BR102015031492A2

BR102015031492A2 - PROCESS OF GENOMIC DNA EXTRACTION OF FILAMENTAL AND LEVEDURIFORM FUNGI

Info

Publication number: BR102015031492A2
Application number: BR102015031492A
Authority: BR
Inventors: De Andrade Monteiro Cristina; Barros Alves Marcia; Richard Jardim Araújo Willyson
Original assignee: Inst Federal De Educacão Ciencia E Tecnologia Do Maranhao Ifma
Priority date: 2015-12-16
Filing date: 2015-12-16
Publication date: 2017-06-20

Abstract

processo de extração de dna genômico de fungos filamentosos e leveduriformes. o processo, no campo da biologia molecular, para extração de dna de fungos filamentosos ou leveduriformes cultivados tanto em meio sólido como em meio líquido, utiliza-se tampão stes, areia da praia e cia. as colônias de leveduras isoladas ou fungos filamentosos são retiradas diretamente de placas de cultivo (crescidas 18 horas em placas com ágar saboraud / clorafenicol) e colocadas em microtubos de 1,5 ml contendo 200 ul de tampão de lise (tl). alternativamente, 2 ml do isolado específico crescido em bhi por 24 horas a 37ºc é transferido para microtubos e centrifugados por 5 minutos a 12000 rpms. as células são ressuspendidas em 200 µl de tl. o tl é composto de 200 mm tris ph 8,0, 25 mm de edta, 100mm de nacl e 1% sds. para os filamentosos, pedaços de área da colônia de 0,5 x 0,5 cm2 são retirados e colocados diretamente em microtubos contendo tl; a maceração do tecido é realizada com areia de praia lavada e autoclavada, em substituição à sílica gel e outros materiais de kits comerciais.extraction process of genomic DNA from filamentous and yeast fungi. The process, in the field of molecular biology, for DNA extraction from filamentous or yeast fungal cultivated in both solid and liquid medium, is used as buffer, beach sand and co. Colonies of isolated yeast or filamentous fungi are taken directly from culture plates (grown 18 hours in saboraud / chlorafenicol agar plates) and placed into 1.5 ml microtubes containing 200 µl lysis buffer (tl). alternatively, 2 ml of the specific isolate grown in bhi for 24 hours at 37 ° C is transferred to microtubes and centrifuged for 5 minutes at 12000 rpms. cells are resuspended in 200 µl tl. the tl is composed of 200 mm tris ph 8.0, 25 mm edta, 100 mm nacl and 1% sds. for the filamentous, 0.5 x 0.5 cm2 pieces of colony area are removed and placed directly in microtubes containing tl; Tissue maceration is performed with washed and autoclaved beach sand, replacing silica gel and other commercial kit materials.

Description

“PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURIFORMES” [001] O presente processo, no campo da biologia molecular, diz respeito à extração de DNA (Ácido Desoxirribonucleico) de fungos leveduriformes e filamentosos utilizando areia de praia esterilizada, solução tampão de lise celular com redução da quantidade de reagentes e sem a presença de reagentes com alta toxicidade e bastões de vidro para a maceração e quebra da parede celular presente nas células fúngicas. Além disso, nesse processo extrai-se o ácido nucléico a partir de um segmento mínimo de micélio retirado diretamente da colônia em crescimento em meio sólido, no caso de fungos filamentosos, ou a partir de uma “alçada” de colônia retirada do meio sólido, para as leveduras. A separação entre restos celulares (polissacarídeos-lipídeos-proteínas) e ácido nucléico é feita com clorofórmio e álcool isoamilico, seguida de precipitação do DNA com álcool puro.“Genomic DNA Extraction Process of Filamentous and Yeast-Fungal Fungi” [001] The present process, in the field of molecular biology, concerns the extraction of DNA (deoxyribonucleic acid) from sterile yeast and sand beach fungi, buffer solution Cell lysis with reduction of the amount of reagents and without the presence of reagents with high toxicity and glass rods for maceration and breakage of the cell wall present in the fungal cells. In addition, in this process nucleic acid is extracted from a minimal segment of mycelium taken directly from the growing colony in solid medium, in the case of filamentous fungi, or from a colony “raised”, for yeast. The separation between cellular debris (polysaccharides-lipids-proteins) and nucleic acid is made with chloroform and isoamyl alcohol, followed by precipitation of DNA with pure alcohol.

