BR102016030134B1 - Processo de obtenção de nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanopartículas de sílica, nanocompósito assim obtido e seus usos - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NANOCOMPÓSITO À BASE DE ÓXIDO DE GRAFENO E NANOPARTÍCULAS DE SÍLICA, NANOCOMPÓSITO ASSIM OBTIDO E SEUS USOS. A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanopartículas de sílica como carreador de fármacos hidrofóbicos. O presente invento refere-se, ainda, ao nanocompósito obtido ou não pelo dito processo e seu uso na preparação de medicamentos para tratamentos antitumorais, antimicrobianos, anti-inflamatórios, antissépticos e anti malária sem, no entanto, se limitar a tais aplicações. Os nanocompósitos obtidos mostraram redução do teor de hemólise de no mínimo duas vezes menor e no máximo oito vezes menor do que o óxido de grafeno isoladamente quando expostos às células vermelhas do sangue. Adicionalmente, os nanocompósitos obtidos mostraram redução de interação com proteínas do sangue, podendo incluir a família proteica do sistema imunológico, prevenindo-se de sua eliminação prematura do sistema circulatório anteriormente ao carreamento do fármaco hidrofóbico no alvo biológico.

Description

Campo da invenção:

[001] A presente invenção pertence ao campo da nanotecnologia compreendendo as áreas de química de materiais e química do estado sólido com ênfase na nanomedicina.

[002] Mais especificamente, a presente invenção refere- se ao processo de obtenção de nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanopartículas de sílica como carreador de fármacos hidrofóbicos, nanocompósito obtido ou não pelo dito processo e seu uso na preparação de medicamentos para tratamentos antitumorais, antimicrobianos anti- inflamatórios, antissépticos e anti-malária.

Fundamentos da invenção:

[003] O óxido de grafeno (GO) é um material bidimensional de carbono compreendendo uma região na qual são encontrados átomos de carbono em hibridização sp2 (semelhante à estrutura intrínseca do grafeno)e outra onde são encontrados carbonos sp3 associados a funções oxigenadas.

[004] Além disso, o GO detém grupos funcionais epóxi e hidroxil localizados em seu plano basal e grupos carbonila e carboxil associados preferencialmente às bordas das folhas bidimensionais, conferindo-lhe possibilidade de diversas funcionalizações no processo de aquisição de novas propriedades físico-químicas de interesse. O referido material detém, intrinsecamente, propriedades interessantes, como elevada hidrofilicidade, capacidade de formar dispersões em diversos solventes orgânicos, alta resistência mecânica, significativa área superficial e transparência óptica. Levando-se em consideração tais aspectos, tem-se no estado da técnica uma gama de tecnologias baseadas em GO nessa área.

[005] No entanto, sua aplicação e/ou interação com sistemas biológicos é ainda uma nova tendência mundial e, nesse panorama, o óxido de grafeno é um potencial candidato devido à sua alta biocompatibilidade e baixa toxicidade quando funcionalizado com moléculas-chave, somados ao fato de que materiais de carbono são referenciados como compatíveis com sistemas vivos. Nesse sentido, existem tecnologias relacionadas a nanocompósitos de GO funcionalizado utilizados como plataforma para carreamento de fármacos (drug delivery), imageamento de células e interações com sistemas biológicos. Especificamente para sistemas de entrega de fármacos, a interação entre o grafeno e os ativos ocorre através de interações n-n, de caráter não covalente, caracterizando a principal maneira pela qual fármacos são adsorvidos neste tipo de nanoestrutura.

[006] As nanoparticulas de silica, por sua vez, possuem propriedades interessantes no que se refere à sua aplicação como nanocarreadores de fármacos, visto que sua estrutura esférica serve como compartimento para encapsulamento e sua grande área superficial interna e externa permite inúmeras possibilidades de funcionalização em virtude da presença dos grupos silanóis Si-OH, possibilitando a obtenção de novas e importantes propriedades fisico-quimicas. O interior das nanoparticulas pode, ainda, ser funcionalizado com funções orgânicas hidrofóbicas que interagem substancialmente com fármacos antitumorais (a maioria, também de natureza hidrofóbica), garantindo sua retenção e integridade fisico- quimica até serem liberados.

[007] Externamente à superficie das nanoparticulas, podem também ser enxertadas funções orgânicas de origem hidrofilica, importantes para a estabilidade coloidal em fluidos biológicos como o sangue (também hidrofilico, compreendendo espécies que proporcionam possibilidades de formação de ligações covalentes e/ou estabilidade coloidal (grupos aminopropil) para posterior funcionalização das nanoparticulas em superficie de nanomateriais suporte como o óxido de grafeno, grupos poliméricos à base de polietilenoglicol de diversos tamanhos de cadeia para efeitos de biocompatibilidade, ligantes para células cancerígenas e marcadores moleculares, sendo estes últimos importantes para a aquisição de propriedades de imageamento celular. Embora referenciadas como "seguras" pela agência americana Food and Drugs Administration (FDA), as nanoparticulas de silica merecem atenção no contexto de toxicidade em relação a biossistemas. Mais especificamente, sabe-se da significativa afinidade quimica dos grupos silanóis por grupos fosfatidilcolina presentes na membrana celular de hemácias, relacionada a elevados efeitos hemoliticos e, portanto, atrelada a baixa biocompatibilidade. Não obstante, a nanoparticula de silica isenta de funcionalização na superficie externa necessita ser submetida a um processo de pós-modificação ou ser adicionada em nanomateriais biocompativeis de modo a possibilitar sua aplicação intravenosa e, conforme é relatada, a funcionalização das referidas nanoparticulas permite "blindar" os grupos silanóis e reduzir efeitos hemoliticos.

[008] Do ponto de vista de aplicação, a presente invenção é aplicada para a resolução da baixa solubilidade de fármacos hidrofóbicos antitumorais no sangue, um fluido hidrofilico. No estado da técnica são conhecidas as propriedades fisico- quimicas do óxido de grafeno no contexto de estabilidade em meios hidrofilicos e sua eficiente interação quimica com fármacos. Adicionalmente, além da problemática a respeito dos elevados teores de hemólise pela nanoparticula de silica, no estado da técnica existem, ainda, relatos de que o óxido de grafeno possa ou não gerar hemólise em virtude de sua elevada interação com células vermelhas.

[009] No entanto, tal propriedade depende das propriedades intrínsecas do material e estas, por sua vez, estão relacionadas com a maneira pela qual o material é produzido. O óxido de grafeno sintetizado da presente invenção, por exemplo, gerou elevados teores de hemólise. Para a resolução desses problemas, pensou-se na interação mútua da silica com o GO, de modo que o nanocarredor esférico interaja com as folhas minimizando as interações responsáveis pela hemólise e, simultaneamente, o óxido de grafeno recubra os grupos silanóis no intuito de amenizar os mesmos efeitos gerados pelas nanoparticulas quando aplicados diretamente.

[0010] Ainda do ponto de vista de aplicação, um dos problemas resolvidos pela presente invenção é a elevada interação que a nanoparticula de silica e o óxido de grafeno (individualmente) detém com proteinas do plasma. Mais especificamente, o fluido sanguineo compreende proteinas denominadas opsoninas que interagem com corpos estranhos no sangue e sinalizam o sistema imunológico para sua eliminação do organismo, acarretando diminuição do tempo de circulação sanguínea e, consequentemente, evitando alcance à célula alvo. Os resultados obtidos após a obtenção do nanocompósito mostraram, ainda, significativa redução da interação do referido nanomaterial com as proteínas do sangue, podendo incluir nesse panorama a redução de interação com as opsoninas. Consequentemente, espera-se um aumento no tempo de circulação sanguínea em virtude da menor probabilidade de fagocitose pelos glóbulos brancos que dependem da referida ação protéica para a ação.

[0011] Do ponto de vista da estabilidade do nanomaterial em água e de processo (dois problemas inter-relacionados) , outra problemática resolvida pela presente invenção é a baixa estabilidade aquosa do nanocompósito de óxido de grafeno e silica principalmente quando obtido através de métodos de produção relatados no estado da técnica. O controle no processo de mistura de ambas as nanoestruturas é importante, visto que o nanocompósito possui elevada quantidade de massa em relação aos materiais isolados, característica diretamente relacionada com sua estabilidade de dispersão. A maioria das tecnologias à base de óxido de grafeno e silica existentes são aplicadas para fins eletrônicos, de catálise ou para extração em fase sólida, isto é, o material obtido no estado sólido é um dos requisitos para o sucesso nesses casos, não sendo necessário obter-se uma dispersão estável em água. Dessa maneira, os métodos de produção vigentes não geram materiais estáveis e, somado ao fato de haver poucas tecnologias à base de GO-SÍO2 para aplicações biológicas, significativo esforço foi direcionado para o desenvolvimento de um novo método para produção de um nanocompósito estável, uma vez que a estabilidade aquosa é diretamente relacionada com a maneira na qual o material é obtido. Para melhor compreensão dos problemas do estado da técnica relatados acima (resolvidos pela presente invenção), são descritas a seguir as tecnologias existentes mais relevantes, suas limitações, e as vantagens da presente invenção em relação a cada uma delas.

[0012] O documento de Speltini et al., denominado "Graphene-derivatized silica as an efficient solid-phase extraction sorbent for pre-concentration of fluoroquinolones from water followed by liquid-chromatography fluorescence detection" publicado na revista Journal of Chromatography A em 30 de janeiro de 2015, descreve um material à base de óxido de grafeno reduzido e microparticula de silica isenta de funções orgânicas na superficie interna para aplicação em processos de extração em fase sólida. A tecnologia descrita no periódico assemelha-se à presente invenção pelo fato de compreender um material à base de grafeno e silica esférica, por compreender ligação covalente entre ambos os constituintes e pelo fato de o material SÍO2 apresentar grupos -NH2 na superficie externa. A presente invenção, no entanto, difere-se da tecnologia mencionada pelo fato de compreender óxido de grafeno e nanoparticulas de silica (a tecnologia utiliza óxido de grafeno reduzido e microparticulas de silica). Óxido de grafeno reduzido é conhecido pela sua baixa estabilidade em água. Adicionalmente, a presença de partículas de dimensões significativas na ordem do micrômetro também contribui para esse efeito, inviabilizando sua aplicação biológica como a antitumoral, cuja estabilidade da dispersão é crucial para a efetiva circulação sanguinea do nanomaterial para entrega de fármacos em células alvo. Além disso, a tecnologia publicada por Speltini compreende partículas de silica isentas de funções orgânicas hidrofóbicas na superfície interna, importantes para o encapsulamento de fármacos hidrofóbicos. Nesse contexto, a presente invenção compreende óxido de grafeno, material constituinte de grupos carboxilicos, epóxi, hidroxi, aldeido e cetonas que conferem estabilidade aquosa, nanoparticulas de silica (dimensões nanométricas) abrangendo superfície interna funcionalizada com funções hidrofóbicas fenila (encapsulamento de fármacos hidrofóbicos) e externamente com funções amino bem como fármaco hidrofóbico encapsulado. A presença de um fármaco no nanocompósito como um todo também diferencia a presente invenção da tecnologia descrita no documento de anterioridade. No que se refere ao processo, o artigo mencionado utiliza solventes tóxicos como a dimetilformamida e realiza o processo a 60°C (maior demanda energética). Na presente invenção, água é utilizada como solvente reacional, a reação é executada à temperatura ambiente e em meios reacionais revestidos com material plástico compreendendo um dos diferenciais no contexto de processo. A utilização de reatores de vidro gera impurezas, característica frequentemente omitida nos protocolos processuais no estado da técnica. Adicionalmente, a proporção mássica de silica em relação ao grafeno utilizada no processo da tecnologia existente é de 10 mg de SÍO2 para 1 mg de grafeno enquanto que na presente invenção 0,5 mg (quantidade máxima) de silica são acoplados para cada 1 mg de grafeno, aspecto importante para a obtenção de uma dispersão aquosa estável, importante para aplicações intravenosas. Durante o desenvolvimento da presente invenção, foi constatado que quantidades significativas de silica em relação ao GO bem como a adição rápida do material esférico durante a reação são fatores atrelados à formação de um nanomaterial com baixa estabilidade aquosa, sendo necessários a quantidade máxima de 50% de silica em relação ao GO (massa/massa) e adição vagarosa da nanoparticula para maior homogeneidade e garantia de obtenção de um material estável. Do ponto de vista de aplicações que demandam o material na forma de dispersão, o produto obtido no artigo descrito pode não compreender estabilidade aquosa, inviabilizando sua aplicação biológica.

