BR102016026252A2

BR102016026252A2 - tratamento de vaginite

Info

Publication number: BR102016026252A2
Application number: BR102016026252A
Authority: BR
Inventors: Glock Gaston
Original assignee: Glock Health Science And Res Gmbh
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2017-05-23
Also published as: CN106974932A; KR102335607B1; CA2947570C; AU2016247097B2; KR20170055932A; TR201904382T4; JP6792420B2; EP3167890A1; EP3167891A1; EP3167891B1; US20170136060A1; JP2017088603A; CA2947570A1; ES2719223T3; CN106974932B; AU2016247097A1

Abstract

a presente invenção refere-se ao tratamento de micoses vaginais, vaginoses bacterianas e outras formas de vaginite (inflamação da vagina). de acordo om a invenção, para esse fim, é usada externamente clinoptilolita, que apresenta um tamanho de partícula entre 0,2 e 10 micrômetro, no tratamento dessas doenças vaginais em mamíferos e seres humanos, bem como para restauração do microbioma vaginal saudável. a clinoptilolita pode ser usada com um ou mais dos seguintes aditivos: veículos farmaceuticamente compatíveis, micro-organismos viáveis e/ou extratos dos mesmos, nutrientes para o microbioma vaginal saudável (por exemplo, lactose, etc.), substâncias, que influenciam favoravelmente o meio vaginal para o microbioma vaginal saudável (por exemplo, estradiol, ácidos orgânicos, etc.). a composição usada pode ser usada localmente, de preferência, em uma das seguintes formas de administração: espuma, supositório, comprimido vaginal, óvulo, gel, aerossol, pó, lavagem, banho íntimo, creme/pomada, suspensão.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMENTO DE VAGINITE".

[001] A presente invenção refere-se ao tratamento de micoses vaginais, vaginoses bacterianas e outras formas da vaginite (inflamação da vagina) de acordo com a reivindicação 1.

[002] Do documento WO 00/64586 é conhecido um dispositivo e um processo relacionado ao mesmo, para triturar materiais minerais, do qual, a seguir, é contado superficialmente em que doenças pode ser usado com sucesso, sendo que quase nenhuma doença é omitida. Foram feitas algumas referências a testes a respeito de doenças carcinogênicas, doenças hepáticas, diabetes, esclerose múltipla, sem qualquer indicação à organização a ser realizada ou quaisquer detalhes. Outras áreas de aplicação citadas são a produção de alimentos, de cosméticos, de defensivos para plantas, de cigarros e matérias primas na indústria de construção. O dispositivo descrito consegue triturar acima de 98% de todas as partículas para abaixo de 4,3 mm, sendo que acima de 28% de todas as partículas são menores do que 0,5 mm. Esses dados não estão em nenhuma relação com os da aplicação.

[003] Do mesmo inventor origina-se o documento WO 2007/054085, que descreve clinoptilolite, triturado para abaixo de 100 nanômetros, corresponde a 0,1 mm, com própolis e/ou colostro como agente antiviral, entre outros, para tratamento de gripe, resfriado, tosse, sarampo, caxumba, rubéola, eritema infeccioso (também chamado de Quinta Doença), febre-de-três-dias, catapora, febre glandular de Pfeiffer, SARS, zitomegalia, diarreia, hepatite, paralisia infantil, Herpes labialis, verrugas, raiva, febre de Lassa, ebola, febre de Marburg, febre de Hanta vírus, encefalite do carrapato ("FSME"), RSSE, encefalomie-litis ovina, encefalite de Powassan, doença da floresta de Kyasanur, febre hemorrágica de Omsk, febre de carrapato do Colorado, febre amarela, febre de dengue, encefalite japonesa, febre do Nilo ocidental, febre de Chikungunya, febre de Q'nuong-nyong, febre de Rift -Tal, febre de SandmOcken, febre de Ross River, febre de Sindbis, febre de Mayaro, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, encefalite de Rocio, encefalite da Califórnia, febre de Bunyamera, febre de Oro-pouche, AIDS, Herpes genitalis e/ou Herpes simplex. No curso do "tratamento" de AIDS, como quadro clínico que se apresenta, entre muitos outros, também é citada a Candidose vaginal. Testes clínicos não são citados, isso tudo é mera racionalização de desejos.

[004] O documento WO 2008/003101 do inventor do presente pedido descreve um processo para purificação de clinoptilolite de metais pesados.

[005] O documento WO 2010/057849 descreve o aperfeiçoamento da cura de feridas por aplicação de clinoptilolite triturada, que reduz a concentração de aminas. Sem referência mais detalhada sobre as aplicações individuais, são citados tamanhos de partículas de 2 a 16 mm, que também precisam dispor de um potencial zeta predefinido e de uma superfície específica predefinida. Métodos de medição não estão indicados. Como exemplos são indicados, exclusivamente, ensaios in-vitro, com soluções aquosas contendo aminas produzidas sin-teticamente.

[006] Do documento EP 956 858 é conhecido que bactérias pro-bióticas são úteis no tratamento de infecções vaginais.

[007] Em geral, pode-se considerar o seguinte: [008] No caso típico (saudável), o microbioma vaginal da mulher sexualmente madura está composto, em sua maior parte, por lactoba-cilos diferentes, dependendo da correspondência étnica, Lactobacillus crispatus, L. gasseri, L. iners, L. jensenii), que, entre outros, asseguram um valor de pH ótimo e inibem o crescimento de agentes patogênicos. Sob influência de diversos fatores ambientais, a flora vaginal natural é atacada e, devido a um desequilíbrio (disbiose), pode ocorrer uma predominância de germes patogênicos.

