diversos tipos de câncer (incluindo mama) que se liga à subunidade beta da tubulina, estabilizando microtúbulos e interferindo com o processo de divisão celular; também inibe migração e proliferação de células endoteliais e tem atividade anti-angiogênica. Os resultados demonstraram que a encapsulação de ceramida C6, aumenta a citotoxicidade dos fármacos contra células de câncer de mama comparado às suas respectivas soluções. Assim, a nanoemulsão com Ceramida C6 representa uma estratégia inovadora e promissora para o tratamento e prevenção de tumores e lesões pré-tumorais de mama.

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23/36 [038] Cabe ressaltar que a adição dos fármacos paclitaxel, ceramida C6, diclofenaco sódico ou do inibidor de P-gp elacridar não alterou de maneira pronunciada as características do nanocarreador, conforme pode ser observado na Tabela 6. Houve um pequeno aumento do tamanho com a incorporação de ceramida, mas esse aumento não foi significativo (p > 0,05).

Tabela 6: Tamanho e potencial zeta dos nanocarreadores obtidos mediante incorporação dos fármacos paclitaxel (0,25%), ceramida C6 (0,4%) ou diclofenac sódico (1%) e do inibidor do transportador glicoproteína P elacridar (0,05%).

	Tamanho	PDI	Potencial
	(nm)		zeta (mV)
Paclitaxel	47,3 ± 3,6	0,22 ± 0,02	+10,3 ± 1,1
Ceramida C6 Amanda	65,7 ± 9,7	0,24 ± 0,01	+7,8 ± 2,0
Diclofenaco sódico	42,5 ± 4,0	0,26 ± 0,08	+ 9,3 ± 1,5
Elacridar	39,7 ± 0,3	0,20 ± 0,01	+8,5 ± 1,1

[039]	0 tamanho e potencial zeta foram obtidos após
diluição na	proporção de 1:10 (v/v) com água em cubeta
descartável.	Para medida do potencial zeta foi utilizado
dip cell.	As mediadas foram realizadas em duplicatas

utilizando dois lotes de cada formulação.

[040] Determinado o protocolo de obtenção do nanocarreador e a possibilidade de incorporação de fármacos, passamos a avaliar a eficácia de formulações selecionadas. Primeiramente, avaliamos a citotoxicidade da formulação vazia, ou seja, sem fármaco. O objetivo foi avaliar a influência da presença de tributirina sobre a citotoxicidade da formulação (FIG. 4), já que este triglicerídeo é citotóxico em algumas linhagens tumorais. A formulação sem

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24/36 tributirna foi obtida mediante substituição deste por tricaprilina, de modo que a composição da fase oleosa foi monoleina:tricaprilina 1:4 (m/m). Pode-se observar na Figura 4 que, em concentrações baixas (até 1 mg/mL), a citotoxicidade do nanocarreador com e sem tributirina aproxima-se da curva do PBS, indicando que ambas são pouco tóxicas às células. Em contrapartida, quando em concentrações acima de 1 mg/mL, ambas as nanoemulsões apresentam aumento da citotoxicidade, sendo aquela na qual a tributirina está presente significativamente mais tóxica (p < 0,05), indicando a influência do triglicerideo sobre esta propriedade da formulação.

[041] Uma vez analisado o perfil citotóxico da nanoemulsão e a influência da presença de tributirina, foi avaliada sua influência sobre a citotoxicidade do fármaco Ceramida C6. Os resultados obtidos são demonstrados na FIG. 5.

[042] Nota-se que a concentração de ceramida C6 em solução de DMSO necessária para reduzir a viabilidade celular para 50% (EC50) foi 26 μΜ. Quando o fármaco foi incorporado no nanocarreador sem tributirina, observou-se um deslocamento da curva de citotoxicidade para a esquerda, demonstrando que menores concentrações de ceramida são necessárias para o efeito citotóxico. A redução da viabilidade celular para 50% foi obtida com uma concentração de ceramida aproximadamente quatro vezes menor quando da sua incorporação na nanoemulsão sem tributirina. Esses resultados sugerem que o nanocarreador melhora o uptake celular do agente tumoral, quer seja por facilitar a penetração através da membrana plasmática em decorrência da desorganização propiciada por tensoativos presentes na

