BR102015017256B1 - COMPOSITION OF LIGNOCELLULOLYTIC ENZYMES AND ENZYME CONVERSION METHOD - Google Patents
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Abstract
COMPOSIÇÃO DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS, MÉTODOS DE CONVERSÃO ENZIMÁTICA E VETOR DE EXPRESSÃO DE UMA SUPERÓXIDO DISMUTASE. A presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignocelulolíticas que compreende uma superóxido dismutase, a um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase. A presente invenção tem aplicação nos processos de aproveitamento do material lignocelulósico, tais corno na produção de etanol de segunda geração ou de outros subprodutos de alto valor agregado.COMPOSITION OF LIGNOCELLULOLYTIC ENZYMES, ENZYME CONVERSION METHODS AND EXPRESSION VECTOR OF A SUPEROXIDE DISMUTASE. The present invention relates to a composition of lignocellulolytic enzymes comprising a superoxide dismutase, to a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and to an expression vector of said superoxide dismutase. The present invention has application in processes for using lignocellulosic material, such as in the production of second generation ethanol or other by-products with high added value.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma composição enzimas lignocelulolíticas, a um método de conversão enzimática e a um vetor de expressão de uma superóxido dismutase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignocelulolíticas que compreende uma superóxido dismutase, um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase.[001] The present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition, an enzymatic conversion method and a superoxide dismutase expression vector. More specifically, the present invention relates to a composition of lignocellulolytic enzymes comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide dismutase.
[002] A presente invenção tem aplicação nos processos de aproveitamento e conversão de materiais lignocelulósicos para a produção de etanol de segunda geração ou de outros subprodutos de alto valor agregado.[002] The present invention has application in the processes of using and converting lignocellulosic materials for the production of second generation ethanol or other by-products with high added value.
[003] Os materiais lignocelulósicos são compostos basicamente por cadeias de celulose (polissacarídeo formado por unidades de glicose ligadas através de ligações ß-1,4-glicosidicas), recobertas por hemiceluloses (polissacarídeos ramificados formados principalmente por D-xilose, com pequenas quantidades de L- arabinose, D-glicose, D-manose, D-galactose, ácido glucurônico e ácido manurônico) e ligninas (redes poliméricas formadas por unidades fenilpropano interligadas).[003] Lignocellulosic materials are basically composed of cellulose chains (polysaccharide formed by glucose units linked through ß-1,4-glycosidic bonds), covered by hemicelluloses (branched polysaccharides formed mainly by D-xylose, with small amounts of L- arabinose, D-glucose, D-mannose, D-galactose, glucuronic acid and mannuronic acid) and lignins (polymeric networks formed by interconnected phenylpropane units).
[004] Nos processos de aproveitamento da biomassa vegetal, realiza-se urna etapa de prê-tratamento com o objetivo de desestruturar o complexo llgnina e/ou hemicelulose. Após o pré— tratamento, as cadeias de celulose e de hemicelulose tornam-se mais suscetíveis aos efeitos da hidrólise, sendo convertidas em um licor rico em açúcares monoméricps que podem, posteriormente, passar por uma etapa de fermentação microbiana a etanol e a outros subprodutos de alto valor agregado.[004] In the processes for using plant biomass, a pre-treatment step is carried out with the aim of disrupting the llgnin and/or hemicellulose complex. After pretreatment, the cellulose and hemicellulose chains become more susceptible to the effects of hydrolysis, being converted into a liquor rich in monomeric sugars that can subsequently undergo a stage of microbial fermentation to ethanol and other byproducts. high added value.
[005] Os processos de hidrólise podem ser catalisados por ácido ou por enzimas. No caso da hidrólise catalisada por ácido, seu ambiente corrosivo demanda o uso de reatores construídos com materiais especiais. Além disso, produtos de degradação como fragmentos de lignina, furfural e ácido acético, atuam como inibidores dá fermentação microbiana e devem ser removidos previamente a essa etapa. Desta forma, o processo torna-se oneroso não só do ponto de vista econômico, mas também do ponto de vista técnico, dada a necessidade de um maior tempo de operação e uma possível redução de rendimento de produto final em virtude das etapas adicionais de operação. Com isso, a viabilização dos processos de hidrólise catalisada por ácidos torna-se mais difícil do ponto de vista da prática industrial.[005] Hydrolysis processes can be catalyzed by acid or enzymes. In the case of acid-catalyzed hydrolysis, its corrosive environment demands the use of reactors built with special materials. Furthermore, degradation products such as lignin fragments, furfural and acetic acid act as inhibitors of microbial fermentation and must be removed prior to this step. In this way, the process becomes costly not only from an economic point of view, but also from a technical point of view, given the need for longer operation time and a possible reduction in the final product yield due to the additional operation steps. . As a result, the feasibility of acid-catalyzed hydrolysis processes becomes more difficult from the point of view of industrial practice.
[006] Em relação à hidrólise catalisada por ácidos, a hidrólise enzimãtica apresenta as vantagens de não necessitar do uso de materiais anticorrosivos e de nâo promover a formação de compostos inibitórios da fermentação microbiana. No entanto, como os materiais 1ignocelulósicos são de composição extremamente ligno.ce lulol iticas para uma quebra efetiva dos diferentes polissacarídeos em açúcares monoméricos.[006] In relation to acid-catalyzed hydrolysis, enzymatic hydrolysis has the advantages of not requiring the use of anticorrosive materials and of not promoting the formation of compounds that inhibit microbial fermentation. However, as 1ignocellulosic materials are of extremely ligno.ce lulol itic composition for an effective breakdown of the different polysaccharides into monomeric sugars.
[007] Na procura por composições enzimáticas cada vez mais eficientes, bactérias e fungos decompositores da madeira figuram como boas fontes de enzimas lignocelulôsicas. Como exemplo, o documento ÜS20130337503, de 29/05/2013, que trata-se de um método de hidrólise de material lignocelulósico com uma composição compreendendo todas as celulases do fungo Triçhoderína reesei suplementada com uma beta-glicosidase.[007] In the search for increasingly efficient enzyme compositions, wood-decomposing bacteria and fungi appear as good sources of lignocellulosic enzymes. As an example, document ÜS20130337503, dated 05/29/2013, which is a method of hydrolysis of lignocellulosic material with a composition comprising all cellulases from the fungus Triçhoderína reesei supplemented with a beta-glucosidase.
