BR102016000130A2 - Bioinoculante containing bacillus megaterium in polymeric compound - Google Patents

Abstract

a presente invenção compreende um inoculante em forma de gel, contendo a bactéria b. megaterium inserida em cmc e amido, para uso em solos agricultáveis, proporcionando a disponibilização do fósforo, contribuindo para promoção do crescimento do vegetal de interesse. refere-se a um composto com a finalidade de induzir ao aumento da quantidade de fósforo disponível para absorção pelas plantas a partir do solo. a invenção permite a introdução de uma estirpe de bacillus megaterium strain10 acessos gi:952025480 no solo, que tem o efeito de aumentar a solubilidade de fosfatos que podem ser nativos no solo ou adicionados a ele, na forma de fosfato de rocha, de fosfato insolúvel ou fertilizante industrializado. a invenção é utilizada para aumentar as taxas de crescimento e o rendimento das culturas, e ao mesmo tempo eliminar ou reduzir a necessidade de fertilizantes químicos, preservando o ambiente.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para BIOINOCULANTE CONTENDO BACILLUS MEGATERIUM EM COMPOSTO POLIMÉRICO

OBJETO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um composto com a finalidade de induzir ao aumento da quantidade de fósforo disponível para absorção pelas plantas a partir do solo. A invenção permite a introdução de uma estirpe de BacilIusmegateriumstralnlO acessos Gl:952025480 no solo, que tem o efeito de aumentar a solubilidade de fosfatos que podem ser nativos no solo ou adicionados a ele, na forma de fosfato de rocha, de fosfato insolúvel ou fertilizante industrializado. A invenção é utilizada para aumentar as taxas de crescimento e o rendimento das culturas, e ao mesmo tempo eliminar ou reduzir a necessidade de fertilizantes químicos, preservando o ambiente.

PROBLEMA QUE A INVENÇÃO SE PROPOE A RESOLVER

[002] O fósforo tem sido o elemento mais crítico nas adubações nas últimas décadas, em razão do alto grau de interação com o solo. A maioria dos solos brasileiros é altamente deficiente em P, apresentando baixa disponibilidade devido à grande reatividade e à alta taxa de retenção de seus íons, relacionados a numerosos constituintes dos solos. Em razão disso, há necessidade de aplicações frequentes de P para proporcionar e manter alta a produtividade das culturas.

[003] Muitos micro-organismos participam no ciclo do fósforo, transformando e disponibilizando esse elemento para as plantas, através da imobilização de fosfato solúvel ou pela solubilização de fosfato insolúvel.

[004] O uso de insumos biológicos visando reduzir a aplicação de adubos químicos, como os inoculantes contendo micro-organismos com habilidade em solubilizar fosfatos, pode representar uma alternativa à utilização de fertilizantes sintéticos de alta solubilidade, que geram efeitos momentâneos ao solo e possuem elevado custo [005] Inoculantes ou biofertilizantes são produtos comerciais contendo microorganismos vivos adicionados a um veículo inerte. A utilização destes produtos objetiva a colonização da planta pelo micro-organismo inoculado, para que os mecanismos microbianos de promoção do crescimento vegetal possam ser ativados.

[006] Um veículo de inoculação de elevada qualidade deve ser de fácil obtenção, ser de fácil processamento e manuseio, ter características constantes, assegurar a nutrição e viabilidade das células durante o período de armazenamento, ser atóxico, não exigir condições especiais de armazenamento, ser de fácil transporte, permitir a aplicação mecânica e não ser abrasivo a máquinas e equipamentos.

CAMPO DE ATUAÇÃO

[007] A presente invenção se relaciona com o uso de inóculos microbianos para fins agrícolas, em veículos poliméricos compatíveis com a bactéria solubilizadora de fosfatos Bacillus megateriumstràm 10 acesso Gl:952025480.

ESTADO DA TÉCNICA

[008] Pesquisas realizadas nos últimos anos sobre a utilização de microorganismos promotores de crescimento de plantas com os solubilizadores de fosfato têm mostrado que o uso de tais insumos biológicos, visando reduzir a aplicação de adubos químicos, pode representar uma alternativa à utilização de fertilizantes sintéticos de alta solubilidade, que geram efeitos momentâneos ao solo e possuem elevado custo.

[009] O documento de patente US20120015806, intitulada Novel formulationof microbial consortium based bioinoculant for wide spread use in agriculture practices, refere-se a uma formulação com uma alta densidade de células do consórcio microbiano de Pseudomonasfluorescens, Pseudomonasstriata, Bacilluspolymyxa , Bacillussubtilis , Azospirillum , Rhizobium , Azotobacter, Tríchodermaviride e Tríchodermaharzianum para ser usado como solubilizador de fosfatos, fixador de nitrogênio, e decompositor de resíduos vegetais. O referido consórcio microbiano é proporcionado numa composição adequada para o tratamento de plantas ou sementes de plantas ou diretamente ao solo. O veículo apropriado usado na invenção pode ser tanto na forma de pó como na forma de líquido.