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25/36 formulação, quer seja por facilitar outros mecanismos de internalização. A combinação de tributirina e ceramida na formulação resultou em novo aumento da citotoxicidade e a concentração de ceramida necessária para redução da viabilidade celular para 50% (EC50) foi reduzida para 2,5 μΜ. Note que esse efeito ocorreu em concentrações em que a nanoformulação (sem fármaco) com ou sem tributirina apresentaram citotoxicidade semelhante; assim, ele não poder ser atribuído à formulação vazia. De maneira semelhante, a EC50 da tributirina também foi reduzida quando da sua associação com ceramida (~12 vezes) . Os valores de EC50 estão descritos na Tabela 7. O sinergismo entre tributirina e ceramida foi avaliado através do cálculo do índice combinatório (Cl, Chou TC et al., 2005), que estima quantitativamente efeitos de adição (CI=1), sinergismo (CI<1) e antagonismo (CI>1) entre dois compostos. Tendo em vista que o cálculo do Cl resultou em um número menor do que 1 (0,48), concluímos que o aumento da citotoxicidade de ceramida promovido pela sua encapsulação em NE contendo tributirina é decorrente de uma interação sinérgica entre os dois componentes.

Tabela 7 : Comparação entre os valores de EC50 referentes às diferentes combinações de ceramida, nanoemulsão e tributirina.

Composto	EC50
NE sem tributirina	> 16 mg/mL
NE com tributirina	3,2 mg/mL
Tributirina incorporada à NE	450 μΜ
Tributirina incorporada à NE com ceramida	37,5 μΜ
Solução de ceramida	26 μΜ

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Ceramida incorporada à NE sem tributirina	6,4 μΜ
Ceramida incorporada à NE com tributirina	2,5 μΜ

[043] Em seguida, foi avaliada a habilidade da nanoemulsão de incorporar elacridar, um inibidor de glicoproteina P (P-gp) de terceira geração, analisando-se em paralelo seu potencial de inibição do transportador. A P-gp é parte da família dos transportadores ABC, um dos mais importantes transportadores de efluxo. Ela é caracterizada por usar a energia da hidrólise do ATP para fazer o transporte de moléculas pelas membranas biológicas, sendo responsável por proteger a célula de componentes citotóxicos, transportando-os para o meio extracelular contra o gradiente de concentração. A superexpressão desse transportador por células tumorais é comumente descrita como um dos fatores que levam ao desenvolvimento de resistência pelos tumores a quimioterápicos. Considerando que diversos quimioterápicos são substratos de P-gp, a possibilidade de incorporação de inibidores do transportador no nanocarreador amplia o leque de funções da formulação, permitindo potencial reversão da resistência tumoral. Para avaliar a possiblidade de inibição, foi determinado o consumo de ATP pelo transportador na presença do nanocarreador com e sem elacridar. Como pode-se observar na FIG. 6, a nanoformulação contendo elacridar diminuiu o consumo de ATP pelo transportador em aproximadamente 2,6 vezes comparado ao sistema sem elacridar, o que sugere sua inibição. Em maior concentração, houve inibição do transportador independentemente da presença do elacridar, o que provavelmente decorre do efeito de polisorbato e monoleína, já que ambos excipientes apresentam capacidade de inibir o

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27/36 transportador em elevadas concentrações. Esses resultados indicam que o nanocarreador contendo elacridar é capaz de inibir a P-gp em concentração 2-vezes inferior à formulação sem elacridar, demonstrando a vantagem da incorporação do inibidor para uma potencial reversão de resistência tumoral.

[044] Para que as formulações tenham aplicabilidade, é necessário garantir que elas não provoquem irritação ao local de aplicação e tecido mamário em geral. Utilizamos o modelo HET-CAM para avaliar o potencial irritativo de nanocarreadores ao sítio de administração. O método se baseia na observação de que a membrana corioalontoide de ovos embrionados de galinha se assemelha à mucosa vascularizada dos olhos e a outros tecidos, sendo utilizada como modelo para avaliação da irritação ocular, cutânea e de efeitos no sítio de administração resultantes da administração parenteral. Observa-se hemorragia, lise vascular e coagulação após cinco minutos de aplicação da formulação, e obtém-se uma escala que considera os fenômenos observados. Formulações selecionadas foram avaliadas em ovos fertilizados de galinha da raça Leghorn, pesando entre 50 e 60 gramas. A membrana corioalontoide dos ovos foi exposta ao nanocarreador (0,1 mL) , controle positivo (NaOH 0,1 M) e negativo (salina), e o desenvolvimento de hemorragia, lise vascular e coagulação foi avaliado (protocolo aprovado pelo comitê de ética do ICB-USP, sob número 70/2016). A FIG. 7 mostra imagens da membrana tratada por até 5 min. Durante esse período, o NaOH gerou hemorragia, lise e coagulação, o que está de acordo com a literatura, enquanto que nenhuma alteração foi observada para a salina e o nanocarreador. Com base na ausência de alterações, acreditamos que a formulação

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28/36 proposta é segura para administração.