[009] É um objetivo e tarefa da invenção indicar um tratamento, que, por um lado, combate germes patogênicos o mais eficientemente possível, por outro lado, protege o mais possível os lactobacilos úteis.

[0010] Essa tarefa de acordo com a invenção é solucionada com as características indicadas na reivindicação 1, em outras palavras, é usado localmente (externamente) clinoptilolite, para tratamento de doenças vaginais, tais como vaginose bacteriana, candidose vulvovaginal e tricomoníase de mamíferos e seres humanos, bem como para restauração do microbioma vaginal saudável.

[0011] Para jurisdições, nas quis isso é possível ou exigido, a invenção consiste no fato de que clinoptilolite, que apresenta um tamanho de partícula entre 0,2 e 10 mm, é usado para produção de um medicamento para tratamento da(s) doença(s) citada(s) inicialmente.

[0012] De preferência, o clinoptilolite está liberado de metais pesados, de modo particularmente preferido por um processo de acordo com o documento EP 2 040 837 ou do documento US 8.173.101 correspondente. Para jurisdições, nas quais isso é possível, o teor da declaração desses documentos é feito teor do presente pedido, por referência.

[0013] A eficiência da substância de acordo com a invenção evidencia-se dos exames e ensaios narrados a seguir em várias cepas de micro-organismos diferentes. Está comprovado que a substância apresenta sobre representantes da espécie Candida, bem como sobre agentes patogênicos bacterianos selecionados da flora vaginal, um efeito inibidor de crescimento, enquanto representantes de uma flora vaginal saudável são até mesmo estimulados no crescimento.

[0014] Para ilustrar a relação entre tamanho de partícula e a eficiência, no final dos ensaios que comprovam a eficiência estão anexados ensaios comparativos correspondentes.

[0015] As indicações postas em [n] referem-se à bibliografia apresentada no final da descrição. Os resultados estão representados em diversas tabelas e gráficos na forma de figuras, nesse caso mostra ou mostram: [0016] Figura 1 o crescimento de Candida albicans com/sem zeóli-to no caldo de Sab, [0017] Figura 2 a influência de zeólito sobre o crescimento de Candida albicans no caldo de Sabouraud, [0018] Figura 3 a influência de zeólito sobre o número de germes de culturas de Candida albicans, depois de 300 min de incubação, [0019] Figura 4 a influência de zeólito sobre o crescimento de Candida albicans no caldo de Sabouraud (Vialight Assay), [0020] Figura 5 a influência de zeólito sobre o crescimento de Candida parapsilosis no caldo de Sabouraud, [0021] Figura 6 o efeito de zeólito sobre o crescimento de Candida parapsilosis no caldo de Sabouraud, [0022] Figura 7 a influência de zeólito sobre o crescimento de Gardnerella vaginalis, medição de viabilidade por meio de Vialight As-say, depois de 15 horas de incubação, [0023] Figura 8 a influência de zeólito sobre o crescimento de G. vaginalis, medição de viabilidade por meio de Vialight Assay, depois de 15 horas de incubação, [0024] Figura 9 a influência de zeólito sobre o crescimento de L. crispatus, medição de ATP, depois de 6 ou 24 horas de incubação, [0025] Figura 10 o número de células das culturas de L. crispatus, depois de 24 horas de incubação, determinado por contagem de colônias, [0026] Figura 11 os valores de pH dos meios e culturas de L. cris-patus, depois de 24 horas de incubação, [0027] Figura 12 a influência de zeólito sobre o crescimento de L. jensenii em caldo de MRS, dentro de 3 horas, [0028] Figura 13 a influência de zeólito sobre o crescimento de L. jensenii em caldo de MRS, dentro de 4 e 7 horas, [0029] Figura 14 a influência de zeólito sobre o crescimento de Lactobacillus. casei em caldo de MRS - Resazuriassay, [0030] Figura 15 a influência de zeólito sobre o crescimento de Lactobacillus. casei em caldo de MRS - Vialight Assay, [0031] Figura 16 os teores de lactato de diversas culturas e cocul-turas, depois de 6 horas de incubação, [0032] Figura 17 os teores de lactato de diversas culturas e cocul-turas com idade de 24 horas, [0033] Figuras 18-20 placas de ágar com diferentes culturas, [0034] Figuras 21-23 distribuições de tamanhos de partículas que foram usadas em testes comparativos, [0035] Figuras 24 e 25 crescimento dependente da distribuição das partículas de C.Albicans - medição de Resazurin [0036] Figuras 26- 28 o mesmo para C. glabrata, e [0037] Figura 29 o crescimento dependente da distribuição dos tamanhos de partículas de C.glabrata - Vialight Assay Sobre as doenças e seu tratamento [0038] Micose vaginal: [0039] A micose vaginal representa, depois da vaginose bacteria-na a segunda causa mais frequente de uma infecção da vagina.

[0040] O causador principal de infecções confirmadas são fungos de levedura da variedade Candida, sendo que Candida albicans é responsável por 85-90% de todas a infecções por fungos da vagina.

