BR102016026208A2 - Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da neosporose bovina e uso - Google Patents
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Abstract
peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da neosporose bovina e uso. a presente tecnologia trata de 31 (trinta e um) peptídeos, definidos pelas seq id n°1 a 31, altamente específicos e reativos para amostras de animais com neosporose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da neosporose bovina, que utilizam como antígenos os 31 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados; ou pelo menos um clone de bacteriófago expressando tais peptídeos, isolado ou associado.
Description
(54) Título: PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA E USO (51) Int. Cl.: C07K 7/06; C12N 15/10; G01N 33/569 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS, SOCIEDADE EDUCACIONAL UBERABENSE (72) Inventor(es): DANIEL MENEZES SOUZA; EDUARDO ANTÔNIO FERRAZ COELHO; LOURENA EMANUELE COSTA; ANA MARIA RAVENA SEVERINO CARVALHO; MARIANA COSTA DUARTE; BRUNO MENDES ROATT; DÊNIA MONTEIRO DE MOURA FRANCO; GUILHERME CAETANO GARCIA; RUTYANNE MARIA TONELLI ELISEI; TIAGO ANTÔNIO DE OLIVEIRA SILVA; EUSTÁQUIO RESENDE BITTAR; JOELY FERREIRA FIGUEIREDO BITTAR (57) Resumo: PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA E USO. A presente tecnologia trata de 31 (trinta e um) peptídeos, definidos pelas SEQ ID N°1 a 31, altamente específicos e reativos para amostras de animais com neosporose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da neosporose bovina, que utilizam como antígenos os 31 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados; ou pelo menos um clone de bacteriófago expressando tais peptídeos, isolado ou associado.
1/16 “PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA E USO” [001] A presente tecnologia trata de 31 (trinta e um) peptídeos, definidos pelas SEQ ID N°1 a 31, altamente específicos e reativos para amostras de animais com neosporose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da neosporose bovina, que utilizam como antígenos os 31 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados; ou pelo menos um clone de bacteriófago expressando tais peptídeos, isolado ou associado. [002] A neosporose bovina é uma doença infecciosa de origem parasitária, causada pelo protozoário Neospora caninum, parasito intracelular obrigatório, constituindo uma doença de importância econômica e expressão mundial, sendo a principal causa de abortos na pecuária de corte e leite em diversos países (DUBEY, J. P. et al. Newly recognized fatal protozoan disease of dogs. Journal American Veterinary Medical Association, v. 193, p.1269-1283, 1988a). A infecção por N. caninum tem sido diagnosticada principalmente em ruminantes domésticos e silvestres, sendo que, no Brasil, a doença foi diagnosticada pela primeira vez em 1997 no estado de São Paulo por meio do teste sorológico de imunofluorescência indireta (IFI) (GONDIM, L.F.P. et al. Neospora caninum infection in an aborted bovine foetus in Brazil. New Zealand Veterinary Journal, v.47, p.35, 1999a).
[003] A transmissão da doença para bovinos pode ocorrer após a ingestão de oocistos do parasito presente nas fezes de cães, os quais, após esporulação, formarão cistos teciduais (McALLISTER M. M. et al. Dogs are definitive hosts of Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v. 28, p.1473-1478, 1998). Entretanto, a maioria das infecções por Neospora em bovinos ocorre por meio da transmissão vertical. Nesses casos, a doença em fêmeas pode causar abortos principalmente a partir do terceiro mês de gestação até próximo ao parto. Neste sentido, também
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2/16 pode ocorrer de os fetos serem natimortos ou nascerem apresentando sinais clínicos graves no sistema nervoso central (SNC) associados principalmente a lesões inflamatórias do SNC. Sinais clínicos como paralisia, baixo crescimento e ganho de peso são observados nestes animais após o nascimento (DUBEY, J.P. et al. A review of Neospora caninum and neosporosis. Veterinary Parasitology, v.67, p. 1 -59, 1996).
