BR102017002143A2 - Processo de construção de imunossensores para detecção eletroquímica indireta de micobactérias - Google Patents
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Abstract
processo de construção de imunossensores para detecção eletroquimica indireta de micobactérias. a presente invenção trata-se do desenvolvimento de um imunossensor para detecção eletroquímica indireta de micobactéria mediante a aplicação de rodamina 6g (r6g) como etiqueta de reconhecimento biológico entre carboidratos e proteínas. a presente invenção apresenta características que chamam a atenção de investimentos científicos uma vez que trata-se da detecção de uma doença tropical negligenciada com diagnóstico diferencial para micobacterioses tais como, hanseníase e tuberculose. o r6g é o primeiro composto orgânico usado como indicador eletroquímica para detecção indireta em imunossensores de constituição proteica elou de carboidratos. a presente invenção apresenta vantagens inerentes à sua rapidez no diagnóstico destas patogenias, aplicabilidade, sensibilidade, seletividade e baixo custo.
Description
[001] Campo da invenção
[002] A presente invenção trata-se do desenvolvimento de um imunossensor para detecção eletroquímica indireta de micobactéria mediante a aplicação de Rodamina 6G (R6G) como etiqueta de reconhecimento biológico entre carboidratos e proteínas. A presente invenção apresenta características que chamam a atenção de investimentos científicos uma vez que trata-se da detecção de uma doença tropical negligenciada com diagnóstico diferencial para micobacterioses tais como, hanseníase e tuberculose. O R6G é o primeiro composto orgânico usado como indicador eletroquímico para detecção indireta em imunossensores de constituição proteica e/ou de carboidratos. A presente invenção apresenta vantagens inerentes à sua rapidez no diagnóstico destas patogenias, aplicabilidade, sensibilidade, seletividade e baixo custo.
[003] Estado da Técnica
[004] A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada por Mycobacterium leprae acometendo principalmente a pele e os nervos periféricos (Walker, S.L., Lockwood, D.Ν.J. Leprosy. Clin. Dermatol. 25(2): 165-172, 2007). Este micro-organismo é álcool-ácido resistente apresentando morfologia de bastonetes e atua como parasita intracelular obrigatório no corpo do hospedeiro (PORTAL DA SAÚDE. Hanseníase. Disponível em: <http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/oministerio/principal/secretarias/svs/ hanseniase>. Acesso em: 03.11.2016.)
[005] A transmissão ocorre pelas vias aéreas superiores de pacientes não tratados portadores de bacilos que entram em contato próximo e prolongado com indivíduos suscetíveis. Assim, este micro-organismo possui baixa infectividade, alta patogenicidade e longo período de incubação (PORTAL DA SAÚDE. Hanseníase. Disponível em: <http://portalsaude.saude.qov.br/index.php/o- ministerio/principal/secretarias/svs/hanseniase>. Acesso em: 03.11.2016.)
[006] Em 2015, a Organização Mundial da Saúde registrou 211.973 novos casos de hanseniase, sendo este 26.395 somente no Brasil sendo o segundo pais com maior prevalência de hanseniase no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION. Leprosy elimination. Disponível em:<http://www.who.int/lep/en/>. Acesso em: 01.11.2016). Além disso, a hanseniase é uma doença de notificação compulsória no Brasil e de investigação obrigatória.
[007] A classificação atual utilizada mundialmente é baseada no sistema de Ridley e Jopling dividindo-se em cincos formas clínicas: (i) lepromatoso (LL); (ii) borderline-lepromatoso (BL); (iii) borderline-borderline (BB); (iv) borderline-tuberculoide (BT) e (v) tuberculoide (TT) (Ridley, D.S., Jopling, W.J. Classification of leprosy according to immunity. A five-group sistemy. Int. J. Lepr. Other. Mycobact. Dis. 34: 255-273, 1966). Esta classificação é baseada em estudos histopatológicos podendo não ser acessível em países em desenvolvimento. Assim, existe uma classificação operacional preconizada pela OMS baseada no número de lesões, sendo classificadas em paucibacilares (PB) com até 5 lesões de pele e baciloscopia negativa, e multibacilares (MB) com mais de 5 lesões e baciloscopia positiva. Pacientes multibacilares possuem alta densidade bacilar, tendo um importante papel como grupo transmissor (WORLD HEALTH ORGANIZATION. Leprosy elimination. Disponível em:<http://www.who.int/lep/en/>. Acesso em: 01.11.2016).
