BR102015030674A2 - biosensor colorimétrico integrado em plataforma de papel para monitoramento de glicose em amostras de lágrima - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um biosensor à base de papel para determinação de glicose em amostra lágrima utilizando uma imagem digital. o biosensor é fabricado a partir de uma modificação química do papel com um biopolímero constituído de grupamentos hidroxilas e aminos em sua estrutura. o processo de modificação baseia-se na solubilização prévia do biopolímero em meio ácido seguida da adição da solução na superfície do dispositivo de papel.

Description

BIOSENSOR COLORIMÉTRICO INTEGRADO EM PLATAFORMA DE PAPEL PARA MONITORAMENTO DE GLICOSE EM AMOSTRAS DE LÁGRIMA Campo da invenção [001] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um biosensor à base de papel para determinação de glicose em amostra lágrima utilizando uma imagem digital. O biosensor é fabricado a partir de uma modificação química do papel com um biopolímero constituído de grupamentos hidroxilas e aminos em sua estrutura. O processo de modificação baseia-se na solubilização prévia do biopolímero em meio ácido seguida da adição da solução na superfície do dispositivo de papel.

[002] O biopolímero recobre a fibras de celulose modificando sua estrutura e fornece uma superfície mais adequada para uma imobilização enzimática afim de assegurar a interação da enzima com a superfície do papel recoberta com o biopolímero. Essa hipótese, idealizada nessa invenção, melhorou significativamente a resposta analítica permitindo alcançar excelentes níveis de detectabilidade.

[003] Os biosensores resultantes do processo de modificação podem ser utilizados em conjunto com a detecção por imagem, na qual diferentes equipamentos para aquisição da imagem digital podem ser empregados incluindo scanner, microscópio, câmera de celulares, dentre outros. O biosensor pode ainda ser usado em ensaios rápidos para diagnósticos de espécies clinicamente relevantes, mais principalmente como um novo sistema não invasivo para a detecção e monitoramento de glicose em amostra de lágrima. Fundamentos da Invenção [004] De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), mais de 5% da população mundial, ou seja, cerca de 347 milhões de pessoas no mundo apresentam problemas de saúde associados com a diabetes1'3. Deste total, estima-se que 80% dessas pessoas vivem em países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. O Brasil, por exemplo, aparece como o 8o país com maior incidência de diabetes, especialmente a Diabetes mellitus1. A diabetes é uma doença que ocorre quando o pâncreas não produz mais insulina ou quando os organismos não conseguem utilizar efetivamente a insulina produzida e que está relacionada diretamente com ao hábito alimentar ou ao sedentarismo. É uma doença crônica que causa um grande impacto nos gastos com a saúde uma vez que, quando mal controlada, proporciona complicações que oneram os gastos com a saúde pública12. Para evitar índices mais expressivos relacionados ao impacto na saúde pública, diversas ações governamentais têm estimulado o tratamento preventivo, os quais apresentam efeitos significativos mais rapidamente quando acompanhados da mudança do estilo de vida do paciente glicêmico. No mercado atual, existem diferentes tipos de equipamentos disponíveis para o monitoramento diário dos níveis de glicose no sangue. No entanto, eles geram um enorme desconforto ao paciente sendo métodos dolorosos e que necessitam ser repetidos várias vezes ao longo de um dia.

[005] Neste cenário geral, acredita-se que o biosensor colorimétrico aqui proposto apresenta vários pontos positivos que possam solucionar a problemática relacionada ao monitoramento dos níveis de glicose, que são eles: 1. O biosensor é fabricado em substrato de papel, que é um material de baixo custo, abundante, biodegradável, leve, flexível e de acessibilidade global. Essas características são importantes, uma vez que reduz drasticamente o custo de uma análise o que é ideal para os países em desenvolvimento, os quais são os mais afetados pela doença. 2. O biosensor utiliza a lágrima como um fluido biológico para o monitoramento da glicose, devido à boa correlação entre os níveis de glicose no sangue e na lágrima. 3. O monitoramento dos níveis de glicose é simples e rápido feito pelo simples posicionamento do biosensor ao canto do olho. É um método “não invasivo” e, principalmente, não doloroso ao paciente. 4. O monitoramento pode ser feito de modo visual, no qual os níveis são acompanhados pelo paciente a partir da intensidade de cor gerada da reação entre a glicose e os reagentes específicos, e então comparados à uma escala pré-definida.