[0013] O documento de Zhang et al., denominado "Preparation and retention mechanism study of graphene and graphene oxide bonded silica microspheres as stationary phases for high performance liquid chromatography", publicado na revista Journal of Chromatography A em 4 de agosto de 2013, descreve urn material à base de grafeno ou óxido de grafeno e particulas de silica de dimensão micrométrica (isenta de funções hidrofóbicas na superfície interna e com funções amino na superfície externa) para aplicações em cromatografia liquida. A tecnologia mencionada assemelha-se à presente invenção pelo fato de o material compreender óxido de grafeno, silica esférica e pelo fato de a interação entre ambos os constituintes ser através de ligação covalente. A presente invenção, no entanto, diferencia-se da tecnologia existente pelo fato de compreender partículas de sílica em dimensões nanométricas, abranger grupos hidrofóbicos funcionalizados na superfície interna, pela quantidade de SÍO2 ser minoritária em até 50% em massa com relação ao GO (a tecnologia utiliza sílica como componente majoritário em quantidade mínima de 20 mg para 1 mg de GO, implicando em problemas de estabilidade de dispersão aquosa já comentados), por compreender um fármaco hidrofóbico encapsulado e pelo fato de a morfologia do nanomaterial ser de folhas abrangendo nanoparticulas de sílica. A morfologia do material produzido por Zhang et al. é distinta em relação à presente invenção, pois trata-se de uma estrutura esférica (grafeno ou óxido de grafeno funcionalizado na superfície de micropartículas de sílica). Na presente invenção, nanoparticulas são aderidas em folhas de óxido de grafeno, preservando majoritariamente a estrutura bidimensional das folhas, importante característica no que se refere à maior acessibilidade química ou elevada área superficial para funcionalização de fármacos. Tratando-se da diferenciação técnica processual, o processo descrito no presente pedido de patente assemelha- se à tecnologia existente pelo fato de utilizar água como solvente reacional, utilizar EDC/NHS como crosslinker para efetivação da ligação covalente entre a sílica e grafeno mediante formação de ligação amida oriunda da reação química entre os grupos -NH2 do componente SÍO2 e ácidos carboxílicos do GO e pelo fato de ser à temperatura ambiente - o EDC e NHS, do inglês l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida e N-hidroxisuccinimida, respectivamente, são duas moléculas orgânicas catalisadoras de reações de amidação. O processo da presente invenção, no entanto, diferencia-se da tecnologia existente pelo fato de utilizar os componentes nanoestruturados em concentrações diluidas, sendo 0,1 mg/mL a concentração máxima de ambos durante a reação para garantia de melhor homogeneidade para funcionalização da silica nas folhas de óxido de grafeno e, consequentemente, contribuindo para formação de uma dispersão aquosa estável (Zhang et al. utilizam a concentração de silica em 10 mg/mL, contribuindo para aglomeração do sistema durante a reação quimica, e concentração minima de 0,1 mg/mL de GO) . Adicionalmente, a presente invenção diferencia-se da tecnologia pelo fato de realizar reação de óxido de grafeno com EDO por lhora e prosseguir o processo com reação com NHS durante 23horas. Esse aspecto reacional permite maior probabilidade de formação do éster NHS (espécie intermediária anterior à formação da ligação amida) nos grupos carboxilicos do GO, importante para maior quantidade de silica ser acoplada covalentemente nas folhas. Posteriormente, silica é adicionada vagarosamente (detalhe técnico também importante para garantia de obtenção de uma dispersão estável) e misturada ao GO durante outro periodo de 24horas de reação, encerrando um processo de 48horas de reação em ambientes revestidos com material plástico (ambientes revestidos de material vitreo devem ser evitados no intuito de prevenir a reação de silica presente no vidro com o óxido de grafeno, aspecto pouco relatado no estado da técnica e que compreende um dos diferenciais da presente invenção). Na tecnologia descrita, GO, SÍO2, EDC/NHS são adicionados em uma única reação de 24horas, o que pode interferir na homogeneidade e estabilidade da dispersão final somado ao fato de que as proporções massa/massa de silica e óxido de grafeno também contribuem para esse efeito. Os autores, ainda, não mencionam a natureza do material revestido no ambiente reacional e não relatam a velocidade de adição dos componentes.

[0014] O documento de Yao et al., denominado "Fabrication of Fesθ4/Siθ2 core/shell nanoparticles attached to graphene oxide and its use as an adsorbent" publicado na revista Journal of Colloid and Interface Science em 20 de abril de 2012, relata urn nanomaterial à base de óxido de grafeno compreendendo nanoparticulas de silica abrangendo um núcleo interno de natureza magnética devido à presença de FeaCU (isento de funções hidrofóbicas) e superfície externa funcionalizada com grupos amino, aplicado para a remoção de corantes catiônicos de soluções aquosas. A tecnologia descrita no artigo assemelha-se à presente invenção pelo fato de compreender um nanomaterial de óxido de grafeno e partículas de silica em dimensões nanométricas, pelo fato de a nanoparticula esférica abranger superfície externa funcionalizada com grupos amino e por abranger ligações covalentes que caracterizam a interação entre o grafeno e silica. Diferentemente da tecnologia existente, a presente invenção compreende um nanomaterial cujas nanoparticulas de silica abrangem funções orgânicas hidrofóbicas funcionalizadas em sua superfície interna, dimensões entre 50 e 80 nm (as nanoparticulas de silica magnéticas na tecnologia existente abrangem diâmetro entre 30 e 40 nm), e distribuição de poros entre 3 e 20 nm (maior acessibilidade quimica para encapsulamento de fármacos, característica importante na descrição de um nanocarreador e que não foi avaliada). Adicionalmente, na presente invenção a quantidade de nanoparticulas de silica em relação ao óxido de grafeno é de até 50% em massa, característica importante para a manutenção da estabilidade do nanocompósito em água - acima desse valor percentual o nanocompósito final pode coalescer devido à significativa massa associada, afetando sua estabilidade aquosa. Nesse contexto, a tecnologia existente adiciona sílica em 100% de massa em relação ao GO. Ainda, a presente invenção difere-se do produto comentado pelo fato de compreender, também, um fármaco hidrofóbico. É importante notar que Yao et al. utiliza apenas a nanoestrutura GO@SiO2 para aplicação final. No caso da presente invenção, a nanoestrutura e o fármaco compreendem o produto final que é aplicado no tratamento antitumoral, sem, no entanto, se limitar a essa aplicação. No que se refere ao processo, a tecnologia descrita por Yao et al. assemelha-se à presente invenção pelo fato de executar, em primeiro passo, a reação química entre o GO e os agentes de crosslinker EDC/NHS, adicionar a sílica e prosseguir a reação química utilizando- se água como solvente reacional. A presente invenção, no entanto, difere-se da tecnologia existente pelo fato de realizar, primeiramente, a reação química entre o GO e EDO por lhora, adicionar NHS e agitar durante 23horas e, finalmente, prosseguir com adição do nanocarreador SÍO2 e efetuar a reação por mais 24horas. A reação com EDO, primeiramente, é importante para sua efetiva interação com os ácidos carboxílicos do óxido de grafeno, sendo necessário tempo considerável. Ainda, a adição de NHS (que reage quimicamente com o EDO ligado no GO) e sua reação por 23horas aumenta consideravelmente a probabilidade de formação do intermediário EDC/NHS que reage com os grupos amino da sílica. Por fim, a reação química com a sílica durante outro período de 24horas torna mais eficiente a reação química entre as nanopartículas e as folhas, importante aspecto para a forte interação entre ambos os componentes. A tecnologia adiciona EDC e NHS simultaneamente no frasco com GO, reagindo os componentes por um período de apenas lhora. Sequencialmente, sílica é transferida ao meio reacional em outra reação química que perdura por apenas lhora - nesse contexto, o processo abrangido na presente invenção se mostra mais eficiente pelo fato de realizar a produção em três etapas importantes para a efetiva formação do intermediário EDC/NHS e garantia de maior probabilidade de ligação covalente entre a sílica e óxido de grafeno, aumentando o rendimento da reação comparado com o protocolo de produção de Yao et al. É importante notar que a formação da ligação amida ocorre devido à presença dos catalisadores mencionados, sendo necessário maior tempo para sua interação inicial com os grupos carboxílicos na folha de GO. Outro aspecto importante que enquadra a presente invenção como diferencial em relação à tecnologia existente do ponto de vista de processo é o fato de adicionar a sílica vagarosamente no meio reacional de modo a proporcionar melhor dispersão pelas folhas de óxido de grafeno e pelo fato de ambos os componentes abranger concentração de até 0,1 mg/mL, crucial para a formação de um nanocompósito estável em dispersão aquosa. Segundo os autores, a sílica na forma sólida é adicionada diretamente na reação, o que acarreta significativa aglomeração do sistema e probabilidade de altas concentrações de SÍO2 locais na folha (heterogeneidade e baixa estabilidade). Também, os autores relatam reações em concentrações de 5 mg/mL para ambas as nanoestruturas, somando na contribuição de baixa estabilidade do sistema desenvolvido. Adicionalmente, a proporção mássica entre SÍO2 e GO no trabalho publicado na Journal of Colloid and Interface Science é de 1 mg para 1 mg (quantidades dos nanomateriais em proporções iguais, ou seja 1:1), o que também proporciona aglomeração do sistema, um dos problemas resolvidos na presente invenção.

[0015] O documento de Liang et al., denominado "A novel octadecylsilane functionalized graphene oxide/silica composite stationary phase for high performance liquid chromatography", publicado na revista Journal of Separation Science em 27 de abril de 2012, relata urn material à base de microparticulas de silica (isenta de funcionalizações na superficie interna e funcionalizada externamente com grupos amino) e óxido de grafeno funcionalizado com grupos octadecilsilano (hidrofóbico) aplicado a cromatografia liquida. O produto é obtido hierarquicamente mediante funcionalização externa das partículas de silica (dimensões micrométricas) com óxido de grafeno de modo a recobri-las em toda a sua superficie para formação de um núcleo de silica e casca de GO. Sobre a superficie deste último, silano octadecil é funcionalizado - a morfologia do material final é definida por microesferas hibridas.

[0016] A tecnologia mencionada assemelha-se à presente invenção pelo fato de compreender um material à base de silica funcionalizada com grupos NH2, óxido de grafeno e por abranger uma função hidrofóbica. A presente invenção difere- se da tecnologia existente pelo fato de a partícula de silica compreender dimensões nanométricas, por abranger funções hidrofóbicas funcionalizadas em seu interior poroso e compreender um fármaco hidrofóbico encapsulado. Ainda, o nanomaterial descrito no presente pedido de patente compreende morfologia compreendendo folhas decoradas com nanoparticulas esféricas enquanto que o produto de Liang et al. abrange forma de microesferas encapsuladas/revestidas com as folhas de GO, cujo raciocínio para explicação da vantagem morfológica da presente invenção é semelhante ao que foi exemplificado na diferenciação técnica no documento de Zhang et al.

[0017] É importante notar que a aplicação antitumoral da tecnologia existente não é viável, uma vez que as funções hidrofóbicas estão presentes em sua superficie externa, isto é, o produto como um todo é hidrofóbico e não pode ser disperso em meio aquoso - deve-se lembrar que materiais hidrofóbicos não detém estabilidade no sangue pelo fato de este fluido ser hidrofilico. Do ponto de vista de processo, a tecnologia existente realiza a mistura de silica (10 mg/mL) em GO (1 mg/mL) em meio aquoso durante 12horas a 80°C. A presente invenção diferencia-se do referido processo pelo fato de a reação entre ambos os componentes ser intermediada pelo crosslinking de EDC/NHS em três importantes etapas que encerram um periodo de 48horas e que possibilita que as nanoparticulas de SÍO2 sejam funcionalizadas covalentemente sobre a superficie das folhas de GO, e a concentração de ambos os materiais ser de até 0,1 mg/mL e a temperatura ser ambiente.

[0018] O documento de Li et al., denominado "Docetaxel- loaded Siθ2@Au@GO core-shell nanoparticles for chemophotothermal therapy of cancer cells", publicado na revista Royal Society of Chemistry (RSC) Advances em 29 de abril de 2016, refere-se a um nanocompósito de óxido de grafeno funcionalizado na superficie externa de nanoparticula de ouro (casca) e silica (núcleo) compreendendo fármaco docetaxel (hidrofóbico) adsorvido na superficie externa do referido nanomaterial cuja morfologia final é esférica (GO adsorvido na silica esférica) - as nanoparticulas de silica reportadas são maciças e funcionalizadas com grupos amino e a casca de ouro compreende polietilieno glicol (PEG) com grupos NH2 funcionalizado. A tecnologia assemelha-se à presente invenção pelo fato de compreender um nanocompósito à base de nanoparticula de silica (funcionalizada externamente com grupos amino), óxido de grafeno e fármaco hidrofóbico. A presente invenção, no entanto, difere-se da tecnologia pelo fato de a nanoparticula de silica compreender funções hidrofóbicas funcionalizadas na superficie interna, ser oca (constituir uma casca), de compreender diâmetro de particula entre 50 e 80 nm (as nanoparticuas de SÍO2 publicadas abrangem tamanhos entre 143 e 620 nm), de o óxido de grafeno compreender dimensões entre 550 e 3500 nm e de a interação entre GO e SÍO2 ser através de ligação covalente amida (na tecnologia existente ambos os componentes possivelmente interagem entre si através de interações eletrostáticas em função da presença de grupos NHa+ do PEG enxertado na superficie externa da nanoparticula de ouro e dos grupos COO- ou carboxilatos presentes na superficie do óxido de grafeno). É importante salientar que a ligação covalente, mais forte em comparação com as interações eletrostáticas, é importante para significativa interação das nanoparticulas de silica com o óxido de grafeno, mantendo-se a integridade estrutural.

[0019] Adicionalmente, a presente invenção difere-se da tecnologia existente pelo fato de compreender morfologia à base de folhas decoradas com nanoparticulas esféricas. Do ponto de vista de processo, a tecnologia mencionada assemelha-se à presente invenção pelo fato de utilizar água como meio reacional. O invento aqui descrito difere-se, no entanto, pelo fato de utilizar catalisador EDC/NHS na reação, de realizá-la em 3 importantes etapas encerrando um periodo de 24horas, pela concentração inicial dos componentes nanoestruturados ser de até 0,1 mg/mL e a adição de silica ser vagarosa.

[0020] Considerando-se os problemas do estado da técnica comentados acima, a presente invenção compreende diferencial técnico sob diversos aspectos. Do ponto de vista de produto, o diferencial da presente invenção é a combinação de duas nanoestruturas (óxido de grafeno e nanoparticula de silica) e um fármaco hidrofóbico. Adicionalmente, a presença de grupos hidrofóbicos nos poros do nanocarreador de SÍO2 também contribui para o destaque técnico da invenção proposta. A silica detém significativo potencial de encapsulamento de fármaco devido à sua morfologia esférica e porosa, à sua elevada área superficial e em virtude da presença de funções hidrofóbicas no interior de seus poros, que intensifica o referido efeito. A ligação covalente entre ambos os componentes (óxido de grafeno e nanoparticulas de silica) caracteriza outro diferencial, importante para a manutenção da integridade estrutural durante os processos de drug delivery. A referida combinação, por sua vez, é responsável pela sua interação compatível com células vermelhas do sangue, caracterizado por efeitos hemoliticos significativamente reduzidos quando comparados com os nanomateriais isolados, redução da interação com proteinas do sangue, possivelmente atrelada à redução de interação com proteinas especificas do sistema imunológico, e aumento da eficiência de encapsulamento também em comparação com ambos os materiais aplicados de maneira isolada.

