BR102015030442A2 - processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico para a detecção de doenças virais, preferencialmente do vírus da cinomose canina e referido kit colorimétrico - Google Patents

Abstract

processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico para a detecção de doenças virais, preferencialmente do vírus da cinomose canina e referido kit colorimétrico. a presente invenção faz referência a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de detecção do vírus da cinomose canina (cdv) utilizando nanopartículas de ouro modificadas com anticorpos para o vírus. adicionalmente, a invenção se refere a um kit colorimétrico compreendendo os reagentes obtidos conforme processo aqui descrito. além disso, como se trata de uma metodologia que utiliza anticorpos, alternativamente, o presente kit colorimétrico se aplica para a detecção de outras doenças viróticas, utilizando o mesmo procedimento apenas trocando o anticorpo de interesse.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS REAGENTES DE UM KIT COLORIMÉTRICO PARA A DETECÇÃO DE DOENÇAS VIRAIS, PREFERENCIALMENTE DO VÍRUS DA CINOMOSE CANINA E REFERIDO KIT COLORIMÉTRICO Campo da invenção: [001] A presente invenção se aplica no campo da ciência veterinária, de forma mais específica na área de diagnóstico, e faz referência a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de detecção de doenças virais, utilizando nanopartículas de ouro modificadas com anticorpos. Mais especificamente, esta invenção se refere a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de visualização a olho nu para a detecção do vírus da cinomose canina, utilizando nanopartículas de ouro modificadas com os anticorpos contra o referido vírus.

[002] Adicionalmente, a invenção se refere a um kit colorimétrico compreendendo os reagentes obtidos conforme processo aqui descrito.

Fundamentos da invenção: [003] A cinomose canina (CC) é uma doença altamente contagiosa, causada pelo vírus da cinomose canina. Esta doença tem altas taxas de mortalidade, com índices inferiores apenas em casos de raiva canina, e a erradicação do vírus é considerada impossível por causa da sua ampla variedade de hospedeiros, que inclui carnívoros terrestres. No entanto, a CC pode ser prevenida através da vacinação.

[004] A alta taxa de mortalidade da CC requer a aceleração dos procedimentos de diagnóstico, movendo para a quarentena os indivíduos infectados e iniciando o tratamento adequado precocemente. No entanto, um amplo espectro dos sinais clínicos é semelhante àqueles observados em outras doenças respiratórias e entéricas de cães, dificultando o diagnóstico clínico da cinomose e exigindo confirmação laboratorial.

[005] Algumas técnicas utilizadas para o diagnóstico da CC incluem: testes sorológicos, fluorescência indireta, histopatologia, reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa, imunofluorescência, e imunohistoquímica. No entanto, cada um destes testes possui suas limitações.

[006] As técnicas sorológicas são limitadas, só permitindo o diagnóstico da CC quando o animal infectado morre devido à cinomose e pode fornecer títulos mensuráveis de anticorpos. A técnica de isolamento do vírus em cultura de células é específica, mas requer um longo tempo e necessita de teste confirmatório, podendo apresentar resultado falso-negatívo se o animal não estiver na fase aguda da doença. A histopatologia não é específica e requer um teste confirmatório.

[007] Além destas, a reação em cadeia da polimerase ou "real time PCR", associada à transcrição reversa (RT-PCR ou RT-qPCR respectivamente), é a que possui melhor sensibilidade e especificidade analíticas e diagnosticas. Entretanto, possui elevado custo, tempo e requer a extração do RNA viral.

[008] Recentemente, nanopartícuias metálicas têm sido empregadas com sucesso como elementos de reconhecimento molecular e amplificadores para produção de biossensores.

[009] Nanopartículas de ouro têm atraído muita atenção por causa do seu tamanho, forma e propriedades ópticas independentes, que diferem significativamente dos outros metais. Isto as tornam materiais ideais para a produção de biossensores, pois apresentam propriedades ópticas e eletrônicas únicas.