[008] Os cupins, insetos da ordem laoptera,também são tidos como boas fontes de enzimas lignocelulósicas por se alimentarem de todo tipo de materiais que contenham celulose, uma vez que o digestõma dos cupins pode degradar até 90% do material lignocélulósico ingerido. 0 documento WO2013126230, de 11/02/2013, apresenta um sistema para gerar um produto fermentescivel a partir de material vegetal lignificado, em que dito sistema apresenta urna série de enzimas compreendendo., ao menos, duas enzimas cooperativas, Estas enzimas são obtidas a partir do cupim Reticulitermes flavípes e de protozoários ditos simbiontes intestinais. Ainda nesta mesma linha, o documento W0201Q117843, depositado em 31/03/2010, visa à proteção de um método de conversão de um material vegetal lignificado a um produto fermentescível compreendendo as etapas de (i) obtenção de uma série de polipeptídeos isolados de um cupim e (ii) incubação da série de polipeptideos com o material vegetal lignificado para a produção do produto fermentescivel.[008] Termites, insects of the Laoptera order, are also considered good sources of lignocellulosic enzymes as they feed on all types of materials that contain cellulose, since the termite digestion can degrade up to 90% of the lignocellulosic material ingested. 0 document WO2013126230, dated 11/02/2013, presents a system for generating a fermentable product from lignified plant material, in which said system presents a series of enzymes comprising at least two cooperative enzymes. These enzymes are obtained from from the termite Reticulitermes flavipes and protozoa known as intestinal symbionts. Still along the same lines, document W0201Q117843, deposited on 03/31/2010, aims to protect a method of converting a lignified plant material to a fermentable product comprising the steps of (i) obtaining a series of polypeptides isolated from a termite and (ii) incubation of the series of polypeptides with lignified plant material to produce the fermentable product.
[009] É fato que bactérias, fungos e cupins produzem complexos enzimáticos relativamente completos, porém nem sempre todas as atividades necessárias estão presentes nestes complexos para efeitos de degradação do material lignocelulósico com a finalidade de aproveitamento industrial, o que pode levar à necessidade de suas suplementações com outras enzimas e/ou substâncias com atividades complementares. Mesta complementação, a resistência a temperaturas superiores à ambiente e a manutenção da atividade durante o maior período possível do processo de hidrólise são características fundamentais para a incorporação de novas enzimas no processo atual, de forma a gerar avanços técnicos na eficiência de catálise,[009] It is a fact that bacteria, fungi and termites produce relatively complete enzymatic complexes, however, not always all the necessary activities are present in these complexes for the purpose of degrading the lignocellulosic material for the purpose of industrial use, which may lead to the need for their supplementations with other enzymes and/or substances with complementary activities. This complementation, resistance to temperatures higher than ambient and maintenance of activity for the longest possible period of the hydrolysis process are fundamental characteristics for the incorporation of new enzymes in the current process, in order to generate technical advances in catalysis efficiency,
[0010] As composições enzimáticas atualmente disponíveis apresentam,, em geral, enzimas responsáveis pela degradação da cadeia principal (celulases e/ou hemicelulases) e, opcionalmente, enzimas com atividade auxiliar que, por exemplo, removam grupos laterais.[0010] Currently available enzyme compositions generally contain enzymes responsible for degradation of the main chain (cellulases and/or hemicellulases) and, optionally, enzymes with auxiliary activity that, for example, remove side groups.
[0011] Aguiar e Ferraz {Quim. Nova, Vol. 34, No. 10, 17291738, 2011} descrevem que, dentre as hemicelulases, as xilanases rompem ligações entre unidades mõnomérlcas de xilose, enquanto as rtiananases atuam sobre ligações entre moléculas de manose, respectivamente. Outras enzimas importantes são as a- glicuronidases e acetil-esterases, que atuam sobre ligações de ácidos urônicos e grupos acetila com moléculas de açúcares, respectivamente.[0011] Aguiar and Ferraz {Quim. Nova, Vol. 34, No. 10, 17291738, 2011} describe that, among the hemicellulases, xylanases break bonds between monomeric xylose units, while rtiananases act on bonds between mannose molecules, respectively. Other important enzymes are a-glucuronidases and acetyl esterases, which act on bonds of uronic acids and acetyl groups with sugar molecules, respectively.
[0012] Com relação às celulases., as çelobiõhidrolases e as endoglucanases atuam na liberação de moléculas de celobiosé e celo- oligcssacarideos de tamanhos variados respectivamente. As beta- glicosidases, que hidrolisam celo-oligossacarideos a glicose, formam um grupo finalizador da hidrólise. Ainda dentro das composições, enzimas que realizam reações de oxido-redução, como a celobiose-desidrogenase, possuem o papel de oxidar vários açúcares. Canella et al. (Biotechnology for Biofuels 2012, 5:26 doi:10.1186/1754-6834-5-26) descrevem que enzimas oxidantes tais como AA9 aumentam o rendimento global de preparações de enzimas hidrolíticas. Segundo os autores, a recente descoberta de proteínas acessórias aumentou a eficiência econômica e técnica de processamento de celulose em bioetanol.[0012] With regard to cellulases, cellobiohydrolases and endoglucanases act in the release of cellobiose and cellooligosaccharide molecules of varying sizes respectively. Beta-glucosidases, which hydrolyze cello-oligosaccharides to glucose, form a hydrolysis terminating group. Still within the compositions, enzymes that carry out oxidation-reduction reactions, such as cellobiose-dehydrogenase, have the role of oxidizing various sugars. Canella et al. (Biotechnology for Biofuels 2012, 5:26 doi:10.1186/1754-6834-5-26) describe that oxidizing enzymes such as AA9 increase the overall yield of hydrolytic enzyme preparations. According to the authors, the recent discovery of accessory proteins has increased the economic and technical efficiency of processing cellulose into bioethanol.
[0013] Como aceptor de elétrons, para fechar o seu ciclo catalítico, a celobiose-desidrogenase pode utilizar quinonas, citocromps, radicais orgânicos, 0; molecular, ions Fe3+ e Cu-t Ao reduzir Fe31 a FeSí, a celobiose-desidrogenase pode gerar radicais hidroxíla via reação de Fenton, os quais podem despolimerizar polissacarídeos e modificar a estrutura da lignina. A própria celobiose-desidrogenase ou outras enzimas oxidativas geram o H;-Õ2 envolvido na reação.[0013] As an electron acceptor, to close its catalytic cycle, cellobiose dehydrogenase can use quinones, cytochromes, organic radicals, 0; molecular, Fe3+ and Cu-t ions When reducing Fe31 to FeSí, cellobiose dehydrogenase can generate hydroxyl radicals via the Fenton reaction, which can depolymerize polysaccharides and modify the structure of lignin. Cellobiose dehydrogenase itself or other oxidative enzymes generate the H;-Õ2 involved in the reaction.