Impacto Tecnológico [006] O impacto tecnológico do dispositivo proposto se refere ao desenvolvimento de um biosensor com alta sensibilidade analítica capaz de monitorar os níveis de glicose em amostras de lágrima empregando-se um sistema de detecção por imagem. O biosensor é produzido em substrato (papel) de custo extremamente reduzido e as metodologias de fabricação desse biosensor são também baratas e facilmente implementáveis em qualquer ambiente de trabalho.

[007] O processo de modificação da superfície do papel, que melhorou o desempenho analítico desse tipo de plataforma tornando-o ideal para monitoramento de espécies em níveis de concentração reduzida, também consiste de um processo simples e rápido que ocorre pela simples adição de um biopolímero nas fibras de celulose.

[008] O método de monitoramento é feito utilizando amostra de lágrima em alternativa aos métodos convencionais existentes e é um sistema menos invasivo e doloroso ao paciente. Além disso, o sistema de detecção e monitoramento dos níveis de concentração do analito é realizado pelo método colorimétrico, no qual a resposta é obtida pela simples captura da imagem utilizando equipamentos como scanner, microscópio e até mesmo câmera de celular. O biosensor colorimétrico à base de papel apresenta características ideais para serem inseridas ao mercado, principalmente naqueles países considerados em desenvolvimento, no qual o custo por biosensor é inferior à dez centavos de real (< R$ 0,10).

Objeto da Invenção [009] Uma correlação satisfatória entre as quantidades de glicose no sangue e na lágrima foi encontrada em estudos realizados anteriomente2"6. O monitoramento desse analito (glicose) é cada vez mais importante visto que existe um número crescente de pacientes glicêmicos a cada ano. Neste contexto, faz necessário o desenvolvimento de sensores analíticos com potencialidade de monitorar os níveis glicêmicos nesse fluido biológico, tornando o método de análise cada vez mesmo doloroso ao paciente.

[010] Uma das principais dificuldades no uso da lágrima como fluido para diagnóstico se refere à baixa concentração de glicose (cerca de 100 vezes menor que a concentração no sangue) nesse fluido2 7. Neste contexto, a presente invenção descreve o desenvolvimento de um biosensor colorimétrico para detecção de glicose na lágrima, o qual foi construído a partir da modificação química do substrato de papel com um biopolímero. O método de modificação é simples e requer apenas uma etapa de adição da solução do biopolímero sobre a superfície do papel. O processo de modificação pode ser realizado em tempo total de 20 minutos, podendo ser usado imediatamente em qualquer local e região sem a necessidade de qualquer instrumento de médio ou grande porte.

[011] O monitoramento dispensa qualquer etapa complicada ou treinamento técnico especializado. Devido às propriedades das fibras de celulosa, basta posicionar o biosensor no canto interno do olho (região mais próxima ao nariz) para que a amostra de lágrima (necessário cerca de 10 μΙ_) seja absorvida pelo papel e migre por capilaridade até atingir a região modificada. Ao atingir essa região, que contém os reagentes previamente imobilizados, uma cor específica desenvolve-se e a intensidade dessa cor pode ser diretamente relacionada com a concentração da glicose na amostra. O próprio paciente pode comparar a intensidade de cor desenvolvida com as cores descritas em um rótulo tendo a resposta em níveis concentração. O tempo total de análise requerido é de aproximadamente 10 minutos.

[012] Em relação ao custo, os biosensores produzidos a partir da modificação apresentam um custo final da ordem de R$ 0,10 (dez centavos de reais), incluindo reagentes e consumíveis para ensaios colorimétricos rápidos. Além dos testes de glicose, outros analitos de interesse podem ser analisados simultaneamente no mesmo biosensor. Além disso, devido ao custo reduzido, os biosensores são considerados descartáveis e podem ser facilmente produzidos em larga escala.

Sumário da Invenção [013] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um biosensor colorimétrico incorporado em plataforma de papel altamente sensível para detecção e monitoramento de glicose em amostras de lágrima. Os níveis de glicose na lágrima podem ser correlacionados com as concentrações comumente encontradas no sangue. Portanto, o desenvolvimento de dispositivos analíticos com potencialidade para monitorar os níveis de glicose em fluidos biológicos coletados de forma menos invasiva pode oferecer um enorme potencial tecnológico para a medicina moderna. O dispositivo à base de papel foi modificado quimicamente através da incorporação de um biopolímero em sua estrutura celulósica.