[010] O documento de patente CN102653500, intitulada Compound type slow release fertilizer and preparing method thereof, refere-se a um fertilizante de liberação lenta e um método de preparação dos mesmos. O método de preparação compreende os principais passos de mistura constituída: matérias-primas , incluindo ureia , celulose , farelo , um agente de retenção de água , pó de serra , carbonato de palha , polipropileno , fosfato de amónio , pó de cálcio , sulfato de potássio , atapulgite, bórax , sulfato ferroso, levedura fertilizante microbiano , fertilizantes e Azotobacter, pó de talco de acordo com certa parte , em peso, e realizando a fermentação de forma a obter o composto do tipo de fertilizante de libertação lenta .

[011] O documento de patente US20090308121, intitulada Polymicrobial Formulations For EnhancingPlant Productivity, descreve formulações contendo misturas de isolados microbianos incluindo Azotobacter, Azospiríllum, Azorhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Mycoplasma. Os pós molháveis apropriados para pulverização podem ser preparados por mistura da composição com um sólido finamente dividido, tal como argilas, silicatos e carbonatos inorgânicos, e sílicas, incorporando agentes molhantes, agentes de colagem, e/ou agentes dispersantes em tais misturas.

[012] O documento de patente CN1830919, intitulada Environmental protection type synergia and controlled-releasing fertilizer and its prepn. Method, se refere a um produto com liberação controlada de um composto feito de fertilizante químico comum e uma camada de revestimento feita de pó de mineral e as bactérias funcionais que utiliza fosfato de rocha, fosfogesso, sedimentos de lago, amido, óleo vegetal, poliuretano, carboximetilcelulose. bactérias solubilizadoras de fosfato, fungos e Azotobacter. O pó de talco é adicionado ao fertilizante mineral com um ligante que permite um pó uniforme e para formar uma camada de revestimento.

[013] O artigo intitulado "Effect of Polymeric Additives, Adjuvants, Surfactants on Survival, Stability and Plant Growth Promoting Ability of Liquid Bioinoculants Leo Daniel et al., J PlantPhysiolPathol. 2013.Fala sobre o efeito de inoculantes líquidos formulados com 2% de polivinilpirrolidona (PVP K 30), 0,1% carboximetilcelulose (CMC- de alta densidade) e 0,025 % de polissorbato 20, o qual promoveu a sobrevivência a longo prazo de Bacillusmegaterium var. phosphaticum, Azospirillum e Azotobacter com 5.6x107, 1.9x108 e 3.5xl07UFC ml'1.

[014] Ainda uma outra solução para a preparação de um \nocu\anteRhizobiumê proposta no documento de patente US2002050096, intitulada Aqueous base inoculant composition for seeds, coated seeds and method for storing the composition. Este método baseia-se no uso de um composto de molibdênio para neutralizar os exsudados tóxicos da semente em uma base aquosa. A composição inoculante é, sob a forma de uma suspensão das células em Bradyrizobium uma base aquosa contendo: o composto de molibdênio; um polímero selecionado de entre polímeros de vinilpirrolidona, copolímeros de acetato de vinilo e copolímeros de estireno; e adjuvantes, tais como carboxymethylcelulose, goma arábica, alginato de sódio e semelhantes. No entanto, as composições líquidas apresentam vários inconvenientes, como apontado acima.

[015] O documento de patenteUS6410618, intitulada Polymericcomposite material and method of manufacturing the same, refere-se a um composto polimérico que contém um material biodegradável que pode ser decomposto biologicamente no solo. Mais especificamente, ele contém celulose bacteriana, incluindo em forma de fita microfibras que podem ser decompostos biologicamente por micróbios e serem utilizados em programas de melhoria propriedades físicas incluindo a resistência à tração.

[016] O documento de patente US8592343, intitulada Polymeric compositions containing rhizobium and/or plantgrowth-promoting rhizobacteria inoculant, use there of and seeds treated with the compositions, se refere a novas composições composta por polímeros hidrossolúveis, rhizobium e rizobactérias promotoras de crescimento vegetal. Usos da nova composição incluem o tratamento de sementes antes do plantio e usam no solo em torno de raízes para melhorar a saúde e o crescimento das plantas.

[017] O documento de patente US8530220, intitulada Microorganisms, microbial phosphatefertilizersandmethods for preparingsuch microbial phosphatefertilizers, trata de um fertilizante microbiano de fosfato contendo os micro-organismos: Bacillussubtilis estirpe WH2 , Bacilluslicheniformis estirpe WH4, Streptomycescellulosae estirpe WH9 e Aspergillusversicolor estirpe WH13 cultivados em meio suplementado com fosfato de rocha contendo entre 8 e 12% de P2O5 e matéria orgânica ativa (torta de filtro da indústria do açúcar, esterco de galinha, esterco de suínos, farelo de amendoim, aveia, resíduo de mandioca,torta de colzaetc).