[008] O genoma da M. leprae possui 89,6% de similaridade com M. tuberculosis (Cole, S.T. et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature, 409(6823): 1007-1011, 2001). Além disso, a parede celular deste micro-organismo apresenta glicolipídios específicos e altamente antigênicos, tais como glicolipidio fenólico (PGL1) que possui importante papel na patogênese e diagnóstico da hanseniase (Buhrer-Sekula, S. Sorologia PGL-I na hanseniase. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 41(2): 3-5, 2008). Em contrapartida, a disponibilidade desse antígeno para prática clínica é limitada, devido as dificuldades de cultivo in vitro deste micro-organismo. Assim, a obtenção do PGL-1 nativo é restrita ao crescimento do M. leprae em tatus e camundongo (Chatterjee, D., Hunter, S.W., McNeil, M., Brennan, P.J. Lipoarabinomannan multiglycosylated form of the mycobacterial mannosylphosphatidylinositols. J. Biol. Chem. 267: 6228-6233, 1992.
[009] O diagnóstico de M. leprae é baseado principalmente em testes clínicos realizados no exame dermatoneurológico com o objetivo de identificar lesões características na pele, áreas com alteração de sensibilidade e/ou comprometimento de nervos periféricos sensitivo, motor ou autonômico (Duthie, M.S., Hay, Μ.Ν., Rada, Ε.Μ., Convit, J., Ito, L. et al. Specific IgG antibody responses may be used to monitor leprosy treatment efficacy and as recurrence prognostic markers. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: 1257-1265, 2011). Cerca de 70% dos casos de hanseniase podem ser diagnosticados somente com base no sinal clínico de lesões de pele com perda sensitiva, porém 30% de pacientes, inclusive pacientes multibacilares (MB) não apresentam sintomas.
[010] Atualmente, testes laboratoriais complementares têm demonstrado uma importante ferramenta no diagnóstico da hanseniase.
[011] A pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes (baciloscopia) é um exame complementar realizado em todos os pacientes com suspeita clínica da doença (Ustianowski, A.P., Lockwood, D.N.J. Leprosy current diagnostic and treatment approach. Curr. Opin. Infect. Dis. 16: 421-427, 2003). O raspado dérmico coletado das lesões, dos lóbulos das orelhas, joelhos e dos cotovelos é de fácil execução e baixo custo. Em contrapartida, a baciloscopia do raspado intradérmico apresenta baixa sensibilidade, na qual cerca de 70% de pacientes com hanseniase possuem baciloscopia negativa.
[012] Atualmente, o "padrão de ouro" para o diagnóstico de hanseniase é o teste histopatológico, no qual uma amostra de biópsia de pele obtida de uma lesão ativa, fixada em formalina tamponada neutra, embebida em parafina é examinada por um patologista experiente. Nas lesões tuberculóides, os bacilos podem ser raros e difíceis de serem encontrados e uma correlação clínica e histológica pode ser necessária para o diagnóstico (Scollard, D.M., Adams, L B., Gillis, T.P,, Krahenbuhl, J.L., Truman, R.W., Williams, D.L, The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 19(2):338-381, 2006).
[013] Há também o teste cutâneo (mitsuda) que consiste na inoculação intradérmica de bacilos inativados pelo calor, na qual é avaliada a resposta imune celular e a hipersensibilidade do tipo tardia. Este teste não apresenta-se útil como diagnóstico, sendo inespecífico, além de não apresentar infecção, nem mesmo por exposição ao Mycobacterium leprae (Scollard, D.M., Adams, L.B., Gillis, J.L., Krahenbuhl, R.W., Truman, D., Williams, L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. 19(2): 338-381, 2006).