Descrição do estado da técnica [002] Para identificação de fungos de interesse clínico são utilizados meios cromógenos, métodos bioquímicos e moleculares em laboratórios de análises clínicas e de pesquisa.Description of the state of the art [002] Chromogenic media, biochemical and molecular methods are used to identify fungi of clinical interest in clinical analysis and research laboratories.

[003] Dentre os métodos citados o mais seguro para identificação de fungos de interesse clínico é aquele feito a nível molecular, para o qual a extração de DNA é a primeira e mais importante etapa, pois a partir deste pode-se aplicar outras técnicas moleculares que permitem a identificação segura da espécie a qual pertence o isolado.Among the cited methods the safest for identification of fungi of clinical interest is that made at the molecular level, for which DNA extraction is the first and most important step, because from this one can apply other molecular techniques. that allow the secure identification of the species to which the isolate belongs.

[004] Um passo chave para a detecção de fungos, utilizando PCR (Reação em cadeia da Polimerase), é a capacidade de extrair DNA de hifas e/ou conídios eficientemente. A eficiência desta etapa é ainda mais crítica durante a tentativa de detectar pequenas quantidades de material fúngico em amostras biológicas tais como sangue humano, muco e tecidos (Karakousis et al., 2006).A key step for fungal detection using PCR (Polymerase Chain Reaction) is the ability to efficiently extract DNA from hyphae and / or conidia. The efficiency of this step is even more critical when attempting to detect small amounts of fungal material in biological samples such as human blood, mucus and tissues (Karakousis et al., 2006).

[005] Os métodos mais utilizados para extração de DNA de fungos são métodos remetem a técnicas mecânicas ou químicas para realização da quebra de parede e membrana celulares. Os métodos de isolamento de DNA de fungos para lisar conídios e hifas, tais como enzimas de digestão, como proteinase K, liticase, Zymolyase (Chen et al., 2002), o congelamento em nitrogênio líquido e trituração com almofariz e pilão, sonicação, moagem com esferas de vidro e micro-ondas (Bir et al., 1995; Dean et al., 2004; Gang e Weber, 1995; Haugland et al., 2002; Jin et al., 2004; Loffler et al., 1997; Maaroufi et al., 2004;. Millar et al., 2000; Williams et al., 2001) e métodos não mecânicos de ruptura tais como o tratamento com produtos químicos alcalinos, detergentes e xantogenatos também têm sido utilizados e relataram o rendimento de grandes quantidades de DNA de boa qualidade a partir de uma variedade de espécies de fungos (Chen et al., 2002; Ross, 1995).[005] The most commonly used methods for extracting DNA from fungi are methods that refer to mechanical or chemical techniques for performing cell wall and membrane breakage. Methods of DNA isolation from fungi to lyse conidia and hyphae such as digestion enzymes such as proteinase K, lithicase, Zymolyase (Chen et al., 2002), freezing in liquid nitrogen and grinding with mortar and pestle, sonication, glass ball and microwave milling (Bir et al., 1995; Dean et al., 2004; Gang and Weber, 1995; Haugland et al., 2002; Jin et al., 2004; Loffler et al., 1997 ; Maaroufi et al., 2004; Millar et al., 2000; Williams et al., 2001) and non-mechanical disruption methods such as treatment with alkaline chemicals, detergents and xantogenates have also been used and reported the yield of large amounts of good quality DNA from a variety of fungal species (Chen et al., 2002; Ross, 1995).

[006] Além destes métodos acima citados, existem kits comerciais que utilizam, além dos tampões adquiridos com o kit, enzimas para lise da parede e membrana da célula fungica e recuperação do DNA a partir de culturas líquidas.In addition to these methods mentioned above, there are commercial kits that use, in addition to the buffers purchased with the kit, enzymes for fungal cell wall and membrane lysis and DNA recovery from liquid cultures.