[0041] Fatores de risco que favorecem uma micose vaginal são: Gravidez Ingestão e antibióticos Diabetes mellitus Imunossupressores Medicamentos para uma terapia de câncer Medicamentos contendo cortisona Estresse ou carga psíquica [0042] Terapias recomendadas no estado da técnica consistem na aplicação tópica de diferentes antimicóticos, tais como polienos (nistatina), imidazolen (butoconazol, clotrimazol, etc.) ou ciclopiroxo-lamina. Os mesmos são administrados de modo intravaginal em um grande número de diversas preparações, tais como comprimidos va-ginais, óvulos ou cremes vaginais. A duração do tratamento pode perfazer 1 a 7 dias. Uma outra possibilidade consiste no uso único de uma substância ativa de triazol (fluconazol, itraconazol). Paralelamente à terapia antimicótica, a administração local de probióticos (por exemplo, Gynoflor, Multi-gyn Flora plus u.v.m.) pode ajudar a formar novamente a flora vaginal saudável e baixar o valor de pH do meio. Esses produtos (comprimidos vaginais, óvulos, géis, cremes etc.), podem conter, entre outras coisas, lactobacilos viáveis (os chamados "bastonetes de Doderlein") ou lisados dos mesmos, bem como es-triol, que como derivado de estrogênio promove a formação de um meio de mucosa "saudável", e lactose como nutriente para os lacto-bacilos.

[0043] Nos casos de uma fraqueza imunológica local, já pouco tempo depois do término da terapia ocorre uma recaída. Contra essa vulvovaginite por Candida albicans cronicamente recidiva, na falta de alternativas, são recomendadas terapias de manutenção locais ou orais, para evitar recaídas. Aqui, como terapia inicial é usada, tal como descrito previamente, um produto tópico durante 7-14 dias e, parale- lamente a isso, é administrado oralmente, na primeira semana 3 x 200 mg de fluconazol. A terapia de manutenção consiste, em seguida a isso, em uma administração semanal de 150 mg de fluconazol.

[0044] Todos os dados de concentração na descrição, nas reivindicações e nas figuras, quando não estão indicados de outro modo, devem ser vistos como % em M/V [kg/litro] .

[0045] De acordo com a invenção, clinoptilolite, que apresenta um tamanho de partícula entre 0,2 e 10 mm, é usado localmente em uma concentração de 1 mg/ml até 10 mg/ml {correspondendo a 0,1% M/V até 1% M/V, quando M é indicado em kg e V em litros), com o seguinte efeito sobre Candida albicans: 1° Teste: [0046] Candida albicans (DSM No. 1386) [4] foi cultivada de acordo com métodos frequentemente usados na rotina sobre Ágar de Levedura de Cloranfenicol Glicose (”Yeast Glucose Chloramphenicol") (YGC) e depois transferida para um meio líquido (caldo de Sabou-raud).

[0047] Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas), em cada caso, com 1 x 105 células/ml, sendo que a 4 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 4 culturas foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 1 mg/ml e a outras 4 culturas, pó de zeólito na quantidade de 10 mg/ml. As culturas de teste foram incubadas a 37°C sob condições aeróbicas, sob agitação. Para determinação dos valores cegos, todos os meios também podem conduzidos no teste em condições estéreis.

[0048] Ao longo do período de 6 horas, a cada hora foram tiradas alíquotas das culturas para determinação da atividade do metabolismo por meio do teste de viabilidade (Resazurin-Assay) [7];

[0049] Os resultados, dos quais se evidencia diretamente a alta eficiência, estão representados graficamente na Figura 1. Curvas de cima para baixo: 0%, 0,1% e 1% de zeólito. 2°Teste [0050] O ensaio descrito previamente foi repetido com as seguintes duas modificações: - o tempo do teste foi ampliado para 7 horas - alíquotas das culturas foram diluídas depois de 5 horas de incubação, para determinação do número de células efetivo, dispostas sobre ágar de Sabouraud e avaliadas depois da incubação por meio de contagem de colônias.

[0051] A Figura 2 mostra os resultados do Resazurin Assay, curvas tal como na Figura 1. O resultado do ensaio de crescimento precedente pôde ser confirmado. Na Figura 3, os números de germes determinados empiricamente dos grupos de teste (a partir da esquerda: 0%. 0,1%, e 1% de zeólito). 3° Teste: [0052] Em uma repetição do ensaio, foi selecionada uma medição alternativa da atividade metabólica (Vialigh Assay) [8], para fundamentar os resultados dos testes. A Figura 4 (colunas, em cada caso, a partir da esquerda: 0,01% e 1% de zeólito) mostra os grupos de teste depois de 3, 4 e 5 horas de incubação. Tal como visível, com a substância de acordo com a invenção pôde ser obtida uma redução da atividade do metabolismo de Candida albicans em cultura de caldo.

[0053] A seguir, foi testado o efeito da substância de acordo com a invenção em concentrações de 10 mg/ml e 50 mg/ml sobre Candida parapsilosis (isolado próprio; S0811-01) [9]: Candida parapsilosis foi inicialmente cultivado sobre Ágar de YGC de acordo com métodos frequentemente usados na rotina e, a seguir, transferido para um meio líquido (caldo de Sabouraud) e incubado.

[0054] Depois do número de células por meio da câmara de contagem foram produzidas 9 preparações de teste (cultura de levedo), com, em cada caso, 1 x 106 de células de levedo/ml, sendo que a 3 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 3 culturas, foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 10 mg/ml (1% M/V) e a outras 3 culturas, pó de zeólito na quantidade de 50 mg/ml (5% M/V). As culturas de teste foram incubadas a 30°C, sob agitação: 3 x 12 ml de caldo de Sabouraud 3 x 12 ml de caldo de Sabouraud e 0,1% de zeólito 3 x 12 ml de caldo de Sabouraud e 5% de zeólito [0055] Para determinação dos valores, foram incubadas alíquotas de todos os meios, que também são conduzidos no teste em condições estéreis.

[0056] Depois de 60 min, 120 min, e, depois a cada outros 30 min, foram determinadas as atividades metabólicas de cada cultura de teste, indiretamente, por meio de teste de viabilidade corrente (Resazuri-nassay). Os valores de medição das 3 preparações da mesma condição tiveram a média determinada e inclusive desvios padrão foram representados na Figura 5 (curvas, a partir de cima: 0 mg/ml, 10 mg/ml e 50 mg/ml.