[010] Biossensores baseados em nanopartículas de ouro são fáceis de se trabalhar, altamente estáveis e podem ser bioconjugados com vários ligantes, como ácidos nucleicos, aptâmeros e anticorpos.

[011] Biossensores baseados na técnica de ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR) utilizam nanopartículas de metais nobres como alternativa aos sensores de ressonância plasmônica de superfície (SPR), visto que os campos eletromagnéticos altamente localizados que ocorrem em superfícies de nanopartículas podem ativar e melhorar a detecção de analitos biológicos em nanoescala.

[012] LSPR pode monitorar sensivelmente eventos de ligação em tempo real e tem sido utilizada para detectar uma grande variedade de processos, incluindo interações biomoleculares (antígeno-anticorpo, DNA-DNA e proteína-enzima) e tempos de detecção típicos. Além disso, a posição do pico da LSPR é fortemente dependente do tamanho e da forma das nanopartículas, bem como na constante dielétrica do ambiente.

[013] Assim, a distância entre as nanopartículas muda radicalmente a posição do pico das nanopartículas de ouro na LSPR. Normalmente, as nanopartículas de ouro apresentam uma absorção máxima de luz no comprimento de onda de 520 nm. Após a bioconjugação, elas começam a formar agregados, ocorrendo o deslocamento da banda de absorção em torno de 600-800 nm.

[014] Essa mudança pode ser observada a olho nu e também pode ser medida quantitativamente utilizando um espectrofotômetro de ultravioleta-visível (UV-Vis). Esse comportamento tem sido utilizado para detecção de várias substâncias biológicas como: imunoglobulina, doença de Alzheimer, E. coli e Salmonela, atividade de nuclease, DNA, virus influenza e bacteriófagos.

[015] Portanto, em contraste com os métodos convencionais já citados para a detecção de CC, a presente invenção se refere a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de detecção de doenças virais, mais especificamente, para a detecção rápida e sensível do vírus da cinomose (CDV), utilizando a ligação em tempo real do antígeno ao conjugado anticorpo-nanopartículas de ouro com sensibilidade e especificidade comparadas às das técnicas mais modernas como RT-qPCR.

[016] Adicionalmente, a invenção se refere a um kit colorimétrico compreendendo os reagentes obtidos conforme processo aqui descrito.

Estado da técnica: [017] Alguns documentos do estado da técnica descrevem um kit para detecção de doenças virais, tais como a cinomose canina.

[018] O documento JP2004301537 descreve um kit para a detecção da cinomose canina utilizando uma película de papel filtro modificado com o específico anticorpo correspondente ao vírus indicando assim a presença do mesmo na amostra ou não.

[019] O documento CN103439498 descreve um método para detecção de cinomose canina através do teste ELISA, onde um complexo contendo o anticorpo é visualizado pelo acoplamento da enzima ao anticorpo. Neste método, são necessárias amostras de controle e soluções de substratos auxiliares.

[020] Diferentemente das duas técnicas acima citadas, a presente invenção se refere a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de detecção de doenças virais, mais especificamente, do virus da cinomose canina, utilizando nanoparticulas de ouro modificadas com anticorpos contra o virus. Uma das vantagens desta técnica em relação às existentes, é que esta se baseia em análise colorimétrica utilizando nanoparticulas de ouro, que têm características únicas em comparação com outros materiais, tais como boa biocompatibilidade e fácil conjugação a proteínas, o que as tornam ideais como marcadores ou plataformas de leitura para biossensores.

[021] Outra vantagem é que o kit poderá ser utilizado por um operador não treinado, pois após a adição da amostra ocorrerá à variação da coloração da solução em caso de positivo.

[022] Deste modo, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de detecção de doenças virais, mais especificamente, do virus da cinomose canina, tal como aqui proposto, assim como não há documentos que fazem referência ao kit colorimétrico compreendendo os reagentes obtidos conforme processo aqui descrito.