[014] Uma ferramenta para a abordagem da detecção precoce da infecção pelo Mycobacterium leprae é o teste sorológico. Utilizando o PGL-I nativo e seus derivados semissintéticos, diversos ensaios foram desenvolvidos para detectar a presença de anticorpos. Vários estudos publicados recentemente tem utilizado as técnicas de ensaio imunoenzimático (ELISA). Apesar da difícil padronização, o baixo custo do ELISA e os resultados quantitativos fazem com que este teste seja o escolhido para estudos epidemiológicos de grande escala (Buher-Sekula, S. Sorologia PGL-I na hanseníase. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 41(2): 3-5, 2008). A maior desvantagem do diagnóstico sorológico para a hanseníase são as variações laboratoriais, tais como as diferenças no preparo e concentração do antígeno, soluções, procedimentos de lavagem, diluição de soro e tipo de substrato usado na técnica. Além disso, a sorologia tem menor relevância para o diagnóstico da hanseníase paucibacilar. Em áreas endêmicas, uma proporção significativa de indivíduos saudáveis podem apresentar sorologia anti-PGL-l positiva (Oskam, L., Slim, E., Buhrer-Sekula, S. Serology: recent developments, strengths, limitations and prospects: a state of the art overview. Leprosy Rev. 74: 196-205, 2003).
[015] Há alguns anos a técnica de reação em cadeia polimerase (PCR) vem revolucionando o diagnóstico molecular laboratorial com a extração, amplificação e identificação de DNA e RNA em diversas amostras clínicas. A PCR apresenta boa sensibilidade em até 100% em casos de hanseníase multibacilar, mas geralmente é pouco sensível (inferior a 50%) em casos de hanseniase paucibacilar (Santos, A.R., Miranda, A.B., Sarno, E.M., Suffys, PN., Degrave, W.M. Uso de PCR mediada por amplificação de Mycobacterium leprae DNA em diferentes tipos de amostras clínicas para o diagnóstico da lepra. J. Med. Microbiol. 39: 298-304, 1993).
[016] A PI 1105460-3 A2 mostra a utilização da PCR multiplex para a detecção de micobactérias.
[017] Além disso, a tecnologia de PCR requer equipamentos e infraestrutura de alto custo, não sendo recomendada como teste de diagnóstico para a hanseniase, mas sim como ferramenta de pesquisa (WHO. Global strategy for further reducing the leprosy burden and sustaining leprosy control activities 20062010. Operational guidelines. Leprosy Rev. 77(3): 1-50, 2006). No caso de M. tuberculosis há kits para amplificação multiplex de sequências alvo para quantificar a sequência na amostra (PI 9403324-2).
[018] A detecção eletroquímica parte de dois princípios, direto e indireto. A detecção direta parte dos princípios de oxidação de bases nitrogenadas (no caso de DNA) e de aminoácidos (no caso de peptídeos e proteínas), na qual a partir de potenciais específicos os valores quantitativos podem proporcionar a concentração destas biomoléculas (WO 2012153124 A1 / W02009045116 A1). A detecção indireta utiliza indicadores eletroquímicos sendo estes passíveis de oxidação e/ou redução também com valores quantitativos proporcionais (direta ou inversamente proporcionais).
[019] Em genosensores é comum a utilização destes indicadores para comprovar o processo de hibridação seletiva de DNA, RNA e aptâmeros como mostrado na PI 9302052-0.
[020] Compostos que possuam anéis aromáticos podem ser usados como indicadores eletroquímicos por interagirem com DNA através de ligação eletrostática ou de fusão (RICHARDS, A. D., RODGERS, A. Synthetic metallomolecules as agents for the control of DNA structure. Chemical Rev. 36(3): 471-483, 2007). Muitos estudos relatam o azul de metileno, brometo de etídio e tetrametilbenzidina como indicadores de DNA (ALVES-BALVEDI, R.P., CAETANO, L.P., MADURRO, J.M., BRITO-MADURRO, A.G. Use of 3,3',5,5'tetramethylbenzidine as new electrochemical indicator of DNA hybridization an dits application in genossensor. Biosens. Bioelectron. 85: 226231, 2016 / BALVEDI, R.P.A., CASTRO, A.C.H., MADURRO, J.M., BRITO-MADURRO, A.G., Detection of a Specific Biomarker for Epstein-Barr Virus Using a Polymer-Based Genosensor. Int. J. Mol. Sci. 15: 9051-9066, 2014/TALEATAT, Z„ CRISTEA, C„ MARRAZZA, G„ MAZLOUM-ARDAKANI, M., SANDULECU, R. Electrochemical immunoassay based on aptamer-protein interaction and functionalized polymer for cancer biomarker detection J. Electroanalyt. Chem. 15: 119-124, 2014.