[0021] O processo detém o diferencial de ser realizado em três etapas importantes: 1) adição de EDC no GO e reação por lhora; 2) adição de NHS e reação por 23horas; adição de silica e reação por 24horas. Adicionalmente, contribuem para o diferencial processual o fato de a concentração dos componentes nanoestruturados ser de até 0,1 mg/mL durante a reação, a silica ser adicionada vagarosamente (gota a gota) por pelo menos 20 minutos e em quantidades de até 50% de massa em relação ao GO, o meio reacional ser revestido de material plástico para evitar reações com as paredes do meio reacional quando o material é composto de vidro, e o nanocompósito final ser direcionado à filtração acompanhada de sucessivas lavagens com álcool metilico e água.

Breve descrição da invenção:

[0022] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica, nanocompósito obtido ou não pelo dito processo e seus usos como carreador de fármacos hidrofóbicos na preparação de medicamentos para tratamentos antitumorais, antimicrobianos, anti-inflamatórios, antissépticos e anti malária.

[0023] O processo de obtenção de nanocompósito à base de óxido de grafeno compreende nanoparticulas de silica e as seguintes etapas: preparar uma dispersão aquosa de óxido de grafeno em meio reacional revestido com material plástico; diluir a dispersão de óxido de grafeno com água; esfoliar a dispersão de óxido de grafeno; preparar uma dispersão aquosa de nanoparticulas de silica funcionalizadas com grupos amino na superficie externa; homogeneizar a dispersão de nanoparticulas de silica; adicionar lentamente cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC) aquoso na dispersão de óxido de grafeno e agitar até que se obtenha homogeneidade e distribuição de espécies EDC no decorrer das folhas de óxido de grafeno; adicionar N-hidroxisuccinimida (NHS) aquoso no meio reacional e agitar; adicionar a dispersão de nanoparticulas de silica no meio reacional sob agitação constante, e agitar a mistura para formação do nanocompósito; separar o nanocompósito das nanoparticulas de silica que não formaram ligação covalente às folhas de GO, por meios de separação; lavar o nanocompósito obtido com pelo menos 200 mL de álcool metilico até a remoção do excesso de EDC e NHS, e pelo menos 800 mL de água até a remoção do álcool, da silica não ligada ao óxido de grafeno e moléculas de EDC e NHS que atuam como catalisadores; suspender o nanocompósito obtido em água, obtendo-se o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica, em dispersão aquosa; preparar a dispersão do nanocompósito em concentrações entre 1 e 10 mg/mL; adicionar fármaco hidrofóbico na dispersão e misturar; separar o nanocompósito compreendendo o dito fármaco encapsulado na nanoparticula e incorporado no óxido de grafeno, do fármaco não encapsulado e incorporado, por meios de separação; obter o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica como carreador de fármacos hidrofóbicos.

[0024] O nanocompósito obtido ou não pelo dito processo compreende razão de óxido de grafeno:nanoparticula de silica entre 24:1 (m/m) e 2:1 (m/m) ; estrutura bidimensional de folhas de óxido de grafeno decoradas com nanoparticulas de silica mesoporosa; ligação covalente entre o óxido de grafeno e as nanoparticulas de silica mesoporosa; nanoparticulas de silica mesoporosa compreendendo superficie interna funcionalizada com grupos hidrofóbicos e superficie externa funcionalizada com grupos aminopropil ou PEG amino; fármaco hidrofóbico encapsulado nas nanoparticulas de silica mesoporosa e incorporado no óxido de grafeno.

[0025] Por fim, a presente invenção descreve, ainda, o uso do nanocompósito como carreador de fármacos hidrofóbicos na preparação de medicamentos para tratamentos antitumorais, antimicrobianos, anti-inflamatórios, antissépticos e anti malária.

Breve descrição das figuras:

[0026] Figura 1: esquema da obtenção das nanoparticulas de silica contendo grupos fenila internos e funções amina externas (A) ; e dos nanocompósitos de óxido de grafeno e silica (B).

[0027] Figura 2: espectro de infravermelho (A), curvas termogravimétricas (B), isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio (C) e gráfico de distribuição de poros das nanoparticulas de silica.

[0028] Figura 3: espectros de RMN 13C (A) e 29Si (B) , difratograma de raios-X (C) e imagem de microscopia eletrônica de varredura (D) das nanoparticulas de silica com grupos fenila internos e funções amina externos.

[0029] Figura 4: espectro de infravermelho (A), espectro Raman (B) , curva termogravimétrica (C) , difratograma de raios-x e imagem de microscopia eletrônica de transmissão (E) do óxido de grafeno.

[0030] Figura 5: espectros de infravermelho (A), curvas termogravimétricas (B) e difratogramas de raios-x (C) dos nanocompósitos de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica.

[0031] Figura 6: espectros de XPS survey dos nanomateriais de partida GO e H2N-SÍO2 e dos nanocompósitos GO-SÍO2 (A) , espectros XPS Cis do óxido de grafeno (B) , nanoparticula de silica com grupos fenila internos e funções amina externos (C) , GO-3SÍO2 (D) , GO-2SÍO2 (E) e GO-ISÍO2 (F) .

[0032] Figura 7: espectros de XPS Nis da H2N-SÍO2 (A) , dos nanocompósitos GO-3SÍO2 (B) , GO-2SÍO2 (C) e GO-ISÍO2.

[0033] Figura 8: imagens de microscopia eletrônica de transmissão dos nanocompósitos GO-3SÍO2 (A), GO-2SÍO2 (B) e GO-ISÍO2 (C) .

[0034] Figura 9: gráfico de hemólise pelo óxido grafeno e nanocompósitos de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica.

[0035] Figura 10: SDS-PAGE de proteinas corona fortemente adsorvidas e extraidas da superficie de óxido de grafeno e dos nanocompósitos de óxido de grafeno e silica.

Descrição detalhada da invenção:

[0036] A presente invenção compreende um processo de obtenção do nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica como carreador de fármacos hidrofóbicos, que compreende as seguintes etapas: a) preparar uma dispersão aquosa de óxido de grafeno em concentrações entre 0,1 e 1 mg/mL em meio reacional revestido com material plástico; i) diluir a dispersão de óxido de grafeno compreendida na etapa (a), com água; ii) esfoliar a dispersão de óxido de grafeno compreendida na etapa (al) por pelo menos 1 hora por meios ultrassónicos; b) preparar uma dispersão aquosa de nanoparticulas de silica funcionalizadas com grupos amino na superficie externa, em concentrações entre 0,01 e 0,1 mg/mL: i) dissolução de surfactante, preferencialmente o brometo de hexadeciltrimetilamônio, entre 0,65 e 0,75 g, preferencialmente 0,75 g, em catalisador de amónia em concentração entre 0,03 e 0,07 mol/L, preferencialmente 0,05 mol/L, e solvente de reação alcoólico em volumes entre 2,5 e 3,8 mL, preferencialmente 3,2 mL; ii) agitação da solução obtida na etapa anterior em temperatura entre 40 e 80 °C, preferencialmente 60 °C; iii) adição de precursor inorgânico de silicio entre 1 e 3 mL, preferencialmente 1,5 mL, em feniltrietóxisilano (PTES) entre 10 a 40% de mol-Si; iv) adição lenta da solução obtida na sub etapa (iii) na solução obtida na sub etapa (i); v)agitação da solução obtida na etapa anterior durante 120 minutos em temperaturas entre 40 e 80 °C, preferencialmente 60 °C: 1) adição de precursor inorgânico de silicio, após 60 minutos de reação, em quantidades volumétricas entre 100 e 150 μL, preferencialmente 124 μL; 2) adição de precursor inorgânico de silicio, após 90 minutos de reação, em quantidades volumétricas entre 100 e 150 μL, preferencialmente 124 μL; vi) Centrifugação por entre 40 e 80 minutos, preferencialmente 60 minutos, entre 10.000 e 20.000 rpm, preferencialmente 15.000; descarte do sobrenadante e redispersão em etanol, obtendo-se dispersão de nanoparticulas de partida; vii) dispersão de nanoparticulas de partida em massas entre 50 e 500 mg, preferencialmente 300 mg, em solvente etanol em volumes entre 20 e 60 mL, preferencialmente 40 mL; agitação da solução entre 40 e 90 minutos, preferencialmente 75 minutos em temperatura entre 40 e 80 °C, preferencialmente 60 °C; viii) Adição de silano aminopropil ou silano-PEG amino na solução da sub etapa (vii); ix)Agitação da solução da sub etapa (viii) entre 10 e 20 horas, preferencialmente 13 horas; x) Centrifugação da solução compreendida na sub etapa (ix) entre 40 e 80 minutos, preferencialmente 60 minutos, entre 10.000 e 20.000 rpm, preferencialmente 15.000; descarte do sobrenadante e redispersão em etanol; repetida pelo menos duas vezes; xi) Obtenção das nanoparticulas de silica funcionalizadas com grupos amino na superficie externa em etanol; xii) homogeneizar a dispersão de nanoparticulas de silica; c) adicionar lentamente cloridrato de N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC) aquoso na dispersão de óxido de grafeno obtida na etapa (aii) , em razão EDC:óxido de grafeno entre 1:10 (m/m) e 1:1 (m/m) e agitar até que se obtenha homogeneidade e distribuição de espécies EDC no decorrer das folhas de óxido de grafeno com largura e dimensões entre 550 e 3500nm; d) adicionar N-hidroxisuccinimida (NHS) aquoso em quantidades entre 0,1 e 1 mol para cada mol de EDC no meio reacional compreendido na etapa (c), e agitar; e) adicionar a dispersão de nanoparticulas de silica compreendida da etapa (bl) no meio reacional compreendido na etapa (d) sob agitação constante, e agitar a mistura para formação do nanocompósito; f) separar o nanocompósito compreendido na etapa (e) das nanoparticulas de silica que não formaram ligação covalente às folhas de GO, por meios de separação; g) lavar o nanocompósito obtido na etapa (f) com pelo menos 200 mL de álcool metilico até a remoção do excesso de EDC e NHS; e pelo menos 800 mL de água até a remoção do álcool, da silica não ligada ao óxido de grafeno e moléculas de EDC e NHS que atuam como catalisadores; h) suspender o nanocompósito obtido na etapa (g) em água, obtendo-se o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica, em dispersão aquosa; i) preparar a dispersão do nanocompósito compreendido na etapa (h) em concentrações entre 1 e 10 mg/mL; j) adicionar fármaco hidrofóbico na dispersão compreendida na etapa (i) e misturar; k) separar o nanocompósito compreendendo o dito fármaco encapsulado na nanoparticula e incorporado no óxido de grafeno, do fármaco não encapsulado/incorporado, por meios de separação; l) obter o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica como carreador de fármacos hidrofóbicos.

[0037] Sendo que: - na etapa (ai) a diluição água:óxido de grafeno é realizada na razão minima de 8:1 (v/m); - a razão de EDC:óxido de grafeno (m/m) é entre 1:10 (m/m) e 1:1 (m/m), preferencialmente 1:1 (m/m); - NHS é utilizado em quantidades entre 0,1 e 1 mol, preferencialmente 1 mol, para cada 1 mol de EDC; - razão de óxido de grafeno:nanoparticula de silica é entre 24:1 (m/m) e 2:1 (m/m); - o fármaco hidrofóbico ser adicionado na razão de até 1:10 (m/m) ao nanocompósito; - o fármaco hidrofóbico pode ser selecionado do grupo de fármacos compreendendo a curcumina, camptotecina, docetaxel, doxorrubicina, violaceina, tamoxifeno, beta- lapacona e análogos, preferencialmente curcumina ou camptotecina; - os meios de separação da etapa (f) compreendem a filtração em membranas hidrofilicas compreendendo poros entre 0,09 e 0,22μm; - os meios de separação da etapa (k) compreendem a decantação por pelo menos 24 horas.

[0038] No que diz respeito às nanoparticulas de silica: - o precursor inorgânico de silicio compreende alcóxidos de silicio e organosilanos, preferencialmente o tetraetilortossilicato; - o silano aminopropil ou silano PEG amino são utilizados em quantidades entre 5 e 25% mol-Si; - o PEG compreendido no silano PEG amino compreende peso molecular entre 350 e 2000 Da; - o silano hidrofóbico é utilizado em quantidades entre 10 e 40% mol-Si, preferencialmente 30% mol-Si; - o grupo hidrofóbico compreendido no silano hidrofóbico compreende grupos hidrofóbicos selecionados dentre grupos aromáticos e derivados; e grupos à base de hidrocarboneto e derivados; - os grupos aromáticos e derivados são selecionados dentre o grupo das funções fenil, acetofenil, e pireno; - os grupos à base de hidrocarbonetos e derivados são selecionados dentre o grupo das funções octil e octadecil.

[0038] A presente invenção refere-se, ainda, ao nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica como carreador de fármacos hidrofóbicos, obtido ou não pelo processo ora descrito, compreendendo as seguintes características: - razão de óxido de grafeno:nanoparticula de silica entre 24:1 (m/m) e 2:1 (m/m); - estrutura bidimensional de folhas de óxido de grafeno decoradas com nanoparticulas de silica mesoporosa; - ligação covalente entre o óxido de grafeno e as nanoparticulas de silica mesoporosa; - as nanoparticulas de silica mesoporosa compreendem superficie interna funcionalizada com grupos hidrofóbicos e superficie externa funcionalizada com grupos aminopropil ou PEG amino; - fármaco hidrofóbico encapsulado nas nanoparticulas de silica mesoporosa e incorporado no óxido de grafeno.