[0057] Tal como visível, das duas doses usadas da substância levam a uma nítida inibição de crescimento dos germes de teste. 4° Teste [0058] Efeito da substância de acordo com a invenção sobre Candida parapilosis, em concentrações de 1 mg/ml e 0,2 mg/ml: Candida parapilosis foi primeiramente cultivada sobre Ágar de YGC de acordo com métodos frequentemente usados na rotina, e, a seguir, transferido a um meio líquido (caldo de Sabouraud) e incubado.

[0059] Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem de Neubauer, foram produzidas 9 preparações de teste (culturas de levedo), com, em cada caso, 1 x 106 de células de levedo/ml, sendo que a 3 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a três culturas, foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 1 mg/ml (0,1% M/V) e a outras 3 culturas, pó de zeólito na quantidade de 0,2 mg/ml (0,02% M/V). As culturas de teste foram incubadas a 30°, sob agitação: 3 x 12 ml de caldo de Sabouraud 3 x 12 ml de caldo de Sabouraud e 0,1% de zeólito 3 x 12 ml de caldo de Sabouraud e 0,02% de zeólito [0060] Para determinação dos valores cegos, foram incubadas alíquotas de todos os meios, conduzidas no teste em condições estéreis.

[0061] Depois de 60 min, 120 min e, depois, a cada outros 30 min, foram determinadas as atividades metabólicas de cada cultura de teste, indiretamente, por meio de teste de viabilidade corrente (Resazuri-nassay). O valores de medição das 3 preparações da mesma condição tiveram a média determinada e inclusive desvios padrão foram representados na Figura 5 (curvas, a partir de cima: 0%, 0,02% e 0,1% de zeólito.

[0062] Mesmo nas menores concentrações usadas (0,02%), linha central na Figura 6, a substância daí tem uma ação nitidamente retar-dadora do crescimento sobre Candida parapsilosis.

Vaginose Bacteriana [0063] A vaginose bacteriana representa a forma mais frequente da vaginite. Ela ocorre quando a flora vaginal saudável, produtora de H2O2 (principalmente diversos representantes do lactobacilos), é substituída no âmbito de uma disbiose por bactérias predominantemente anaeróbicas. As mesmas incluem, predominantemente, Gardnerella vaginalis e Atopobium vaginae, mas também representantes das variedades Megasphaera, Dialister, Mobiluncus, Prevotella e outros. Fato- res de risco que favorecem uma vaginose bacteriana são, entre outros: estado socioeconômico baixo estresse) frequentes lavagens vaginais fumo relações sexuais não protegidas, com troca frequente de parceiros dispositivos contraceptivos no útero uso frequente de doses mais altas do espermicida Nonoxi- nol-9 [0064] Recomendações terapêuticas: [0065] Exceto na gravidez, é realizada uma terapia de 7 dias com metronidazol (2 x 500 mg/dia). Outras possiblidades consistem na administração local de metronidazol ou clindamicina na forma de cremes vaginais de 2% (período de 7 dias). Também é possível o uso de comprimidos vaginais, para a administração local, duas vezes ao dia, de 500 mg de metronidazol, pelo período de 7 dias. Além disso, existem óvulos para a aplicação intravaginal de clindamicina (100 mg por dia, por 3 dias).

[0066] O biofilme bacteriano aderente, no entanto, não é eliminado nas terapias descritas, portanto, a proporção de cura, depois de 3 meses, só está em 60-70%, e, depois de 6 meses, ainda mais abaixo. Pelo uso de probióticos, que, entre outros, baixam o valor de pH vaginal e estimulam a flora vaginal, a proporção de recidivas do BV pode ser reduzida, aproximadamente, pela metade (veja [2]: S1-Terapia da mi-cose vaginal).

[0067] A eficiência da substância de acordo com a invenção evidencia-se dos exames e ensaios com Gardnerella vaginalis, narrados a seguir: 5° Teste [0068] Efeitos da substância de acordo com a invenção, na con- centração de 1 mg/ml (0,1% M/V) e 10 mg/ml (1% MV) sobre Gardne-rella vaginalis: [0069] Gardnerella vaginalis, (DSM N°. 4944) foi cultivado de acordo com métodos frequentemente usados na rotina sobre Ágar de Casman e, depois, transferido para um meio líquido (TSB+5% de Horse Serum [soro de cavalo).

[0070] Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas), em cada caso, com 1 x 105 células/ml, sendo que a 4 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 4 culturas foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 1 mg/ml, e a outras 4 culturas, pó de zeólito na quantidade de 10 mg/ml. As culturas de teste foram incubadas, sob agitação, por 15 horas, sob condições anaeróbi-cas, a 37°C.

[0071] Para determinação dos valores cegos, todos os meios também foram conduzidos no teste em condições estéreis.

[0072] Depois, foram retiradas alíquotas das culturas, para determinação da atividade metabólica, por meio de teste de viabilidade (Vialight-Assay).

[0073] Na Figura 7 (coluna, a partir da esquerda: 0%, 0,1%, e 1% de zeólito), os resultados estão representados graficamente. 6° Teste [0074] O teste de crescimento foi repetido com um número de células inicial ainda menor (5 x 104 células/ml) e forneceu um resultado equiparável, veja Figura 8 (coluna, a partir da esquerda: 0%, 0,1% e 1% de zeólito).