[021] Sensores proteicos ou com peptídeos miméticos foram desenvolvidos para a detecção de M. leprae, conforme Visto em US 7622121 B2.
[022] A WO 2007091881 A2 / US 4906742 A2 trata do isolamento de antígenos para o diagnóstico de M. leprae.
[023] Nas pesquisas com indicadores eletroquímicos, para indicar o reconhecimento biológico entre proteínas, a BR 1020160195390 evidencia a aplicação do tetrametilbenzidina (4-DMAA) uma vez que é um composto orgânico que pode oxidar, reduzir e interagir com biomoléculas.
[024] A partir destas análises, a Rodamina 6G da família das Rodaminas, ao apresentar anéis aromáticos torna-se uma interessante molécula de outra aplicação tecnológica como a comumente utilizada em microscopia, citometria de fluxo, espectroscopia e ELISA. Na presente invenção é utilizada como um indicador eletroquímico em sensoriamento biológico.
[025] O processo da síntese e preparação industrial das rodaminas (B, 3B, 6G e outras) é descrito na EP 0468821 A1 e da Fiorina, uma robamina com radioisótopo F18 na US 9101673 B2.
[026] Α preparação de soluções concentradas e diluídas, estáveis, aquosas ou solventes orgânicos de R6G (C28H31N2O3CI, ΜΜ 479.02g/mol; solubilidade me água 20 g/l e em metanol 400 g/l) estão contidos em US 20070531413 / W02007RU00130 / US 6191278 B1 / WO 2005007678 A2.
[027] A patente US 3849065 A descreve como as soluções de corantes como a rodamina estereficada com glicol e/ou derivado de glicol seriam usadas para corar papel.
[028] A patente US 6750357 B1 mostra que a rodamina pode ser utilizada como matéria-prima para a síntese de outros compostos excitáveis por luz em apropriados comprimentos de onda.
[029] Aplicação de interesse de saúde pública foi a utilização da rodamina no tratamento de células cancerosas, como descrito nas patentes W02010IL00233 / US2010144854.
[030] A interação de diferentes tipos de rodamina no processo de sequenciamento de DNA, é descrito na US 5366860 A.
[031] Nas análises eletroquímicas a rodamina é utilizada na detecção de íons metálicos (KAMAL, A., KUMAR, Ν., BHALLA, V., Rhodamine- dimethyliminocinnamyl based electrochemical sensors for selective detection of iron (II). Sens Act Β Chem 190, 127-133, 2013/ KIM, H„ LEE, D-H., SON, Y-A. Electrochemical Study on Rhodamine 6G-lndole Based Dye for HOMO and LUMO Energy Levels. Text. Coloration Finish. 25, 7-12, 2013).
[032] Até onde se tem conhecimento esta forma de diagnóstico para micobactérias e a utilização da R6G não foi aplicada como indicador eletroquímico em sensores biológicos.
[033] Descrição e detalhamento dos componentes da invenção
[034] Visando proporcionar um indicador de baixo custo para o diagnóstico de micobactérias, a presente invenção apresenta a construção de um imunossensor que possui a capacidade de diagnosticar M. leprae. Nesta plataforma, utiliza-se a rodamina 6G como indicador eletroquímico e o anticorpo anti-PGL1 imobilizado sobre a superfície transdutora de um eletrodo comercial tipo screen printed. Cabe ressaltar que esta aplicação serve como exemplo da viabilidade de seu uso, não sendo para este fim exclusivamente e sim poderá ser utilizado em diagnóstico de diferentes micobactérias.
