BR102017011629A2 - nanomicelas formadas a partir do poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo destinadas ao tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos - Google Patents

Abstract

nanomicelas formadas a partir do poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo destinadas ao tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos . a presente invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica composta por nanomicelas formadas a partir de poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo destinadas ao tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos. a supracitada formulação farmacêutica é composta por sistemas nanométricos micelares formados pelo poloxamer conjugado ao metotrexato, que se posiciona na superfície micelar, e incorporados de fármacos hidrofóbicos antitumorais, em especial o etoposídeo, presente no núcleo hidrofóbico micelar. estas nanomicelas podem ser administradas pelas vias intraocular e/ou parenteral. a formulação pode ser internalizada pelas células tumorais que expressam transportadores de folatos e folatos reduzidos, devido à presença do metotrexato na superfície micelar. por ser um análogo do ácido fólico, o metotrexato funciona como um elemento de reconhecimento para as células tumorais. após a captação celular, o metotrexato e o etoposídeo são liberados para exercerem ação antitumoral específica. além disso, a exposição prolongada destes fármacos no interior da célula também garante a interrupção do ciclo celular. o poloxamer também exerce ação anti-proliferativa. a formulação proposta ainda promove efeito antitumoral especificamente nas células tumorais, o que leva à redução dos efeitos colaterais e/ou tóxicos sistêmicos decorrentes da quimioterapia. além disso, protege o etoposídeo incorporado de processos de degradação, devido às variações de ph, e garante o aumento da sua solubilidade nos fluidos biológicos, bem como a de outros agentes antineoplásicos que apresentam baixa solubilidade aquosa nos fluidos.

Description

NANOMICELAS FORMADAS A PARTIR DO POLOXAMER CONJUGADO AO METOTREXATO E INCORPORADAS DE ETOPOSÍDEO DESTINADAS AO TRATAMENTO DO RETINOBLASTOMA E OUTROS TUMORES MALIGNOS [01] A presente invenção consiste em uma formulação farmacêutica composta por nanomicelas formadas a partir de poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo, que podem ser administradas pelas vias intraocular e/ou parenteral, destinadas ao tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos, de modo a atuar especificamente nas células tumorais que expressam transportadores de folatos e folatos reduzidos. A especificidade na ação em células tumorais deve-se ao fato de que o metotrexato conjugado à superfície do poloxamer que forma as nanomicelas funciona como um elemento de reconhecimento às células tumorais que expressam os transportadores de folatos e folatos reduzidos. Uma vez internalizadas, as nanomicelas liberam o metotrexato e o etoposídeo para exercerem efeito antineoplásico específico nas células tumorais, além de garantir a exposição destes fármacos por tempo prolongado no interior das células, interrompendo o ciclo celular. A vetorização destes fármacos antitumorais e a especificidade na sua ação levam a redução dos efeitos colaterais e/ou tóxicos sistêmicos decorrentes da quimioterapia.

[02] A presente invenção também diz respeito a uma formulação farmacêutica composta por nanomicelas formadas a partir de poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo que permite proteger o etoposídeo de processos de degradação, devido às variações de pH, e garante o aumento da sua solubilidade nos fluidos biológicos, bem como a de outros agentes antineoplásicos que apresentam baixa solubilidade aquosa nos fluidos.

[03] O retinoblastoma é um tumor maligno primário devastador, originário da retina em desenvolvimento. O retinoblastoma acomete principalmente crianças e representa até 4% dos tumores malignos pediátricos (KISS, S.; LEIDERMAN,

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Y.; MUKAI, S. Diagnosis, classification, and treatment of retinoblastoma. International Ophthalmology Clinics, v.48, n.2, p.135, 2008; MELL, R.; RADHAKRISHNAN, V. BAKHSHI, S. Current therapy and recente advances in the management of retinoblastoma. Indian Journal of Medicai and Paediatric Oncology. v.33, n.2, p.80-88, 2012). A incidência mundial do retinoblastoma é de um caso em 15.000 a 20.000 nascidos vivos, correspondendo a cerca de 9.000 novos casos anualmente (DIMARAS, Η.; KIMANI, K.; DIMBA, E.A.; GRONSDAHL, P.; WHITE, A.; CHAN, H.S.; GALLIE, B.L. Retinoblastoma. Lancet, v.379 n.9824, p. 1436-1446, 2012); sendo que, em aproximadamente 42% dos casos, há óbito. A mortalidade varia por região. Na América do Norte, Europa e em outras nações desenvolvidas, há apenas 3% a 5% de mortalidade. Entretanto, em regiões menos desenvolvidas da África, a mortalidade pode alcançar taxas superiores a 70% (SHIELDS, C. L., SHIELDS, J. A. Intra-arterial chemotherapy for retinoblastoma: the beginning of a long journey. Clinicai and experimental ophthalmology. 38 ed. v.6. p. 638- 643, 2010).

[04] O desenvolvimento do retinoblastoma ocorre quando há perda, deleção, inativação ou mutação dos dois alelos correspondentes ao gene supressor do tumor (RB1), que está localizado no braço longo do cromossomo 13 (13q14) (SHIELDS, C., SHIELDS, J. Diagnosis and management of retinoblastoma. Câncer Control: Journal of The Moffitt Câncer Center.11 ed. v.5. p. 317-327, 2004). O gene RB1 codifica uma fosfoproteína nuclear (pRB). A falta de pRB, ou a sua inativação, remove a restrição exercida por esta fosfoproteína no controle do ciclo celular, levando a uma proliferação celular desregulada (RODRIGUEZ-GALINDO, Carlos; ORBACH, Darren B; VANDERVEEN, Deborah, Retinoblastoma, Pediatric Clinics of North América, v.62, p.201-223, 2015.). Quanto mais jovem for o paciente (menos de 1 ano de idade), maior a probabilidade do retinoblastoma se manifestar bilateralmente. Pacientes no segundo ou terceiro ano de vida apresentam a doença unilateral (ABRAMSON, D.H.; FRANK, C.M.; SUSMAN, M.; WHALEN,

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M.P.; DUNKEL, I.J.; BOYD, N.W. Presenting signs of retinoblastoma. The Journal of Pediatrics, v.132, p.505-508, 1998.) [05] A manifestação clínica mais comum do retinoblastoma é a leucocoria (reflexo pupilar anormal à luz incidente, podendo apresentar-se como branco, róseo ou amarelo esbranquiçado). O estrabismo é o segundo sinal mais comum e usualmente está correlacionado ao comprometimento macular. Os demais sinais e sintomas são atípicos, como vermelhidão, dor ocular causada por glaucoma secundário, córnea turva, visão deficiente, hemorragia vítrea ou sinais inflamatórios na órbita que mimetizam celulite orbital. Geralmente, esses sinais são tardios e estão associados ao estágio avançado da doença, à baixa taxa de sobrevivência e de preservação do olho (BALMER, A.; MUNIER, F.; ZOGRAFOS, L. Retinoblastoma: Diagnosis, Treatment and Prognosis. In: HAYAT, M.T. Methods of Cancer Diagnosis, Therapy, and Prognosis. New Jersey: Springer, 2009. cap.22, p.319-336. DIMARAS, H.; KIMANI, K.; DIMBA, E.A.; GRONSDAHL, P.; WHITE, A.; CHAN, H.S.; GALLIE, B.L. Retinoblastoma. Lancet, v.379 n.9824, p.1436-1446, 2012).