[018] O documento de patenteCN103103150 sob o título Efficient phosphate solubilizing growth-promoting bactéria and microbial agente prepared from same and application se refere a preparação e aplicação de uma bactéria Promotora de Crescimento de Plantas, eficiente solubilizadora de fosfatos em um produto contendo aditivos, adesivos e agente protetor; em que o aditivo é sílica, caulim, pó de casca de arroz, farinha de casca de trigo, pó de palha, bentonita ou polissacarídeo microbiano; o agente de proteção é glicerol, leite desnatado, alginato de sódio ou quitosana.

[019] Dos EUA o documento de patente US8932382, intitulado Process of producing bio-organo-phosphate(BOP) fertilizer through continuous soiubilization of rock phosphateby a composting bioprocess and bioaugmentation with phosphorus solubilizing microorganisms,se refere a um método para solubilizar fosfato de rocha e os processos de transformação dos teores de fósforo em bioorganofosfato (BOP). Os métodos incluem recolha e triagem de resíduos orgânicos; misturando-se com fosfato de rocha ; sujeitar a mistura para biocompostagem; coleção, isolamento, seleção e otimização de crescimento dos consórcios de micro-organismos solubilizadores de fósfatos eficientes, e os mecanismos que induzem ao crescimento de plantas como a produção de ácidos orgânicos e outros compostos orgânicos na fase mesófila da compostagem, formando assim uma rica cultura ácida resultando na solubilização de fosfato de rocha.

[020] O documento de patente CA2668519, intitulada Methods of generating phosphorus fertilizers through the utilization of microbial fermentation technology, inclui utilizações e métodos de preparação de fosfitos e / ou hipofosfitos (e suas formas poliméricas e / ou os seus sais) e agroquímicos baseados em fosfito (fertilizantes e biocidas) a partir de fosfato ou outras fontes de fósforo ocorrência natural ou sintética, utilizando fermentação microbiana anaeróbia. O processo de fermentação produz um líquido e sais de fosfito fase hipofosfito de sólidos que pode ser usado como um produto agroquímico.

[021] O documento de patente US8822190, intitulada Polymicrobiai formulations for enhancing plant productivity, se refere a uma formulação microbiana, que compreende um veículo líquido que compreende água e ácido húmico a 12% / volume de solução (ml) com um pH de 7,0,contendo uma concentração microbiana que varia de 101°-1017 unidades formadoras de colônia por mililitro de líquido. A formulação seca consiste de uma formulação líquida liofilizada, um agente de molhagem, agente dispersante, agente, ou o adesivo que cola. Pode ser aplicada em imersão de sementes, pipetagem, rega, pulverização, e pulverização foliar.

[022] O documento de patenteWO2011099021, intitulada Product that makes phosphorous available to plants, trata da composição e método de preparação de um produto contendo as bactérias solubilizadoras de fosfato Bacillusmegateríum e Pseudomonasputida.

[023] O documento de patenteWO2014163472, intitulado Biofertilizer product based on Bacillus megateríum Ir2 and Bacillus mucilaginosus Ir5 which can be used for agricultural fertilization, se refere a formulação e utilização de um produto fertilizante organomineral com base nas duas estirpes bacterianas, gram-positivas que têm a capacidade de solubilizar fosfato.

[024] O documento de patente BR PI0506338-8, intitulada Composições poliméricas contendo inoculante de rizobactérias promotoras de crescimento, usos das mesmas e material propagativo de cana-de-açúcar tratado com as composições, se refere à aplicação na cultura da cana-de-açúcar de composições contendo inoculante de rizobactérias promotoras de crescimento de planta compreendendo: (a) uma suspensão aquosa contendo células de pelo menos uma rizobactéria selecionada de rizobactérias promotoras de crescimento de planta; (b) um veículo, em forma de gel, para os inoculantes compreendendo: (i) um polímero derivado de celulose, solúvel em água; (ii) uma fonte de carbono; (iii) opcionalmente, um agente de compatibilização para a mistura; (iv) opcionalmente, aditivos nutrientes ou fatores de crescimento; (v) opcionalmente, adjuvantes; (c) água em quantidade suficiente para formar o gel de polímero e manter viáveis as células dos microrganismos.

[025] A turfa é o veículo para mais utilizado como inoculante, sendo o teor de matéria orgânica e a capacidade de retenção de água as principais propriedades que possibilitam a sua utilização como tal. No entanto, apresenta algumas desvantagens que podem comprometer a eficiência do inoculante: as fontes de turfa utilizadas são bastante ácidas, o que torna necessária uma correção no pH com carbonato de cálcio ou magnésio; a variabilidade de sua composição e a idade da turfeira podem afetar a composição da matéria orgânica e podem produzir algum elemento tóxico durante o processamento industrial, além do aspecto ambiental.

[026] Os inoculantes líquidos têm demonstrado ser de fácil manuseio e apresentam eficácia equivalente aos encontrados utilizando a turfa. Funcionam bem em condições de laboratório, porém, a sobrevivência de bactérias nesse tipo de inoculante e nas sementes inoculadas é dificultada porque as bactérias ficam mais sujeitas ao estresse ambiental.