[035] O processo de construção de um imunossensor utiliza um eletrodo de grafite com nanotubos de carbono e nanopartículas de ouro como material condutor tipo screen printed DRP110 GPH-GNP110; um anticorpo PGL-1 para interação dos antígenos de M. leprae e rodamina 6G usado como indicador eletroquímico, para a detecção indireta, acompanhando a variação dos sinais por voltametria de pulso diferencial, do pico de oxidação ou redução do indicador do reconhecimento específico entre sonda e alvos.
[036] Para os ensaios de especificidade e sensibilidade do imunossensor para diagnóstico de M. leprae, a ordem de adição da rodamina 6G foi investigada. No entanto, a presente invenção não se restringe apenas à utilização da rodamina 6G para essas micobactérias.
[037] O eletrodo utilizado deve ser de um material preferencialmente condutor e, apresentar inércia eletroquímica na faixa de -0,4 V à +1,4 V (versus Ag/AgCI ou Ag), tal como o grafite, carbono vítreo, pasta de carbono, diamante, ouro, platina ou até mesmo combinações destes materiais. Estes materiais também podem estar incorporados aos materiais nanotecnológicos como filmes poliméricos, grafeno, nanotubos de carbono e nanopartículas, visando o aumento da condutividade e melhoramento de sinais eletroquímicos.
[038] O anticorpo anti-PGLI específico empregado na interação de antígenos específicos de M. leprae foi imobilizado na superfície do eletrodo por adsorção. O anticorpo e o soro utilizados foram diluídos em tampão fosfato 0,1 mol.L-1.
[039] Descrição das figuras
[040] Para melhor compreensão das características da presente invenção que utiliza a rodamina 6G como indicador eletroquímico aplicada em biossensores para diagnóstico de micobactérias, resultados gráficos exemplificadores são apresentados.
[041] Estudo da interação da rodamina 6G com superfícies eletródicas
[042] Para todas as figuras, a linha (2) ilustra a varredura do voltamograma de pulso diferencial para a rodamina 6G quando adicionada nos eletrodos de grafite com nanotubos de carbono e nanopartículas de ouro contendo o anticorpo específico de M, leprae (anti-PGL-1) e o BSA utilizado como bloqueador do bioeletrodo. Observou-se no pico da primeira varredura, a oxidação completa da rodamina 6G com potencial entre 0,30 e 0,95 V.
[043] Investigação da ordem de adição
[044] O TESTE A (Figura 1) mostra as varreduras do voltamograma de pulso diferencial para a rodamina 6G quando adicionada nos eletrodos de grafite com nanotubos de carbono e nanopartículas de ouro, seguida da adsorção de amostras de saliva positiva para M. leprae (linha 3), negativa (linha 4) e positiva para M. tuberculosis (linha 5). A linha (1) refere-se a linha base contendo apenas tampão fosfato. Nesse teste, observa-se a inespecificidade do sistema, uma vez que a rodamina 6G ao interagir com o anti-PGL-1 ocupa o epítopo de reconhecimento impedindo assim a discriminação entre os soros.
[045] O TESTE Β (Figura 2) contém as varreduras do voltamograma de pulso diferencial para a rodamina 6G, quando adicionada nos eletrodos juntamente com as amostras de sativa. A inespecificidade ainda ocorre, provavelmente pelo fato da rodamina 6G não estar interagindo com o PGL-1, mas quando a solução é disponibilizada na superfície do eletrodo a rodamina interage mais rapidamente com a anti-PGL-1 do que o próprio PGL-1 da saliva, sendo impeditiva na interação antígeno-anticorpo. Ressalta-se que este resultado apresentou-se de forma mais discriminatória do que o teste anterior, porém ainda não satisfatória.
[046] NO TESTE C (Figura 3), a rodamina 6G foi adicionada nos eletrodos após a adsorção das amostras de saliva no biossensor. Esta sequência de disponibilização a priori das biomoléculas e posterior a adição da rodamina, resultou em um sensor eletroquímico seletivo e específico devido a interação de anti-PGL-1 com o PGL-1 presente na saliva de pacientes positivos para hanseníase e a rodamina como indicador qualitativo e quantitativo da interação. Os resultados apresentaram-se discriminatórios para os pacientes soro negativos e os pacientes soro positivos para uma outra espécie do mesmo gênero (M. tuberculosis).