[06] O diagnóstico do retinoblastoma é usualmente feito por meio da avaliação da retina com a pupila dilatada e indentação escleral. A ultrassonografia bidimensional, tomografia computadorizada e ressonância magnética são utilizadas para avaliar a extensão extraocular do tumor e diferenciá-lo de outras causas de leucocoria (PARULEKAR, M.V. Retinoblastoma: current treatment and future direction. Early Human Development, v.86, n.10, p.619-625, 2010). Em caso de retinoblastoma endofítico, há o crescimento do tumor para o interior da cavidade vítrea. Já o retinoblastoma exofítico cresce no espaço subretiniano, causando progressivo descolamento da retina. Enfim, o diagnóstico da doença deve estar associado a detalhamentos acerca de número, localização e tamanho do tumor; bem como a existência de descolamento da retina e de fluido subretiniano.

[07] O tratamento do retinoblastoma envolve primariamente preservar a vida e a visão do paciente. Alguns fatores devem ser considerados de modo a

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4/26 definir o tratamento mais adequado, tais como a unilateralidade ou bilateralidade, os estágios endofítico, exofítico ou misto, o prognóstico visual e as condições clínicas do paciente (DIMARAS, H.; KIMANI, K.; DIMBA, E.A.; GRONSDAHL, P.; WHITE, A.; CHAN, H.S.; GALLIE, B.L. Retinoblastoma. Lancet, v.379 n.9824, p.1436-1446, 2012). A enucleação, radioterapia, termoterapia, crioterapia, fotocoagulação a laser e quimioterapia são as estratégias usadas para tratar este tumor ocular. Em geral, o tratamento do retinoblastoma envolve a administração de 4 classes de agentes quimioterápicos, dentre as quais citam-se: (1) agentes alquilantes (melfalano, ciclofosfamida), os quais provocam a formação de ligações intra-fita de DNA e reticulações, resultando em danos no DNA, que por sua vez, não pode ser transcrito; (2) inibidores da topoisomerase (etoposídeo, topotecan), os quais interagem com a topoisomerase II, formando um complexo, que induz quebras nas fitas de DNA e impede o seu reparo; (3) agentes antineoplásicos a base de platina (carboplatina), os quais se ligam as fitas de DNA, enrolando-as. Este DNA danificado sofre apoptose; (4) alcalóides da vinca (vincristina), que se ligam aos dímeros de tubulina, bloqueando a formação do fuso mitótico e inibindo a mitose. A combinação de diversos agentes quimioterápicos, que apresentam diferentes mecanismos de ação, é comum no tratamento deste tumor ocular. Estes pacientes frequentemente administram o regime quimioterápico combinado composto por vincristina, carboplatina e etoposídeo c. Estes fármacos quimioterápicos podem ser administrados por meio de infusões intra-arteriais e/ou injeções sistêmicas e intravítreas. As infusões intraarteriais envolvem um cateterismo transfemural com cateter de balão, que é avançado sob fluoroscopia para a origem da artéria oftálmica. Apesar de efetivas na redução do tumor, estas infusões devem ser frequentes, podendo provocar graves complicações, tais como eritema/edema das pálpebras, embolia da retina/coroide com vasculopatia oclusiva, hemorragia vítrea e vaso constrição cerebral (SHIELDS, C.L.; BIANCIOTTO, C.G.; JABBOUR, P.; GRIFFIN, G.C.; RAMASUBRAMANIAN, A.; ROSENWASSER, R.; SHIELDS

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J.A. Intra-arterial Chemotherapy for Retinoblastoma. American Academy of Ophthalmology, v.129, n.2, p.1407-1415, 2011. ABRUZZO, Todd et al, Pediatric Neurology Cerebral Vasoconstriction Triggered By Sympathomimetic Drugs During Intra-atrerial Chemotherapy, Pediatric Neurology, v. 48, n. 2, p. 139-142, 2013. MUNIER, F. L.; BECK-POPOVIC, M.; BALMER, A.; GAILLARD, M.; BOVEY, E.; BINAGHI, S. Occurrence of sectoral choroidal occlusive vasculopathy and retinal arteriolar embolization after superselective ophthalmic artery chemotherapy for advanced intraocular retinoblastoma. The Journal of Retinal and Vitreos Diseases, v.31, n.3, p. 566-573, 2011). As injeções parenterais sistêmicas nem sempre permitem a difusão de concentrações terapêuticas dos agentes quimioterápicos no segmento posterior do olho, devido à existência da barreira hemato-retiniana, que oferece um obstáculo ao transporte sistêmico dos fármacos para o interior do olho (SHORT, Brian, Safety Evaluation of Ocular Drug Delivery Formulations:, Toxicologic Pathology, v. 36, n.1, p.49-62, 2008. Como consequência, efeitos colaterais e/ou tóxicos sistêmicos decorrentes da quimioterapia serão desenvolvidos.

[08] Como alternativa, as injeções intravítreas podem ser administradas por meio de agulhas de 32 gauge numa seringa de tuberculina. Esta agulha deve ser congelada com um crioprobe à medida que ela é removida do olho, a fim de prevenir a distribuição de células tumorais nos tecidos oculares em contato direto com a agulha (MUNIER, F. L.; SOLIMAN, S.; MOULIN, A.P.; GAILLARD, M.; BALMER, A.; BECK-POPOVIC, M. Profiling safety of intravitreal injections for retinoblastoma using an anti-reflux procedure and sterilisation of the needle track. British Journal of Ophthalmology, v.96, n.8, p.1084-1087, 2012). Além desta técnica de injeção intravítrea, novas técnicas vêm sendo desenvolvidas, de modo a torná-las extremamente seguras para a administração de fármacos quimioterápicos destinados ao tratamento do retinoblastoma (GROSSNIKLAUS, Hans E, Retinoblastoma. Fifty Years of Progress. The LXXI Edward Jackson Memorial Lecture, American Journal of Ophthalmology,

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v.158, n. 5, p.875-891.e1, 2014.), e consequentemente evitar a disseminação das células cancerígenas nos tecidos oculares não comprometidos. Entretanto, a rápida depuração dos fármacos quimioterápicos administrados por meio das injeções intravítreas conduz à necessidade de repetidas administrações, o que pode provocar danos físicos aos tecidos oculares, bem como toxicidade ocular, descolamento da retina, hemorragia vítrea, endoftalmites e aumento da pressão intraocular.

[09] Diante do cenário exposto, o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos quimioterápicos para tratar o retinoblastoma, bem como outros tumores malignos, torna-se necessário, para que se possa eliminar/minimizar as desvantagens apresentadas por estes fármacos quando administrados por meio das formas farmacêuticas convencionais. Esses sistemas de liberação podem ser injetados diretamente no local de ação, promovendo a biodisponibilidade total do fármaco encapsulado. Dessa forma, elimina-se a difusão através da barreira hemato-retiniana, a qual limita a permeação do fármaco no segmento posterior do olho. Esses sistemas de liberação de fármacos podem aumentar a solubilidade de fármacos quimioterápicos pouco solúveis em água, contribuindo também para o aumento da sua biodisponibilidade ocular. Além disso, não há distribuição sistêmica do fármaco quimioterápico, minimizando/eliminando os efeitos colaterais e tóxicos que podem surgir devido ao acometimento de diferentes órgãos do organismo humano. Esses sistemas podem controlar a liberação do fármaco incorporado em doses terapêuticas, por tempo prolongado, o que reduz a frequência de administrações, minimizando/eliminando os danos físicos aos delicados tecidos oculares, bem como outras complicações oculares advindas das repetidas injeções intravítreas (descolamento da retina, endoftalmites, aumento da pressão intraocular, hemorragia vítrea, dentre outras). Esses sistemas de liberação de fármacos podem ser elaborados por meio de polímeros biodegradáveis de diferentes massas moleculares, os quais permitem ajustar a velocidade de liberação destes agentes em doses terapêuticas efetivas.