[0075] O estímulo da substância de acordo com a invenção sobre o crescimento da flora vaginal saudável evidencia-se dos exames e ensaios apresentados, que foram realizados em bactérias da variedade Lactobacillus: 7° Teste [0076] Lactobacillus crispatus (DMS N°. 20584) [6] foi cultivado sobre ágar de Man Rogosa Sharp (MRS) de acordo com métodos frequentemente usados na rotina e, depois, transferido para um meio líquido (caldo de MRS).

[0077] Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas), em cada caso, com 1 x 106 células/ml, sendo que a 4 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 4 culturas foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 1 mg/ml (0,1% MV), e a outras 4 culturas, pó de zeólito na quantidade de 10 mg/ml (1% M/V). As culturas de teste foram incubadas, sob agitação, a 37°C, sob condições anaeróbicas.

[0078] Para determinação dos valores cegos, todos os meios também foram conduzidos no teste em condições estéreis.

[0079] Depois de 6 e 24 horas, foram retiradas alíquotas das culturas, para determinação da atividade metabólica, por meio de teste de viabilidade (Vialight-Assay), veja a Figura 9 (coluna, a partir da esquerda: 0%, 0,1%, e 1% de zeólito). Depois de 24 horas, além disso, foram diluídas alíquotas das culturas e dispostas sobre placa com ágar de MRS, veja Figura 10 (coluna, a partir da esquerda: 0%, 0,1% e 1% de zeólito); e os valores de pH das preparações de teste foram medidos no final do teste por meio de elétrodo de pH, veja Figura 11 (coluna, em cada caso: meios, à esquerda, culturas, à direita; em cada caso, a partir da esquerda: 0%, 0,1% e 1% de zeólito).

[0080] Os resultados da contagem de colônias (Figura 10) confirmam as medições de viabilidade; a Figura 11 mostra os valores de pH das cultura depois de 24 h de incubação. Independentemente do fato de se foi ou não adicionada a substância de acordo com a invenção, em todos os casos o germe baixou o valor do meio para abaixo de 3,8. 8° Teste [0081] Lactobacillus jensenii (DMS No. 20557) [12] foi cultivado sobre ágar de Man Rogosa Sharp (MRS) de acordo com métodos frequentemente usados na rotina e, depois, transferido para um meio líquido (caldo de MRS).

[0082] Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas), em cada caso, com 5 x 105 células/ml, sendo que a 4 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 4 culturas foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 1 mg/ml (0,1% M/V) e a outras 4 culturas, pó de zeólito na quantidade de 10 mg/ml (1% M/V). As culturas de teste foram incubadas, sob agitação, a 37°C, sob condições anaeróbicas.

[0083] Para determinação dos valores cegos, todos os meios também foram conduzidos no teste em condições estéreis.

[0084] Depois de 3 horas, foram retiradas alíquotas das culturas, para determinação da atividade metabólica, por meio de teste de viabilidade (Vialight-Assay). A Figura 12 mostra graficamente o resultado do ensaio. Mostra-se um aumento da atividade metabólica por incubação com a substância de acordo com a invenção. 9° Teste [0085] O ensaio de crescimento foi repetido sob prolongamento do tempo de incubação. A medição da atividade metabólica (Vialight Assay) deu-se depois de 4 e 7 horas, da mesma maneira tal como descrita acima. A Figura 13 mostra a avaliação gráfica dos resultados de medição. O efeito promotor de crescimento da substância de acordo com a invenção sobre L. jensenii fica ainda mais nitidamente visível depois de 7 horas do que depois de 3 horas no teste 8. 10° Teste [0086] Lactobacillus casei (DMS No. 20011) [11] foi cultivado so- bre ágar de Man Rogosa Sharp (MRS) de acordo com métodos frequentemente usados na rotina e, depois, transferido para um meio líquido (caldo de MRS).

[0087] Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas), em cada caso, com 5 x 105 células/ml, sendo que a 4 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 4 culturas foi adicionado pó de zeólito na quantidade de 1 mg/ml (0,1% M/V) e a outras 4 culturas, pó de zeólito na quantidade de 10 mg/ml (1% M/V). As culturas de teste foram incubadas, sob agitação, a 37°C, sob condições anaeróbicas.

[0088] Para determinação dos valores cegos, todos os meios também foram conduzidos no teste em condições estéreis.

[0089] Depois de 1, 3 e 5 horas, foram retiradas alíquotas das culturas, para determinação da atividade metabólica, por meio de teste de viabilidade (Resazurin-Assay e Vialight Assay). (veja Figura 14 e Figura 15; as duas colunas, a partir da esquerda: 0%, 0,1% e 1% de zeóli-to).

[0090] Os resultados nas Figuras 14 e 15 não mostram, supreen-dentemente, nenhum efeito das substâncias de acordo com a invenção sobre a atividade metabólica do germe de teste dentro do período de teste. Nem com Assay de Resazurin, nem ATP, puderam ser medidas sobre longos trechos do teste diferenças significativas entre as condições individuais.

[0091] É surpreendente que a substância de acordo com a invenção, obviamente, estimula, de modo muito específico a espécie L. crispatus e L. jensenii no crescimento, relevantes para a flora vaginal, mas, simultaneamente não exerce nenhuma influência sobre o crescimento da espécie L. casei., não relevante para a flora vaginal.

[0092] Os exames e ensaios seguintes comprovam que a subs- tância de acordo com a invenção, em combinação com uma cepa de lactobacilo vaginal, pode promover a regeneração do meio vaginal saudável ou atuar de modo inibidor de crescimento sobre Gardnerella vaginalis, os dos principais agentes patogênicos da vaginose. 11° Teste [0093] Lactobacillus crispatus (DSM N°. 20584) [6] e Gardnerella vaginalis (DSM No 4944) [5] foram primeiramente cultivados em cultura pura, de acordo com métodos frequentemente usados na rotina.