[007] As técnicas de extração de DNA demonstradas acima se utilizam de reagentes que apresentam elevado custo e compostos que possuem propriedades nocivas à saúde humana, além disso são métodos trabalhosos e que podem ter baixo rendimento.The DNA extraction techniques shown above utilize high cost reagents and compounds that have properties harmful to human health, and are laborious and low yielding methods.

[008] Dada a variedade de protocolos de extração de DNA de fungos na literatura, pode ser difícil selecionar um método apropriado para a espécie de interesse. Idealmente, para melhores aplicações da técnica de PCR, o protocolo deve maximizar o rendimento e não afetar a qualidade e a pureza do DNA com contaminantes transportados ao longo de etapas anteriores da extração e que podem reduzir significativamente a sensibilidade da PCR.Given the variety of fungal DNA extraction protocols in the literature, it may be difficult to select an appropriate method for the species of interest. Ideally, for better PCR technique applications, the protocol should maximize yield and not affect the quality and purity of DNA with contaminants transported through earlier extraction steps that can significantly reduce PCR sensitivity.

[009] No entanto, o custo e a não reprodutibilidade do método para extrair DNA de forma eficiente comprometem as demais etapas para a identificação do isolado. A presente patente tem como objetivo o desenvolvimento de uma técnica que diminua os custos e os riscos associados para se obter DNA íntegro e livre de impurezas de fungos filamentosos e leveduriformes com a utilização de reagentes e materiais que podem ser encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular, sem a necessidade da utilização de Kits de extração e compostos perigosos e caros.However, the cost and non-reproducibility of the method for efficiently extracting DNA compromises the remaining steps for identification of the isolate. The present patent aims to develop a technique that reduces the costs and associated risks of obtaining intact and free DNA from filamentous and yeast-like fungi using reagents and materials that can be found in most biology laboratories. without the use of hazardous and expensive extraction kits and compounds.

Breve Descrição da Técnica [010] Aqui se conseguiu desenvolver um método rápido e eficiente de extração de DNA que pode ser aplicado tanto em leveduras como em fungos filamentosos, cultivados tanto em meio sólido como líquido, com materiais simples e de baixo custo. Utilizamos este método para extrair DNA genômico de fungos de importância médica.Brief Description of the Art [010] Here we have developed a fast and efficient method of DNA extraction that can be applied to both yeast and filamentous fungi grown in both solid and liquid medium with simple and inexpensive materials. We use this method to extract genomic DNA from fungi of medical importance.

Estas amostras de DNA mostraram ser de alta qualidade, pois produziram resultados positivos em reações de PCR e reagem prontamente com as enzimas modificadoras de DNA, tais como endonucleases de restrição.These DNA samples were shown to be of high quality as they produced positive results in PCR reactions and readily reacted with DNA modifying enzymes such as restriction endonucleases.

Descrição Detalhada da técnica [011] Para que a técnica seja entendida completamente é necessária a apresentação de alguns termos referentes a esta antes de seguir com a descrição detalhada da patente. Os termos a seguir apresentados são termos técnicos comumente utilizados nas áreas às quais pertence a técnica desenvolvida e com significado entendido por técnicos e estudiosos dessas áreas.DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNIQUE In order for the technique to be fully understood, certain terms relating thereto are required prior to following the detailed description of the patent. The following terms are technical terms commonly used in the fields to which the developed technique belongs and meaningful to technicians and scholars of those fields.

[012] A sigla “DNA” refere-se ao Ácido Desoxirribonucleico, o ácido nucleico responsável por carregar a informação genética em todos os seres vivos e em alguns vírus. Contém as informações necessárias para a síntese de proteínas e RNAs (Ácido Ribonucleico). O ácido desoxirribonucleico é um polímero constituído por porções menores chamadas de nucleotídeos, e estes são formados por um açúcar (uma pentose chamada desoxirribose), um grupo fosfato e por uma de um conjunto de quatro bases nitrogenadas (adenina, citosina, guanina e timina). Os termos “DNA genômico” referem-se ao ácido desoxirribonucleico presente no núcleo celular somente, não envolvendo DNA mitocondrial.[012] The acronym “DNA” refers to Deoxyribonucleic Acid, the nucleic acid responsible for carrying genetic information in all living things and some viruses. Contains the necessary information for the synthesis of proteins and RNAs (Ribonucleic Acid). Deoxyribonucleic acid is a polymer made up of smaller portions called nucleotides, and these are formed by a sugar (a pentose called deoxyribose), a phosphate group and one of a set of four nitrogenous bases (adenine, cytosine, guanine and thymine). . The terms "genomic DNA" refer to deoxyribonucleic acid present in the cell nucleus only, not involving mitochondrial DNA.