[014] O biopolímero apresenta em sua estrutura vários grupamentos hidroxílicos e aminos, os quais permitem a interação química com a celulose. Além disso, o biopolímero também favorece a adsorção de enzimas e outras biomoléculas em sua estrutura química. O processo de modificação baseia-se na solubilização prévia do biopolímero em meio ácido seguido da adição da solução na superfície do dispositivo de papel. A incorporação do biopolímero na celulose favoreceu à adsorção das enzimas glicose oxidase e peroxidase em sua estrutura, contribuindo ainda para um aumento da área superficial quimicamente modificada promovendo, consequentemente, uma melhora significativa na uniformidade e principalmente na intensidade da cor gerada após a reação enzimática da glicose na presença de um indicador cromógeno.

[015] O desempenho analítico da invenção forneceu resultados satisfatórios para uso clínico dedicado ao monitoramento dos níveis de glicose em amostras de lágrima. Em pacientes com quadro glicêmico normal, os níveis de glicose se encontram na faixa entre 100-600 μΜ, os quais não podem ser detectados colorimetricamente em plataformas de papel sem modificação química. Com o uso do biopolímero, a resposta colorimétrica ofereceu excelente linearidade na faixa de concentração entre 0-1000 μΜ com um limite de detecção igual a 23 pM. Diante desse avanço tecnológico, a concentração de glicose foi determinada colorimetricamente com sucesso em amostras de lágrima sem qualquer diluição prévia.

[016] A confiabilidade obtida na resposta do biosensor foi superior a 90%. Dessa forma, o dispositivo microfluídico com fase biosensora incorporada apresenta elevada potencialidade para ser explorado no monitoramento dos níveis de glicose em amostras de lágrima bem como no diagnóstico de diabetes e no controle do tratamento de pacientes com quadro de hiperglicemia. Antecedentes da Invenção [017] Desde de 1950 tem sido realizado estudos afim de tentar usar a lágrima como um possível fluido biológico alternativo ao sangue para monitoramento dos níveis de glicose. Levando-se em conta todos as características desse fluido biológico, as técnicas já estudadas são aquelas que apresentam limites de detecção adequados mais medir quantitativamente níveis de concentração na faixa micromolar utilizando-se volumes entre 2-10 pL de amostra28. Sendo assim, os métodos de detecção já explorados e consolidados para essa finalidade incluem a fluorescência induzida a laser910, a espectrometria de massas1112, os sensores holográficos13 e os biosensores eletroquímicos5’6’8’14'15.

[018] Dentre os sistemas mencionados, a detecção eletroquímica é a mais explorada visto à sua alta sensibilidade, seletividade ajustável e reprodutibilidade analítica. Um dos primeiros sensores eletroquímicos utilizado para monitorar glicose em amostra de lágrima foi descrito em 1995 por Mitsubayash e colaboradores16. Neste trabalho, o biosensor foi fabricado através da imobilização da enzima glicose oxidase sobre uma fina membrana do polímero politetrafluoroetileno (teflon) recoberto por uma camada de ouro. O sensor apresentou uma linearidade para uma faixa de concentração até 3,7 mM, a qual engloba as concentrações de glicose em fluido lacrimal humano em níveis normais e diabéticos.

[019] Em 2010, a Google Inc. inovou na área dos sensores eletroquímicos, mostrando uma lente de contato como um sensor para o monitoramento de diferentes analitos na lágrima. Este sensor foi primeiramente desenvolvido por Yao e colaboradores17, e consiste de uma lente de contato funcional, interconexões metálicas, um nanosensor (posicionado na lente), uma antena e circuito de telecomunicação que permite o monitoramento não invasivo e contínuo da concentração de glicose apenas pelo posicionamento da lente ao olho. O sensor apresentou uma boa linearidade na faixa de 0,1 a 0,6 mM, com limite de detecção igual a 0,01 mM, No entanto, um dos problemas relatados é a necessidade de uso de uma fonte adequada de energia, o que acaba sendo uma limitação instrumental.

[020] Em um cenário mais próximo dos sensores colorimétricos, um biosensor à base de papel foi recentemente patenteado por Andreescu et al.18. Nessa patente, os autores descrevem o uso de nanopartículas de cério como o próprio reagente de cor necessário para detecção colorimétrica de diferentes espécies.

[021] A grande vantagem do sistema é a eliminação do uso de indicadores visto que a nanopartícula de cério gera uma cor específica, quando oxidada, durante as reações enzimáticas associadas aos ensaios colorimétricos. Nessa patente em questão, os autores reivindicam a possível utilização das nanopartículas de cério para recobrimento de lentes de contato para o monitoramento contínuo de glicose em amostra de lágrima.