[0014] Estratégias de oxido-redução para promover ò aumento da hidrólise do material lignocelulósicõ são encontradas no estado da técnica. Estas estratégias estão relacionadas ao emprego de agentes redox químicos (ions metálicos), enzimàticos (oxirredutases), ou ambos. O documento WO20121915.1, de 0.5/08/2011, apresenta um método de degradação de um polissãcarideo. preferencialmente celulose ou quitina, caracterizado por compreender o contato do polissacarideo com Uma ou mais enzimas óxido-hidroliticas na presença de pelo menos um agente redutor e um ion metálico divalente adicionados ao meio reacional. Já o documento US20030186036, de 05/02/2003, visa à proteção de um método não enzimático de oxidação de um material lignocelulósico usando radicais hidroxila formados via reação de Fenton. Este método envolve a geração de espécies reativas de oxigênio pelo contato de um quelante redox com um. oxidante que contenha oxigênio e um metal de transição, preferencialmente ferro pu cobre. Uma desvantagem nestes tipos de metodologias é o fato de que pode haver a necessidade dé tratamento dos resíduos gerados antes do descarte devido à presença dos agentes redox químicos, que podem ocasionar um risco ambiental quando não descartados corretamente.[0014] Oxidation-reduction strategies to promote increased hydrolysis of lignocellulosic material are found in the prior art. These strategies are related to the use of chemical redox agents (metal ions), enzymatic agents (oxidoreductases), or both. Document WO20121915.1, dated 05/08/2011, presents a method of degradation of a polysaccharide. preferably cellulose or chitin, characterized in that it comprises the contact of the polysaccharide with one or more oxide-hydrolytic enzymes in the presence of at least one reducing agent and one divalent metal ion added to the reaction medium. Document US20030186036, dated 02/05/2003, aims to protect a non-enzymatic method of oxidizing a lignocellulosic material using hydroxyl radicals formed via the Fenton reaction. This method involves the generation of reactive oxygen species by contacting a redox chelator with a. oxidant that contains oxygen and a transition metal, preferably iron or copper. A disadvantage in these types of methodologies is the fact that there may be a need to treat the waste generated before disposal due to the presence of chemical redox agents, which can cause an environmental risk when not disposed of correctly.
[0015] Em uma abordagem puramente enzimática, o documenta WO2.01268236, de 16/11/2011, apresenta uma gama de enzimas oxi- redutases fúngicas, um método de degradação de material lignocelulósico com ditas oxi-redutases e composições genéricas que as compreendem. É sabido, no entanto, que nem sempre as enzimas atuam de forma sinérgica: em alguns casos, a adição de uma nova enzima a uma composição estabelecida pode, inclusive, reduzir a atividade inicial da composição, o que não é vantajoso do ponto de vista da eficiência degradação do material lignocelulósico.[0015] In a purely enzymatic approach, document WO2.01268236, dated 16/11/2011, presents a range of fungal oxi-reductase enzymes, a method of degradation of lignocellulosic material with said oxi-reductases and generic compositions comprising them . It is known, however, that enzymes do not always act synergistically: in some cases, the addition of a new enzyme to an established composition can even reduce the initial activity of the composition, which is not advantageous from the point of view. efficiency degradation of lignocellulosic material.
[0016] De maneira semelhante, o documento US2010159509, de 15/12/2009, versa sobre métodos de degradação ou conversão de um material lignocelulósico na presença de üm polipõptideo com atividade peroxidase ou composição que compreenda esta enzima. 0 próprio documento descreve que o termo "atividade peroxidase"é definido como a atividade da enzima que converte um peróxido, por exemplo o peróxido de hidrogênio, em espécies menos oxidativas, como a água. 0 polipeptideo que possui "atividade peroxidase", segundo este mesmo documento, abrange uma enzima de decomposição de peróxido, definido como sendo da classe E.C. number 1.11.1.x. Opc.ionaImente, a composição pode apresentar enzimas que aumentem sua atividade lignocelulolítica, podendo a dita composição ser adicionada de enzimas "geradoras de peróxido" tais como, dentre uma lista de exemplos, superóxidos dismutases (classe EC 1.15.1.1). Novamente, cabe ressaltar que, não necessariamente, qualquer enzima adicionada apresentará efeito sinérgico e estabilidade em uma composição nas condições de uso, sendo essas características necessárias para o avanço da técnica de hidrólise enzimática. Ainda nesse sentido, destaca-se que o grande gargalo atual na plena viabilização emprego de métodos puramente enzimáticos trata-se de uma limitação técnico-económica: ao mesmo tempo em que a adição de múltiplas enzimas a uma composição pode não torná-la tecnicamente mais eficaz, a elevação do seu custo devido a essa multiplicidade torna-a desvantajosa do ponto de vista econômico da aplicação industrial. Portanto, carece-se de composições que possuam um conjunto enzimático capaz de fechar o ciclo da hidrólise de biomassas vegetais com eficácia ampliada, mantendo sua atividade na temperatura do processo durante o maior periodo e com o minimo de carga enzimática possíveis.[0016] In a similar way, document US2010159509, dated 15/12/2009, deals with methods of degradation or conversion of a lignocellulosic material in the presence of a polypeptide with peroxidase activity or a composition that comprises this enzyme. The document itself describes that the term "peroxidase activity" is defined as the activity of the enzyme that converts a peroxide, for example hydrogen peroxide, into less oxidative species, such as water. The polypeptide that has "peroxidase activity", according to this same document, encompasses a peroxide decomposition enzyme, defined as being of class E.C. number 1.11.1.x. Optionally, the composition may present enzymes that increase its lignocellulolytic activity, and said composition may be added with "peroxide-generating" enzymes such as, among a list of examples, superoxide dismutases (EC class 1.15.1.1). Again, it is worth highlighting that, not necessarily, any added enzyme will present a synergistic effect and stability in a composition under the conditions of use, these characteristics being necessary for the advancement of the enzymatic hydrolysis technique. Still in this sense, it is highlighted that the current major bottleneck in fully enabling the use of purely enzymatic methods is a technical-economic limitation: at the same time that the addition of multiple enzymes to a composition may not make it technically more effective, the increase in its cost due to this multiplicity makes it disadvantageous from the economic point of view of industrial application. Therefore, there is a lack of compositions that have an enzymatic set capable of closing the hydrolysis cycle of plant biomass with increased effectiveness, maintaining its activity at the process temperature for the longest period and with the minimum possible enzymatic load.