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Adicionalmente, sistemas compostos por polímeros biodegradáveis não precisam ser removidos do segmento posterior do olho após a depleção do agente quimioterápico, e os seus produtos de degradação biocompatíveis não irão induzir reações inflamatórias e/ou imunológicas no olho. Finalmente, caso estes sistemas de liberação de fármacos quimioterápicos apresentem dimensões nanométricas e elementos superficiais de reconhecimento pelas células tumorais, além das vantagens previamente descritas, estes nanosistemas oferecem a vantagem adicional de poderem ser internalizados e exercerem a sua atividade antitumoral especificamente na célula alvo.

[010] Os sistemas nanométricos de liberação de fármaco quimioterápico contendo elemento superficial de reconhecimento podem ser representados pelas nanomicelas compostas pelo poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo.

[011] As micelas poliméricas são estruturas que se organizam espontaneamente num formato esferoidal, devido à presença de um domínio hidrofílico e um domínio hidrofóbico no copolímero precursor. Os domínios hidrofílico e hidrofóbico são unidades monoméricas diferentes do copolímero, que em meio aquoso, se organizam de modo a expor o domínio hidrofílico, enquanto que o domínio hidrofóbico se mantém no núcleo micelar (MIYATA, K.; CHRISTIE, R. J.; KATAOKA, K., Polymeric micelles for nano-scale drug delivery. Reactive and Functional Polymers, v.71, n.3, p.227-234, 2011. VADLAPUDI, A. D.; MITRA, A. K. Nanomicelles: an emerging platform for drug delivery to the eye. HHS Public Access, v. 4, n. 1, p. 1-3, 2015). As condições de formação das micelas permitem reduzi-las ao tamanho nanométrico.

[012] O poloxamer é um copolímero anfifílico formado por unidades monoméricas não iônicas de óxido de etileno (EO) e de óxido de propileno (PO) dispostas em uma estrutura tri-bloco EOX-POY-EOX. Possui fórmula molecular HO[CH2-CH2O]X[CH(CH3)-CH2O]Y[CH2-CH2O]XOH, em que a estrutura central é hidrofóbica e as estruturas laterais são hidrofílicas (ALBERTINI, B.; PASSERINI, N.; SABATINO, M.; MONTI, D.; BURGALASSI,

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S.; CHETONI, P.; RODRIGUEZ, L. Poloxamer 407 microspheres for orotransmucosal drug delivery. Part II: In vitro/in vivo evaluation, International Journal of Pharmaceutics, v.400, n.1-2, p.32-36, 2010. REN, J.; FANG, Z.; YAO, L.; DAHMANI, F.Z.; YIN, L.; ZHOU, J.; YAO, J. A micelle-like structure of poloxamer-methotrexate conjugates as nanocarrier for methotrexate delivery, International Journal of Pharmaceutics, v.487, n.1-2, p. 177-186, 2015). Portanto, em meio aquoso, o poloxamer se organiza em micelas. As condições de formação das micelas de poloxamer permitem reduzi-las ao tamanho nanométrico.

[013] Os blocos de poli (óxido etileno) do poloxamer na superfície micelar conferem estabilização estérica a estas micelas quando em contato com a circulação sanguínea, já que o processo de opsonização e absorção por macrófagos do sistema reticular endotelial é reduzido/eliminado. Como resultado, há o aumento do tempo de circulação destas micelas, favorecendo a sua passagem para a região tumoral (BATRAKOVA, E. V.; KABANOV, A. V. Pluronic block copolymers: Evolution of drug delivery concept from inert nanocarriers to biological response modifiers. Journal of Controlled Release, v.130, n.2, p.98-106, 2008. DUMORTIER, G.; GROSSIORD, J.L.; AGNELY, F.; CHAUMEIL, J.C. A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics, Pharmaceutical Research, v.23, n.12, p.2709-2728, 2006. REN, J.; FANG, Z.; YAO, L.; DAHMANI, F.Z.; YIN, L.; ZHOU, J.; YAO, J. A micelle-like structure of poloxamer-methotrexate conjugates as nanocarrier for methotrexate delivery, International Journal of Pharmaceutics, v.487, n.1-2, p.177-186, 2015).

[014] Recentemente, foram desenvolvidas micelas compostas por uma mistura de poloxamer (Pluronic P123 e F127) e paclitaxel, um fármaco quimioterápico, visando o tratamento do câncer. A mistura de poloxamer aumentou significativamente a estabilidade das micelas contendo paclitaxel. As micelas apresentaram diâmetro equivalente a 25 nm e permitiram a liberação sustentada do paclitaxel quando comparada à liberação deste mesmo fármaco

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9/26 presente no Taxol®. O estudo de citotoxicidade in vitro contra células do adenocarcinoma pulmonar (linhagens SPC-A1 e A-549) demonstrou que a concentração inibitória de 50% das células (IC50) do paclitaxel incorporado nas micelas (0,1 pg mL^-1) foi muito inferior a IC50 do Taxol® (0,4 pg mL^-1) e do paclitaxel livre (1,7 pg mL^-1) (WEI, Z.; HAO, J.;YUAN, S.; JUAN, W.; SHA, X.; FANG, X. Paclitaxel-loaded Pluronic P123/F127 mixed polymeric micelles: Formulation, optimization and in vitro characterization. International Journal of Pharmaceutics, v. 376, n.1-2, p.176-185, 2009). Sugere-se, portanto, que as micelas foram internalizadas pelas células tumorais, permitindo que o paclitaxel atuasse diretamente no seu sítio ativo. Deste modo, a concentração necessária para inibir estas células foi reduzida quando comparada a concentração do paclitaxel não vetorizado. Adicionalmente, o poloxamer também pode ter exercido ação antineoplásica após internalização das micelas pelas células tumorais.

[015] Adicionalmente, a patente US 8,460,644 B2 (MEADOWS, J.; DWYER, C.M. Synergistic mixed poloxamer systems for the solubilisation of drugs. US 8460644 B2. 04 jun. 2010, 11 jun. 2013) descreve a utilização de dois tipos de poloxamer (P407 e P188) misturados em diferentes proporções, os quais permitiram a incorporação de fármacos pertencentes a classes terapêuticas diversas (antiesquizofrênicos, anestésicos locais e anti-séptico). O sinergismo dos poloxamer favoreceu a solubilização destes fármacos, considerados insolúveis ou pobremente solúveis em água. Portanto, a mistura de poloxamer favoreceu a solubilização destes fármacos devido à sua encapsulação no interior das micelas, as quais podem ser administradas pela via parenteral por meio de injeções. A patente CN 102626518 B (Preparation and application of insoluble drug-entrapped poloxamer/amphiphilic polysaccharide mixed micelle) descreve uma formulação constituída por uma mistura de micelas formadas a partir do poloxamer e de polissacarídeo anfifílico incorporadas de fármacos quimioterápicos insolúveis em água, especialmente o paclitaxel, o camptotecina e o tamoxifeno, que podem ser administradas por meio de

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10/26 cápsulas, comprimidos, pílulas e outras formas farmacêuticas orais. A presença do polissacarídeo anfifílico aumenta a estabilidade das micelas de poloxamer. A administração destes fármacos incorporados nestas micelas pela via oral leva a redução da irritação do trato gastrointestinal, aumento da estabilidade do fármaco administrado e aumento da biodisponibilidade devido à endocitose das micelas pelas células intestinais, redução do efluxo pelo sistema das glicoproteínas P e redução do metabolismo pelo citocromo P450. Portanto, micelas de poloxamer associadas ao polissacarídeo anfifílico levam à melhoria de diversos parâmetros físico-químicos e farmacocinéticos de fármacos quimioterápicos insolúveis em água.