[0039] Mais especificamente, o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica carreador de fármacos hidrofóbicos compreende as seguintes características: - grupos aminopropil ou PEG-amino funcionalizados em quantidades entre 5 e 25% mol-Si; - grupos hidrofóbicos funcionalizados em quantidades entre 10 e 40% mol-Si, preferencialmente 30% mol-Si; - grupos hidrofóbicos selecionados dentre grupos aromáticos e derivados; e grupos à base de hidrocarbonetos e derivados; - grupos aromáticos e derivados selecionados do grupo das funções fenil, acetofenil e pireno; - grupos à base de hidrocarbonetos e derivados selecionados do grupo das funções octil e octadecil; - fármaco hidrofóbico em quantidades de até 10% em massa; - fármaco hidrofóbico selecionado do grupo que compreende a curcumina, camptotecina, docetaxel, doxorrubicina, violaceina, tamoxifeno, beta-lapacona e análogos, preferencialmente curcumina ou camptotecina; - nanoparticulas de silica mesoporosa compreendendo diâmetro entre 50 e 80 nm; - nanoparticulas de silica mesoporosa compreendendo área superficial entre 650 e 1200 m2/g; - nanoparticulas de silica mesoporosa compreendendo volume de poros entre 1,8 e 2,3 cm3/g; - estrutura bidimensional de folhas compreendendo largura e comprimento em dimensões entre 550 e 3500 nm; - óxido de grafeno compreendendo grupos funcionais ácido carboxilico, epóxi, hidróxi, cetona e aldeido em sua superficie; - óxido de grafeno obtido pela oxidação quimica do grafite natural; - ligação covalente ser uma ligação amida; - gerar no minimo 3,5 % e no máximo 47% de hemólise na faixa de concentrações entre 50 e 250 μg/mL; - pouca interação com proteínas provenientes do plasma humano.

[0040] A presente invenção compreende, ainda, o uso do nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanoparticulas de sílica como carreador de fármacos hidrofóbicos na preparação de medicamentos para tratamentos antitumorais, antimicrobianos, anti-inflamatórios, antissépticos e anti malária sem, no entanto, se limitar a tais aplicações.

Exemplos de concretização: Materiais e técnicas de caracterização

[0041] O brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB, ^98,0%), 3-aminopropiltrietóxisilano (APTES, 99,0%), N- hidroxisuccinimida (NHS, 98,0%), persulfato de potássio (K2S2O8, 99,0%) e o pentóxido de fósforo (P2O5, 98,0%) foram obtidos da Sigma-Aldrich. O cloridrato de N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC, ^99,0%) foi obtido da Fluka. O hidróxido de amónio (NH4OH, 27,0%), pó de grafite natural (98,0%), ácido clorídrico (HC1, 36,5-38,0%), permanganato de potássio (KMnO4, 99,0%), peróxido de hidrogênio (H2O2, 30,0%), ácido sulfúrico (H2SO4, 95,0-98,0%) e álcool etílico absoluto (EtOH, >99,5%, P.A.) foram obtidos da Synth (Brasil). O álcool metílico (MetOH, 99,9%) foi consumido da LC Chemicals. O tetraetilortosilicato (TEOS, 98,0%) e o feniltrietóxisilano (PTES, 98,0%) foram consumidos da Acros Organics. A água deionizada foi obtida de um sistema de purificação Synergy®UV Merck Milipore.

[0042] Os espectros de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram obtidos em um espectrômetro ABB Bomem MB-series, modelo FTLA2000-102, através do método de transmitância na faixa de 4000-400 cm-1, com uma precisão de 4 cm-1 e 32 acumulações no modo ATR. A espectroscopia Raman foi realizada em um espectrômetro Horiba T64.000 utilizando- se laser de He:Ne (comprimento de onda de 633 nm) . 0 equipamento detém filtro de densidade 1 e microscópio confocal de abertura de 200 μm. Os espectros foram obtidos em tempos de integração de 60s e 3 acumulações. A espectroscopia eletrônica de absorção no ultravioleta- visivel (espectroscopia UV-Vis) foi realizada no espectrômetro Shimadzu UV 1650 PC. A técnica de espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-X (XPS) foi realizada em um equipamento VG Thermo Alpha 110 com analisador hemisférico e fonte de raios-X AlKa. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 29Si foram feitos em um equipamento Bruker Avance 300 MHz, com método HPDEC ("high-power decoupling", 29Si ^-H) , com 1024 scans, tempo de aquisição de 0,0299 s, intervalo entre os pulsos de 60,0 s e frequências de 59, 624 MHz no canal 1 (29Si) e 300,130 MHz no canal 2 pH) .

[0043] A análise foi feita com excitação por pulso único de 90° de 5,0 μs no canal 1 (29Si) seguido pela aquisição do sinal sob um pulso continuo de desacoplamento no canal 2 (1H) , iniciado simultaneamente ao pulso do canal 1, até a relaxação do sinal nesse canal. Os espectros de RMN de 13C foram obtidos com o método CPMAS ("cross polarization and magic angle spinning", dos núcleos 1H vizinhos) com 20480 scans, tempo de aquisição de 0,0499 s, intervalo entre os pulsos de 3,0 s e frequências de 75,475 MHz no canal 1 (13C) e 300,131 MHz no canal 2 pH).

[0044] A análise é feita com excitação por pulso de 90° de 2,7 μs no canal 2 (1H), seguido de um pulso de 4000 μs no canal 1 (13C) , seguido da aquisição do sinal. Juntamente com o pulso do canal 1 (13C) , se produz outro pulso para desacoplamento no canal 2 pH) , que se prolonga até a relaxação do sinal no canal 1. A velocidade de rotação do porta-amostra foi de 10 kHz para ambas as análises (silicio e carbono), feitas sob ângulo mágico (54,74°). A difratometria de raios-X (DRX) foi realizada em um difratômetro Shimadzu XRD-700, conduzida mediante aplicação de radiação raio-X CuKa em comprimento de onda de 1,54056 Á com gerador de voltagem de 40kV. O intervalo de ângulos de difração, reportados no difratograma como 20, compreende os valores entre 5 e 50° e foram obtidos em taxa de scan de 2°/min. As análises termogravimétricas (TGA) foram feitas em um analisador térmico TA Instruments 500, módulo TGA 2050.

[0045] A taxa de aquecimento foi mantida em 10,0°C/min e o fluxo de ar sintético ou nitrogênio em 100 mL/min (a escolha do gás depende do tipo de amostra analisada). O espalhamento de luz dinâmico (DLS) para avaliar os tamanhos das partículas e o potencial zeta (PZ) foram obtidos com o instrumento Malvern ZetaSizer-Nano. Os resultados de DLS foram obtidos usando água deionizada como dispersante (1,0 mg/mL).

[0046] As medidas de adsorção de nitrogênio foram feitas na temperatura do nitrogênio liquido em um analisador ASAP 2020 Micromeritics. As amostras foram tratadas a 120°C por 12 horas antes da análise. A área de superficie foi calculada a partir do ramo de adsorção da isoterma usando o método Brunauer-Emmett-Teller (BET). O diâmetro e volume dos poros foram calculados a partir do ramo de adsorção da isoterma usando o método Barrett- Joyner-Halenda (BJH) e a partir da quantidade de adsorção em um ponto único (P/Po = ~0,94), respectivamente. A morfologia das nanoestruturas foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão em modo de campo claro (TEM, Zeiss Libra 120, operando a 80kV) e por microscopia eletrônica de varredura (SEM, JEOL JMS 6360), na qual as amostras foram metalizadas em ouro através do equipamento Bal-Tec MD 020.

Síntese das nanoparticulas de sílica mesoporosa com grupos fenila internos e funções NH∑ externas (H2N-SÍO2)

[0047] A sintese das nanoparticulas de partida com grupos fenilas internos na presença de CTAB (denominadas HO-SÍO2- CTAB) foi realizada em uma reação do tipo sol-gel através do método de Stober Modificado. Inicialmente, dissolve-se 0,75 g de CTAB em 20 mL de solução de amónia 0,05 mol/L, seguido de adição de 3,2 mL de etanol e agitação a 60 °C. Paralelamente, foi preparada uma mistura de 1,49 mL de TEOS e 816 μL de PTES que, foi logo em seguida, vertida no sistema contendo o molde orgânico, o co-solvente etanol e o catalisador (NH3) . Agitou-se a solução durante 120 min, (a contar do tempo t = 0) com duas adições de 124 μL de TEOS em t = 60 min e t = 90 min. Após essa etapa, as nanoparticulas obtidas foram centrifugadas e redispersas em etanol para remoção de excesso de reagentes.

[0048] Foi realizada a remoção do molde orgânico da HO- SÍO2-CTAB seguindo-se o protocolo sintético descrito adiante, obtendo-se apenas as nanoparticulas com funções fenilas no seu interior (HO-SÍO2) .

[0049] As nanoparticulas de silica com grupos fenila e funções NH2 (H2N-SÍO2) foram sintetizadas através de métodos de funcionalização descritos na literatura. Nesse processo, 300 mg das nanoparticulas HO-SÍO2-CTAB são dispersas em 40 mL de etanol absoluto por 60 minutos e em seguida homogeneizadas por mais 15 minutos a 60°C. Posteriormente o reagente APTES é transferido para o balão de reação de modo que sua quantidade seja equivalente a 25% mol-Si em relação ao número de mol de silicio total presente na massa de HO- SÍO2-CTAB adicionada. Prosseguiu-se a reação mediante agitação constante a 60°C durante uma hora, e mais 12 horas de funcionalização à temperatura ambiente. Os produtos foram submetidos à centrifugação e dispersão em etanol, obtendo- se as nanoparticulas de silica com grupos NH2 na presença de CTAB, denominadas H2N-SÍO2-CTAB. A remoção do molde orgânico foi realizada segundo procedimento experimental descrito adiante, para obtenção das nanoparticulas de silica H2N-SÍO2.

Extração do molde orgânico

[0050] Conforme descrito nos tópicos anteriores a HO-SÍO2- CTAB e H2N-SÍO2-CTAB contém em seu interior o molde orgânico para extração. Para a remoção do CTAB, cada uma das nanoparticulas são transferidas para um frasco contendo uma solução etanólica de HC1 na proporção volumétrica de HC1:Etanol = 1:9 e submetidos ao ultrassom durante 15 minutos para remoção do molde. A proporção estequiométrica padrão foi de 5 mg de nanoparticula para 1 mL de solução HCl/Etanol.

[0051] O resumo da sintese da nanoparticula de silica contendo grupos fenila internos e funções amina externas é mostrado na Figura 1(A). As nanoparticulas de silica foram caracterizadas pelas técnicas FTIR, XPS (survey, Cis e Nis) , RMN (13C CPMAS e 29Si HPDEC) , DRX, TGA, DLS, PZ, adsorção/dessorção de nitrogênio e SEM.

Síntese do óxido de grafeno

[0052] A síntese do óxido de grafeno é realizada através do método de Hummers modificado e abrange duas etapas:

Etapa (A): Pré-tratamento do grafite

[0053] Em um frasco de reação, 4,4 mL de ácido sulfúrico é pré aquecido a 80 °C e 0,8 g de K2S2O8 e 0,8 g de P2O5 são posteriormente adicionados. Sequencialmente é adicionado 1 g de pó de grafite natural e o sistema é mantido sob agitação constante por 4,5 h. Mantendo-se a mistura na temperatura ambiente sob agitação, 170 mL de água deionizada são transferidos para o frasco, e a mistura é deixada em repouso durante a noite. Após essa etapa o sistema é submetido à filtração em membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) 0,22 μm, lavado com água deionizada até neutralização do pH e o sólido filtrado (grafite pré-tratado) é seco à temperatura ambiente durante a noite.

Etapa (B): Oxidação do grafite pré-tratado

[0054] A etapa (b) é iniciada pelo resfriamento de 40 mL de ácido sulfúrico até a temperatura de -10 °C, adição de grafite pré-tratado e transferência gradual de 5g de KMnCU em intervalo de tempo entre 15 e 20 minutos. A temperatura foi elevada para 35 °C e a reação foi mantida sob agitação constante durante 2horas. Adiciona-se 77 mL de água deionizada controlando-se a temperatura para que permaneça abaixo de 50 °C e prossegue-se a reação por mais duas horas à temperatura ambiente. A seguir, 230 mL de água deionizada e 4 mL de H2O2 são sequencialmente adicionados ao frasco e o sistema é mantido em repouso por quatro dias. O sobrenadante é removido e descartado e o sólido é centrifugado a 3000 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente e lavado com 500 mL de HC1 10% (v/v) - ressalta-se que durante a lavagem são executadas centrifugações adicionais até utilização total do volume da solução de ácido clorídrico. Posteriormente é realizada lavagem com água deionizada mediante novas centrifugações a 15000 rpm a 4 °C durante 30 minutos por rodada. O material resultante é submetido à diálise durante 10 dias em tubo de diálise Fisherband 12-14 kDa, liofilizado e estocado. Finalmente, as suspensões de óxido de grafeno são obtidas através da dispersão do sólido em água deionizada colocada em banho de ultrassom em equipamento Cole Parmer 8891.

[0055] O GO foi caracterizado pelas técnicas FTIR, espectroscopia Raman, XPS (survey, Cis e Nis) , DRX, TGA, PZ e TEM.

Síntese do nanocompósito (NC) de óxido de grafeno e nanoparticulas de sílica (GO-SiO∑)

[0056] A sintese do GO-SÍO2 é realizada através da combinação de diversos protocolos sintéticos descritos na literatura. Nesse processo a suspensão de GO (1 mg/mL)é diluida com água na proporção de 8 mL de água para cada 1 mg de óxido de grafeno, posteriormente colocada em banho ultrassom por 2 horas e adicionada em um frasco de reação de material plástico. Sequencialmente uma solução de EDC (lmg/mL) é adicionada gota a gota em quantidades de 1 mg de EDC para cada 1 mg de GO mantendo-se a reação por lhora, seguido de transferência de NHS (1 mg/mL), também gota a gota, ao frasco e prosseguindo-se a sintese sob agitação constante por 24 horas.