[004] O diagnóstico da neosporose bovina pode ser realizado por meio da avaliação clínica dos animais e exames laboratoriais, como por exemplo, técnicas histológicas, moleculares, sorológicas e também isolamento e inoculação em animais de laboratório (OOI, Η. K. et al. Serological survey and first finding of Neospora caninum in Taiwan, and the detection of its antibodies in various body fluids of cattle. Veterinary Parasitology, v. 90, p. 47-55, 2000). Os resultados também dependem da expertise técnica do profissional e da qualidade das lâminas preparadas, muitas vezes não disponíveis em estudos no campo. Assim, um técnico bem treinado e um controle de qualidade eficaz são necessários para o diagnóstico preciso da doença. Nenhum método atualmente disponível para o diagnóstico da neosporose bovina apresenta todas as características desejáveis de elevadas sensibilidade e especificidade, facilidade de execução e baixo custo. Desta forma a busca de peptídeos sintéticos para serem utilizados como antígeno em testes diagnósticos mais específicos e sensíveis, faz-se necessário. Os avanços tecnológicos têm levado a melhorias significativas no desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico, sendo considerados úteis para o diagnóstico rápido e preciso de doenças, além de permitir o desenho racional de estratégias efetivas de seu controle. Um teste ideal para diagnóstico sorológico para a neosporose bovina deveria ser focado no uso de antígenos que possam ser reativos com soros de todos os animais infectados, independente da sintomatologia clínica, mas
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3/16 que não devem ser reconhecidos por animais sem a doença, ainda que residentes em áreas endêmicas da mesma.
[005] A tecnologia de phage display, técnica que é baseada na expressão de peptídeos, proteínas ou fragmentos de anticorpos associados a proteínas presentes na superfície externa de bacteriófagos recombinantes, vem sendo utilizada em diversos trabalhos para a pesquisa de novos antígenos, para que sob a forma de clones de bacteriófagos expressando peptídeos de interesse, ou sob a forma dos peptídeos individuais produzidos sinteticamente; possam ser testados para o diagnóstico laboratorial de várias doenças, como nas infecções virais, no câncer e em doenças auto-imunes; como também na produção de vacinas recombinantes (MANOUTCHARIAN K, et al. Phage-displayed T-cell epitope grafted into immunoglobulin heavy-chain complementarity-determining regions: an effective vaccine design tested in murine cysticercosis. Infect Immun,v. 67, p. 4764-70, 1999; NOYA, O, et al. Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides. Curr. Prot. Peptide Sci., v. 4, p. 299-308, 2003; SARTORIUS R, et al. The use of filamentous bacteriophage fd to deliver MAGE-A10 or MAGE-A3 HLA-A2-restricted peptides and to induce strong antitumor CTL responses. J Immunol, v 15,p.3719-28, 2008). A identificação dos peptídeos reativos na superfície dos fagos permite sua utilização e/ou a construção sintética posterior dos mesmos, seguida pelo seu emprego nos testes laboratoriais, objetivando o diagnóstico laboratorial e/ou o desenvolvimento de vacinas contra diversas doenças.
[006] Dong e colaboradoras descreveram o uso da tecnologia phage display para selecionar anticorpos específicos para o reconhecimento da proteína do parasito Neospora caninum denominada “Surface-associated protein 1 (NcSAGI)”. Essa tecnologia utiliza uma biblioteca de fagos (pDong1/Fab) diferente da utilizada na presente tecnologia, já que emprega fagos produtores de anticorpos, enquanto a apresentada nesta patente, que
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4/16 descreve o uso de peptídeos selecionados pela técnica de phage display, utiliza uma biblioteca que produz uma sequência de peptídeos. Adicionalmente, a sequência de aminoácidos desta invenção é diferente da proteína NcSAG1 e estão sendo empregados no diagnóstico sorológico da neosporose bovina, ou seja, para serem reconhecidos por anticorpos produzidos pelo hospedeiro. Ao contrário, no trabalho supracitado são selecionados anticorpos para reconhecerem a presença do parasito (DONG J, et al. Development of two murine antibodies against Neospora caninum using phage display technology and application on the detection of N. caninum. PloS One, v.8, p.1-9,2013).