[027] Ouso de imobilização em alginatos normalmente envolve a síntese in situ da matriz porosa em torno das células a serem utilizadas, sendo um método que tem sido extensivamente estudado para a imobilização de células viáveis para inoculação, pela possibilidade do uso de polímeros hidrofílicos biocompatíveis como os suportes de imobilização, proteção das condições adversas, ou qualquer composto que iniba o desenvolvimento celular presente no meio. No entanto, apresenta as desvantagens de: pequeno volume disponível para a contenção das células imobilizadas, perda de células para o meio durante o processo de utilização e instabilidade dos suportes normalmente utilizados.

[028] Os documentos apresentados anteriormente, demonstram que vários materiais podem ser utilizados como veículos para inoculantes microbianos, no entanto a utilização de polímeros, como proposto na presente invenção, reside principalmente nas características básicas desse tipo de material. Seu peso é consideravelmente baixo, o que permite seu manuseio mais fácil e facilita o processo produtivo de materiais baseados em polímeros; baixa temperatura de processamento, permitindo facilidade de manuseio; custo relacionado a sua produção também é baixo, permitindo um menor custo de fabricação de materiais; permite o seu uso na produção de materiais baseados em diversas formas, cores e tamanhos; é biodegradável reduzindo o custo ambiental; a formulação em gel tem a propriedade de reter água suficiente para permitir a sobrevivência da bactéria; pode ser esterilizado por autoclavagem reduzindo as taxas de contaminação e o número de células viáveis; contém uma fonte de carbono que pode ser utilizado pelo B. megaterium quando for liberado no ambiente. Foi verificado que o produto proposto mantém o número de células viáveis dentro do período requerido para armazenamento.

[029] Desde o século passado, o estudo de misturas poliméricas tem recebido bastante destaque na área da ciência e tecnologia de polímeros, tendo estas misturas inúmeras aplicações na área médica, farmacêutica, indústria de plásticos, borracha, etc. (ROBESON, L.M. Applications ofpolymerblends: Emphasis on recente advances. Polymer Engineering and Science, v 24. 587-597, 1984).

[030] O desenvolvimento de misturas poliméricas como materiais utilizáveis em diversas áreas é uma estratégia para reunir em um único material, propriedades de polímeros diferentes a custo muito baixo (SOARES, B.G.; OLIVEIRA, P.J. de. Efeito da Compatibilização da Mistura NBR/EVA sobre sua Morfologia de Fase Co-contínua. Polímeros-Ciência e Tecnologia, v. 13, p. 28-35, 2001). Outro autor (KONING et al.,2001. Strategies for compatibilization of polymer blends. Progress. Polymer Science, v. 23, p. 707-757, 1998) destacam a viabilidade do uso de misturas poliméricas como estratégia no desenvolvimento de materiais de engenharia, uma vez que a síntese de novas moléculas que tenham as propriedades de interesse pode ser muito onerosa e despender muito tempo.

[031] Como a maiorias das misturas poliméricas são imiscíveis, a compatibilização do par polimérico misturado é de fundamental importância para se obter o sinergismo de propriedades. Para se conseguir a compatibilidade de misturas poliméricas, são utilizados agentes compatibilizantes, esses agentes são moléculas que atuam na interface da mistura, permitindo que haja uma maior interação na mistura, devido a sua elevada atividade junto a elas. Os agentes compatibilizantes podem ser polímeros ou copolímeros, moléculas orgânicas de baixo peso molecular com abundância de grupos reativos, por exemplo carboxilas e hidroxilas.

[032] Misturas a base de carboximetilcelulose (CMC) e amido foram estudadas por Suvorovaet al. (1999) em Thermo dynamic and diffusion of biodegradable Systems based on starch and celulose derivates. Journal of Environmental Polymer Degradation. v. 7, p. 35-40, 1999). Nesse estudo, os autores demonstraram que as misturas com cinquenta por cento de massa de cada um dos polímeros apresentavam elevada interação com a água, baixa energia livre e elevada biodegradabilidade em solo, essas misturas foram mais estáveis quando comparadas a misturas de amido e metilcelulose.

[033] Para o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, inoculante é o material que contenha micro-organismos que atue favoravelmente no desenvolvimento das plantas entendendo-se como: a) suporte: material excipiente e esterilizado, livre de contaminantes segundo os limites estabelecidos, que acompanha os micro-organismos e tem a função de suportar ou nutrir, ou ambas as funções, o crescimento e a sobrevivência destes micro-organismos, facilitando a sua aplicação e; b) pureza do inoculante: ausência de qualquer tipo de micro-organismos que não sejam os especificados; ((BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Decreto n° 4.954, de 14 de janeiro de 2004. Disponível em:<http:// www.agricultura.gov.br>. Acesso em: 25 de junho de 2014).