[013] Entende-se por fungo filamento aquele que forma micélio, que é formado por hifas. A hifa possui cerca de 5 a 10 pm de largura e é formada pela reunião de várias células. As hifas podem apresentar divisórias formadas por um septo, mas há hifas que não apresentam septos. Desse modo, observando-se microscopicamente as hifas podemos diferenciar as hifas septadas das não septadas. Um conjunto de hifas forma o micélio. As colônias de fungos filamentosos podem apresentar vários aspectos, como aveludadas, cotonosas, pulverulentas e cores. Os fungos filamentosos contêm espécies que colonizam o corpo humano e provocam graves problemas de saúde, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, como paciente com AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida).[013] Filament fungus is one that forms mycelium, which is formed by hyphae. The hyphae is about 5 to 10 pm wide and is formed by the assemblage of several cells. Hyphae may have dividers formed by a septum, but there are hyphae that do not have septa. Thus, observing the hyphae microscopically, we can differentiate between septate and non-septate hyphae. A set of hyphae forms the mycelium. The filamentous fungal colonies can present various aspects, such as velvety, cottony, powdery and color. Filamentous fungi contain species that colonize the human body and cause serious health problems, especially in immunocompromised individuals, such as AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) patients.

[014] Os fungos leveduriformes são fungos unicelulares, não filamentosos, tipicamente esféricos ou ovais. Da mesma forma que os fungos filamentosos, as leveduras são amplamente distribuídas na natureza, são fungos unicelulares, não filamentosos, tipicamente esféricos ou ovais. Da mesma forma que os fungos filamentosos, as leveduras apresentam importância clínica e constituem seres oportunistas, também acometendo pacientes imunocomprometidos.[014] Yeast fungi are unicellular, non-filamentous fungi, typically spherical or oval. Like filamentous fungi, yeasts are widely distributed in nature, they are unicellular, non-filamentous, typically spherical or oval fungi. Like filamentous fungi, yeasts are of clinical importance and constitute opportunistic beings, also affecting immunocompromised patients.

[015] A técnica de extração de DNA usa areia da praia para o auxílio da quebra da parede celular nas células dos fungos. Para aquisição da areia são feitas coletas em praias no litoral da cidade de São Luís. Após essa coleta, a areia é levada ao laboratório onde passa por processos de esterilização.[015] The DNA extraction technique uses beach sand to assist in breaking down the cell wall in fungal cells. To acquire the sand, collections are made on beaches on the coast of the city of São Luís. After this collection, the sand is taken to the laboratory where it goes through sterilization processes.

[016] A areia é lavada com água destilada duas vezes e retira-se o excesso da água escorrendo a areia lavada em peneira. A areia então é adicionada à uma solução de 1% de hipoclorito de sódio por 24 horas para eliminar possíveis contaminantes. Após o período descrito, a areia é novamente lavada com água destilada, o excesso de água é retirado e a areia é conduzida à estufa de secagem regulada para 90°C, afim de que seque completamente. Após 24 horas na estufa de secagem, a areia é acondicionada em béqueres estéreis para ser esterilizada em autoclave por 15 minutos à 120° C. Depois do processo de esterilização, é transferido 0,0342 gramas de areia lavada e estéril para microtubos novos, também estéreis para serem utilizados no processo de extração de DNA.[016] The sand is washed with distilled water twice and excess water is removed by draining the washed sand through a sieve. The sand is then added to a 1% sodium hypochlorite solution for 24 hours to eliminate potential contaminants. After the period described, the sand is washed again with distilled water, excess water is removed and the sand is brought to the drying oven set at 90 ° C to dry completely. After 24 hours in the drying oven, the sand is packed in sterile beakers to be autoclaved for 15 minutes at 120 ° C. After the sterilization process, 0.0342 grams of washed and sterile sand is transferred to new microtubes as well. sterile for use in the DNA extraction process.