[007] O documento de patente US2002034733, depositado em 24 de dezembro de 2009, intitulado “Novel methods for displaying (poly) peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds”, descreve métodos para apresentação de (poli) peptídeos/proteínas na superfície de partículas de bacteriófagos por meio de ligações do tipo dissulfeto. Entretanto, apesar de descrever a ligação/apresentação de 2 peptídeos que semelhantes aos da presente invenção (Sequências ID N°23 e 25) na superfície de bacteriófagos, o documento citado não demonstra o uso ou emprego desses peptídeos ou de bacteriófagos expressando esses peptídeos no diagnóstico sorológico da neosporose bovina.
[008] O documento de patente US2011251106, intitulado “PVII phage display’, trata de métodos alternativos para apresentação de peptídeos na superfície de bacteriófagos filamentosos por meio de novas proteínas de fusão a partir da pVII. Entretanto, apesar de descrever métodos alternativos para apresentação de 1 peptídeo semelhante ao da presente invenção (Sequência ID N°2) na superfície de bacteriófagos filamentosos por meio de novas proteínas de fusão a partir da pVII, o documento citado não demonstra o uso ou emprego desse peptídeo ou de bacteriófagos
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5/16 expressando esse peptídeo no diagnóstico sorológico da neosporose bovina.
[009] O documento de patente US2005014261, intitulado “Chimaeric phages”, descreve métodos para geração de fagos auxiliares e bibliotecas de phage display para identificação de moléculas ligantes. Entretanto, apesar de descrever métodos para a geração de fagos auxiliares e bibliotecas de phage display para identificação de moléculas ligantes utilizando 1 peptídeo semelhante ao da presente invenção (Sequência ID N°16), o documento citado não demonstra o uso ou emprego desse peptídeo ou de bacteriófagos expressando esse peptídeo no diagnóstico sorológico da neosporose bovina.
[010] O documento de patente US2013203630, intitulado “Modified peptide display’, descreve um pacote genético replicável que compõe uma biblioteca de peptídeos. Entretanto, apesar de descrever 1 peptídeo semelhante ao da presente invenção (Sequência ID N°3), o documento citado também não demonstra o uso ou emprego desse peptídeo ou de bacteriófagos expressando esse peptídeo no diagnóstico sorológico da neosporose bovina.
[011] Como visto acima, não há nenhum trabalho disponível ou publicado na literatura no qual a técnica de phage display foi utilizada para a seleção de novos antígenos diagnósticos utilizando soros de animais infectados pelo parasito Neospora caninum.
[012] A presente tecnologia trata de 31 peptídeos altamente específicos e reativos para amostras de animais (bovinos) infectados com o parasito Neospora caninum, além de um método e um kit para o diagnóstico da neosporose bovina, que utilizam como antígenos os 31 (trinta e um) peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados, ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.
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6/16 [013] No estado da técnica não foi encontrada nenhuma tecnologia para diagnóstico da neosporose bovina que compreenda o uso desses trinta e um peptídeos selecionados pela técnica de phage display descritos na presente invenção. Os 31 peptídeos apresentam acurácia variando de 80,00-100,00% para detectar animais com neosporose bovina por meio de ensaios sorológicos. Entre as vantagens da presente tecnologia, destacamse a maior estabilidade de seus compostos, menor custo de produção e maior especificidade de detecção da N. caninum.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [014] A figura 1 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°1 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[015] A figura 2 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°2 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[016] A figura 3 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°3 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[017] A figura 4 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°4 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[018] A figura 5 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°5 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[019] A figura 6 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°6 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
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7/16 [020] A figura 7 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°7 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[021] A figura 8 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°8 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[022] A figura 9 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°9 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[023] A figura 10 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°10 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[024] A figura 11 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°11 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[025] A figura 12 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°12 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[026] A figura 13 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°13 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[027] A figura 14 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°14 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[028] A figura 15 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°15 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
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8/16 [029] A figura 16 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°16 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[030] A figura 17 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°17 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[031] A figura 18 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°18 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[032] A figura 19 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°19 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[033] A figura 20 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°20 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[034] A figura 21 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°21 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[035] A figura 22 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°22 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[036] A figura 23 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°23 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[037] A figura 24 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°24 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
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9/16 [038] A figura 25 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°25 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[039] A figura 26 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°26 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[040] A figura 27 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°27 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[041] A figura 28 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°28 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[042] A figura 29 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°29 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[043] A figura 30 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°30 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
[044] A figura 31 representa a avaliação da especificidade/sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°31 na detecção de N. caninum. Os valores de sensibilidade de detecção são indicados em cada gráfico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [045] A presente tecnologia trata de 31 (trinta e um) peptídeos altamente específicos e reativos para amostras de animais com neosporose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da neosporose bovina, que utilizam como antígenos os 31 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados, ou pelo menos um clone de bacteriófago expressando tais peptídeos, isolado ou associado.