[034] Alguns fatores são requeridos num produto a ser empregado como inoculante (ALBAREDA, M. et al. Alternatives to peat as a carrier for rhizobia inoculants: solidandliquidformulations. Soil Biology and Biochemistry, v. 40, p. 2771-2779, 2008.) devendo-se destacar: a. as características físicas e químicas, que devem ser uniformes; b. consistência na qualidade; c. ter afinidade pela água; d. ser de fácil produção; e. não ser tóxico; f. de fácil manejo e g. apresentarem biodegradabilidade e não fornecer riscos ambientais [035] Além dos fatores citados deve-se considerar a eficiência do processo da inoculação, que está diretamente relacionada com o número de células viáveis quando levados para o solo, e uma das estratégias utilizadas para aumentar o número de células viáveis e conferir proteção é através do uso de suplementação nutricional (ANANDHAM, R. et al. Evaluation of shelf life and rock phosphate solubilization of Burkholderia sp. in nutrient-amendedclay, rice branand rock phosphate-based granular formulation. Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 23, p. 1121-1129, 2007).

[036] No que se refere à comercialização dos inoculantes, a viabilidade celular deve ser de 109 células por grama ou mililitro no produto até a data estabelecida pelo fabricante, que para considerando como parâmetro os inoculantes turfosos contendo células de rizóbio, é de 180 dias após a inoculação na turfa como preconizado pelo ministério da agricultura, pecuária e abastecimento, no qual o decreto n° 4.954, de 14 de janeiro de 2004 aprova o Regulamento da Lei n° 6.894, de 16 de dezembro de 1980, que dispõe sobre a inspeção e fiscalização da produção e do comércio de fertilizantes, corretivos, inoculantes ou biofertilizantes destinados à agricultura (BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Decreto n° 4.954, de 14 de janeiro de 2004. Disponível em:<http:// www.agricultura.gov.br>. Acesso em: 25 de junho de 2014).

[037] Para a se obter um produto eficiente e que garanta a expressão dos efeitos promotores de crescimento vegetal pela estirpe bacteriana os veículos inoculantes são de extrema importância. O uso de misturas poliméricas biodegradáveis vem sendo apontado como alternativa para produção de inoculantes, pois podem ser degradados pela ação de microrganismos, tais como bactérias, fungos ou algas, sem causar danos ao meio ambiente (SILVA, M. F. et al. Inoculantes formulados com polímeros e bactérias endofíticas para a cultura da cana de açúcar. Pesquisa. Agropecuária Brasileira, v. 44, p. 1437-1443, 2009.).

[038] Dessa forma apresenta-se a invenção que compreende um inoculante em forma de gel, contendo a bactéria B. megaterium inserida em CMC e amido, para uso em solos agricultáveis, proporcionando a disponibilização do fósforo, contribuindo para promoção do crescimento do vegetal de interesse. DESCRIÇÃO DA FIGURA A figura 1 mostra o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por grama de massa fresca com até 45 dias após inoculação com B. Megaterium em composto polimérico (média de 20 repetições).

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA

[039] O veículo para preparação do inoculante baseia-se numa mistura de polímeros solúveis em água e biodegradáveis. A característica do veículo resultante é a de um polímero não-oleoso ou não aquoso na forma de gel. A mistura é compatibilizada com óxido de magnésio a 2% v/v.

[040] Para preparação do veículo, foram utilizados os polímeros carboximetilcelulose (viscosidade média 2000-3000 cP) procedência Quimesp S.A, e amido (Amido solúvel P.A - modificado-procedência da Vetec S.A) na proporção 60% e 40% v/v (SILVA, M.F. et al. Inoculantes formulados com polímeros e bactérias endofíticas para a cultura da cana-de-açúcar. Pesq. agropec. bras., v. 44, p. 1437-1443, 2009).

[041] A partir da proporção 60/40 v/v (CMC e amido), foi preparada a mistura polimérica na concentração de 2,5 gL 1 em água destilada.

[042] Com a finalidade de melhorar as propriedades físicas e mecânicas da mistura polimérica, foi utilizado o compatibilizante óxido de magnésio a 2% v/v, previamente dissolvido em água destilada antes de ser adicionado a mistura.

[043] 10 mL da mistura foram transferidas para sacos de polipropileno com gramatura de 0,08 e dimensão 8 cm x11 cm, que foram selados em seguida, com a finalidade de realizar testes de sobrevivência da bactéria.

[044] A mistura foi esterilizada em autoclave a 1,3 Kgf/cm2 e 120° C por duas horas (uma hora inicialmente e apos 24 horas é feita a segunda autoclavagem), para assegurar a ausência de outros micro-organismos, garantindo as condições adequadas para a sobrevivência do microrganismo alvo.

[045] O processo de autoclavagem, além de esterilizar, ajuda a promover uma maior interação entre as cadeias poliméricas que conferem uma maior estabilidade dimensional à mistura. A compatibilidade é melhorada devido a um melhor equilíbrio das fases, o que melhora a dispersão da bactéria na mistura. O gel formado manteve essa forma depois da autoclavagem.

[046] O isolado de B. megaterium isolado strainIO acessos GL952025480, isolado da rizosfera de cana-de-açúcar e avaliado quanto a solubilização de fosfato entre outras características de promoção de crescimento, apresentou um alto índice de solubilização (6,58). Em meio líquido com Ca3(PC>4)2, foi detectada a presença de fósforo solúvel comprovando a atividade solubilizadora da bactéria.