[017] As substâncias para uso no tampão de lise (TL) utilizado no processo de extração são preparadas em concentrações padrões com reagentes que mantém o pH da solução e a integridade do material nucléico durante o processo de extração de DNA. As concentrações e os reagentes são preparados de acordo com os seguintes valores: 0,5 M de EDTA, com p.H. ajustado para 7.8; 2 M de Tris, com p.H. ajustado para 7.8; 5 M de NaCl e lOx de SDS. As substâncias são devidamente esterilizadas em autoclave, a 120°C por 15 minutos, com exceção do SDS.[017] Substances for use in the lysis buffer (TL) used in the extraction process are prepared at standard concentrations with reagents that maintain the pH of the solution and the integrity of the nucleic material during the DNA extraction process. Concentrations and reagents are prepared according to the following values: 0.5 M EDTA with p.H. adjusted to 7.8; 2 M Tris, with p.H. adjusted to 7.8; 5 M NaCl and 10x SDS. Substances are autoclaved at 120 ° C for 15 minutes, except for SDS.

[018] A partir das soluções padrões são usadas concentrações ideais para o preparo do tampão de lise, denominado STES em alusão as iniciais dos constituintes. As concentrações dos reagentes são: 25 mM de EDTA, com pH 7.8, 200 mM de Tris, com pH 7.8, 100 mM de NaCl e 1% de SDS. O tampão STES deve ter o pH ajustado para 8,0 e ser esterilizado por autoclavagem a 120°C por 15 minutos.From the standard solutions ideal concentrations are used for the preparation of the lysis buffer, called STES alluding to the initials of the constituents. Reagent concentrations are: 25 mM EDTA, pH 7.8, 200 mM Tris, pH 7.8, 100 mM NaCl and 1% SDS. The STES buffer should be pH adjusted to 8.0 and autoclaved at 120 ° C for 15 minutes.

[019] Colônias de leveduras isoladas devem ser retiradas diretamente de placas de cultivo (crescidas 24 horas em placas com Agar Saboraud / Cloranfenicol) com alça de platina e colocadas em microtubos de 1,5 ml contendo 600 pL de STES em seguida leva-se os microtubos ao agitador de tubos por aproximadamente 3 minutos. Altemativamente, 2 mL do isolado específico crescido em BHI por 24 horas a 37°C devem ser transferidos para microtubos e centrifugados por 5 minutos a 12000 rpms. As células são ressuspendidas em 600 pL de STES. Para os fungos filamentosos, pedaços de área da colônia de 0,5 x 0,5 cm2 são retirados com lâmina esterilizada e colocados diretamente em microtubos de 1,5 mL contendo STES e areia de praia lavada e autoclavada, em substituição à sílica gel e outros materiais de kits comerciais, para fazer a maceração do tecido é utilizado bastão de vidro adaptado (necessário fazer arredondamento de uma das extremidades), após a maceração com o bastão de vidro e areia os microtubos devem ser levados ao agitador de tubos por aproximadamente 3 minutos. Depois os microtubos são incubados em banho-maria por 65°C durante por 20 minutos, de forma que na metade desse intervalo os microtubos são agitados em agitador de tubos e levados de volta ao banho-maria para completar o tempo de incubação.Isolated yeast colonies should be taken directly from culture plates (grown 24 hours on Saboraud / Chloramphenicol Agar plates) with platinum loop and placed into 1.5 ml microtubes containing 600 pL STES then taken. the microtubes to the tube shaker for approximately 3 minutes. Alternatively, 2 mL of the specific isolate grown in BHI for 24 hours at 37 ° C should be transferred to microtubes and centrifuged for 5 minutes at 12000 rpms. The cells are resuspended in 600 µl STES. For filamentous fungi, 0.5 x 0.5 cm2 pieces of colony area are removed with a sterile slide and placed directly into 1.5 mL microtubes containing STES and washed and autoclaved beach sand, replacing silica gel and Other materials of commercial kits, to make the fabric maceration, adapted glass rod is used (rounding off one end), after maceration with the glass rod and sand the microtubes should be taken to the tube shaker for approximately 3 minutes Then the microtubes are incubated in a water bath for 65 ° C for 20 minutes, so that in the middle of this interval the microtubes are shaken in a tube shaker and taken back to the water bath to complete the incubation time.