[0017] Memais, alguns métodos de pré-tratamento de materiais lignoeelulósicos, tais como as tratamentos à vapor com súbita descompressão (explosão a vapor) , fazem com que uma quantidade bastante substancial de lignina remanescente persista no meio em que a etapa de hidrólise é realizada. É bastante conhecido pelo estado da técnica que a lignina possui afinidade pelas enzimas lignoceluloliticas, em um fenômeno designado como "adsorçao improdutiva". Neste fenômeno, as enzimas lignoceluloliticas sao adsorvidas irreversivelmente, tornando-as indisponíveis para a hidrólise enzimática. Sendo assim, outro problema técnico a ser transposto é a constituição de composições de enzimas lignoceluloliticas com eficiência aumentada e que viabilize a hidrólise das cadeias de celulose e de hemicelulose mesmo na presença de lignina remanescente.[0017] Furthermore, some methods of pre-treatment of lignocellulosic materials, such as steam treatments with sudden decompression (steam explosion), cause a very substantial amount of remaining lignin to persist in the medium in which the hydrolysis step is carried out. carried out. It is well known from the state of the art that lignin has affinity for lignocellulolytic enzymes, in a phenomenon known as "unproductive adsorption". In this phenomenon, lignocellulolytic enzymes are irreversibly adsorbed, making them unavailable for enzymatic hydrolysis. Therefore, another technical problem to be overcome is the creation of lignocellulolytic enzyme compositions with increased efficiency and that enable the hydrolysis of cellulose and hemicellulose chains even in the presence of remaining lignin.
[0018] A presente invenção refere-se a uma composição de enzimas lignoceluloliticas, a um método de conversão enzimática e a um vetor de expressão de uma superóxido dismutase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignoceluloliticas que compreende uma superóxido dismutase, um método de conversão enzimática de material lignoçelu.lósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase.[0018] The present invention relates to a composition of lignocellulolytic enzymes, an enzymatic conversion method and a superoxide dismutase expression vector. More specifically, the present invention relates to a composition of lignocellulolytic enzymes comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide dismutase.
[0019] A composição de enzimas lignoceluloliticas da presente invenção é caracterizada por compreender a superóxido dismutase de sequência definida pela SEQ ID NO: 1 e celulases.[0019] The composition of lignocellulolytic enzymes of the present invention is characterized by comprising superoxide dismutase of the sequence defined by SEQ ID NO: 1 and cellulases.
[0020] Opcionalmente, a composição da presente invenção é caracterizada por compreender proteinas selecionadas dentre hemicelulases, enzimas com atividade auxiliar ou combinações entre ditas proteinas.[0020] Optionally, the composition of the present invention is characterized by comprising proteins selected from hemicellulases, enzymes with auxiliary activity or combinations between said proteins.
[0021] Comparativamente a uma composição base composta por celulases, a composição da presente invenção apresenta atividade aumentada a 30 e a 50oC, com estabilidade superior a 24 h nas condições do processo de conversão enzimática do material lignocelulósico.[0021] Compared to a base composition composed of cellulases, the composition of the present invention presents increased activity at 30 and 50oC, with stability greater than 24 h under the conditions of the enzymatic conversion process of lignocellulosic material.
[0022] O método de conversão enzimática da presente invenção é caracterizado por compreender as etapas de {ijpré- tratamento do material lignocelulósico e (ii) incubação do material lignocelulósico pré-tratado com a composição da presente invenção. O método da presente invenção apresenta a vantagem de permitir ã maior liberação de açúcares monoméricos para a produção de etanol de segunda geração ou de outros subprodutos de valor agregado em relação ao mesmo método executado com a composição base composta por celulases, mesmo quando o pré-tratamento realizado permita um teor substancial de lignina remanescente.[0022] The enzymatic conversion method of the present invention is characterized by comprising the steps of pre-treatment of the lignocellulosic material and (ii) incubation of the pre-treated lignocellulosic material with the composition of the present invention. The method of the present invention has the advantage of allowing greater release of monomeric sugars for the production of second generation ethanol or other value-added by-products in relation to the same method carried out with the base composition composed of cellulases, even when the pre- treatment carried out allows a substantial content of remaining lignin.
[0023] 0 vetor de expressão do presente invento é caracterizado por compreender a sequência definida como SEQ ID NO: 2 ligada de modo operativo ãs sequências promotora e terminadora heterôlogas. A vantagem do vetor do presente invento é o de permitir que a SEQ ID NO: 2 seja expressa heterologamente com uma produtividade adequada da proteína superóxido dismutase definida pela SEQ ID NO: 1 em uma célula hospedeira.[0023] The expression vector of the present invention is characterized by comprising the sequence defined as SEQ ID NO: 2 operatively linked to heterologous promoter and terminator sequences. The advantage of the vector of the present invention is that it allows SEQ ID NO: 2 to be expressed heterologously with an adequate productivity of the superoxide dismutase protein defined by SEQ ID NO: 1 in a host cell.
[0024] A Figura 1 mostra o mapa do vetor pET-26a (Novagen) , que contém entre outros sítios, o promotor T7 [370-386), iniciador de transcrição T7 (369), sequência codificadora para His*Tag (270- 287), sequência codificadora para T7’Tag (207-239), múltiplos sítios de clonagem , dentre eles os sítios Nhel e BamHI, sequência codificadora para His*Tag [140-157), terminado.r T7 (26-72), sequência codificadora para lacl (773-1852), pBR322 origin (3286), sequência codificadora Kan (kanamicina) (3995-4807) e fl origin (4903-5358).[0024] Figure 1 shows the map of the pET-26a vector (Novagen), which contains, among other sites, the T7 promoter [370-386], T7 transcription primer (369), coding sequence for His*Tag (270- 287), coding sequence for T7'Tag (207-239), multiple cloning sites, including the Nhel and BamHI sites, coding sequence for His*Tag [140-157), termina.r T7 (26-72), coding sequence for lacl (773-1852), pBR322 origin (3286), Kan (kanamycin) coding sequence (3995-4807) and fl origin (4903-5358).
[0025] A Figura 2 mostra o percentual de inibição da autOxidãção do pirogalol pela superóxido dismutase de sequência definida como SEQ ID NO: 1 em diferentes concent rações (A) , em diferentes valores de pH (B) e a diferentes temperaturas (C) . Também mostra a atividade de SEQ ID NO: 1 em diferentes temperaturas (15 a 85 °C) por ensaio de riboflavina-azul de nitro tetrazólio em gel nativo (NBT-PAGE) (D) . Halos brancos correspondem a atividade positiva. As análises foram realizadas em triplicate.[0025] Figure 2 shows the percentage of inhibition of pyrogallol autoOxidation by superoxide dismutase of sequence defined as SEQ ID NO: 1 at different concentrations (A), at different pH values (B) and at different temperatures (C) . It also shows the activity of SEQ ID NO: 1 at different temperatures (15 to 85 ° C) by native gel riboflavin-nitro tetrazolium blue assay (NBT-PAGE) (D). White halos correspond to positive activity. Analyzes were performed in triplicate.