[022] Das vantagens mencionadas pelos inventores, estão que o biosensor pode ser utilizado como um método não invasivo de monitoramento de glicose, todos os componentes são biocompatíveis e que as nanopartículas apresentam propriedades antioxidantes. Por outro lado, está descrito que o biosensor colorimétrico exibiu uma boa linearidade na faixa de 0,5 a 500 mM com limite de detecção de 0,5 mM. Devido às baixas concentrações de glicose na lágrima, o biosensor descrito por Andreescu et al.18 limita-se à identificação de glicose se, somente se, a concentração estiver em níveis superiores a 0,5 mM. Dessa forma, a patente encontrada não permite o monitoramento com qualidade suficiente para validar os níveis de concentração de glicose lacrimal, que podem variar entre 100-600 μΜ.

[023] Quando comparado aos antecedentes da invenção, o biosensor colorimétrico, objeto dessa invenção, apresenta como principais diferenciais (i) o uso de um biopolímero que possibilitou na melhoria do desempenho analítico em conjunto com a escolha do indicador cromogênico, (ii) a possibilidade de monitoramento dos níveis de glicose diretamente na lágrima, que quando comparado à coleta de sangue trata-se de um método não-invasivo, e por último (iii) a capacidade de self-test por parte dos próprios pacientes no ponto de necessidade, ou no point-of-care, sem qualquer equipamento externo aos dispositivos com fase biosensora incorporada.

[024] Em relação aos níveis de glicose na lágrima, o uso do biopolímero promoveu uma redução dos níveis de concentração onde normalmente se observada comportamento linear da resposta baseada na coloração. A faixa linear obtida está abaixo dos limites de detecção reportados na literatura e associados ao uso do detector colorimétrico. Os valores obtidos nesse invento são comparáveis a outros detectores que apresentam melhor sensibilidade e seletividade. Esse foi o primeiro ponto favorável do invento descrito.

[025] A coleta da lágrima para testes de diabetes já foi reportada recentemente, porém através do uso de sensores eletroquímicos que são reconhecidamente mais sensíveis, específicos e requerem obrigatoriamente, um sistema eletrônico para processamento do sinal obtido. No invento descrito, a amostra de lágrima pode ser coletada de forma não invasiva após uma indução química ou mecânica e o resultado pode ser obtido visualmente, usando-se uma escala de cor devidamente calibrada. A resposta pode ser extraída em um intervalo inferior a 20 minutos.

[026] Devido às vantagens descritas, o uso da lágrima e de uma escala de cor integrada, por exemplo, na embalagem do produto, podem permitir que os pacientes tenham informações precisas e exatas de forma rápida, visual e simples em sua própria casa. Caso seja necessário, uma imagem pode ser capturada com um celular e transmitida para o médico especialista ou equipe clínica para recomendações de tratamento ou orientações complementares. Vale enfatizar que, além do dispositivo objeto do presente invento, nenhum equipamento externo é requerido para essa finalidade de self-test.

[027] As respostas “sim” ou “não” bem como informações relevantes sobre um desequilíbrio na concentração podem ser obtidas em função do uso de uma escala de cor, similar aos kits para testes de pH. A ideia descrita é genuína e passível de comercialização.

Descrição Detalhada da Invenção Fabricação do Biosensor Colorimétrico [028] A Figura 1 apresenta a geometria do dispositivo microfluídico de papel utilizado e o processo de modificação química através da adição do biopolímero sobre a superfície da celulose. Antes da etapa de modificação, os dispositivos de papel são fabricados através da construção de barreiras hidrofóbicas sobre a sua superfície, as quais delimitam canais hidrofílicos para a transporte da solução até atingir uma zona específica. A zona é determinada como zona de detecção, ou câmara de reação, e representa a região onde ocorre as reações enzimáticas específicas associadas ao desenvolvimento de cor. As barreiras hidrofóbicas podem ser fabricadas utilizando diferentes metodologias como as técnicas de fotolitografia, impressão a cera e processo de estampagem. Tendo os canais e as zonas de detecção delimitadas por barreiras hidrofóbicas é realizado o processo de modificação química. A etapa de modificação é realizada somente na zona de detecção e inicia-se pela solubilização do biopolímero em meio ácido. Em seguida, cerca de 1,5 μΐ_ da solução é adicionada a zona de detecção e deixado secar a temperatura ambiente por cerca de 15 min. Após a etapa de secagem, o biopolímero já está aderido e recobrindo a superfície do papel a ponto de ser preparado para a próxima etapa para o ensaio de colorimétrico.