Breve descrição da invenção: [023] A presente invenção faz referência a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de detecção de doenças virais, mais especificamente, do virus da cinomose canina, utilizando nanoparticulas de ouro modificadas com anticorpos contra o virus em questão.

[024] Adicionalmente, a invenção se refere a um kit colorimétrico de visualização a olho nu compreendendo os reagentes obtidos conforme processo aqui descrito.

Breve descrição das figuras: [025] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se fazem referências, conforme se segue.

[026] A Figura 1 representa um espectro de todas as etapas de modificações das nanoparticulas de ouro, até a detecção do CDV utilizando UV-Vis.

[027] As Figuras 2A-B representam, respectivamente, o teste colorimétrico para a detecção do CDV e seus possíveis interferentes.

[028] As Figuras 3A-B representam graficamente, respectivamente, a sensibilidade da metodologia em detecção o CDV em diferentes concentrações e a faixa linear da concentração do CDV.

Descrição detalhada da invenção: [029] A presente invenção se refere a um processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico de visualização a olho nu para a detecção de doenças virais, mais especificamente, do vírus da cinomose canina.

[030] Os reagentes do kit colorimétrico obtidos conforme processo aqui proposto podem ser para detecção de qualquer doença virótica, com a condição de o anticorpo utilizado está de acordo com a doença virótica investigada.

[031] Assim, o processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico da presente invenção compreende as etapas de: a) Obtenção de nanoparticulas de ouro; b) Obtenção da solução de ácido 11-mercaptoundecánoico (MUA); c) Obtenção da solução colorimétrica; e d) Adição do anticorpo.

[032] As etapas do processo aqui proposto estão mais bem detalhadas a seguir. a) Obtenção de nanoparticulas de ouro: [033] Na etapa "a", primeiramente, prepara-se uma solução de sal de ouro de 0,001 a 0,10 g, preferencialmente 0,004 g de HAUCI4 em 1 a 1000 mL, preferencialmente 10 mL de água.

[034] Logo após, prepara-se uma solução de 0,01 a 1,0 g, preferencialmente 0,1 g de citrato de sódio em 1 a 1000 mL, preferencialmente 10 mL de água.

[035] Subsequentemente, mistura-se de 0,1 a 100 mL, preferencialmente 3,2 mL da solução de sal de ouro obtida em 0,1 a 100 mL, preferencialmente 16,7 mL de água. Essa mistura é realizada por agitação mecânica utilizando uma barra magnética em rotação que varia de 100 a 300 rpm, sob aquecimento até o ponto de ebulição.

[036] Logo após, adiciona-se de 0,1 a 100 mL, preferencialmente 2 mL da solução de citrato de sódio, sob agitação de 300 rpm e sob aquecimento que varia de 100 a 200 °C, até a mudança de cor da solução para o vermelho.

[037] Assim, a solução de nanopartícuias de ouro obtida na etapa "a" é resfriada e guardada à temperatura ambiente.

[038] Vale ressaltar que a etapa "a" é realizada para modificar as nanopartícuias de ouro através da deposição das monocamadas auto-organizadas (SAM) utilizando alcanotióis. b) Obtenção da solução de MUA: [039] Na etapa "b", primeiramente, prepara-se uma solução de ácido 11-mercaptoundecánoico (MUA), dissolvendo de 0,01 a 2,0 g, preferencialmente 0,02 g de MUA em 10 a 1000 pL, preferencialmente 100 pL de etanol.

[040] Logo após, mistura-se de 0,5 a 1000 pL, preferencialmente 5 pL de solução de MUA obtida, em 0,1 a 100 mL, preferencialmente em 5,0 mL de etanol, resultando assim, na solução final a ser utilizada na próxima etapa. c) Obtenção da solução colorimétrica: [041] Na etapa "c", para a obtenção da solução colorimétrica, adiciona-se de 0,5 a 1000 pL, preferencialmente 200 pL da solução obtida na etapa "b" em recipiente adequado juntamente com 0,1 a 100 mL, preferencialmente 2 mL da solução de nanopartícuias de ouro obtida na etapa "a".