[047] A bactéria B. megaterium foi armazenada congelada no meio de cultura com 20% de glicerol, crioprotetor, que tem a função de proteger as células para não romper durante o congelamento. Foi empregado o meio mineral preparado conforme as composições mostradas na Tabela 1. Ao meio, foi adicionado 1 ml_ de solução de micronutrientes a cada litro de meio mineral, cuja composição está apresentada na Tabela 2. O meio de cultura foi esterilizado em autoclave a 1,3 Kgf/cm2e a 120° C, por vinte minutos.

Tabela 1. Meio mineral utilizado nos cultivos.

Componente_______Composição (gL1) Sacarose 16 Na4S04 2 MgS04.7H20 0,008 Na2HP04 3,6 KH2P04 1*5 FeS04-7H20 o,05 CaCl2-2H20 o,01 ÁcidoCítrico o,1 Tabela 2. Solução de micronutrientes Componente _ . _ , .-1. __________________________Composição (mgL )_______ H3BO3 300 C0CI2.6H2O 200 ZnS04.7H20 30 MnCl2.4H20 30 (NH4)6Mo7024.4H20 30 NÍS04.7H20 30 CuSQ4.5H2Q_________________10________________ [048] A reativação da bactéria foi realizada em cultivo em erlenmayer contendo meio mineral em agitação, em temperatura ambiente, por um período de 18 horas (pré-inóculo). Após este período, alíquotas de 10 mL do pré-inóculo foram adicionados a outro erlenmayer e cultivados nas mesmas condições de agitação e temperatura, por aproximadamente 6 horas até atingir a população de 109 células mL·1 [049] Posteriormente, a cada saco contendo o veículo em gel, esterilizado, foi adicionado 1,0 ml_ do inóculo contendo 1012 células mL'1, ajustado por densidade ótica igual a 1 (λ = 540 nm), agitado manualmente para incorporação das células à matriz polimérica, e incubado a temperatura ambiente por 48 horas.

[050] Após esse período foi realizada a contagem de células viáveis, e os sacos armazenados a 10°C. A sobrevivência do Bacillus megaterium foi verificada aos 2, 15, 30, 60 90 120 e 180 dias após a inoculação. Foram observadas 20 repetições para cada avaliação.

[051] Para preparo do produto desta invenção, 100 mL da mistura polimérica, foram transferidas para sacos de polipropileno com gramatura de 0,08 que foram selados em seguida.

[052] A mistura foi esterilizada em dois processos de autoclave a 1,3 Kgf/cm2 e 120° C. O primeiro após a mistura e o segundo 24 horas após a primeira autoclavagem. O isolado de B. megaterium isolado strainIO acessos Gl:952025480 foi cultivado em meio mineral (citado previamente), esterilizado em autoclave a 1,3 Kgf/cm2 e a 120° C, por vinte minutos. A cultura foi incubada sob agitação, em temperatura ambiente, por um período de 18 horas (pré-inóculo).

[053] Alíquotas de 10ml do pré-inóculo foram adicionados a outros erlenmayers cultivados nas mesmas condições de agitação e temperatura, por aproximadamente 6 horas até atingir a população de 109 células mL'1.

[054] Para preparo do inoculante, 25 mL do inóculo foram adicionados a 100mL do veículo polimérico, agitado manualmente para incorporação do das células à matriz polimérica, e incubado a temperatura ambiente por 48 horas.

[055] O inoculante foi armazenado sob refrigeração por 60 dias.

[056] O inoculante assim constituído, foi utilizado nos experimentos em campo (milho) e telado (minitoletes de cana-de-açúcar).

[057] Antes da utilização do inoculante nos experimentos, foi verificada a população microbiana por densidade ótica igual a 1 (λ = 540 nm).

[058] O conteúdo de cada saco foi diluído em água na proporção 1:100, para microbiolização das semente de milho e minitoletes de cana-de-açúcar. EXEMPLOS: EXEMPLO 1 [059] Para a contagem de células viáveis, foram realizadas diluições seriadas e semeadura em placas contendo meio mineral suplementado com Agar 15gL' 1e a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC), por meio da seguinte ,. , i ,ΓΛ Média do número de colônias x Fator de diluição ... .... formula: UFC=---------------;---- : ; :--------—. Os resultados obtidos Volume de moculo estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Sobrevivência de B. megaterium no veículo polimérico Tempo de armazenamento (dias) UFCg-1 (Log)* 2 11,699 15 11,653 30 11,255 60 11,255 90 10,949 120 10,732 ______________180_______________________10,699________ *Média de 20 repetições [060] Aos 90 dias verificou-se queda populacional, no entanto o número manteve-se em 1010, permanecendo estável até 180 dias, atendendo, portanto, as determinações do MAPA.