[047] Exemplos de atuação da invenção
[048] Exemplo 1
[049] Preparo do bioeletrodo
[050] O eletrodo tipo screen printed grafite (DropSens, Metrohm), consiste em um eletrodo de trabalho (4 mm de diâmetro), contra eletrodo e eletrodo de referência. Lâminas de grafite/ouro, com nanotubos de carbono, nanopartículas de ouro, prata, respectivamente (Ref. DRP 110 GPH-GNP/ C110 /110/ BT220 / AT220).
[051] Variações dos testes utilizando a rodamina 6G
[052] Foram realizados três testes utilizando a rodamina 6G de forma diferencial como /indicador eletroquímico:
- (A) saliva adicionada nos eletrodos antes da rodamina 6G;
- (Β) saliva adicionada juntamente com a rodamina 6G;
- (C) saliva adicionada após a adsorção da rodamina 6G.
[053] Preparação dos eletrodos
[054] Eletrodo 1: para a formulação da linha base (eletrodo 1), medições de voltametria de pulso diferencial (v=15 mV.s-1) no eletrodo screen printed conectado a um potenciostato PalmSens 3, (Compact Electrochemical Interfaces) foram obtidas, utilizando 50 a 120 μL de tampão fosfato (0,1 a 1 mol.L-1) como eletrólito suporte (detecção indireta).
[055] Eletrodos 2, 3, 4 e 5: para os testes (Α, Β e C), foram aplicados na superfície de trabalho dos eletrodos 2 a 10 μL do anticorpo específico de M. leprae (anti-PGL-1) e incubados a temperatura entre 25 a 37° durante 5 a 50 minutos. Posteriormente, foram aplicados 2 a 10 μL de albumina de soro bovino (BSA) 0,1 a 5% e incubados por mais 5 a 50 minutos para bloqueio da adsorção inespecífica das biomoléculas. Em seguida, os eletrodos foram lavados com 50 a 120 μL de água ultrapurificada e secados.
[056] Após este procedimento, foi adicionado 2 μL de rodamina 6G no eletrodo 2 e incubado por 20 minutos. Em seguida, o eletrodo foi lavado com 100 pL de água ultrapurificada e secado. As medições foram realizadas no PalmSens semelhante aquelas descritas para o eletrodo 1.
[057] Para o teste “A”, nos eletrodos previamente preparados com o anticorpo (anti-PGL-1 ou anti-LAM ou anti- específicas de micobacterias), BSA e rodamina 6G foram adicionados 2 pL das amostras de saliva positiva para M. leprae (eletrodo 3), saliva negativa (eletrodo 4) e saliva positiva para M. tuberculosis (eletrodo 5), todos incubados por 30 minutos. Em seguida, os eletrodos foram lavados com 50 a 120 μL de água ultrapurificada e secados. Posteriormente, as medições foram feitas no PalmSens como descrito anteriormente.
[058] Para os testes “B" e “C” foi utilizado o mesmo procedimento inicial para a preparação dos eletrodos anticorpo (anti-PGL-1 ou anti-LAM ou anti- específicos de micobacterias), BSA e rodamina 6G, no entanto variou-se quanto à disposição da rodamina 6G, conforme já descrito para cada teste. O teste “C” foi realizado em triplicata.
[059] Exemplo 2
[060] Preparo da lâmina para coleta das amostras
[061] A técnica tipo slit skin parte do princípio da coleta de amostras contaminadas de lobo de orelha, cotovelos, joelhos e a de lesão ativa se estiver presente. A lâmina incisona estas regiões, que por apresentarem temperatura em torno de 30° C permitem o alojamento e concentrações destes microorganismos. Esta lâmina passa por um processo de lavagem em tampão PBS 1x (50 a 500 microlitros), podendo ou não ser liofilizada.