[042] Esse preparo é realizado sob agitação que varia de 100 a 300 rpm entre 40 e 180 minutos , preferencialmente 60 minutos.

[043] Posteriormente, adiciona-se à solução obtida anteriormente, 0,5 a 1000 pL, preferencialmente 200 pL da mistura de 1:1 de 0,4 mol L”1 de l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e 0,1 mol L”1 de N- Hidroxisuccinimida, sob agitação que varia de 100 a 300 rpm por pelo menos 60 minutos. d) Adição do anticorpo: [044] Por fim, na etapa "d", adiciona-se à solução obtida anteriormente de 10 a 1000 pL, preferencialmente 100 pL de anticorpo de acordo com a doença virótica investigada, mais preferencialmente 100 pL de CVD para a detecção do virus da cinomose canina.

[045] Assim, obtém-se uma solução final de cor levemente avermelhada a qual será compreendida no kit colorimétrico.

[046] Desse modo, adicionalmente, a presente invenção se refere a um kit colorimétrico para a detecção de doenças virais, o qual este compreende um recipiente adequado com volume de até 2 mL, preferencialmente um tubo cônico de plástico, contendo uma única solução de reagentes conforme obtidos no processo aqui descrito, em que estes são: - nanoparticulas de ouro; - citrato de sódio; - MU A; - EDC/NHS; e - anticorpo.

[047] Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se um kit colorimétrico para a detecção do virus da cinomose canina.

[048] Vale ressaltar que o teste provoca a mudança de cor no kit aqui proposto quando se adiciona uma amostra de urina contendo o virus, passando para a cor amarela. Caso a amostra não contenha o virus, a solução mantém a cor avermelhada. Logo, é um kit colorimétrico de visualização a olho nu que não necessita de pessoa altamente treinada para efetuar tal procedimento.

Testes Realizados: - Resultados do kit colorimétrico para a detecção do vírus da cinomose canina com amostras: [049] Os resultados obtidos por UV-vis demonstrados na figura 1 mostraram que as nanoparticulas de ouro exibiram um pico em 525 nm (linha preta) . A modificação das nanoparticulas com o MUA conduziu a um deslocamento do pico de 6 nm, indicando a modificação com as monocamadas auto-organizadas (linha vermelha).

[050] Após o modificação com EDC-NHS, houve um deslocamento para 533 nm (linha verde). Após a conjugação do anticorpo, o pico deslocou para 616 nm, indicando que ocorreu a ligação das nanoparticulas com o anticorpo em questão. Esta mudança é atribuída a um aumento do índice de refração local devido ao anticorpo e o resultado de um aumento do índice de refração local do meio em torno das nanoparticulas de ouro, indicado pela linha azul.

[051] Quando as nanoparticulas de ouro conjugadas com o anti-CDV foram medidas, a intensidade da banda de LSPR diminuiu e continuou se mantendo inferior a banda da LSPR antes da adição do anti-CDV. Este comportamento é causado pela aglutinação do ouro com o anticorpo IgG anti-CDV, que reduz a área de superfície das nanoparticulas e consequentemente a ressonância plasmônica de superfície.

[052] A comparação dos espectros das nanoparticulas antes e após a ímobilização dos anticorpos mostram que houve um deslocamento do pico em 97 nm, porque a razão do pico da LSPR aumenta quando as amostras são iluminadas com luz não polarizada. Essa mudança no espectro ótico sugere que algumas nanoparticulas podem ser ligadas no final da configuração.

[053] Após a conjugação com o virus do CDV, houve uma mudança no pico de 30 nm (linha rosa) . Assim como demonstrado na Figura 2, há uma clara alteração colorimétrica também é observada quando o CDV foi adicionado ao conjugado de nanoparticulas de ouro-anticorpo, ocorrendo uma mudança da coloração para o amarelo (C) conforme observado na Figura 2B.