[061] O veículo preservou as características físicas e viscosidade em temperatura ambiente e sob resfriamento. EXEMPLO 2 [062] O experimento foi realizado no Centro de Ciências Agrárias - Rio Largo/AL (9°29’S, 35°49’W, 127 m), com clima caracterizado como tropical chuvoso, e Pluviosidade anual média de 1.152,2mm.

[063] A condução do experimento aconteceu no período de abril a setembro de 2012, repetições. O experimento foi em blocos casualizados, utilizando 3 tratamentos (controle, adubação recomendada para a cultura e B. megaterium), com 8 repetições sendo utilizada a variedade de milho Pé-de-boi, e o espaçamento, de 2m x 0,8m x 0,2m.

[064] Dez mL do inoculante, com 60 dias de armazenamento, foi diluído em água destilada esterilizada, até se obter 109 células mL'1. Inóculo foi ajustado por densidade ótica igual a 1 (λ = 540 nm). As sementes foram embebidas na solução por 30 minutos, e em seguida semeadas.

[065] Foram usadas 640 sementes por bloco e o desbaste foi feito aos 15 dias. Para o tratamento com adubação utilizou-se a recomendação de 100 Kg ha'1 de N, 80 Kg ha~1 de P e 80 Kg ha-1 de K, aplicadas uma vez, diretamente nos sulcos. A cultura foi implantada no sistema de sequeiro e o milho colhido manualmente. Foram feitas as seguintes avaliações: a) Altura de plantas: medidos com trena de 5m; b) Número de folhas e área foliar: determinada por métodos não destrutivo;. c) Produtividade: que é a razão dos grãos e espigas sobre a área plantada; d) Os índices de aumento dos tratamentos foram determinados pela formula: IA%=-----------;-----xlOO.

Controle [066] Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade através do software estatístico Assistat.

[067] Os resultados obtidos em relação à altura de planta, número de folhas e área foliar demonstram que não houve diferença significativaentre os três tratamentos (Tabela 4).

Tabela 4. Resultado das avaliações de altura de planta, número de folhas e área foliar. Tratamento* Altura de^planta N° de folhas Área foliar (cm2) Controle 2,03a 8,2a 59,68a Adubação recomendada 2,20a 8,2a 59,85a B. Megaterium (polímero) 2,19a 8,0a 60,91a ‘Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey p<0,05 [068] Para os resultados de produtividade (Tabela 5) o tratamento com B.megaterium diferiu significativamente do controle, e foi estatisticamente igual a adubação recomendado para a cultura. Foi observada promoção de crescimento considerando enchimento de grãos e espigas, aumentando a produtividade.

Tabela 5. Resultados de produtividade e índices de aumento Tratamento Produtividade (t ha1) índice de Aumento (%) Controle 22,70 Adubação recomendada 30,42a 36,41a B. Megaterium ('polímero) 31,20a 38,92a *Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey p<0,05 EXEMPLO 3 [069] Para verificar a eficiência do inoculante em plântulas de cana de açúcar, foi realizado experimento com vermiculita esterilizada por autoclavagem. O experimento foi conduzido sob telado, o delineamento foi inteiramente casualizado com três tratamentos (controle com água destilada, controle com meio de cultura e inoculante) e sete repetições.

[070] Minitoletes de tamanho e diâmetro similares, contendo uma gema foram retirados do terço superior de colmos da variedade RB92579 com 12 meses de idade. Foram selecionados os minitoletes com as melhores gemas (mais jovens e vigorosas). Após a seleção, foi realizado um processo de assepsia, por imersão em álcool 70% por 15 minutos, hipoclorito de sódio 2% por 5minutos e tríplice lavagem com água destilada esterilizada.

[071] O inoculante, com 60 dias de armazenamento, foi diluído em água destilada esterilizada, até se obter a concentração de109 células mL 1(inóculo ajustado por densidade ótica igual a 1 λ = 540 nm). Posteriormente os minitoletes permaneceram imersos por 30 minutos, enquanto que para os tratamentos controles a imersão foi em água destilada esterilizada e o meio de cultura líquido.

[072] Os minitoletes foram plantados em vermiculita esterilizada, contida em vasos com capacidade para um quilo; 45 dias após o plantio, foi realizada a coleta e as plântulas foram retiradas, lavadas em água corrente, em seguida foram separadas em minitolete, parte aérea e raízes.

[073] A aplicação do B. Megaterium em composto polimérico do inóculo misto, promoveu aumento significativo no número de brotações, matéria seca de raiz e matéria seca da parte aérea (Tabela 6). A inoculação aumentou significativamente a velocidade de brotação, emissão de brotos e raízes.