[0026] A Figura 3 mostra o grau de sinergismo entre a endo-B-l,4-glicosidase do cupim Coptotermes gestroí (CgEGl) e a superóxido dismutase de sequência definida como SEQ ID NO: 1. No ensaio, 0,5£ de ß -glucana foi utilizada como substrato em tampão fosfata 50 mmol pH 6,0. A reação foi conduzida a 30°C durante 30 min. Um total de 100 ng da CgEGl foi usada em todos os ensaios, enquanto diferentes quantidades da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 foram testadas (100, 500, 750 e 2000 ng) . O grau de sinergismo (GS.) foi calculado como ab/ [a+b), em que ab é o resultado do sinergismo (µmol.mirr1), enquanto que a e b são os resultados das enzimas isoladas..[0026] Figure 3 shows the degree of synergism between endo-B-1,4-glucosidase from the termite Coptotermes gestroí (CgEGl) and superoxide dismutase of sequence defined as SEQ ID NO: 1. In the test, 0.5% of ß -glucan was used as substrate in 50 mmol phosphate buffer pH 6.0. The reaction was carried out at 30°C for 30 min. A total of 100 ng of CgEGl was used in all assays, while different amounts of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 were tested (100, 500, 750 and 2000 ng). The degree of synergism (GS.) was calculated as ab/ [a+b), where ab is the result of synergism (µmol.mirr1), while a and b are the results of the isolated enzymes.
[0027] A Figura 4 representa o comportamento, a 30°C, das composições contendo SEQ ID NO: 1, nas concentrações de 2 e 20 µg, e Celluclast® [Novozymes) a 1 (A] , 5 (B) e 10 FPU (C) . As amostras foram retiradas nos tempos de 1, 3, 6 e 24 horas e os açúcares redutores totais (ART) foram medidos pelo método de DNS (3,5-ácido dinitrosalicilico)e expressos no eixo y do gráfico em gramas por litro. O grau de sinergismo da combinação de duas enzimas (GS) foi calculado como: ART (Celluclast®. + SEQ ID NO: 1) /ART Celluclast®. Não foi detectada a liberação de açúcares redutores totais (ART) após incubação de bagaço de cana explodido não deslignifiçado (BEX) puro ou apenas na presença da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1. Além disso, não houve grau de sinergismo ao se fazer os experimentos com a enzima desnaturada.[0027] Figure 4 represents the behavior, at 30°C, of the compositions containing SEQ ID NO: 1, at concentrations of 2 and 20 µg, and Celluclast® [Novozymes) at 1 (A], 5 (B) and 10 FPU (C). Samples were taken at 1, 3, 6 and 24 hours and total reducing sugars (ART) were measured using the DNS method (3,5-dinitrosalicylic acid) and expressed on the y-axis of the graph in grams per liter. The degree of synergism of the combination of two enzymes (GS) was calculated as: ART (Celluclast®. + SEQ ID NO: 1) /ART Celluclast®. The release of total reducing sugars (ART) was not detected after incubation of non-delignified exploded sugarcane bagasse (BEX) pure or only in the presence of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1. Furthermore, there was no degree of synergism when carrying out the experiments with the denatured enzyme.
[0028] A Figura 5 mostra o comportamento, a 50 °C, da composição contendo Celluclast® e a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 na hidrólise de bagaço de cana explodido não deslignifiçado (BEX). Condições: pH 5,5; 100 mmol tampão Acetato; 2% de BEX, 1 FPU/g BEX de Celluclast® e 1,34 mg/ g BEX de SEQ ID NO: 1 purificada. Agitação: 1000 rpm. Os açúcares redutores totais (ART) foram medidos pelo método de DNS [3,5-ácido dinitrosalicilico)e o tempo de reação foi de 3 e 6 horas.[0028] Figure 5 shows the behavior, at 50 °C, of the composition containing Celluclast® and superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 in the hydrolysis of non-delignified exploded sugarcane bagasse (BEX). Conditions: pH 5.5; 100 mmol Acetate buffer; 2% BEX, 1 FPU/g BEX from Celluclast® and 1.34 mg/g BEX from purified SEQ ID NO: 1. Agitation: 1000 rpm. Total reducing sugars (ART) were measured by the DNS method [3,5-dinitrosalicylic acid) and the reaction time was 3 and 6 hours.
[0029] A presente invenção refere-se a únia composição de enzimas lignoceluloliticas, a um método de conversão enzimática é a um vetor de expressão de uma superóxido dismutase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignoceluloliticas que compreende uma superóxido dismutase, um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase.[0029] The present invention relates to a single composition of lignocellulolytic enzymes, a method of enzymatic conversion and a superoxide dismutase expression vector. More specifically, the present invention relates to a composition of lignocellulolytic enzymes comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide dismutase.
[0030] A composição de enzimas lignoceluloliticas da presente invenção é caracterizada por compreender a superóxido dismutase de sequênica definida como SEQ ID NO: 1 e celulases.[0030] The composition of lignocellulolytic enzymes of the present invention is characterized by comprising superoxide dismutase of the sequence defined as SEQ ID NO: 1 and cellulases.
[0031] Entende-se "celulases" por enzimas responsáveis pela degradação da celulose, tais coroo as exoglucanases, as endo glucanases e as beta-glucosidases. As celulases da composição do presente invento são caracterizadas por serem selecionadas dentre o grupo que compreende exoglucanases, endoglucanases, betaglucosidases ou combinações entre elas.[0031] "Cellulases" are understood as enzymes responsible for the degradation of cellulose, such as exoglucanases, endoglucanases and beta-glucosidases. The cellulases of the composition of the present invention are characterized by being selected from the group comprising exoglucanases, endoglucanases, beta-glucosidases or combinations thereof.
[0032] Ainda, as celulases da composição do presente invento podem ser provenientes de bactérias, fungos ou insetos, porém não se restringindo a esses, sendo essas celulases de origem natural ou heteróloga, com ou sem mutações, provenientes ou não de evolução dirigida.[0032] Furthermore, the cellulases in the composition of the present invention can come from bacteria, fungi or insects, but are not restricted to these, with these cellulases being of natural or heterologous origin, with or without mutations, whether or not arising from directed evolution.