[062] Exemplo 3
[063] Diferenciação das classificações paucibacilar e multibacilar
[064] O sensor da presente invenção possibilita discriminar de forma quantitativa os bacilos presentes na amostra, e assim as formas paucibacilar e multibacilar podem ser eletroquimicamente detectadas e diferenciadas.
[065] Exemplo 4
[066] Detectar o anticorpo para fins de diagnóstico operacional estando o antígeno no eletrodo
[067] Eletrodo 1: para a formulação da linha base (eletrodo 1), medições de voltametria de pulso diferencial (v=15 mV.s-1) no eletrodo screen-printed conectado a um potenciostato PalmSens 3, (Compact Electrochemical Interfaces) foram obtidas, utilizando 50 a 120 pL de tampão fosfato (0,1 a 1 mol.L- 1) como eletrólito suporte (detecção indireta).
[068] Eletrodos 2, 3, 4 e 5: para os testes (Α, Β e C), foram aplicados na superfície de trabalho dos eletrodos 2 a 10 μL do antígeno específico de M. leprae (PGL-1, LAM ou outros antígenos específicos de micobactérias) e incubados a temperatura entre 25 a 37° durante 5 a 50 minutos. Posteriormente, foram aplicados 2 a 10 μL de albumina de soro bovino (BSA) 0,1 a 5% e incubados por mais 5 a 50 minutos para bloqueio da adsorção inespecífica das biomoléculas. Em seguida, os eletrodos foram lavados com 50 a 120 μL de água ultrapurificada e secados.
[069] Após este procedimento, foi adicionado 2 μL de rodamina 6G no eletrodo 2 e incubado por 20 minutos. Em seguida, o eletrodo foi lavado com 100 μL de água ultrapurificada e secado. As medições foram realizadas no PalmSens semelhante aquelas descritas para o eletrodo 1.
[070] Para o teste “A”, nos eletrodos previamente preparados com o antígeno (PGL-1, LAM ou antígenos específicos de micobactérias), BSA e rodamina 6G foram adicionados 2 μL das amostras de saliva positiva para M. leprae (eletrodo 3), saliva negativa (eletrodo 4) e saliva positiva para M. tuberculosis (eletrodo 5), todos incubados por 30 minutos. Em seguida, os eletrodos foram lavados com 50 a 120 μL de água ultrapurificada e secados.
[071] Posteriormente, as medições foram realizadas no PalmSens como descrito anteriormente. Para os testes “B" e “C” foi utilizado o mesmo procedimento inicial para a preparação dos antígenos (PGL-1, LAM ou antígenos específicos de micobactérias), BSA e rodamina 6G, no entanto variou-se quanto à disposição da rodamina 6G, conforme já descrito para cada teste. O teste “C” foi realizado em triplicata.
[072] O imunossensor caracteriza-se por ser funcional nas faixas de pH compreendidas entre 2 e 10,99; podendo utilizar amostras como saliva, sangue, urina, lágrima, leite materno, sêmen, suor e amostras teciduais.
[073] Exemplo 5
[074] Bead com proteína G acoplada
[075] Beads magnéticos, com proteína G acoplada, possuem afinidade específica anti-PGL1 ou anti-LAM ou outro anticorpo para micobactérias, e assim na presença de íma, a captura magnética permitirá a maior sensibilidade ao sistema na detecção eletroquímica conforme já descrito em BR 1020160190410.
[076] Exemplo 6
[077] Kit liofilizado e disposição direta da saliva e outras amostras biológicas
[078] A proposta de Kits liofilizados contendo anti-PGL1/anti-LAM ou outros anticorpos específicos para micobactérias, BSA, rodamina 6G, parte do princípio de duas formas para análise in house para que facilitar e agilizar o processo de diagnóstico.
[079] Forma 01: Beads magnéticas acopladas com proteína G e anticorpo. Após a imobilização dos anticorpos as moléculas de BSA bloqueiam as superfícies não ligantes ou inativas, evitando interação inespecífica das amostras. Esta solução foi liofilizada para proposta de um Kit estável esteja disponível no mercado. A próxima etapa, passa pela coleta de amostras de saliva ou outras amostras biológicas (saliva, sangue, urina, lágrima, leite materno, sêmen, suore amostras teciduais) dos pacientes avaliados como suspeitos ou com a soberania clínica determinada.