[054] De forma mais detalhada, na Figura 2 é mostrado as diferentes etapas do teste colorimétrico, em que (A) refere-se às nanoparticulas de ouro modificação com MUA, (B) refere-se ao EDC/NHS e anticorpo, (C) refere-se à amostra positiva do CDV e (D) à amostra negativa.

[055] Desse modo, os dados colorimétricos demonstraram que o presente kit é altamente sensível para detecção do CDV e pode distinguir das outras proteínas.

[056] Vale ressaltar que a análise de uma amostra leva menos de 10 segundos. Logo essa ferramenta irá ajudar o médico veterinário a confirmar ou negar a presença do vírus CDV em cães durante uma consulta, sem a necessidade da espera de 15 dias para uma análise normalmente realizando em laboratórios especializados e a um custo atual de menos de 1 dólar por amostra. - Sensibilidade do Kit: [057] A capacidade do conjugado das nanoparticulas de ouro com os anticorpos se ligarem especificamente ao antígeno foi realizada através da monitorização da mudança nas medidas de LSPR pela ligação dos anticorpos em diferentes concentrações de CC.

[058] A sensibilidade da metodologia foi determinada conforme visto nas figuras 3A-B, onde foi testada a eficiência da detecção do CDV em diferentes concentrações. Uma representação gráfica das alterações na absorbância como em função da concentração do anti-IgG mostrada na figura 3A indica que o limite de detecção para o CDV foi de 0,7 ng mL-1, indicando no gráfico que quanto mais concentrada estiver a amostra, maior será seu comprimento de onda e menor sua absorbância. Esta sensibilidade é melhor do que a encontrada pelas técnicas de rotina em laboratório para CDV.

[059] Assim, na figura 3A são mostradas cinco variações das concentrações de CDV, em que a linha rosa refere-se à amostra de CDV diluida em 1 mL de 100,0 pg L_1 em 10 mM PBS para 0,0 mL PBS; a linha preta para 20,0 mL PBS; a linha vermelha para 50,0 mL PBS; a linha verde para 100,0 mL PBS; e a linha azul para 150,0 mL PBS.

[060] Já a figura 3B mostra graficamente a faixa linear da concentração do CDV, bem como o ajuste linear do gráfico. Esta observação é devido ao fato de que o CDV é muito maior em tamanho (100 nm) do que as nanoparticulas de ouro modificadas pelo anticorpo anti-CDV (88 nm) e diversos anticorpo conjugados as nanoparticulas de ouro estão ligado à superfície do CDV.

[061] Vale ressaltar que vírus semelhantes precisam ser seriamente considerados, porque eles podem dar uma resposta positiva falsa. Portanto, foram investigados os efeitos do paramixovírus ofídico (OPMV) (1), parvovírus canino(2), Vírus do sarampo (3) e vírus de Newcastle (4), sobre a resposta do imunossensor (Figura 2) . Em todos os vírus testados, não houve alteração de cor para o amarelo que indica a presença do vírus CDV. Estes resultados demonstram que a metodologia foi seletiva para o CDV na presença de outros vírus semelhantes. - Viabilidade do Kit: [062] Para avaliar a viabilidade da metodologia utilizando nanopartícuias de ouro marcadas com anticorpos, os resultados foram comparados com a metodologia de RT-qPCR utilizando 14 amostras de urinas positivas. Os acertos médios positivos estão na faixa de 98,0%, o que indica ainda que o imunossensor desenvolvido possuí excelente especificidade e o seu desempenho atende aos requisitos de uma determinação sensível ao CDV em amostras de urinas.

[063] Além disso, o teste provoca a mudança de cor no kit quando na presença da amostra contendo o vírus. Logo é um método colorimétrico que não necessita de pessoa altamente treinada para efetuar tal procedimento [064] Portanto, o presente kit colorimétrico possui o potencial de fornecer informações rápidas e valiosas sobre a presença do CDV sendo uma alternativa para análises demoradas e de alto custo.