[0094] Depois da determinação do número de células das culturas prévias por meio de câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas ou coculturas), em cada caso com 5 x 105 células/ml em um meio de mistura (TSB+HS e MRS na relação de 7 + 3): 1 x 10 ml de meio (7 ml de TBS + 5% de soro de cavalo e 3 ml de caldo de MRS) 1x G.vaginalis 1x G.vaginalis + 0,5% zeólito 1x L.crispatus 1x L.crispatus + 0,5% zeólito 1x L.crispatus + G.vaginalis (5:1) A 1x L.crispatus + G.vaginalis + 0,5% zeólito (5:1) A 1x L.crispatus + G.vaginalis (5:1) B 1x L.crispatus + G.vaginalis + 0,5% zeólito (5:1) B 1x L.crispatus + G.vaginalis (10:1) A 1x L.crispatus + G.vaginalis + 0,5% zeólito (10:1) A 1x L.crispatus + G.vaginalis (10:1) B 1x L.crispatus + G.vaginalis + 0,5% zeólito (10:1) B

[0095] As preparações de teste foram incubadas a 37°C, sob condições anaeróbicas sobre o agitador orbital. Depois de 6 e 24 horas, foram centrifugadas alíquotas das culturas (5 min, 15000 g), as sobras foram desativadas por 15 min, a 80°C, no banho de água e alimentadas a uma quantificação de ácido láctico [13]. O ácido láctico produzido pelos lactobacilos vaginais representa um dos fatores principais do meio vaginal saudável.

[0096] Os resultados de medição depois da 6a incubação estão representados graficamente na Figura 16. Os valores das preparações de cocultura tiveram sua média calculada para o gráfico.

[0097] Por meio da Figura 16 fica claro que a adição da substância de acordo com a invenção às coculturas promove a produção de ácido láctico de L. crispatus.

[0098] Nas culturas saturadas, depois de um tempo de incubação de 24 horas, todas as coculturas têm aproximadamente teores de lac-tato do mesmo valor como as culturas puras de L. crispatus (veja a Figura 17), o que indica que esse germe tornou-se determinante do meio. 12° Teste [0099] Lactobacillus crispatus (DSM N°. 20584 [6] e L. jensenii (DSM N°. 20557 [12) são cultivados anaerobicamente em meio líquido, de acordo com métodos frequentemente usados na rotina. Como meio de nutrição foi usado caldo de MRS, com e sem adição da substância de acordo com a invenção (10 mg/ml), que foi precondicionada antes do ensaio no mesmo meio. Alíquotas das culturas saturadas foram centrifugadas e as sobras testadas tal como descrito a seguir com relação ao seu efeito inibidor de crescimento sobre Gardnerella vaginalis.

[00100] G. vaginalis foi cultivado durante a noite em TSB + 5% de soro de cavalo e disposta densamente sobre placas de ágar e BHI+5% de soro de cavalo. Subsequentemente, com uma ponta de pipeta estéril foram estampados, em cada caso, 3 furos nas placas. Nesses entalhes das placas de ágar foram adicionadas por pipeta as sobras das culturas de lactobacilo. Como controle positivo serviu uma mistura de antibióticos (penicilina/estreptomicina), como controle negativo, foi usado meio (caldo de MRS centrifugado). As placas foram incubadas anaerobicamente a 37°C, até que se tornasse visível crescimento de campo denso de G. vaginalis. Para aumentar a umidade do ar, são adicionados aos recipientes de incubação panos úmidos.

[00101] Na avaliação, mostrou-se uma inibição do crescimento de Gardnerella vaginalis na forma de zonas de inibição, que ficaram visíveis em torno dos entalhes com as sobras de cultura. Esse efeito pode ser constatado no caso das duas cepas de Lactobacillus testadas, tanto nas sobras com como também sem a adição da substância de acordo com a invenção, no entanto, de modo mais acentuado em L. crispatus do que em L. jensenii. As reproduções (Figuras 18, 19 e 20 a seguir mostram, exemplificadamente, as placas de ágar no momento da avaliação do teste. O campo denso de bactérias de Gardnerella vaginalis está entalhada em torno das sobras de cultura de Lactobacilllus (e dos antibióticos, conduzidos conjuntamente como controle positivo).

[00102] Em suma, pode ser constatado que, por um lado, pôde ser mostrada uma inibição ou uma influência negativa sobre o crescimento de germes vaginais potencialmente patogênicos pela substância de acordo com a invenção. Por outro lado, pôde ser documentado que germes relevantes do microbioma vaginal saudável não só não são prejudicados em seu crescimento, mas até mesmo estimulados. Esse efeito inibidor de crescimento da substância de acordo com a invenção sobre germes vaginais patogênicos, a um simultâneo estímulo tenden-cial e específico do microbioma vaginal pode ser visto como surpreendente e novo.

[00103] Para o efeito da distribuição de grãos do pó de zeólito de acordo com a invenção, foram produzidos três lotes para os testes comparativos descritos a seguir. Nesse caso, a distribuição de acordo com a Figura 21 é designada como "pó de zeólito finíssimo", a distribuição de acordo com a Figura 22, como "pó de zeólito padrão" e a distribuição de acordo com a Figura 23, como "pó de zeólito grosso". Os dados da tabela são, nesse caso, os seguintes: "Pó de zeólito finíssimo" "Pó de zeólito padrão" (tal como usado também nos testes 1-12) "Pó de zeólito grosso" [00104] Portanto, o "pó de zeólito finíssimo" corresponde ao âmbito inferior de acordo com a invenção, o pó de zeólito padrão", ao âmbito superior de acordo com a invenção, e o "pó de zeólito grosso", situa-se com aproximadamente 50% de sua massa fora (acima) do âmbito de acordo com a invenção.