[016] Além da utilização do poloxamer na elaboração de sistemas de liberação de fármacos nanométricos e também para a solubilização e veiculação de fármacos de baixa solubilidade aquosa, este polímero vem sendo associado, por meio de ligações covalentes, aos fármacos, para que diversas aplicações. O grupo alcoólico (-OH) terminal livre existente no poli (óxido etileno) do poloxamer pode reagir com um ácido orgânico, como por exemplo, o ácido carboxílico (-COOH), gerando um grupo alcoxila (-OR). Esta reação de esterificação é lenta, sendo necessária a catálise ácida, o aumento da temperatura do meio reacional e condições anidras (SKORONSK, E.; JOAO, J.J.; CECHINEL, M.A.P.; FERNANDES, M. Otimização da esterificação de ácido hexanóico com n-butanol empregando lipase imobilizada em gelatina. Quimica Nova, v. 36, n. 10, p. 1605-1609, 2013). Um método de síntese de ésteres comumente empregado baseia-se na utilização de diciclohexilcarbodiimida (DCC) como reagente de acoplamento entre o derivado de ácido carboxílico e o álcool que se deseja esterificar. Associado ao DCC, pode-se acrescentar também o 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) ao meio reacional, que atua como catalisador nucleofílico acelerando a reação de esterificação (BRINKERHOFF, R. C. Síntese de β-cetoésteres graxos a partir do ácido de Meldrum usando DCC e DMAP. p. 82, 2014. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande,

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2014. COSTA, P. et al. Substâncias carboniladas e derivados. Porto Alegre: Bookman, p. 412, 2006). Neste contexto, o álcool terminal livre existente no poli (óxido etileno) do poloxamer pode reagir com o ácido carboxílico existente na molécula do metotrexato, gerando uma alcoxila. Esta esterificação pode ser iniciada por meio da reação entre o ácido carboxílico do metotrexato e o DCC. Forma-se um produto intermediário, que por sua vez, reage com o Nhidroxisuccinimida (NHS), gerando o éster-NHS e o dicicloexiluréia. Em seguida, por adição nucleofílica, o éster-NHS reage com o DMAP, levando à saída do NHS e à formação de um produto intermediário eletrofílico. Este último produto reage com o álcool terminal livre existente no poli (óxido etileno) do poloxamer, formando o poloxamer esterificado com o metotrexato (REN, J.; FANG, Z.; YAO, L.; DAHMANI, F.Z.; YIN, L.; ZHOU, J.; YAO, J. A micelle-like structure of poloxamer-methotrexate conjugates as nanocarrier for methotrexate delivery, International Journal of Pharmaceutics, v.487, n.1-2, p.177-186, 2015).

[017] O poloxamer conjugado ao metotrexato pode ser utilizado na elaboração de nanomicelas as quais este fármaco fica exposto na superfície micelar, de modo a funcionar como um elemento de reconhecimento às células tumorais. Adicionalmente, após a internalização das nanomicelas pelas células tumorais, o metotrexato conjugado ao polímero pode ser libertar no citoplasma celular, e exercer sua ação antineoplásica especificamente.

[018] O metotrexato (4-amino-4-desoxi-N-10-metilfolato) é um fármaco antineoplásico utilizado no tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos (KIVELÃ, T.; ESKELIN, S.; PALOHEIMO, M.;, Intravitreal Methotrexate for Ophthalmology, Ophthalmology, v. 118, n. 8, p. 1689e6, 2011.). O metotrexato, um análogo do ácido fólico, entra nas células por meio de transporte ativo para folatos reduzidos e inibe a enzima di-hidrofolato redutase (DHFR), que por sua vez, catalisa a conversão do ácido fólico aos tetrahidrofolatos. Dessa forma, as células tornam-se carentes de folatos reduzidos, o que leva à inibição da biossíntese dos ácidos nucléicos

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12/26 necessários à síntese de DNA e de RNA. Concomitantemente à inibição da síntese dos ácidos nucléicos, interrompe-se a fase S do ciclo celular e também se posterga a transição da fase G2 para a fase S (FERNANDES, B. F. et al. Local chemotherapeutic agents for the treatment of ocular malignancies. Survey of ophthalmology, v. 59, p. 97-114, 2014). Adicionalmente, nas células carentes de folatos reduzidos, há a inibição da conversão da glicina em serina e de homocisteína em metionina, o que compromete a síntese de enzimas relacionadas à formação e ao reparo do DNA (CHEN, Y.; TSAI, C.; HUANG, P.; CHANG, M.; CHENG, P.; CHOU, C.; CHEN, D.; WANG, C.; SHIAU, A.; WU, C. et al. Methotrexate Conjugated to Gold Nanoparticles Inhibits Tumor Growth in a Syngeneic Lung Tumor Model. Molecular Pharmaceutics, v. 4, n. 5, p. 713-722, 2007). Portanto, células malignas, que são ativamente proliferativas, expressam maiores quantidades de receptores de folatos quando comparadas às células normais, de modo que se tornam especialmente sensíveis às ações farmacológicas do metotrexato.

[019] Especifica-se que as células do retinoblastoma humano e de outros tumores malignos, incluindo as dos tumores sólidos, da leucemia linfocítica, coriocarcinoma, osteosarcoma, câncer de mama, dentre outras, apresentam grande número de receptores de folatos e carreadores de folatos reduzidos em suas membranas plasmáticas que internalizam o ácido fólico. O receptor de folato é uma proteína ancorada na membrana plasmática celular com massa equivalente a 38 a 40 kDa. Este receptor interage com o ácido fólico mais eficientemente do que com os folatos reduzidos. O carreador de folato reduzido é um transportador bidiorecional com 12 domínios transmembrana que exige alta afinidade pelos folatos reduzidos e moderada a baixa afinidade pelos folatos não reduzidos (KANSARA, V.; PATURI, D.; LUO, S.; GAUDANA, R.; MITRA, A. Folic acid transport via high affinity carrier-mediated system in human retinoblastoma cells, International Journal of Pharmaceutics, v. 355, p. 210-219, 2008). Considerando que o ácido fólico é essencial no crescimento, diferenciação e duplicação celular, o grande número de

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13/26 transportadores de folatos e folatos reduzidos na membrana das células tumorais é essencial para a sobrevivência e multiplicação celular. Diante do exposto, o contato do metotrexato, um análogo do ácido fólico, com estes transportadores, resulta em sua ávida internalização pelas células tumorais. [020] Apesar da reconhecida aplicabilidade do metotrexato no tratamento do câncer humano, quando administrado por meio de formas farmacêuticas convencionais, altas doses deste fármaco são necessárias, provocando graves efeitos adversos e/ou tóxicos e resistência celular. Portanto, a especificidade do metotrexato é essencial para aumentar o perfil de segurança deste fármaco, a sua eficácia terapêutica e a adesão do paciente à terapia (JUNYAPRASERT, V.; DHANAHIRANPRUK, S.; SUKSIRIWORAPONG, J.; SRIPHA, K.; MOONGKARNDI, P. Enhanced toxicity and cellular uptake of methotrexateconjugated nanoparticles in folate receptor-positive cancer cells by decorating with folic acid-conjugated d - α -tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 136, p. 383-393, 2015). Neste contexto, nanopartículas contendo o metotrexato fisicamente encapsulado têm sido elaboradas; entretanto estas nanopartículas não controlam a liberação do fármaco, de modo que, em poucas horas, concentrações elevadas do metotrexato são lixiviadas (KANG, H.; KIM, J.D.; HAN, S.H.; CHANG, I.S. Selfaggregates of poly(2-hydroxyethyl aspartamide) copolymers loaded with methotrexate by physical and chemical entrapments. J Control Release,.v. 17;81(1-2), p. 135-144, 2002). A fim de se eliminar esta desvantagem, uma abordagem a ser utilizada consiste na conjugação do metotrexato ao polímero sintético usado na elaboração do sistema de liberação nanométrico. Esta conjugação baseia-se numa ligação covalente, a qual pode ser obtida, por exemplo, por meio de reações de esterificação. A ligação covalente do metotrexato ao polímero impede a sua liberação diretamente na circulação sanguínea, permitindo que o fármaco atinja o órgão ou tecido cancerígeno e atua especificamente. A conjugação do metotrexato ao polímero também garante a interação deste fármaco com os transportadores de folato

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14/26 presentes na membrana plasmática das células cancerígenas, e este reconhecimento conduz à internalização do sistema nanométrico de liberação de fármacos, aumentando, conseqüentemente, o perfil de segurança do metotrexato e sua eficácia terapêutica.