[0033] Opcionalmente, a composição da presente invenção é caracterizada por compreender, também, proteínas selecionadas dentre hemicelulases, enzimas com atividade auxiliar ou combinações entre ditas proteínas.[0033] Optionally, the composition of the present invention is characterized by also comprising proteins selected from hemicellulases, enzymes with auxiliary activity or combinations between said proteins.
[0034] Entende-Se "hemicelulases" por- -enzimas que atuam quebrando as ligações químicas nos diferentes tipos de hemi celulose, tais como as xilanasês, ß-xilos idases, endoarabinases, arabinofuran.osidas.es, mannanases, ß-manosidases, xiloglucanases, pectinases e ß-gliicutonidases, porém não se restringindo a essas, e suas combinações.[0034] "hemicelulases" are understood as enzymes that act by breaking the chemical bonds in different types of hemicellulose, such as xylanases, ß-xylosidases, endoarabinases, arabinofuran.osidas.es, mannanases, ß-mannosidases, xyloglucanases, pectinases and ß-glucutonidases, but not restricted to these, and their combinations.
[0035] Entende-se "enzimas de atividade auxiliar" por enzimas classificadas dentro da família "Auxiliary Activity" no banco de dados CAZY (http://www.cazy.org/), dentre estas as AA3, AA9 e AA10.[0035] "Auxiliary activity enzymes" are understood as enzymes classified within the "Auxiliary Activity" family in the CAZY database (http://www.cazy.org/), including AA3, AA9 and AA10.
[0036] As hemicelulases e as enzimas de atividade auxiliar da composição da presente invenção também podem ser provenientes de bactérias, fungos ou insetos, porém não se restringindo a esses, sendo de origem natural ou heteróloga, com ou sem mutações, provenientes ou não de evolução dirigida.[0036] Hemicellulases and enzymes with auxiliary activity in the composition of the present invention can also come from bacteria, fungi or insects, but are not restricted to these, being of natural or heterologous origin, with or without mutations, whether or not originating from directed evolution.
[0037] o métodó de conversão enzimática da presente invenção é caracterizado por compreender as etapas de: (i) pré-tratamento do material lignocelulósico, e (ii) incubação do material lignocelulósico pré-tratado com a composição da presente invenção.[0037] the enzymatic conversion method of the present invention is characterized by comprising the steps of: (i) pre-treatment of the lignocellulosic material, and (ii) incubation of the pre-treated lignocellulosic material with the composition of the present invention.
[0038] O material, lignocelulósico pode ser pré-tratado de acordo com quaisquer métodos constantes no estado da técnica. Preferencialmente, o material lignocelulósico é pré-tratado por explosão a vapor.[0038] The lignocellulosic material can be pretreated according to any methods contained in the prior art. Preferably, the lignocellulosic material is pretreated by steam explosion.
[0039] Õ Vetor de expressão da presente invenção, que eontém a sequência de origem de replicação, sequência marcadora de seleção e sítios múltiplos de clonagem, é caracterizado por compreender a sequência definida como SEQ ID NO: 2 ligada de modo operativo às sequências promotora e terminadora heterólogas. Em uma configuração da presente invenção, o vetor de expressão é caracterizado por compreender a sequência SEQ ID NO: 2 inserida entre os sítios de clonagem Nhel e BamHI do vetor que contém o promotor T7 (370-386), iniciador de transcrição 17 (369), sequência codificadora para His*Tag (270-287), sequência codificadora para T7»Tag (207-239), múltiplos sítios de clonagem , dentre eles os sítios Nhel e BamHI, sequência codificadora para His*Tag (140-157), terminador 17 (26-72), sequência codificadora para lacl (773-1852), origem de replicação pBR322 origin (3286), sequência codificadora Kan (kanamicina) (3995-4807) e fl origin (4903-5358), tal qual apresentado na Figura 1.[0039] The expression vector of the present invention, which contains the origin of replication sequence, selection marker sequence and multiple cloning sites, is characterized by comprising the sequence defined as SEQ ID NO: 2 operatively linked to the promoter sequences and heterologous terminator. In one embodiment of the present invention, the expression vector is characterized by comprising the sequence SEQ ID NO: 2 inserted between the Nhel and BamHI cloning sites of the vector containing the T7 promoter (370-386), transcription primer 17 (369 ), coding sequence for His*Tag (270-287), coding sequence for T7»Tag (207-239), multiple cloning sites, including the Nhel and BamHI sites, coding sequence for His*Tag (140-157) , terminator 17 (26-72), coding sequence for lacl (773-1852), origin of replication pBR322 origin (3286), Kan (kanamycin) coding sequence (3995-4807) and fl origin (4903-5358), as presented in Figure 1.
[0040] O vetor de expressão da presente invenção é passível de expressão heteróloga em células hospedeiras, preferencialmente em células de E. coll.[0040] The expression vector of the present invention is capable of heterologous expression in host cells, preferably in E. coll cells.
[0041] EXEMPLO:[0041] EXAMPLE:
[0042] A sequência SEQ ID NO: 2 foi inserida entre os sítios Nhel e BamHI do vetor pET-28a conforme instruções do fabricante (Novagen, Figura 1), permitindo a inserção de um Taq 6X-His na posição N-terminal, gerando o vetor pET28a /SEQ ID NO: 2. Após clonagem e sequenciamento, a caracterização da sequência foi realizada nas plataformas Protparam, Signal? e SectetomõP.[0042] The sequence SEQ ID NO: 2 was inserted between the Nhel and BamHI sites of the pET-28a vector according to the manufacturer's instructions (Novagen, Figure 1), allowing the insertion of a 6X-His Taq in the N-terminal position, generating the vector pET28a /SEQ ID NO: 2. After cloning and sequencing, sequence characterization was carried out on the Protparam, Signal? and SectetomõP.
[0043] Células competentes de E. coli ArticExpress (Movagen) foram transformadas com p vetor pET28a /SEQ ID NO: 2 e plaqueadas em meio LB sólido contendo kanamicina (50 µg mg L) . As células de uma colônia isolada foram cultivadas em meio LB- kanamicina liquido, com a kanamicina na mesma concentração do meio sólido, por 16 h a 37°C e 200 rpm. Em seguida, a cultura foi diluída em SOO mL de meio LB-kanamicina líquido e crescida a 3G°C, por 4 h, a 200 rpm. Apôs 1 h de aclimatação, MnClí e CuCla a 2,5 mmol L’1 cada, foram adicionados ao meio e a expressão da enzima recombinante foi induzida pela adição de IPTG 1 mmol L"1. Após 24 h, as células foram, centrifugadas a 8500 g.[0043] Competent E. coli ArticExpress cells (Movagen) were transformed with pET28a vector / SEQ ID NO: 2 and plated on solid LB medium containing kanamycin (50 µg mg L). Cells from an isolated colony were cultivated in liquid LB-kanamycin medium, with kanamycin at the same concentration as the solid medium, for 16 h at 37°C and 200 rpm. Then, the culture was diluted in SOO mL of liquid LB-kanamycin medium and grown at 3°C for 4 h at 200 rpm. After 1 h of acclimation, MnClí and CuCla at 2.5 mmol L'1 each were added to the medium and the expression of the recombinant enzyme was induced by the addition of IPTG 1 mmol L"1. After 24 h, the cells were centrifuged at 8500 g.