[020] Após a incubação deve-se acrescentar 500 pL de uma solução de clorofórmio e álcool isoamílico em uma proporção de 24:1 respectivamente, essa solução é chamada de CIA e promove a extração de lipídeos, proteínas e polissacarídeos. Em seguida os microtubos devem ser levados à microcentrifuga e centrifugados em temperatura ambiente a 12000 rpm por 5 minutos. Após centrifugados os microtubos apresentarão uma fase inferior clorofórmica e outra superior aquosa separadas por uma película onde estarão os restos celulares. A fase superior, onde se encontra o ácido nucleico, deve ser retirada com o uso de micropipeta e posta em outro microtubo, de forma que a fase inferior e a película são descartados. Ao novo microtubo com o ácido nucleico em solução são acrescentados 900 pL de álcool etílico absoluto gelado (armazenado a -20°C) para precipitação dos ácidos nucléicos. Para que haja maior quantidade de DNA precipitado, os microtubos devem ser incubados a -20°C durante 4 horas no mínimo. Após esta etapa os microtubos devem ser centrifugados e o DNA recuperado deve ser lavado em etanol 70% gelado. Os microtubos são centrifugados novamente nas mesmas condições. Após a centrifugação o álcool 70% é descartado e espera-se os microtubos contendo DNA secarem em temperatura ambiente. Então acrescenta-se 40 pL de TE (TRIS-EDTA) para que o DNA seja ressuspendido com o auxílio de uma micropipeta.After incubation 500 µl of a solution of chloroform and isoamyl alcohol should be added at a ratio of 24: 1 respectively, this solution is called CIA and promotes the extraction of lipids, proteins and polysaccharides. The microtubes should then be brought to the microcentrifuge and centrifuged at room temperature at 12000 rpm for 5 minutes. After centrifugation the microtubes will have a lower chloroform phase and an upper aqueous phase separated by a film where the cell remains will be. The upper phase, where the nucleic acid is located, must be removed using a micropipette and placed in another microtube, so that the lower phase and the film are discarded. To the new microtube with the nucleic acid in solution is added 900 µl of cold absolute ethyl alcohol (stored at -20 ° C) for precipitation of nucleic acids. In order to have more precipitated DNA, microtubes should be incubated at -20 ° C for a minimum of 4 hours. After this step the microtubes should be centrifuged and the recovered DNA washed in 70% ice cold ethanol. The microtubes are centrifuged again under the same conditions. After centrifugation 70% alcohol is discarded and DNA containing microtubes are expected to dry at room temperature. Then 40 pL TE (TRIS-EDTA) is added so that the DNA is resuspended with the help of a micropipette.

[021] A qualidade e quantidade de DNA podem ser avaliadas visualmente em gel de agarose a 0,8% ou com espectrofotômetro.[021] The quality and quantity of DNA can be assessed visually on 0.8% agarose gel or spectrophotometer.

ReivindicaçõesClaims

Claims

1. Process for the extraction of genomic DNA from yeast and yeast fungi characterized by having the following steps: i. preparation of the STES lysis buffer with the minimum concentrations of its constituent substances from 24 to 26 mM EDTA (with 25 mM being optimal), with pH 7.8, 190 to 210 mM Tris (with 200 mM being ideal), with pH 7.8, 90 to 110 mM (with 100 being ideal) NaCl and 1% SDS; ii. mechanical treatment for fungal cell maceration and cell wall lysis using sterile sand; iii. separation of cellular debris from DNA using CIA solution (chloroform and isoamyl alcohol) at a ratio of 24: 1.

Process for the extraction of genomic DNA from filamentous and yeast fungi according to claim 1, characterized by the use of sterile sand by washing with 1% hypochlorite and autoclaving.