[021] Junyaprasert e colaboradores (JUNYAPRASERT, V.; DHANAHIRANPRUK, S.; SUKSIRIWORAPONG, J.; SRIPHA, K.; MOONGKARNDI, P. Enhanced toxicity and cellular uptake of methotrexateconjugated nanoparticles in folate receptor-positive cancer cells by decorating with folic acid-conjugated d - α -tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate.

Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 136, p. 383-393, 2015) elaboraram nanopartículas complexas, as quais foram conjugadas com o metotrexato e decoradas com succinato de D-a-tocoferol polietileno glicol 1000 associado ao ácido fólico. Observou-se que as nanopartículas conjugadas com 10% de metotrexato e decoradas apresentaram maior captação e toxicidade contra as células de câncer de mama (MCF-7), que expressam transportadores de folatos, do que as nanopartículas conjugadas com 20% de metotrexato e decoradas e as nanopartículas não decoradas. Finalmente, demonstrou-se que as nanopartículas conjugadas com metotrexato e decoradas atuaram especificamente contra as células tumorais, já que foram internalizadas devido à presença do metotrexato ligado ao polímero e também do ácido fólico. Neste caso, o metotrexato funcionou como um elemento de reconhecimento para as células tumorais, e uma vez internalizado, também atuou como fármaco antineoplásico.

[022] Na Patente CN 101991860 B, expirada em 28 de dezembro de 2016, (REN, J.; FANG, Z.; HOU, L.; ZHOU, J.; YAO, J. Poloxamer-carboxylic acid drug conjugate and preparation method and application thereof. CN 101991860 B. 8 nov. 2010, 19 jun. 2013) vem descrita a seguinte invenção: o álcool terminal livre do poloxamer foi conjugado com fármacos que apresentam um ácido carboxílico (metotrexato, ácido trans-retinóico, rosuvastatina, gatifloxacino, dentre outros), gerando um grupo alcoxila e caracterizando uma

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15/26 reação de esterificação. Este poloxamer conjugado com o metotrexato foi utilizado por Ren e colaboradores (REN, J.; FANG, Z.; YAO, L.; DAHMANI, F.Z.; YIN, L.; ZHOU, J.; YAO, J. A micelle-like structure of poloxamermethotrexate conjugates as nanocarrier for methotrexate delivery, International Journal of Pharmaceutics, v.487, n.1-2, p.177-186, 2015) para a formação de nanomicelas, as quais encapsularam fisicamente o próprio metotrexato. A liberação controlada do metotrexato por estes sistemas mostrou um perfil bifásico. Na primeira fase, o metotrexato fisicamente encapsulado apresentou rápida lixiviação. Na segunda fase, o metotrexato conjugado ao poloxamer sofreu hidrólise na ligação éster, libertando-se para o meio de forma sustentada. Portanto, a liberação do fármaco pode ser controlada de modo a garantir a liberação de concentrações terapêuticas deste fármaco por período prolongado e reduzir a toxicidade deste fármaco. Estudos farmacocinéticos in vivo demonstraram que a biodisponibilidade e meia vida do metotrexato foi significantemente aumentada quando este fármaco foi administrado por meio das nanomicelas conjugadas e incorporadas pelo metotrexato, sugerindo uma melhoria no perfil farmacocinético do metotrexato.

[023] Além do metotrexato, outros fármacos anticancerígenos são utilizados no tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos, dentre os quais cita-se o etoposídeo. O etoposídeo é um derivado semi-sintético da podofilotoxina (extraída da espécie Podophyllum peltatum) que exerce ação antitumoral devido à inibição da enzima topoisomerase II. Este fármaco interage reversivelmente com a topoisomerase II, formando um complexo ternário (etoposídeo/topoisomerase II/DNA) que leva a quebras no DNA de fita dupla e impede o reparo exercido pela topoisomerase II. As quebras acumuladas no DNA impedem que a célula entre na fase mitótica, provocando a morte celular por apoptose (HANDE, K.R. Topoisomerase II inhibitores. Update on Cancer Therapeutics, v.3, n.1, p. 13-26, 2008. MONTECUCCO, A.; BIAMONTI, G. Cellular response to etoposide treatment. Cancer Letters, v. 252, n.1, p. 330-342, 2010. TOFFOLI, G.; CORONA, G.; BASSO, B.;

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BOIOCCHI, M. Pharmacokinetic optimisation of treatment with oral etoposide. Clinicai Pharmacokinetics, v. 43, n.7, p.441-466, 2004).

[024] Como a inibição da topoisomerase II pelo etoposídeo é reversível, o complexo ternário (etoposídeo/topoisomerase II/DNA) pode se desfazer, possibilitando o reparo do DNA e reduzindo a atividade antitumoral do etoposídeo. Logo, a exposição prolongada do etoposídeo representa uma estratégia para aumentar o tempo de inibição enzimática, e consequentemente, aumentar a citotoxicidade deste fármaco (CICCOLINI, J.; MONJANELMOUTERDE, S.; BUN, S.S.; BLANC, C.; DUFFAUD, F.; FAVRE, R.; DURAND, A. Population pharmacokinetics of etoposide: application to therapeutic drug monitoring. Therapeutic Drug Monitoring, v. 74, n.6, p. 709-714, 2002).

[025] O etoposídeo é administrado por meio de formas farmacêuticas convencionais pelas vias parenteral e oral, as quais apresentam desvantagens. Por ser praticamente insolúvel em água, o etoposídeo deve ser incorporado a veículo não aquoso composto por etanol, álcool benzílico, polissorbato 80 e polietilenoglicol. Esta formulação líquida parenteral deve ser diluída em fluidos no momento da infusão, o que pode levar a precipitação do fármaco (REIF, S. et al. Bioequivalence investigation of high dose etoposide and etoposide phosphate in lymphoma patients. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, v.48, n.2, p. 134 - 140, 2001). Adicionalmente, este veículo pode provocar reações de hipersensibilidade. Finalmente, a estabilidade do etoposídeo diluído em fluidos varia entre 5 a 72 horas, dependendo da concentração do fármaco (HANDE, K.R. Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor. European Journal of Cancer, v.34, n.1, p.1514-1521). O etoposídeo, presente em cápsulas moles, está incorporado num veículo misto de solventes orgânicos apolares. Quando administrado pela via oral, parte do fármaco é degradada pelos fluidos do trato gastrointestinal, já que em pH inferior a 2 e superior a 8 (CHOW, D.; SHAH, J. Stability-indicating high-performance liquid chromatography of etoposide at various pH conditions using a reversed-phase octyl column. Journal of Chromatography, v.396, p.217-223, 1987), o fármaco

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17/26 sofre hidrólise. Como resultado do processo degradativo, a biodisponibilidade do etoposídeo varia de 40 a 80% da dose inicial administrada (BRANDÃO, H. N.; DAVID, J.P.; COUTO, R.D.; NASCIMENTO, J.A.P.; DAVID, J.M. et al. Química e farmacologia de quimioterápicos antineoplásicos derivados de plantas. Química Nova, v. 33, n. 6, p. 1359-1369, 2010).