[0044] As células foram ressuspendidas em tampão de lise (fosfato de sódio 20 mmol L"1pH 7,5, NaCl 500 mmol L’1, imidaíol 5 mmol L'1, egg lysozyme 80 g mL-1 e PMSF 5 mmol L-!í e, em seguida, rompidas em banho de gelo em um processador ultrassónico. A proteína expressa presente nó sobrenadante (superóxido dismutase, definida como SEQ 10 NO; 1) foi purificada por cromatografia, utilizando-se um sistema ÃKTA FPLC (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) e uma coluna HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare) carregada com Ni-’, seguida de uma coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). O rendimento desta purificação foi de aproximadamente 8 mg de superóxido dismutase por mL.[0044] The cells were resuspended in lysis buffer (sodium phosphate 20 mmol L"1pH 7.5, NaCl 500 mmol L'1, imidayl 5 mmol L'1, egg lysozyme 80 g mL-1 and PMSF 5 mmol L -!í and then disrupted in an ice bath in an ultrasonic processor. The protein expressed in this supernatant (superoxide dismutase, defined as SEQ 10 NO; 1) was purified by chromatography using an ÃKTA FPLC system (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) and a HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare) loaded with Ni-', followed by a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare). The yield of this purification was approximately 8 mg of superoxide dismutase per mL.
[0045] A superóxido dismutase purificada (SEQ ID NO: 1) teve sua atividade enzimática testada por um procedimento de auto- oxidação do pirogalol modificado (Marklund and Marklund, 1974). Diferentes concentrações da solução de SEQ ID NO: 1 (0,25 a 2,5 µg) foram adicionadas ao tampão Tris 50 mmol L_J, pH 8,2, contendo EDTA 1 mmol L"1. A reação se deu em placas de 96 poços e foi Iniciada com a adição de pirogalol 0,2 mmõl L (concentração final). A mudança da absorbância a 325 nm foi medida a cada 30 s, por 10 min, a 25 °C. Os resultados foram expressos em quantidade de enzima (µg) requeridos para a inibição de 50 % da auto-oxidação do pirogalol (ÍÇ 50). Quanto aos resultados, a proteína SEQ ID NO:1 apresentou um JÇ 50 de 1,17 ug (4,8 pg/mL) , muito inferior aos valores reportados para as superóxido—dismutases de Therpius fill forrais(410 µg) e de Telypocladium sp (1,3 mg/mL][0045] Purified superoxide dismutase (SEQ ID NO: 1) had its enzymatic activity tested by a modified pyrogallol autooxidation procedure (Marklund and Marklund, 1974). Different concentrations of the SEQ ID NO: 1 solution (0.25 to 2.5 µg) were added to the Tris buffer 50 mmol L_J, pH 8.2, containing EDTA 1 mmol L"1. The reaction took place in 96 plates wells and was started with the addition of pyrogallol 0.2 mmol L (final concentration). The change in absorbance at 325 nm was measured every 30 s, for 10 min, at 25 °C. The results were expressed in amount of enzyme (µg) required for the inhibition of 50% of pyrogallol auto-oxidation (ÍÇ 50) Regarding the results, the protein SEQ ID NO:1 presented a JÇ50 of 1.17 ug (4.8 pg/mL), much lower than the values reported for superoxide—dismutases from Therpius fill forrais(410 µg) and Telypocladium sp (1.3 mg/mL]
[0046] Para avaliar a estabilidade, 2,5 µg da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 foram incubadas entre os pH 4 e 11 (25 °C) e entre as temperaturas de 20 e 7 0 °C antes da realização do ensaio de auto-oxidação do pirogalol. A atividade enzimática da proteína SEQ ID NO: 1 sob diferentes temperaturas também foi avaliada pelo ensaio NBT-PAGE (Boonmee et al., 2011). Os ensaios mostraram que a proteína SEQ ID NO: 1 é ativa nos pH 4-11, com atividade ótima a pH 5. Além disso, SEQ ID NO: 1 inibiu a auto-oxidação do pirogalol era raais de 80% após incubação nas temperaturas entre 30 e 65 °C, com atividade ótima a 35 °C[0046] To evaluate stability, 2.5 µg of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 were incubated between pH 4 and 11 (25 °C) and between temperatures of 20 and 70 °C before carrying out the stability test. pyrogallol auto-oxidation. The enzymatic activity of the protein SEQ ID NO: 1 under different temperatures was also evaluated by NBT-PAGE assay (Boonmee et al., 2011). The tests showed that the protein SEQ ID NO: 1 is active at pH 4-11, with optimal activity at pH 5. Furthermore, SEQ ID NO: 1 inhibited the auto-oxidation of pyrogallol by more than 80% after incubation at temperatures between 30 and 65 °C, with optimal activity at 35 °C
[0047] Ensaios de si.nergismo com outras enzimas foram realizados com a superóxido dismutase SEQ ID NO:1. Em um primeiro teste, avaliou-se a sinergia da superóxido dismutase SEQ ID NO:1 com uma endo-ß-1,4-glicosidase de Coptotermes gestroi.0 grau de sinergisino (GS) foi calculado como ab/(a+b) , em que ab é o resultado do sinergismo (µmol .mirr1),, enquanto que a e b são os resultados das enzimas isoladas. A reação foi conduzida com 100 µl de ß-glucan 0,5% em 50 mmol L-1of tampão acetato pH 5,5, 100 ng de endo-B-í,4-glicosidasé de C. gestroi e diferentes concentrações da superóxido dismutase SEQ ID NO:1 (100, 500, 750 e 2000 ng). Todas as reações foram realizadas em quintupliçata a 30 °C durante 30 min em placas de PCR. Após a hidrólise, 100 µl da reação foram transferidos para uma nova placa e 100 µl de DNS (3,5-ácido dinitrosalicilico) foram adicionados. As reações foram incubadas a 99 °C por 5 min e as absorbâncias foram m.edidads a 540 nm. Os resultados foram expressos em glicose equivalente (µmol). Por este ensaio, 100 ng de SEQ ID N0:l conseguiu aumentar a hidrólise do B- glucan em um GS de 1,46 (Figura 3).[0047] Energy tests with other enzymes were carried out with superoxide dismutase SEQ ID NO:1. In a first test, the synergy of superoxide dismutase SEQ ID NO:1 was evaluated with an endo-ß-1,4-glucosidase from Coptotermes gestroi. The degree of synergisine (GS) was calculated as ab/(a+b) , where ab is the result of synergism (µmol .mirr1), while a and b are the results of isolated enzymes. The reaction was carried out with 100 µl of 0.5% ß-glucan in 50 mmol L-1of acetate buffer pH 5.5, 100 ng of endo-B-í,4-glucosidase from C. gestroi and different concentrations of superoxide dismutase SEQ ID NO:1 (100, 500, 750 and 2000 ng). All reactions were performed in quintuple at 30 °C for 30 min in PCR plates. After hydrolysis, 100 µl of the reaction was transferred to a new plate and 100 µl of DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) was added. The reactions were incubated at 99 °C for 5 min and absorbances were measured at 540 nm. The results were expressed in glucose equivalent (µmol). By this assay, 100 ng of SEQ ID N0:l was able to increase the hydrolysis of B-glucan at a GS of 1.46 (Figure 3).