[0057] A razão molar de EDC/NHS utilizada é de 1:1. Após essa etapa, colocou-se as nanoparticulas H2N-SÍO2 (1 mg/mL) em banho ultrassom durante 30 minutos seguido de sua diluição em concentração de até 0,1 mg/mL e transferência ao frasco contendo o GO ativado com EDC/NHS - as nanoparticulas foram adicionadas gota a gota, durante 20 minutos, na reação e em quantidade de até 50% em massa em relação ao óxido de grafeno ativado. A mistura de GO e H2N-SÍO2 é realizada durante 24horas à temperatura ambiente.

[0058] O nanocompósito obtido é filtrado em membrana de PVDF 0,22 μm, lavado com metanol e água deionizada de modo a eliminar os nanocarreadores de silica não acoplados no óxido de grafeno. Foram preparados três nanocompósitos denominados GO-3SÍO2, GO-2SÍO2 e GO-ISÍO2, nas quais a massa de nanoparticulas de silica em relação ao óxido de grafeno é de 10, 30 e 50%, respectivamente.

[0059] O resumo da sintese pode ser encontrado na Figura 1(B). Os nanocompósitos foram caracterizados pelas técnicas FTIR, XPS (survey, Cis e Nis) , DRX, TGA, PZ e TEM.

Ensaios hemolíticos

[0060] Na realização dos experimentos de hemólise utilizou-se uma bolsa de concentrado de hemácias do Tipo 0+ concedido pelo Hemocentro da Universidade Estadual de Campinas. Concomitantemente, duas soluções de NaCl foram preparadas de acordo com o procedimento descrito a seguir: a) NaCl (2x) : foi preparado 500 mL de uma solução de NaCl 0,3 M em água deionizada estéril; b) NaCl (lx): 250 mL da solução acima foram diluidos em 250 mL de água deionizada estéril, gerando uma solução de NaCl 0,15 M.

[0061] O volume de 10 mL da bolsa de concentrado de hemácias Tipo 0+ foi submetido à centrifugação a 10.000 rpm a 4 °C por 10 minutos. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 20 mL de NaCl (lx) ao pellet (hemácias) que, foi subsequentemente resuspendido. Após esse processo, realizou-se duas novas lavagens seguindo-se o procedimento vigente, obtendo-se 20 mL de uma solução de hemácias em NaCl (lx). Desse total, 2,5 mL foram diluidos em 12,5 mL de NaCl (lx) obtendo-se a solução estoque de hemácias.

[0062] O pré-tratamento das nanoparticulas (inicialmente em etanol) para os ensaios hemoliticos compreendem um procedimento no qual todas são centrifugadas a 15.000 rpm a 4°C durante 30 minutos e dispersas em água deionizada. Esse processo é repetido mais duas vezes obtendo-se dispersões coloidais finais em água deionizada nas concentrações de 1 mg/mL.

[0063] A influência dos nanocompósitos e sua concentração foi investigada no processo de interação com hemácias. Nesse processo, foram preparadas soluções de GO-SÍO2 nas seguintes concentrações: 10 μg/ mL, 50 μg/ mL, 100 μg/ mL, 150 μg/ mL, 200 μg/ mL e 250 μg/ mL. Cada nanocompósito é adicionado a uma mistura de NaCl (2x) (cujo volume é sempre igual ao volume de nanocompósito adicionado) e NaCl (lx). Em seguida, é adicionado 100 μL de uma solução estoque de hemácias, iniciando-se o processo de incubação por uma hora - note que para cada microtubo tem-se um volume total de 1000 μL, o volume de solução de nanocompósito varia de acordo com a concentração final desejada, o volume de solução estoque de hemácias é sempre 100 μL e a quantidade de NaCl (lx) complementa o volume final citado.

[0064] Após o periodo de incubação, as soluções biológicas contendo as nanoparticulas são centrifugadas a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos e 100 μL do sobrenadante é analisado por UV-Vis no comprimento de onda de 540 nm (absorção da hemoglobina liberada após a lise da célula vermelha). Os valores de absorbância são referência para os cálculos percentuais da taxa de hemólise.

[0065] Tratando-se do aspecto estatístico na interpretação confiável e precisa dos resultados, todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Ensaios de interação com proteínas (efeito corona)

[0066] Os nanocompósitos foram submetidos aos experimentos de adsorção de proteinas oriundas de plasma humano no intuito de investigar sua interação com as proteinas plasmáticas, uma vez que a via intravenosa é a principal rota de aplicação em processos de tratamentos antitumorais e, dessa maneira, compreender os fenômenos bioquímicos provenientes desse tipo de interação é crucial.

[0067] O plasma humano preservado Tipo 0+ (250 mL) foi obtido do Hemocentro da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp, São Paulo, Brasil). Para o estudo da interação com proteinas adsorvidas nos nanocompósitos (efeito corona), o plasma foi primeiramente centrifugado a 14.000 rpm por 5 minutos, utilizando-se o sobrenadante para os experimentos. Os nanocompósitos (1 mg/mL em água deionizada) foram incubados nos microtubos contendo plasma durante lhora a 37 °C em termoblocos (SmartBlock, Eppendorf) sem agitação.

[0068] Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 30 minutos, descartados os sobrenadantes e os pellets obtidos (compreendendo os complexos nanocompósito- proteinas) foram lavados 3 vezes com solução de NaCl (lx) para remoção de excesso de proteinas fracamente adsorvidas (soft corona) na superficie, obtendo-se o complexo GO- SiO∑/proteina fortemente adsorvida (hard corona). Este último foi resuspendido em um tampão (contendo 150 μL, contendo 62,5 mM de Tris-HCl, 2% (m/v) de SDS, 10% de glicerol, e 0,01 % (m/v) de azul de bromofenol; pH 6,8) e aquecido por 3 minutos a 100 °C. Dessa suspensão resultante, 15 μL foram aplicados para um gel de SDS-poliacrilamida. Após a corrida em eletroforese, o gel foi corado com Azul de Coomassie para identificação e visualização de proteinas fortemente adsorvidas nos nanocompósitos (hard corona).

Resultados e discussão Nanopartícula de sílica mesoporosa com grupos fenila internos e funções NH∑ externas (H2N-SÍO2)

[0069] A primeira evidência experimental da funcionalização das nanoparticulas de silica com grupos amino mediante condensação do silano APTES é a análise de variação de carga superficial externa através das medidas de potencial zeta. De acordo com a Tabela 1, apresentada abaixo, o nanocarreador anteriormente à funcionalização (HO-SÍO2) compreendendo em sua superficie externa grupos SiO~ (cargas negativas), apresentou carga de -20,5 ±5,8 mV.

[0070] Após a reação com as espécies aminopropiltrietoxisilano, o valor de potencial zeta variou para +24,0 ± 0,7 mV, indicando a predominância de cargas positivas provenientes dos grupos -NH3+ presentes na superficie externa da SÍO2. Ainda, de acordo com a tabela, os valores de raio hidrodinâmico da HO-SÍO2 e H2N-SÍO2 foram de 128,0 nm (PDI = 0,1) e 138,1 nm (PDI = 0,09), respectivamente. Tais resultados estão de acordo com o esperado, uma vez que se enquadram nas dimensões nanométricas das nanoparticulas sintetizadas conforme procedimentos de quimica supramolecular.

[0071] Tabela 1: Valores de potencial zeta e tamanho de partícula (DLS) das nanoparticulas de silica anterior e posteriormente à funcionalização.

* indice de polidispersividade

[0072] Na Figura 2(A) são exibidos os espectros de infravermelho das nanoparticulas H2N-SÍO2-CTAB (preto) e H2N- SÍO2 (azul) . Em ambas as situações são observadas banda típicas da sílica em 1042, 963, 801 e 464 cm-1 referentes ao estiramento assimétrico Si-O-Si, estiramento Si-OH, estiramento simétrico Si-O-Si e deformação angular Si-O-Si, respectivamente. Para ambos os nanocarreadores são observadas, ainda, bandas típicas das funções fenila condensadas no interior poroso em 1597 (estiramento C=C), 1481 (estiramento C=C), 740 (deformação angular C-H) e 698 cm-1 (deformação angular). Especificamente no espectro da SÍO2-CTAB, são observadas bandas típicas do molde orgânico em 2927 e 2856 cm-1 provenientes do estiramento assimétrico C-H e estiramento simétrico C-H dos grupos -CH2-, respectivamente, que constituem a cadeia de 16 carbonos do CTAB.

[0073] Após a extração das micelas para obtenção da H2N- SÍO2, as últimas bandas mencionadas encontram-se ausentes no espectro deste último carreador, evidenciando a referida remoção. Especificamente ao possivel estiramento C-N dos grupos alquilamônio nas moléculas de CTAB, sua banda encontra-se sobreposta pela banda da silica em aproximadamente 1232 cm-1, impossibilitando sua visualização.

[0074] Seguindo-se o mesmo raciocínio, não foi possivel confirmar a presença dos grupos amino funcionalizados externamente em ambas as nanoparticulas através da técnica de infravermelho, uma vez que a banda tipica da deformação angular N-H em 715 cm-1 e deformação angular simétrica -NH2 em 1518 cm-1 são também sobrepostas. A técnica de infravermelho confirma a presença dos principais grupos funcionais nas nanoparticulas de silica mesoporosa. No entanto, a confirmação da efetiva remoção do CTAB das cavidades mesoporosas, bem como a condensação do silano APTES na superficie da HO-SÍO2-CTAB, demandam a interpretação das técnicas apresentadas a seguir.

[0075] A Figura 2 (B) mostra as curvas TGA das nanoparticulas, HO-SÍO2-CTAB, HO-SÍO2 e H2N-SÍO2. Analisando- se a curva da nanoparticula de silica com CTAB não funcionalizada externamente, observa-se um evento tipico de decomposição do molde orgânico entre 150 e 417 °C. Nota-se que nas curvas da HO-SÍO2 e H2N-SÍO2, a referida perda de massa não é observada, uma vez que o molde orgânico foi extraido de ambas. Prosseguindo-se o raciocínio analisando- se a curva da HO-SÍO2 na qual a única entidade orgânica presente são os grupos fenila, observa-se seu evento de decomposição entre 318 °C e 800 °C, ocorrendo também nas outras nanoparticulas. Nesse contexto, as curvas TGA confirmam a presença de ambos os grupos orgânicos na HO- SÍ02-CTAB e complementam as informações constantes na técnica de infravermelho. Considerando-se a H2N-SÍO2 na qual os grupos orgânicos presentes compreendem as funções fenila e aminopropil, observa-se um evento de perda de massa iniciando-se em 291 °C supostamente devido à eliminação da espécie -CH2CH2CH2-NH2, coincidindo com a perda de massa dos grupos aromáticos a partir de 318 °C.

[0076] A Figura 2 (C) apresenta as isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênico das nanoparticulas H2N- SÍO2-CTAB e H2N-SÍO2. De acordo com os resultados, o perfil apresentado em ambas as situações é semelhante àquele classificado como do tipo IV segundo a classificação da IUPAC, cuja definição reside no fato de que materiais porosos detentores de isotermas desse tipo apresentam uma histerese característica e são classificados como mesoporosos. Ainda de acordo com a IUPAC, materiais mesoporosos são classificados como aqueles detentores de poros compreendendo diâmetro entre 2 e 50 nm.

[0077] Analisando-se especificamente as isotermas de ambos os nanocarreadores, são nitidas histereses semelhantes àquelas denominadas como histerese do tipo H3, isto é, apresentam estrutura porosa complexa e não definida. Tais resultados são reflexo da significativa quantidade de grupos fenil presentes no processo de co-condensação entre o TEOS e PTES, no qual os referidos grupos aromáticos localizados entre as cadeias carbônicas do CTAB aumentam seu espaçamento, pois encontram-se em grande quantidade (30% mol-Si de silano PTES).

[0078] Dessa maneira, a condensação do TEOS ao redor do molde orgânico caracteriza uma nanoparticula compreendendo poros aleatórios e de alta complexidade topográfica, conforme esperado para o tipo de nanoparticula planejada. 0 gráfico de distribuição de poros das nanoparticulas mostrado na Figura 2 (D) apresenta poros detendo, predominantemente, tamanhos entre 3 e 48 nm para ambos os carreadores, corroborando com a informação contida nas isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio e, portanto, são classificados como mesoporosos.

[0079] Em última instância tratando-se da técnica de adsorção e dessorção de nitrogênio, foram estimados a área superficial e volume total de poros das nanoparticulas de silica anterior e posteriormente à remoção do CTAB. Na presença do molde orgânico, os valores medidos foram de 658,3 cm2/g (área) e 1,82 cm3/g (volume). Na ausência do CTAB, os valores mencionados sofreram aumento para 1.178,7 cm2/g de área superficial e 2,27 cm3/g de volume total de poros, confirmando a extração do soft template. Essa técnica, conjuntamente com as análises termogravimétricas e a espectroscopia infravermelho foi importante para a confirmação da extração das micelas e para evidenciar a presença dos grupos aromáticos e aminopropil nas superficies interna e externa, respectivamente. No entanto, a confirmação da condensação das referidas espécies nas nanoparticulas de silica demanda a investigação através da técnica de RMN.