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10/16 [046] Mais especificamente, a presente invenção trata dos peptídeos identificados pelas seguintes sequências de aminoácidos definidos pelas SEQ ID N° 1 a 31 de bacteriófagos capazes de expressar tais peptídeos; e do uso de tais peptídeos e/ou bacteriófagos no diagnóstico da neosporose bovina.
[047] O método proposto para o diagnóstico da neosporose bovina compreende as seguintes etapas:
a. Exposição de uma amostra a pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No1 a 31, ou a pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No1 a 31, estando tais peptídeos ou bacteriófagos ligados a um suporte sólido ou a um carreador;
b. Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
c. Detecção dos anticorpos específicos para neosporose bovina na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).
[048] Na etapa “a”, as amostras utilizadas são selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.
[049] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses; a proteína pode ser a Proteína A e/ou a Proteína G; e a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou à proteína é selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Já o marcador é selecionado do grupo
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11/16 compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
[050] Na etapa “c”, o reagente para detectar a enzima ou o marcador é selecionado do grupo compreendendo qualquer substrato cromógeno que seja reconhecido por alguma das enzimas supracitadas ou algum dos marcadores supracitados.
[051] O kit para o diagnóstico da neosporose bovina compreende:
a. Suporte sólido ou carreador contendo pelo menos um dos peptídeos sintéticos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No1 a 31 ou pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No1 a 31;
a. Anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador;
b. Reagente para detectar a enzima ou marcador.
[052] O suporte sólido do item “a” pode ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno. Preferencialmente, deve consistir em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.
[053] No item “b” o anticorpo secundário pode ser IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses e a proteína pode ser a proteína A e/ou proteína G.
[054] Para os itens “b” e “c”, a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou à proteína pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Já o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e/ou quimioluminescentes.
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12/16 [055] O reagente para detectar a enzima ou o marcador do ítem “c” pode ser selecionado do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados.
[056] Como descrito acima, a tecnologia propõe o uso dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No 1 a 31 no diagnóstico e/ou em kits para diagnóstico da neosporose bovina.
[057] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes da tecnologia.
EXEMPLO 1. SELEÇÃO DOS BACTERIÓFAGOS PARA O SORODIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA [058] As amostras de soro que foram utilizadas para a realização dos ciclos de bio-pannings na técnica de phage display e nos ensaios de ELISA para o sorodiagnóstico da neosporose bovina foram: soros de animais nãoinfectados (controle negativo, n=5) e soros de animais infectados pelo parasito N. caninum (neosporose, n=5). A seleção dos clones para o diagnóstico sorológico foi realizada utilizando pool de soros de animais não infectados e soro de animais infectados por N. caninum.