[045] Finalmente, foi avaliado se a administração intraductal permite localização do composto encapsulado ou se este é rapidamente distribuído sistemicamente. Avaliouse por imageamento in vivo o destino de um marcador fluorescente (Alexa Flúor) após administração intraductal comparado à administração sistêmica. As ratas foram anestesiadas com isofluorano (2%) , e a camada de queratina que recobre a superfície da mama foi retirada com gaze embebida em álcool, expondo o orifício do dueto. Os duetos mamários foram canulados com agulha de 33 G acoplada a uma microseringa e cada mama recebeu 2 0 pL da nanoemulsão contendo 0,05% (m/m) do marcador Alexa Flúor 647 (protocolo aprovado pelo CEUA ICB-USP sob número 69/2016). A distribuição do marcador foi avaliada por até 12 0 h após administração intraductal ou intraperitoneal (IP). Observouse a localização de marcador fluorescente no tecido mamário por até 120 h quando da administração do nanocarreador por via intraductal (FIG. 8) , enquanto que a administração intraperitoneal resultou em fluorescência dispersa, que desapareceu em 24 h, demonstrando que a ausência de direcionamento para o tecido mamário quando da administração sistêmica.

Preparação dos nanocarreadores [046] Os componentes da fase oleosa foram pesados, misturados, e adicionados ao tensoativo. Após fusão e mistura desses componentes, foi adicionada a fase aquosa. Dois tipos de protocolo foram realizados, a fim de identificar como a quitosana (modificador de superfície para conferir carga positiva e bioadesividade) deveria ser adicionada:

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- Protocolo 1: adição da fase aquosa (total de 66%) em duas metades, umas delas composta por uma solução de aquosa de quitosana (1%) e a outra metade, solução aquosa de poloxamer (2%), sendo a solução de poloxamer adicionada imediatamente após a de quitosana. Essa divisão da fase aquosa foi realizada, pois, a dissolução da quitosana ocorre em pH<5; no entanto, desejamos um pH mais próximo de 6 para administração intraductal, conforme guiado pelo pH do leite materno. Se o poloxamer fosse dissolvido na mesma solução, o pH da dispersão final teria que ser corrigido, o que poderia afetar as propriedades de superfície (como a carga) do nanocarreador. Como controle, esse mesmo protocolo foi utilizado substituindo-se a solução de quitosana por água apenas.

- Protocolo 2: adição de fase aquosa (49,5%) composta apenas por solução aquosa de poloxamer (2%) . 0 restante (16,5%), representado por solução de quitosana a 2%, foi adicionado em etapa subsequente, ou seja, foi utilizada para incubação do nanocarreador já formado a fim de recobrir as gotículas. A incubação de nanocarreadores com solução de quitosana é o método mais empregado na literatura para modificação de superfície de carreadores com este polímero.

[047] A mistura da fase aquosa, oleosa e tensoativo foi imediatamente emulsifiçada utilizando vórtex (30 s), seguido de homogenizador manual a 10,000 rpm (30 s) , e subsequentemente sonicada por 20 min sob banho de gelo, com pulso de 58 s on e 30 s off. No protocolo 1, a preparação chegou ao fim. Já no protocolo 2, a dispersão obtida foi incubada sob agitação magnética por 30 min à temperatura

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30/36 ambiente com o restante da fase aquosa, composta por solução de quitosana (2%).

[048] A FIG. 1 e Tabela 8 mostram o tamanho da fase dispersa (ou interna) e potencial zeta do nanocarreador obtido de acordo com os protocolos 1 e 2.

Tabela 8: Influência da etapa de adição da quitosana sobre o tamanho e potencial zeta do nanocarreador cuja composição encontra-se na Tabela 2 (nanocarreador 1) . Os valores numéricos foram obtidos a partir dos gráficos da FIG. 1.