[0080] A Figura 3 exibe os espectros de RMN de carbono 13C (A) e 29Si (B) das nanoparticulas HO-SÍO2 (funcionalizada com grupos fenila internos) e H2N-SÍO2(funcionalizada com grupos fenila internos e funções amino externos) . Analisando-se os resultados de RMN 13C são observados picos oriundos dos núcleos dos anéis aromáticos (núcleos de 1 a 4) das funções fenila em ambas as situações no intervalo de deslocamentos quimicos entre 134 e 126 ppm, confirmando sua presença e complementando os resultados dos espectros de infravermelho e análise termogravimétrica. A presença da função aminopropil na H2N-SÍO2 é confirmada em seu respectivo espectro analisando-se os núcleos dos carbonos 5, 6 e 7 em 9, 21 e 42 ppm, respectivamente. Tal resultado indica que a referida espécie quimica está presente na referida nanoparticula de silica. É importante notar que os três picos mencionados estão ausentes no espectro da HO-SÍO2. No entanto, para a confirmação da condensação do silano fenila e silano APTES nas superficies interna e externa, respectivamente, faz-se necessário analisar os espectros de RMN 29Si. De acordo com a Figura 3 (b), os resultados de RMN 29Si exibem picos tipicos do núcleo de silicio observados em -109,3 (Q4), -100,9 (Q3) , -91,9 (Q2) , -77,8 (T3) e - 69,5 ppm (T2) para ambos os nanocarreadores. Os sitios Q4, Q3, Q2, T3 e T2 referem-se às espécies de silicio (SiO-)4Si, (SiO-)3Si- OH, (SiO-)2Si(-OH)2, (SiO-)3Si-R e (SiO-)2Si-R(-OH), respectivamente.

[0081] É notório que as estruturas (SiO-)3SÍ-OH, (SiO- )2Si(-OH)2 relacionam-se aos grupos silanóis disponíveis para funcionalização nas superficies interna ou externa da nanoparticula enquanto que as espécies (SiO-JaSi-R e (SiO- )2—Si—R(—OH) são provenientes de núcleos de silicio ligados a grupos R (representando funções orgânicas diversas e presença de algum organosilano condensado). Adicionalmente, os sitios Q4 representam a rede de SiO2 com cada núcleo de silicio circundado por 4 ligações -OSi. Nesse contexto, a análise do espectro da HO-SÍO2 apresenta os picos Q4, Q3 e Q2 intrinsecamente em alusão à silica e os picos T3 e T2 referentes ao silano PTES condensado no interior poroso na forma (SiO-)3SÍ-(fenil) ou (SiO-)2SÍ(OH)-(fenil). Comparado com o espectro da H2N-SÍO2, observa-se diminuição dos picos Q3 e Q2 em relação ao pico Q4.

[0082] Tal informação indica menor quantidade de grupos silanóis e aumento de espécies SÍO2 no sistema, confirmando a condensação do APTES. Soma-se a isso, a observação do aumento dos picos T3 e T2 no espectro da H3N-SÍO2 em relação ao da HO-SÍO2, isto é, tem-se na nanoparticula funcionalizada núcleos de silicio na forma (SiO-)3S-(fenil) e (SiO-)3Si- (aminopropil) - atrelados ao sitio T3 - e (SiO-)2SÍ(OH)- (fenil)e (SiO-)2SÍ-(OH) (aminopropil) - atrelados ao sitio T2. Portanto, o conjunto de espectros de RMN na Figura 3 confirmam a condensação dos silanos PTES e APTES na H2N-SÍO2.

[0083] Na Figura 3 (C) tem-se o difratograma de raios-X das H2N-SÍO2. O resultado indica um pico largo na faixa de valores 20 entre 13 e 40°, sugerindo que as nanoparticulas possuem estrutura não-cristalina, corroborando com os resultados reportados na literatura.De fato, a aleatoriedade e complexidade, dos poros, analisada e confirmada pelas isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio, reflete a característica amorfa do referido nanomaterial.

[0084] A Figura 3 (D) mostra a imagem de microscopia eletrônica de varredura das nanoparticulas H2N-SÍO2. A imagem permite confirmar a morfologia esférica das nanoparticulas, conforme planejado inicialmente no protocolo sintético. Nesse contexto, a formulação foi escolhida no intuito da formação de micelas de CTAB abrangendo formato esférico, ao redor da qual os precursores inorgânicos de silica se depositariam para posterior formação de uma esfera nanométrica compreendendo poros aleatórios e cavidades internas compreendidas por grupos fenila. As imagens, portanto, indicam a morfologia de interesse.

[0085] O conjunto de técnicas aplicadas para caracterização da nanoparticula de silica detendo grupos amino em sua superficie externa confirmam sua obtenção e presença de suas principais entidades quimicas, permitindo sua futura funcionalização na superficie das folhas de óxido de grafeno, cuja principal estratégia é o acoplamento via ligação amida, formada entre a reação quimica dos grupos - NH2 da silica e os grupos -COOH do GO.

Óxido de grafeno (GO)

[0086] A Figura 4 (A) apresenta o espectro de infravermelho do GO, exibindo bandas referentes aos estiramentos C-0 (epóxi) e C-O-C em 1050 e 1225 cm-1, respectivamente. Observam-se, ainda, bandas em 1355 (deformação angular C-OH), 1620 (estiramento C=C) e 1726 cm- 1 (estiramento carbonila de ácido carboxilico). Os resultados confirmam a presença das principais funções orgânicas oxigenadas presentes na superficie do óxido de grafeno após a oxidação do grafite. Adicionalmente, essa técnica é importante para a observância de funções orgânicas importantes para a posterior funcionalização das nanoparticulas de silica na formação dos nanocompósitos.

[0087] A Figura 4 (B) refere-se ao espectro de espalhamento Raman do óxido de grafeno, apresentando duas bandas tipicas do referido material denominadas banda D e banda G. A primeira, localizada em 1331 cm-1 (banda D) está relacionada com os defeitos estruturais do material, enquanto que a banda G, em 15 91 cm-1' é proveniente da vibração dos átomos de carbono detendo hibridização sp2. Nesse contexto, a oxidação do grafite a óxido de grafeno, que contém grupos oxigenados na superficie das folhas, promove a inserção de defeitos estruturais que refletem no aumento de intensidade (I) da banda D. A razão de intensidade da banda D (ID) em relação à banda G (IG) foi estimada em ID/IG = 1,329. Tal resultado, juntamente com as informações contidas no espectro de infravermelho, confirma a oxidação do grafite a óxido de grafeno.

[0088] A Figura 4 (C) apresenta a curva termogravimétrica do óxido de grafeno. Os resultados indicam um tipico evento de perda de massa entre 115 e 285 °C referente à decomposição dos grupos oxigenados, que representam 35,3% da massa total do material. O evento de perda de massa observado a partir de 285°C está relacionado com a decomposição das regiões grafiticas do GO.

[0089] O difratograma de raios-X do grafite e do óxido de grafeno são apresentados na Figura 4 (D). O difratograma do grafite apresenta um pico de difração em 20 = 26,5° referente ao plano cristalográfico 002, tipico desse material. O espaçamento interplanar do plano 002 foi estimado em 0,34 nm através dos cálculos previstos na Lei de Bragg. No que se refere aos resultados do óxido de grafeno, observou-se deslocamento do pico de difração para valores de 20 = 10,36° (distância interplanar de 0,84 nm) , isto é, a distância entre planos mencionados aumentou após a oxidação. Tal resultado evidencia a incorporação dos grupos oxigenados no grafite durante a etapa sintética de oxidação devido ao aumento da distância interplanar.

[0090] A Figura 4 (E) exibe a imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) do óxido de grafeno. A análise permite confirmar a obtenção de folhas transparentes e lisas.

Nanocompósito (NC) de óxido de grafeno e nanoparticulas de sílica (GO-SiOs)

[0091] A sintese e obtenção do nanocompósito de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica constitui parte importante e crucial no presente pedido de patente por se tratar do produto final para as aplicações de interesse. Nesse contexto, a complexidade desse sistema demanda um conjunto de técnicas que possibilitem a extração de informações importantes para a robusta compreensão de suas propriedades fisico-quimicas. Logo, a complementaridade de cada uma das técnicas de caracterização é estratégica para aquisição de todas as informações.

[0092] Primeiramente foram analisadas as variações de carga superficiais (potencial zeta) dos nanomateriais de partida e dos nanocompósitos obtidos para a prévia constatação de mudanças nas propriedades topográficas. De acordo com a Tabela 2, as cargas superficiais do óxido de grafeno e da nanoparticula de silica (H2N-SÍO2) são de -45,4±1,1 mV e +24,0±0,7 mV, respectivamente. Tal resultado indica a presença de espécies detentoras de cargas em ambas as estruturas. No GO, o valor de potencial zeta observado está relacionado com a presença de funções hidroxil e carboxilatos -COO- derivado dos ácidos carboxilicos enquanto que na nanoparticula é proveniente das espécies -NHs+ derivadas das funções amina. Após o acoplamento de silica em 10% em massa em relação ao GO (GO-3SÍO2) , observa-se diminuição de carga para -26,0±0,6 mV devido à presença dos grupos -NH3+ da H2N-SÍO2 que, reduzem o valor inicial do PZ do óxido de grafeno. Aumentando-se a massa para 30 e 50%, observa-se valores de carga de -27,3±0,7 mV e -23,2±0,7 mV nos nanocompósitos GO-2SÍO2 e GO-ISÍO2, respectivamente. A redução de PZ do óxido de grafeno em relação aos nanocompósitos ocorre devido à presença das cargas positivas oriundas das nanoparticulas de silica.

[0093] Tabela 2: potencial zeta dos nanomateriais de partida GO e H2N-SÍO2 e nanocompósitos de óxido de grafeno e silica (GO-SÍO2)

[0094] A Figura 5 (A) exibe os espectros de infravermelho dos nanocompósitos para primeira investigação de formação da ligação amida e/ou possiveis variações no perfil das bandas do óxido de grafeno e das nanoparticulas de silica. De maneira geral, são observadas, em todas as situações, bandas oriundas de ambos os nanomateriais presentes nos nanocompósitos. As bandas provenientes do GO podem ser observadas em 1721 cm-1 (estiramento C=O de ácido carboxilico) e 1224 cm-1. As bandas atreladas à presença da nanoparticula de silica mesoporosa podem ser observadas em 1060 cm-1 (banda de estiramento assimétrico Si-O-Si sobreposta com a banda de estiramento C-0 do GO), 961 cm-1 (banda de estiramento Si-OH) , 740 cm-1 e 699 cm-1 (estas últimas duas bandas são oriundas das deformações angulares C-H nos anéis aromáticos no interior poroso da H2N-SÍO2) . Atenção deve ser focada para uma banda larga com máximo de transmitância em 1600 cm-1 em todas as situações, visto que compreende a possivel sobreposição entre as bandas referentes ao estiramento C=C do GO (1624 cm-1) , deformação angular N-H de amina proveniente dos grupos amino da silica (1600 cm-1) e à possivel formação de ligação amida cujas bandas tipicas podem ser formadas na faixa de 1640-1690 cm- 1 (estiramento C=0 de amida) e entre os valores de 1550 e 1640 cm-1 (deformação angular N-H de amida) . A banda larga observada nessa região compreende todas as bandas mencionadas sem, no entanto, apresentar definições precisas sobre a formação de ligação -N-C=O. Dessa maneira, foi necessária a utilização de outras técnicas complementares para essa análise. Adicionalmente, é importante notar que, à medida que a quantidade de H2N-SÍO2 aumenta no nanocompósito, a banda presente em 1060 cm-1 (vass Si-O-Si) torna-se mais larga e as bandas em 740 e 699 cm-1 (5C-H) são mais pronunciadas, confirmando a funcionalização das nanoparticulas de silica no óxido de grafeno.

[0095] A Figura 5(B) exibe as curvas termogravimétricas dos nanocompósitos no intervalo de temperatura compreendido entre 20 e 900 °C. A análise dos resultados permite afirmar, nas três situações, dois eventos tipicos de perda de massa ocorrendo, respectivamente, na faixa de temperatura entre e entre 284 e 580 °C. No primeiro evento tem-se a decomposição térmica dos grupos oxigenados do óxido de grafeno enquanto que aquele último se refere à combustão da estrutura grafitica do GO, das espécies quimicas aminopropil e fenila. Nas curvas termogravimétricas dos nanomateriais de partida, as temperaturas de decomposição das referidas entidades orgânicas foram observadas em 285, 291 e 318 °C, respectivamente. No segundo evento de decomposição observado nas curvas TGA dos materiais à base de GO-SÍO2, portanto, tem-se a eliminação concomitante de três tipos de grupos funcionais. A técnica de termogravimetria foi importante para a estimativa da quantidade de SÍO2 nos nanocompósitos analisando-se a massa residual em 900 °C proveniente de silica não decomposta devido à sua natureza inorgânica. Os resultados mostram a presença de 4, 13 e 18%, em massa, de silica residual nos nanocompósitos GO-3SÍO2, GO-2SÍO2 e GO- ISÍO2, respectivamente. Os resultados indicam, portanto, quantidades crescentes das nanoparticulas sobre as folhas de óxido de grafeno, proporcionando avaliar sua influência na área superficial do material e nos efeitos biológicos apresentados posteriormente.

[0096] A Figura 5 (C) exibe os difratogramas de raios-x dos nanocompósitos, mostrando perfil semelhante nos três casos. Nota-se, em todas as situações, o pico em 20 = 10,34° (d = 0,84 nm) característico do GO sugerindo que o acoplamento da silica mantém o distanciamento interplanar observado para o óxido de grafeno anteriormente à funcionalização. Outra característica dos difratogramas exibidos é o largo pico oriundo da presença de silica na faixa de valores 2θ entre 14 e 41,1°, semelhantemente ao espectro DRX da H2N-SÍO2 anteriormente à formação do nanocompósito. Interessantemente, nota-se diminuição de intensidade do pico 002 em relação ao máximo de intensidade do pico da silica proporcional ao aumento da quantidade deste último nanomaterial, sugerindo o aumento da característica não cristalina no nanocompósito como um todo. No entanto, a presença do pico referente ao plano 002 e sua significativa intensidade sugere uma estrutura majoritariamente à base de folhas.