EXEMPLO 2. AMPLIFICAÇÃO E EXTRAÇÃO DO DNA DOS BACTERIÓFAGOS SELECIONADOS PARA O SORODIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA [059] As colônias de E. coli ER2738 individualizadas contendo os bacteriófagos selecionados foram coletadas para a extração do DNA. Para a amplificação dos fagos, 1,2 mL da cultura de células E. coli ER2738 em fase early-log (OD600nm~0,3) foram distribuídos em cada poço de uma placa deepwell. Com palitos de dente esterilizados, 96 colônias azuis foram retiradas da placa de Petri e transferidas para a placa de cultura. A cada poço, apenas uma colônia de fago foi adicionada, totalizando 96 colônias na placa. A mesma foi vedada e incubada por 5 horas, sob agitação
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13/16 constante e a 37oC. Após a incubação, a placa foi centrifugada por 20 minutos a 2.250 x g, sendo o sobrenadante transferindo para outra placa. A essa 2a placa, foi adicionado PEG/NaCI (1/6 do volume total do sobrenadante), sendo a mesma incubada por 14 horas e a 4oC. Após, a placa foi centrifugada por 1 hora, o sobrenadante foi retirado e o precipitado foi ressuspendido em tampão iodeto (10 mM de Tris HCl pH 8.0, 1 mM de EDTA e 4 M de NaI). As placas foram agitadas vigorosamente e, em seguida, adicionou-se etanol absoluto. Após uma incubação de 10 minutos, as placas foram centrifugadas (2.250 x g a 4°C e por 10 minutos), sendo o sobrenadante descartado. O precipitado contendo o DNA foi lavado com 500 pL de etanol 70% e novamente centrifugado. Finalmente, o DNA foi diluído em 20 pL de água ultra-pura e sua qualidade foi avaliada após uma corrida eletroforética realizada em gel de agarose 0,8%, corado com uma solução de brometo de etídio.
[060] Sequenciamento dos clones de bacteriófagos selecionados Com a realização da técnica de ELISA, 31 clones foram selecionados por apresentaram melhor reatividade sorológica para distinção dos soros positivos e negativos para N. caninum. A reação de sequenciamento utilizando o DNA desses fagos foi realizada com 500 ng de DNA de cada fago selecionado, 5 pmol do Primer 96 glII (5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'-Biolabs) e o pré-mix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle KitAmersham Biosciences). A reação de 35 ciclos ocorreu em um termociclador de placas, nas seguintes condições: desnaturação a 95°C por 20 segudos, anelamento a 58°C por 15 segundos e extensão a 60°C por 60 segundos. Os amplicons gerados da reação de sequenciamento foram precipitados com 1 pL de acetato de amônio e 27,5 pL de etanol absoluto. A placa foi centrifugada por 45 minutos a 2.432 x g e o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se 150 pL de etanol 70% ao pellet e o material foi centrifugando novamente por 10 minutos e a 2.432 x g, sendo o
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14/16 sobrenadante descartado. A placa permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta posição foi centrifugada a 486 x g, durante 1 minuto. Em seguida, a placa foi coberta com papel alumínio, permanecendo por 5 minutos, para a evaporação completa do etanol remanescente. O precipitado foi ressuspendido em tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences) e o sequenciamento foi realizado no sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences). A dedução in silico das sequências de aminoácidos do DNA dos 31 fagos de interesse, para a identificação dos peptídeos exógenos, foi realizada pelo programa DNA2PRO12, que é designado para a dedução de sequências de insertos das bibliotecas da New England Biolabs (Ph.D.12TM ou Ph.D.-C7CTM), como de outras bibliotecas de interesse que contenham as sequências inicial e final do vetor. O programa automaticamente localiza a posição do inserto, traduz o mesmo e indica os possíveis erros na tradução (tais como códons inesperados ou erros na sequência próxima). As sequências que não puderam ser traduzidas pelo programa foram analisadas manualmente.