[029] A Figura 2 apresentam micrografias ópticas evidenciando-se a morfologia da superfície do papel após a adição do biopolímero. Na imagem amplificada é possível observar o completo enovelamento das fibras do papel pela adição do polímero.

[030] As Figuras 3 e 4 apresentam duas micrografias ópticas ilustrando o desempenho analítico do biosensor antes e depois da etapa de modificação com o biopolímero, respectivamente, em um ensaio típico para detecção colorimétrica de glicose. A partir das imagens apresentadas pode-se observar que o desenvolvimento da cor no biosensor modificado é bastante uniforme o que melhora significativamente a resposta analítica e melhora a confiabilidade deste tipo de dispositivo.

[031] As Figuras 5 e 6 exemplificam a dependência da intensidade e do gradiente de cor em relação à concentração do biopolímero adicionado na zona de detecção. Conforme observado, a concentração do biopolímero não teve um efeito significativo na uniformidade da cor gerada. Por outro lado, notou-se que com o aumento da concentração ocorreu um aumento no gradiente de cor. Os valores de gradiente de cor são obtidos por uma medida de desvio padrão dada por uma ferramenta padrão de um software gráfico e essa medida é inversamente proporcional a uniformidade de cor. Sendo assim com aumento da concentração do biopolímero na superfície do papel observou-se uma redução na uniformidade de cor.

[032] A Figura 7 mostra uma imagem obtida com oito ensaios simultâneos para detecção de glicose. O ensaio com desenvolvimento de cor ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, ocorre a reação de oxidação da glicose em ácido glucônico e peróxido de hidrogênio, que é catalisada pela enzima glicose oxidase. Já a segunda etapa se refere à redução do peróxido de hidrogênio formado seguido pela oxidação do agente cromógeno, que é catalisada pela enzima peroxidase. Para este ensaio utilizou-se uma mistura cromogênica composta de 4-aminoantipirina (4-APP) e e um reagente fenólico (DHBS). Esta reação promove a mudança de coloração do incolor para magenta na presença da glicose, indicando sua presença no meio reacional. No ensaio colorimétrico, os reagentes necessários para o desenvolvimento de cor são compostos por duas soluções. A solução 1 consiste da mistura 4:1 do agente cromógeno 4-AAP/DHBS (4 mM/8 mM) dissolvida em tampão fosfato 100 mM, pH 6,0. A solução 2 consiste na mistura na proporção de 5:1 de glicose oxidase 120 unidades/mL e peroxidase 30 unidades/mL. Após o dipositivo ser modificado com o biopolímero, aplica-se 1,0 pL da solução 1 na zona de detecção e espera 5 minutos para secar, em seguida aplica-se 1,0 pL da solução 2 e espera secar pelo mesmo período de tempo. Por fim, aplica-se 70 pL de padrão de glicose (dissolvido em água) na zona central do biosensor, com a finalidade desta ser tranportada por fluxo lateral e assim chegar na zona de detecção contendo o reagente de cor imobilizado; depois de 15 minutos, o dispositivo é digitalizado, via scanner, e a imagem é analisada por um software gráfico, em uma ferramenta chamada histograma, onde mede-se a intensidade média de pixels em cada região que desenvolveu coloração; esta intensidade obtida é correlacionada com a concentração do analito.

[033] A Figura 8 apresenta uma curva de calibração para o ensaio colorimétrico de glicose, para concentrações de 0 a 1,0 mM. Como pode-se observar, o ensaio apresentou linearidade na faixa indicada, o que é ideal para o monitoramento de glicose em amostras de lágrima. O limite de detecção obtido foi de 23 μΜ e representa o menor valor já reportado para detecção de glicose em dispositivos de papel usando-se captura de imagens. O avanço no desempenho analítico é atribuído exclusivamente à incorporação do biopolímero na superfície da celulose, que garantiu uma maior área superficial para imobilização enzimática.

[034] A Figura 9 demonstra uma utilização real do biosensor à base de papel no monitoramento simultâneo da glicose e pH em amostra de lágrima. Uma das zonas de detecção é chamada de zona controle. Como pode ser visto, o biosensor, previamente preparado, pode ser utilizado diretamente através do simples posicionamento do canal ao canto do olho. O volume de amostra de lágrima é coletado e absorvido pelo papel. Em seguida, devido às propriedades intrínsecas deste substrato, a amostra é transportada por capilaridade nos canais microfluídicos até atingir a zona de detecção. A reação dos analitos presentes na lágrima com os reagentes imobilizados gera alteração na coloração permitindo uma análise qualitativa imediatamente após a adição da amostra.