[00105] A execução do teste foi a seguinte: [00106] Candida albicans foi cultivado em cultura líquida (caldo de Sabouraud) de acordo com métodos frequentemente usados na rotina. Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (cultu- ras), em cada caso, com 1 x 105 células/ml, sendo que a 3 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 3 culturas foi adicionado pó de zeólito da distribuição de tamanhos padrão, na quantidade de 10 mg/ml, a outras 3 culturas, pó de zeólito finíssimo, na quantidade de 10 mg/ml e novamente a 3 culturas, pó de zeólito grosso, na quantidade de 10 mg/ml. As culturas de teste foram incubadas, sob agitação, a 37°C, sob condições aeróbicas.

[00107] Para determinação dos valores cegos, todos os meios também foram conduzidos no teste em condições estéreis.

[00108] Pelo período de 7 horas foram retiradas, a cada hora, alíquotas das culturas, para determinação da atividade metabólica por meio do teste de viabilidade (Resazurin-Assay). No teste de resazurin trata-se de um teste frequentemente usado na pesquisa biomédica, para medição da citotoxicidade de substâncias. Às amostras da cultura é adicionado o indicador redox resazurin, que pelo NADH gerado no metabolismo das células é reduzido para resorufin fluorescente, cuja concentração é determinada fluorimetricamente [7].

[00109] Na Figura 24 estão representados graficamente os resultados. Pode ser visto nitidamente que o efeito do pó de zeólito sobre o crescimento do germe de teste é fortemente dependente do tamanho de partícula. Assim, as preparações de teste com pó de zeólito finíssimo (curva em pontilhado, na região do diagrama à direita, a curva mais inferior) e pó de zeólito padrão (curva em traços curtos, a próxima acima da curva de zeólito finíssimo) mostram uma inibição significativamente mais forte da atividade metabólica do que a fração de tamanhos de partículas grossas (curva em traços longos, por sua vez, a próxima acima). A curva mais acima, correspondente ao grupo de controle atinge, nesse caso, de modo consideravelmente mais cedo, a fase do crescimento exponencial (também mais fortemente acentuado).

[00110] A Figura 25 mostra os valores de medição depois de incu- bação por 5, 6 e 7 horas, na forma de diagramas de barras. Nesse caso, estão dispostos, em cada caso, da esquerda para a direita, o pó de zeólito grosso, o pó de zeólito padrão, o pó de zeólito finíssimo e o grupo de controle. Tal como pode ser visto nitidamente, os valores da fração de tamanhos de partículas grossas (o mais à esquerda) mais próximos dos controles sem zeólito (o mais à direita).

[00111] Para testar se o efeito diferente dos tamanhos de partículas do zeólito usados também pode ser mostrado para outros agentes patogênicos vaginais da variedade Candida, foram realizados os seguintes ensaios em Candida glabrata [ATCC 2001], o outro germe da can-didose vulvovaginal.

[00112] A execução do teste foi a seguinte: [00113] Candida glabrata foi cultivado em cultura líquida (caldo de Sabouraud) de acordo com métodos frequentemente usados na rotina. Depois da determinação do número de células por meio da câmara de contagem Thoma, foram produzidas 12 preparações de teste (culturas), em cada caso, com 6 x 105 células/ml, sendo que a 3 culturas não foi adicionado nenhum pó de zeólito (controle), a 3 culturas foi adicionado pó de zeólito da distribuição de tamanhos padrão, na quantidade de 10 mg/ml, a outras 3 culturas, pó de zeólito finíssimo, na quantidade de 10 mg/ml e novamente a 3 culturas, pó de zeólito grosso, na quantidade de 10 mg/ml. As culturas de teste foram incubadas, sob agitação, a 37°C, sob condições aeróbicas.

[00114] Para determinação dos valores cegos, todos os meios também foram conduzidos no teste em condições estéreis.

[00115] Pelo período de 7 horas foram retiradas, a cada hora, alíquotas das culturas, para determinação da atividade metabólica por meio do teste de viabilidade (Resazurin-Assay), tal como descrito acima.

[00116] Na Figura 26 estão representados graficamente os resulta- dos. Também para C. glabrata pode ser visto nitidamente que o efeito do pó de zeólito sobre o crescimento do germe de teste é fortemente influenciado pelo tamanho de partícula. Assim, as preparações de teste com pó de zeólito finíssimo (curva em pontilhado, na borda à direita, a segunda de baixo) e pó de zeólito padrão (curva em traços curtos, na borda à direita, bem embaixo) mostram uma inibição significativamente mais forte da atividade metabólica do que a fração de tamanhos de partículas grossas (curva em traços longos, por sua vez, a segunda curva de cima).

[00117] A Figura 27 mostra para melhor ilustração dos resultados dos valores de medição depois de 5 e 6 h de incubação na forma de diagramas de barras. Os valores da fração de tamanhos de partículas grossas (barra totalmente à direita no diagrama) estão mais próximos dos controles sem zeólito (barra totalmente à esquerda) no diagrama. Os grupos de zeólito padrão estão reproduzidos internamente à esquerda, os grupos de zeólito finíssimo, internamente à direita.

[00118] Para garantir os resultados dos exames apresentados previamente, foi realizado um teste de crescimento tal como descrito previamente, dessa vez, porém, o número das células semeadas foi reduzido para aproximadamente 1 x 104 células, mas, em compensação, o tempo de incubação foi prolongado para 16 h. Tal como é visível da Figura 28, foram obtidos resultados que coincidem muito bem como os precedentes.