	Tamanho (nm)	PDI	Potencial zeta (mV)
Sem quitosana	33,2 + 0,8	0,12 + 0,01	-2,9 + 3,5
Com quitosana, Protocolo 1	46,3 + 0,7	0,19 + 0,002	±13,6 ± 0,6
Com quitosana, Protocolo 2	97,6 + 1,4	0,53 + 0,01	— 0,6 ± 0,8

[049] Como pode ser observado, nanocarreadores controle, obtidos conforme protocolo 1 mas sem quitosana, apresentaram tamanho inferior a 100 nm, e carga levemente negativa. Essas características foram alteradas mediante adição da quitosana de forma dependente do protocolo utilizado, ou seja, a etapa de adição da solução de quitosana mostrou-se determinante para as caraterísticas do sistema: a adição antes da sonicação conforme protocolo 1, originou gotícuias com distribuição monomodal, tamanho abaixo de 50 nm e potencial zeta de +13,6 ±0,6 mV (indicativo de sistema catiônico, C e D) . A adição após a sonicação, mediante incubação da quitosana com o nanocarreador conforme protocolo 2, originou partículas com distribuição bimodal

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31/36 (ou seja, duas populações com tamanho variando até quase 1000 nm) e levemente aniônicas (E e F) . Assim sendo, para obtenção do nanocarrador com as características desejadas, é necessária a inclusão de quitosana durante o processo de homogenização e dispersão da nanoemulsão. Isso representa uma modificação do método mais frequentemente empregado. Assim, por mostrar-se mais adequado, o protocolo 1 foi selecionado.

[050] Conforme mencionado, a adição de quitosana também foi importante para aumentar a viscosidade da formulação sem influenciar o comportamento reológico (FIG. 2) . Esse aumento da viscosidade também contribui para aumentar o tempo de permanência da formulação nos duetos comparado à uma solução de fármaco em água ou tampão sem modulares de viscosidade, mas sem dificultar a injeção. Além disso, conferiu propriedade bioadesiva ao nanocarreador, conforme alteração no tamanho e carga superficial (FIG. 3).

[051] Além de melhorar as características da formulação, facilitando a emulsificação, o polaxamer é capaz de aumentar a estabilidade estérica da nanoformulação; sendo uma molécula grande, ele impede a aproximação das gotículas e sua agregação. Isso é essencial para a estabilidade do nanocarreador, já que o potencial zeta do sistema não alcançou valores geralmente relacionados à alta estabilidade por repulsão elétrica (Tabela 6), ou seja, inferiores a -30 mV ou superiores a +30mV.

[052] Com base nos resultados apresentados até o momento, a nanoemulsão por si só representa uma nova formulação com características adequadas para administração intraductal de diversos tipos de compostos ativos.

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32/36 [053] A formulação é passível de obtenção (mediante uso do protocolo 1) com fármacos lipofílicos (como ceramida C6 ou paclitaxel, 0,25 e 0,4%, m/m) ou hidrofílicos (como diclofenaco sódico, 1% m/m) mediante solubilização destes na fase oleosa ou aquosa, respectivamente, previamente à emulsificação. É necessário garantir a solubilização dos fármacos antes da emulsificação, o que pode ser realizado mediante agitação em vórtex (como caso da ceramida e diclofenaco) ou sonicação em banho da fase oleosa (misturada ou não ao tensoativo, como no caso do paclitaxel) ou aquosa por 15-20 min. A adição destes compostos não alterou as características físico-químicas do nanocarreador. O fármaco de maior interesse aqui é a ceramida C6, mas esses resultados indicam que outros compostos, com características físicoquímicas diferentes, também podem ser incorporados.

[054] É importante ressaltar outro papel da tributirina na formulação: além de compor a fase oleosa e servir para solubilização de fármacos lipofílicos, ela potencializou a atividade citotóxica do agente anti-tumoral ceramida C6 (FIG. 5) . Quando o fármaco foi incorporado no nanocarreador sem tributirina, observou-se um deslocamento da curva de citotoxicidade para a esquerda comparado à solução do fármaco, demonstrando que a incorporação no nanocarreador, mesmo sem tributirna, promoveu redução da viabilidade de células tumorais para 50%, com uma concentração de ceramida menor (Tabela 1). Esses resultados sugerem que o nanocarreador melhora o uptake celular do agente tumoral. A inclusão de tributirina no nanocarreador resultou em novo aumento da citotoxicidade, e concentração de 2,5 μΜ foi suficiente para reduzir a viabilidade celular

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33/36 para 50%. A EC50 da tributirina também foi reduzida mais de 10 vezes mediante sua combinação com ceramdia C6. O cálculo do índice combinatório como proposto por Chou e colaboradores indica a ocorrência de sinergismo entre esses compostos.