[0097] A Figura 6 exibe os espectros de XPS survey e Cis do óxido de grafeno e nanoparticula de silica pristinos bem como dos respectivos nanocompósitos. É importante destacar a importância dessa técnica para a investigação da possivel formação de ligação amida entre ambos os nanomateriais de partida, uma vez que todas as técnicas mencionadas acima não contêm informações precisas sobre esse aspecto quimico.

[0098] A Figura 6 (A) exibe o espectro survey de todas as nanoestruturas compreendidas no presente pedido de patente. A nanoparticula de silica H2N-SÍO2 apresenta carbono, nitrogênio, silicio e oxigênio em porcentagens atômicas de 36,6±3,2%, 1,810,3%, 21,211,3% e 40,511,6%, respectivamente. Os referidos valores foram importantes para o cálculo da porcentagem de funcionalização dos grupos amino na superficie externa, estimado em 8,311,5% mol-Si. No que se refere ao óxido de grafeno, os resultados permitiram calcular a razão atômica C/O, estimada em 2,2610,01.Os espectros dos nanocompósitos foram importantes, em primeira instância, para identificação dos principais núcleos. Nesse contexto, foram observados em todos os casos a presença dos núcleos de nitrogênio e silicio oriundos intrinsecamente da nanoparticula de silica e os restantes (carbono, oxigênio) provenientes do GO e também da H2N-SÍO2.

[0099] A Figura 6 (B) exibe o espectro de XPS de alta resolução da região do pico Cis do óxido de grafeno. As curvas deconvoluidas permitem identificar as principais funções orgânicas presente na superficie do nanomaterial, apresentando picos referentes aos grupos 0=0 de ácidos carboxilicos (288,6010,08 eV) , C-0 (286, 8910,02 eV) e um pico em 284,8910,04 eV representando as ligações C-C (carbono sp3) e C=C (carbono sp2)1. Os resultados corroboram com as informações contidas no espectro de infravermelho e são suporte para a análise da formação de ligação amida nos nanocompósitos. A Figura 6 (C) mostra o espectro de XPS de alta resolução da região do pico Cis da nanoparticula de silica compreendendo grupos fenila internos e funções amina externas. As deconvoluções realizadas permitem identificar as principais funções orgânicas representadas pelos picos oriundos da ligação C-N (286,1210,07 eV) oriunda da função aminopropil e da ressonância eletrônica (291,7510,05 eV) nos anéis aromáticos nos orbitais p fora do plano do anel (nn*) referente aos grupos fenila. Adicionalmente, o pico em 284,9010,02 eV refere-se à sobreposição de picos atrelados às ligações C-C e C=C das funções fenila, às ligações CH2 da função aminopropil e às ligações C-Si dos silanos PTES e APTES condensados nas superficies interna e externa da nanoparticula de silica, respectivamente. As informações contidas no espectro corroboram com aquelas contidas no espectro de infravermelho e suporta, juntamente com os resultados dos espectros de XPS Cis do óxido de grafeno, a investigação de ligação amida nos nanocompósitos.

[00100] As Figuras 6 (D-F) referem-se, respectivamente, aos espectros de XPS Cis dos nanocompósitos GO-3SÍO2, GO- 2SiC>2 e GO-ISÍO2. Em uma análise geral, os resultados mostram a formação de ligação amida através da deconvulação dos picos N-C=O indicados nas figuras. É notório, ainda, em todos os casos, o aumento de intensidade e alargamento do pico localizado em aproximadamente 295 eV, comparado com o pico do espectro do GO no mesmo valor de energia. Essa variação relaciona-se com a presença da silica que, contém, na mesma região,sobreposição com os picos das ligações C-C/C=C óxido de grafeno, gerando aumento gradual de intensidade e alargamento à medida que sua quantidade aumenta no nanocompósito. Nos três casos foi possivel separar os picos da ligação C-N e CH2/C-C/C=C/C-Si. Fenômeno semelhante ocorreu no pico localizado em aproximadamente 287 eV, no qual o alargamento perceptível nos três nanocompósitos em relação ao pico localizado na mesma região no espectro do GO ocorre devido ao surgimento do pico da ligação amida e da ligação C-O. Nesse contexto, foi também possivel separá-los para fins de observação da ligação NCO. Calculou-se, ainda, a área percentual dos picos relacionados aos grupos carboxilicos (C=O) no óxido de grafeno e nos produtos GO- SÍO2. Os valores encontrados no GO (5,0±0,8%) e nos nanocompósitos GO-3SÍO2(4,6±0,8%) , GO-2SÍO2 (3,7±0,3%) e GO- ISÍO2 (3,3±0,4%) mostram diminuição de intensidade da referida função oxigenada, proporcional ao aumento da quantidade de silica, isto é, o número de espécies ácido carboxilicos decresce nesse processo. A explicação para tal resultado reside no fato de que na reação entre os grupos COOH do GO e NH2 da sílica é formada a ligação N-C=O (com liberação de água para o meio), reduzindo-se, consequentemente, o número de espécies COOH. Essa observação complementa as informações espectrais acima no contexto de investigação da presença da referida ligação covalente. Mais especificamente, o espectro do GO-3SÍO2 na Figura 6 (D) mostrou picos referentes às funções C=0 (289,2310,04 eV), N- C=O (287,8910,02 eV), C-0 (287,2110,12 eV), C-N (285,7010,08 eV) e CH2/C-C/C=C/C-Si (284,9310,10 eV). No que se refere ao nanocompósito GO-2SÍO2 na Figura 6 (E), foram observados picos oriundos das espécies C=O (289,2710, 01 eV) , N-C=O (287,9310,05 eV), C-0 (287,1810,09 eV), C-N (285,5710,05 eV) e CH2/C-C/C=C/C-Si (284,9310,08 eV). Finalmente, no espectro da GO-ISÍO2 na Figura 6 (F) são notórios picos atrelados às funções C=O (289,2210, 02 eV) , N-C=O (287,9310,05 eV) , C-0 (287,1310,02 eV) , C-N (285,5510,04 eV) e CH2/C-C/C=C/C-Si (284,7310,24 eV) .

[00101] A Figura 7 exibe os espectros de XPS Nis das nanoparticulas H2N-SÍO2 dos nanocompósitos obtidos. A Figura 7(A) apresenta o espectro XPS Nis da referida nanoparticula de sílica, utilizado como referência e comparação para análise dos espectros dos materiais GO-SÍO2. Nesse contexto, são observados dois picos em 399,5810,05 eV e 401,9210,13 referentes às ligações -NH2/C-N e -NH3+ (aminas protonadas), respectivamente. Após a funcionalização do óxido de grafeno com as nanoparticulas, observa-se, em todas as situações, ligeiro deslocamento de pico da ligação -NH2/C-N para valores de energia de ligações ligeiramente maiores. O referido fenômeno ocorre em todos os nanocompósitos devido à formação da ligação amida, resultado importante e complementar às informações contidas nos espectros XPS Cis no que se refere à investigação da ligação covalente mencionada. Mais especificamente, o espectro de XPS Nis do GO-3SÍO2 na Figura 7 (B) apresenta dois picos em 402,1310,15 eV e 399,9910,12 eV oriundos das ligações -NH3+ e NH2/C-N/N-C=O (formação de ligação amida), respectivamente. O espectro XPS Nis do GO- 2SiO2 mostrado na Figura 7 (C) apresenta dois picos em 402,1810,15 eV e 400,0510,17 atrelados às ligações -NH3+ e NH2/C-N/N-C=O (formação de ligação amida), respectivamente. Finalmente, o espectro de XPS Nis do GO-ISÍO2 na Figura 7 (D) exibe os dois principais picos em 402,1010,09 eV e 400,0110,04 eV referentes, respectivamente, às ligações - NH3+ e NH2/C-N/N-C=O (formação de ligação amida). O espectro de XPS do núcleo de nitrogênio foi importante para a confirmação da ligação amida nos nanocompósitos e complementação dos resultados obtidos e comentados acima. Nota-se, ainda, a importância da técnica da espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-x na resolução desse problema, uma vez que as técnicas anteriores não proporcionaram precisamente as informações necessárias para a investigação desse aspecto de ligação quimica, importante no processo de caracterização dos nanocompósitos. Outra observação igualmente importante reside no fato da utilização estratégica do conjunto de técnicas de caracterização, visto que cada uma delas forneceu informações especificas referentes às propriedades quimicas desses materiais. Nesse contexto, a sua utilização de maneira complementar foi crucial no somatório de informações que proporcionou nosso grupo caracterizar e conhecer quimica e estruturalmente os materiais obtidos. Para maior compreensão, a Figura 7 indica, de maneira clara e objetiva, o deslocamento de picos devido à formação da ligação amida nos nanocompósitos GO-SÍO2.

[00102] A Figura 8 abrange as imagens de microscopia eletrônica de transmissão dos nanocompósitos. Nota-se, em todas as situações, que a morfologia do GO-3SÍO2 (A) , GO- 2SÍO2 (B) e GO-ISÍO2 (C) são semelhantes e caracterizada por folhas transparentes e homogêneas de óxido de grafeno decorado com nanoparticulas de silica de morfologia esférica. Nota-se que as nanoparticulas estão presentes em pequenos aglomerados sobre as folhas de GO. O resultado observado através da técnica de TEM, portanto, corrobora com as informações contidas nas técnicas apresentadas.

Ensaios hemolíticos

[00103] A Figura 9 exibe os resultados biológicos dos experimentos de hemólise pelo óxido de grafeno e os nanocompósitos obtidos no presente pedido de patente. Em primeira instância, observou-se, em todas as situações, efeitos hemoliticos dose dependentes, isto é, aumento de lise das células vermelhas do sangue proporcional ao aumento de concentração de cada uma das nanoestruturas aplicadas nos ensaios, cuja faixa de valores de concentração é compreendida entre 0 e 250 μg/mL. A curva do óxido de grafeno apresenta um resultado interessante do ponto de vista biológico, uma vez que a taxa de hemólise pelo referido material aumenta significativamente a partir da concentração de 10 μg/mL.

[00104] Nessa situação, a taxa hemolitica de 9,511,4% passa para valores percentuais de 55,6112,1% (50 μg/mL), 69,6116,1% (100 μg/mL), 82,013,4% (150 μg/mL), 80,217,3% (200 μg/mL) e 79,0±l,6 % (250 μg/mL), indicando baixa hemocompatibilidade do GO. Considerando-se o inicio das investigações cientificas a respeito da interação desse tipo de nanomaterial com sistemas biológicos, há ainda grande discussão sobre o fenômeno mencionado, uma vez que estudos da literatura reportam óxido de grafeno pristino atrelado a baixos valores de hemólise e estudos compreendendo resultados contrários, isto é, elevados teores de lise das células vermelhas do sangue pelo referido material. A maneira pela qual o óxido de grafeno é sintetizado, proporcionando características fisico-quimicas distintas, detém relação com os resultados biológicos mencionados. Nesse contexto, o elevado teor de hemólise observado na Figura 9 pelo óxido de grafeno pode compreender uma série de razões: em um primeiro aspecto, a carga superficial estimada em -45,4±1,1 mV pode deter correlação com o efeito observado. Adicionalmente, sabe-se que as cargas negativas presentes na superficie do GO são provenientes dos grupos carboxilatos (-COO-). Finalmente, a funcionalização do óxido de grafeno com nanoparticulas de silica gerou efeitos hemoliticos não previstos, mostrando significativa redução da porcentagem de lise comparada com a do óxido de grafeno pristino. Uma análise mais detalhada do gráfico contido na Figura 9 mostra, em primeira instância, teores de hemólise quase semelhantes em todos os nanocompósitos obtidos na faixa de concentração entre 0 e 250 μg/mL. Nesse contexto, os efeitos hemoliticos das nanoestruturas GO-SÍO2 na faixa de concentrações entre 50 e 250 μg/mL foram de, no minimo 4,5±l,0% (pelo menos 8 vezes menor do que no óxido de grafeno) e no máximo de 37,4±9,6% (pelo menos duas vezes menor do que no óxido de grafeno). A redução de cargas eletrostáticas na superfície dos nanocompósitos observada através na técnica de potencial zeta é possivelmente relacionada com o fenômeno observado, uma vez que a diminuição de espécies carboxilato (negativos) devido à formação de ligação amida pode ser responsável pela redução de interação com as membranas das células vermelhas do sangue, diminuindo a hemólise. A morfologia pode, também, contribuir para os efeitos observados: nesse contexto, as folhas de óxido de grafeno podem blindar os grupos silanóis superficiais da sílica (SiO-, carregados negativamente) e, as nanoparticulas de sílica por sua vez, contribuem para a redução de hemólise mediante formação de ligação amida e devido à presença de seus grupos amina carregados positivamente, minimizando a interação eletrostática com a membrana mencionada, também detendo cargas positivas. Portanto, do ponto de vista de aplicação biológica em processos drug delivery os nanocompósitos de óxido de grafeno e sílica apresentam-se como potenciais candidatos, podendo ser aplicados por via intravenosa.

Ensaios de interação com proteínas (efeito corona)

[00105] A Figura 10 apresenta o SDS-PAGE do óxido de grafeno e dos nanocompósitos obtidos no presente pedido de patente bem como a distribuição de proteínas compreendendo pesos moleculares entre 10 e 250 kDa. No gel de eletroforese do GO são observadas bandas de proteínas abrangendo pesos moleculares de aproximadamente 13 kDa e outra de proteínas entre 32 e 250 kDa, mostrando adsorção de quantidades significativas e de tamanhos variados das referidas macromoléculas.