EXEMPLO 3. ENSAIOS DE ELISA PARA SELEÇÃO DE BACTERIÓFAGOS ESPECÍFICOS PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA [061] Os 31 clones foram selecionados em um experimento de ELISA utilizando pool de soros negativos e positivos, com o propósito de préselecionarmos aqueles com melhor atividade sorodiagnóstica para a neosporose bovina. Para esse fim, placas de ELISA com 96 poços (Jet Biofil) foram sensibilizadas por 16 horas a 37°C com 100 pL de uma solução contendo 1x109 fagos de cada um dos 31 clones de fagos, sendo diluídos em tampão carbonato/bicarbonato pH 9.6. Após, as placas foram lavadas por 3 vezes com solução de lavagem (PBS 1x e Tween 20 0.05%) e bloqueadas com a solução de bloqueio (BSA 5% diluída em PBS 1x) por
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15/16 hora e a 37°C. Após, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e amostras contendo pools de soros de animais com neosporose bovina (pool positivo) e de indivíduos não-infectados (pool negativo) foram adicionadas na diluição de 1:500 diluídas em solução de bloqueio (BSA 5% diluída em PBS 1x). A reação ocorreu por 1 hora e na temperatura de 37°C. Após, as placas foram lavadas 5 vezes com a solução de lavagem e o anticorpo anti-IgG bovino conjugado à peroxidase (Sigma; diluído 1:10.000 em tampão de incubação) foi acrescentado. A reação foi desenvolvida pela adição de 100 pL de uma solução composta por orto-fenilenodiamino (0,33 mg/mL), 4 pL de H2O2 e 10 mL de tampão citrato/fosfato, pH 5,0. Após 30 minutos de incubação ao abrigo da luz, a reação foi interrompida pela adição de 25 pL de ácido sulfúrico 2 N. A leitura das absorbâncias foi realizada no comprimento de onda de 492 nm, em leitor de ELISA (Molecular Devices, Spectra Max Plus, Canada) (Molecular Devices, Spectra Max Plus, Canada).
[062] As reações individuais dos 31 clones frente às amostras de soro dos animais positivos e dos animais não infectados são mostradas na Tabela 1. [063] Tabela 1: Sequências dos 31 clones selecionados e resultados de análises sorológicas obtidas usando os clones de bacteriófagos selecionados expressando cada um dos trinta e um peptídeos para o diagnóstico da neosporose bovina. Abreviaturas: Se: sensibilidade; Ep: especificidade; IC: intervalo de confiança; AUC: área abaixo da curva.
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| Clone | Sequência | Cut-off | Se (%) | IC 95 (%) | Es (%) | IC 95 (%) | Acurácia (%) | | AUC | IC 95 (%) | Valor de P |
| 1 | PRSTSHL | 0,2736 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0001 |
| 2 | LYHDTHY | 0,1549 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 3 | NPFCGSR | 0,1893 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 4 | FGAPVSL | 0,2013 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 69,15-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 5 | TSPPLHA | 0,3571 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 69,15-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 6 | QSTSGSS | 0,3036 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 69,15-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 7 | TFSPLSV | 0,2644 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 69,15-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0002 |
| 8 | FPHLSRY | 0,1823 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 69,15-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 9 | LEKVFSP | 0,1195 | 80,00 | 28,36-99,49 | 80,00 | 44,39-97,48 | 80,00 | 0,78 | 0,53-1,03 | p = 0,0765 |
| 10 | QATHFHS | 0,0355 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0008 |
| 11 | LASLPFR | 0,0354 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 12 | THVFSWI | 0,0290 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 13 | ACDPSPN | 0,0525 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0045 |
| 14 | NPFLADP | 0,0246 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 15 | ALTPQLL | 0,0614 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0025 |
| 16 | MSPTYLL | 0,0285 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 17 | FPLFGLS | 0,0384 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 18 | DRAALSL | 0,0277 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 19 | VHSPFWP | 0,0342 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0006 |
| 20 | DLCTQIT | 0,0766 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0044 |
| 21 | GSRSYPR | 0,0746 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 22 | VQSWSVR | 0,1156 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0048 |
| 23 | SPDSLFP | 0,0716 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0001 |
| 24 | PQDPKQW | 0,0885 | 100,00 | 47,82-100,00 | 80,00 | 28,36-99,49 | 90,00 | 0,96 | 0,84-1,08 | p = 0,0144 |
| 25 | PSPSRFP | 0,0999 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0002 |
| 26 | DSAFRLK | 0,0817 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0019 |
| 27 | AETVESC | 0,1126 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p < 0,0001 |
| 28 | VYSALVE | 0,0726 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0006 |
| 29 | GYSALVE | 0,1137 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0011 |
| 30 | DRRGYGL | 0,0844 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0005 |
| 31 | ACFDGVF | 0,0985 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 47,82-100,00 | 100,00 | 1,00 | 1,00-1,00 | p = 0,0064 |
[064] Pode-se observar que, de acordo com a Tabela 1 e a Figura 1, os 31 clones avaliados foram reconhecidos pelos soros de animais com neosporose bovina com elevada sensibilidade (80,00-100,00%), especificidade (80,00-100,00%), acurácia (80,00-100,00%) e área abaixo da curva (AUC: 0,78-1,00). Cabe ressaltar que 29 peptídeos apresentaram 100,00% de sensibilidade, especificidade e acurácia, além de obter valor de área abaixo da curva de 1,00, simultaneamente, o que indica que conseguem identificar os casos positivos de neosporose sem a ocorrência de resultados falsos positivos e falsos negativos. Dessa forma, apresentamse como novos antígenos para compor um método e um kit para o sorodiagnóstico sensível e específico da neosporose bovina.