[055] Além disso, é possível incorporar aditivos que confiram propriedades específicas ao nanocarreador. Aqui o inibidor de P-gp elacridar foi adicionado sem alterar as características da formulação (Tabela 6). Para tal, ele foi dissolvido em DMSO, o qual foi adicionado à mistura de fase oleosa e tensoativo. Para tal, 3 mg de elacridar foram dissolvidos em 300 mg de DMSO. A nanoemulsão foi preparada substituindo-se 5% da mistura fase oleosa-tensoativo pela solução de elacridar para uma concentração final do inibidor de 0,05%. A solução de elacridar foi sonicada por 15-20 min para solubilização antes da mistura com a fase oleosa e tensoativo. Alternativamente, a mistura pode ser sonicada para solubilização do elacridar antes da sonicação para emulsificação com a fase aquosa. Como pode ser observado na FIG. 6, a nanoformulação contendo elacridar diminuiu o consumo de ATP pelo transportador em aproximadamente 2,6 vezes comparado ao sistema sem elacridar, o que sugere sua inibição. Em maior concentração, houve inibição do transportador independentemente da presença do elacridar, o que provavelmente decorre do efeito de polisorbato e monoleína, já que ambos excipientes apresentam capacidade de inibir o transportador em elevadas concentrações. Esses resultados indicam que o nanocarreador contendo elacridar é capaz de inibir a P-gp em concentração 2-vezes inferior à formulação sem elacridar, demonstrando a vantagem da incorporação do inibidor para uma potencial reversão de

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34/36 resistência tumoral.

Possíveis alterações na composição/processo de obtenção

Composição: como tensoativos, podem ser utilizados outros polisorbatos, compostos da série Brij, vitamina E TPGS, sozinhos ou em combinação dependendo da fase oleosa selecionada. Alternativamente, podem ser utilizados tensoativos catiônicos para conferir carga às partículas, o que, além de melhorar a interação com o epitélio, melhora a repulsão elétrica, conferindo maior estabilidade à dispersão. Exemplos são os compostos de amônio quaternários e fosfolipídeos catiônicos como fosfatifdilestearilamina. Como fase oleosa, podem ser utilizados ácidos graxos, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, e ceramidas de longa cadeia alifática, incluindo as catiônicas (como fitoesfingosina). Na formulação utilizada nos ensaios, o composto responsável por conferir propriedade bioadesiva também conferiu carga positiva ao nanocarreador, mas essas propriedades podem ser conferidas por compostos diferentes. Compostos bioadesivos como ácido hialurônico ou alginato de sódio também podem ser utilizados em substituição à quitosana; nesse caso, um composto catiônico (tensoativo ou lipídio) deve ser adicionado à formulação para conferir carga positiva já que o ácido hialurônico é aniônico.

Processo: o tempo de sonicação deve ser padronizado de acordo com o tipo e potência do sonicador, bem como sistema tensoativo e fase oleosa. Além da sonicação, pode ser utilizado o processo de homogeneização sob alta pressão.

Fármacos: os ensaios de eficácia (citotoxicidade)

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35/36 foram realizados com ceramida C6, mas outros compostos podem ser incorporados sem alteração das características do sistema, como paclitaxel e diclofenaco de sódio. De maneira semelhante, outros agentes quimioterápicos e agentes quimiopreventivos podem ser utilizados.

Propriedades do nanocarreador [056] Três propriedades do referido nanocarreador são essenciais: o tamanho nanométrico, a bioadesão e a carga positiva.

[057] O tamanho nanométrico é essencial para não obstruir duetos e permitir contato íntimo com células doentes localizadas nos duetos, o que geralmente melhora o uptake de fármacos, principalmente, os de características físicoquímicas desfavoráveis (como alta massa molecular, logP acima de 4 ou abaixo de zero), comumente observadas em agentes anti-tumorais.

[058] A propriedade bioadesiva aumenta o tempo de permanência do nanocarreador nos duetos, que são considerados permeáveis, principalmente quando acometidos por doenças inflamatórias e tumores. O aumento do tempo de permanência do nanocarreador permite maior tempo de contato entre fármaco e lesões tumorais/pré-tumorais que se desenvolvem nos duetos, melhorando o uptake. Também permite liberação prolongada de fármacos utilizados no tratamento de doenças inflamatórias/infecciosas, reduzindo a frequência de administração.