[080] Forma 02: Produção do kit liofilizado contendo PGL1/LAM ou outros antígenos específicos para micobactérias, BSA, rodamina 6G. Posteriormente, é adicionado a amostras de saliva ou outras amostras biológicas como suspeitos ou com a soberania clínica determinada. Após este procedimento, adiciona-se ímã para atrair as beads magnéticas e assim promover captura específicas do antígeno com anticorpo e respostas eletroquímicas serão avaliadas diferenciando paucibacilar e multibacilar.
[081] Conclusões
[082] O imunossensor desenvolvido destaca-se por promover o diagnóstico da hanseníase. Os resultados demonstraram que a rodamina 6G (R6G) é um indicador eletroquímico vantajoso por detectar indiretamente proteínas e carboidratos. Este estudo em particular mostrou que a ordem de adição do indicador eletroquímico interfere na sensibilidade e na especificidade de detecção de hanseníase. A presente invenção apresenta vantagens inerentes à sua rapidez no diagnóstico destas patogenias, aplicabilidade, sensibilidade, seletividade e baixo custo.
Claims (8)
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES PARA DETECÇÃO ELETROQUÍMICA INDIRETA DE MICOBACTÉRIAS é caracterizado por compreender as seguintes etapas:
- i. Escolha do eletrodo de trabalho podendo ser de grafite com Nanotubos de carbono e nanopartículas de ouro (screen printed DRP 110 - GPH-GNP110) ou outros eletrodos de trabalho constituídos;
- ii. Combinação de materiais nanotecnológicos como filmes poliméricos, grafeno, Nanotubos de carbono e nanopartículas,
- iii. Imobilização do anticorpo anti-PGL1, anti-LAM ou outro peptídeo/anticorpo mimético;
- iv. Incorporação do Indicador eletroquímico Rodamina 6G;
- v. Uso de amostras de fluidos biológicos;
- vi. Detecção dos picos de oxidação da Rodamina 6G identificado com potencial entre 0,30 e 0,95V.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por serem os eletrodos de trabalho de material condutor e, apresentar inércia eletroquímica na faixa de -0,4V e +1,4V (versus Ag/AgCl ou Ag), tal como grafite, carbono vítreo, pasta de carbono, diamante, ouro, platina.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser a alteração da ordem de adição do indicador eletroquímico Rodamina 6G sobre a superfície do eletrodo, antes ou após a disponibilidade das amostras de fluido, como também homogenizando antes de gotejá-la sobre o bioeletrodo, uma interferência significativa dependendo da biomolécula.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar o acoplamento de beads magnéticos ou outras partículas/cristais de grandeza micro ou manométrica para o diagnóstico das formas paucibacilar e multibacilar.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser funcional nas faixas de pH compreendidas entre 2 e 10,99.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar como amostras biológicas saliva, sangue, urina, lágrima, leite materno, sêmen, suor e amostras teciduais.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado na detecção de proteínas, que não apresentam aminoácidos oxidáveis, como antígeno, anticorpos, peptídeos, enzimas ou quaisquer outras proteínas ou fragmentos de proteínas biológicos ou sintéticos.
- PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE IMUNOSSENSORES, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser utilizado na obtenção de um Kit liofilizado contendo beads magnéticas acopladas a proteína G e/ou a anticorpos (como PGL1/LAM) e/ou outros antígenos específicos para micobactérias, seguido por etapas consecutivas ou em ordens alternadas de BSA, rodamina 6G, acrescentando amostras biológicos a fim de realizarem a suspensão, após este procedimento, adiciona-se ímã para atrair as beads magnéticas ocorrendo assim a captura magnética na superfície do eletrodo, na sequencia as respostas eletroquímicas são avaliadas possibilitando a diferenciação diagnóstica.
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| BR102017002143-2A BR102017002143A2 (pt) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Processo de construção de imunossensores para detecção eletroquímica indireta de micobactérias |
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-
2017
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