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1/3
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. PEPTÍDEOS SINTÉTICOS caracterizados por compreenderem as sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID No 1 a 31.
- 2. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) Exposição de uma amostra a pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No1 a 31, ou a pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No1 a 31, estando tais peptídeos ou bacteriófagos ligados a um suporte sólido ou a um carreador;b) Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);c) Detecção dos anticorpos específicos para neosporose bovina na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).
- 3. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSE BOVINA, de acordo com a reivindicação 2, etapa “a”, caracterizado pelas amostras utilizadas serem selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.
- 4. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSE BOVINA, de acordo com a reivindicação 2, etapa “b”, caracterizado pelo anticorpo secundário poder ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses; pela proteína poder ser a Proteína A e/ou Proteína G; pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase ePetição 870160066014, de 09/11/2016, pág. 35/472/3 penicilinase; pelo marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes .
- 5. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA, de acordo com a reivindicação 2, etapa “c”, caracterizado pelos reagentes serem selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas ou algum dos marcadores da reivindicação 4.
- 6. KIT PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA caracterizado por compreender:a) Suporte sólido ou carreador contendo pelo menos um dos peptídeos sintéticos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No 1 a 31 ou pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID No 1 a 31;b) Anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador;c) Reagente para detectar a enzima ou marcador.
- 7. KIT PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA, de acordo com a reivindicação 6, item “a”, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno.
- 8. KIT PARA DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo suporte sólido consistir, preferencialmente, em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.
- 9. KIT PARA O DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA, de acordo com a reivindicação 6, itens “b” e “c”, caracterizado pelos anticorpos secundários, proteínas, enzimas, marcadores ePetição 870160066014, de 09/11/2016, pág. 36/473/3 reagentes serem selecionados dos grupos descritos nas reivindicações 4 e 5.
- 10. USO de peptídeos e/ou bacteriófagos, caracterizado por serem pelo menos um dos 31 peptídeos descritos na reivindicação 1, sob a forma sintética, isolados ou associados, ou pelo menos um clone de bacteriófago expressando tais peptídeos, isolado ou associado, no diagnóstico e/ou em kits para diagnóstico da neosporose bovina.Petição 870160066014, de 09/11/2016, pág. 37/471/11ELISA-PRSTSHLDESENHOSCurva ROC -PRSTSHLAbwnm AbiSOnm AbüünmΟί«Ί045·0.30·0.15·0.0004-,0.302o.i-I0.0 = 1K-K« £=-10:-0:¾ A= 10000¾100 ££o ££ Oj2-0 -|Controle Negativo NeosporaELISA-LYHDTHY = 10000¾ s=io:· 0:¾A= 10000¾Controle Negativo NeosporaELISA-NPFCG SR04-,0.3AUC = 1.0020 40 00 £0100¾ - Especificidade {% |100
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