[00119] Para uma garantia ainda maior dos dados determinados experimentalmente, foi realizado um teste de crescimento, tal como descrito previamente, dessa vez a concentração de atividade dos pós de zeólito usados foi aumentada para 50 mg/ml e usado um segundo método com o Vialight Assay para determinação da atividade metabólica. Esse teste baseia-se na quantificação do trifosfato de adenosina (ATP) por medição da bioluminescência, que é emitida na dissociação do ATP pela enzima luciferase [8].

[00120] Tal como pode ser visto por meio das curvas de crescimento na Figura 29, também sob essas condições de teste , com o produto padrão (cura mais inferior, em traços curtos) é um tido um efeito inibidor de crescimento nitidamente mais forte do que com o pó de zeólito grosso (segunda curva de cima, traços longos).

[00121] Quando se considera, em suma, que o "pó de zeólito grosso" também apresentou proporções perceptíveis do âmbito de tamanhos de acordo com a invenção, então resulta um limite muito bom da eficiência na borda superior de acordo com a invenção. A eficiência do "pó de zeólito finíssimo" permite identificar o limite na borda inferior, onde, em consequência do tamanho pequeno das partículas, presumivelmente a estrutura do zeólito está danificada ou parcialmente danificada.

[00122] A determinação do tamanho de grão não é crítico, de preferência ela se dá com ajuda de um Mastersizer 2000 da Malvern Instruments GmbH. Esse aparelho trabalha em base óptica de acordo com o princípio da refração de um raio laser. Nesse caso, é medida a intensidade da luz dispersa de um raio laser, que transpassa uma amostra de partícula dispersa e continuamente movida. Comparações evidenciaram que os tamanhos de grãos medidos desse modo correspondem aos que existem realmente.

[00123] Partículas, que estão presentes em uma composição a ser avaliada, mas não se situam no âmbito de tamanhos de grãos citado e reivindicado, são vistos como não existentes e não são levados em consideração.

[00124] A aplicação da substância de acordo com a invenção pode dar-se em qualquer composição farmaceuticamente compatível, assim, particularmente, um ou mais dos seguintes aditivos podem ser usados: veículos farmaceuticamente compatíveis; micro-organismos viáveis e/ou extratos dos mesmos; nutrientes para o microbioma vaginal (por exemplo, lactose, etc.); substâncias, que influenciam favoravelmente o microbioma vaginal saudável, por exemplo, estradiol, ácidos orgânicos, etc.

[00125] A aplicação pode dar-se, particularmente, na forma de cremes pomadas, géis, úvulas, comprimidos vaginais, óvulos, supositó-rios, espumas, aerossóis, pós, lavagens, banhos íntimos, suspensões, etc.

[00126] Nas duas configurações os materiais e processos a serem aplicados são conhecidos do estado da técnica e podem ser selecionados e realizados, sem problemas, pelo farmacêutico no conhecimento da doença a ser tratada (aplicação) e da invenção.

Referências: [1] Hainer, B.,L. (2011) Vaginitis: Diagnosis and Treatment; American Academy of Family Physicians; http://www.sonoma.edu/users/w/wilkosz/n540a-07/VaginitisDX and TX.pdf [2] AWMF online: S1-Leitlinie: Bakterielle Vaginose (BV) in Gynakolo-gie und Geburtshilfe; AWMF - Leitlinien-Register Nr. 015/28; aktueller Stand: 07/2013.

[3] AWMF online: S2k-Leitlinie: Vulvovaginalkandidose; AWMF-Register Nr. 015/072; Stand 12/2013.

[4] Candida albicans DSM Nr. 1386 https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-1386.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304 [5] Gardnerella vaginalis DSM Nr. 4944 https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-4944.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304 [6] Lactobacillus crispatus DSM Nr. 20584 https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM- 20584.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304 [7] Rampersad, S., N. (2012) Multiple Applications of Alarm Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bio-assays; Review, Sensors 2012, 12, 12347-12360.

[8] VialightTM MDA plus - High sensitivity microbial detection kit with extended signal stability; Lonza LT07-122.

[9] Protokoll zur mikrobiologischen Untersuchung S0811-01 [10] Protokoll zur mikrobiologischen Untersuchung S0903-19 [11] Lactobacillus casei DSM Nr. 20011 https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-20011 .html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304 [12] Lactobacillus jensenii DSM Nr. 20557 https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-20557.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304 [13] EnzytecTM D/L Milchsaure Art.Nr. E1255 - Gebrauchsanleitung; r-Biopharm.

[14] Candida glabrata ATCC Nr. 2001 https://www.atcc.org/~Zps/2001.ashx REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Clinoptilolita, caracterizada por apresentar um tamanho de partícula entre 0,2 e 10 mm, para uso no tratamento de doenças va-ginais, tais como vaginose bacteriana, candidose vulvovaginal e trico-moníase de mamíferos e seres humanos, bem como para restauração do microbioma vaginal saudável.

2. Clinoptilolita de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ela está liberada de metais pesados.

3. Clinoptilolita de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a mesma é usada com um ou mais dos seguintes aditivos: - veículos farmaceuticamente compatíveis, - micro-organismos viáveis e/ou extratos dos mesmos, - nutrientes para o microbioma vaginal saudável (por exemplo, lactose, etc.), - substâncias, que influenciam favoravelmente o meio vaginal para o microbioma vaginal saudável (por exemplo, estradiol, ácidos orgânicos, etc.).

4. Clinoptilolita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a mesma é aplicada localmente em uma das seguintes formas de administração: espuma, su-positório, comprimido vaginal, óvulo, gel, aerossol, pó, lavagem, banho íntimo, creme/pomada, suspensão.