[065] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Processo de obtenção dos reagentes de um kit colorimétrico para a detecção de doenças virais, preferencialmente do virus da cinomose canina caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) Obtenção de nanopartículas de ouro; b) Obtenção da solução de ácido 11- mercaptoundecánoico (MUA); c) Obtenção da solução colorimétrica; e d) Adição do anticorpo.

2. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "a", primeiramente, ser preparada uma solução de sal de ouro de 0,001 a 0,10 g, preferencialmente 0,004 g de HAuC14 em 1 a 1000 mL, preferencialmente 10 mL de água.

3. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de, na etapa "a", posteriormente, ser preparado uma solução de 0,01 a 1,0 g, preferencialmente 0,1 g de citrato de sódio em 1 a 1000 mL, preferencialmente 10 mL de água.

4. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de, na etapa "a", subsequentemente, ser misturado de 0,1 a 100 mL, preferencialmente 3,2 mL da solução de sal de ouro obtida em 0,1 a 100 mL, preferencialmente 16,7 mL de água.

5. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a mistura ser realizada por agitação mecânica utilizando uma barra magnética em rotação que varia de 100 a 300 rpm, sob aquecimento até o ponto de ebulição.

6. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de subsequentemente, ainda na etapa "a", ser adicionado de 0,1 a 100 mL, preferencialmente 2 mL da solução de citrato de sódio, sob agitação de 300 rpm e sob aquecimento que varia de 100 a 200 °C, até a mudança de cor da solução para o vermelho.

7. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a solução de nanoparticulas de ouro obtida na etapa "a" ser resfriada e guardada à temperatura ambiente.

8. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "b", primeiramente, ser preparado uma solução de ácido 11-mercaptoundecánoico (MUA), em que dissolve-se de 0,01 a 2,0 g, preferencialmente 0,02 g de MUA em 10 a 1000 pL, preferencialmente 100 pL de etanol.

9. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de, posteriormente, ser misturado de 0,5 a 1000 pL, preferencialmente 5 pL de solução de MUA obtida, em 0,1 a 100 mL, preferencialmente em 5,0 mL de etanol.

10. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "c", ser adicionado de 0,5 a 1000 pL, preferencialmente 200 pL da solução obtida na etapa "b" em recipiente adequado juntamente com 0,1 a 100 mL, preferencialmente 2 mL da solução de nanoparticulas de ouro obtida na etapa "a".

11. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o preparo ser realizado sob agitação que varia de 100 a 300 rpm entre 40 e 180 minutos , preferencialmente 60 minutos.

12. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de, na etapa "c", ser adicionado à solução obtida anteriormente, 0,5 a 1000 pL, preferencialmente 200 pL da mistura de 1:1 de 0,4 mol L_1 de l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e 0,1 mol L-1 de N-Hidroxisuccinimida, sob agitação que varia de 100 a 300 rpm por pelo menos 60 minutos.

13. Processo de obtenção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "d", ser adicionado à solução obtida anteriormente, 10 a 1000 pL, preferencialmente 100 pL de anticorpo de acordo com a doença virótica investigada, mais preferencialmente 100 pL de CVD para a detecção do virus da cinomose canina.

14. Kit colorimétrico para a detecção de doenças virais caracterizado pelo fato de compreender um recipiente adequado com volume de até 2 mL, preferencialmente um tubo cônico de plástico, contendo uma única solução de reagentes obtidos conforme processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Kit colorimétrico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a solução de reagentes ser uma mistura de: - nanoparticulas de ouro; - citrato de sódio; - MU A; - EDC/NHS; e - anticorpo.

16. Kit colorimétrico, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de, em uma modalidade preferida, ser para a detecção do vírus da cinomose canina, em que o anticorpo utilizado é o CVD.

17. Kit colorimétrico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de provocar mudança de cor de visualização a olho nu ao adicionar uma amostra de urina contendo o vírus, em que se positivo passa para a cor amarela e negativo mantém a cor avermelhada.