[00106] Nesse contexto, há significativa probabilidade de adsorção de proteinas opsoninas, proteinas do sistema imunológico importantes na detecção de corpos estranhos do sangue. Portanto, o óxido de grafeno obtido ainda não é adequado para aplicação como carreador de fármacos antitumorais, pois seria facilmente removido do organismo vivo, refletindo consequentemente em tempos curtos de circulação sanguinea. É importante frisar a relevância do tempo pela qual um nanocarreador transporta fármacos no sangue, pois trata-se de um parâmetro crucial para aumento de probabilidade de alcance às células alvo. Os nanocompósitos, por sua vez, mostraram resultados interessantes. A análise do gel de eletroforese exibe significativa redução de interação dos materiais GO-SÍO2 com proteinas, mostrando perfil de bandas semelhantes nos três casos. Mais especificamente, proteinas compreendendo pesos específicos encontram-se adsorvidas em pequenas quantidades, podendo-se observar bandas de polipeptideos de pesos moleculares de 13, 58, 100 e 250 kDa. Consequentemente, proteinas compreendidas entre as faixas 13-58kDa, 58-100kDa e 100-250kDa são observadas em quantidades significativamente menores, o que é importante do ponto de vista biológico. Mais especificamente, sabe-se que os anticorpos (também chamados de imunoglobulinas) , um dos tipos de opsoninas que atuam na remoção de corpos estranhos no sangue, detêm peso molecular de aproximadamente 150 kDa.

[00107] Este peso molecular refere-se à um tipo de imunoglobulina mais abundante no sangue, a imunoglobulina G (IgG). Dessa maneira, sabendo-se que proteinas abrangendo o referido valor apresentam pouca ou nenhuma interação com os nanocompósitos (notar que proteínas entre 100 e 250 kDa são pouco observadas no gel da Figura 10), pode-se inferir que a probabilidade de remoção desses materiais pelo sistema imunológico no sangue é baixa, promovendo tempos significativos de circulação sanguínea e, portanto, maiores chances de alcance efetivo às células alvos no processo de carreamento de fármacos antitumorais. De maneira mais abrangente, considerando-se alto potencial de redução de interação com proteínas pelos nanocompósitos, há significativa probabilidade de pouca adsorção de outros tipos de opsoninas mais específicas do sangue na superfície desses materiais.

[00108] Do ponto de vista físico-químico, o efeito corona reduzido observado pode estar relacionado, em primeira instância, com a diminuição de cargas eletrostáticas negativas nos nanocompósitos em relação ao óxido de grafeno pristino e grupamentos aromáticos, uma vez que as proteínas são atraídas eletrostaticamente e por interações hidrofóbicas, respectivamente. A segunda possibilidade para explicação dos efeitos observados pode ter origem estereoquímica, isto é, a presença de sílica na superfície do GO pode gerar efeitos esféricos capazes de minimizar sua atração com os polipetídeos. É interessante notar que, a redução de cargas eletrostáticas tendendo à neutralidade e o aumento do caráter hidrofílico é um efeito conhecido e proveniente de processos de funcionalização de nanoparticulas de sílica com um polímero denominado polietileno glicol (neutro e hidrofílico) aplicadas para redução do efeito corona, hemocompatibilidade e carreamento de fármacos.

[00109] No caso dos nanocompósitos, as referidas propriedades fisico-quimicas refletem um efeito sinérgico proveniente do acoplamento das nanoparticulas de silica com óxido de grafeno que, quando isolados, são caracterizados pela elevada adsorção de proteinas. Os resultados provenientes dos experimentos de efeito corona e hemólise sugerem a possibilidade de potencial aplicação dos nanocompósitos como carreadores de fármacos antitumorais no sangue, uma vez que mostraram uma redução no efeito hemolitico e com alta probabilidade de tempos elevados de circulação sanguinea devido à baixa interação com proteinas (podendo incluir as opsoninas) do plasma sanguineo.

Conclusão

[00110] O conjunto de técnicas de caracterizações fisico- quimicas e de microscopia como o XPS, RMN, TEM, SEM, DRX e outras comprova a obtenção de nanocompósitos de óxido de grafeno e nanoparticulas de silica em teores crescentes de 4, 13 e 18% (m/m) de silica em relação ao GO. Os estudos biológicos de interação dos materiais GO-SiOz com hemácias mostraram teores de hemólise no minimo duas vezes menor e no máximo 8 vezes menor comparado com o óxido de grafeno pristino, na faixa de concentração entre 0 e 250 μg/mL de material que interage.

[00111] Contribuindo com tais efeitos, os estudos de efeito corona mostram expressiva redução de interação de proteinas do sangue humano com os nanocompósitos, possibilitando minimizar a interação com proteinas especificas do sistema imunológico atuantes no processo de remoção de corpos estranhos e, portanto, possibilitando maiores tempos de circulação sanguinea em processos drug delivery. Dessa maneira, os materiais GO-SÍO2 sintetizados caracterizam-se como potenciais nanocarreadores de fármacos e abre perspectivas como: novos estudos fenomenológicos com outros sistemas biológicos (macrófagos por exemplo); possibilidade de otimização topográfica mediante funcionalização com moléculas especificas para sua internalização seletiva em células antitumorais; estudos de interação com sistemas biológicos mediante modelagem computacional e molecular para maior compreensão das forças envolvidas nesse processo; novas possibilidades de exploração de aplicações no ramo de catálise, remediação ambiental e novos estudos de interação com insetos em processos de controle de pragas em produtos agricolas.

Claims (29)

1. Processo de obtenção de nanocompósito à base de óxido de grafeno caracterizado por compreender nanoparticulas de sílica e as seguintes etapas: a) preparar uma dispersão aquosa de óxido de grafeno em concentrações entre 0,1 e 1 mg/mL em meio reacional revestido com material plástico; i) diluir a dispersão de óxido de grafeno compreendida na etapa (a), com água; ii) esfoliar a dispersão de óxido de grafeno compreendida na etapa (a (i)) por pelo menos 1 hora por meios ultrassônicos; b) preparar uma dispersão aquosa de nanopartículas de sílica funcionalizadas com grupos amino na superfície externa, em concentrações entre 0,01 e 0,1 mg/mL: i) dissolução de surfactante, preferencialmente o brometo de hexadeciltrimetilamônio, entre 0,65 e 0,75 g, preferencialmente 0,75 g, em catalisador de amônia em concentração entre 0,03 e 0,07 mol/L, preferencialmente 0,05 mol/L, e solvente de reação alcoólico em volumes entre 2,5 e 3,8 mL, preferencialmente 3,2 mL; ii) agitação da solução obtida na etapa anterior em temperatura entre 40 e 80 °C, preferencialmente 60 °C; iii) adição de precursor inorgânico de silício entre 1 e 3 mL, preferencialmente 1,5 mL, em feniltrietóxisilano (PTES) entre 10 a 40% de mol- Si; iv) adição lenta da solução obtida na sub etapa (iii) na solução obtida na sub etapa (i); v) agitação da solução obtida na etapa anterior durante 120 minutos em temperaturas entre 40 e 80 °C, preferencialmente 60 °C: 1) adição de precursor inorgânico de silício, após 60 minutos de reação, em quantidades volumétricas entre 100 e 150 μL, preferencialmente 124 μL; 2) adição de precursor inorgânico de silício, após 90 minutos de reação, em quantidades volumétricas entre 100 e 150 μL, preferencialmente 124 μL; vi) Centrifugação por entre 40 e 80 minutos, preferencialmente 60 minutos, entre 10.000 e 20.000 rpm, preferencialmente 15.000; descarte do sobrenadante e redispersão em etanol, obtendo-se dispersão de nanopartículas de partida; vii) dispersão de nanopartículas de partida em massas entre 50 e 500 mg, preferencialmente 300 mg, em solvente etanol em volumes entre 20 e 60 mL, preferencialmente 40 mL; agitação da solução entre 40 e 90 minutos, preferencialmente 75 minutos em temperatura entre 40 e 80 °C, preferencialmente 60 ° r • viii) Adição de silano aminopropil ou silano-PEG amino na solução da sub etapa (vii); ix) Agitação da solução da sub etapa (viii) entre 10 e 20 horas, preferencialmente 13 horas; x) Centrifugação da solução compreendida na sub etapa (ix) entre 40 e 80 minutos, preferencialmente 60 minutos, entre 10.000 e 20.000 rpm, preferencialmente 15.000; descarte do sobrenadante e redispersão em etanol; repetida pelo menos duas vezes; xi) Obtenção das nanopartículas de sílica funcionalizadas com grupos amino na superfície externa em etanol; xii) homogeneizar a dispersão de nanopartículas de sílica; c) adicionar lentamente cloridrato de N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC) aquoso na dispersão de óxido de grafeno obtida na sub etapa (a (ii)) , em razão EDC:óxido de grafeno entre 1:10 (m/m) e 1:1 (m/m)e agitar até que se obtenha homogeneidade e distribuição de espécies EDC no decorrer das folhas de óxido de grafeno com largura e dimensões entre 550 e 3500nm; d) adicionar N-hidroxisuccinimida (NHS) aquoso em quantidades entre 0,1 e 1 mol para cada mol de EDC no meio reacional compreendido na etapa (c), e agitar; e) adicionar a dispersão de nanopartículas de sílica compreendida da etapa (b (xii)) no meio reacional compreendido na etapa (d) sob agitação constante, e agitar a mistura para formação do nanocompósito; f) separar o nanocompósito compreendido na etapa (e) das nanopartículas de sílica que não formaram ligação covalente às folhas de GO, por meios de separação; g) lavar o nanocompósito obtido na etapa (f) com pelo menos 200 mL de álcool metílico até a remoção do excesso de EDC e NHS; e pelo menos 800 mL de água até a remoção do álcool, da sílica não ligada ao óxido de grafeno e moléculas de EDC e NHS que atuam como catalisadores; h) suspender o nanocompósito obtido na etapa (g) em água, obtendo-se o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanopartículas de sílica, em dispersão aquosa; i) preparar a dispersão do nanocompósito compreendido na etapa (h) em concentrações entre 1 e 10 mg/mL; j) adicionar fármaco hidrofóbico na dispersão compreendida na etapa (i) e misturar; k) separar o nanocompósito compreendendo o dito fármaco encapsulado na nanopartícula e incorporado no óxido de grafeno, do fármaco não encapsulado/incorporado, por meios de separação; l) obter o nanocompósito à base de óxido de grafeno e nanopartículas de sílica como carreador de fármacos hidrofóbicos.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a), a dispersão aquosa de óxido de grafeno ser em concentração de 1 mg/mL em meio reacional revestido com material plástico.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b), o preparo da dispersão aquosa de nanopartículas de sílica funcionalizadas com grupos amino na superfície externa ser em concentração de 0,1 mg/mL.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na sub etapa (b1), a homogeneização da dispersão de nanopartículas de sílica ser por pelo menos 15 minutos por meios de homogeneização ultrassônicos.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (d), a adição de NHS aquoso no meio reacional ser gota a gota por pelo menos 10 minutos e em concentração de até 1 mg/mL, e a agitação ser por pelo menos 23 horas.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (e), a adição da dispersão de nanopartículas de sílica no meio reacional ser gota a gota por pelo menos 20 minutos, e a agitação ser por pelo menos 24 horas.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (i), a preparação da dispersão do nanocompósito ser em concentração de 1 mg/mL.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa (j), a mistura ser por meios de homogeneização ultrassônica em tempos entre 30 e 60 minutos.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa (a1) a diluição água:óxido de grafeno ser realizada na razão mínima de 8:1 (v/m).

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da razão de óxido de grafeno:nanopartícula de sílica é entre 24:1 (m/m) e 2:1 (m/m) no nanocompósito.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do fármaco hidrofóbico ser adicionado na razão de até 1:10 (m/m) ao nanocompósito.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do fármaco hidrofóbico ser selecionado do grupo de fármacos compreendendo a curcumina, camptotecina, docetaxel, doxorrubicina, violaceína, tamoxifeno, beta-lapacona e análogos.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos meios de separação da etapa (f) compreenderem a filtração em membranas hidrofílicas compreendendo poros entre 0,09 e 0,22μm.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos meios de separação da etapa (k) compreenderem a decantação por pelo menos 24 horas.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do precursor inorgânico de silício compreender alcóxidos de silício e o tetraetilortossilicato.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do silano aminopropil ou silano PEG amino serem utilizados em quantidades entre 5 e 25% mol-Si.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do PEG compreendido no silano PEG amino compreender peso molecular entre 350 e 2000 Da.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do grupo hidrofóbico compreendido no silano hidrofóbico compreender grupos hidrofóbicos selecionados dentre grupos aromáticos e derivados; e grupos à base de hidrocarboneto e derivados.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato dos grupos aromáticos e derivados serem selecionados dentre o grupo das funções fenil, acetofenil, e pireno.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato dos grupos à base de hidrocarbonetos e derivados serem selecionados dentre o grupo das funções octil e octadecil.

21. Nanocompósito caracterizado pelo fato ser obtido no processo descrito nas reivindicações de 1 a 20 e compreender nanopartículas de sílica mesoporosa compreenderem diâmetro entre 50 e 80 nm, área superficial entre 650 e 1200 m2/g e volume de poros entre 1,8 e 2,3 cm3/g.

22. Nanocompósito, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato do óxido de grafeno ser obtido pela oxidação química do grafite natural.

23. Nanocompósito, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato da ligação covalente entre o óxido de grafeno e as nanopartículas de sílica mesoporosa ser uma ligação amida.

24. Nanocompósito, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de gerar no mínimo 3,5% e no máximo 47% de hemólise na faixa de concentrações entre 50 e 250 μg/mL.

25. Nanocompósito, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato dos grupos aminopropil ou PEG-amino serem funcionalizados em quantidades entre 5 e 25% mol-Si.

26. Nanocompósito, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato do óxido de grafeno compreender grupos funcionais ácido carboxílico, epóxi, hidróxi, cetona e aldeído em sua superfície.

27. Nanocompósito, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato do fármaco hidrofóbico ser encapsulado nas nanopartículas de sílica mesoporosa e incorporado no óxido de grafeno.

28. Uso do nanocompósito, conforme definido nas reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de ser aplicado como carreador de fármacos hidrofóbicos.

29. Uso do nanocompósito, conforme definido nas reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de ser aplicado na preparação de medicamentos para tratamentos antitumorais, antimicrobianos, anti-inflamatórios, antissépticos e anti malária.

Images