[059] A carga positiva permite melhor interação com o epitélio, uma vez que o dueto mamário apresenta carga negativa devido, principalmente, às proteínas constituintes do tecido, tais como a mucina. Muitas delas, como a própria

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36/36 mucina, é superexpressa em tecidos tumorais; a interação eletrostática entre a carga negativa do epitélio e positiva do nanocarreador contribui para o aumento do tempo de permanência do nanocarreador nos duetos e melhor interação com as células.

[060] Ainda, a inclusão de um aditivo permitiu a inibição do transportador de eluxo de P-gp. Esse aditivo não é necessário para a estrutura do nanocarreador, mas amplia seu leque de funções.

[061] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims (19)

1. Nanocarreador emulsionado catiônico multifuncional, caracterizado pelo fato de compreender:

até 20% de uma fase oleosa;

de 60 a 95% de uma fase aquosa;

até 5% de um agente bioativo;

de 5 a 25% de uma mistura de tensoativos e cotensoativos;

até 1%, preferencialmente 0,5% de um composto catiônico; e até 1% de aditivos adicionais.

2. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de para a fase oleosa serem utilizados compostos apoiares selecionados do grupo consistindo em mono, di e triglicerideos e ácidos graxos de cadeia curta, média ou longa, preferencialmente, tributirina, tricaprilina e monoleina, óleos vegetais, ésteres de ácido graxos, preferencialmente, miristato de isopropila.

3. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de para a fase aquosa ser utilizada água, tampão fosfato, PBS ou soluções aquosas de fármacos.

4. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de opcionalmente misturar solventes polares, preferencialmente, propilenoglicol e glicerol em concentrações inferiores a 10% da massa total.

5. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de a solução aquosa de fármacos consistir em poloxamer 407 em concentrações entre 0,1 e 1%, preferencialmente 1%, e quitosana em concentrações entre 0,5

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2/4 e 1%, preferencialmente 0,5%.

6. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o agente bioadesivo ser selecionado do grupo consistindo preferencialmente em ácido hialurônico, quitosana, alginato de sódio e monoleina.

7. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o agente bioadesivo ser incorporado na fase aquosa, oleosa ou mistura de tensoativos durante a produção do nanocarreador, ou posteriormente na dispersão do nanocarreador pronto.

8. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a mistura de tensoativos ser selecionada do grupo consistindo em tensoativos biocompativeis, preferencialmente os fosfolipidios, e os não iônicos, preferencialmente os polisorbatos 60 ou 80, álcoois graxos etoxilados, preferencialmente os da série BRIJ e MIRJ), poloxamer, principalmente o 407, alquil poliglicosideos, ésteres de sorbitan, preferencialmente, monooleato, monoestearato e monopalmitato de sorbitan, e álcoois de alta massa molecular, preferencialmente monoestearato de glicerila e álcool cetilico.

9. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de opcionalmente serem associados co-tensoativos, preferencialmente glicerol e propilenoglicol.

10. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de os compostos catiônicos serem selecionados do grupo consistindo em compostos de amônio quaternários, preferencialmente cloreto de benzalcônio e DMAB (brometo de didocildimetilamônio), lipidios catiônicos,

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3/4 preferencialmente fosfoesfingosina, fosfolipídeos, principalmente fosfatifdilestearilamina, ceramidas de longa cadeia alifática, preferencialmente fitoesfingosina, e polímeros catiônicos, preferencialmente quitosana.

11. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de os compostos catiônicos serem adicionados na fase oleosa, aquosa ou mistura de tensoativos.

12. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado promotores direcionamento serem preferencialmente

13. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de os aditivos adicionais serem adicionados na fase oleosa, aquosa ou mistura de tensoativos.

14. Nanocarreador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de serem encapsulados os fármacos ceramida C6, paclitaxel e diclofenaco de sódio.

15. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de apresentar um tamanho entre 39,7 ± 0,3 e 65,7 ± 9,7 nm.

16. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de apresentar um índice de polidispersibilidade entre 0,20 ± 0,01 e 0,26 ± 0,08.

17. Nanocarreador, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de apresentar um potencial zeta entre +7,8 ± 2,0 e +10,3 ± 1,1 mV.

18. Uso do nanocarreador conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de

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4/4 ser para a administração de agentes quimioterápicos capazes de atuar na prevenção do desenvolvimento de tumores diretamente no dueto mamário.

19. Uso do nanocarreador, de acordo com a reivindicação

18, caracterizado pelo fato de reduzir a biodisponibilidade sistêmica do fármaco, aumentar sua concentração e captação tumoral e aumentar a retenção do fármaco nos duetos e a sua exposição tumoral.