[026] O etoposídeo administrado pelas vias parenteral e oral pode provocar efeitos colaterais e/ou tóxicos que desmotivam a continuidade da terapia. Dentre os efeitos colaterais e/ou tóxicos, citam-se os danos hepáticos e renais e a mielossupressão (MICROMEDEX. Disponível em: <http://micromedex.com/>. Acesso em: 17 mar. 2016). Portanto, as formas farmacêuticas convencionais que veiculam o etoposídeo não garantem que este fármaco atue especificamente contra as células tumorais, já que os tecidos sadios são extensivamente acometidos.

[027] Uma estratégia para aumentar a especificidade do etoposídeo e o tempo de exposição deste fármaco às células cancerígenas é veiculá-lo em nanosistemas de liberação de fármacos. Estes sistemas nanométricos podem ser internalizados pelas células cancerígenas e liberar o etoposídeo diretamente no sítio ativo, o que minimizariam/eliminariam os efeitos colaterais e/ou tóxicos provenientes da distribuição deste fármaco em tecidos sadios. Além disso, seria possível eliminar os inconvenientes relacionados à degradação do etoposídeo em diferentes pH's, já que o fármaco estaria protegido no interior dos sistemas. Finalmente, os sistemas nanométricos de liberação do etoposídeo poderiam ser dispersos em água para injetáveis e ser administrado pela via parenteral e/ou via intraocular, de modo que se elimina a possibilidade de desenvolvimento de reações de hipersensibilidade.

[028] Vários estudos acerca do desenvolvimento de sistemas de liberação de etoposídeo em escala nanométrica estão descritos na literatura. Reddy e Murthy (2005) (REDDY, L. H.; MURTHY, R.S.R. Etoposide-loaded nanoparticles made from glyceride lipids: formulation, characterization, in vitro drug release, and stability evaluation. AAPS PharmSciTech, v. 6, n. 2, 2005)

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18/26 prepararam nanopartículas lipídicas sólidas contendo etoposídeo, utilizando três lipídeos diferentes: monoestearato de glicerol, diesterato de glicerol e tripalmitina, por meio da técnica de emulsificação e homogeneização seguidos de secagem por pulverização (spray drying). As nanopartículas compostas de tripalmitina apresentaram 99,40% de eficiência de encapsulação do etoposídeo e diâmetro de 354 nm. Estas nanopartículas apresentaram liberação sustentada do fármaco por 80 horas. Reddy e colaboradores (2006) (REDDY, L. H. et al. Tumoricidal effects of etoposide incorporated into solid lipid nanoparticlesafter intraperitoneal administration in dalton ' s lymphoma bearing mice. The AAPS Journal, v. 8, n. 2, 2006) também avaliaram os efeitos antitumorais destas nanopartículas lipídicas sólidas contendo etoposídeo em ratos que desenvolveram o linfoma ascítico de Dalton. Estes ratos receberam injeções intra-peritoneais contendo as nanopartículas lipídicas sólidas e o etoposídeo livre. Concluiu-se que o etoposídeo presente nos nano-sistemas induziu apoptose das células tumorais, o que foi atribuída à penetração das nanopartículas e a liberação sustentada deste fármaco no interior das células. Além disso, o etoposídeo liberado pelas nanopartículas lipídicas sólidas modificou significativamente o ciclo celular, fazendo-as estacionar na fase G2 e reduzir a fase S. Estas características celulares foram observadas mesmo após 8 dias de administração das nanopartículas. Já o etoposídeo livre induziu apoptose nas células tumorais, mas após 3 dias da administração, as estas células reiniciaram o processo proliferativo.

[029] Mitra e colaboradores (2011) (MITRA, M.; DILNAWAZ, F.; MISRA, R.; HARILAL, A.; VERMA, R.S.; SAHOO, S.K.; KRISHNAKUMAR, S. Toxicogenomics os nanoparticule delivery of etoposide: potential impacto n nanotechnology in retinoblastoma therapy. Cancer Nanotechnology, v.2, n. 16, p.21-36, 2011) desenvolveram nanopartículas constituídas por PLGA e etoposídeo destinadas ao tratamento do retinoblastoma. Estas nanopartículas promoveram a liberação do etoposídeo por aproximadamente seis semanas e apresentaram elevada atividade citotóxica contra linhagem de células humanas

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19/26 de retinoblastoma (Y79), sendo em torno de cem vezes mais ativas que o etoposídeo puro.

[030] Jiang e colaboradores (2016) (Jiang, H.; Geng, D.; Liu, H.; Li, Z.; Cao, J. Co-delivery of etoposide and curcumin by lipid nanoparticulate drug delivery system for the treatment of gastric tumors. Drug delivery, v. 23, n.9, p.36653673, 2016) desenvolveram nanopartículas lipídicas sólidas incorporadas de etoposídeo e curcumina. Estas nanopartículas apresentaram alta citotoxicidade contra as células humanas de câncer no estômago (SGC7901). Adicionalmente, estas nanopartículas se distribuíram em maior proporção no tecido tumoral quando comparado ao etoposídeo e a curcumina livres, o que foi atribuído ao seu maior tempo de circulação sanguínea e a sua aumentada permeabilidade através dos capilares, devido ao seu diâmetro reduzido (100 a 150 nm). Já os fármacos livres se distribuíram e concentraram nos tecidos cardíaco e renal, provocando toxicidade sistêmica. Finalmente, as nanopartículas apresentaram elevada atividade antitumoral em animais com tumor gástrico, já que o etoposídeo e a curcumina acumuladas no tumor promoveram a inibição da topoisomerase II e a regulação negativa de genes antiapoptóticos mediados pelo NF-kB, respectivamente.

[031] Na patente US8828925 B2 vem descrita a seguinte invenção: polipeptídeos ligados covalentemente ao etoposídeo e ao derivado da podofilotoxina (etoposídeo 4’-dimetilglicina) ou a doxorrubicina e ao derivado da doxorrubicina foram elaborados e usados como vetores para o transporte destes agentes terapêuticos através da barreira hematoencefálica ou em células específicas, tais com as de ovário, fígado, pulmão ou rim. Estes conjugados se comportaram como eficazes sistemas de liberação de fármacos antitumorais. Adicionalmente, estes sistemas aumentaram a solubilidade destes compostos e também favoreceram as suas propriedades farmacodinâmicas, já que permitiram atingir as células alvo e reduziram a

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20/26 toxicidade quando comparado a estes compostos livres (não conjugados aos polipeptídeos).

[032] A presente invenção descreve a elaboração de sistemas nanométricos micelares formadas a partir de poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo destinados ao tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos os quais as células expressam grande número de transportadores de folatos e folatos reduzidos para a captação do ácido fólico, vitamina essencial em processos de crescimento, diferenciação e multiplicação celular. Estes sistemas apresentam diversas vantagens que estão descritas a seguir, em tópicos relacionados.

[033] Vantagens das nanomicelas referenciadas nesta invenção no que se refere à especificidade na ação terapêutica: (1) Estas nanomicelas podem penetrar os capilares frenestrados do tumor ocular ou tumor em outros órgãos e tecidos, acumulando-se nestes locais, de modo a garantir o efeito terapêutico específico no sítio ativo; (2) A presença do metotrexato conjugado ao poloxamer e exposto na superfície hidrofílica das nanomicelas faz com que este fármaco funcione com um elemento de reconhecimento frente às células tumorais. Assim, tais células podem internalizar avidamente as nanomicelas por meio dos transportadores de folatos e folatos reduzidos presente na membrana plasmática celular; (3) Quando presente no citoplasma das células tumorais, o metotrexato e o etoposídeo podem ser liberados de modo a se concentrarem neste local, promovendo exposição prolongada dos fármacos no interior das células, e consequentemente, ação antineoplásica induzida por diferentes mecanismos; (4) Quando presente no citoplasma das células tumorais, o poloxamer presente nas nanomicelas também exerce ação antitumoral por complexos mecanismos que pode ser sinérgica às ações quimioterápicas oferecidas pelo metotrexato e etoposídeo.