Tabela 6. Brotação (BROT), altura de parte aérea (ALT), matéria seca da parte aérea (MSPA), matéria seca de raízes (MSR) e diâmetro de colmo (DC) 45 após inoculação com B. _________________________Megateríumem composto polimérico._______________________ ________Tratamentos_________BROT % ALT (cm) DC mm MSPR (g) MSPA (g) Controle (água) 47,33b 33* 18,7* 2,00b 3,62b Controle (meio de Cultura) 46,32b 32 18,3 2,87a 3,75b B. Megaterium (polímero) 75,00a 38 18,9 3,13a 5,71a *Não significativo *Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey p<0,05 [074] Para monitorar a população dos micro-organismos inoculados, foram feitas coletas das plântulas, por tratamento, antes da semeadura (tempo 0), aos 15, 30 e 45 dias após o plantio. Foram pesados um grama de raízes, parte aérea e toletes que foram macerados em 9,0 mL de solução salina (NaCI 0,9%) e os extratos submetidos a diluições seriadas e semeadura em placa, contendo o meio mineral suplementado com Agar 15(gl_’1), e posterior contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Para confirmação, as colônias obtidas foram comparadas com as da cultura estoque.

[075] No momento do plantio foi verificada uma população de 7,7 unidades logarítmicas, ocorrendo um ligeiro aumento aos 15 dias, porém com uma tendência a se manter constante (Figura 1).

VANTAGENS DA PATENTE

[076] A presente invenção proporciona uma composição contendo uma bactéria capaz de solubilizar fosfato e os seus agentes, não só para aumentar disponibilidade do fósforo no solo, mas também aumentar a absorção de outros nutrientes pela planta e a presença de tais microrganismos na rizosfera podem absorver zinco, cobre, cálcio e outros oligoelementos, melhorando a nutrição de plantas; secretando também reguladores de crescimento, que promovem o crescimento radicular. Após a inoculação, se reproduzem rapidamente, e permanecem viáveis ao longo de um período de tempo tornando-se as bactérias dominantes na rizosfera e, assim, podendo inibir ou reduziras possibilidades de criação de agentes patogênicos para melhorar a resistência a doenças de plantas. O processo de produção é simples e de alta eficiência de produção, para atingir uma produção industrial, com impacto positivo nas consequências econômicos e sociais.

[077] A Carboximetilcelulose, amido são fontes de carbono prontamente disponível podendo estimular a multiplicação e a sobrevivência da bactéria, favorecendo o seu estabelecimento na rizosfera e no solo.

[078] As formulações de inoculantes em géis proporcionam maior proteção aos micro-organismos, em condições de dessecação e temperatura elevada.

[079] Os polissacarídeos possuem características que permitem modificações químicas e bioquímicas, são abundantes na natureza, por isso podem ser obtidos a baixo custo, não são tóxicos e são provenientes de recursos renováveis. O que torna a apresente invenção altamente viável para a produção e implementação, principalmente no plantio das culturas de maior significância econômicas e sociais do país.

REINVINDICAÇÕES

Claims (8)

1- Composto para inoculação em solos e outros meios de cultivo, caracterizado por compreender a bactéria solubilizadora de fosfatos Bacillus megaterium estirpe 10 em um veículo apropriado em forma de gel.

2- Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma suspensão em meio mineral (Sacarose 16g, Na4S04 2g, MgS04.7H20 0.008g, Na2HP04 3.6g, KH2P04 1.5g, FeS04.7H2 0.05g, CaCl2.2H20 0.01g, ÁcidoCítrico 0.1g, água destilada 1000mL, suplementado com 1mL da solução de micronutientes: H3B03 300mg, C0CI2.6H2O 200mg, ZnS04.7H20 30mg, MnCl2.4H20 30mg, (NH4)6Mo7024.4H20 30mg, NÍS04.7H20 30mg, CuS04.5H20 10mg, água destilada 1000mL), contendo 1012 células da bactéria solubilizadora de fosfatos Bacillus megaterium strain 10 acesso Gl:952025480.

3- Composto de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por utilizar a solução aquosa de Bacillus megaterium adicionada a uma mistura de carboximetilcelulose e amido em proporções que variam entre 70:30 e 50:50, esterilizada em autoclave uma pressão de 1,3 Kgf/cm2 e temperatura de 121° C. por um período de duas horas, sendo uma hora inicialmente e após repouso de 24 horas, mais uma hora.

4- Composto de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por utilizar água em quantidade suficiente para formar a composição polimérica e manter a viabilidade das células bacteriana, na faixa de 1012 a 109 UFC mL·1 (2.0 a 2.5% da mistura polimérica).

5- Composto de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por utilizar um caldo de cultivo para suspensão das células de micro-organismos, composto por nutrientes que compreendem açúcares, aminoácidos, proteínas, sais e suas misturas, podendo receber corretores de pH, agentes tampão e agentes osmóticos-reguladores, sendo esterilizado em autoclave a1,3 Kgf/cm2a 120° C por vinte minutos.

6- Composto de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por apresentar uma taxa de sobrevivência mínima de 109 de células viáveis no gel, por 180 dias.

7- Uso do composto de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado por ser usado como inoculante em solos ou outro meio de cultivo para aumento da produtividade de culturas de interesse.

8- Uso do composto de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado por ser para tratamento de gemas para aumento no número e na velocidade de brotação, matéria seca de raiz e matéria seca da parte aérea a taxa de brotação e propagação de toletes de cana de açúcar.