[035] A Figura 10 apresenta uma faixa de intensidade de cor para os ensaios de glicose e pH, que permitem o paciente possa correlacionar a intensidade de cor gerada com a concentração de glicose ou pH na lágrima. Este teste possui a vantagem de ser realizado pelo próprio paciente sem a necessidade de uso de métodos invasivos para coleta da amostra. Além disso, o procedimento requer apenas o uso do biosensor. Na dúvida quanto à interpretação do resultado, o paciente pode capturar uma imagem e enviar para um médico, ou corpo clínico, via celular para uma análise mais compreensiva.

REFERÊNCIAS

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REIVINDICAÇÕES

BIOSENSOR COLORIMÉTRICO INTEGRADO EM PLATAFORMA DE PAPEL PARA MONITORAMENTO DE GLICOSE EM AMOSTRAS DE LÁGRIMA

Claims (23)

1. Construção do biosensor colorimétrico à base de papel para monitoramento dos níveis de concentração de glicose em amostras de lágrima, caracterizado pelo fato de compreender: Superfície do papel modificada quimicamente com biopolímero contendo em sua composição grupamentos hidroxilas e aminos.

2. Processo de construção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do biosensor possuir canais microfluídicos delimitados por barreiras hidrofóbicas.

3. Processo de construção, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato da possibilidade de construção do biosensor microfluídico sem barreiras hidrofóbicas.

4. Processo de construção, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato da estrutura microfluídica ser desenvolvida em múltiplas configurações podendo oferecer canais simples, arranjos de microcanais, spot tests e câmaras de reação para obtenção da resposta colorimétrica.

5. Processo de construção, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do biosensor de papel ter uma região modificada quimicamente resultando em uma estrutura de celulose, biopolímero e enzimas para detecção seletiva de glicose.

6. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato do dispositivo ser utilizado em ensaios colorimétricos com detecção por imagem capturada com scanner, câmera de celular ou qualquer outro dispositivo eletrônico com câmera integrada.

7. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato do dispositivo poder ser usado no ponto de necessidade com uma escala de cor, disponibilizada no rótulo do produto, permitindo uma rápida interpretação do nível de concentração de glicose pelo próprio paciente.

8. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizado pelo fato do dispositivo ser usado em associação com aplicativos instalados em smartphones para análise direta da intensidade de cor.

9. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato da área modificada apresentar reagentes específicos e indicadores seletivos para visualização da mudança de cor em função da concentração de glicose.

10. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato do dispositivo ser aplicado no monitoramento de glicose em amostras de lágrima.

11. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato do dispositivo poder ser aplicado de forma análoga no monitoramento de outras espécies de interesse clínico, como lactato, pH, proteínas totais, albumina, lisozima, isoleucinas e ácido úrico.

12. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato do dispositivo poder ser aplicado para diagnóstico clínico via telemedicina.

13. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato do dispositivo poder ser aplicado para diagnóstico clínico usando outros fluídos biológicos como saliva, suor, urina e sangue.

14. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato do dispositivo poder ser fabricado em plataformas microfluídica diferentes do papel, mas com propriedades similares no que diz respeito ao transporte da amostra.

15. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato da superfície do papel ser modificada por processos físicos e de alta demanda energética antes da incorporação enzimática.

16. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato do dispositivo ser fabricado em multicamadas, afim de aprisionar melhor os reagentes estendendo a durabilidade do mesmo.

17. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato da possibilidade de integração de detecção eletroquímica e detecção colorimétrica, a fim de minimizar possíveis interferentes.

18. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato do dispositivo ser completamente fechado, ou envelopado, mantendo apenas um ponto aberto para adição da amostra e outro para visualização da cor desenvolvida.

19. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato do dispositivo poder ser modificado com outros materiais contendo grupamentos químicos que favoreçam a imobilização enzimática para estudos clínicos.

20. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato do dispositivo ser fabricado com um arranjo de microcanais para análise multiplexada na amostra de lágrima.

21. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato do dispositivo apresentar sistema para medição e controle do volume a ser coletado e analisado.

22. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato do biosensor modificado ser utilizado sem reagentes cromogênicos.

23. Biosensor colorimétrico, de acordo com as reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato do dispositivo ser implementado em um kit descartável englobando escala de cor para interpretação imediata pelo próprio paciente.