[034] Vantagens das nanomicelas referenciadas nesta invenção no que se refere aos parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos:(1) A concentração das nanomicelas no interior das células tumorais resulta na

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21/26 administração de doses menores do metotrexato e do etoposídeo no interior do olho ou no organismo humano. Já que as doses são menores, mas efetivas terapeuticamente, os tecidos e órgãos sadios são menos afetados ou não são afetados pela ação dos quimioterápicos; (2) O volume de distribuição para as nanomicelas é menor do que àquele necessário para distribuir o metotrexato e o etoposídeo; (3) A freqüência de administração das nanomicelas é menor do que àquela necessária para as formas farmacêuticas convencionais que contém o metotrexato e o etoposídeo; (4) Todas as vantagens previamente mencionadas levam à redução/eliminação dos efeitos colaterais e/ou tóxicos oculares e/ou sistêmicos, que são extremamente agressivos e limitantes para os pacientes com câncer instalado.

[035] Vantagens das nanomicelas referenciadas nesta invenção no que se refere ao desenvolvimento farmacotécnico de formulações: (1) Os fármacos quimioterápicos insolúveis ou com baixa solubilidade aquosa, dentre eles o etoposídeo, são veiculados solubilizados no interior das nanomicelas poliméricas; (2) O poloxamer é um polímero que apresenta a capacidade de se auto-organizar em estruturas micelares, por ser anfifílico, garantindo a formação de sistemas de vetorização de fármacos por técnica simplificada de manipulação/produção; (3) O poloxamer pode ser conjugado, por meio de reações de esterificação, a diferentes ligantes que apresentem, em sua estrutura molecular, um ácido carboxílico reativo, que podem funcionar como elementos de reconhecimento para as células tumorais; (4) O núcleo hidrofílico das nanomicelas de poloxamer conjugado ao metotrexato possibilita a veiculação do etoposídeo já solubilizado; (5) A veiculação do etoposídeo já solubilizado no interior das nanomicelas de poloxamer conjugado ao metotrexato elimina a possibilidade de precipitação deste fármaco no momento da sua administração parenteral e/ou intraocular, devido à sua insolubilidade em fluidos biológicos; (6) O poloxamer, formador das nanomicelas, pode ser conjugado ao metotrexato e também a outros fármacos ou substâncias bioativas que funcionem como elemento de reconhecimento para as células

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22/26 tumorais; (7) As nanomicelas formadas por poloxamer conjugado ao metotrexato podem também encapsular, além do etoposídeo, quaisquer outros fármacos insolúveis ou pouco solúveis em água, da classe dos quimioterápicos, ou outros fármacos de mesma propriedade e pertencentes a outras classes terapêuticas, o que permite diversificar a aplicação terapêutica das nanomicelas; (8) O etoposídeo incorporado no interior das nanomicelas de poloxamer conjugado ao metotrexato está protegido de processos de degradação que acontece em função das variações de pH, garantindo a sua estabilidade química.

[036] Vantagens das nanomicelas referenciadas nesta invenção no que se refere ao paciente a ser tratado: (1) A redução/eliminação dos efeitos colaterais e/ou tóxicos sistêmicos aumenta a adesão do paciente à terapia quimioterápica; (2) A redução/eliminação dos efeitos colaterais e/ou tóxicos sistêmicos aumenta a qualidade de vida do paciente com câncer; (3) A administração do etoposídeo, um fármaco insolúvel em água, já solubilizado nas nanomicelas de poloxamer conjugado ao metotrexato faz com seja reduzida/minimizada a dor provocada por este fármaco presente nas formas farmacêuticas convencionais no momento de sua infusão; (4) A especificidade na ação terapêutica das nanomicelas aumenta a possibilidade de cura do retinoblastoma e dos outros tumores malignos, ou garante a redução dos tumores para posterior intervenção cirúrgica. Como resultado, a chance de preservação do olho e/ou dos tecidos e órgãos acometidos é aumentada, bem como a chance de preservação da vida.

[037] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos exemplos a seguir: [038] Exemplo 1: Preparo do poloxamer conjugado ao metotrexato Inicialmente, realizou-se a esterificação do poloxamer com o metotrexato. Entre 0,3 e 0,4 gramas de metotrexato foram dissolvidos em 1 a 3 mL de solvente orgânico e 0,5 a 1,5mL de ácido clorídrico 0,1 a 0,3 mol L^-1. O metotrexato foi ativado com 0,1 a 0,3g de dicicloexilcarbodiimida (DCC) e 0,1 a 0,3g de Nhidroxisuccinimida (NHS). A solução foi mantida em banho de gelo, sob

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23/26 agitação magnética. Em seguida, manteve-se a agitação magnética por mais 24 a 36 horas fora do banho de gelo. A solução resultante foi centrifugada para remoção de diciclohexilureia (DCU). Ao sobrenadante, adicionaram-se 12 a 16 mL solvente orgânico e 5,0 a 6,0 gramas de poloxamer , além de 0,09 a 0,12g de 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Por fim, a mistura foi colocada sob agitação magnética a 40 - 50 °C por 24 a 36 horas. A solução resultante foi secada sob vácuo. O poloxamer conjugado ao metotrexato foi lavado três a cinco vezes com ácido clorídrico 0,1 a 0,3 mol L^-1 para remoção dos reagentes em excesso.

[039] Exemplo 2: Obtenção do grau de substituição do poloxamer conjugado ao metotrexato

Entre 40 e 60 miligramas de poloxamer conjugado ao metotrexato foram submetidos à hidrólise utilizando hidróxido de sódio 0,1 a 0,3 mol L^-1 adicionado a uma mistura de solventes orgânicos e água purificada. Esta mistura foi levada ao vortex e armazenada por 24 a 36 horas para a completa hidrólise das ligações éster entre poloxamer e metotrexato. Em seguida, a 50 e 100 pL dessa solução foram acrescentados ácido clorídrico 0,1 a 0,3 mol L^-1, para neutralização do meio reacional. A solução resultante foi injetada em cromatógrafo à líquido de alta eficiência para quantificação do metotrexato que estava conjugado ao poloxamer. O grau de substituição do poloxamer conjugado ao metotrexato foi de 9,73%.

[040] Exemplo 3: Caracterização do poloxamer conjugado ao metotrexato obtido no Exemplo 1

Para avaliar a conjugação por esterificação entre o poloxamer e o metotrexato, a espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e a calorimetria diferencial exploratória (DSC) foram utilizadas. O espectro FTIR indicou que o poloxamer conjugado ao metotrexato apresentava bandas típicas do poloxamer e do metotrexato puros e uma banda adicional em 1710 cm^-1, característica da ligação éster formada entre a hidroxila e ácido carboxílico do poloxamer e do metotrexato, respectivamente. O termograma DSC indicou que

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24/26 o poloxamer conjugou-se ao metotrexato devido à presença de evento térmico completamente diferente dos eventos térmicos referentes ao poloxamer e ao metotrexato puros.