[0048] Em um segundo momento, a atividade da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 foi mensurada na hidrólise do material lignocelulósico bagaço de cana-de-açúcar explodido não deslignifiçado (BEX). A dosagem de proteínas totais foi realizada segundo o método de Bradford (1976) utilizando-se Albumina de Soro Bovino (BSA) como padrão. A mistura reacional constitui-se de 1,5 ml em solução de 2% de BEX em tampão acetato 100 mM, pH 5,5. Cargas de 10, 5 e 1 Unidades de papel filtro (FPU) por grama de BEX do coquetel comercial Celluclast® (Novozymes, constituído basicamente de celulases) e concentrações da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 entre 2 e 20 µg por grama de BEX foram combinadas. A mistura foi incubada sob agitação de 1000 rpm a 30 °C e 50 °C (Figura 4) e após 1, 3 ,6 e 24 horas, teve alíquotas retiradas. Os açúcares redutores foram quantificados pelo método de DNS, e as leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 575 nm, conforme descrito pox Miller (1959). 0 grau de sinergismo (GS) foi determinado comparando a hidrólise da combinação enzimática (ab) pela hidrólise das enzimas separadas (a+b) , ou seja, a.b/ (a+b) . As amostras foram retiradas nos tempos de 1, 3, 6 e 24 horas e os açúcares redutores totais (ART) foram medidos pelo método de DNS. A tabela 1, bem como a figura 4, apresentam os resultados obtidos.[0048] In a second step, the activity of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 was measured in the hydrolysis of the lignocellulosic material exploded non-delignified sugarcane bagasse (BEX). Total protein measurement was carried out according to the method of Bradford (1976) using Bovine Serum Albumin (BSA) as standard. The reaction mixture consists of 1.5 ml of 2% BEX solution in 100 mM acetate buffer, pH 5.5. Loads of 10, 5 and 1 Filter Paper Units (FPU) per gram of BEX from the commercial cocktail Celluclast® (Novozymes, consisting basically of cellulases) and concentrations of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 between 2 and 20 µg per gram of BEX were combined. The mixture was incubated under shaking at 1000 rpm at 30 °C and 50 °C (Figure 4) and after 1, 3, 6 and 24 hours, aliquots were removed. Reducing sugars were quantified using the DNS method, and readings were taken in a spectrophotometer at 575 nm, as described by Miller (1959). The degree of synergism (GS) was determined by comparing the hydrolysis of the enzyme combination (ab) with the hydrolysis of the separate enzymes (a+b), that is, a.b/ (a+b). Samples were taken at 1, 3, 6 and 24 hours and total reducing sugars (ART) were measured using the DNS method. Table 1, as well as figure 4, present the results obtained.
[0049] Tabela 1: SUplementação de Celluclast® (Novozymes) com a superóxido dismutase SEQ ID NO ; 1. As quantidades de lü, 5 e 1 FPU de Celluclast® (Novozymes)por grama de BEX foram testadas versus as concentrações de 2 e 20 µg de SEQ ID NO: 1 por grama de BEX. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART). [0049] Table 1: Supplementation of Celluclast® (Novozymes) with superoxide dismutase SEQ ID NO; 1. The amounts of lü, 5 and 1 FPU of Celluclast® (Novozymes) per gram of BEX were tested versus the concentrations of 2 and 20 µg of SEQ ID NO: 1 per gram of BEX. The results were expressed in total reducing sugars (g/L) (ART).
[0050] Cabe salientar que a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 não apresentou atividade sobre BEX quandõ incubado isoladamente.[0050] It should be noted that superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 did not show activity on BEX when incubated alone.
[0051] Como a hidrólise ideal da biomassa encontra-se em temperaturas mais elevadas (50 °C, temperatura ótima de atividade das composições para a hidrólise enzimática de materiais lignocelulósícos), novos parâmetros foram formulados a fim de demonstrar o efeito positivo adicionando-se a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 a Celluclast®.[0051] As the ideal hydrolysis of biomass is found at higher temperatures (50 °C, optimum temperature of activity of the compositions for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials), new parameters were formulated in order to demonstrate the positive effect by adding superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 Celluclast®.
[0052] A hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar explodido não deslignifiçado (BEX) se deu com a composição Celluclast® e a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 nas seguintes condições: pH 5,5; 100 mmol tampão Acetato; 2% de BEX, 1 FPü/g de Celluclast® e 1,3-3 mg da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 purificada. A temperatura de reação foi de 50 cC e a agitação foi de 1000 rpm. Os açúcares redutores foram medidos pelo método de DNS nos tempos de reação de 3 e 6 horas. O efeito positivo de SEQ ID NO: 1 sobre Celluclast® foi demonstrado pelo GS de 1,15 (3 h) e 1,19 (6 h de reação), conforme retratado na figura 5.[0052] Hydrolysis of non-delignified exploded sugarcane bagasse (BEX) took place with the Celluclast® composition and superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 under the following conditions: pH 5.5; 100 mmol Acetate buffer; 2% BEX, 1 FPü/g of Celluclast® and 1.3-3 mg of purified superoxide dismutase SEQ ID NO: 1. The reaction temperature was 50 cC and stirring was 1000 rpm. Reducing sugars were measured by the DNS method at reaction times of 3 and 6 hours. The positive effect of SEQ ID NO: 1 on Celluclast® was demonstrated by the GS of 1.15 (3 h) and 1.19 (6 h of reaction), as depicted in figure 5.
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