[041 ] Exemplo 4: Preparo das nanomicelas formadas a partir do poloxamer conjugado ao metotrexato do Exemplo 1 e incorporadas de etoposídeo usando o delineamento fatorial 2³ com réplicas no ponto central

Para o preparo das nanomicelas, inicialmente 1 a 5 gramas de etoposídeo foram dissolvidos em 2 a 4mL de solvente orgânico. Esta solução foi vertida, sob agitação magnética, em 3 a 9 mililitros de fase aquosa contendo 20 a 50 miligramas de poloxamer conjugado ao metotrexato. Em seguida, a mistura foi agitada com sonicador em banho de gelo. A solução foi estocada a temperatura ambiente (15 a 30 ^oC), sob agitação magnética, por 6 a 9 horas para a evaporação do solvente orgânico. O etoposídeo não encapsulado foi removido utilizando filtro de 0,22 micrômetros. Finalmente, as nanomicelas obtidas foram congeladas a -80 ^oC e submetidas à liofilização até completa secagem. Como as nanomicelas foram preparadas por meio de um delineamento fatorial 2³ com réplicas no ponto central, três variáveis independentes, descritas a seguir, foram deliberadamente modificadas: (1) massa do polímero; (2) tempo de agitação com o sonicador; (3) volume da fase aquosa. Estas variáveis independentes foram modificadas em 3 níveis diferentes, considerando o nível baixo (-1), o nível central (0) e o nível alto (+1). Em seguida, elaborou-se uma matriz do planejamento fatorial 2³ com réplicas no ponto central, na qual as variáveis independentes em seus diferentes níveis foram mescladas, de modo a se obter 9 formulações de nanomicelas diferentes, as quais foram denominadas por números de 1 a 9. As formulações de nanomicelas de 1 a 8 foram produzidas em um único lote para cada. A formulação de nanomicelas 9 foi produzida em cinco diferentes lotes e ela representou o ponto central. Finalmente, após o preparo das 9 formulações de nanomicelas formadas a partir do poloxamer

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25/26 conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo, estas foram submetidas à liofilização.

[042] Exemplo 5: Caracterização das nanomicelas obtidas no Exemplo 4, principalmente as nanomicelas da formulação 1

O preparo das nanomicelas contidas nas 9 formulações foi monitorado por meio da avaliação do diâmetro, índice de polidispersão, potencial zeta e eficiência de encapsulação do etoposídeo incorporado nos sistemas nanométricos.

[043] Exemplo 6: Escolha da formulação de nanomicelas considerando os parâmetros de caracterização do Exemplo 5

A formulação 1 apresentou diâmetro entre 200 e 250 nanômetros; índice de polidispersão entre 0,20 e 0,30; potencial zeta entre -30,0 e -40,0 milivolts e eficiência de encapsulação do etoposídeo entre 80 e 90%, representando a formulação de nanomicelas formadas a partir de poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo que caracteriza esta invenção.

[044] Exemplo 7: Método de quantificação do metotrexato e etoposídeo presentes nas nanomicelas dos Exemplos 5 e 6

O método de quantificação do metotrexato e etoposídeo presentes nas nanomicelas das formulações 1 a 9, e principalmente da formulação 1, objeto desta invenção, foi a cromatografia líquida de alta eficiência. Este método foi desenvolvido usando os seguintes parâmetros cromatográficos: (1) fase móvel composta por água purificada e solventes orgânicos com pH ajustado para 3,0 e fluxo entre 0,8 e 1,2 mililitros por minuto; (2) comprimentos de onda de detecção iguais a 242 nanômetros para o etoposídeo e 313 nanômetros para o metotrexato; (3) coluna do tipo C18 de fase reversa de tamanho 3,9 milímetros x 250 milímetros; (4) temperatura da coluna entre 30 e 40 ^oC; (5) volume de injeção entre 20 e 30 microlitros. O método cromatográfico foi desenvolvido e validado mostrando-se linear, seletivo, preciso, exato e robusto. Portanto, este

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26/26 método mostrou-se confiável para a quantificação do metotrexato e do etoposídeo presentes nas nanomicelas e liberado por estes sistemas.

[045] Exemplo 8: Estudo de liberação in vitro do metotrexato e do etoposídeo presentes nas nanomicelas do Exemplo 6 [046] O estudo de liberação in vitro do metotrexato e do etoposídeo a partir das nanomicelas da formulação 1 (Exemplo 6) foi realizado por meio da técnica de diálise. Alíquotas de 2 a 5 mL das nanomicelas foram transferidas para o interior do saco de diálise (membrana de celulose, Snake Skin®), o qual foi colocado em um frasco de vidro contendo tampão fosfato de potássio 0,5 mol L^-1 (pH 6,8). Estes frascos foram transferidos para uma incubadora com movimento rotacional controlado e mantida a temperatura controlada. Em intervalos de tempo pré-determinados, alíquota do tampão fosfato de potássio 0,5 mol L^-1 (pH 6,8) foi coletada e submetida à quantificação usando o método cromatográfico desenvolvido e validado descrito no Exemplo 7. Imediatamente após a remoção da alíquota, tampão fosfato de potássio 0,5 mol L^-1 (pH 6,8) recentemente preparado foi transferido ao frasco de vidro para recomposição do volume inicial.

[047] O etoposídeo apresentou liberação rápida no período inicial, e em seguida, houve o controle prolongado da liberação deste fármaco. Em 12 horas de estudo de liberação, aproximadamente 80% do etoposídeo havia sido liberado. O metotrexato apresentou liberação de aproximadamente 31% em 12 horas de estudo de liberação, demonstrando-se a cedência lenta deste fármaco pelas nanomicelas.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Nanomicelas formadas a partir do poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo caracterizadas por ter diâmetro entre 200 e 250 nanômetros; índice de polidispersão entre 0,20 e 0,30; potencial zeta entre -30,0 e -40,0 milivolts e eficiência de encapsulação do etoposídeo entre 80 e 90%;
2. 2. Processo de preparo de formulação farmacêutica de nanomicelas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas etapas:

   a) 0,3 a 0,4 g de metotrexato são dissolvidos em 1 a 3 mL de solvente orgânico e 0,5 a 1,5 mL de ácido clorídrico 0,1 a 0,3 mol L^-1 sob agitação magnética e banho de gelo;

   b) À solução descrita no item “a” adiciona-se 0,1 a 0,3 g de dicicloexilcarbodiimida e 0,1 a 0,3 g de N-hidroxisuccinimida;

   c) Retira-se a solução do banho de gelo mantendo-se agitação magnética por 24 a 36 horas;

   d) A solução resultante é centrifugada;

   e) Adicionam-se ao sobrenadante 12 a 16 mL de solvente orgânico e 5 a 6 g de poloxamer além de 0,09 a 0,12 g de 4-dimetilaminopiridina;

   f) A mistura é então colocada sob agitação magnética na temperatura de 40 a 50 °C por 24 a 36 horas;

   g) A seguir a solução é secada a vácuo;

   h) Lava-se três a cinco vezes com ácido clorídrico 0,1 a 0,3 mol L^-1;

   i) Dissolve-se 1 a 5 gramas de etoposídeo em 2 a 4 mL de solvente orgânico;

   j) A solução é vertida em 3 a 9 mL de fase aquosa, contendo 20 a 50 gramas do poloxamer conjugado ao metotrexato previamente preparado descrito nos itens “a” a “h” sob agitação magnética;

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   2/2

   k) A mistura é agitada com sonicador em banho de gelo;

   A solução a seguir é estocada a temperatura de 15 a 30 °C sob agitação magnética por 6 a 9 horas;

   l) O etoposídeo não encapsulado é removido utilizando filtro de 0,22 micrômetros;

   m) As nanomicelas obtidas são então congeladas a -80 °C e submetidas à liofilização até completa secagem;
3. 3. Nanomicelas formadas a partir do poloxamer conjugado ao metotrexato e incorporadas de etoposídeo, de acordo com as reivindicações

   1 e 2 caracterizadas por serem destinadas ao tratamento do retinoblastoma e outros tumores malignos.